Étude de la flore bactérienne et de sa résistance aux

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Submitted on 15 Feb 2019

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Étude de la flore bactérienne et de sa résistance auxantibiotiques des produits de la pêche et de l’aquaculture

Arnaud Briet

To cite this version:Arnaud Briet. Étude de la flore bactérienne et de sa résistance aux antibiotiques des produits de lapêche et de l’aquaculture. Sciences et techniques des pêches. Université du Littoral Côte d’Opale,2018. Français. �NNT : 2018DUNK0494�. �tel-02021052�

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Université Littoral Côte d’Opale

Ecole Doctorale des Sciences de la Matière, du rayonnement et de l’Environnement

Thèse de doctorat

Présentée par : Arnaud Briet

Etude de la flore bactérienne et de sa

résistance aux antibiotiques des

produits de la pêche et de l’aquaculture

Sous la direction de : Dr. Graziella MIDELET

Soutenue le : 11/12/2018

Devant le jury composé de :

Pr. PILET Marie-France Professeur, Oniris, Nantes Rapporteur

Pr. LINA Gérard Professeur des universités, Université Lyon 1, Lyon Rapporteur

Dr. MADEC Jean-Yves Directeur de recherche, ANSES, Lyon Examinateur

Pr. HOCQUET Didier Professeur des universités, Université de Franche-Comté, Besançon Examinateur

Dr. GRANIER Sophie Chargée de recherche, ANSES, Maisons-Alfort Co-encadrante

1

Remerciement

Cette thèse a été possible grâce au soutien financier de l’ANSES et de la région Haut-de-France. Je

tiens à remercier Laurent Laloux, directeur du Laboratoire de sécurité des aliments de l’ANSES et

Anne Brisabois, directrice adjointe et responsable du département des produits de la pêche et de

l’aquaculture de m’avoir accueilli au sein de leur laboratoire.

Je tiens également à remercier le Pr Marie-France Pilet et le Pr Gérard Lina, d’avoir accepté d’être

rapporteur de ces travaux de thèse. Merci également au Dr Jean-Yves Madec et au Pr Didier Hocquet

d’être examinateur de mes travaux de thèse.

La thèse quelle aventure ! Je tiens à remercier chaleureusement Graziella Midelet, qui a dirigé cette

thèse et qui m’a beaucoup apporté, autant scientifiquement que professionnellement et

humainement. Ensuite, merci à Sophie Granier de m’avoir encadré sur la partie antibiorésistance, tes

connaissances et ta pédagogie m’ont beaucoup apporté. Vous m’avez, toutes les deux, par votre

rigueur et votre complémentarité aidé à faire ce que cette thèse a été : beaucoup de travail, mais

toujours dans la bonne humeur.

Je tiens à remercier mes compagnons de thèse, d’abord ceux qui sont passés dans le bureau des

doctorants ( THE bureau), Estelle et notre passion commune des bébés goélands, Julia et nos

conversation « philosophique » du vendredi matin et surtout Ludo, nous nous sommes supportés

pendant ces trois ans, un véritable exploit !

Mes autres compagnons de thèse, Nicolas, Sylvain et Sarah, merci de m’avoir supporté comme

maître de stage, toujours un peu désorganisé et dans l’improvisation. Votre travail et votre bonne

ont également amené cette thèse où elle est.

Aux membre de l’équipe B3PA, Thomas et tes embuscades à l’Alcazar qui remontent le moral ☺,

Mélanie et nos discussions toujours intéressantes (surtout quand tu débarques dans le bureau pour

2

te joindre aux débats des doctorants !), Cindy et nos rendez-vous du lundi matin, Sabine et Guylaine

et votre bonne humeur (sisi je vous ai vu sourire), Stéphanie, Virginie, Odile et nos conversations

autours d’un café ou d’un gâteau je vous remercie tous profondément. Merci également aux

membres de l’équipe qui nous ont quittés, Clémence, Régine et Nina vous avez fait vivre ce

laboratoire.

Karine, Corinne et Sophie (Z et K), merci pour les discussions que nous avons pu avoir, ça fait toujours

du bien de se vider la tête avec vous. Alexandre, une petite kasdédi parce que tu le vaux bien ! Enfin

merci à Sylvie, Guillaume, Charlotte, Marie et Gaëlle pour les discussions que nous avons pu avoir au

détour d’un couloir.

Je tiens à remercier toutes les personnes qui ont travaillé de près ou de loin sur ces travaux, vos

petites attentions, aides sont toujours agréables.

Mes amis, Mélody, Maleaume, Romain, Anne, Marion, Flavien, Benoit, Alisson, Gaël et Tiphaine vos

passages à Boulogne et nos soirées aux quatre coins de la France ont toujours été un plaisirs et ça fait

toujours du bien de vous voir et vos petites têtes d’EBIste ( et celles des pièces rapportées :p )

Enfin ma petite famille, mes soutiens de toujours, Maman, Papa, Emilie, Coline merci de m’avoir

toujours porté et soutenu, moi le petit dernier de la famille. Merci également à Adrien (mon futur

beauf) et William (mon beauf), vous rendez toujours les réunions familliales plus épicées et

pétillantes ! Enfin mes petites bouilles de Loris et Malia, mon neveu et ma nièce, vous êtes de vrais

rayon de soleil ( et de vrais tempêtes du désert aussi).

3

Sommaire

Liste des abréviations ......................................................................................................................... 7

Liste des tableaux ............................................................................................................................... 9

Liste des figures ................................................................................................................................ 13

Introduction ............................................................................................................................... 17

Étude bibliographique ................................................................................................................ 23

I. Consommation, production et commerce international des produits de la pêche et point

sur la réglementation .................................................................................................. 24

II. Risques liés à la flore bactérienne présente dans les produits de la pêche ...................... 27

II.1. Flore bactérienne pathogène alimentaire pour l’homme : Toxi-infections

alimentaires et résistance aux antibiotiques.......................................................... 27

II.2. Flore bactérienne cultivable des produits de la pêche et de l’aquaculture .............. 31

II.3. Résistance aux antibiotiques de la flore des produits aquatiques ............................ 34

II.4. Techniques d’isolement et d’identification de la flore bactérienne des produits

aquatiques .............................................................................................................. 36

III. La résistance aux antibiotiques : Dissémination et détection .......................................... 39

III.1. Les éléments génétiques mobiles et les intégrons ................................................... 41

III.1.A. Les Plasmides ............................................................................................................. 41

III.1.B. Les ilôts génomiques : integrative and conjugative element (ICE) et integrative and

mobilisable element (IME) .......................................................................................... 42

III.1.C. Transposon ................................................................................................................. 43

III.1.D. Les intégrons .............................................................................................................. 44

III.1.E. Imbrication des éléments génétiques mobiles........................................................... 45

III.2. La transduction et la transformation ........................................................................ 46

III.3. Diffusion des bactéries résistantes aux antibiotiques et sureveillance .................... 47

III.4. Techniques de détection phénotypique et génotypique de la résistance aux

antibiotiques ........................................................................................................... 50

III.4.A. Techniques de détection phénotypique ................................................................... 50

III.4.B. Interprétation des résultats phénotypiques selon les référentiels du CLSI et EUCAST

..................................................................................................................................... 51

III.4.C. Techniques de confirmation et d’identification des mécanismes de résistance et de

leurs supports génétiques ........................................................................................... 55

Chapitre 1 : Isolement et identification de la flore bactérienne mésophile cultivable des produits de

la pêche et de l’aquaculture .............................................................................................. 59

I. Contexte .............................................................................................................................. 60

II. Matériel et méthodes ........................................................................................................ 63

II.1. Préparation des broyats ............................................................................................. 63

II.2. Isolement des bactéries ............................................................................................. 64

II.3. Identification bactérienne par la technique MALDI-TOF et par l’amplification et le

séquençage de gènes de ménage (ADNr 16S, gyrB, rpoB et tuf) ........................... 66

4

II.3.A. Technique MALDI-TOF ................................................................................................ 66

II.3.B. Techniques d’amplification et de séquençage de gènes de ménage de l’ADNr 16S,

gyrB, rpoB et tuf .......................................................................................................... 67

III. Comparaison des performances de différentes techniques d’identification bactérienne 70

III.1. Techniques MALDI-TOF vs amplification et séquençage de l’ADNr 16S ................... 70

III.2. Complément d’identification par les autres gènes de ménage gyrB, rpoB et tuf .... 74

III.3. Discussion ................................................................................................................. 74

IV. Identification des souches isolées des produits de la pêche et performance de la

sélectivité des géloses ................................................................................................. 78

IV.1. Identification des isolats ........................................................................................... 78

IV.2. Performance de la sélectivité des géloses ................................................................ 79

IV.3. Discussion ................................................................................................................. 89

V. Diversité de la flore bactérienne des produits de la pêche et de l’aquaculture ............... 91

V.1. Diversité et proportion des bactéries Gram positif isolées des produits de la pêche

et de l’aquaculture ................................................................................................. 91

V.1.A. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Bacilliales .................. 93

V.1.B. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Lactobacilliales .......... 96

V.1.C. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Micrococcales............ 98

V.2. Diversité et proportion des bactéries Gram négatif isolées des produits de la pêche

et de l’aquaculture ................................................................................................. 98

V.2.A. Diversité bactérienne des γ-proteobacteria ............................................................. 100

V.2.B. Diversité bactérienne des souches appartenant aux α-proteobacteria :

Caulobacteriales, Flavobacteriales, Rhizobiales et Sphingobacteriales .................... 104

V.3. Discussion ................................................................................................................ 104

Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins ... 113

I. Contexte ............................................................................................................................ 114

II. Antibiorésistance de la flore des produits de la pêche et de l’aquaculture .................... 116

II.1. Matériel et méthodes .............................................................................................. 116

II.1.A. Sélection des souches ............................................................................................... 116

II.1.B. Antibiogramme par diffusion .................................................................................... 117

III. Etude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées dans les produits de la

pêche et de l’aquaculture .......................................................................................... 122

III.1. Contexte .................................................................................................................. 122

III.2. Enterococcus ........................................................................................................... 123

III.2.A. Contexte ................................................................................................................... 123

III.2.B. Panel de souches étudiées ....................................................................................... 123

III.2.C. Détermination de la population non-sauvage ......................................................... 123

III.2.D. Multi-résistance ....................................................................................................... 127

III.2.E. Discussion ................................................................................................................. 128

III.3. Staphylococcus ........................................................................................................ 132

III.3.A. Contexte ................................................................................................................... 132


5

III.3.C. Détermination de la population non-sauvage des Staphylococcus coagulase positif

................................................................................................................................... 133

III.3.D. Détermination de la population non-sauvage des Staphylococcus coagulase négatif

................................................................................................................................... 134

III.3.E. Multi-résistance ........................................................................................................ 136

III.3.F. Discussion ................................................................................................................. 137

III.4. Exiguobacterium ..................................................................................................... 140

III.4.A. Contexte ................................................................................................................... 140




III.4.E. Discussion ................................................................................................................. 143

III.5. Pseudomonas .......................................................................................................... 145

III.5.A. Contexte ................................................................................................................... 145




III.5.E. Discussion ................................................................................................................. 149

III.6. Vibrio ....................................................................................................................... 151

III.6.A. Contexte ................................................................................................................... 151


III.6.C. Etude de la résistance aux antibiotiques.................................................................. 151

III.6.D. Discussion ................................................................................................................. 153

III.7. Proteus .................................................................................................................... 156

III.7.A. Contexte ................................................................................................................... 156


III.7.C. Etude de la résistance aux antibiotiques.................................................................. 156

III.7.D. Discussion ................................................................................................................. 159

IV. Antibiorésistance et produits de la pêche et de l’aquaculture ...................................... 160

IV.1. Contexte ................................................................................................................. 160

IV.2. Résultats ................................................................................................................. 160

IV.3. Discussion ............................................................................................................... 164

V. Bactérie (s) candidate(s) potentielle(s) indicatrice(s) de la résistance aux antibiotiques

dans les produits de la pêche et de l’aquaculture ..................................................... 167

V.1. Contexte .................................................................................................................. 167

V.2. Résultats .................................................................................................................. 170

V.3. Discussion ................................................................................................................ 171

Chapitre 3 : Étude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits

de la pêche et de l’aquaculture......................................................................................... 179

I. Contexte de l’étude ........................................................................................................... 180

II. Définition des seuils épidémiologiques avec la recherche des intégrons/SXT ................ 182

II.1. Contexte ................................................................................................................... 182

II.2. Matériel et méthodes .............................................................................................. 183

6

II.2.A. Sélection des souches ............................................................................................... 183

II.2.B. Antibiogramme par diffusion .................................................................................... 183

II.2.C. Interprétation des résultats ...................................................................................... 184

II.2.D. Recherche des intégrases des intégrons de type 1, 2 et 3 et de l’intégrase des ICE

SXT/R391 par PCR...................................................................................................... 184

II.3. Résultats ................................................................................................................... 187

II.3.A. Origine des souches .................................................................................................. 187

II.3.B. Définition des seuils épidémiologiques expérimentaux (COWT) ................................ 188

II.3.C. Recherche d’intégrons .............................................................................................. 194

II.4. Discussion ................................................................................................................ 195

III. Caractérisation des résistances de la souche V. parahaemolyticus 16-B3PA-006 ......... 201

III.1. Contexte .................................................................................................................. 201

III.2. Matériel et méthodes ............................................................................................. 202

III.2.A. Caractérisation du mécanisme de résistance aux β-lactamines .............................. 202

III.2.B. Séquençage et analyse du génome total ................................................................. 203

III.2.C. Conjugaison bactérienne .......................................................................................... 203

III.3. Résultats .................................................................................................................. 205

III.3.A. Caractérisation du mécanisme de résistance aux β-lactamines .............................. 205

III.3.B. Séquençage du génome total et analyse bio-informatique ..................................... 206

III.3.C. Conjugaison bactérienne .......................................................................................... 206

III.4. Discussion ............................................................................................................... 208

Conclusion et perspectives ........................................................................................................ 215

Valorisation des travaux de thèse .............................................................................................. 225

Références bibliographiques ...................................................................................................... 227

Annexes .................................................................................................................................... 255

7

Liste des abréviations ADN : Acide désoxyribonucléique

ALOA : Agar Listeria selon Ottaviani et Agosti

ANT : Aminoside nucléotidyltransférase

ARNr : Acide ribonucléique ribosomal

APH : Aminoside O-phosphotransphérase

ATCC: American Type Culture Collection

Bla: β-lactamase

BLSE: β-lactamse à spectre étendu

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

CDC: Centers for Disease Control and prevention

CFC: Cephalosporine Fucidine Cetrimide

CGE: Center for genomic epidmemiology

CIPARS: Canadian Integrated Program for Antimicrobial Resistance Surveillance

CLSI : Clinical laboratory Standard Institute

CMI : Concentration minimale inhibitrice

COWT : Seuil épidémiologique expérimental

CXG : Céphalosporine Xème génération

DGAL : Direction générale de l’alimentation

ECOFF: epidemiological cut-off value (seuil épidémiologique)

ECV: epidemiological cut off value (seuil épidémiologique)

EFSA: European food Safety Authority

EMBL: European Molecular Biology Laboratory

EPT : Eau peptonée tamponnée

EPSA : Eau peptonée saline alcaline

EUCAST: European comitte on antimicrobial susceptibility testing

FAO: Food and Agriculture Organisation of the United Nations

GNS: Gélose nutritive salée

GSP: Glutamate Strach Phenol red

8

ICE: Integrative and conjugative element

IME: Integrative and mobilizable element

IMI: Imipenem-hydrolysing β-lactamase

IS: Insertion sequence

Kb: kilobase

Maldi-Tof: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight

MCR: plasmid-mediated colistin resistance

MLS: Macrolide lincosamide streptogramine

NARMS : National Antimicrobial Resistance Monitoring System for Enteric Bacteria

NCBI: National center for biotechnology information

NDM: New Delhi Metallo-β-lactamase

NPP : Nombre le plus probable

OIE : Organisation mondiale de la santé animale

OMS : Organisation mondiale de la santé

PEMBA: Polymyxin pyruvate Egg yolk Mannitol Bromothymol blue Agar

PCA: Plate count agar

PCR: Polymerase chain reaction

PLP : Protéine liant la pénicilline

SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méticilline

SCC: Staphylococcal Chromosomal Cassette

SGI: Salmonella Genomic Island

ST: Sequence type

TBX : Triptone Bile X-glucuronide

TCBS : Thiosulfate itrate bile saccharose

TIAC : Toxi-infection alimentaire collective

UFC : Unité formant colonie

USD: United States Dollar

VIM: Vérona imipénémase

VCC : Vibrio cholerae carbapenemase

VRBG : Milieu glucosé biliées au cristal violet et au rouge neutre

9

Liste des tableaux Tableau 1: Volume de consommation, de production et d'importation des produits aquatiques les

plus consommés par les français (moyenne 2013-2015) (FranceAgrimer, 2016). ...................... 60

Tableau 2: Conditions d’incubation pour l‘isolement et le repiquage des souches bactériennes. ...... 65

Tableau 3:Abbréviation des noms des géloses sélectives. .................................................................... 66

Tableau 4: Couples d'amorces utilisés pour la PCR et le séquençage. .................................................. 68

Tableau 5: Conditions de PCR utilisées ................................................................................................. 68

Tableau 6: Comparaison des résultats d’identifications des isolats obtenus par la technique MALDI-

TOF et par amplification et séquençage de l'ADNr 16S (n = 501). Gen : identification au genre,

Esp : identification à l’espèce, - : aucune identification. Lorsqu’aucune comparaison des

résultats n’était possible, les cases ont été grisées. .................................................................... 70

Tableau 7: Taux d’identification des genres bactériens principaux (n>10) par la technique MALDI-TOF

et de l’amplification et du séquençage de l’ADNr 16S (n= 373). ................................................. 72

Tableau 8: Nombre d'isolats pour chaque genre bactérien identifié par milieux gélosés utilisés (n =

1882). Les cases grises correspondent à l’absence d’isolats, les cases vertes aux genres

bactériens ciblés par les géloses sélectives, les cases orange aux genres bactériens non ciblés

mais décrits dans les fiches techniques des géloses et les cases blanches aux genres bactériens

non décrits dans les fiches techniques des géloses. .................................................................... 80

Tableau 9: Nombre d'isolats par gélose des espèces bactériennes. Les espèces présentées

appartiennent aux genres bactériens avec plus de 100 isolats et aux genres bactériens dont au

moins une espèce est potentiellement un pathogène alimentaire. Les espèces bactériennes en

rouge sont de potentiels pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont

des marqueurs d’hygiène dans les aliments. ............................................................................... 84

Tableau 10: Proportion des genres bactériens Gram positif dans les produits de la pêche et de

l'aquaculture. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules,

Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats (n=978). .... 92

Tableau 11: Bacilliales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr=

crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches

représentent l’absence d’isolats. Les espèces bactériennes en rouge sont de potentiels

pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène

dans les aliments. ......................................................................................................................... 94

Tableau 12: Lactobacilliales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons

plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases

10

blanches représentent l’absence d’isolats. Les espèces bactériennes soulignées sont des

marqueurs d’hygiène dans les aliments. ..................................................................................... 97

Tableau 13: Micrococcales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats,

Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches

représentent l’absence d’isolats. ................................................................................................. 98

Tableau 14 : Proportion des genres bactériens Gram négatif dans les produits de la pêche et de

l'aquaculture. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules,

Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats (n=640). .... 99

Tableau 15: Enterobacteriales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr=


représentent l’absence de souches. Les espèces bactériennes en rouge sont les potentiels

pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène

dans les aliments. ....................................................................................................................... 101

Tableau 16: Pseudomonadales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr=


représentent l’absence de souches. .......................................................................................... 102

Tableau 17: Vibrionales, Aeromonadales, Alteromondales, Oceanospiralles et Xanthomonadales

isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard,

Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence de

souches....................................................................................................................................... 103

Tableau 18: α-proteobacteria, Sphingobacteriia et Flavobacteriia isolées des produits aquatiques. Ca=

cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-

Jacques. Les cases grisées représentent l’absence de souches. ................................................ 104

Tableau 19: Population bactérienne Enterococcus spp. (n=46) ayant acquis des résistances selon les

seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ;

COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait

pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil

S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement

intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de

données. ..................................................................................................................................... 124

Tableau 20 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Enterococcus spp. (n = 38). ............................ 127

Tableau 21 : Population bactérienne Staphylococcus aureus (n=8) ayant acquis des résistances selon

les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ;

COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait

pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil

11

S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement

intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de

données. ..................................................................................................................................... 133

Tableau 22 : Population bactérienne de Staphylococcus spp. coagulase négatif (n=35) ayant acquis

des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique

définit dans l’EUCAST ; COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la

distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC :

écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des

populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont

pour une absence de données. .................................................................................................. 134

Tableau 23 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Staphylococcus spp. (n = 29). ......................... 136

Tableau 24: Population bactérienne Exiguobacterium spp. (n=40) ayant acquis des résistances selon

les seuils épidémiologiques COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car

la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC :

écart-type > 3,35 mm. Les cases bleues foncées sont pour une absence de données. ............ 141

Tableau 25: Cumul de phénotype-non sauvage pour Exiguobacterium spp. (n = 22) ........................ 142

Tableau 26 : Population bactérienne Pseudomonas spp. (n =54) ayant acquis des résistances selon les

seuils épidémiologiques COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la

distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC :

écart-type > 3,35 mm. Les cases bleues foncées sont pour une absence de données. ............ 146

Tableau 27 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Pseudomonas spp. (n = 27). ........................... 148

Tableau 28: Population bactérienne Vibrio spp. (n=46) ayant acquis des résistances selon les seuils

épidémiologiques et cliniques. COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé

car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC :




Tableau 29: Population bactérienne Proteus spp. (n=32) ayant acquis des résistances selon les seuils

épidémiologiques et cliniques. COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé

car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC :




12

Tableau 30: Caractéristiques des genres bactériens dont la résistance aux antibiotiques a été étudiée

selon les critères pour être une bactérie indicatrice de la résistance aux antibiotiques. ECOFF=

seuils épidémiologiques définis pas EUCAST. ............................................................................ 170

Tableau 31: Amorces pour la détection des intégrons de type 1, 2 et 3 et l’intégrase des ICE SXT/R391

et la confirmation de l’espèce V. parahaemolyticus. ................................................................. 185

Tableau 32: Conditions de PCR pour la détection des intégrons de type 1, 2 et 3 et de l’intégrase SXT.

.................................................................................................................................................... 186

Tableau 33: Définition des COwt de V. parahaemolyticus et des populations non-sauvages (n = 384).

ND non déterminé...................................................................................................................... 189

Tableau 34: Phénotypes non-sauvages des souches de V. parahaemolyticus (n = 60). ..................... 191

Tableau 35: Comparaison des COWT et seuils cliniques du CLSI pour V. parahaemolyticus (CLSI 2015).

ND : COWT non déterminé, S : sensible, I : intermédiaire, R : résistant. Les cases bleues

représentent l’absence de seuil. ................................................................................................ 193

Tableau 36: Comparaison des COWT pour Vibrio spp. et pour V. parahaemolyticus. ND : COWT non

déterminé, SP : présence sous-population dans la distribution, EC : écart-type non validé. Les

cases vertes montrent les antibiotiques pour lesquels les COWT de Vibrio spp. et V.

parahaemolyticus étaient identiques ou avaient une différence inférieure à l’incertitude de

mesure (±2 mm). Les cases roses représentent les antibiotiques pour lesquels les COWT de Vibrio

spp. et V. parahaemolyticus avaient une différence supérieure à l’incertitude de mesure (±2

mm). ........................................................................................................................................... 194

Tableau 37: Concentrations d'antibiotiques utilisées pour la conjugaison bactérienne. ................... 204

13

Liste des figures Figure 1: Le poisson comme aliment : apport par habitant (moyenne 2011-2013) (FAO 2016) .......... 24

Figure 2: Principaux flux commerciaux des produits de la pêche dans le monde (2016)(EUMOFA 2016)

...................................................................................................................................................... 26

Figure 3: Lieu de vie des produits de la pêche ©IFREMER. .................................................................. 32

Figure 4: Structure mosaïque du plasmide R100. En jaune les gènes de résistance aux tétracyclines,

en jaune-orangé le gène de résistance aux aminosides (aadA1), en orange le gène de résistance

aux désinfectants (qacE), en rose vif le gène de résistance aux sulfamides (sul1) et en rose pâle

le gène de résistance aux phénicolés (cat). En marron rayé verticalement l’opéron de résistance

au mercure (mer). Les différents bleus montrent les différentes structures portant les gènes de

résistance (Gillings et Stokes). ..................................................................................................... 45

Figure 5: Distribution des diamètres d’inhibition de souches d’E. coli pour la ciprofloxacine. Les barres

bleues représentent les souches sensibles cliniquement, en vert les souches intermédiaires et

en rouge les souches résistantes cliniquement (Kronvall et al. 2011). ........................................ 52

Figure 6: Distribution des bactéries de l’espèce E. coli selon les diamètres d’inhibition de la

ciprofloxacine. Le seuil épidémiologique est 25 mm. Les barres noires représentent la

population bactérienne sauvage et les barres blanches la population non sauvage .................. 53

Figure 7:Antibiogramme des bactéries Gram positif. ......................................................................... 119

Figure 8 : Antibiogramme des bactéries Gram négatif. ...................................................................... 120

Figure 9:Distribution des diamètres d'inhibition Enterococcus spp. pour la rifampicine. .................. 126

Figure 10: Distribution des diamètres d'inhibition Enterococcus spp. pour la vancomycine. ............ 126

Figure 11: Antibiogramme d'une souche de S. aureus ATTC 25923 présentant un phénotype sauvage

à gauche et d’une souche de S. haemolyticus AF16-62-CCCH3 à droite présentant un phénotype

MLSB (en rouge). Pénicilline (PEN), céfoxitine (FOX), sulfamides (SSS), triméthoprime (TMP),

linézolide (LZD), vancomycine (VAN), acide fusidique (FUS), tétracycline (TET), kanamycine

(KAN), tobramycine (TOB), gentamicine (GEN), chloramphénicol (CHL), ciprofloxacine (CIP),

érythromycine (ERY), clindamycine (CLI) et rifampicine (RIF). .................................................. 135

Figure 12 : Distribution des diamètres d'inhibition de Staphylococcus spp. pour a) la pénicilline, b) le

triméthoprime. ........................................................................................................................... 136

Figure 13 : Distribution des diamètres d’inhibition pour Exiguobacterium pour la pénicilline. La ligne

rouge représente le COWT........................................................................................................... 141

Figure 14 : Distribution des diamètres d’inhibition pour Exiguobacterium pour le triméthoprime. La

ligne rouge représente le COWT. ................................................................................................. 142

Figure 15:Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour l’ampicilline ..................... 147

14

Figure 16 : Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour la tétracycline ................ 147

Figure 17: Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour l’acide nalidixique ........... 148

Figure 18: Antibiogrammes des souches de Pseudomonas spp. présentant un phénotype d’induction

de résistance à la ceftazidime. a) Souche AF16-309PEPE3. b) Souche AF16-280PECF1. Les

antibiotiques écrits en rouge sont ceux impliqués dans le phénotype. Ampicilline (AMP),

amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF),

céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine

(GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL),

ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST)......................................................................................... 149

Figure 19: Distribution des diamètres d'inhibition de Vibrio spp pour l'ampicilline. .......................... 153

Figure 20 : Distribution des diamètres d’inhibition de Vibrio spp. a) amoxicilline/clavulanate, b)

céfalotine. .................................................................................................................................. 153

Figure 21 : Distribution des diamètres d’inhibition de Proteus spp. pour l’ampicilline. ..................... 158

Figure 22 : Distribution des diamètres d'inhibition du chloramphénicol pour Proteus spp ............... 158

Figure 23: Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par genres bactériens étudiés en

fonction du mode de production des matrices d’isolement. Les produits issus de la pêche sont

les cabillauds, poissons plats, noix de Saint-Jacques et homards. Les produits issus

d’aquaculture sont les crevettes, moules et huîtres. St=Staphylococcus, En=Enterococcus,

Ex=Exiguobacterium, Pr=Proteus, Ps=Pseudomonas, Vr=Vibrio. ............................................... 161

Figure 24 : Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par genres bactériens étudiés selon le

lieu de production. Les produits importés sont les crevettes, Saint-Jacques et homards. La

production Européenne comprend les cabillauds, poissons plats, moules et huîtres.

St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium, Ps=Pseudomonas, Pr=Proteus,

Vr=Vibrio. ................................................................................................................................... 162

Figure 25 : Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par matrice alimentaire et par genres

bactériens étudiés. St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium,

Ps=Pseudomonas, Pr=Proteus, Vr=Vibrio. .................................................................................. 163

Figure 26: Matrices d'origine des souches des souches de V. parahaemolyticus............................... 187

Figure 27: Origines géographiques des matrices dans lesquelles les souches de V. parahaemolyticus

ont été isolées. ........................................................................................................................... 188

Figure 28: Distribution des diamètres d'inhibition de V. parahaemolyticus par antibiotiques a)

ampicilline ; b) gentamicine ; c) tétracycline ; d) chloramphénicol. Les histogrammes

représentent la population sauvage et les histogrammes représentent la population non-

sauvage. Le trait rouge représente le COwt. ............................................................................... 190

15

Figure 29: Antibiogramme de la souche de V. parahaemolyticus 15-B3PA-0752 présentant un

phénotype sauvage à gauche et de la souche 16-B3PA-006 à droite présentant un phénotype

non-sauvage pour 9 molécules testées (en rouge). Ampicilline (AMP), amoxicilline/clavulanate

(AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF), céfotaxime (CTX), témocilline

(TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine (GEN), cotrimoxazole (SXT),

tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL), ciprofloxacine (CIP) et colistine

(CST). .......................................................................................................................................... 192

Figure 30: Exemple de PCR de détection de l'intégrase intI1. La souche E. coli pTRC99A était le témoin

positif de la réaction. Les souches E. coli SXT, V. parahaemolyticus CIP 70.63 et CNRVC 089

étaient les témoins négatifs. Les puits avec le mélange réactionnel étaient des témoins de

contamination de la PCR. MP : marqueur de poids moléculaire en paire de base. .................. 195

Figure 31: Résultats du CIM test. ........................................................................................................ 205

Figure 32: Antibiogrammes de la souche E. coli réceptrice UB 5201 et les deux phénotypes obtenus

après la conjugaison avec V. parahaemolyticus 16-B3PA-006. Ampicilline (AMP),

amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF),

céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine

(GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL),

ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST)......................................................................................... 207

17

Introduction

18

La résistance aux antibiotiques est un des enjeux majeur de santé publique mondial, pouvant

augmenter la létalité de bactéries pathogènes et entrainer des pertes économiques. En 2007, en

Europe, il était estimé que les bactéries résistantes aux antibiotiques étaient responsables de 25 000

morts par an (Norrby et al. 2009). Sur la même année, le coût des infections avec des bactéries

résistantes était estimé à 1,5 milliard d’euros (surcoût pour les des systèmes de santé et perte de

productivité). En France, 158 000 patients contractent, chaque année, une infection par un germe dit

multi-résistant, avec près de 12 500 décès (Santé Publique France 2015). De plus, si rien n’est mis en

place pour lutter contre la résistance aux antibiotiques, il est prévu qu’en 2050 les bactéries

résistantes aux antibiotiques pourraient être responsables de 10 millions de morts par an dans le

monde dont 390 000 en Europe . Les pertes économiques mondiales s’élèveraient à 100 000 milliard

d’euros (O’Neill 2016).

Par conséquent, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) coopère avec l’Organisation

mondiale de la santé animale (OIE) et la Food and Agriculture Organisation (FAO) au sein du concept

« One Health », pour lutter contre la résistance aux antibiotiques et sa dissémination. En effet, les

résistances aux antibiotiques peuvent circuler entre l’Homme, les animaux et l’environnement.

L’Homme peut être exposé à des bactéries résistantes aux antibiotiques via son alimentation.

Il y a deux risques associés à la présence de bactéries résistantes aux antibiotiques dans

l’alimentation. Le premier est lié à la présence de bactéries pathogènes alimentaires résistantes aux

antibiotiques, il y a un risque d’échec thérapeutique si un traitement antibiotique est nécessaire. Le

second risque est le transfert des résistances aux antibiotiques entre la flore bactérienne de l’aliment

et la flore intestinale du consommateur. Il participe alors à la dissémination des résistances aux

antibiotiques.

Face à ce problème sanitaire, une surveillance de la résistance aux antibiotiques de la

« fourche à la fourchette » a été mise en place dans l’Union Européenne. La résistance aux

antibiotiques des bactéries isolées des animaux de rente et des viandes est étudiée. Cela concerne

19

des bactéries zoonotiques alimentaires pour l’Homme (Salmonella spp. et Campylobacter spp.) et les

bactéries indicatrices de la résistance aux antibiotiques (Escherichia coli, Enterococcus faecalis et

Enterococcus faecium). Cependant, ces plans de surveillance ne concernent que les animaux et les

viandes des filières bovines, avicoles et porcines mais pas la filière de la pêche et de l’aquaculture. De

plus, les études sur la résistance aux antibiotiques de la flore bactérienne présente dans les produits

aquatiques sont peu nombreuses.

Pourtant, le milieu aquatique est une source alimentaire pour l’Homme, avec une

augmentation mondiale de la production des produits de la pêche et de l’aquaculture depuis les

années 1960. De plus, les effluents agricoles, d’aquacultures, urbaines, hospitalières et industrielles

contaminent le milieu aquatique avec des résidus d’antibiotiques et des bactéries résistantes aux

antibiotiques. Les effets de ces apports anthropiques sur la flore bactérienne du milieu aquatique

sont encore peu connus. Pourtant, le génome des bactéries aquatiques est particulièrement riche en

éléments génétiques mobiles impliqués dans la sélection et la dissémination de gènes de résistance.

Plusieurs publications mettent en évidence que des gènes de résistance à fort impact sur la santé

humaine sont issus du génome des bactéries d’origine aquatique. Pour exemple, qnrA et qnrS, gènes

de résistance plasmidique aux fluoroquinolones, ont été mobilisés à partir des génomes de

Shewanella algae et Vibrio splendidus. La découverte de nouveaux gènes de résistance dans le milieu

aquatique est souvent fortuite mais suggère que ce milieu est très favorable à la sélection de

bactéries résistantes. L’expérience acquise dans la surveillance des bactéries des filières terrestres,

montre que la circulation de la résistance au sein des agents zoonotiques ne peut être appréhendée

sans tenir compte de la circulation des éléments génétiques mobiles porteurs de gènes de résistance

au sein de bactéries sentinelles. Ainsi, il a été mis en évidence la circulation d’un unique plasmide

IncI1 porteur de BLSE chez des salmonelles de sérotypes variés isolées chez l’Homme et la volaille et

des E. coli commensaux de poulets (Cloaeckaert, 2010). Pour la filière halieutique et aquacole, si le

choix des bactéries zoonotiques à surveiller peut paraitre simple (Vibrio, Salmonella, Listeria,…), celui

des bactéries sentinelles pertinentes est moins documenté (Aeromonas, Shewanella …). Il y a un

20

risque de sélection de nouveaux gènes de résistance aux antibiotiques depuis des bactéries

aquatiques, comme cela s’est produit pour la β-lactamase blaOXA-48 provenant des bactéries du genre

Shewanella. Il y a également un risque de diffusion des résistances de la flore bactérienne des

effluents à la flore bactérienne aquatique et des animaux y vivant. Aucune étude ne permet de

retracer le devenir des activités anthropiques via les apports fluviaux et de relier l’antibiorésistance

en milieu dulçaquicole avec celle observée en milieu marin.

L’objectif principal de ces travaux de thèse a été de caractériser la résistance aux

antibiotiques des bactéries présentes sur des produits issus de la pêche et de l’aquaculture parmi les

plus consommés en France.

Dans un premier temps, nous avons réalisé une cartographie (isolement, identification) de la

flore bactérienne cultivable mésophile présentes sur 9 produits aquatiques parmi les plus

consommés en France (cabillaud, plie, limande, sole, moules, huîtres, noix de Saint-Jacques, homard,

crevettes).

Dans un second temps, nous avons caractérisé phénotypiquement la résistance aux

antibiotiques des genres bactériens les plus fréquemment isolés de ces produits dans deux objectifs :

- Déterminer les populations sauvages et non-sauvages de ces genres bactériens,

- Définir le(s) genre(s) bactérien(s) pouvant être de(s) potentiel(s) candidat(s) indicateur(s)

de la résistance aux antibiotiques des produits issus du milieu marin.

Dans un troisième temps, nous avons étudié la résistance aux antibiotiques d’une collection

de souches de l’espèce bactérienne Vibrio parahaemolyticus, espèce pathogène alimentaire indigène

du milieu marin, isolée principalement de crustacés et de coquillages. Nous avons caractérisé les

phénotypes de résistance de la collection et le potentiel de diffusion des souches phénotypiquement

résistante.

23

E tude bibliographique

Étude bibliographique

24

I. Consommation, production et commerce international des produits

de la pêche et point sur la réglementation

Les produits de la pêche et de l’aquaculture sont une part importante des apports en

protéines animales dans l’alimentation humaine. En 2014, ils représentaient 17 % de ces apports

dans le monde (FAO 2016). Ceci est le résultat d’une augmentation de la consommation des produits

aquatiques depuis 50 ans. Elle est passée de 9,9 kg/an/habitant dans les années 1960 à

20 kg/an/habitant en 2014. Cependant, la consommation de ces produits est inégale et dépend des

régions du monde. Les pôles de consommation principaux sont l’Europe du Nord et de l’Ouest, avec

25 kg/an/habitant, l’Amérique du Nord, la façade pacifique de l’Asie et l’Asie du Sud-Est

(Figure 1)(EUMOFA 2016). Au sein de l’union Européenne, il y a également des disparités de

consommation entre les pays. En 2015, les Portugais consommaient 60kg/an/habitant de produits

aquatiques alors qu’en Hongrie, la consommation était de 4,8kg/an/habitant (EUMOFA 2016) (Figure

1).

Figure 1: Le poisson comme aliment : apport par habitant (moyenne 2011-2013) (FAO 2016)

Pour soutenir la consommation croissante des produits aquatiques, la production mondiale

des produits issus de la pêche a quadruplé, elle est passée de 20 millions de tonnes à près de


25

80 millions de tonnes à la fin des années 1980 puis s’est stabilisée (FAO 2016). À partir de cette

stabilisation de la pêche de capture, la production de l’aquaculture a fortement augmenté. Elle a été

multipliée par 7, en passant de 10 millions de tonnes à la fin des années 1980 à 70 millions de tonnes

en 2014 (FAO 2016). Les pays asiatiques produisent près de 74 % des ressources de pêche et

d’aquaculture mondiale. Quatre pays concentrent 78 % de la production aquacole du monde : la

Chine (±45 469 000 t), l’Indonésie (±4 254 000 t), l’Inde (±4 881 000 t) et le Vietnam (±3 397 000 t). La

Chine, à elle seule représente 60 % des ressources aquacoles (FAO 2016).

L’Europe et les États-Unis produisent près de 10 % des ressources mondiales aquatiques

chacun, l’Afrique et l’Océanie sont à 5 et 1 % respectivement (EUMOFA 2016). En 2015, au sein de

l’Union européenne, 4 686 000 t de poissons ont été débarquées. Les principales espèces étaient le

hareng (720 750 t, 15%), le sprat (553 714 t, 12 %) et le maquereau (464 160 t, 10 %). En ce qui

concerne l’aquaculture, 80 % de la production aquacole européenne concernait l’élevage de

mollusques bivalves et salmonidés (saumon et truite)(38 % de moules, 15 % de truite, 11 % de

saumon et 7 % d’huîtres). En 2016, la France était le troisième producteur Européen de produits de la

pêche avec 785 000 tonnes, ce qui correspondait à 11 % de la production Européenne

(FranceAgriMer 2017c). Les principales espèces produites étaient le thon (102 880 t totalement

issues de la pêche), les huîtres (79 010 t entièrement issues de l’aquaculture) et les moules (77 040 t

très majoritairement issues de l’aquaculture).

Les pôles mondiaux de production et de consommation des produits aquatiques sont

différents. En effet, un tiers de la production halieutique mondiale est exportée. Les principales

espèces échangées, en termes de valeur, sont le saumon (16,6 %), les crevettes (15,3 %) et les

thonidés (10,2 %). En termes de volume, ce sont les morues, merlus, églefins (14,4 %) puis les autres

poissons pélagiques (12,7 %) et enfin les thonidés (8,3 %) (FAO 2016). Les flux de marchandises

aquatiques se font principalement des pays en développement vers les pays développés (Figure 2)

(FAO 2016). Les trois principaux pays exportateurs sont la Chine (20 980 millions d’USD), la Norvège


26

(10 803 millions d’USD) et le Viet Nam (8 029 millions d’USD). En parallèle, l’Union Européenne est le

marché d’importation le plus important du monde (54 000 millions d’USD) devant les Etats-Unis

(20 317 millions USD) et le Japon (14 844 millions d’USD).

Figure 2: Principaux flux commerciaux des produits de la pêche dans le monde (2016)(EUMOFA 2016)

Entrée en vigueur au 1er janvier 2006, la réforme de la réglementation européenne relative à

l’hygiène des aliments a simplifié et harmonisé les textes applicables dans l’Union européenne. Cet

ensemble de textes réglementaires, appelé « Paquet hygiène », concerne l’ensemble de la filière

agroalimentaire depuis la production primaire, animale et végétale jusqu’au consommateur pour

d'harmoniser le niveau de sécurité sanitaire. La consommation des produits aquatiques comporte

des dangers dont font partie les bactéries. En effet certaines peuvent être des pathogènes

alimentaires pour l’homme. En 2006, en Europe, l’Union Européenne a mis ne place un ensemble de

règlements appelé le « paquet hygiène » pour assurer la sécurité sanitaire des aliments, dont les

produits aquatiques. Il s’applique à l’ensemble des acteurs de la filière agro-alimentaire, de la

production à la distribution au consommateur. Ils doivent veiller à ce que les produits alimentaires

qu’ils vendent soit sain et sûr pour les consommateurs, sinon les produits non conformes doivent

être retirés du marché. Parmi l’ensemble des textes, les règlements 2073/2005 et 1441/2007

définissent les critères microbiologiques de sécurité sanitaire des aliments. Les produits aquatiques

concernés dans cette réglementation sont les fruits de mer (mollusques et crustacés) et les produits


27

prêts-à-consommer. Les fruits de mer doivent contenir moins de 130 NPP Escherichia coli et aucune

Salmonella. Pour les produits prêts à consommer, moins de 100 ufc/g de Listeria monocytogenes

doivent être détecté en date limite de consommation (Commission européenne 2005 ).

En France, la direction générale de l’alimentation (DGAL) a défini que les produits aquatiques

importés disponible à la consommation ne doivent pas être porteurs de Vibrio cholerae possédant les

gènes des toxines cholériques, de V. parahaemolyticus porteur des gènes codant pour des

hémolysines ou de Vibrio vulnificus (DGAL 2014).

II. Risques liés à la flore bactérienne présente dans les produits de la

pêche

II.1. Flore bactérienne pathogène alimentaire pour l’homme : Toxi-

infections alimentaires et résistance aux antibiotiques

La présence de bactéries pathogènes pour l’homme dans les aliments peut entraîner une

infection alimentaire. Aux États-Unis, entre 1999 et 2008, la moyenne annuelle d’infections

alimentaires dues à la consommation de produits aquatiques était de 664 021 personnes dont 100

morts et engendrait un coût estimé à 941 millions de dollars (Batz et al. 2012). En 2016, en Europe,

13,4% des TIAC avaient pour origine les produits aquatiques. Les principaux agents bactériens

responsables de ces TIAC étaient Salmonella et Vibrio parahaemolyticus (EFSA et ECDC 2017). Listeria

monocytogenes est également responsable de TIAC liée à la consommation de produits aquatiques

transformés et prêt-à-consommer comme du saumon fumé ou des poissons marinés (EFSA et ECDC

2017).

L’espèce bactérienne Vibrio parahaemolyticus, indigène du milieu aquatique, est considérée

comme la principale cause d’infection alimentaire bactérienne due aux produits aquatiques (Jaime et

al. 2018). Les infections à V. parahaemolyticus se traduisent par des gastroentérites et la guérison

est généralement spontanée. Pourtant pour les personnes à risque, notamment les personnes


28

immunodéprimées ou souffrant de maladies hépatiques, l’infection peut évoluer en septicémie (Hou

et al. 2011). Une antibiothérapie à base de fluoroquinolones, de C3G ou d’azithromycine peut être

prescrite (Diemert 2006a, Hou et al. 2011, Chiou et al. 2015). Le Center for Disease Control and

prevention (CDC) estime que cette bactérie est responsable de plus de 45 000 cas par an aux Etats-

Unis du à l’alimentation (CDC 2017b). Au Japon, cette bactérie serait responsable de 20 à 30% des

infections alimentaires (Jahangir Alam et al. 2002). En Europe, l’incidence des infections à

V. parahaemolyticus est inconnue, exceptéé en Galice, où depuis les années 1990 des infections,

liées à la consommation de produits aquatiques sont reportées régulièrement (Jaime et al. 2018). En

Espagne, en 2004 et 2012, 80 et 100 personnes ont été contaminées en mangeant des crustacés.

Dans le premier cas, des crabes importés d’Angleterre étaient probablement la cause de la TIAC

(Jaime Martinez-Urtaza et al. 2005). Dans le deuxième cas, il y aurait eu une contamination croisée

entre des coquillages de Galice contaminés et des crevettes congelées via la glace utilisée pour

refroidir les aliments cuits (Martinez-Urtaza et al. 2016). En France, en 1997, une infection notable a

impliqué 44 personnes ayant consommées des crevettes importées d’Asie (Robert-Pillot et al. 2004).

L. monocytogenes n’est pas considérée comme une bactérie native du milieu aquatique. Sa

présence dans ce milieu serait causée par une contamination d’effluents terrestres (plantes en

décomposition, fèces de bétails)(Vázquez-Boland et al. 2001, Lyautey Emilie et al. 2007, Jami et al.

2014). L. monocytogenes contaminerait les produits aquatiques dans l’eau ou les ateliers agro-

alimentaires (Jami et al. 2014). Cette espèce bactérienne a été isolée de 0 à 34 % de saumons et

truites vivantes ou fraîches et de 0 à 79 % de saumons et truites fumées (Gram 2001).Ce pathogène

alimentaire est isolé d’environ 5 % des produits aquatiques transformés dans l’union européenne

(Jami et al. 2014). L’ingestion d’aliments contaminés par des personnes en bonne santé peut

déclencher des gastro-entérites. L’infection dure quelques jours et la guérison est spontanée. En

revanche, chez les personnes fragilisées (comme les nouveau-nés, les personnes âgées, les femmes

enceintes et les personnes immunodéprimées), la bactérie peut passer la barrière intestinale et se

propager dans le corps humain (septicémie, méningite) (Santé Publique France). Le taux de mortalité


29

pour les sujets à risque est de 20% à 30 %(Vázquez-Boland et al. 2001). De plus, chez les femmes

enceintes la bactérie peut envahir le placenta et infecter le fœtus. Il y a alors un risque de fausse

couche ou que le nourrisson soit atteint de listériose. En cas d’infection, un traitement antibiotique à

base d’aminoside et de pénicilline peut être prescrit (Temple et Nahata 2000).

Entre 2008 et 2015, dans l’union Européenne, il y a eu 7 TIAC liées à la consommation de

produits aquatiques (viande de crabe, hareng marinés, saumon gravad et poissons

fumés/fermentés). Il y a eu 40 malades, dont 25 hospitalisations et 4 morts (Ricci et al. 2018).

Récemment, en 2017, la consommation de saumons fumés, produits en Pologne et contaminés par L.

monocytogenes, a causé une TIAC touchant 4 personnes (RASFF 2017, Vidal 2017).

Les bactéries du genre Salmonella sont responsables de près de 15 % et 21 % des TIAC aux

États-Unis et en Europe respectivement (Huang 2016, EFSA et ECDC 2017). Cependant, ces bactéries

ne sont pas natives du milieu aquatique, la contamination des produits issus de ce milieu se fait par

des eaux souillées ou une mauvaise hygiène dans les entreprises (Fernandes et al. 2018). Par

conséquent, en 2016, en Europe, Salmonella était l’agent causatif de 5 % des TIAC associées avec la

consommation des produits de la pêche, contre 40 % des TIAC associées à la consommation de

produits à base de viande (EFSA et ECDC 2017). Les symptômes des infections alimentaires causées

par cette bactérie sont généralement des gastro-entérites et le patient guérit spontanément.

Cependant, pour les individus à risque comme les enfants, les personnes âgées, les femmes

enceintes et les personnes immunodéprimées, les infections alimentaires peuvent entraîner des

complications, comme une septicémie et menacer la vie du patient (Santé Publique France , Chlebicz

et Śliżewska 2018). Un traitement antibiotique à base de fluoroquinolone, de C3G ou d’azithromycine

peut être prescrit (Diemert 2006a, Le Hello et al. 2011).En 2015, aux Etats-Unis, la consommation de

thon congelé, contaminé par Salmonella sérovar paratyphi B et Salmonella sérovar Weltevred, a

causé des infections alimentaires à travers 11 états. Au total, 65 personnes ont été malades avec

11 hospitalisations (Hassan et al. 2018). En 2016, en Arizona, 25 personnes ont été infectées par


30

Salmonella sérovar javina et 17 hospitalisées après avoir mangé des produits aquatiques dans un

restaurant. Du fait du nombre d’aliments différents incriminés (crevettes, huîtres, poissons), une

contamination croisée dans le restaurant a été suspectée (Venkat et al. 2018).

Cependant, si les souches bactériennes responsables d’infections acquièrent des résistances

aux antibiotiques, alors il y a un risque d’ échec thérapeutique, pouvant mener au décès du patient. Il

n’y a pas de cas référencé de toxi-infection alimentaire avec des bactéries résistantes aux

antibiotiques liés à la consommation de produits aquatiques. Pourtant, le risque d’infection

alimentaire par une bactérie résistante aux antibiotiques n’est pas nul. En effet, une étude réalisée

entre 2000 et 2005 aux Etats-Unis, sur la contamination par Salmonella de produits aquatiques

importés d’Asie, a montré que 25 % des souches étaient résistantes à au moins un antibiotique (Khan

et al. 2009). De plus, des infections alimentaires impliquant d’autres aliments avec des bactéries

résistantes aux antibiotiques ont été décrites dans la littérature scientifique. En 2015, aux États-Unis,

192 personnes ont été infectées par Salmonella sérotype I 4,[5],12:i:- et infantis en mangeant de la

viande de porc. Les souches du sérovar I 4,[5],12:i:- étaient multirésistantes, elles avaient acquis des

résistances aux pénicillines (ampicilline), aminosides (streptomycine), tétracyclines (tétracycline),

sulfamides (sulfisoxazole) (CDC 2015). Suite à ces infections 30 personnes ont été hospitalisées et

aucune mort n’a été déclarée. De plus, depuis 2002 des souches de Salmonella sérotype Kentucky

ST198-X1 résistantes aux quinolones, pénicillines, phénicolés, aminosides, sulfamides et cyclines se

sont disséminées en Afrique (Egypte, Maroc, Nigéria), Asie (Inde, Bangladesh), Europe (Pologne,

Allemagne, France) (Le Hello et al. 2011). Entre 2000 et 2008, plus de 500 personnes ont été malades

à cause de la consommation d’aliments contaminés par ce clone en France, en Angleterre, au Pays de

Galle et au Danemark(Le Hello et al. 2011).Ce clone bactérien a été isolé de matrices alimentaires

comme de la viande, des épices ou des produits aquatiques, mais aussi de reptiles et de

prélèvements environnementaux (rivière, compost) (Le Hello et al. 2013).


31

II.2. Flore bactérienne cultivable des produits de la pêche et de

l’aquaculture

La flore bactérienne non pathogène présente dans les produits aquatiques est peu décrite

dans la littérature scientifique. Les quelques travaux ont montré que l’environnement (température,

salinité, …) impacte la composition de cette flore bactérienne. Il a été établi que les saisons influaient

la composition des flores bactériennes des poissons. En hiver, la flore digestive des saumons est

dominée par les bactéries à Gram positif et, en été, elle est dominée par les Vibrionaceae (Tarnecki

et al. 2017). En effet, les poissons, mollusques et crustacés sont des animaux dont la température

interne est variable et donc la flore bactérienne associée à ces animaux est également dépendante

de la température du milieu (Liston 1957, Georgala 1958, Chen et al. 2016). Il a été également

montré que la salinité de l’eau influence les flores bactériennes isolées des animaux marins. En effet,

les bactéries du genre Vibrio sont isolées des animaux marins (Kueh et Chan 1985, Tarnecki et al.

2017) tandis que celle du genre Aeromonas sont plus spécifiques aux animaux d’eau douce (Tarnecki

et al. 2017). De plus, l’origine géographique influe également la composition des flores bactériennes.

Par exemple, les bactéries du genre Vibrio sont associées aux animaux des eaux chaudes (Al-Harbi et

Uddin 2005, Baker-Austin et al. 2017). Les animaux vivants près des côtes comme les mollusques et

les poissons côtiers sont soumis directement aux pollutions microbiologiques anthropiques comme

bactéries les fécales par rapport aux animaux de pleine mer comme le cabillaud.

Par ailleurs, la position de l’animal dans la colonne d’eau peut également avoir un impact sur

sa flore bactérienne : les espèces benthiques comme les poissons plats et les mollusques bivalves

sont en contact avec la flore bactérienne sédimentaire, alors que les espèces pélagiques comme le

thon ne le sont pas (Figure 3). La composition des flores des animaux aquatiques semble donc être

multifactorielle, ce qui ne permet pas aux chercheurs de différencier une flore allochtone

(transitoire) d’une flore autochtone (résidente) (Cahill 1990, Austin 2006, Lyons et al. 2017, OIE


32

2017a). Cependant certains auteurs émettent l’hypothèse d’une notion d’une flore de base, c’est-à-

dire que la diversité et la prévalence de certains genres bactériens sont spécifiques à des espèces ou

des groupes d’espèces d’animaux aquatiques (Georgala 1958, Kueh et Chan 1985, Larsen et al. 2013,

Tarnecki et al. 2017).

Figure 3: Lieu de vie des produits de la pêche ©IFREMER.

La plupart des études se concentrent sur le tube digestif des poissons d’élevage et de son

rôle en aquaculture sur la croissance des poissons (Leroi 2010). Pourtant, la chair des poissons est

considérée stérile et la contamination bactérienne se fait par contamination croisée avec la peau, les

branchies et/ ou le tube digestif lors de leur manipulation. Quelques études également ont décrit la

flore bactérienne isolée de la peau et des branchies des poissons issus de la pêche. Liston et al.

(1957) ont décrit la flore bactérienne de limandes (Pleuronectes microcephalus) pêchées au large de

l’Ecosse. Il a montré la présence de bactéries du genre Pseudomonas (57 %), Achromobacter (16,7

%), Alcaligenes (9,5 %), Flavobacterium (9,5 %) sur la peau. Ils ont montré que la flore bactérienne

dans les branchies et sur la peau étaient la même, mais pas celle présente dans le tube digestif. En

effet dans le tube digestif, les proportions bactériennes étaient différentes : Pseudomonas (34,6 %),


33

Achromobacter (7,7 %), Alcaligenes (1,9 %), Flavobacterium (9,6 %). De plus ils ont montré la

présence des bactéries du genre Vibrio (34,6 %) et Corynebacterium (5,8 %) (Liston 1957). Georgala

et al. (1958), dans les mêmes conditions expérimentales, ont décrit sur la peau de cabillaud la même

flore bactérienne que sur la peau de limande. Ils ont montré en plus la présence des bactéries des

genres Vibrio (4,7 %), Corynebacterium (5,1 %) et Micrococcus (0,9 %). Le constat était le même pour

des poissons provenant de la Baie de Seattle. Les flores bactériennes de la peau et des branchies

étaient proches et il y avait une différence avec celle du tube digestif. Les genres bactériens décrits

étaient les mêmes que ceux isolés de limande et de cabillaud dans des proportions proches.

Cependant quelques genres supplémentaires ont été décrits comme Bacillus, Aeromonas, Proteus,

Brevibacterium, Arthrobacter, Photobacterium et Enterobacter mais ils étaient minoritaires (Colwell

1962). Des bactéries des genres Pseudomonas, Psychrobacter, Proteus, Vibrio, Pseudoalteromonas,

Shewanella, Vagococcus, Staphylococcus, Oceanisphaera, Synechococcus, Bizoni et Bacillus ont été

isolées de la peau, des branchies et des intestins de maquereaux d’Atlantique Nord sur une gélose

(Svanevik et Lunestad 2011). L’ensemble de ces flores décrites sont dominées par les bactéries à

Gram négatif : Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Cytophaga, et les

genres appartenant à la famille des Enterobacteriaceae. Toutefois dans d’autres travaux des

bactéries à Gram positif appartenant aux genres Micrococcus, Bacillus et Corynebacterium ont été

également isolées (Cahill 1990, Austin 2006, Leroi 2010).

Dans la flore bactérienne des mollusques bivalves, les genres bactériens fréquemment isolés

étaient Pseudomonas, Vibrio, Acinetobacter, Corynebacterium, Alcaligenes, Micrococcus, Bacillus

(Colwell et Liston 1960, Kueh et Chan 1985, Linton et al. 2003, Cruz-Romero et al. 2008, Cao et al.

2009, Amadi 2015). Cependant, les proportions de ces genres bactériens étaient différentes selon les

études. Par exemple, les bactéries du genre Pseudomonas représentaient 50 % des souches isolées

de moules et d’huîtres de Hong-Kong (Kueh et Chan 1985), 10 % des isolats de coquilles Saint-

Jacques et de moules, 20 % des isolats d’huîtres prélevées en Chine (Cao et al. 2009). La présence

d’Enterobacteriaceae était également fréquente dans la flore bactérienne des mollusques bivalves.


34

Des souches d’E. coli et de Proteus spp. étaient notamment identifiées dans deshuîtres (Amadi 2015).

Cependant, une identification plus précise que la famille Enterobacteriaceae était rarement faite

(Linton et al. 2003, Cruz-Romero et al. 2008, Cao et al. 2009, Amadi 2015). D’autres genres

bactériens, comme Moraxella et Lactobacillus peuvent être isolés de moules, d’huîtres et de Saint-

Jacques, Flavobacterium et Staphylococcus de moules et d’huîtres, Leuconostoc isolés de moules et

de Saint-Jacques (Kueh et Chan 1985, Linton et al. 2003, Amadi 2015). De plus, dans certaines études,

des souches de Shewanella et Enterococcus ont été isolées dans des huîtres (Colwell et Liston 1960,

Cao et al. 2009).

Les crustacés sont un sous-embranchement des arthropodes. Ils possèdent une carapace de

chitine. Ce polymère facilite l’adhésion de certains genres bactériens comme Vibrio (Carman et

Dobbs 1997). Les études décrivant la flore bactérienne des crustacés sont peu nombreuses et ne

concernent que les crevettes. Cependant, les bactéries des genres Bacillus et Staphylococcus étaient

systématiquement isolées, comme les bactéries appartenant aux bactéries lactiques (Enterococcus,

Lactococcus, Lactobacillus) et aux Enterobactericeae (Proteus, Serratia, Escherichia, Enterobacter)

(Heinsz et al. 1988, Linton et al. 2003, Broekaert et al. 2013, Dabadé et al. 2016). Les genres

Acinetobacter, Moraxella, Pseudomonas, Micrococcus, Corynebacterium, Flavobacterium,

Exiguobacterium étaient également fréquemment isolés dans les crevettes (Heinsz et al. 1988, Linton

et al. 2003, Broekaert et al. 2013, Dabadé et al. 2016). Les bactéries des genres Aeromonas, Vibrio,

Alcaligenes ont été isolées plus spécifiquement de crevettes pêchées en mer d’Irlande (Linton et al.

2003), Chryseobacterium, Loktanella, Planococcus, Pseudoalteromonas, Psychrobacter de crevettes

pêchées en Mer du nord (Broekaert et al. 2013) et Kurthia, Macrococcus, de crevettes d’élevage

Béninois (Dabadé et al. 2016).

II.3. Résistance aux antibiotiques de la flore des produits aquatiques

La présence de résistance acquise aux antibiotiques dans la flore bactérienne, qu’elle soit

pathogène ou non pathogène, des produits de la pêche et de l’aquaculture présente un risque de


35

transmission de gènes de résistance des bactéries présentes dans l’aliment à celles du tube digestif

humain. Ce phénomène peut alimenter le réservoir de gènes de résistance que constitue le

microbiote humain à partir du réservoir animal (Broaders et al. 2013). Ces gènes de résistance

peuvent être mobilisés ultérieurement de ce réservoir par une bactérie pathogène. De plus, les

individus porteurs de résistance peuvent la diffuser dans leur environnement.

Quelques travaux scientifiques ont mis en évidence la présence de bactéries porteuses de

résistance aux antibiotiques dans les produits aquatiques. Une étude canadienne a décrit une

nouvelle carbapénémase, VCC-1, dans des souches de Vibrio cholerae isolées de crevettes

disponibles à la consommation (Mangat et al. 2016). Une autre étude a mis en évidence la présence

d’un gène de carbapénémase blaIMI chez Enterobacter cloacae et Enterobacter aerogenes isolés de

crevettes en provenance d’Asie du Sud-Est (Janecko et al. 2016). De plus, une souche E. coli

productrice de VIM-1 et une souche E. cloacae productrice de NDM-1 ont été isolées de palourdes

importées, d’Italie vers l’Allemagne pour la première, du Vietnam vers le Canada pour la seconde

(Janecko et al. 2016, Roschanski et al. 2017). Des résistances à d’autres classes d’antibiotiques ont

été retrouvées dans ces souches, notamment aux aminosides, quinolones, phénicolés et sulfamides

(Janecko et al. 2016, Roschanski et al. 2017). En 2014, une équipe canadienne a mis en évidence une

souche de Pseudomonas spp, isolée d’un calamar, produisant la carbapénémase VIM-2 (Joseph et al.

2014). Une étude japonaise a mis en évidence des souches Aeromonas hydrophila, isolées de

palourdes, de poisson empereur et de dorade japonaise, porteurs la β-lactamase blaPSE-1 et de gènes

de résistance aux aminosides et au triméthoprime (Ahmed et al. 2015). De plus, dans une ferme

aquacole française, au moment de l’abattage de truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), des

souches Aeromonas spp résistantes aux quinolones, sulfamides, aminosides et triméthoprime ont été

isolées (Naviner et al. 2011). De même, une bactérie du genre Citrobacter porteuse de β-lactamase

blaOXA-48 et des bactéries de l’ordre des Enterobacteriales porteuses de gènes de résistance aux

tétracyclines, et aux inhibiteurs de la synthèse des folates ont également été isolées des poissons

d’élevage en Lituanie (Ruzauskas et al. 2018).


36

II.4. Techniques d’isolement et d’identification de la flore bactérienne

des produits aquatiques

Les conditions expérimentales des études sur la flore bactérienne des produits aquatiques

sont très différentes et dépendent des bactéries recherchées. Pour des études portant sur la flore

totale, des géloses non sélectives, comme des géloses trypcase soja (TSA), Plate Count Agar (PCA) ou

de l’eau de mer gélosé (SWA) peuvent être utilisées (Liston 1957, Svanevik et Lunestad 2011,

Broekaert et al. 2013). Pour des études portant sur des flores spécifiques (altération, contamination

fécale, pathogène pour l’animal,…) des géloses sélectives peuvent être utilisées pour les cibler. Par

exemple la gélose Iron Agar Lyngby est utilisée pour sélectionner les bactéries productrices de H2S, la

gélose de Man Rogosa Sharp (MRS) pour sélectionner la flore lactique, le milieu thiosulfate-citrate-

bile-saccharose (TCBS) pour isoler les bactéries du genre Vibrio ou encore la gélose glutamate starch

red phenol (GSP) pour isoler les bactéries du genre Aeromonas (Heinsz et al. 1988 , Linton et al. 2003,

Al-Harbi et Uddin 2005, Svanevik et Lunestad 2011, Broekaert et al. 2013, Dabadé et al. 2016, Baron

et al.).

Les températures d’incubation des géloses ont également un rôle dans la sélection des

bactéries. Elles s’échelonnent de 0 à 37 °C (Georgala 1958, Heinsz et al. 1988, Linton et al. 2003,

Broekaert et al. 2013, Dabadé et al. 2016). Une étude montre que la flore cultivable des produits

aquatiques est moins importante à 37°C qu’à des températures inférieures à 20°C (Georgala 1958).

En effet, les animaux aquatiques étant des animaux à « sang-froid », leur température corporelle

dépend de la température de l’eau et la flore bactérienne associée à ces animaux est donc également

dépendante de cette température. C’est pourquoi, la plupart des études sur la flore des produits

aquatiques se font entre 0°C et 25°C(Liston 1957, Georgala 1958, Kueh et Chan 1985, Austin 2006).

En outre, les températures basses, comme par exemple le 8°C, sont utilisées pour étudier la flore

d’altération de ces produits (Leroi et al. 1998). La température de 37°C est utilisée pour sélectionner

les bactéries pouvant se développer chez les animaux à sang-chaud, dont l’Homme. Cette

température est utilisée pour détecter des bactéries pathogènes pour l’homme ou des marqueurs de


37

contamination fécale. De plus, les temps d’incubation sont impactés par la température utilisée. En

général, plus la température est basse, plus le temps d’incubation est long, de 24 h jusqu’à deux

semaines, selon les études (Liston 1957, Georgala 1958, Kueh et Chan 1985, Austin 2006).

Les premiers travaux réalisés sur l’identification de la flore bactérienne ont utilisé des critères

morphologiques et biochimiques qui sont toujours utilisés (Liston 1957, Georgala 1958, Al-Harbi et

Uddin 2005, Hoel et al. 2015). Tout d’abord, la morphologie des colonies sur les géloses, et leur

couleur, permet de discriminer des colonies bactériennes selon des caractères biochimiques. Par

exemple sur la gélose GSP, les bactéries du genre Aeromonas sont jaunes et celles du genre

Pseudomonas sont mauves, ou alors les souches produisant du H2S sont noires sur les géloses TCBS

et Iron lyngy Agar. Ensuite, l’identification des souches est confirmée par des examens en

microscopie (coloration de Gram, mobilité, forme, …) et la réalisation des tests biochimiques

(catalase, oxydase, fermentation, utilisation de sucre,….). Ces tests ont été miniaturisés et

commercialisés, les galeries API® étant les plus anciennes (Smith et al. 1972, Janin 1973). Ces

systèmes nécessitent un temps d’incubation pour que les caractères de la bactérie puissent

s’exprimer (Janin 1973). Les techniques biochimiques sont très utilisées dans les laboratoires en

routine pour identifier les bactéries, mais elles ne sont utilisables que pour les bactéries dont les

caractéristiques biochimiques ont été décrites. Il est donc nécessaire de savoir quelles espèces

bactériennes sont recherchées. Aujourd’hui, il existe des appareils, VITEK® 2 Compact, BD Phoenix™,

permettant l’automatisation de la manipulation et de la lecture (BD , Biomerieux). En parallèle, des

techniques d’identification basées sur l’amplification et le séquençage de gènes de ménage et basées

sur l’analyse de spectres protéiques par spectrométrie ont été développées.

Les méthodes moléculaires s’appuient sur l’amplification et le séquençage de gènes de

ménage et la comparaison des séquences à des bases de données comme celles du National Center

for Biotechnology Information (NCBI) ou European Molecular Biology Laboratory (EMBL). Les gènes

de ménage sont présents dans le génome bactérien avec des séquences qui peuvent être spécifiques


38

à une espèce bactérienne. C’est le cas par exemple des gènes de l’ARNr16S, gyrA, gyrB, rpoA, rpoB,

rpoC, rpoD (Mollet et al. 1997, Drancourt et al. 2000, Das et al. 2014). Le gène le plus utilisé pour

identifier les espèces bactériennes est celui de l’ARNr16S (Drancourt et al. 2000). Cependant, ce gène

est présent en plusieurs copies sur le chromosome bactérien avec des séquences hétérogènes et

l’amplification de ces copies va entrainer l’apparition de séquences chimériques. Ces séquences

seront différentes de celles présentes sur les génomes de référence (Wang et Wang 1997). Cela

entraine une perte de précision dans l’identification bactérienne. L’utilisation de ce gène de ménage

pour l’identification d’une souche à l’espèce bactérienne n’est pas « garantie », notamment pour les

souches appartenant à la famille des Enterobacteriaceae ou au genre Bacillus (Fox et al. 1992, Mollet

et al. 1997, Das et al. 2014). Le séquençage des autres gènes de ménage a été principalement utilisé

pour discriminer des espèces proches au sein d’un même genre bactérien, comme le gène gyrB qui a

été utilisé pour identifier les espèces du genre Pseudomonas (Yamamoto et Harayama 1995, Das et

al. 2014). Cependant, il n’existe pas d’amorces universelles permettant d’identifier tous les genres et

espèces bactériennes. Il est nécessaire de cibler les genres bactériens que l’on veut identifier pour

savoir quel(s) gène(s) et quelles amorces utiliser pour l’amplification et le séquençage.

Les techniques de spectroscopie sont des techniques d’identification bactérienne récentes.

La plus utilisée pour l’identification bactérienne est le Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization

Time Of Flight ou MALDI-TOF. Cette technique permet d’obtenir un spectre protéique pour une

souche bactérienne. Ce spectre est comparé à des spectres de référence, cela permet l’identification

au genre ou à l’espèce. Cette technique est plus simple à mettre en place que l’amplification et le

séquençage des gènes de ménage. En effet, pour avoir un spectre protéique, il faut cultiver la souche

bactérienne, en extraire les protéines puis déposer les échantillons pour l’analyse dans l’appareil . De

plus, l’interprétation des résultats est automatisée par l’appareil. Cependant, les bases de données

des spectres de référence sont aujourd’hui construites avec des profils de souches cliniques et ceux

des souches environnementales et alimentaires sont peu présents. De plus, les spectres sont

dépendant des protocoles de préparation des échantillons et donc les comparaisons avec les


39

spectres de référence ne peuvent se faire qu’avec un protocole identique (Bohme et al. 2010, Bohme

et al. 2011). D’autres techniques de spectroscopie existent comme la spectroscopie Raman et

infrarouge, mais elles sont peu développées et il n’existe ni de standardisation des protocoles, ni de

bases de données de spectres validées (Quintelas et al. 2018).

III. La résistance aux antibiotiques : Dissémination et détection

Dans ses travaux Sir Alexander Fleming a observé des espèces bactériennes naturellement

insensibles à la pénicilline (Fleming 1929). Ces résistances sont naturelles et sont caractéristiques de

toutes les souches d’une espèce bactérienne. Par exemple, toutes les bactéries à Gram négatif sont

résistantes aux glycopeptides car la membrane externe est imperméable à ces molécules. Toutes les

bactéries à Gram positif sont résistantes aux polymyxines, car la molécule ne pénètre pas à travers

leur peptidoglycane épais. Pour le traitement d’infection avec ces bactéries les antibiotiques

correspondant aux résistances naturelles ne sont pas prescrits et il n’est pas utile de surveiller la

résistance à ces antibiotiques car, si la bactérie est identifiée, ces résistances sont constitutives.

Au contraire, Sir Alexander Fleming et Selman Waksman ont observé, qu’en cultivant des

bactéries avec des concentrations non létales d’antibiotiques (pénicilline et streptomycine) elles

avaient acquis une résistante à des concentrations thérapeutiques de ces molécules (Fleming 1945,

Waksman 1952). Ces résistances acquises, au contraire des résistances naturelles, sont des

caractères phénotypiques non-constitutifs. De plus, entre 1959 et 1961, des études japonaises

mettent en évidence le transfert de résistance aux antibiotiques par contact entre Shigella spp. et

Escherichia coli (Hawkey 2018). Ce mécanisme sera appelé conjugaison bactérienne, et il montre le

potentiel de diffusion des résistances aux antibiotiques. Les bactéries peuvent cumuler des

résistances à différentes familles d’antibiotiques. Lorsqu’une souche bactérienne acquiert au moins 3

résistances à des familles d’antibiotiques auxquelles elle est naturellement sensible, elle est dite

multi-résistante (Magiorakos et al. 2012). Dans le cadre d’un traitement, une résistance acquise à

l’antibiotique prescrit peut entrainer un échec thérapeutique. Par exemple en 1940, Abraham et al.


40

(1940) ont découvert un mécanisme de résistance à la pénicilline, la production d’une enzyme

inactivant cette molécule, qu’ils appellent pénicillinases. Alors que l’introduction de la pénicilline

dans les années 1940 a permis de diminuer la mortalité des infections dues à Staphylococcus aureus,

la moitié des souches de cette espèce bactérienne étaient résistantes à la pénicilline à la fin de cette

décennie (Long 1952). À la fin des années 1960, 80 % des souches de Staphylocococus aureus étaient

résistantes à la pénicilline et aujourd’hui 90 % des souches de S. aureus sont productrices de

pénicillinase. Cet antibiotique n’est plus recommandé pour traiter les infections à S. aureus (Lowy

2003, Cattoir et Leclercq 2012). En 2015, le gène mcr-1, qui confère une résistance à la colistine a été

décrit dans des souches d’E. coli et de Klebsiella pneumoniae isolées de l’homme et d’animaux

d’élevage (Liu et al. 2016). Ce gène risque de diminuer l’efficacité de la colistine, qui est un

antibiotique de dernier recours dans le traitement des infections à bactérie Gram négatif multi-

résistante. Les résistances aux antibiotiques acquises sont au cœur de l’enjeu de santé publique que

représente la résistance aux antibiotiques.

Les bactéries peuvent devenir résistantes grâce à plusieurs mécanismes. Elles peuvent

acquérir des mutations sur un gène ou le système de régulation de l’expression des gènes. Par

exemple, la résistance aux quinolones peut s’obtenir en cumulant des mutations sur les sous-unités

de l’ADN gyrase et la topo-isomérase IV qui sont les cibles de cette famille d’antibiotique (Hawkey

2003). Les souches de Pseudomonas aeruginosa acquièrent des résistances à des antibiotiques de

familles différentes par la surexpression des systèmes d’efflux (Courvalin et Leclercq 2012). Ces

résistances sont transmises aux cellules filles, la transmission est dite verticale. Ces résistances

peuvent apparaître chez toutes les espèces bactériennes.

Elles peuvent aussi acquérir des gènes exogènes par transfert de gènes horizontaux. Le

mécanisme principal de transfert horizontal de gènes est la conjugaison bactérienne. Par ce

mécanisme les bactéries se transfèrent des éléments génétiques mobiles. Ces éléments peuvent

porter des gènes de résistance et participer à la diffusion de la résistance aux antibiotiques. Les


41

autres mécanismes de transfert de gènes entre bactéries connus sont la transduction, qui met en jeu

la dissémination de gènes bactériens par les bactériophages et la transformation, qui permet

l’incorporation d’ADN libre dans le milieu dans le génome bactérien (Davies et Davies 2010).

III.1. Les éléments génétiques mobiles et les intégrons

Les éléments génétiques mobiles sont des fragments d’ADN capables de se mouvoir au sein

d’un même génome ou d’un génome bactérien à un autre. Les structures connues sont les plasmides,

les îlots génomiques et les transposons. Les intégrons ne sont pas des structures mobiles, mais ce

sont des systèmes de capture de gènes pouvant cumuler des gènes de résistance.

III.1.A. Les Plasmides

Les plasmides sont des molécules d’ADN circulaires extra-chromosomiques ayant une taille

allant de quelques kilobases à plus de plusieurs centaines de kilobases. Plus de 4400 plasmides

bactériens entièrement séquencés sont disponibles dans la base de données Plasmid Genome du

NCBI (Shintani et al. 2015). Les plasmides peuvent être conjugatifs, c’est-à-dire qu’ils possèdent dans

leur séquence les gènes codant pour la machinerie nécessaire à la conjugaison, ou mobilisables,

c’est-à-dire qu’ils ne possèdent pas de système de conjugaison dans leur séquence. Pour leur

transfert par conjugaison ils dépendent de la machinerie d’un élément conjugatif. Selon les travaux

de Smilie et al. (2010), environ 15 % des plasmides séquencés seraient conjugatifs et 24 % serait

mobilisables. La réplication des plasmides est autonome et indépendante de celle du chromosome

bactérien. Il existe différents systèmes de réplication plasmidique, et des plasmides possédant le

même système de réplication ne peuvent pas coexister dans la même cellule bactérienne, ils sont

dits incompatibles. Les plasmides sont classés par groupe d’incompatibilité (Inc). Actuellement, 28

groupes d’incompatibilité ont été définis dans la famille Enterobacteriaceae, 14 dans le genre

Pseudomonas et 18 dans le genre Staphylococcus (Shintani et al. 2015).


42

Les plasmides ne sont pas nécessaires à la survie de la bactérie, mais ils peuvent porter des

gènes ayant un rôle dans l’adaptation des bactéries à leur environnement (virulence, résistance aux

métaux et aux antibiotiques…).

III.1.B. Les ilôts génomiques : integrative and conjugative element (ICE) et

integrative and mobilisable element (IME)

Les îlots génomiques sont des éléments génétiques capables de s’intégrer et de s’exciser du

chromosome bactérien ou des plasmides (Wozniak et al. 2009, Bellanger et al. 2014). Comme pour

les plasmides certains îlots génomiques ont la capacité de conjuguer, ce sont les integrative and

conjugative elements, ou ICE. D’autres sont mobilisables, ce sont les integrative and mobilizable

elements. À la différence des plasmides, les ICEs et les IMEs ne peuvent pas se répliquer de manière

autonome, ils dépendent de la réplication du support génétique dans lequel ils sont intégrés. Leurs

tailles s’échelonnent de quelques dizaines de kilobases à plus de 600 kilobases (Bellanger et al. 2014,

Bañuelos-Vazquez et al. 2017, Burrus 2017, Cury et al. 2017).

Les ICEs comme les IMEs peuvent être porteur de gènes de résistance aux antibiotiques et

être acteurs dans la dissémination des résistances aux antibiotiques. Dans leurs travaux, Bellanger et

al. (2014) ont relevé 18 ICEs et 11 IMEs décrits dans la littérature portant des gènes de résistance aux

antibiotiques. L’ICE et l’IME Salmonella genomic island 1 (SGI1) sont les îlots génomiques associés à

de la multirésistance (Bellanger et al. 2014).

L’ICE SXT, fait partie de la famille des ICEs SXT/R391. L’îlot SXT a été découvert au sein

d’isolats cliniques de Vibrio cholerae O139 du sous-continent Indien qui leur a conféré la résistance

aux sulfamides, triméthoprime, chloramphénicol et à la streptomycine (Waldor et al. 1996). Ils ont

été ensuite regroupés avec les éléments génétiques R391, avec lesquelles ils avaient une structure

génétique et un fonctionnement proche (Beaber et al. 2002, Bioteau et al. 2018). L’élément R391 a

été découvert en 1967 en Afrique du Sud dans une souche de Providencia rettgeri et il conférait la

résistance à la kanamycine et au mercure (Coetzee et al. 1972). Une étude in silico sur 68 ICEs de


43

cette famille a montré qu’il y en existait 4 types. Le type 1 comprend tous les ICEs s’insérant dans le

gène prfC et sont trouvés dans les génomes des Enterobacteriaceae et Vibrionaceae. Les ICEs de type

2, 3 et 4 s’intègrent dans le gène codant pour l’ARNt-Ser et ils ont été décrits dans le génome

d’espèces de Vibrio (Bioteau et al. 2018). L’activation de la réponse SOS de la cellule hôte induit

l’excision de ces ICEs du chromosome bactérien leur transfert vers une nouvelle cellule (Beaber et al.

2003).

L’îlot génomique SGI1 a été décrit pour la première fois dans une souche de Salmonella

enterica sérovar typhimurium de lysotype DT104. Cet IME confère une résistance aux

aminopénicillines, aminosides, phénicolés, sulfamides et tétracyclines (Boyd et al. 2001). Il s’intègre

dans le chromosome bactérien en 3’ du gène trmE, et il a été montré qu’il pouvait également

s’intégrer, in vitro, au niveau des gènes sodB et purR. Ne possédant pas de machinerie pour

conjuguer, la mobilité de SGI1 est dépendant d’un élément conjugatif. Drouet et al. (2010) ont

montré que les plasmides de type IncA/C sont capables de le mobiliser. Cet îlot génomique a

également été décrit dans les génomes d’autres sérovars de Salmonella enterica dont Salmonella

enterica sérotype Kentucky, mais il a aussi été détecté dans des souches de Proteus mirabilis (Ahmed

et al. 2007, Le Hello et al. 2013).

III.1.C. Transposon

Les transposons sont les principaux éléments génétiques mobiles intracellulaires. Ils sont

caractérisés par la présence d’un gène codant pour une transposase et flanqués de deux séquences

inversées répétées. L’ensemble est appelé séquence d’insertion (IS). La transposase de l’IS reconnait

et coupe de manière spécifique les séquences inversées répétées. Deux IS peuvent encadrer des

gènes de résistance aux antibiotiques, ce sont des transposons composites (Siguier et al. 2006). La

mobilité de ces transposons composites se fait par l’activité combinée des deux IS. Ce mécanisme

permet aux résistances de se déplacer au sein du génome bactérien, entre le chromosome et des

plasmides ou entre des éléments génétiques mobiles par exemple. Les transposons dépendent de


44

leur support pour se déplacer d’une cellule à une autre. De plus, des gènes de résistance naturelle

présents sur un chromosome bactérien peuvent être recrutés par ce mécanisme. En effet, la β-

lactamase chromosomique OXA-48 a été recrutée depuis le chromosome des bactéries du genre

Shewanella par un transposon composite Tn1999 vers des plasmides. Les plasmides ont ensuite

diffusé dans les Enterobacteriaceae (Poirel et al. 2012b).

III.1.D. Les intégrons

Les intégrons sont des structures génétiques de capture et d’expression de gènes, qui sont

sous forme de cassette (Gillings 2014). Ils possèdent au minimum un gène codant pour une intégrase

(intI) permettant d’intégrer et exciser les gènes cassettes, un site de recombinaison (attI) où les

cassettes s’intègrent et un promoteur (Pc) permettant l’expression des gènes cassettes (Gillings

2014). Les intégrons sont classés selon la séquence de leur intégrase, mais plus d’une centaine de

variants du gène existent (Gillings 2014).Les cassettes de gène sont de petites molécules d’ADN

codant pour un gène et possédant un site de recombinaison attC. Ce site permet l’intégration de la

cassette dans l’intégron par recombinaison avec le site attI (Partridge et al. 2009). Le niveau

d’expression des cassettes diminue de façon proportionnelle avec son éloignement du promoteur Pc

(Jove et al. 2010). Les cassettes sont un réservoir de gènes pour des fonctions diverses, plus de 65 %

des gènes compris dans ces cassettes n’ont pas d’homologues connus dans les bases de données

(Boucher et al. 2007). De plus, au moins 130 cassettes portant un gène de résistance aux

antibiotiques ont été décrits (Partridge et al. 2009). Les intégrons peuvent être chromosomiques, ils

sont notamment présents sur les chromosomes des bactéries du genre Vibrio ou Pseudomonas

(Rowe-Magnus et al. 2003, Gillings 2014). D’autres intégrons sont présents sur des éléments

génétiques mobiles comme des transposons, îlots génomiques ou plasmides. Ils dépendent de leur

support pour disséminer au sein de population bactérienne. Cinq classes d’intégrons sont présents

sur des éléments génétiques mobiles et sont associés avec des cassettes de gènes de résistance aux

antibiotiques. Les intégrons de classe 1, 2 et 3 sont les plus étudiés (Partridge et al. 2009, Barraud et

al. 2010). Ces intégrons peuvent cumuler 4 à 5 cassettes et, par leur présence sur des éléments


45

génétiques mobiles, participer à la diffusion des résistances aux antibiotiques et des cassettes de

gènes associées (Domingues et al. 2012). Ils sont utilisés comme des marqueurs de l’acquisition de

résistance aux antibiotiques dans l’environnement (Stalder et al. 2012)

III.1.E. Imbrication des éléments génétiques mobiles

Les gènes de résistance, les intégrons et les éléments génétiques mobiles peuvent être

imbriqués les uns dans les autres comme des matriochka, donnant des structures mosaïques. Le

plasmide R100, porteur de plusieurs gènes de résistance, en est un bon exemple. D’un côté les gènes

de résistance à la tétracycline tet (R), tet (A), tet (C) et tet (D) sont sur un transposon Tn10 qui est

dans le plasmide. De l’autre côté, les gènes de résistance aux sulfamides sul1 et aux aminosides

aadA1 sont dans un intégron de type 1 qui est lui-même dans un transposon Tn402. Ce dernier est

inclus, avec un opéron de résistance au mercure mer, dans un autre transposon Tn21 qui est lui-

même intégré dans un transposon Tn9 avec le gène cat qui donne une résistance aux phénicolés.

Cette dernière structure est portée par le plasmide (Figure 4).

Figure 4: Structure mosaïque du plasmide R100. En jaune les gènes de résistance aux tétracyclines, en jaune-orangé le gène de résistance aux aminosides (aadA1), en orange le gène de résistance aux désinfectants (qacE), en rose vif le gène de résistance aux sulfamides (sul1) et en rose pâle le gène de résistance aux phénicolés (cat). En marron rayé verticalement l’opéron de résistance au mercure (mer). Les différents bleus montrent les différentes structures portant les gènes de résistance (Gillings et Stokes).


46

III.2. La transduction et la transformation

La transduction est un mécanisme de transfert d’ADN entre bactérie par les bactériophages.

Ce mécanisme résulte de l’encapsidation d’ADN non viral lors du cycle lytique des bactériophages. Ce

mécanisme de transmission de gènes de résistance joue un rôle dans la dissémination de la

résistance aux antibiotiques. Volkova et al. (2014)ont estimé, par un modèle mathématique, que la

fréquence de transmission des gènes de résistance est 1000 fois moins élevée par le phénomène de

transduction que par la conjugaison bactérienne.

En parallèle, des travaux ont montré que les gènes de résistance tet(A), aphA1, floR et blaTEM

ont été transférés par transduction de souches d’E. coli isolées de viande de poulet vers des souches

sensibles aux antibiotiques (Shousha et al. 2015). De plus, deux phages conférant à Bacillus anthracis

la résistance à la fosfomycine ont été décrits. Ce sont les seuls bactériophages connus portent dans

leur génome un facteur de résistance aux antibiotiques (Schuch et Fischetti 2006, Enault et al. 2017).

La transformation est l’acquisition d’ADN libre (chromosomique ou plasmidique) présent

dans l’environnement de la bactérie (Lorenz et Wackernagel 1994). Si les morceaux d’ADN

contiennent des gènes de résistance aux antibiotiques, ils sont ajoutés au génome bactérien. De plus,

il peut aussi y avoir une recombinaison entre la molécule d’ADN acquis et celle de la bactérie. Ce

mécanisme permet la formation de séquences mosaïques. Les bactéries du genre Streptococcus sont

capables d’acquérir des fragments d’ADN codant pour la PLP d’autres Streptococcus. En recombinant

ces fragments d’ADN avec son gène codant pour une PLP, il en résulte une séquence mosaïque.

L’expression de ce gène mosaïque peut conférer une résistance aux β-lactamines (Spratt 1994). Des

travaux ont montré que les bactéries du genre Vibrio étaient capables d’acquérir des plasmides libres

et d’exprimer la résistance aux aminosides qu’ils codaient à des fréquences allant de 10-7 à 10-10

transformant par cellule réceptrice (Frischer et al. 1990, Paul et al. 1991). D’autres genres bactériens

ont montré des capacités de transformation dont les espèces du genre Aeromonas, Bacillus et

Salmonella mais aussi pour des souches des espèces E. coli (Lorenz et Wackernagel 1994, Huddleston


47

et al. 2013). Cependant, la transformation bactérienne nécessite que les cellules bactériennes soit

dans un état physiologique permettant d’assimiler de l’ADN exogène, si c’est le cas elles sont dites

compétentes (Lorenz et Wackernagel 1994).

III.3. Diffusion des bactéries résistantes aux antibiotiques et

sureveillance

Les mécanismes de sélection et de dissémination des résistances acquises aux antibiotiques

sont complexes et multifactorielles (Webb et al. 2017). C’est pourquoi la surveillance de la résistance

aux antibiotiques est importante pour suivre l’émergence et l’évolution des résistances acquises au

sein des populations bactériennes.

En 2015, en Chine, lors d’un programme de surveillance de la résistance aux antibiotiques de

souches d’E. coli isolées d’animaux d’élevage, le premier gène de résistance à la colistine

transmissible, mcr-1 (Liu et al. 2016) a été démontré. Des études rétrospectives sur la prévalence du

gène mcr-1 ont montré que ce gène était déjà présent dans des souches d’E. coli isolées de volailles

depuis les années 1980 en Chine (Shen et al. 2016). Pendant les 20 ans qui ont suivi, ce gène n’a pas

été détecté. C’est à partir des années 2000 que ce gène a diffusé dans le monde. Il a été observé

dans des souches d’Enterobacteriaceae isolées d’animaux de rente et d‘aliments en Europe, en Asie,

en Afrique et en Amérique (Wang et al. 2018). L’alimentation est une des voies possible de

dissémination de ce gène entre l’animal et l’Homme. Des cas humains de personnes porteuses de ce

gène ont aussi été détectés chez l’Homme en Europe, Asie, Moyen-Orient, Amérique (Pham Thanh et

al. 2016, Webb et al. 2017). Des souches porteuses de mcr-1 ont également été isolées dans

l’environnement, à partir d’animaux sauvages et d’échantillons d’eau (Webb et al. 2017, Drali et al.

2018, Wang et al. 2018). Des études génétiques ont montré que le gène mcr-1 avait été mobilisé

dans un transposon composite ISApl1-mcr-1-orf-ISApl1 sur un plasmide (Wang et al. 2018). Cette

structure génétique a ensuite transposée sur des plasmides de type IncX4, IncI2 et IncHI2 pour

diffuser plus largement au sein de Enterobacteriaceae (Matamoros et al. 2017, Wang et al. 2018).


48

La diffusion de la β-lactamase blandm-1 est un autre exemple de diffusion de résistance aux

antibiotiques par des éléments génétiques mobiles. La diffusion de cette carbapénèmase est un

enjeu de santé publique car elle capable d’hydrolyser toutes les β-lactamines, dont les carbapénèmes

qui sont des antibiotiques de dernier recours. Elle a été décrite pour la première fois en Suède en

2008 dans une souche de Klebsiella pneumoniae isolée d’un patient revenant d’Inde (Yong et al.

2009). Les bactéries productrices de cette enzyme sont principalement décrites en Asie, au Moyen-

Orient et dans les Balkans (Dortet et al. 2014). Des travaux ont montré que ce gène se trouvait sur un

transposon composite Tn125. Ce transposon a été identifié dans des souches cliniques et

environnementales d’Enterobacteriaceae, d’Acinetobacter, et de Vibrio (Dortet et al. 2014). La

dissémination de ce gène n’est pas spécifiquement n’est pas liée spécifiquement à un plasmide, une

espèce ou une souche bactérienne.

En parallèle de la diffusion de la résistance aux antibiotiques par les éléments génétiques

mobiles, certaines souches bactériennes ayant acquis des résistances ont diffusé dans le monde. Le

cas de Salmonella enterica sérotype Kentucky ST198-X1 résistante à la ciprofloxacine en est un

exemple (Le Hello et al. 2011). Ce clone bactérien a été initialement isolé d’un élevage de volaille en

Egypte dans les années 1990 et n’avait pas acquis de résistance. Il a par la suite cumulé des

mutations sur les gènes gyrA et parC, le rendant résistant aux quinolones et il a acquis un îlot

génétique Salmonella Genomic Island (SGI) portant une région de multi-résistance aux antibiotiques

pénicillines, phénicolés, aminosides, sulfamides, cyclines. La présence d’ISVCh4 issue de Vibrio

cholerae dans l’îlot SGI montre que l’acquisition des résistances s’est faite dans le milieu aquatique,

plus précisément au sein d’un élevage aquacole qui produisait des farines de poissons pour nourrir

des volailles (Le Hello et al. 2011). A partir de 2002, la souche s’est disséminée à travers le monde au

sein de troupeaux de volailles, en 2006 en Ethiopie, en 2008 au Nigeria et au Maroc, en 2010 au

Bengladesh, en France, en Allemagne et en Pologne (Le Hello et al. 2013). Ce clone bactérien a

également été isolé de matrices alimentaires comme de la viande, des épices ou des produits


49

aquatiques, mais aussi de reptiles et de prélèvements environnementaux (rivière, compost) (Le Hello

et al. 2013).

Le risque lié à la dissémination de la résistance aux antibiotiques dans l’alimentation et dans

la chaîne de production alimentaire est pris en compte dans quelques régions du monde. En

Amérique du Nord, il y a les plans de surveillance du National Antimicrobial Resistance Monitoring

System (NARMS) aux Etats-Unis et du Canadian Integrated Program for Antimicrobial Resistance

Surveillance CIPARS au Canada. En Europe, depuis le milieu des années 2000, la commission

Européenne demande à l’European Food Safety Authority (EFSA) de recueillir les données sur la

résistance aux antibiotiques de bactéries pathogènes alimentaires pour l’Homme comme Salmonella

spp, Campylobacter coli et C. jejeuni dans les filières bovines, porcines, volaille (Commission

Européenne 2013). D’un autre côté, il est également demandé de surveiller la résistance aux

antibiotiques des bactéries commensales Escherichia coli et Enterococcus spp dans ces filières à

l’abattoir et au niveau de la distribution. Ces bactéries servent d’indicatrices de la résistance aux

antibiotiques de la flore bactérienne des produits carnés et des animaux d’élevage dont ils sont issus.

Toutefois, les plans de surveillance de la résistance aux antibiotiques ne concernent que les

filières animales terrestres : les volailles, les porcs et les bovins mais pas la filière des produits

aquatiques. La résistance aux antibiotiques de pathogènes alimentaires pour l’Homme comme

Listeria monocytogenes et Vibrio spp n’est pas surveillé par ces plans (EFSA et ECDC 2018). De plus,

les bactéries indicatrices du milieu terrestre E. coli ou Enterococcus spp. sont peu décrites dans les

flores des produits aquatiques. Elles ne peuvent pas être utilisées comme indicatrices de la résistance

aux antibiotiques dans les produits aquatiques. Les bactéries des genres Aeromonas et Vibrio ont été

proposées comme indicateur de la résistance aux antibiotiques pour le milieu aquatique (Banerjee et

Farber 2018).


50

III.4. Techniques de détection phénotypique et génotypique de la

résistance aux antibiotiques

III.4.A. Techniques de détection phénotypique

Les tests phénotypiques sont des tests in vitro permettant de visualiser la sensibilité d’une

souche bactérienne par rapport à un antibiotique. Le principe est de déterminer la plus petite

concentration d’antibiotique inhibant la croissance bactérienne, la concentration minimale inhibitrice

ou CMI de façon directe ou indirecte. Deux organismes internationaux ont standardisés des

protocoles pour tester la sensibilité de souches bactériennes aux antibiotiques par antibiogramme le

Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) et l’EUropean Comitee on Antimicrobial Susceptibility

Testing (EUCAST). Les protocoles ont été développés principalement pour les bactéries pathogènes

pour l’homme ou les animaux domestiques. Les conditions expérimentales sont les mêmes pour les

deux référentiels : utilisation du milieu Mueller-Hinton ou Mueller-Hinton supplémentée en sang,

une température d’incubation de 35 °C et un temps d’incubation de 16-20h (CLSI 2016b, EUCAST

2018).

La méthode de référence pour attester d’un phénotype de résistance est la microdilution en

milieu liquide (ISO 2007). Le principe est de soumettre une souche bactérienne à une gamme de

concentration croissante de l’antibiotique testé. La dernière concentration pour laquelle aucune

croissance bactérienne n’est détectée à l’œil nu correspond à la CMI pour l’antibiotique testé.

D’autres méthodes existent pour mesurer la CMI. Il y a la dilution en milieu solide. Le principe

est le même que pour la microdilution en milieu liquide, sauf que le milieu est gélosé (EUCAST 2000).

Cette différence entraîne des difficultés pour l’étude de certains antibiotiques comme la

daptomycine. En effet, l’activité de cet antibiotique varie en fonction de la concentration en ions

Ca2+, qui ne peut pas être maitrisée précisément dans un milieu gélosé (Courvalin et Leclercq 2012).

Enfin, en 1988, la société suédoise AB biodisk a mis au point une bandelette permettant de mesurer

la CMI par diffusion en milieu gélosé, le E-test®. L’antibiotique diffuse à partir d’une bandelette sur


51

laquelle différentes quantités d’antibiotiques ont été placées. Plusieurs gradients de concentration

vont se former, et une zone d’inhibition en forme d’ellipse va être créée. La bandelette est graduée

en fonction des CMI et la graduation où la limite de croissance croise la bandelette correspond à la

CMI (Hall et Parshall). Cette méthode n’est pas recommandée pour tester la résistance à certains

antibiotiques comme la colistine (EUCAST 2016).

Cependant la méthode la plus couramment utilisée en microbiologie clinique est la diffusion

en milieu gélosé (Courvalin et Leclercq 2012). Le principe est de déposer un disque imprégné d’une

quantité d’antibiotique connue sur une gélose préalablement ensemencée avec la souche à tester.

L’antibiotique va diffuser dans la gélose en créant un gradient de concentration autour du disque

d’antibiotique. Lorsque la concentration de l’antibiotique est supérieure à la CMI, la croissance

bactérienne va être inhibée. Si elle est inférieure à la CMI les bactéries vont se diviser ce qui va

former une zone d’inhibition de croissance de la bactérie autour du disque d’antibiotique. Le

diamètre de cette zone d’inhibition de croissance est mesuré. Cette technique ne permet pas de

connaître directement la CMI, mais repose sur la corrélation entre le diamètre d’inhibition et la CMI

(Kronvall et Ringertz 1991). Cependant, pour certains antibiotiques, la méthode de diffusion par

disque n’est pas appropriée, comme pour les glycopeptides et les polypeptides, qui diffusent mal

dans la gélose.

III.4.B. Interprétation des résultats phénotypiques selon les référentiels du CLSI

et EUCAST

Les résultats de CMI et de diamètre d’inhibition sont interprétés par rapport à des valeurs

seuils. Il en existe deux catégories, les seuils cliniques et les seuils épidémiologiques.

Les seuils cliniques, ou clinical breakpoints, définissent la résistance clinique d’une souche à

un antibiotique. Ils sont utilisés par les cliniciens pour prédire la réussite d’un traitement

antibiotique. Ces seuils sont définis par rapport au trio antibiotique/bactérie/hôte et permettent de

détecter les mécanismes de résistance ayant un impact clinique (Silley 2012, Baron et al. 2017a). Ils


52

séparent les résultats en 3 catégories, sensible, intermédiaire et résistant (Figure 5). Si une souche

est dite sensible, le traitement antibiotique a de forte chance de fonctionner, si la souche est dite

résistante il y a de forte chance que le traitement antibiotique ne fonctionne pas, si la souche est dite

intermédiaire, la réussite du traitement antibiotique est inconnue. Les seuils cliniques sont établis

par les référentiels du CLSI et de l’EUCAST (CLSI 2015, CLSI 2016b, EUCAST 2018).

Figure 5: Distribution des diamètres d’inhibition de souches d’E. coli pour la ciprofloxacine. Les barres bleues représentent les souches sensibles cliniquement, en vert les souches intermédiaires et en rouge les souches résistantes cliniquement (Kronvall et al. 2011).

Les seuils épidémiologiques définissent la résistance microbiologique d’une souche à un

antibiotique. Ils sont utilisés par les microbiologistes/épidémiologistes pour détecter les souches

ayant acquis un mécanisme de résistance, sans prendre en compte l’efficacité clinique de

l’antibiotique. Ces seuils sont déterminés par rapport au couple antibiotique/bactérie et permettent

de détecter l’émergence de résistance au sein d’une population bactérienne mais n’a aucune valeur

clinique. Ils séparent la population sauvage qui a le phénotype naturel vis-à-vis d’un antibiotique de

la population non sauvage qui a acquis une résistance (Figure 6). Les référentiels du CLSI et de

l’EUCAST ont définis des seuils épidémiologiques ou epidemiological cut-off value, (ECV pour CLSI et

ECOFF pour l’EUCAST). Cependant, par rapport aux seuils cliniques, peu de seuils épidémiologiques

ont été déterminés et concernent majoritairement les espèces bactériennes pathogènes pour

l’Homme (EUCAST , CLSI 2014, CLSI 2016b).


53

Figure 6: Distribution des bactéries de l’espèce E. coli selon les diamètres d’inhibition de la ciprofloxacine. Le seuil épidémiologique est 25 mm. Les barres noires représentent la population bactérienne sauvage et les barres blanches la population non sauvage

Pour déterminer des seuils épidémiologiques, pour un couple antibiotique/bactérie,

plusieurs études indépendantes avec les mêmes conditions expérimentales sont nécessaires (CLSI

2016b). Les seuils épidémiologiques sont calculés par des méthodes statistiques se basant sur l’étude

de la distribution des diamètres d’inhibition ou des CMI (Figure 6) (Turnidge et al. , Kronvall 2010,

Baron et al. 2017a). Les seuils cliniques et épidémiologiques ont été définis dans les référentiels pour

les bactéries pathogènes isolées du milieu terrestre à une température de 35°C. Cependant, cette

température n’est pas optimale pour la croissance de toutes les bactéries isolées du milieu

aquatique, ce qui pose des difficultés pour l’étude de la résistance aux antibiotiques des celles-ci. Le

CLSI a mis en place des lignes directrices pour tester la résistance aux antibiotiques de ces bactéries,

par la dilution en milieu liquide et par diffusion. Deux températures d’incubation sont utilisées 22°C

et 28°C, les durées d’incubation sont de 44-48 h ou 24-28 h, respectivement. Cependant, ces lignes

directrices ont été développées pour étudier les bactéries présentes dans les produits aquatiques

provenant de l’élevage (aquaculture), et plus particulièrement les bactéries pathogènes des animaux.

De plus, les classes d’antibiotiques étudiées sont celles utilisées pour leur traitement : β-lactamines,

quinolones, aminosides, macrolides, phénicolés, tétracyclines, inhibiteurs de la synthèse des folates

(CLSI 2006a, CLSI 2006b, CLSI 2014). Des seuils cliniques ont été établis uniquement pour Aeromonas

Diamètre d’inhibition (mm)

% d

e so

uch

es


54

salmonicida à 22°C (44-48h) pour l’oxytétracycline et l’acide oxolinique pour le traitement du

saumon Atlantique.

En parallèle, des seuils épidémiologiques expérimentaux, non validés par les référentiels, ont

été calculés dans différents travaux en s’appuyant sur les lignes directrices du CLSI. Ces seuils ont été

définis par diffusion A. salmonicida à 22 °C pendant 44/48 h (Ruane et al. 2007, Smith 2012),

Edwerdsiella tarda et Vibrio harveyi à 28 °C pendant 24/28 h(Lim et al. 2016) et par microdilution

pour Aeromonas spp. à 22 °C pendant 24 h (Baron et al. 2017a), et Vibrio ichthyoenteri à 22 °C

pendant 24/28 h (Lee et al. 2012). Ces seuils expérimentaux n’ont pas été définis dans les mêmes

conditions expérimentales (dilution/diffusion, 22 °C/28 °C, 24-28 h/44-48 h) et ne sont utilisables que

dans les mêmes conditions expérimentales.

De plus, il a été montré que plus la température d’incubation des antibiogrammes est basse

et plus le temps est élevé ce qui conduit à une perte de précision des résultats obtenus par la

méthode de diffusion alors que cela n’impacte pas ceux obtenus par la méthode par dilution (Smith

et al. 2018). En comparant les diamètres d’inhibition de souches de référence (Enterococcus faecalis,

Escherichia coli, Haemophilus influenza, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,

Streptococcus pneumoniae et Streptococcus pyogenes), de 9 laboratoires dans différentes conditions,

Smith et al. (2015) ont remarqué une variation des écart-types moyens selon les conditions

d’incubation. À 35 °C pendant 18 h l’écart-type moyen était de 1,5 mm, à 28°C 24 il était de 1,9 mm,

à 22 °C 24h, l’écart-type moyen était de 2,4 mm et à 22 °C 48 h l’écart-type moyen était de 2,9 mm.

De plus, la perte de précision dans la mesure des diamètres d’inhibition entraine une

variabilité dans le calcul de seuils épidémiologiques expérimentaux. Par exemple, à 22 °C et 44/48 h,

les seuils épidémiologiques pour A. salmonicida pour l’acide oxolinique allaient de 30 à 36 mm selon

les études (Smith 2012, Smith et Kronvall 2015, Smith et al. 2018). Cette variabilité et le nombre

faible d’études complique l’établissement de seuils épidémiologiques « universels » pour la méthode

de diffusion par disque (CLSI 2014, Smith et al. 2018). De ce fait, il est recommandé, pour des


55

antibiogrammes à des températures inférieures à 22°C, d’utiliser la méthode de dilution en milieu

liquide car ni la température d’incubation, ni la durée n’ont d’impact sur la précision des CMI

mesurées.

III.4.C. Techniques de confirmation et d’identification des mécanismes de

résistance et de leurs supports génétiques

Les seuils épidémiologiques et cliniques sont utilisés pour détecter in vitro des souches

résistantes aux antibiotiques. Dans le but d’étudier et d’identifier les mécanismes menant à des

résistances, différentes techniques phénotypiques, biochimiques et moléculaires ont été

développées.

La méthode de diffusion permet d’observer à l’œil nu des interactions entre les antibiotiques

et d’observer la présence de mécanismes de résistance inductibles ou engendrant des phénotypes

particuliers. Par exemple, les gènes de résistance aux antibiotiques erm sont détectables par une

image d’antagonisme entre un macrolide et la clindamycine (Leclercq 2012a). La présence de β-

lactamase à spectre étendu (BLSE) se visualise par l’apparition d’une synergie entre un disque

contenant de l’acide clavulanique et un disque de céphalosporine 3ème génération (Jarlier et al. 1988).

Cependant, d’autres β-lactamases, comme les céphalosporinases et les carbapénémases, qui ne sont

pas sensibles à l’acide clavulanique, masquent la synergie et empêchent la détection des BLSE.

Les méthodes biochimiques sont utilisées principalement pour détecter l’activité

enzymatique des β-lactamases. Des méthodes chromogènes comme le test à la nitrocéfine® ou le

test NP ont été développées (O'Callaghan et al. 1972, Nordmann et al. 2012b). La nitrocéfine® est

une céphalosporine incolore qui devient rouge lors de son hydrolyse par une β-lactamase

(O'Callaghan et al. 1972). Le test NP permet de visualiser l’acidification du milieu par l’activité d’une

β-lactamase, il est principalement utilisé pour détecter l’activité d’une carbapénèmase. Un lysat

bactérien est mélangé à une solution contenant un carbapénème et un indicateur coloré. S’il n’y a

pas de carbapénémase la solution est rouge, si une carbapénémase est présente la solution devient


56

jaune (Nordmann et al. 2012b). Une autre manière de mettre en évidence l’activité d’une

carbapénémase est le CIM test (Carbapenemase inactivation method). Le principe de ce test est

d’incuber un disque de carbapénème dans une suspension bactérienne à tester. Si la souche testée

ne produit pas de carbapénémase, le carbapénème sera toujours actif. Le disque est ensuite posé sur

une gélose ensemencée avec une souche E.coli sensible aux carbapénèmes. L’antibiotique présent

dans le disque va créer une zone d’inhibition. Le test sera négatif. Si la souche testée produit une

carbapénémase, l’antibiotique dans le disque perd son activité et la souche E. coli va pousser au

contact du disque. Le test sera positif (van der Zwaluw et al. 2015).

L’amplification des gènes de résistance par PCR est utilisée pour leur détection et leur

identification (Visser et Fluit 1995, Fluit et al. 2001). Cependant, ces techniques ciblent de manière

spécifique un gène ou une famille de gènes et sont utilisées pour des études ciblées sur des

mécanismes de résistance. De plus, face à des résistances dont le nombre de gènes décrits est très

important, comme les β-lactamases ( plus de 1 000 ont été décrites), des méthodes de criblage,

comme des puces à ADN, ont été développées (Chopra et Roberts 2001, Fluit et al. 2001, Randegger

et Hächler 2001, Call et al. 2003, Byrne-Bailey et al. 2009, Bush 2012). L’amplification par PCR a

également été utilisée pour détecter des éléments génétiques mobiles en ciblant des marqueurs

épidémiologiques. Par exemple, différents travaux ont développé des PCR ciblant les intégrases des

intégrons de classe 1,2 et 3 ou des ICEs SXT/R391 (Ceccarelli et al. 2006, Barraud et al. 2010). Ces

techniques permettent de mettre en évidence la présence d’éléments génétiques mobiles.

Cependant, ces techniques de détection ne permettent pas d’associer les gènes de résistance aux

antibiotiques aux éléments génétiques mobiles.

Afin d’étudier les structures génétiques de résistance présentes dans une souche

bactérienne, un séquençage du génome total et l’analyse des séquences obtenues peut être réalisé.

Les gènes de résistance peuvent être identifiés directement avec l’aide de bases de données de


57

séquences de gènes de résistance aux antibiotiques, comme the Comprehensive Antibiotic Resistance

Database (CARD) ou ResFinder (Jia et al. 2017) (Zankari et al. 2012). De même, des bases de données

ont été développées pour identifier les éléments génétiques mobiles dans les génomes, comme

Integrall pour identifier les intégrons (Moura et al. 2009), PlasmidFinder pour les plasmides (Carattoli

et al. 2014) ou ICEberg pour identifier les ICEs (Bi et al. 2012). De plus, dans un but épidémiologique,

l’annotation de l’ensemble du génome est nécessaire pour identifier le contexte génétique des gènes

de résistance. Le NCBI a développé des algorithmes comme procaryotic genome annotation

pipeline(PGAP) pour annoter les génomes par rapport aux séquences présentes dans sa base de

données de gènes (Zhao et al. 2012). Cependant, les techniques de séquençage du génome total sont

chères et l’analyse prend du temps. Ces techniques sont utiles pour caractérisation génotypique des

souches d’intérêt (multi-résistantes ou présentant des phénotypes de résistance aux antibiotiques

critiques).

59

Chapitre 1 : Isolement et identification de la flore bacte rienne me sophile cultivable des produits de

la pe che et de l’aquaculture

Chapitre 1 : Isolement et identification flore bactérienne

60

I. Contexte

Les produits aquatiques sont une source alimentaire importante pour les Français, ils en

consomment 34 kg/an/habitant, ce qui équivaut à la consommation annuelle de viande de porc

(FranceAgriMer 2016, FranceAgriMer 2017b). Les produits les plus consommés sont décrits dans le

Tableau 1. Ils et font partis de différentes catégories de matrices importées ou produit en France. En

effet, certains animaux sont principalement pêchés comme le thon, le cabillaud ou les Saint-Jacques

et sont des produits importés. Au contraire, le saumon ou les crevettes proviennent principalement

de l’aquaculture et sont également des produits importés. Par contre, la France est un des leaders

européens dans la production de mollusques bivalves (moules et huîtres).

Tableau 1: Volume de consommation, de production et d'importation des produits aquatiques les plus consommés par les français (moyenne 2013-2015) (FranceAgrimer, 2016).

Nom vernaculaire Consommation apparente

(t) Production française

(t) Importation

(t)

Thon 267 210 102 880 256 310

Moule 184 690 79 010 110 050

Cabillaud 178 530 12 680 173 070

Saumon 178 440 1 520 208 480

Saint-Jacques 121 210 24 240 116 290

Crevette 120 860 380 136 780

Huître 74 060 77 040 5 980

Sardine 62 900 24 730 42 030

Merlu 62 860 39 160 32 520

Hareng 49 780 30 450 20 480

De plus, ces animaux sont organisés selon leur position dans la colonne d’eau. Ils peuvent

vivre sur le fond marin en contact avec les sédiments (Saint-Jacques) et la flore bactérienne des

sédiments, ils sont dits benthiques, ils peuvent être à différents niveaux dans la colonne d’eau et en

contact avec la flore bactérienne aquatique (thon), ils sont dits pélagiques. Les animaux proches du

fond marin sont dits démersaux (cabillaud).


61

L’essentiel des travaux scientifiques sur les flores bactériennes des produits aquatiques

ciblait la flore pathogène et la flore d’altération, et leurs évolutions lors de la transformation et la

conservation des produits aquatiques (Gram et Huss 1996, Leroi et al. 1998 , Gram 2001 , Gram et

Dalgaard 2002, Jaime Martinez-Urtaza et al. 2005, Böhme et al. 2013 , Parlapani et al. 2015, Calliauw

et al. 2016, Fernandes et al. 2018 , Lopatek et al. 2018 ). Les flores d’altération décrites sont

principalement psychrophiles et sont capables de se développer à la température de conservation

des aliments (0 à 8°C). Cette flore se composait principalement de bactéries lactiques (Lactococcus

spp., Lactobacillus spp., Enterococcus spp., Carnobacterium spp., Vagococcus spp.) et de bactéries

Gram négatif (Shewanella putrefaciens, Phtobacterium phosphoreum, Pseudomonas spp,

Vibrionaceae, Enterocateriaceae) (Leroi et al. 1998 , Gram et Dalgaard 2002, Leroi 2010, Parlapani et

al. 2015 , Calliauw et al. 2016). Mais il y a peu de données sur la flore mésophile cultivable des

produits de la pêche et de l’aquaculture crus les plus consommés.

Ces travaux avaient pour objectif de faire un état des lieux de la flore mésophile cultivable

présente sur les produits de la pêche et de l’aquaculture parmi les plus consommés en France et

reflétant la diversité de nature et d’origine de ces produits. Pour cela, nous avons sélectionné et

analysé les produits suivants :

- Le cabillaud car c’est un poisson démersal de pleine mer,

- Des poissons plats (soles, limandes, plies) car ce sont des poissons benthiques et côtiers

et près de 10 000 t de ces poissons sont consommés annuellement (FranceAgriMer

2017b),

- Des mollusques bivalves (moules, Saint-Jacques et huîtres). Les moules et les huîtres sont

produites par conchyliculture alors que les Saint-Jacques sont pêchées. De plus, dans le

cas des moules et huîtres toute la chaire est consommée alors que dans les Saint-Jacques

seul le muscle adducteur, ou noix, et les gonades, ou corail, sont consommés,


62

- Des crustacés (crevettes, homard). La quasi-totalité des crevettes est importée

d’aquaculture de pays tropicaux, dont 50 % proviennent d’Equateur, d’Inde et du

Vietnam (FranceAgriMer 2017a). Par contre, le homard est importé de pêcheries de pays

tempérées, dont plus de la moitié d’Amérique du Nord (FranceAgriMer 2017a).

Des espèces animales différentes peuvent être commercialisées, comme les pectinidés (Pecten

maximus, Pecten jacobeus, Placopecten magellanicus, Chlamys islandica,…) sous la dénomination

Saint-Jacques (OMC 1996). Dans la suite de ces travaux, les noms courants des animaux plutôt que

leurs noms scientifiques, ont été utilisés.

Les prélèvements ont été réalisés sur la peau et les branchies ont été étudiées. Les viscères

n’ont pas été étudiées car dans le référentiel de l’OIE : « la flore digestive des animaux aquatiques

est transitoire et ne doit pas être étudiée en antibiorésistance » (OIE 2017a). De plus des études

préliminaires, dans le laboratoire ont montré que la flore présente dans le tube digestif n’avait pas

de croissance dans nos conditions expérimentales.

Les flores bactériennes mésophiles, cultivables, pathogènes et non pathogènes des différents

produits marins sélectionnés ont été étudiées. Les bactéries ciblées étaient Bacillus spp.,

Enterococcus spp., Listeria spp., Staphylococcus spp., Aeromonas spp., E.coli, Pseudomonas spp.,

Salmonella spp., Vibrio spp. et les bactéries résistantes présentant un enjeu majeur en santé

publique comme Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM), Enterococcus résistant à la

vancomycine (VRE), Enterobacteriales producrice de β-lactamase à spectre étendu (BLSE) ou de

carbapénémase. La flore mésophile a été sélectionnée par un enrichissement à 30°C, puis sur 14

milieux sélectifs. Les colonies bactériennes ont été isolées selon leurs morphologies sur chaque

milieu.

Enfin, les isolats bactériens ont été identifiés par amplification et séquençage de gènes de ménage

(ADNr 16S, gyrB, rpoBet tuf) et par la méthode Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of

Flight ou MALDI-TOF.


63

II. Matériel et méthodes

II.1. Préparation des broyats

En 2016, trente poissons ont été achetés auprès de coopératives de pêcheurs : 15 cabillauds,

2 plies, 6 limandes, 7 soles et nous les avons identifiés comme « poissons plats » dans cette étude. Ils

étaient achetés entiers non éviscérés. Les prélèvements (mucus sur la peau et les ouies) ont été

réalisés sur chaque individu. Une éponge stérile imbibée d’eau peptonée tamponnée (EPT) (3M,

Cergy-Pontoise, France) a été passée sur la peau de chaque poisson pour récupérer le mucus. L’EPT

était récupérée en essorant l’éponge puis diluée au 1/2 avec de l’EPT (Oxoid, Dardilly, France)

supplémentée à 20 % v/v de glycérol (VWR, Fontenay-sous-bois, France) et mis dans un cryotube qui

était conservé à -20°C. Pour les branchies prélevées stérilement dans les cabillauds, la dilution au 1/2

avec de l’EPT (m/m) a été effectuée dans un sachet stérile avec un dilueur gravimétrique

(Interscience, St Nom la Bretèche, France) puis broyée pendant 1 min à l’aide d’un stomacher

(Biomerieux, Marcy l’étoile, France). Pour les autres poissons, la dilution au 1/2 avec de l’EPT (m/m) a

été réalisée dans un pot stérile puis agitée au vortex pendant 1 min. Les broyats obtenus ont été

supplémentés avec 20 % (v/v) de glycérol dans un cryotube et conservés à -20°C.

En 2015-2016, quarante-cinq lots de mollusques bivalves ont été préparés (15 lots de moules

françaises fraîches, 15 lots d’huîtres françaises fraîches et 15 lots de noix de Saint-Jacques congelées

importées). Les prélèvements ont été réalisés soit directement sur les produits frais soit après

décongélation. Ving-cinq grammes de chair ont été prélevés stérilement puis dilués au 1/10 avec de

l’EPT dans un sachet stérile avec un dilueur gravimétrique puis broyés pendant 1 min avec un

stomacher. Les broyats étaient ensuite supplémentés avec 20 % (v/v) de glycérol puis mis dans un

cryotube et conservés à -80°C. Les broyats des noix de Saint-Jacques ont été incubés à 37°C pendant

18 h puis supplémentés avec 20 % de glycérol dans un cryotube et conservés à -80°C.

Les broyats de cent six lots de crustacés congelés importés (15 lots de homards en 2015-2016

et 91 lots de crevettes tropicales crues en 2013) ont été préparés. Les homards ont été


64

préalablement décongelés puis 25 g de chair ont été prélevés et dilués au 1/10 (m/m) avec de l’eau

peptonée saline alcaline (EPSA) (Peptone/NaCl, Oxoid) dans un sachet stérile avec un dilueur

gravimétrique puis broyés pendant 1 min avec un stomacher. Les broyats ont été incubés à 37°C

pendant 18 h puis supplémentés avec 20 % (v/v) de glycérol dans un cryotube et conservés à -80°C.

Pour les crevettes, le céphalothorax a été retiré stérilement, 50 g de l’abdomen ont été dilués au 1/3

dans de l’EPT et broyés dans un bol waring puis supplémenté avec 10 % (V/V) de glycérol et congelés

à -20°C.

II.2. Isolement des bactéries

Chaque broyat a été décongelé puis dilué dans 2 mL d’EPSA ou 2 mL d’EPT pour obtenir une dilution

finale de 1/10. Les tubes ont ensuite été incubés une nuit à 30°C. Les suspensions bactériennes

enrichies dans l’EPSA ont été ensemencées sur les géloses sélectives suivantes : Thiosulfate Citrate

Bile Saccharose (TCBS, Oxoid), Glutamate Strach Phenol red (GSP, Merk, Darmstadt, Allemagne),

Chapman (Oxoid), ChromID® MRSA (Biomérieux)(Tableau 2). Les suspensions bactériennes enrichies

dans l’EPT ont été ensemencées sur les géloses sélectives suivantes : Triptone Bile X-glucuronide

(TBX, Oxoid), Cephalosporine Fucidine Cetrimide (CFC, Oxoid), Brillance Salmonella agar (Oxoid),

Polymyxin pyruvate Egg yolk Mannitol Bromothymol blue Agar (PEMBA, Oxoid), Agar Listeria selon

Ottaviani et Agosti (ALOA, Biomérieux), Slanetz & Bartley (Oxoid), ChromID® VRE (Biomérieux),

ChromID® BLSE (Biomérieux ), ChromID® OXA-48 (Biomérieux ), ChromID® Carba (Biomérieux).

Ensuite, les géloses GSP et CFC ont été incubées à 25°C pendant 48 h, la gélose TBX à 41°C pendant

24 h, la gélose PEMBA à 30°C pendant 48 h, les géloses ALOA et Slanetz & Bartley à 37°C pendant 48

h et les géloses TCBS, Chapman, Brillance Salmonella et celles de la gamme ChromID® à 37°C pendant

24 h.

Sur chaque gélose, une colonie de morphologie différente (couleur et/ ou forme) était repiquée sur

une gélose nutritive : plate count agar (PCA, Oxoid) pour les géloses dont l’enrichissement a été fait

dans de l’EPT et de la gélose nutritive salée à 1 % (GN, Biorad, Marnes-la-Coquette, France, NaCl,

Oxoid) pour les géloses dont l’enrichissement a été fait dans de l’EPSA. Les températures et les temps


65

d’incubation appliqués étaient identiques à ceux des milieux sélectifs initiaux. Chaque souche

repiquée était conservée à -80°C dans du bouillon cœur cervelle (BCC, Biomérieux) supplémenté avec

20 % (v/v) de glycérol et dans une gélose longue conservation (Bio-rad).

Tableau 2: Conditions d’incubation pour l‘isolement et le repiquage des souches bactériennes.

Bouillons Géloses sélectives Conditions

d’incubation

des géloses

Géloses de

repiquage

Conditions

d’incubation

des géloses

Bactérie(s) ciblée(s)

EPT TBX 41±1°C/24±2h PCA 37±1°C/24±2h E. coli

Brillance salmonella 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Salmonella spp.

Chrom ID ESBL 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Enterobacteriaceae

productrice de β-

lactamase à spectre

étendu

ChromID OXA-48 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Enterobacteriaceae

productrice de l’enzyme

OXA-48

ChromID Carba 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Enterobacteriaceae

productrices de

carbapénémases

ChromID VRE 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Enterococcus résistant à

la vancomycine

Slanetz & Bartley 37±1°C/48±2h 37±1°C/24±2h Enterococcus spp.

ALOA 37±1°C/48±2h 37±1°C/24±2h Listeria spp.

PEMBA 30±1°C/48±2h 30±1°C/24±2h Bacillus spp.

CFC 25±1°C/48±2h 25±1°C/24±2h Pseudomonas spp.

EPSA Chapman 37±1°C/24±2h GNS 37±1°C/24±2h Staphylococcus spp.

TCBS 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Vibrio spp.

GSP 25±1°C/48±2h 25±1°C/24±2h Aeromonas spp. et

Pseudomonas spp.

ChromID MRSA 37±1°C/24±2h 37±1°C/24±2h Staphylococcus aureus

résistant à la méticilline

Chaque souche a été codifiée comme suit :

AF[Année]-[N° d’échantillon][Type de tissu]-[Nom de milieu isolé][Numéro de souche]

Liste des occurrences pour chaque catégorie :

[Année] : 2016, 2017

[N° d’échantillon] : Le numéro s’incrémentait


66

[Type de tissu] : Peau (PE), Chair (CH), Ouïes/branchies (OU), Chair + Carapace (CC).

[Nom du milieu d’isolement] : Tableau 3

Tableau 3:Abbréviation des noms des géloses sélectives.

Nom des géloses

sélectives

Abréviations du nom des

géloses sélectives

GSP GS

TCBS TC

CFC CF

Brillance Salmonella SA

TBX TB

ALOA AL

PEMBA PE

Chapman CH

Slanetz & Bartley SL

ChromID® VRE VRE

ChromID® ESBL ESBL

ChromID® MRSA MRSA

ChromID® OXA-48 OXA

ChromID® Carba CARBA

[Numéro de souche] : En fonction du nombre de souches de morphologies différentes isolées.

Exemple : Pour la souche du projet AntibioFish de 2016 isolée à partir de la chair (CH) de l’échantillon

1 sur le milieu TBX, le nom attribué sera : AF16-1CH-TB1.

II.3. Identification bactérienne par la technique MALDI-TOF et par

l’amplification et le séquençage de gènes de ménage (ADNr 16S, gyrB,

rpoB et tuf)

II.3.A. Technique MALDI-TOF

Les isolats préparés dans les géloses de longue conservation ont été envoyés à la plateforme MALDI-

TOF de l’ANSES (Nancy, France) pour leur identification à partir des spectress protéiques qui ont été

obtenus. Les souches bactériennes ont été repiquées en suivant les conditions données dans le

tableau 2. Une colonie ou un extrait protéique de chaque souche était analysé par le spectromètre

MALDI-TOF (Microflex®Bruker V4.0.0.1_4613-5627). Les spectres protéiques obtenus étaient

comparés à ceux présents dans la base de données de l’appareil Bruker. Un score était


67

automatiquement assignait par l’appareil à chaque comparaison de spectre. Pour chaque isolat, seul

le meilleur score était pris en compte comme suite :

- Si le score était strictement inférieur à 1,7 : aucune identification possible,

- Si le score était compris entre 1,7 et 2 : l’identification se faisait au genre bactérien,

- Si le score était supérieur ou égal à 2 : l’identification se faisait à l’espèce bactérienne.

II.3.B. Techniques d’amplification et de séquençage de gènes de ménage de l’ADNr

16S, gyrB, rpoB et tuf

II.3.B.a. Extraction de l’ADN

A partir d’un cryotube, les souches ont été repiquées comme décrit dans le Tableau 2.

Ensuite, plusieurs colonies étaient suspendues dans 200 μL d’InstaGeneTM Matrix (Bio-rad) dans un

tube Eppendorf. La suspension était incubée pendant 30 min à 56°C puis agitée pendant 10 s et

incubée pendant 8 min à 100°C. Enfin, les tubes étaient centrifugés pendant 5 min à 13 000 x g. Les

solutions d’ADN pouvaient être utilisées immédiatement ou conservées à -20°C. Par contre pour les

solutions congelées, elles devaient être agitées et centrifugées 5 min à 13 000 x g avant leur

utilisation.

II.3.B.b. Amplification de l’ADN par polymerase chain reaction (PCR)

Cinq couples d’amorces ont été utilisés pour l’identification des isolats (Tableau 4).

La PCR amplifiant le gène de l’ADNr 16S a été réalisée pour identifier toutes les souches

bactériennes. Les PCR amplifiant les gènes gyrB, ropB et tuf ont été effectuées pour confirmer et

identifier les espèces du genre Vibrio, Pseudomonas et Staphylococcus respectivement. Le mélange

réactionnel de chaque PCR était préparé comme suit : 40,75 µL de nuclease free water (Qiagen,

Courtaboeuf, France), 5 µL de tampon 5X (Qiagen), 1 µL de dNTP à 100 mM (Eurobio, Les Ulis,

France), 0,25 µL de chaque amorce à 50 µM (Eurobio) et 0,25 µL de Hot Start Taq DNA Polymerase à

5 U.µL-1 (Qiagen). Le mélange réactionnel était réparti dans une plaque avec 47,5 µL par puits auquel


68

était ajouté 2,5 µL de l’extrait d’ADN. Les conditions de PCR utilisées sont indiquées dans le

tableau 5.

Tableau 4: Couples d'amorces utilisés pour la PCR et le séquençage.

Gènes ciblés Amorces Séquences

5’->3’

Taille de l’amplicon

(pb)

Références

ADN 16S ENV1 AGAGTTTGATIITGGCTCAG 1 484 (Olofsson et al.

2007) ENV2 CGGITACCTTGTTACGACTT

gyrB gyrB3F TCCGGCGGTCTGCACGGCGT 957 (Yanez et al.

2003) gyrB14R TTGTCCGGGTTGTACTCGTC

UP-1 CAYGCNGGNGGNAARTTYGA 1 200 (Yamamoto et

Harayama

1995)

UP-2r CCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT

UP-1S GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA Utilisé pour le

séquençage UP-2Sr AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC

rpoB LAPS TGGCCGAGAACCAGTTCCGCGT 1 247 (Ait Tayeb et al.

2005) LAPS27 CGGCTTCGTCCAGCTTGTTCAG

tuf FTuf ACHGGHRTHGARATGTTCCG 299 adapté de

(Tanaka et al.

2010)

RTuf GTTDTCRCCHGGCATNACCAT

Tableau 5: Conditions de PCR utilisées

Gènes ciblés (amorces) Conditions de PCR

ADNr 16S 95°C/1min ; 35x( 94°C/45s ; 48°C/45s; 72°C/1min); 72°C/10min

gyrB (gyrB3F et gyrB14R) 95°C/1min ; 35x( 94°C/30s ; 55°C/30s; 72°C/1min); 72°C/10min

gyrB (UP1 et UP2r) 95°C/5 min ; 30 x (96°C/1 min ; 56°C/1 min ; 72°C/1 min) ; 72°C/7 min

rpoB 95°C/15min; 35x (94°C/30s; 55°C/30s; 72°C/1min); 72°C/10min

tuf 95°C/15min ; 35x (95°C/10s ; 60°C/1min ; 72°C/1min) ; 72°C/10min

II.3.B.c. Séquençage et analyses bio-informatique

Quinze µL de l’amplicon était mélangé à du tampon de charge (Eurobio) puis déposé dans un gel

d’agarose (Eurobio) à 0,8% (m/v) préparé avec du tampon Tris-Borate-EDTA 10X (Eurobio)

préalablement dilué au 1/10 auquel était ajouté du bromure d’éthidium à 1% (v/m) (BET, Eurobio).

La migration s’effectuait à 125 V pendant 90 min puis le gel était visualisé sous UV. Chaque

échantillon avec un amplicon à la taille attendue (tableau 4) était envoyé à la plateforme Genoscreen

(Lille, France) pour être séquencé par la méthode Sanger. Le séquençage a été réalisé avec l’amorce


69

ENV-2 pour les amplicons de la PCR ADNr 16S, les amorces gyrB3F,gyrB14R, UP-1S et UP-2Sr pour les

amplicons de la PCR gyrB, les amorces LAPS et LAPS27 pour les amplicons de la PCR rpoB et les

amorces FTuf et RTuf pour les amplicons de la PCR tuf. Après réception des séquences, elles étaient

nettoyées en supprimant les extrémités comportant des bases non identifiées. Les séquences de

l’ADNr 16S étaient ensuite comparées à la base ADNr 16S du NCBI par l’algorithme BLAST

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) et les autres séquences à la base des génomes de référence

(refseq) du NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov//refseq/). Seul le résultat avec le pourcentage

d’identité le plus élevé était pris en compte comme suit :

- Si le pourcentage d’identité était supérieur ou égal à 97 % : l’identification était au genre

bactérien

- Si plusieurs résultats avaient un score et un pourcentage d’identité identiques (supérieur ou

égal à 97 %) mais que les genres bactériens correspondants étaient différents :

l’identification n’était pas possible.

- Si le pourcentage d’identité était supérieur ou égal à 99 % : l’identification était à l’espèce

bactérienne.

- Si plusieurs résultats avaient un même score, un pourcentage d’identité de 99 % ou plus et

que les espèces correspondantes étaient différentes, mais le genre bactérien identique :

l’identification se faisait au genre bactérien.

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi


70

III. Comparaison des performances de différentes techniques

d’identification bactérienne

Les résultats d’identification bactérienne ont été obtenus par la technique MALDI-TOF et par

l’amplification et le séquençage du gène de l’ADNr 16S sur un panel de 501 souches isolées des

produits de la pêche. En premier lieu, l’identification des isolats a été validée après l’analyse des

résultats obtenus par ces deux techniques. En second lieu, elle a pu être complétée et/ou confirmée

par le séquençage d’autres gènes de ménage.

III.1. Techniques MALDI-TOF vs amplification et séquençage de l’ADNr

16S

Au total, 469 isolats ont été identifiés au genre sur les 501 analysées (94 %) par les deux

techniques (Tableau 6). Parmi ces 469 souches, 148 (32 %) ont été identifiées au genre bactérien et

321 (68 %) à l’espèce bactérienne. En examinant les résultats d’identifications bactériennes obtenues

par chaque technique, la technique MALDI-TOF a conduit à l’identification au genre pour 81 % des

isolats et à l’espèce bactérienne pour 50 % des souches alors qu’avec le séquençage de l’ADNr 16S,

c’était 91 % au genre et 37% à l’espèce bactérienne.

Tableau 6: Comparaison des résultats d’identifications des isolats obtenus par la technique MALDI-TOF et par amplification et séquençage de l'ADNr 16S (n = 501). Gen : identification au genre, Esp : identification à l’espèce, - : aucune identification. Lorsqu’aucune comparaison des résultats n’était possible, les cases ont été grisées.

Nombre de

souches

Résultats de l'identification

par technique

Comparaison des résultats

d’identification

par les deux techniques

Validation de

l’identification

MALDI-TOF ADNr 16S Genre Espèce

75 Gen Gen Gen = Gen

Identification au genre

50 - Gen - = Gen


3 Gen - - = Gen


20 Esp Eps Gen = Gen Esp ≠ Esp Identification au genre

86 Esp Esp Gen = Gen Esp = Esp Identification à l’espèce

42 - Esp - = Gen - = Esp Identification à l’espèce

38 Esp - Gen = - Esp = - Identification à l’espèce

44 Gen Esp Gen = Gen - = Esp Identification à l’espèce

111 Esp Gen Gen = Gen Esp = - Identification à l’espèce

5 - -

Non identifiée

27 Esp Esp Gen ≠ Gen Esp ≠ Esp Non identifiée


71

En comparant les résultats d’identification obtenus par les deux techniques utilisées, trois

scenarii ont conduit à la validation de l’identification au genre bactérien pour 148 des 501 isolats

analysés :

- Pour 51% des isolats, les résultats des deux techniques étaient identiques et ont permis

d’identifier les souches au genre bactérien,

- Pour 36% des souches, une seule des deux techniques a donné un résultat et a permis

d’identifier les souches au genre bactérien,

- Pour 13% des isolats, les résultats d’identification à l’espèce bactérienne étaient discordants

entre les 2 techniques mais identiques au genre bactérien, ce qui a validé l’identification au

genre.

Pour 321 des isolats analysés, trois cas de figures ont permis de les identifier à l’espèce

bactérienne :

- Pour 27% des souches, les résultats d’identification étaient identiques à l’espèce bactérienne

par les deux techniques,

- Pour 25 % des isolats, une seule des deux techniques donnait un résultat d’identification au

genre bactérien et également à l’espèce bactérienne. Nous avons décidé de valider

l’identification à l’espèce bactérienne,

- Pour 48% des isolats, les résultats d’identification étaient identiques au genre bactérien par

les deux techniques mais une seule des techniques donnait aussi un résultat à l’espèce

bactérienne. L’identification était validée à l’espèce bactérienne.

Pour 30 isolats, aucune identification n’a pu être validée car :

- Aucun résultat d’identification n’a été obtenu par les deux techniques pour 13 % des

souches,


72

- Les résultats d’identification obtenus étaient discordants pour le genre et l’espèce

bactérienne pour 87 % des souches.

Au total, 44 genres bactériens ont été définis par les 2 techniques. Nous avons analysé plus en

détail les taux d’identification de 12 genres bactériens dont le nombre d’isolats était supérieur à 10

(Tableau 7). Si la proportion de souches identifiées était supérieure à 75 %, nous avons considéré que

le taux d’identification de la technique était bon soit au genre soit à l’espèce. Pour les proportions

comprises entre 25 et 75 %, nous avons considéré que le taux d’identification était moyen et si elles

étaient inférieures à 25%, le taux d’identification était mauvais.

Tableau 7: Taux d’identification des genres bactériens principaux (n>10) par la technique MALDI-TOF et de l’amplification et du séquençage de l’ADNr 16S (n= 373).

Genres bactériens (nombre de souches)

Proportion de souches identifiées par MALDI-TOF (%)

Proportion de souches identifiées par ADNr 16S (%)

Genre Espèce Genre Espèce

Aerococcus (11) 82 73 100 18

Bacillus (155) 86 46 92 22

Brevundimonas (11) 100 73 91 27

Enterococcus (49) 100 100 92 86

Exiguobacterium (55) 29 4 100 89

Lactococcus (10) 100 100 90 80

Macrococcus (11) 91 64 91 0

Proteus (12) 100 58 100 67

Pseudomonas (16) 81 13 94 13

Staphylococcus (15) 93 73 100 80

Stenotrophomonas (18) 78 56 72 17

Vagococcus (10) 80 80 90 50

Total souches analysées (373)

80 52 93 44

Le genre bactérien a été identifié par la technique MALDI-TOF pour toutes les souches de

Brevundimonas, Enterococcus, Lactococcus et Proteus. Au contraire, le taux d’identification des

souches du genre Exiguobacterium était le plus mauvais avec 29 %. Les taux d’identification des

autres genres bactériens étaient bons car ils étaient compris entre 78 % et 93 %. De même, la

technique MALDI-TOF a donné une bonne identification à l’espèce bactérienne pour toutes les


73

souches des genres Enterococcus (100 %), Lactococcus (100 %) et Vagococcus (80 %). Par contre, la

technique MALDI-TOF n’était pas efficace pour identifier des espèces dans les genres

Exiguobacterium (4%) et Pseudomonas (13 %). Pour les autres genres bactériens, les taux

d’identification étaient compris entre 46 % et 73 %.

Par la technique du séquençage de l’ADNr 16S, les taux d’identification des genres bactériens

étaient bons pour 11 genres, avec même 100% pour Aerococcus, Enterococcus, et Proteus, et

intermédiaire pour Stenotrophomonas. Par ailleurs, les taux d’identification des espèces bactériennes

étaient bons pour les espèces des genres Exiguobacterium (89 %), Enterococcus (86 %), Lactococcus

(80%) et Staphylococcus (86 %). Par contre, aucune espèce du genre Macrococcus n’a été identifiée

par le séquençage de l’ADNr 16S. De plus, les taux d’identification des espèces étaient mauvais pour

les genres Pseudomonas (13 %), Stenotrophomonas (17 %), Aerococcus (18 %) et Bacillus (22 %).

En outre, il y a 27 des souches pour lesquelles les 2 techniques n’ont pas donné le même

genre bactérien. Pour 9 de ces 27 isolats, il y a des discordances au niveau de l’identification entre

des genres Gram positif et Gram négatif comme par exemple pour 5 isolats qui sont identifiés au

genre Gram négatif Exiguobacterium par la technique du séquençage de l’ADNr 16S et identifiés

comme des genres Gram positif (Bacillus, Macrococcus, Staphylococcus, Lactococcus) par la

technique MALDI-TOF.

De plus, des discordances ont été observées lors de l’identification à l’espèce au sein d’un

même genre bactérien comme par exemple dans les genres Enterococcus et Proteus. En effet,

4 isolats du genre Enterococcus ont été identifiés à l’espèce comme E. casselifavus et 4 isolats du

genre Proteus comme P. vulgaris par la technique MALDI-TOF alors qu’ils étaient identifiés comme

E. gallinarum et P. terrae par le séquençage de l’ADNr 16S.

Enfin, 1 % des souches n’ont pas été identifiés par aucune des deux techniques.


74

III.2. Complément d’identification par les autres gènes de ménage gyrB,

rpoB et tuf

L’identification par l’amplification et le séquençage des gènes de ménage gyrB, rpoB et tuf a

été réalisée pour confirmer les espèces bactériennes de 33 souches. Les amorces du gène gyrB ont

été utilisées pour amplifier et séquencer le genre Vibrio., rpoB pour Pseudomonas et tuf pour

Staphylococcus.

Le séquençage du gène gyrB a été effectué pour 2 souches du genre Vibrio mais aucune

identification n’a été possible.

De même, l’amplification et le séquençage du gène rpoB a été effectué sur 16 souches de

Pseudomonas. L’identification du genre Pseudomonas a été confirmée pour 6 souches. De plus, une

souche identifiée au genre par la technique MALDI-TOF et le séquençage de l’ADNr 16S a été

identifiée à l’espèce P. alcaliphila par le séquençage du gène rpoB.

L’amplification et le séquençage du gène tuf a été réalisés sur 15 souches du genre

Staphylococcus. Le genre bactérien a été confirmé pour 13 souches et l’espèce bactérienne a

également été confirmée pour 6 souches.

III.3. Discussion

L’identification bactérienne par la technique MALDI-TOF a montré l’avantage d’être rapide et

simple d’utilisation. Cependant, cette technique est basée sur la comparaison du spectre protéique

de la souche à identifier aux spectres de référence présents dans une base de données.

L’identification au genre était bon (81 %) sur le panel étudié par cette technique mais moins

performant (50%) pour l’espèce bactérienne. Les conditions de culture (gélose, température et

temps d’incubation) et d’extraction des protéines des isolats influent fortement les spectres

protéiques obtenus. C’est pourquoi il est important que les souches à identifier soient préparées

dans les mêmes conditions que celles utilisées pour établir les spectres de référence (Bohme et al.

2010, Bohme et al. 2011). Dans ces travaux, la flore bactérienne a été isolée et cultivée à des


75

températures variables qui ne sont pas automatiquement celles utilisées pour l’obtention des

spectres de référence (de 25 °C à 37°C). Ces différences ont pu entraîner une perte de précision ou

des erreurs d’identification de certaines souches par la technique MALDI-TOF. Elles peuvent

également expliquer les désaccords d’identification observés lors de la comparaison entre les

résultats obtenus par la technique MALDI-TOF et ceux avec les techniques d’amplification et de

séquençage des gènes de ménage.

L’amplification et le séquençage de gènes de ménage pour l’identification bactérienne est

une technique couramment utilisée. Ces gènes sont présents dans le génome de toutes les bactéries

et leurs séquences peuvent être spécifiques à une espèce bactérienne (Mollet et al. 1997, Drancourt

et al. 2000). Le séquençage du gène de l’ADNr 16S est le plus utilisé. Plusieurs travaux scientifiques

sur la flore bactérienne de truites, de baudroies, ou de filets de dorade ont utilisé ce gène pour

l’identification bactérienne (Haygood et al. 1992, Kim et al. 2007, Parlapani et al. 2015). Dans nos

travaux, le taux d’identification au genre était bon (91 %) et supérieur à celui obtenus par la

technique MALDI-TOF. Par contre, pour l’identification à l’espèce bactérienne, la technique

d’amplification et de séquençage de l’ADNr 16S était faible (37 %) vs la technique MALDI-TOF.

Cependant, des résultats d’identification à l’espèce ou au genre étaient différents entre les deux

techniques. Ces différences peuvent être dues à une imprécision interne à la technique

d’identification utilisée comme des séquences ou de spectres protéiques de différentes espèces trop

proches pour être discriminées, erreurs dans les spectres/chromatogrammes de référence, absence

de références. De plus, le gène de l’ADNr 16S est présent en plusieurs copies avec des séquences

hétérogènes sur le chromosome bactérien. L’amplification par PCR de ce gène va entraîner

l’apparition de plusieurs amplicons de séquences différentes. Le chromatogramme obtenu par le

séquençage donne une séquence compilant les différentes séquences des amplicons. Il en résulte

une perte d’information avec les séquences de l’ADNr 16S des différentes copies du gène. La

comparaison de cette séquence « chimère » avec celles des génomes de référence dans les bases de

données peut entraîner une identification moins précise (Wang et Wang 1997).


76

De plus, la technique du MALDI-TOF et celle de l’amplification et du séquençage des gènes de

ménage ont des difficultés à discriminer des espèces dans certains genres bactériens. C’était le cas

par exemple pour les genres Bacillus, Pseudomonas et Aeromonas. La faible diversité de spectres de

référence de certaines espèces bactériennes présentes dans la base de données de l’appareil MALDI-

TOF peut entrainer une identification à l’espèce faussement précise. En effet, la technique MALDI-

TOF a permis d’identifier des souches à l’espèce Bacillus altidunis, à la différence du séquençage de

l’ADNr 16s qui ont identifié ces mêmes souches comme B. altidunis, B. xianamensis, B. aerius ou B.

stratosphaericus, or les trois dernières espèces bactériennes ne sont pas présentes dans la base de

données du MALDI-TOF.

Des discordances d’identification ont également été observées entre les 2 techniques c’est

pourquoi nous avons amplifié et séquencé d’autres gènes de ménage comme gyrB, et rpoB qui sont

en monocopie et le gène tuf qui est en une ou deux copies (Venkateswaran et al. 1998, Ait Tayeb et

al. 2005, Tanaka et al. 2010). L’amplification du gène gyrB n’a pas été efficace pour identifier le genre

Vibrio. Pourtant lors d’études préliminaires au laboratoire, nous avions eu une bonne identification

des espèces V. parahaemolyticus et V. alginolyticus. Ces différences peuvent s’expliquer par le fait

que le genre Vibrio comporte 142 espèces donc potentiellement 142 structures différent du gène qui

seront plus ou moins bien ciblés par les amorces que nous avons utilisé. De plus, à l’origine les

amorces ont été dessinées pour pouvoir identifier le genre Aeromonas ou des espèces du groupe

Pseudomonas putida, et il semble que ces amorces ne soient pas utilisables pour identifier toutes les

espèces du genre Vibrio (Yamamoto et Harayama 1995, Yanez et al. 2003). En ce qui concerne le

genre Pseudomonas, Ait Tayeb et al. (2005) ont montré que le séquençage du gène rpoB était plus

efficace que celui du gène de l’ADNr 16S pour identifier les différentes espèces du genre

Pseudomonas. Cependant, même si plus de souches de Pseudomonas ont été identifiées à l’espèce

par le séquençage du gène rpoB que par le séquençage du gène de l’ADNr 16S, des différences


77

d’identification d’espèces entre les gènes ADNr 16S et rpoB ont été observées. Ces différences

concernaient principalement les espèces du groupe P. fluorescens. Enfin, les amorces dessinées pour

amplifier et séquencer le gène tuf ont été efficaces pour identifier les espèces de Staphylococcus.

L’espèce S. aureus a pu être identifiée grâce aux amorces utilisées pour le gène tuf alors que ni la

technique MALDI-TOF, ni l’amplification et le séquençage de l’ADNr 16S ne les avait identifiées.

Toutefois, la pertinence des identifications par la technique MALDI-TOF et celle de

l’amplification et du séquençage des gènes de ménage est liée aux spectres/séquences de référence,

à la taille des bases de données et à leur fiabilité. En effet, l’identification bactérienne par la

technique MALDI-TOF a d’abord été développée pour l’identification de bactéries isolées de patients

dans le milieu médical. La base de données contient donc majoritairement des spectres de référence

d’espèces bactériennes pathogènes pour l’homme, et il y a peu de spectres de souches bactériennes

environnementales et alimentaires. En outre, les chromatogrammes obtenus lors du séquençage

sont comparées à des bases de données comme par exemple celle de la collection de nucléotide du

NCBI qui est publique. Des erreurs d’annotations sont possibles, diminuant la fiabilité de ces bases

pour l’identification bactérienne. Il est important que des critères de fiabilité soient définies au

niveau international pour que les bases de données de séquences puissent être curées afin d’avoir

une bonne identification des souches. De plus, la base de données de l’appareil MALDI-TOF est plus

récente et moins développée que celles des séquences de l’ADNr 16S. En effet, il y avait 2 185

espèces dans la base de données du MALDI-TOF, plus de 14 800 séquences d’ADNr 16S d’espèces

différentes et plus de 52 483 génomes de références bactériens dans les bases du NCBI. Par exemple,

il y avait une bonne identification des espèces Enterococcus spp. par la technique MALDI-TOF et celle

du séquençage de l’ADNr 16S. Au contraire, la technique MALDI-TOF n’était pas capable d’identifier

les souches Exiguobacterium spp. et le séquençage de l’ADNr 16S l’était. D’ailleurs, seule l’espèce

Exiguobacterium aurantiacum était présente dans la base de données du MALDI-TOF.

L’enrichissement des bases de données de spectres protéiques pour la technique du MALDI-TOF


78

permettrait de donner de la force à cette technique pour l’identification d’isolats bactériens

environnementaux.

Les techniques que nous avons employé, dans ces travaux, pour identifier les souches

bactériennes à l’espèce ont chacune leurs avantages et leur inconvénients. En conclusion, il apparait

que l’utilisation de deux techniques soit le minimum pour une bonne identification de la flore

bactérienne cultivable de l’écosystème marin. En effet, il apparait important d’employer une

technique comme le séquençage de l’ADNr 16S pour identifier un large spectre de genres bactériens

et une technique, comme par exemple MALDI-TOF, autres gènes de ménage rpoB/tuf/gyrB, pour

identifier/confirmer à l’espèce selon le genre bactérien obtenu. Cependant, des difficultés

demeurent pour identifier les espèces bactériennes de certains genres comme Pseudomonas ou

Bacillus et de nombreuses souches n’ont pas pu être identifiées au genre ou à l’espèce bactérienne.

IV. Identification des souches isolées des produits de la pêche et

performance de la sélectivité des géloses

Les échantillons de produits de la pêche ont été préparés et un enrichissement dans un bouillon

nutritif à 30°C a été effectué. Suite à l’enrichissement et à l’isolement sur des milieux sélectifs, une

colonie de chaque morphologie différente a été gardée et identifiée par la technique MALDI-TOF

et/ou par séquençage de gènes de ménage.

IV.1. Identification des isolats

La technique MALDI-TOF a été utilisée pour l’identification des souches isolées des lots de

crevettes, de homards, de mollusques bivalves et des poissons plats et sur les géloses TBX, Brillance

Salmonella, Slanetz & Bartley et ChromID®. Au total, 548 isolats ont été identifiés par cette technique

dont 200 identifiés au genre bactérien et 348 à l’espèce bactérienne.

En parallèle, l’identification bactérienne par l’amplification et le séquençage du gène de

l’ADNr 16S a été effectuée sur tous les isolats de cette étude (n = 1882 souches). Parmi ces souches,


79

692 (37 %) ont été identifiées au genre et 763 (41 %) à l’espèce. De plus, ces résultats ont été

complétés pour 289 souches par l’amplification et le séquençage des gènes de ménage gyrB, rpoB et

tuf. Le séquençage du gène gyrB a confirmé 7 souches au genre Vibrio sur 63 analysées. De plus, une

identification plus précise à l’espèce V. metschnikovii a été obtenue pour deux souches. Deux

souches n’ont pas été confirmées Vibrio mais ont été identifiées comme Acinetobacter sp. et

Morganella morganii. De même, l’amplification et le séquençage du gène rpoB a été effectué sur

150 souches de Pseudomonas. Nous avons pu obtenir une identification au genre bactérien pour

80 souches. L’espèce bactérienne obtenue par la technique MALDI-TOF et/ou séquençage de

l’ADNr 16s a été confirmée pour 2 souches (P. stutzeri et P. putida). Treize souches ont été identifiées

à l’espèce par le séquençage du gène rpoB (5 isolats P. fluorescens, 4 souches P. putida, 2 souches

P. fragi, 1 souche P. alcaliphila et 1 souche P. synthaxa). Cependant, 6 autres souches ont été

identifiées P. fluorescens par le séquençage du gène rpoB alors que les techniques MALDI-TOF et/ou

séquençage de l’ADNr 16S les avaient identifiées P. brennerii ou P. helmanticensis. L’amplification et

le séquençage du gène tuf a été réalisé sur 76 souches de Staphylococcus. Le genre bactérien a été

confirmé pour 68 souches et l’espèce bactérienne a également été confirmée pour 30 souches. De

plus, 18 souches ont pu être identifiées jusqu’à l’espèce grâce à cette technique, dont l’espèce

S. aureus (10 souches) qui n’a pas été identifiée par le séquençage de l’ADNr 16S.

IV.2. Performance de la sélectivité des géloses

Dans ces travaux, la sélectivité des milieux sélectifs a été étudiée. Les bactéries isolées des

produits de la pêche et de l’aquaculture sur les milieux sélectifs ont été comparés à ceux décrits dans

les fiches techniques des géloses. Au total, 1882 colonies ont été isolées à partir des 14 géloses

sélectives (Tableau 8).


80

Tableau 8: Nombre d'isolats pour chaque genre bactérien identifié par milieux gélosés utilisés (n = 1882). Les cases grises correspondent à l’absence d’isolats, les cases vertes aux genres bactériens ciblés par les géloses sélectives, les cases orange aux genres bactériens non ciblés mais décrits dans les fiches techniques des géloses et les cases blanches aux genres bactériens non décrits dans les fiches techniques des géloses.

Ordres bactériens Genres bactériens

(n=1882)

Géloses sélectives* Géloses ChromID®* Total

souches TB SA PE SL AL CF TC CH GS OX ES CA VR MR

Bacilliales

Bacillus 94 22 1 74 7 24 222

Brochothrix 4 4

Exiguobacterium 8 54 57 1 1 121

Halobacillus 3 3

Kurthia 2 1 5 8

Lysinibacillus 8 8 1 17

Macrococcus 16 11 1 28

Paenibacillus 1 1

Planococcus 1 1

Salinicoccus 1 1

Savagea 1 1

Staphylococcus 1 25 1 15 14 32 1 1 90

Virgibacillus 1 6 7

Micrococcales

Arthrobacter 4 11 15

Cellulosimicorbium 2 2

Kocuria 1 1

Microbacterium 7 1 8

Micrococcus 2 2 4

Rothia 5 1 1 7

Lactobacilliales

Aerococcus 19 28 2 13 33 3 98

Carnobacterium 8 8

Desemzia 1 13 15 1 30

Enterococcus 3 27 76 11 5 1 1 6 4 2 15 151

Lactococcus 10 10 2 2 1 25

Streptococcus 4 7 11

Vagococcus 47 13 11 7 27 105

Enterobacterales

Citrobacter 3 9 1 1 1 15

Enterobacter 2 2 1 5

Escherichia 4 4 8

Hafnia 1 2 3

Klebsiella 2 1 3

Kluyvera 3 2 1 6

Lelliottia 3 3

Moellerella 1 1 1 3

Morganella 11 10 8 3 9 41

Pantoea 4 1 5

Proteus 6 14 21 21 17 1 12 1 93

Providencia 2 4 4 2 2 1 1 16

Serratia 8 5 5 1 3 7 29


81


(n=1882)

Géloses sélectives* Géloses ChromID®* Total

souches TB SA PE SL AL CF TC CH GS OX ES CA VR MR

Rahnella 1 1 2

Yersinia 1 1 2 4

Pseudomonadales

Acinetobacter 1 4 5 3 10 1 24

Psychrobacter 2 1 14 8 25

Pseudomonas 3 1 14 1 53 1 2 21 6 16 12 130

Aeromonadales Aeromonas 2 12 2 14 4 34

Oceanimonas 2 2

Vibrionales Vibrio 31 27 16 74

Xanthomonadales Stenotrophomonas 5 2 10 9 1 27

Alteromonadales Shewanella 2 1 20 10 12 45

Pseudoalteromonas 1 1

Oceanospirillales Halomonas 2 4 6

Flavobacteriales Myroides 2 6 8

Chryseobacterium 2 2

Sphingobacteriales Sphingobacterium 2 2

Caulobacterales Brevundimonas 11 2 1 21 35

Rhizobiales Pseudochrobactrum 2 2

Ochrobactrum 1 1 2

Non identifiées 1 11 45 9 13 34 34 38 41 15 10 4 3 259

Total souches 27 78 392 147 113 156 237 345 174 6 53 39 37 78 1882

Nombre de genres

par gélose 10 15 28 8 14 17 22 23 25 1 5 6 6 11

* TB=TBX, SA= brillance Salmonella, PE= PEMBA, SL=gélose selon Slanetz et Bartley, AL=

ALOA, CF=CFC, TC= TCBS, CH=Chapman, GS= GSP, OX= chromID OXA-48, ES= ChromID ESBL, CA=

ChromID Carba, VR= ChromID VRE, MR=ChromID MRSA.

Le nombre d’isolats de caractéristiques morphologiques (forme, couleur, taille) différentes

prélevées sur les géloses ChromID® allait de 6 colonies différentes sur la gélose ChromID®OXA-48 à

78 colonies sur la gélose ChromID®MRSA. L’identification de tous les isolats prélevés sur la gélose

ChromID®OXA-48 a été obtenue alors que 28 % des isolats prélevés sur la gélose ChromID®ESBL

n’ont pas été identifiés. Le nombre d’isolats de caractéristiques différentes prélevés sur les autres

géloses sélectives variait de 27 sur le milieu TBX à 392 sur le milieu PEMBA. Les proportions d’isolats

non identifiés par gélose allaient de 4 % pour le milieu TBX à 24 % pour la gélose GSP.

Les isolats prélevés sur les géloses Brillance salmonella, CFC, GSP , ChromID®BLSE,

ChromID®Carba, ChromID®VRE et TBX étaient des bactéries Gram négatif, pour 100 %, 99 % 93 %, 89


82

%, 87 % et 75 % respectivement. Les isolats identifiés sur les autres géloses étaient majoritairement

des bactéries Gram positif, 96 % des isolats obtenus sur les milieux ChromID®MRSA, 93 % sur Slanetz

& Bartley, 77 % sur ALOA, 71 %sur PEMBA, 70 % sur Chapman et 50 % sur TCBS.

La diversité des genres bactériens isolés sur les géloses ChromID® était faible (1 à 11 genres

bactériens identifiés). La performance d’isolement des genres bactériens ciblés par ces milieux

spécifiques était faible allant de 0 à 13 % selon les géloses. Les genres bactériens non ciblés, mais

décrits dans les fiches techniques, représentaient de 0 à 50 % des isolats obtenus sur les différentes

géloses ChromID®. La plus sélective était la gélose ChromID®OXA-48, seulement 6 isolats de

Pseudomonas sp. ont été obtenus. L’isolement de ce genre bactérien sur cette gélose n’était pas

décrit sur la fiche technique du produit. Au contraire, la gélose ChromID®MRSA était la moins

sélective des ChromID® avec 78 isolats prélevés et 11 genres bactériens identifiés. Une seule souche

de Staphylococcus stepanovicii a été isolée de cette gélose. Elle était blanche et non caractéristique.

Bacillus spp. (30 %) et Enterococcus spp. (19 %) ont également été isolés sur la gélose

ChromID®MRSA. Selon le fournisseur, ces genres peuvent être isolés de ce milieu sélectif. De plus,

35 % des isolats étaient des Vagococcus spp., un genre bactérien qui n’était pas décrit dans la fiche

technique du produit. Sur la gélose ChromID®ESBL, cinq genres bactériens ont été identifié donc

Serratia (n=7) qui était le seul identifié ciblé par cette gélose. Trois colonies étaient caractéristiques

(bleu-vert) mais les autres étaient blanches. Cependant, la majorité des souches isolées de cette

gélose étaient Pseudomonas (30 %) et Stenotrophomonas (19 %). L’isolement de Pseudomonas était

décrit dans la fiche technique du produit mais pas Stenotrophomonas. De même, une seule souche

de Citrobacter freundii a été isolée sur la gélose ChromID®CARBA. Bien que ce genre bactérien soit

ciblé, la colonie ne présentait pas la couleur caractéristique bleu-vert mais elle était blanche. De plus,

la majorité des souches isolées ont été identifiées comme Pseudomonas spp. (31 %) et

Stenotrophomonas spp. (23 %), comme sur la gélose ChromID®ESBL. Le genre ciblé par cette gélose


83

était Pseudomonas mais pas Stenotrophomonas. En outre, 4 souches ont été isolées et identifiées

comme le genre Enterococcus sur la gélose ChromID®CARBA ce qui correspond au genre ciblé décrit

dans la fiche technique. Par ailleurs, six genres bactériens ont été isolés à partir de la gélose

ChromID®VRE, le genre principal ciblé par cette gélose était Enterococcus. Deux souches ont été

identifiées comme E. thailandicus avec des colonies blanches et non caractéristiques sur le milieu. La

majorité des isolats étaient des Brevundimonas spp. (58 %) et ce genre bactérien n’était pas attendu

sur cette gélose.

En ce qui concerne les géloses autres que les milieux ChromID®, les plus sélectives étaient le

TBX et la Slanetz & Bartley car moins de 10 genres bactériens différents ont été identifiés sur

chacune d’elles. Au contraire, une diversité bactérienne plus ou moins importante a été observée sur

les autres géloses allant de 14 genres bactériens sur l’ALOA à 28 genres sur le PEMBA. Les

proportions des genres ciblés, isolés sur les géloses utilisés, allaient de 0 à 52 %. La gélose Slanetz &

Bartley était la plus performante pour isoler le genre bactérien cible Enterococcus. Il représentait

52 % des isolats prélevés sur cette gélose. Selon les genres bactériens ciblés, Bacillus représentait 24

% des isolats sur le milieu PEMBA, Pseudomonas 34 et 12 % des isolats sur les géloses CFC et GSP

respectivement, Vibrio 13 % des isolats sur le milieu TCBS, Staphylococcus 9 % des isolats sur le

milieu Chapman et Aeromonas 8 % des isolats sur la gélose GSP. La totalité des autres genres

bactériens isolés sur les géloses Slanetz & Bartley (48 %), TBX (85 %), Chapman (91 %) et GSP (80 %)

n’étaient pas décrits dans les fiches techniques des milieux de culture. Les proportions les plus

importantes d’isolats bactériens non décrits étaient Aerococcus (19 %) sur la gélose Slanetz &

Bartley, Enterobacteriales (63 %) sur le TBX, Exiguobacterium (17 %) sur la gélose Chapman et Vibrio

(9 %) sur la gélose GSP, Vagococcus (12 %) sur la gélose PEMBA, Staphylococcus (13 %) sur le milieu

ALOA Proteus (13 %) sur la gélose CFC et Exiguobacterium (23 %) sur la gélose TCBS. La majorité des

colonies isolées sur la gélose Brillance salmonella (99 %) étaient des Enterobacterales. Les genres


84

bactériens attendus sur la gélose Brillance Salmonella représentaient 45 % des isolats, les autres

(55 %) n’étaient pas décrits sur la fiche technique du produit.

Lors de l’analyse de résultats d’identification à l’espèce, les plus importantes diversités ont

été observées sur les milieux PEMBA (57 espèces) et Chapman (56 espèces) (Annexe I). Certaines des

espèces isolées de ces géloses étaient de potentiels pathogènes alimentaires (B. cereus, E. coli,

S. aureus) (Tableau 9). D’autres espèces isolées étaient des marqueurs d’hygiène

(Staphylococcus spp., E. coli, Enterococcus faecalis et E. faecium).

Tableau 9: Nombre d'isolats par gélose des espèces bactériennes. Les espèces présentées appartiennent aux genres bactériens avec plus de 100 isolats et aux genres bactériens dont au moins une espèce est potentiellement un pathogène alimentaire. Les espèces bactériennes en rouge sont de potentiels pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène dans les aliments.

Genres bactériens

Espèces bactériennes

Géloses sélectives* ChromID®* Total souch

e TB

SA

PE

SL AL

CF

TC

CH

GS

OX

ES

CA

VR

MR

Bacillus

B. altitudinis 1 2 3

B. aquimaris 1 1

B. cereus 12

6 8 5 17 48

B drentensis 1 1

B. firmus 5 5

B. flexus 1 1

B. horikoshii 1 1

B. infantis 1 1

B. invictae 1 1

B. licheniformis 1 4 2 7

B. marisflavii 5 5

B. megaterium 1 1

B. nealsonii 3 3

B. oceanisediminis 7 7

B. oshimensis 1 1

B. paralicheniformis 1 1 2

B. pumilus 8 3 6 17

B. safensis 1 1

B. stratosphericus 3 3

B. subtilis 7 1 8

B. thuringiensis 2 1 3

B. vallismortis 1 1


85

Genres bactériens



e TB

SA

PE

SL AL

CF

TC

CH

GS

OX

ES

CA

VR

MR

B. xianamensis 1 1

Bacillus sp. 59

5 1 28 2 5 100

Nombre d’espèces Bacillus 8 5 18 1 3

Exiguobacterium

E. acetylicum 2 4 6

E. aestuarii 4 33

30 1 1 69

E. aurantiacum 4 2 6

E. marinum 3 4 7

E. profundum 1 3 5 9

Exiguobacterium sp. 1 11

12 24

Nombre d’espèces Exiguobacterium 3 4 5 1 1

Staphylococcus

S. aureus 2 1 2 3 8

S. cohnii 3 1 4

S. epidermidis 2 1 3

S. equorum 3 4 7

S. haemolyticus 2 1 3

S. hominis 1 1

S. lentus 3 5 7 1 16

S. pasteuri 5 3 8

S. saprophyticus 1 2 1 4

S. sciuri 2 3 4 2 11

S. stepanovicci 1 1

S. warneri 1 3 4

Staphylococcus sp. 3 5 2 10 20

Nombre d’espèces Staphylococcus 1 8 1 5 4 8 1 1

Enterococcus

E. aquamarinus 1 1 2

E. casseliflavus 1 7 8

E. durans 1 1

E. faecalis 2 7 29

3 5 4 3 9 69

E. faecium 1 3 6 1 11

E. gallinarum 2 2

E. italicus 1 1 2

E. malodoratus 1 5 6

E. thailandicus 7 21

5 1 1 1 1 2 2 41

Enterococcus sp. 5 5 2 1 3 16

Nombre d’espèces Enterococcus 2 7 8 3 1 1 1 2 2 1 3

Vagococcus

V. carniphilus 6 6

V. fluvialis 26

5 7 6 22 66

V. lutrae 2 2


86

Genres bactériens



e TB

SA

PE

SL AL

CF

TC

CH

GS

OX

ES

CA

VR

MR

V. penaei 2 2 1 5

Vagococcus sp.

13 6 2 1 4

26

Nombre d’espèces Vagococcus 3 2 2 1 2

Pseudomonas

P. alcaliphila 1 1

P. brenneri 1 1 4 1 4 11

P. cichorii 2 1 2 5

P. fluorescens 2 5 7

P. fragi 1 1 2

P. frederikbergensis 1 1

P. helmanticensis 2 1 1 4

P. libanensis 1 1

P. marginalis 2 2 4

P. mendocina 1 1

P. mosselii 1 1

P. putida 3 1 1 5

P. stutzeri 2 1 3

P. tolaasii 1 1 2

P. trivialis 1 1

P. weihenstephanensis

1 1 2

Pseudomonas sp. 1 1 7

30 1

12 6

12 9

79

Nombre d’espèces Pseudomonas 1 5 1 11

2 5 4 2

Vibrio

V. alginolyticus 5 3 8

V. casei 1 1

V. metschnikovii 10

6 8 24

V. mytili 1 1

V. natriegens 2 2

Vibrio sp. 14

16 8 38

Nombre d’espèces Vibrio 3 4 1

Escherichia E. coli 4 3 7

E. hermanii 1 1

Nombre d’espèces Escherichia 1 1

* TB=TBX, SA= brillance Salmonella, PE= PEMBA, SL=gélose selon Slanetz et Bartley, AL=

ALOA, CF=CFC, TC= TCBS, CH=Chapman, GS= GSP, OX= chromID OXA-48, ES= ChromID ESBL, CA=

ChromID Carba, VR= ChromID VRE, MR=ChromID MRSA.


87

Les bactéries du genre Bacillus ont été isolées principalement sur 4 géloses, PEMBA (42 %),

Chapman (33 %), ChromID®MRSA (11 %) et ALOA (10 %). La diversité des espèces de Bacillus isolées

sur la gélose Chapman (18 espèces) était plus importante que celle obtenue sur la gélose PEMBA (8

espèces) ou l’ALOA (5 espèces). Sur la gélose Chapman, les colonies de Bacillus spp. étaient roses ou

jaunes alors que sur le milieu PEMBA, elles étaient blanches, bleues, vertes ou jaunes. Pour l’espèce

pathogène alimentaire B. cereus, des colonies ont été détectées sur 5 milieux sélectifs,

ChromID®MRSA (35 % des isolats), PEMBA (25 %), Chapman (17 %), ALOA (13 %) et GSP (10 %). Les

colonies de cette espèce étaient caractéristiques (bleue) ou non caractéristiques (vertes) sur le milieu

PEMBA, turquoise ou blanches sur le milieu ALOA, blanche sur le milieu ChromID®MRSA et roses ou

jaunes sur le milieu Chapman.

Les souches du genre Staphylococcus ont été isolées majoritairement sur les géloses

Chapman (36 %), PEMBA (28 %), ALOA (17 %) et TCBS (16 %). Huit espèces de ce genre ont été

isolées sur les géloses Chapman et PEMBA, 4 sur ALOA et 5 sur TCBS. Les colonies étaient jaunes,

roses et orange sur le milieu Chapman et jaunes ou vertes sur le milieu PEMBA, turquoise, jaunes et

blanches sur le milieu ALOA et vertes sur le milieu TCBS. Les colonies de l’espèce pathogène

alimentaire S. aureus étaient jaunes (colonies caractéristiques) ou orange sur le milieu Chapman,

jaunes sur le milieu PEMBA, blanches sur le milieu ALOA et jaunes ou vertes sur la gélose TCBS.

Pour le genre Enterococcus, les colonies ont été isolées principalement sur la gélose selon

Slanetz & Bartley (50%) puis à 19 % sur le milieu PEMBA et 10 % sur la gélose ChromID®MRSA. Huit

espèces de ce genre ont été isolées sur la gélose Slanetz & Bartley, 7 sur le milieu PEMBA et 3 sur la

gélose ChromID®MRSA. Les espèces E. faecalis et E. faecium sont des marqueurs de contamination

fécale. Elles font des colonies roses/rouges/bordeaux sur la gélose Slanetz & Bartley (colonies

caractéristiques), jaunes ou blanches sur le milieu PEMBA et turquoise sur le milieu ChromID®MRSA.

Pour le genre Vibrio, les isolats ont été détectés sur les milieux TCBS (42 %), Chapman (36 %)

et GSP (22 %). Un enrichissement a été réalisé dans du bouillon EPSA pour sélectionner ce genre


88

bactérien puis isolé sur le milieu TCBS (colonies vertes ou jaunes), sur le milieu Chapman (colonies

jaunes ou roses) et sur le milieu GSP (colonies roses ou jaunes). Aucune espèce pathogène

alimentaire du genre Vibrio n’a été isolée. Sur le milieu TCBS, 3 espèces ont été identifiées, 4 sur la

gélose Chapman et seul V. metschnikovii a été isolée sur la gélose GSP.

Les souches de Pseudomonas spp. ont été majoritairement isolées sur les milieux CFC (41 %),

GSP (16 %), ChromID®BLSE (12 %), PEMBA (11 %) et ChromID®CARBA (9 %) avec une diversité

d’espèces de 2 sur la gélose ChromID®CARBA à 11 sur le milieu CFC. Les colonies de Pseudomonas

spp. étaient roses sur le milieu GPS, marron/beiges sur la gélose ChromID®BLSE, jaunes et vertes sur

le milieu PEMBA et blanches, jaunes ou jaune fluo sur le milieu CFC.

Des colonies Escherichia coli potentiellement pathogènes pour l’homme, de couleur

turquoise (colonies caractéristiques) et blanche, ont été isolées sur le milieu TBX (50 %) et de couleur

incolore ou beige sur le milieu Brillance Salmonella (50 %).

Deux genres bactériens, Exiguobacterium et Vagococcus, ont été également fréquemment

isolés, plus de 100 souches par genre. Les souches du genre Exiguobacterium ont été principalement

isolées des géloses Chapman (47 %) et TCBS (45 %). La diversité bactérienne obtenue pour ce genre

bactérien sur ces géloses était similaire. Les colonies de ce genre bactérien apparaissaient en grande

majorité jaunes sur les deux géloses, parfois roses sur le milieu Chapman ou vertes sur le milieu

TCBS. L’espèce majoritaire E. aestuarii a été isolée à 43 % du milieu TCBS et 49 % du milieu Chapman.

Les souches de Vagococcus spp. ont été isolées majoritairement des géloses PEMBA (45 %),

ChromID®MRS (26 %), Slanetz & Bartley (12 %), et TCBS (10 %). Les colonies de Vagococcus spp.

étaient jaunes, vertes ou bleues sur PEMBA, roses, rouges, bordeaux sur Slanetz & Bartely et jaunes

ou vertes sur TCBS. Sur la gélose ChromID®MRSA, elles formaient des microcolonies blanches ou

vertes. L’espèce V. fluvialis a été isolée majoritairement des géloses PEMBA (39 %) et

ChromID®MRSA (33 %).


89

IV.3. Discussion

Une première étape de sélection de la flore bactérienne présente dans les produits de la

pêche et de l’aquaculture a été faite par l’enrichissement à 30 °C dans un bouillon nutritif. Cette

température a favorisé la croissance et la sélection de la flore mésophile. De plus, tous les

échantillons ont été congelés avant d’être analysés. Cette étape est stressante pour les bactéries et

elles ont pu entrer en état viable non cultivable (Semanchek et Golden 1998). En raison des étapes

de congélation et d’enrichissement, des genres bactériens comme Aeromonas, Shewanella et Vibrio,

considérés comme naturellement présents dans le milieu aquatique était attendu dans plus de

produits (Ronholm et al. , Poirel et al. 2004, Richards et al. 2008, Janda et Abbott 2010, Usui et al.

2016, Baker-Austin et al. 2017, Baron et al. 2017a, Ceccarelli et al. 2017). Cependant, l’utilisation

d’un bouillon nutritif salé, EPSA, a favorisé la sélection de bactéries halophiles comme certaines

espèces de Vibrio spp. En effet, Vibrio spp. a été isolé sur les géloses TCBS, Chapman et GSP qui ont

été ensemencées à partir du bouillon EPSA enrichi. De plus, les échantillons de homard et de noix de

Saint-Jacques ont été préparés comme décrit dans la norme ISO/TS 21872-1 et 2 de détection des

Vibrio pathogènes alimentaires pour l’homme, ce qui aurait pu favoriser la sélection de certaines

espèces de ce genre.

La diversité bactérienne observée peut en partie s’expliquer par le nombre et la sélectivité

des agents sélectifs présents dans les différentes géloses utilisées. En effet, ces agents sélectifs sont

utilisés pour empêcher la croissance de bactéries non ciblées sur la gélose. Cependant, plusieurs

genres/espèces bactériennes peuvent également être résistants à l’agent sélectif. Par exemple, dans

la gélose Slanetz & Bartley, l’azide de sodium est utilisé comme agent sélectif. Ce sel inhibe la

croissance de la plupart des bactéries Gram négatif et quelques genres bactériens Gram positif,

comme Bacillus. Les genres bactériens qui ont pu être isolés sur cette gélose comme Staphylococcus,

Aerococcus, Streptococcus, sont naturellement résistants à l’azide de sodium (Lichstein et Soule

1944). De même, la polymyxine B est utilisée dans la gélose PEMBA et cet antibiotique est inactif sur


90

les bactéries Gram positif et certaines bactéries Gram négatif comme Proteus spp. et Morganella

spp. Il est donc normal d’avoir des variétés bactériennes différentes selon les géloses utilisées.

De plus, sur les géloses sélectives les espèces ou les genres bactériens ciblés sont mis en

évidence visuellement grâce à leurs caractéristiques biochimiques. Par exemple, sur la gélose Slanetz

& Bartley, Enterocccus spp. réduit le chlorure de tétrazolium, donnant aux colonies une couleur

rouge/marron. Les bactéries ne pouvant pas réduire ce sel donnent des colonies roses. Cependant, la

fiche technique du produit indique que des souches d’Enterococcus spp. ne sont pas capables de

réduire ce sel, ce qui a été noté dans cette étude. De même, un substrat chromogénique est utilisé

dans la gélose ALOA, pour mettre en évidence la production d’une β-glucosidase. Les colonies de

Listeria spp. sont colorées en turquoise. Cependant, dans cette étude, aucune Listeria n’a été

identifiée et des colonies de Bacillus spp. turquoise ont été observées sur cette gélose. Ce

phénomène a déjà été décrit sur ALOA, les colonies de Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus avaient

la même couleur que celles de Listeria spp. (Angelidis et al. 2015).

Les agents sélectifs contenus dans les géloses de la gamme ChromID® ne sont pas toujours

indiqués dans les fiches techniques des produits. De ce fait, il est difficile de savoir si les bactéries

présentant des colonies non caractéristiques isolées sur ces milieux sont naturellement résistantes

aux antibiotiques sélectifs ou si elles ont acquis une résistance. C’était notamment le cas pour les

géloses ChromID®MRSA et ChromID®OXA-48. Cependant, pour les géloses ChromID®BLSE,

ChromID®CARBA et ChromID®VRE un des agents sélectif est connu. Le cefpodoxime, qui est une

céphalosporine 3ème génération, est utilisé comme marqueur de β-lactamases à spectre étendu dans

le milieu ChromID®BLSE. La grande majorité des genres isolés sur cette gélose (Enterococcus,

Pseudomonas, Stenotrophomonas) sont naturellement résistants à cet antibiotique. De même, un

carbapénème est utilisé dans la gélose ChromID®CARBA, des bactéries comme Enterococcus

résistants à la vancomycine, Stenotrophomonas et Pseudomonas peuvent se développer sur ce

milieu. Le constat est le même pour le milieu ChromID®VRE où la vancomycine est utilisée comme


91

agent sélectif. Certaines espèces du genre Enterococcus sont naturellement résistantes et peuvent se

développer sur ce milieu. De plus, des souches du genre Brevundimonas ont été isolées sur cette

gélose. Cette bactérie Gram négatif doit être naturellement à l’ensemble des agents sélectifs utilisés.

Enfin, la sélection des colonies a été réalisée sur leurs morphologies, or les caractères visuels sont

subjectifs. La sélection des colonies dépend donc du manipulateur et des conditions environnantes

(luminosité, couleur du support de lecture, …). De plus, sur certaines géloses, un changement de pH

entraine le changement de couleur de la gélose et des colonies ce qui peut donner une « fausse »

coloration à ces colonies.

V. Diversité de la flore bactérienne des produits de la pêche et de

l’aquaculture

Ces travaux n’avaient pas pour but d’être exhaustif sur toute la flore bactérienne présente dans

les produits de la pêche mais nous nous sommes focalisés sur la flore mésophile cultivable.

Au total, 1882 souches bactériennes ont été isolées des produits de la pêche et de

l’aquaculture analysés (Annexe II). Trente et un pourcents ont pu être identifiés jusqu’au genre et 55

% jusqu’à l’espèce. Il y avait 969 bactéries Gram positif (26 genres, 80 espèces) et 656 bactéries Gram

négatif (31 genres et 70 espèces). La composition des flores bactériennes ne changeaient pas entre

les branchies et les prélèvements de peau des poissons. De ce fait, nous avons décidé de ne pas tenir

compte de l’origine des isolats (peau ou branchie) pour l’analyse de la flore bactérienne isolée des

poissons.

V.1. Diversité et proportion des bactéries Gram positif isolées des


Les bactéries Gram positif isolées des prélèvements appartenaient à 3 ordres bactériens, 504

souches de Bacilliales (13 genres), 428 souches de Lactobacilliales (7 genres) et 46 souches de

Micrococcales (6 genres) (Tableau 10).


92

Tableau 10: Proportion des genres bactériens Gram positif dans les produits de la pêche et de l'aquaculture. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats (n=978).

Ordres

bactériens Genres bactériens

Proportion d’échantillons positifs (%)

Ca

(n=15)

Pp

(n=15)

Cr

(n=91)

Ho

(n=15)

Mo

(n=15)

Hu

(n=15)

St

(n=15)

Bacilliales

Bacillus

Halobacillus

Paenibacillus

Lysinibacillus

Virgibacillus

Exiguobacterium

Brochothrix

Kurthia

Planococcus

Salinicoccus

Savagea

Macrococcus

Staphylococcus

Micrococcales

Arthrobacter

Cellulosimicorbium

Microbacterium

Kocuria

Micrococcus

Rothia

Lactobacilliales

Aerococcus

Carnobacterium

Desemzia

Enterococcus

Lactococcus

Vagococcus

Streptococcus

0 %

100 %


93

Au moins une souche appartenant à l’ordre des Bacilliales a été détectée dans toutes les

catégories de produits analysés. Staphylococcus (n=90) était le seul genre bactérien isolé de toutes

les catégories de produits analysés, et principalement des échantillons de cabillaud (87 %), des

poissons plats (60 %) et des moules (40 %). Les souches du genre Bacillus (n=220) étaient également

isolées de toutes les catégories de produits de la pêche et de l’aquaculture sauf des noix de Saint-

Jacques. Ils ont été principalement isolés des crevettes (66 %), des homards (47 %), des cabillauds

(33 %) et des huîtres (20 %). Par ailleurs, des souches du genre bactérien Exiguobacterium (n=121)

ont été isolées dans 25 à 47 % des échantillons de poissons et de crustacés. Parmi les mollusques

analysés, seul 1 échantillon de noix de Saint-Jacques était positif pour le genre Exiguobacterium.

Des souches appartenant à l’ordre des Lactobacilliales ont été isolées de toutes les catégories

de produits sauf des huîtres. Le genre Enterococcus (n=151) a été détecté dans le plus grand nombre

de produits. Il était présent dans 80 % des échantillons de noix de Saint-Jacques, 60 % des

échantillons de poissons plats, 40 % des échantillons de cabillaud, et 20 % des échantillons de

homard et de moules. De même, les souches du genre Vagococcus (n=105) ont été isolées de 87 %

des échantillons de poissons plats, 67 % des cabillauds, 47 % des échantillons de noix de Saint-

Jacques et 40 % des échantillons de homard.

Par contre, les bactéries de l’ordre des Micrococcales ont été peu isolées des produits

analysés. Elles ont été détectées dans les échantillons de poissons et de crevettes. Un seul

échantillon de moule était positif pour le genre Micrococcus. Les souches d’Arthrobacter (n=15)

étaient les plus fréquemment isolées des échantillons, et principalement des cabillauds (47 %).

V.1.A. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Bacilliales

La diversité bactérienne au sein de l’ordre des Bacilliales était la plus importante avec 13

genres et 51 espèces bactériennes (Tableau 10 & 11).


94

Tableau 11: Bacilliales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats. Les espèces bactériennes en rouge sont de potentiels pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène dans les aliments.

Genres bactériens (proportion de

souches identifiées à l’espèce dans le

genre)



Ca (n=15)

Pp (n=15)

Cr (n=91)

Ho (n=15)

Mo (n=15)

Hu (n=15)

St (n=15)

Bacillus (55 %)

B. altitudinis

B. aquimaris

B. cereus

B. drentensis

B. firmus

B. flexus

B. horikoshii

B. infantis

B. invicate

B. licheniformis

B. marisflavii

B. megaterium

B. nealsonii

B. oceanisediminis

B. oshimensis

B. paralicheniformis

B pumilus

B. safensis

B. stratosphericus

B. subtilis

B. thuringiensis

B. vallismortis

B. xianamensis

Brochotrix (100 %) B. thermosphacta

Exiguobacterium (80 %)

E. acetylicum

E. aestuarii

E. aurantiacum

0 %

100 %


95



genre)



Ca (n=15)

Pp (n=15)

Cr (n=91)

Ho (n=15)

Mo (n=15)

Hu (n=15)

St (n=15)

E. marinum

E. profundum

Kurthia (100 %) K. gibsoni

K. zopfii

Lysinibacillus (18 %)

L. boronitolerans

L. fusiformis

L. sphaericus

Macrococus (75 %) M. caseolyticus

Paenibacillus (100 %) P. lactis

Planococcus (100 %) P. maritimus

Staphylococcus (82 %)

S. aureus

S. cohnii

S. epidermidis

S. equorum

S. haemolyticus

S. hominis

S. lentus

S. pasteuri

S. saprophyticus

S. sciuri

S. stepanovicii

S. warneri

S. xylosus

Virgibacillus (14 %) V. halodenitrificans

Pour les matrices alimentaires, les crevettes étaient celles contenant la plus grande diversité

d’espèces bactériennes cultivables appartenant à l’ordre des Bacilliales. Il y avait 40 espèces

bactériennes identifiées dans l’ensemble des échantillons de crevettes analysés. La diversité

d’espèces bactériennes était la plus importante pour les genres Bacillus (21 espèces), Staphylococcus

(9 espèces) et Exiguobacterium (4 espèces). Dans les prélèvements de cabillauds et de poissons plats,

il y avait 15 espèces de Bacilliales différentes, dont 7 et 9 espèces de Staphylococcus respectivement.

La diversité des Bacilliales isolées des autres matrices était faible ; 5 espèces dans les moules et les

homards, 3 dans les huîtres et 4 dans les noix de Saint-Jacques.

0 %

100 %


96

Pour les genres bactériens, la plus grande diversité en nombre d’espèces bactériennes a été

observée dans le genre Bacillus. En effet, 46 % des espèces de Bacilliales appartenaient à ce genre

bactérien suivi des genres Staphylococcus (26 % des espèces de Bacilliales) et Exiguobacterium (10 %

des espèces de Bacilliales). En effet, les espèces de Bacillus étaient principalement isolées des

crustacés et en particulier des crevettes (21 espèces). Bacillus cereus était la principale espèce isolée

(48 isolats) dans 23 % des échantillons de crevettes et 20 % des échantillons de homard. De plus, les

espèces de Staphylococcus ont été isolées de toutes les catégories de produits mais le nombre

d’échantillons positifs était variable. En effet, l’espèce S. lentus a été détectée dans 33 % des

échantillons de cabillauds suivi de l’espèce S. aureus qui a été isolée dans 27 % des cabillauds et 7 %

des poissons plats. Parmi les 5 espèces identifiées du genre Exiguobacterium, la plus fréquemment

isolée était E. aestuarii (n=69) dans 33 % des échantillons de poissons plats, 27% des échantillons de

cabillauds, 20 % des échantillons de homards et 19% des échantillons de crevettes. Enfin, d’autres

espèces bactériennes ont été détectées de plusieurs catégories de matrices analysées mais en moins

grand nombre comme par exemple Brochotrix thermosphacta isolé des cabillauds (2/15

échantillons), des poissons plats (1/15 échantillons), des noix de Saint-Jacques (1/15 échantillons) et

des crevettes (1/15 échantillons).

V.1.B. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des

Lactobacilliales

La diversité bactérienne au sein de l’ordre des Lactobacilliales était plus faible que celle des

Bacilliales, il y avait 7 genres et 21 espèces (Tableau 10 et 12).

Les bactéries de l’ordre bactérien Lactobacilliales étaient isolées de l’ensemble des

catégories de produits sauf des huîtres avec une diversité des espèces qui était la plus importante

dans les genres Enterococcus (9 espèces), Vagococcus (4 espèces) et Lactococcus (3 espèces). Les

espèces du genre Enterococcus les plus fréquemment isolées étaient E. faecalis (n=62) et E.


97

thailandicus (n=41). E. faecalis a été principalement détecté dans les noix de Saint-Jacques (47 %) et

des poissons plats (33 %). De même, E. thailandicus a été principalement isolé des poissons plats

(27%). Parmi les espèces de Vagococcus, V. fluvialis était la plus présente dans les produits analysés

(n=66). Elle a été détectée dans 80 % des échantillons de poissons plats, 47 % des échantillons de

cabillauds et 33 % des échantillons de noix de Saint-Jacques et de homards. Enfin, trois espèces de

Lactococcus ont été isolées uniquement des échantillons de moules et de crevettes de 7 à 13 % de

prévalence.

Tableau 12: Lactobacilliales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène dans les aliments.



genre)



Ca (n=15)

Pp (n=15

Cr (n=91)

Ho (n=15)

Mo (n=15)

Hu (n=15)

St (n=15)

Aerococcus (73 %) A. urinaeequi

A. viridans

Carnobacterium (13 %)

C. maltaromaticum

Desemzia (100 %) D. incerta

Enterococcus (89 %)

E. aquamarinus

E. casseliflavus

E. durans

E. faecalis

E. faecium

E. gallinarum

E. italicus

E. malodoratus

E. thailandicus

Lactococcus (84 %)

L. garvieae

L. lactis

L. raffinolactis

Streptococcus (18 %) S. parauberis

Vagococcus (75 %)

V. carniphilus

V. fluvialis

V. lutrae

V. penaei

0 %

100 %


98

De plus, certaines espèces bactériennes ont été isolées principalement des cabillauds comme

Desemzia incerta (53 % des échantillons) ou Aerococcus urinaeequi (80 % des échantillons).

V.1.C. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Micrococcales

La diversité bactérienne au sein de l’ordre des Micrococcales était la plus faible des familles

bactériennes Gram positif identifiées, il y avait 6 genres et 9 espèces (Tableau 10 et 13).

Tableau 13: Micrococcales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats.

Genres bactériens (proportion de souches

identifiées à l’espèce dans le genre)



Ca (n=15)

Pp (n=15

Cr (n=91)

Ho (n=15)

Mo (n=15)

Hu (n=15)

St (n=15)

Arthrobacter (20 %) A. soli

A. woluwensis

Cellulosimicrobium (50 %) C. cellulans

Kocuria (100 %) K. palustris

Microbacterium (88 %)

M. arborescens

M. esteraromaticum

M. paraoxydans

Micrococcus (100 %) M. aloeverae

M. luteus

Peu d’isolats de cet ordre bactérien ont été obtenus en comparaison des autres ordres

(n=46). Les crevettes étaient les matrices contenant la plus grande diversité d’espèces bactériennes

cultivables, 8 des 9 espèces bactériennes identifiées appartenant à l’ordre des Micrococcales. La

diversité des Micrococcales était faible dans les cabillauds (4 genres ; 1 espèce), les poissons plats (2

genres ;1 espèce) et les moules (1 genre ; 1epsèce). De plus, aucun isolat de l’ordre des

Micorcoccales n’a été identifié dans les homards, les huîtres et les noix de Saint-Jacques.

V.2. Diversité et proportion des bactéries Gram négatif isolées des


La diversité bactérienne des bactéries Gram négatif étaient plus importante que celle des

Gram positif. La majorité des souches identifiées était des γ-proteobacteria (589 souches). Il y avait 7

0 %

100 %


99

ordres bactériens identifiés : Enterobacteriales (236 souches), Pseudomonodales (173 souches),

Vibrionales (74 souches), Alteromondales (46 souches), Aeromonales (37 souches), Xanthomonadales

(17 souches) et Oceanospiralles (6 souches). Les autres souches identifiées étaient des α-

proteobacteria (39 souches) dont 35 Caulobacteriales et 4 Rhizobiales, des Flavobacteriia (10

Flavobacteriales) et des Sphingobacteriia (2 Sphingobacteriales) (Tableau 14).

Tableau 14 : Proportion des genres bactériens Gram négatif dans les produits de la pêche et de l'aquaculture. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats (n=640).



Ca

(n=15)

Pp

(n=15)

Cr

(n=91)

Ho

(n=15)

Mo

(n=15)

Hu

(n=15)

St

(n=15)

Enterobacterales

Escherichia/Shigella

Klebsiella

kluyvera

Lelliottia

Morganella

Citrobacter

Enterobacter

Proteus

Pantoea

Rahnella

Providencia

Moellerella

Yersinia

Hafnia

Serratia

Pseudomonadales

Acinetobacter

Psychrobacter

Pseudomonas

Aeromonadales Aeromonas

Oceanimonas

Oceanospirillales Halomonas

Vibrionales Vibrio

Xanthomonadales Stenotrophomonas

Alteromonadales Shewanella

Pseudoalteromonas

Flavobacteriales Myroides

Chryseobacterium

Sphingobacteriales Sphingobacterium

Caulobacterales Brevundimonas

0 %

100 %


100



Ca

(n=15)

Pp

(n=15)

Cr

(n=91)

Ho

(n=15)

Mo

(n=15)

Hu

(n=15)

St

(n=15)

Rhizobiales Pseudochrobactrum

Ochrobactrum

Les bactéries Gram négatif ont surtout été détectées dans les échantillons de poissons et de

noix de Saint-Jacques. Et l’ordre bactérien avec le plus de diversité de genre bactérien était les

Enterobacterales qui ont été isolés dans toutes les matrices analysées. Le genre le plus détecté était

Proteus (n=93) dans 47 % des échantillons de poissons plats, 20 % de ceux de cabillauds et 13% de

ceux de homards, moules et noix de Saint-Jacques. Le genre Morganella (n=41) était également

présent dans 40 et 33 % des échantillons de noix de Saint-Jacques et de poissons plats

respectivement. De plus, les souches du genre Serratia (n=29) et Citrobacter (n=15) étaient plus

fréquentes dans les échantillons de noix de Saint-Jacques (47 % et 33%).

En comparaison, les isolats de l’ordre Pseudomonadales étaient plus associés aux

échantillons de poissons. Les souches de Pseudomonas (n=130) ont été isolées dans 93 % et 80 % des

cabillauds et poissons plats respectivement. De plus, les autres genres bactériens de cet ordre,

Psychrobacter (n = 25) et Acinetobacter (n = 24) étaient principalement isolés des cabillauds.

De plus, d’autres genres bactériens comme Vibrio (n = 74), Shewanella (n = 45) et

Brevundimonas (n = 35) ont été détectés. Par exemple, 73 et 47 % des échantillons de noix de Saint-

Jacques étaient positifs pour les genres Vibrio et Shewanella et 67 et 40 % des échantillons de

poissons plats étaient positifs pour les genres Brevundimonas et Shewanella.

V.2.A. Diversité bactérienne des γ-proteobacteria

V.2.A.a. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des

Enterobacteriales

La diversité bactérienne des souches dans cet ordre était la plus élevée parmi les ordres

Gram négatif. Il y avait 27 espèces bactériennes (tableau 15).

0 %

100 %


101

La diversité la plus importante d’Enterobacteriales a été détectée dans les échantillons de

poissons plats et de noix de Saint-Jacques. Les différentes espèces de Proteus et de Citrobacter ont

été isolées principalement des échantillons de poissons plats, mais aussi des échantillons de moules

et de noix de Saint-Jacques. De même, les espèces de Serratia ont été principalement isolées des

noix de Saint-Jacques. De plus, l’espèce Morganella morganii (n=22) a été isolée dans 33 et 20 % des

échantillons de noix de Saint-Jacques et de poissons plats respectivement. Enfin, l’espèce E. coli a été

détectée dans 1 échantillon de poissons plats et 1 échantillon de moule.

Tableau 15: Enterobacteriales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence de souches. Les espèces bactériennes en rouge sont les potentiels pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène dans les aliments.



genre)



Ca (n=15)

Pp (n=15)

Cr (n=91)

Ho (n=15)

Mo (n=15)

Hu (n=15)

St (n=15)

Citrobacter (60 %)

C. braakii

C. farmeri

C. freundii

C. gillenii

Enterobacter (80 %) E. cloacae

Escherichia (100 %) E. coli

E. hermannii

Hafnia (67 %) H. halvei

Klebsiella (33 %) K. oxytoca

Klyuvera (100 %) K. intermedia

Lelliottia (100 %) L. amnigena

Moellerella (100 %) M. wisconensis

Morganella (59 %) M. morganii

M. psychrotolerans

Pantoea (80 %) P. aglomerrans

Proteus (63 %)

P. cibarius

P. hauseri

P. terrae

P. vulgaris

Providencia (63 %) P. rettgeri

P. vermicola

Rahnella (50 %) R. inusitata

0 %

100 %


102

Serratia (48 %)

S. fonticola

S. glossinae

S. marcesens

S. quinivorans

Yersinia (50 %) Y. massiliensis

V.2.A.b. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des

Pseudomonadales

Au total, 3 genres bactériens et 22 espèces appartenant à l’ordre des Pseudomonadales ont

été isolés des produits de la pêche et de l’aquaculture analysés (Tableau 16).

Tableau 16: Pseudomonadales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence de souches.


souches identifiées à l’espèce)



Ca (n=15)

Pp (n=15)

Cr (n=91)

Ho (n=15)

Mo (n=15)

Hu (n=15)

St (n=15)

Acinetobacter (54 %) A. guillouiae

A. puyangensis

Pseudomonas (38 %)

P. alcaliphila

P. brenneri

P. cichorii

P. fluorescens

P. fragi

P. frederikbergensis

P. helmanticensis

P. libanensis

P. marginalis

P. mendocina

P. mosselii

P. putida

P. stutzeri

P. tolaasii

P. trivialis


Psychrobacter (32 %)

P. arenosus

P. celer

P. faecalis

P. maritimus

0 %

100 %


103

Les taux d’identification à l’espèce des genres Acinetobacter, Pseudomonas et Psychrobacter

étaient faibles. Les espèces identifiées dans ces genres étaient associées principalement aux

échantillons de poissons avec une grande diversité d’espèces (16 espèces) pour le genre

Pseudomonas. La moitié de ces espèces étaient du groupe P. fluorescens (P. fluorescens, P. brenneri,

P. libanensis, P. tolaasii, P. fragi, P. frederikbergensis, P. marginalis, P. trivialis) avec P. brenneri qui

était la plus isolée (47 % des échantillons de cabillauds).

V.2.A.c. Diversité bactérienne des souches appartenant aux autres γ-

proteobacteria : Vibrionales, Aeromonadales, Alteromondales, Oceanospiralles

et Xanthomonadales

Le tableau 17 montre les 14 espèces bactériennes des γ-proteobacteria qui n’appartenaient

pas aux ordres des Enterobacterales et des Pseudomonadales.

Tableau 17: Vibrionales, Aeromonadales, Alteromondales, Oceanospiralles et Xanthomonadales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence de souches.

Genres bactériens (proportion de souches identifiées à l’espèce)


Proportion

Ca (n=15)

Pp (n=15)

Cr (n=91)

Ho (n=15)

Mo (n=15)

Hu (n=15)

St (n=15)

Aeromonas (3 %) A. salmonicida

Halomonas (67 %) H. alkaphila

H. glacei

Shewanella (76 %)

S. algae

S. haliotis

S. indica

S. putrefaciens

Stenotrophomonas (74 %) S. maltophilia

S. rhizophila

Vibrio (49 %)

V. alginolyticus

V. casei

V. metschnikovii

V. mytili

V. natriegens

Les différentes espèces de Shewanella ont été isolées des poissons plats (7 à 33% des

échantillons selon les espèces) et des noix de Saint-Jacques (13 % à 27 % des échantillons selon les

espèces). De plus, l’espèce Vibrio metchnikovii a été isolée dans 60 % des noix de Saint-Jacques et

0 %

100 %


104

dans 20 % des homards. Enfin, la souche identifiée Aeromonas salmonicida a été isolée des noix de

Saint-Jacques.

V.2.B. Diversité bactérienne des souches appartenant aux α-proteobacteria :

Caulobacteriales, Flavobacteriales, Rhizobiales et Sphingobacteriales

La diversité des espèces bactériennes des α-proteobacteria (4 espèces), Sphingobacteriia (1

espèce) et Flavobacteriia (2 espèces) étaient faibles (tableau 18).

Tableau 18: α-proteobacteria, Sphingobacteriia et Flavobacteriia isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases grisées représentent l’absence de souches.

Genres bactériens (proportion de souches identifiées à l’espèce)

Espèces bactériennes Proportion

Ca (n=15)

Pp (n=15)

Cr (n=91)

Ho (n=15)

Mo (n=15)

Hu (n=15)

St (n=15)

Brevundimonas (71 %) B. diminuta

B. naejangsanensis

Myroides (75 %) M. odoratimimus

M. phaeus

Ochrobactrum (50 %) O. tritici

Pseudochrobactrum (100 %)

P. asaccharolyticum

Sphingobacterium (100 %) S. mizutaii

Les espèces bactériennes Brevundimonas naejangsanensis et B. diminuta ont été isolées dans

47 % et 40 % des échantillons de cabillaud et des poissons plats respectivement.

V.3. Discussion

Dans cette étude, 1882 isolats ont été obtenus sur 14 géloses sélectives à partir de 181

matrices alimentaires. Au total, 58 genres bactériens et 150 espèces bactériennes ont été identifiés

avec une diversité bactérienne différente selon les produits analysés. En effet, les produits avec les

plus grandes diversités bactériennes étaient les poissons et les crevettes. Ensuite, il y avait les

moules, les noix de Saint-Jacques et les homards. Enfin les huîtres avaient la plus faible diversité

bactérienne. La différence de diversité s’accompagnait de flores bactériennes spécifiques à des

produits ou à des catégories de produits comme les poissons, les crustacés et les mollusques. La

diversité bactérienne de la flore cultivable mésophile présente sur les produits aquatiques est peu

connue. Elle apparait principalement être liée à l’animal analysé et à son mode de vie. En effet, les

0 %

100 %


105

crustacés possèdent un exosquelette composé de chitine. Des travaux ont montré que certaines

bactéries comme Vibrio spp. ou Enterococcus spp. pouvaient adhérer plus facilement que d’autres à

ce polymère (Signoretto et al. 2005). Il existait une diversité bactérienne importante entre les

différents mollusques bivalves (33 genres, 46 espèces) mais aucune bactérie ne semble spécifique à

ces produits. Enterococcus, Staphylococcus et Bacillus étaient les genres bactériens les plus isolés des

noix de Saint-Jacques, des moules et des huîtres, respectivement Ces animaux se nourrissent en

filtrant l’eau et donc concentrent les bactéries dans leur tube digestif (Lee et al. 2010). La législation

française impose, pour les mollusques bivalves commercialisés vivants, dont les moules et les huîtres,

de passer par une étape de purification, ce procédé diminue la charge bactérienne et

potentiellement de la diversité (Lee et al. 2010). A l’inverse, les coquilles Saint-Jacques ne subissent

pas cette étape de purification et seule la flore de la noix (muscle adducteur) a été étudiée. De plus,

la particularité des coquilles Saint-Jacques par rapport aux autres mollusques bivalves étudiés est

leur capacité de s’enfouir dans les sédiments marins et de se mouvoir. Ces facteurs peuvent

influencer la diversité bactérienne présente dans ces coquillages et donc dans la noix par rapport aux

moules et aux huîtres qui sont statiques et accrochées à leurs rochers. Des isolats du genre

Vagococcus, Serratia et Morganella ont été isolés des noix de Saint-Jacques et pas dans les autres

mollusques analysés.

Pour les poissons, la flore bactérienne avait la plus grande diversité en comparaison des

autres produits étudiés (45 genres, 89 espèces). Le mucus présent sur la peau et les branchies ont un

rôle de barrière de protection qui peut favoriser le développement d’une flore bactérienne

spécifique (Smith et al. 2007, Reverter et al. 2017). En effet, entre les poissons plats (benthiques) et

les cabillauds (démersaux) des particularités dans la flore bactérienne ont été remarquées. En effet,

la diversité des Enterobacteriales était plus importante sur les poissons plats que sur les autres

matrices. Au contraire, les bactéries du genre Desemzia ont été isolées uniquement des cabillauds.

L’environnement, le mode de vie des animaux (benthique/pélagique, côtier/pleine mer) et des


106

interactions spécifiques hôte-bactéries semble avoir également un impact sur la composition des

flores bactériennes.

Les genres bactériens Gram positif étaient plus fréquemment isolés des poissons et des

crustacés. De plus, les genres Bacillus, Exiguobacterium, Staphylococcus, Enterococcus et Vagococcus

étaient les plus identifiées. Les bactéries des genres Bacillus et Exiguobacterium semblaient être plus

présentes dans les crustacés que dans les autres matrices analysées. Les bactéries du genre

Exiguobacterium sont natives dans divers écosystèmes du milieu aquatique: glaciers, fonds

océaniques, sources chaudes, eaux de mer, effluents industriels et animaux marins (poissons et

crustacés)(Austin 2006, Vishnivetskaya et al. 2009, Broekaert et al. 2013, Chen et al. 2016, Dabadé et

al. 2016, Lunestad et al. 2018). Cependant, sa présence dans les produits alimentaires d’origine

aquatique n’est pas commentée (Broekaert et al. 2013, Dabadé et al. 2016, Lunestad et al. 2018).

Dans ces travaux, Exiguobacterium spp. a été isolé des poissons et principalement des crustacés

étudiés mais pas des mollusques bivalves.

En outre, le genre Staphylococcus était plus détecté dans les poissons que dans les

mollusques et les crustacés. Les poissons pêchés sont plus manipulés par l’homme (éviscération à

bord) que la chair des crustacés et des mollusques, ce qui peut expliquer les différences de

contamination car l’espèce S. aureus est un marqueur de contamination humaine et d’hygiène des

aliments (Falconnet 2011). II est également possible que les souches de Staphylococcus spp.

adhèrent mieux à la peau et au mucus des poissons que sur les carapaces de chitine des crustacés. En

effet, ces bactéries colonisent naturellement la peau et les muqueuses de divers animaux, et

principalement les animaux à sang chaud, dont l’homme (Becker et al. 2014). Certaines espèces ont

été isolées d’animaux marins, comme S. scuiri de la peau de mammifères marins ou S. xylosus et S.

lentus isolées de mollusques bivalves. Staphylococcus spp. est halophile et donc capable de persister

sur des surfaces soumises à de fortes concentrations de sel, comme sur les bateaux et les animaux

marins.


107

De plus, Enterococcus spp. étaient isolés des différentes matrices analysées sauf des huîtres.

Ces bactéries ont été fréquemment décrites dans la flore d’altération des produits aquatiques, et

principalement des produits à base de poisson (Jaffrès et al. 2009, Sorroza et al. 2012, Calliauw et al.

2016, Kim et al. 2017). Les espèces Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium sont des

marqueurs de contamination fécale des eaux (Salam et al. 2014). Il a été démontré que les espèces E.

faecalis et E. faecium étaient capables de survivre et de persister dans un état viable non cultivable à

la surface des copépodes et dans les sédiments marins (Signoretto et al. 2004, Signoretto et al. 2005)

ce qui favorise sa présence sur de nombreux animaux marins, dont les animaux benthiques. La

présence du genre Enterococcus dans les produits de la pêche est peu documenté mais a été détecté

dans des crevettes et des poissons fumés (Jaffrès et al. 2009, Leroi 2010, Dabadé et al. 2016). Boss et

al. (2016) ont montré que 59 % des leurs produits aquatiques étudiés (huîtres, saumon, panga et

crevettes) étaient porteurs de souches E. faecalis. Les produits les plus contaminés étaient les

crevettes (82 %), les pangas (75 %) et le saumon (64 %). De plus, dans une étude sur des crevettes

importées d’Asie du sud-est en Pologne, 45 % des échantillons étaient positifs pour Enterococcus spp.

(Chajęcka-Wierzchowska et al. 2016).

Pour le genre Vagococcus, des souches ont été isolées des poissons, des homards et des noix

de Saint-Jacques. Ces bactéries sont associées aux animaux aquatiques (Lebreton et al. 2017) et font

également partie de la flore d’altération des produits aquatiques et principalement des produits à

base de poisson (Jaffrès et al. 2009, Sorroza et al. 2012, Calliauw et al. 2016, Kim et al. 2017).

En outre, dans cette étude, les bactéries Gram négatif étaient plus associées aux poissons et

aux mollusques bivalves qu’aux crustacés. Les principaux genres isolés étaient Pseudomonas, Vibrio,

Shewanella, Brevundimonas et les genres appartenant à l’ordre des Enterobacterales.

Les bactéries de l’ordre des Enterobacterales sont fréquemment isolées d’échantillons de

poissons, mollusques et crustacés (Gram et Dalgaard 2002, Linton et al. 2003). Par exemple, des


108

bactéries des genres Serratia, Hafnia et Yersinia ont été isolées de saumons fumés (Jørgensen et al.

2000, Olofsson et al. 2007), des Proteus, Klebsiella et Citrobacter ont été détectées dans des

crevettes d’aquaculture au Bénin (Dabadé et al. 2016). Dans notre étude, les bactéries de cet ordre

ont principalement été isolées des animaux benthiques. Serratia spp.et Morganella spp. ont été

isolés principalement des noix de Saint-Jacques et Proteus spp. et Citrobacter spp. des poissons plats.

Des souches de l’espèce E. coli ont été isolées d’échantillons de poissons et de moules. Cette bactérie

est un indicateur de contamination fécale et peut être un pathogène alimentaire s’il y a présence des

gènes de pathogénicité. Sa prévalence dans les produits de la pêche est variable. En effet, Boss et al.

(2016)ont montré que 83 % des pangas et 64 % des crevettes étaient positifs pour E. coli alors que

seulement 10 % des huîtres. Dans une autre étude au Maroc, E. coli a été détecté dans 8 % des

échantillons de produits aquatiques (Badri et al. 2009).

Pour le genre Pseudomonas, des souches ont été isolées principalement des échantillons de

poissons et peu des échantillons de moules, de crevettes et de noix de Saint-Jacques. Ce genre

bactérien a été montré pour faire partie de la flore d’altération des produits alimentaires, dont les

produits aquatiques (Gram et Dalgaard 2002) comme des poissons et moins dans les crustacés et les

mollusques (Liston 1957, Georgala 1958, Cahill 1990, Linton et al. 2003). En outre, des souches du

genre Shewanella ont été isolées dans des poissons plats et les noix de Saint Jacques qui sont des

bactéries naturellement présentes dans le milieu aquatique. Elles peuvent être isolées de sédiments

marins et divers animaux aquatiques (Ziemke et al. 1998, Bozal et al. 2002, Satomi et al. 2003). Ces

bactéries ont également été isolées de crustacés (Broekaert et al. 2013, Parlapani et al. 2015,

Parlapani et al. 2018). La présence de Pseudomonas, Shewanella et Psychrobacter dans les produits

aquatique est rarement commentée, excepté pour leur rôle dans l’altération des produits aquatiques

(Bjørkevoll et al. 2003, Broekaert et al. 2013).

Enfin, cinq espèces du genre Vibrio ont été détectées principalement dans les noix de Saint

Jacques et dans les homards. Aucune des espèces pathogènes pour l’homme (V. cholerae, V.


109

parahaemolyticus et V. vulnificus). Vibrio spp. est naturellement présent dans le milieu marin, sous

forme planctonique ou en biofilm sur des particules biotiques (plancton) ou abiotiques (plastique)

(Carman et Dobbs 1997, Ogonowski et al. 2018). Ces bactéries peuvent être isolées de tous les

animaux aquatiques et surtout des coquillages et des crustacés. Par exemple, dans une étude sur des

produits importés en Suisse, Vibrio spp. a été isolé dans 18 % des poissons de mer et dans 83 % des

mollusques bivalves (Schärer et al. 2011). Les espèces V. alginolyticus, V. fluvialis,

V. parahaemolyticus et V. cholerae sont le plus fréquemment isolées des produits aquatiques

destinées à la consommation humaine {Zavala-Norzagaray, 2015 #348;Ronholm, #183;Schärer, 2011

#120;Banerjee, 2018 #519}.


110

- La technique MALDI-TOF et l’amplification et le séquençage de l’ADNr 16S ont été

performants pour l’identification des genres bactériens isolés des produits de la pêche et de

l’aquaculture analysés, 80 % et 93 % des isolats ont été identifiés au genre respectivement.

- L’amplification et le séquençage de l’ADNr 16S a été moins performant pour l’identification à

l’espèce (44 % des isolats) en comparaison de la technique MALDI-TOF (54 % des isolats).

- La sélectivité des géloses utilisées a été globalement médiocre. La gélose la plus sélective et

spécifique était la gélose Slantez et Bartley, 52 % des isolats étaient Enterococcus.

- Les genres bactériens majoritairement Enterococcus, Bacillus, Staphylococcus, Vibrio,

Psychrobacter, Aerococcus, Vagococcus, Pseudomonas, Brevundimonas, Aeromonas, Vibrio

ont été principalement isolés de 6 géloses : Brillance Salmonella, PEMBA, Slanetz & Bartley,

CFC, TCBS et Chapman.

- Cinquante-sept genres bactériens et 150 espèces ont été isolés des cabillauds, poissons plats,

crevettes, homards, huîtres, moules et noix de Saint-Jacques.

- Cinq genres bactériens ont été isolés dans au moins 6 des 7 matrices alimentaires :

Enterococcus, Bacillus, Staphylococcus, Vibrio et Psychrobacter.

- La flore bactérienne observée dépend des produits analysés.

- Plus de la moitié des échantillons de poissons étaient porteurs des genres Aerococcus,

Vagococcus, Pseudomonas, Brevundimonas et Staphylococcus.

- Plus de la moitié des échantillons de crustacés étaient porteurs de souches du genre Bacillus.

- Les genres Aeromonas, Enterococcus et Vibrio ont été isolés dans plus de la moitié des

échantillons de noix de Saint Jacques. Les bactéries isolées des échantillons de moules et

d’huîtres présentaient une faible diversité. Il n’y avait pas de genre bactérien

majoritairement isolé, ni spécifique à ces produits.

113

Chapitre 2 : E tude de la re sistance aux antibiotiques des bacte ries isole es des produits marins

Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins

114

I. Contexte

Le suivi de la résistance des bactéries zoonotiques est particulièrement important pour

mieux évaluer les risques pour la santé humaine liés aux contacts avec les animaux ou à la

consommation des denrées d’origine animale. Il correspond aux recommandations internationales

portées par l’OMS (WHO 2001), l’OIE (OIE 2018), le Codex Alimentarius (Commission 2011), et au

niveau européen par le conseil de l’Europe, la commission européenne et l’EFSA. La directive

2003/99/CE sur la surveillance des zoonoses et des agents zoonotiques oblige les états membres à la

mise en place d’une surveillance de la résistance aux antibiotiques chez les agents zoonotiques. La

surveillance des bactéries indicatrices, réservoirs potentiels de gènes de résistance qui peuvent être

transmis aux bactéries pathogènes ou commensales de l’homme est également encouragée. En

France, la surveillance réglementée de la résistance des bactéries zoonotiques (Salmonella enterica,

Campylobacter spp.…) et indicatrices (Escherichia coli, Enterococcus faecium et E. faecalis) est

organisée par les autorités compétentes et les données peuvent être complétées par celles

provenant des réseau nationaux (RESAPATH, réseau Salmonella), ou encore des enquêtes et des

plans de surveillance. Cela permet ainsi d’obtenir régulièrement des données représentatives des

principales filières de production d‘origine animale françaises (bovins, porcins, volailles). Cependant,

le milieu aquatique marin n’est pour le moment pas couvert pas ces différents réseaux. Il apparait

donc important de faire un état des lieux sur ce point car le milieu aquatique marin est une source

potentielle de bactéries résistantes peu explorée de façon pérenne.

Le but de cette étude a été de tester la résistance aux antibiotiques des genres bactériens les

plus isolés des échantillons analysés dans le chapitre 1, afin d’évaluer la contamination des produits

aquatiques avec des bactéries résistantes aux antibiotiques. De plus, cette étude visait à trouver

de(s) bactérie(s) potentielle(s) candidate(s) pour être des indicatrice(s) de la résistance aux

antibiotiques dans les produits aquatiques.


115

Dans un premier temps, la résistance aux antibiotiques des genres bactériens Gram positif et

Gram négatif les plus fréquemment isolés a été étudié par diffusion. Les molécules antibiotiques ont

été choisies pour détecter des mécanismes de résistance pour des classes d’antibiotiques

d’importance critiques et élevées pour la santé humaine définies par l’OMS (OMS 2017b). Les classes

d’antibiotiques ciblées dans cette étude étaient les β-lactamines, les quinolones, les glycopeptides,

les oxalodinones, les aminosides, les macrolides, les phénicolés, les tétracyclines, les inhibiteurs de la

synthèse des folates, les ansamycines et les stéroïdes antibactériens (OMS 2017a).

Dans un deuxième temps, nous avons voulu estimer si les produits analysés (nature, origine

géographique, mode de production) avaient un rôle dans la contamination en bactéries résistantes

aux antibiotiques.

Dans un dernier temps, nous avons cherché si les genres bactériens étudiés pouvaient être

de potentielle(s) candidate(s) indicatrice(s) de la résistance aux antibiotiques dans les produits

marins.


116

II. Antibiorésistance de la flore des produits de la pêche et de

l’aquaculture

II.1. Matériel et méthodes

II.1.A. Sélection des souches

Après isolement des souches dans les produits de la pêche et de l’aquaculture et leur

identification (chapitre I), nous les avons sélectionnées et « dédoublonnées » comme suit :

-La première étape de sélection a été de garder toutes les souches identifiées au genre

bactérien pour chaque échantillon de produits de la pêche.

-La seconde étape a été de conserver une souche de chaque espèce bactérienne par

échantillon. Le milieu d’isolement a été le principal critère de sélection des souches identifiées à

l’espèce. Les souches isolées des milieux de la gamme ChromID® étaient sélectionnées en premier.

De manière arbitraire, en premier nous avons sélectionné les souches isolées sur les milieux de

détection des β-lactamases des bactéries Gram négatif. Puis plus le spectre de la β-lactamase

recherchée était large plus le milieu correspondant était prioritaire. Ensuite, les souches étaient

sélectionnées sur le milieu ChromID®MRSA puis sur le milieu ChromID VRE. Puis les souches étaient

sélectionnées sur les géloses sélectives en fonction de la présence et le nombre de familles

d’antibiotiques critiques pour la santé humaine. Et en dernier, nous avons sélectionné les géloses

pour lesquelles il n’y a pas d’antibiotique comme agent sélectif. Les critères de priorité pour ces

milieux étaient le nombre d’agents sélectifs et la durée du temps d’incubation.

L’ordre de priorité des milieux était donc le suivant : ChromID® CARBA, ChromID® OXA,

ChromID® ESBL, ChromID® MRSA, ChromID® VRE, ALOA, brillance salmonella, CFC, GSP, PEMBA,

TCBS, TBX, Slanetz & Bartley, Chapman. Enfin, aucune différence n’a été faite entre les souches

isolées des branchies et celles de la peau.


117

La troisième étape de sélection a été de conserver les genres bactériens majoritaires qui ont

été isolés dans les différentes matrices alimentaires. Après l’étape de « dédoublonnage », les genres

bactériens étaient sélectionnés comme suite :

Il fallait au minimum 30 souches dans un genre/ et ou une espèce bactérienne,

Il fallait que les souches aient été isolées dans au moins 20 % des échantillons de 3 produits

de la pêche et de l’aquaculture différents pour les bactéries Gram positif et dans au moins 20% des

échantillons de 2 produits de la pêche et de l’aquaculture différents pour les bactéries Gram négati.

II.1.B. Antibiogramme par diffusion

II.1.B.a. Choix des antibiotiques testés

Dans le but de tester la résistance aux antibiotiques des genres bactériens les plus

fréquemment isolées des produits analysés, deux plaques, une pour détecter des mécanismes de

résistance des bactéries Gram positif et une pour ceux des bactéries Gram négatif ont été

développées.

La plaque pour tester la résistance aux antibiotiques des bactéries Gram positif comportait 2

β-lactamines : la pénicilline et la céfoxitine, des aminosides (kanamycine, tobramycine, gentamicine),

des macrolides et apparentée (érythromycine et clindamycine), une quinolone (fluoroquinolone),

une oxazolidinone (linézolide), un glycopeptide (vancomycine), une tétracycline (tétracycline), un

phénicolé (chloramphénicol), une ansamycine (rifampicine), des inhibiteurs de la synthèse des

folates (sulfamide et triméthoprime) et un stéroïde antibactérien (acide fusidique). La céfoxitine a

été utilisée pour détecter la résistance à la méticilline. De plus, le disque de clindamycine a été

positionné à côté du disque d’érythromycine pour visualiser les mécanismes de type MLSb (EUCAST

2017).

La plaque pour tester la résistance aux antibiotiques des Gram négatif comportait 7 β-

lactamines, deux pénicillines (ampicilline et témocilline), l’association pénicilline et inhibiteur de β-


118

lactamase (amoxicilline et clavulanate), une céphalosporine de 1ère génération (céfalotine), une

céphalosporine de deuxième génération (cefoxitine), deux céphalosporines de 3ème génération

(ceftazidime et cefotaxime). Les céphalosporines de 3ème génération ont été placées à côté du disque

contenant du clavulanate pour détecter les β-lactamases à spectre étendu (EUCAST 2017). Aucun

carbapénème n’a été testé, la présence d’une enzyme de ce type pouvant s’observer par la perte

d’activité de l’ensemble des β-lactamines et avec des tests complémentaires. De plus, nous avons

utilisé la témocilline car cette pénicilline est très stable face à des β-lactamases et elle permet de

détecter les carbapénémases de type OXA-48 (EUCAST 2017). Il y avait également des quinolones

(acide nalidixique et ciprofloxacine) et un macrolide (azithromycine), deux aminosides

(streptomycine et gentamicine), un phénicolé (chloramphénicol), une tétracycline (tétracycline), les

inhibiteurs de la synthèse des folates (sulfamétoxazole et triméthoprime utilisés en combinaison que

nous appellerons cotrimoxazol).

II.1.B.b. Antibiogramme par diffusion

À partir des cryotubes, chaque souche a été ensemencée sur une gélose nutritive salée à 2 %

(GNS) ou su une gélose PCA et incubée à 37°C pendant 24h. Les antibiogrammes ont été effectués

selon les recommandations indiquées dans le référentiel de l’EUCAST (EUCAST 2012). Les colonies

ont été suspendues dans de l’eau physiologique (Biomérieux) pour obtenir une culture bactérienne

avec une turbidité de 0,5 McFarland. La suspension était ensuite étalée sur une gélose Mueller-

Hinton (Biorad) à l’aide d’un écouvillon stérile. Les disques d’antibiotiques étaient ensuite déposés et

la gélose était incubée pendant 16 à 18h à 35°C. Nous avons veillé à ne pas dépasser un délai de 15

minutes entre la préparation de la suspension et l’étape d’ensemencement, l’étape

d’ensemencement et le dépôt des disques, et le dépôt des disques et l’incubation de la gélose.


119

Les disques d’antibiotiques (Biorad) utilisés pour les bactéries Gram positif étaient les

suivants : pénicilline G (1 U), céfoxitine (30 µg), ciprofloxacine (5 µg), kanamycine (30 µg),

tobramycine (10 µg), gentamicine (10 µg), érythromycine (15 µg), clindamycine (2 µg), vancomycine

(5 µg), linézolide (10 µg), sulfamides (200 µg), triméthoprime (5 µg), tétracycline (30 µg),

chloramphénicol (30 µg), rifampicine (5 µg) et l’acide fusidique (10 µg) (Figure 7).

Les disques d’antibiotiques testés pour les bactéries Gram négatif étaient les suivants :

ampicilline (10 µg), témocilline (30 µg), amoxicilline-acide clavulanique (20/10 µg), céfalotine (30 µg),

céfoxitine (30 µg), ceftazidime (30 µg), céfotaxime (30 µg), acide nalidixique (30 µg), ciprofloxacine (5

µg), streptomycine (10 µg), gentamicine (10 µg), azithromycine (15 µg), chloramphénicol (30 µg),

tétracycline (30 µg), triméthoprime-sulfamétoxazole (1,25/ 3,75 µg) et colistine (10 µg). Un disque de

colistine a été utilisé dans un but de qualité, pour s’assurer de l’identification des souches et de

l’absence de contamination (Figure 8).

Figure 7:Antibiogramme des bactéries Gram positif.


120

La résistance aux antibiotiques des souches de Pseudomonas spp. a été testée dans les conditions

expérimentales décrites dans le document M42-A du CLSI (CLSI 2016a). Les géloses étaient incubées

à 28°C pendant 24 à 28 h.

Les souches de Staphylococcus aureus ATCC 25923 et E. coli ATCC 25922 ont été utilisées

comme contrôle qualité pour les antibiogrammes des bactéries Gram positif et Gram négatif

respectivement.

Les diamètres d’inhibition ont été mesurés avec un appareil Biomic®V3 (Gilles Scientific,

Santa Barbara, États-Unis).

II.1.B.c. Interprétation des résultats

Les résultats des antibiogrammes ont été analysés pour définir les populations sauvages et

non-sauvages par genre/ espèce bactérienne :

- selon les seuils cliniques établis dans les référentiels du CLSI (CLSI 2015, CLSI 2016b) et de

l’EUCAST (EUCAST 2018),

- selon les seuils épidémiologiques (ECOFF) définis dans le référentiel EUCAST (EUCAST).

Figure 8 : Antibiogramme des bactéries Gram négatif.


121

- lorsque les ECOFFs n’existaient pas, nous avons calculé des seuils épidémiologiques

expérimentaux (COWT). Ces seuils épidémiologiques expérimentaux sont appelés COWT, car

l’appellation ECOFF est celle des seuils épidémiologiques officiels définis dans l’EUCAST (Smith et al.

2016). Les COWT ont été définis selon la méthode normalized resistance interpretation (NRI) décrite

par Kronvall et al.(2003). La méthode NRI a été utilisée avec la permission du détenteur du brevet

européen No 1383913 et américain 7,465,559 (Bioscand AB, TÄBY, Sweden). Il faut au minimum 30

souches/ genre ou espèce pour calculer un COWT. En raison du nombre de souches inférieur à 30 pour

chaque espèce et chaque clade, les seuils épidémiologiques expérimentaux ont été calculés par

genre bactérien toutes espèces confondues. Pour chaque antibiotique, la distribution des souches a

été faite selon le diamètre d’inhibition de croissance. Lorsque cette distribution suivait une loi

normale, la moyenne et l’écart-type ont été déterminés. Le COWT était la valeur entière la plus proche

de la moyenne moins 2,5 fois l’écart-type. Les COWT ont été calculés grâce à une feuille de calcul Excel

mis à disposition gracieusement par P. Smith, W. Finnegan et G. Kronvall.

Les référentiels du CLSI et l’EUCAST ont défini des critères d’interprétation pour des

quantités données d’antibiotiques dans les disques qui sont différents entre eux. Dans les conditions

choisies dans cette étude, certains critères d’interprétation n’ont pas été utilisés car les charges de

disques utilisées ne sont pas disponibles dans l’un ou l’autre des référentiels. Les souches ayant

acquis des résistances à 3 classes d’antibiotiques et plus sont dites multi-résistantes (Magiorakos et

al. 2012).


122

III. Etude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées dans

les produits de la pêche et de l’aquaculture

III.1. Contexte

Le but de cette étude épidémiologique était d’identifier les populations bactériennes

sauvages et non-sauvages c’est à dire celle qui avait acquis un mécanisme de résistance aux

antibiotiques pour un genre/ espèce bactérienne. Pour cela, les résultats ont été interprétés avec les

ECOFFs disponibles dans le référentiel EUCAST. Lorsque qu’il n’y avait pas d’ECOFF, nous avons

calculé des COWT. En parallèle, les résultats des antibiogrammes ont été interprétés selon les seuils

cliniques des référentiels du CLSI ou EUCAST. Les seuils cliniques classent les bactéries en sensible,

intermédiaire et résistant et nous avons considérés que les bactéries classées intermédiaires et

résistantes avaient acquis un mécanisme de résistance. Elles ont été considérées comme une

population non-sauvage. Lorsqu’une souche est résistante à une molécule testée in vitro, elle est

alors considérée comme résistante à la classe d’antibiotique correspondante.

Après l’application des critères de sélection que nous avons définis, nous avons étudié le

panel de souches suivantes : 46 Enterococcus spp., 43 Staphylococcus spp., 40 Exiguobacterium

spp.,54 Pseudomonas spp., 46 Vibrio spp. et 32 Proteus spp.

Les souches des genres Bacillus (n=180) et Vagococcus (n=65) n’ont pas été étudiées car dans

les référentiels CLSI et EUCAST, il n’est pas recommandé d’étudier la résistance aux antibiotiques des

souches de Bacillus par antibiogramme par diffusion, qui est la technique utilisée dans ces travaux

(Hernàndez-Guinàt 2012). De plus, dans les conditions expérimentales de cette étude, les souches de

Vagococcus spp. ne croissaient pas ou peu sur la gélose Mueller-Hinton, ce qui ne permettait pas

l’interprétation des antibiogrammes.

L’analyse des résultats a été présentée par genre bactérien.


123

III.2. Enterococcus

III.2.A. Contexte

Enterococcus spp. sont des bactéries Gram positif qui font parties de la flore lactique

(Signoretto et al. 2004, Naser et al. 2005). Elles sont présentes dans le tube digestif humain et animal

et sont également isolés de produits fermentés et de l’environnement (eaux, plantes,…). De plus, les

espèces E. faecalis et E. faecium sont utilisés comme bactéries indicatrices de la résistance aux

antibiotiques dans les aliments (EFSA 2012). Ces bactéries résistent naturellement aux

céphalosporines, à l’acide fusidique, aux aminosides, aux lincosamides et aux sulfamides (Leclercq et

al. 2013, CLSI 2016b). Selon le référentiel du CLSI, les souches Enterococcus spp. sont également

résistantes naturellement au triméthoprime et selon le référentiel de l’EUCAST, aux macrolides.

III.2.B. Panel de souches étudiées

Les souches du genre Enterococcus étudiées (n=46) ont été groupées selon les clades décrits

par Naser et al. (2005) (Naser et al. 2005). L’espèce E. faecalis (n=14) apparentait au clade éponyme.

Les espèces E. faecium (n=3) et E. durans (n=1) étaient dans le clade E. faecium, E. casseliflavus (n=4)

et E. gallinarum (n=2) au clade E. casseliflavus. De plus, les espèces E. thailandicus (n=9), E.

aquamarinus (n=1) et E. italicus (n=1) n’appartenaient à aucun clade et 11 souches n’ont pas été

identifiées à l’espèce.

III.2.C. Détermination de la population non-sauvage

Des seuils étaient disponibles dans les référentiels du CLSI et EUCAST pour 11 antibiotiques

pour le genre Enterococcus et 5 ont été calculés (Tableau 19). Les distributions des diamètres

d’inhibitions sont dans l’Annexe III.


124

Tableau 19: Population bactérienne Enterococcus spp. (n=46) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ; COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.

Antibiotiques

Seuils épidémiologiques Seuils cliniques Nombre maximal

de souches

ayant acquis

une résistan

ce

ECOFF (mm)

(EUCAST)

Nombre de

souches non-sauvag

es

COwt (mm

)

Nombre de

souches non-sauvag

es

Seuil S/IR

(mm) EUCAS

T

Nombre de

souches avec

un diamètre <au seuil S/IR

Seuil

S/IR (mm

) CLSI

Nombre de

souches avec

un diamètre <au seuil S/IR

Pénicilline SP - - Céfoxitine ND - -

Ciprofloxacine SP - 15 0 21 11 11

Kanamycine EC - - Tobramycine 8 0 0 Gentamicine SP - -

Erythromycine 19 4 23 12 12 Clindamycine 6 - -

Vancomycinea 12 0 SP - 12 0 0

Linézolidea 19 0 18 0 19 0 0

Acide fusidique

26 7 7

Triméthoprimea,b 21 1

EC/SP

- 50 46 46

Sulfamides ND - -

Tétracycline 20 12 19 12 12

Chloramphénicol

EC - 18 1 1

Rifampicine ND - 20 18 18

a) Les ECOFFs ont été défini pour les espèces E. faecalis et E. faecium

b) Selon le référentiel du CLSI, toutes les souches du genre Enterococcus sont naturellement

résistantes au triméthoprime. Selon le référentiel de l’EUCAST, l’activité du triméthoprime

n’est pas certaine sur les souches du genre Enterococcus. Les souches sauvages sont donc

classées intermédiaires au niveau clinique.

Des seuils cliniques pour 4 antibiotiques sont présents uniquement dans le référentiel CLSI ce

qui a permis de déterminer des souches ayant acquis une résistance à la ciprofloxacine (11 souches),

la rifampicine (18 souches) et le chloramphénicol (1 souche). Pour la tétracycline, le seuil clinique du


125

CLSI et le COWT calculé était à un millimètre d’écart. En interprétant les diamètres d’inhibition avec

ces deux seuils, 12 souches avaient un phénotype non-sauvage à la tétracycline. Au contraire, le seuil

clinique du CLSI pour l’érythromycine était plus élevé de 4 mm que le COWT calculé. Le nombre de

souches ayant acquis un mécanisme de résistance était plus élevé en interprétant les diamètres

d’inhibition avec le seuil clinique (12 souches) qu’avec le COWT (4 souches). Enfin, le COWT de l’acide

fusidique a permis de détecter une population non-sauvage de 7 souches.

Aucune acquisition de résistance au triméthoprime n’a pu être détectée avec les seuils

cliniques. En effet, toutes les souches étaient considérées naturellement résistantes à cet

antibiotique par le CLSI ou modérément résistantes selon l’EUCAST. Pourtant, des ECOFFs ont été

définis pour les espèces E. faecalis et E. faecium pour le triméthoprime. Grâce à cela, l’acquisition

d’une résistance à cet antibiotique a été observée pour une unique souche E. faecalis, AF16-253-

OUCARB2.

Dans le référentiel EUCAST, des ECOFFs ont été définis uniquement pour les espèces E.

faecalis et E. faecium. Des COWT ont donc été calculés pour tous les antibiotiques et pour l’ensemble

des souches Enterococcus spp. . La distribution des diamètres d’inhibition suivait une loi normale

pour 6 antibiotiques testés. Pour 5 antibiotiques (tobramycine, érythromycine, linézolide,

tétracycline, acide fusidique), nous avons pu déterminer des COwt . Cependant, celui calculé pour la

clindamycine était à 6 mm. Sachant que le plus petit diamètre mesurable est celui du disque

d’antibiotique (6 mm), tous les isolats Enterococcus testés par cette méthode étaient une population

sauvage. Le COWT calculé pour la clindamycine est inutilisable pour détecter des résistances à cet

antibiotique.

Aucun COWT n’a été déterminé pour les 9 autres antibiotiques : soit la distribution des

diamètres d’inhibition ne suivait pas une loi normale et aucun seuil épidémiologique n’a pu être

calculé (Figure 99) ; soit l’écart-type était trop grand, supérieur à 3,35 mm, la population était trop

hétérogène pour valider la valeur de COwt calculée.


126

Figure 9:Distribution des diamètres d'inhibition Enterococcus spp. pour la rifampicine.

Enfin, une distribution non-homogène des espèces bactériennes au sein de la distribution des

diamètres d’inhibition pour la vancomycine, la ciprofloxacine, la pénicilline, le triméthoprime et la

gentamicine a été observée (Figure 10). Deux sous-populations ont été observées avec la première

qui était principalement composée des souches de l’espèce E. faecalis et la seconde des souches de

l’espèce E. thailandicus. Les souches appartenant à la première avaient toujours un diamètre

s’inhibition plus faible que la seconde et les COWT calculés classaient toujours les populations des

souches E. faecalis en non-sauvage. Il n’y avait pas assez de souches de chaque espèce pour calculer

des seuils épidémiologiques expérimentaux par espèce et confirmer cette observation. Les COWT

calculés pour ces antibiotiques n’ont donc pas été pris en compte pour l’interprétation des

antibiogrammes.

Figure 10: Distribution des diamètres d'inhibition Enterococcus spp. pour la vancomycine.

0

1

2

3

4

5

6

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s

Diamètre d'inhibition (mm)

E. faecalis

E. durans

E. faecium

E. gallinarum

E. casseliflavius

E. aquamarinus

E. italicus

E. thailandicus

Enterococcus sp.

0

2

4

6

8

10

12

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E. faecalis

E. durans

E. faecium

E. gallinarum

E. casseliflavius

E. aquamarinus

E. italicus

E. thailandicus

Enterococcus sp.


127

III.2.D. Multi-résistance

Nous avons observé des populations non-sauvages pour plusieurs antibiotiques ce qui

représentait au total 82 % des souches du genre Enterococcus (Tableau 20).

Tableau 20 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Enterococcus spp. (n = 38).

Nombre de classes d’antibiotiques avec un phénotype non-sauvage

Classes d’antibiotiques Nombre de

souches Espèces

bactériennes

1

Quinolone 2 1 E. faecalis 1 E. faecium

Tétracycline 2 1 E. faecalis 1 E. italicus

Stéroïde antibactérien 1 1 E. faecalis

Ansamycine 6 2 E. faecalis

2 E. thailandicus 2 Enterococcus sp.

2

Macrolides- Stéroïde antibactérien

1 1 E. faecium

Macrolide-Ansamycine 2 1 E. casseliflavus

1 Enterococcus sp.

Quinolone-Macrolide 2 1 E. faecium

1 E. gallinarum

Tétracycline-Ansamycine 5 1 E. casseliflavus 3 E. thailandicus

1 Enterococcus sp.

Ansamycine-Stéroïde antibactérien

1 1 Enterococcus sp.

Ansamycine - Macrolide 1 1 Enterococcus sp.

Tétracycline- Macrolide 1 1 E. faecalis

Quinolone-Ansamycine 4 2 E. faecalis

2 Enterococcus sp.

3

Quinolone-Stéroïde antibactérien- Ansamycine

1 1 E. faecalis

Tétracycline-Ansamycine- Macrolide

1 1 E. thailandicus

Ansamycine-Stéroïde antibactérien - Macrolide

1 1 E. thailandicus

Quinolone -tétracycline- Macrolide

1 1 E. casseliflavus

4

Macrolide -Tétracycline-ISF*- Ansamycine

1 1 E. faecalis

Macrolide -Tétracycline-Stéroïde antibactérien-

Phénicolé 1 1 E. thailandicus

Quinolone-Stéroïde antibactérien- Ansamycine -

Macrolide 1 1 E. faecalis


128

*Inhibiteur de la synthèse des folates

Au total, sept souches étaient multi-résistantes. En effet, quatre souches avaient cumulé des

résistances à 3 classes d’antibiotiques et chaque souche avait un profil de résistance différent. De

même, 3 souches avait acquis des résistances à 4 classes antibiotiques, et chacune des souches avait

un profil de résistance différent. Ces 3 souches étaient résistantes à l’érythromycine.

III.2.E. Discussion

Les populations non-sauvages du genre Enterococcus observées étaient élevées pour les

ansamycines (39 %), les macrolides (26 %), les tétracyclines (26 %) et les quinolones (24 %). En ce qui

concerne les résistances aux macrolides, elles sont souvent causées, pour les souches cliniques, par

l’acquisition des gènes erm(B) et mef(A) (Leclercq 2012a). Le phénotype de résistance à cette famille

d’antibiotique est beaucoup plus élevé en clinique (50-60 % des souches) (Leclercq 2012a) que dans

notre étude. Pour la résistance à la tétracycline que nous avons observé c’est un phénomène décrit

avec un taux élevé dans le milieu hospitalier (environ 71 % des souches isolées) (Tazi et Poyart 2012).

Il a également été montré que 16 % des souches de l’espèce Enterococcus faecalis isolées de pangas

et de crevettes importés en Suisse étaient résistantes à cet antibiotique (Boss et al. 2016). Les

déterminants de ces résistances ne sont pas connus, mais dans plus de 75 % des cas la résistance à la

tétracycline chez Enterococcus spp s’acquiert par le gène tet(M) (Tazi et Poyart 2012).

Pour les quinolones, aucun COWT n’a été déterminé mais 11 souches étaient classés comme

ayant acquis une résistance au regard du référentiel CLSI. Le taux de résistance à cette famille

d’antibiotiques a connu une augmentation dans les années 1990 dans le milieu hospitalier en Europe

(Tankovic et al. 1996, el Amin et al. 1999). En effet, la prévalence de souches Enterococcus

résistantes aux quinolones a augmenté de 11-14 % à 25 %. Les bactéries Gram positif deviennent

résistantes à cette classe par des mutations dans les gènes parC et gyrA ou des pompes à efflux.

Cependant, la prévalence de la résistance aux quinolones parmi les souches Enterococcus est peu


129

documentée. Dans l’étude de Boss et al. (2016), aucune résistance aux quinolones n’a été détectée

pour les souches Enterococcus qu’ils ont isolé.

De plus, nous avons détecté 7 souches multi-résistantes isolées de 3 noix de Saint-Jacques, 2

poissons plats, 1 homard et de 1 crevette. Chaque souche avait un profil de résistance différent. Les

ont acquis des résistances aux macrolides, aux tétracyclines et, pour une souche aux inhibiteurs de la

synthèse des folates et pour l’autre souche à l’acide fusidique.

Les antibiotiques testés ont été choisi pour détecter des mécanismes de résistances à des

classes d’antibiotiques critiques définis par l’OMS. Ces antibiotiques n’étaient pas les plus pertinents

à tester pour Enterococcus, des seuils étaient définis pour 8 molécules testées par les référentiels du

CLSI et EUCAST. De plus, il n’existait pas d’ECOFF pour Enterococcus spp. et seulement 6 COWT ont pu

être calculé.

Des différences de sensibilité aux antibiotiques selon les espèces, notamment entre E.

faecalis et E. thailandicus, ont été observées. Deux sous-populations étaient visibles et pour certains

antibiotiques cela a pu empêcher le calcul d’un COWT ou de calculer un COWT erroné comme par

exemple pour la vancomycine. Le COWT calculé a pris en compte les diamètres d’inhibition les plus

grands qui était ceux de la population de l’espèce E. thailandicus. En effet, l’autre population

bactérienne était constituée principalement de l’espèce E. faecalis qui avait des diamètres

d’inhibition plus faibles et qui était systématiquement considéré comme une population non-

sauvage. Pour résoudre ce problème, il faudrait cumuler plus de souches de chaque espèce ou clade

et interpréter les résultats par espèce bactérienne ou clade.

En outre, les molécules auxquelles les espèces Enterococcus sont naturellement résistantes

ont été testées dans cette étude. Elles appartenaient aux classes des céphalosporines, macrolides et

apparentés, inhibiteurs de la synthèse des folates et l’acide fusidique (Leclercq et al. 2013, CLSI

2016b). Les COWT des molécules de ces classes n’ont pas pu être calculés ou étaient inexploitables,

comme la céfoxitine (céphalosporine), les sulfamides (inhibiteur de la synthèse des folates) et les


130

lincosamides (macrolides et apparenté). Le choix des molécules antibiotiques utilisés n’était pas le

plus pertinent pour tester la résistance aux antibiotiques du genre Enterococcus. La cefoxitine a été

utilisée pour détecter la présence de résistance à la méticilline et la recherche de ce type de

résistance n’est pas utile pour ce genre bactérien (EUCAST 2017).

Pourtant, nous avons testé des classes d’antibiotiques pour lesquelles des résistances

naturelles ont été décrites (inhibiteur de la synthèse des folates et macrolides) mais une population

non-sauvage a été détectée. Les bactéries du genre Enterococcus sont considérées comme

naturellement résistantes au triméthoprime (inhibiteur de la synthèse des folates) dans le référentiel

CLSI et classé dans la catégorie intermédiaire dans le référentiel EUCAST. Cette catégorisation a un

intérêt purement clinique pour déterminer l’efficacité d’un traitement qui peut être incertaine lors

de l’utilisation de cette molécule sur les bactéries du genre Enterococcus. Par ailleurs, ce même

référentiel a défini un seuil épidémiologique pour cette molécule pour E. faecalis, et nous avons

décrit l’acquisition d’une résistance à cet antibiotique. De même, nous avons pu déterminer des

seuils épidémiologiques expérimentaux et détecter des souches non-sauvages pour l’érythromycine

(macrolides) et l’acide fusidique alors que les bactéries du genre Enterococcus sont considérées

naturellement résistantes à ces classes d’antibiotiques. Les résistances naturelles sont

principalement connues pour les espèces isolées de patients mais peu connues pour les espèces

isolées de l’environnement. De plus, dans les référentiels il y a principalement des seuils cliniques

pour interpréter les antibiogrammes des souches Enterococcus spp. dans un but thérapeutique et

pas dans un but d’étude épidémiologique de la résistance aux antibiotiques. Des espèces

naturellement résistantes à des concentrations thérapeutiques d’antibiotiques peuvent quand même

acquérir des résistances, comme observée dans cette étude pour le triméthoprime.

Enteroccoccus spp. présente également une faible résistance naturelle aux molécules de la

classe des aminosides. Il est recommandé d’utiliser des disques de charge élevée en aminosides (120

µg pour la gentamicine et 300 µg pour la streptomycine) car les charges classiques des disques


131

d’antibiotiques, qui ont été utilisées dans cette étude ne permettent pas de détecter les résistances à

cette classe d’antibiotique. Nous l’avons observé par les faibles diamètres d’inhibition de nos

souches pour ces antibiotiques et les seuils épidémiologiques faibles. De même, il est recommandé

d’utiliser une charge de disque plus élevé pour tester la résistance aux pénicillines (10 µg

d’ampicilline ou de pénicilline) (CLSI 2016b). Il est également préconisé de tester l’ampicilline, qui a

une activité plus importante sur les bactéries de ce genre par rapport à la pénicilline (Mainardi 2012).

En conclusion, nous avons montré par l’étude de la résistance aux antibiotiques du genre

Enterococcus que des souches de chaque espèce identifiée ont acquis des résistances. Ces souches

ont été isolées des crustacés et des poissons benthiques mais pas des autres produits. Cependant,

nous n’avons pas pu établir de seuils épidémiologiques pour tous les antibiotiques à cause de la

sensibilité différente entre les espèces et de la faible pertinence du test de certains antibiotiques

pour le genre Enterococcus. De plus, nous n’avons pas étudié les déterminants de ces résistances et il

serait intéressant de comparer ces déterminants avec ceux identifiés en clinique.


132

III.3. Staphylococcus

III.3.A. Contexte

Les bactéries du genre Staphylococcus sont Gram positifs, halophiles. Elles sont

principalement isolées de la peau et des muqueuses des animaux à sang-chaud (Chapman 1945,

Becker et al. 2014). Ces bactéries sont considérées comme des marqueurs d’hygiène des produits

alimentaires et notamment des produits aquatiques (Hammad et al. 2012). Les espèces de

Staphylococcus sont divisées en Staphylococcus coagulase positif et Staphylococcus coagulase

négatif. Tous les Staphylococcus sont résistants à la ceftazidime (Leclercq et al. 2013) et la plupart

des souches cliniques de Staphylococcus coagulase positif et négatif sont productrices de

pénicillinases (Lowy 2003, Cattoir et Leclercq 2012). Les autres résistances naturelles décrites sont

dépendantes des espèces bactériennes, par exemple les souches de S. saprophyticus sont résistantes

à l’acide fusidique, la novobiocine et la fosfomycine (Leclercq et al. 2013, CLSI 2016b).


Dans un premier temps, la résistance aux antibiotiques des souches de Staphylococcus

coagulase positif (n=8) a été étudiée. Il n’y avait qu’une seule espèce S. aureus. Dans un second

temps, les résistances aux antibiotiques des souches de Staphylococcus coagulase négatif (n=31) ont

été étudiées. Les espèces ont été groupées selon leur phylogénie ADNr 16S (Takahashi et al. 1999).

Douze souches appartenaient au clade S. scuiri (S. sciuri (n=7), S. lentus (n=4) S. stepanovicii (n=1)), 8

souches au clade S. warneri (S. pasteuri (n=5), S. warneri (n=3)), 4 souches au clade S. saprophyticus

(S. xylosus (n=2) et S. saprophyticus (n=2)), 4 souches au clade S. haemolyticus (S. haemolyticus (n=3)

S. hominis (n=1)) et 3 souches au clade S. epidermidis, les trois souches appartenaient à l’espèce

éponyme. La résistance aux antibiotiques des 4 souches qui n’ont pas été identifiées à l’espèce a été

étudiée avec les souches de Staphylococcus coagulase négatif.


133

III.3.C. Détermination de la population non-sauvage des Staphylococcus

coagulase positif

Des seuils épidémiologiques et cliniques étaient définis pour 13 des 16 antibiotiques testés.

Le nombre de souches de S. aureus était inférieur à 30 et donc trop faible pour calculer des COwt pour

les antibiotiques pour lesquels aucun ECOFF n’était défini. (Tableau 21)

Tableau 21 : Population bactérienne Staphylococcus aureus (n=8) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ; COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.

Antibiotiques

Seuils épidémiologiques Seuils cliniques Nombre maximal

de souche ayant acquis

une résistance

ECOFF (mm) Staphylococcus

aureus

Nombre de

souches non

sauvage

Seuil S/IR

(mm) EUCAST

Nombre de

souches avec un

diamètre inférieur Seuil S/IR

Seuil S/IR

(mm) CLSI

Nombre de

souches avec un

diamètre inférieur Seuil S/IR

Pénicilline 26 7 26 7 7 Céfoxitine 22 0 22 0 0

Ciprofloxacine 20 0 21 0 21 0 0

Kanamycine - Tobramycine 18 0 18 0 0 Gentamicine 18 0 18 0 15 0 0

Erythromycine 21 0 21 0 23 0 0 Clindamycine 22 0 22 0 21 0 0

Vancomycine -

Linézolide 19 0 21 0 0

Acide fusidique 24 0 24 0 0

Sulfamides - Triméthoprime 19 0 17 0 16 0 0

Tétracycline 22 0 22 0 19 0 0

Chloramphénicol 18 0 18 0 18 0 0

Rifampicine 25 0 26 0 20 0 0

Seule 7 souches de S. aureus coagulase positif ont acquis une résistance clinique à la

pénicilline.


134

III.3.D. Détermination de la population non-sauvage des Staphylococcus

coagulase négatif

Les autres souches de Staphylococcus (n=35) étaient toutes coagulases négatif. Des seuils

étaient disponibles pour 12 des antibiotiques testés (Tableau 22). Des COWT ont pu être calculés pour

2 antibiotiques. Les distributions des diamètres d’inhibition sont dans l’annexe IV

Tableau 22 : Population bactérienne de Staphylococcus spp. coagulase négatif (n=35) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ; COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.

Antibiotique

Seuils épidémiologiques Seuils cliniques

Nombre maximal

de souche ayant acquis

une résistance

ECOFF (mm) Staphylococcus spp. coagulase

négatif

Nombre de

souches non

sauvage

COwt

(mm)

Nombre de

souches Non-

sauvage

Seuil S/IR

(mm) EUCAST

Nombre de

souches avec un

diamètre inférieur au seuil

S/IR

Seuil S/IR

(mm) CLSI

Nombre de

souches avec un

diamètre inférieur au seuil

S/IR

Pénicilline SP - - Céfoxitine

(Staphylococcus spp.)

25 2 25 2 2

Cefoxitine (S. epidermidis)

22 0 0

Ciprofloxacine 24 0 24 0 21 0 0

Kanamycine 22 1 1 Tobramycine 22 2 22 2 2 Gentamicine 22 0 22 0 15 0 0

Erythromycine 21 8 21 8 23 8 8 Clindamycine 22 6 22 6 21 3 6

Vancomycine 14 0 0

Linézolide 19 0 21 0 0

Acide fusidique 24 5 24 5 5

Sulfamides EC - - Triméthoprime SP - 17 2 16 1 2

Tétracycline 22 2 22 2 19 2 2

Chloramphénicol 23 0 18 0 18 0 0

Rifampicine 26 0 26 0 20 0 0

Des souches résistantes à la céfoxitine (2 souches), la tobramycine (2 souches), la

kanamycine (1 souche), la clindamycine (6 souches), l’acide fusidique (2 souches), le triméthoprime

(2 souches) et la tétracycline (2 souches) ont été détectées. Les deux souches résistantes à la


135

céfoxitine étaient potentiellement résistantes à la méticilline. Il s’agissait d’une souche de S.

saprophyticus et une souche Staphylococcus sp. De plus, une image d’induction entre

l’érythromycine et la clindamycine a été observée pour 3 souches (AF16-53-CCTC1 [S. xylosus], AF16-

62-CCCH3 [S. haemolyticus] et AF16-252-OUPE1 [S. haemolyticus]) (Figure 11).

Figure 11: Antibiogramme d'une souche de S. aureus ATTC 25923 présentant un phénotype sauvage à gauche et d’une souche de S. haemolyticus AF16-62-CCCH3 à droite présentant un phénotype MLSB (en rouge). Pénicilline (PEN), céfoxitine (FOX), sulfamides (SSS), triméthoprime (TMP), linézolide (LZD), vancomycine (VAN), acide fusidique (FUS), tétracycline (TET), kanamycine (KAN), tobramycine (TOB), gentamicine (GEN), chloramphénicol (CHL), ciprofloxacine (CIP), érythromycine (ERY), clindamycine (CLI) et rifampicine (RIF).

L’induction d’une résistance de la clindamycine par l’érythromycine est un marqueur d’un

phénotype MLSB. Ces souches ont été isolées de crevettes (n=2) et de poissons plats (n=1).

Les antibiotiques pour lesquels il n’existait pas d’ECOFF (kanamycine, vancomycine,

pénicilline, sulfamides et triméthoprime), des COWT ont pu être définis pour la kanamycine et la

vancomycine. La souche avec un phénotype non-sauvage pour la kanamycine a été détectée grâce à

ce COWT. Nous n’avons pas pu déterminer de COwt pour les 3 autres antibiotiques : la pénicilline car

les diamètres d’inhibition étaient regroupés en 3 sous-populations de sensibilités différentes, les

sulfamides car l’écart-type était non valide et le triméthoprime car deux populations contenant des

espèces différentes étaient visibles (Figure 12a et 12b).

PEN FOX SSS

TMP

LZD VAN FUS TET

KAN TOB

GEN CHL

CIP ERY

CLI RIF

PEN FOX SSS TMP

LZD VAN FUS TET

KAN TOB

GEN CHL

CIP ERY

CLI RIF


136

Figure 12 : Distribution des diamètres d'inhibition de Staphylococcus spp. pour a) la pénicilline, b) le triméthoprime.

III.3.E. Multi-résistance

Au total, 67 % des souches de Staphylococcus avaient une population non-sauvage (Tableau

23).

Tableau 23 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Staphylococcus spp. (n = 29).

Nombre de classes d’antibiotiques avec

phénotype non-sauvage Classes d’antibiotiques

Nombre de souches


1

Macrolide 6

2 S. pasteuri 2 S. epidermidis

1 S. haemolyticus 1 Staphylococcus sp.

β-lactamines 9 7 S. aureus

1 S. saprophyticus 1 Staphylococcus sp.

Lincosamides 4 4 S. scuiri

Aminosides 2 2 S. pasteuri

ISF* 2 1 S. lentus

1 S. epidermidis

Stéroïde antibactérien 1 1 S. scuiri

Macrolide-Stéroïde antibactérien

1 1 S. haemolyticus

2

Tétracycline-Stéroïde antibactérien

1 1 S. hominis

Lincosamide-Stéroïde antibactérien

2 1 S. lentus 1 S. scuiri

Macrolide-Tétracycline 1 1 S. xylosus

*ISF=inhibiteur de la synthèse des folates

0

1

2

3

4

5

6

7

8

6 8 10121416182022242628303234363840

No

mb

re d

e s

ou

che

s

Diamètre d'inhibiton (mm)

a)

0

1

2

3

4

5

6

7

6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39

No

mb

re d

e s

ou

che

s

Diamètres d'inhibition (mm)

S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp

b)


137

Des résistances acquises ont été observées pour 9 des 10 espèces de Staphylococcus

étudiées. De plus, 5 souches appartenant à 5 espèces différentes ont cumulées des résistances à

deux classes d’antibiotiques.

III.3.F. Discussion

Des populations non-sauvages de Staphylococcus ont été détectées pour les macrolides (33

% des souches), β-lactamines (21 % des souches), acide fusidique (12 % des souches), tétracyclines (5

% des souches), aminosides (5 % des souches) et les inhibiteurs de la synthèse des folates (5 % des

souches). En ce qui concerne la classe d’antibiotiques des macrolides et apparentés (macrolide,

lincosamide et streptogramine), les gènes de résistance à l’origine des phénotypes non-sauvages

sont encore à identifier. La présence du phénotype MLSB inductible a déjà été détectée pour des

souches de Staphylococcus coagulase positif et négatif (Leclercq 2012b). Les gènes erm(A) et erm(C),

responsables de ce phénotype, sont les plus fréquemment identifiés dans les souches de

Staphylococcus (Leclercq 2012b). Les autres souches présentant soit un phénotype de résistance aux

macrolides, ou phénotype M, soit un phénotype de résistance aux lincosamides, ou phénotype L,

pouvaient avoir acquis des mécanismes de différentes natures : pompes à efflux, mutations

ribosomales, la production d’enzyme inactivant les molécules antibiotiques. L’étude de la résistance

d’une autre molécule (Streptogramine B ou lincomycine) appartenant à la classe des macrolides et

apparenté, serait utile pour orienter, in vitro, le diagnostic du type de mécanisme de résistance

présent (Leclercq 2012b).

Pour les β-lactamines, nous avons testé la pénicilline et la céfoxitine. Des seuils cliniques et

épidémiologiques pour la pénicilline ont été définis uniquement pour l’espèce S. aureus. Dans cette

étude, 88 % des souches de S. aureus étaient résistantes à la pénicilline. Aujourd’hui, près de 90 %

des souches de S. aureus sont productrices de pénicillinases blaZ (Lowy 2003). Ce gène a largement

diffusé au sein des populations de S. aureus pendant la deuxième moitié de XXe siècle par le biais de

transposon et de plasmides. De plus, la diffusion de β-lactamases semble également avoir impacté


138

les souches de Staphylococcus coagulase négatif isolées dans un contexte clinique (Cattoir et Leclercq

2012, Becker et al. 2014). Ceci peut expliquer les différentes sous-populations observées dans la

distribution des diamètres d’inhibition de la pénicilline, selon la présence/absence de pénicillinases

et le niveau d’expression de celles-ci. La résistance par ce mécanisme est privilégiée car la résistance

par la mutation des PLP est rare pour ce genre bactérien (Cattoir et Leclercq 2012). Pour autant, une

confirmation de la présence de pénicillinase par un test à la nitrocéfine est nécessaire.

En outre, 2 souches de Staphylococcus coagulase négatif avaient un phénotype non-sauvage

pour la céfoxitine. Elles étaient potentiellement résistantes à la méticilline. La résistance à la

méticilline est un problème de santé publique car elle confère une résistance à toutes les β-

lactamines, mais une confirmation de la présence de la cassette SCCmec, élément génétique mobile

porteur de la résistance à la méticilline, est indispensable. De plus, des souches de Staphylococcus

résistantes à la méticilline ont déjà été isolées de sashimi à base de maquereaux, saumon, thon, flet

et sériole (Hammad et al. 2012). La diversité de la structure de cette cassette est importante, 11

types ont été décrits, et plusieurs techniques ont été développés pour détecter et typer cet élément

génétique (Becker et al. 2014). Ces méthodes consistent à chercher les marqueurs génétiques par

PCR multiplexe ou directement par un séquençage du génome total (Deurenberg et Stobberingh

2008).

Les autres classes d’antibiotiques pour lesquelles des souches non-sauvages ont été

détectées, étaient les tétracyclines et l’acide fusidique. Des études ont montré des taux de résistance

aux tétracyclines allant de 7,5 à 20 % pour des souches hospitalières, ce qui est supérieur aux taux

observés dans notre étude (Becker et al. 2014). Les principaux gènes conférant la résistance aux

tétracyclines connus pour les bactéries du genre Staphylococcus sont tet(K) et tet(L) qui sont des

pompes à efflux, tet(M), tet(O) et tet(W) qui codent pour des enzymes modificatrices du ribosome

(Tazi et Poyart 2012). La prévalence de la résistance à l’acide fusidique est variable selon les pays


139

entre 4 et 30 % (Cattoir 2012). L’acquisition des résistances à cet antibiotique se fait soit par la

mutation de la cible fusA soit par l’acquisition d’un déterminant plasmidique fusB (Cattoir 2012).

De plus, un phénotype de résistance à la kanamycine et à la tobramycine, marque

l’acquisition d’une enzyme à activité ANT(4’)-I. En revanche, nous avons une souche avec un

phénotype de résistance à la tobramycine mais pas à la kanamycine, ce phénotype n’a pas été décrit

dans des souches de bactéries Gram positif (Bismuth et Courvalin 2012). Le diamètre d’inhibition a

été mesuré à 22 mm pour la kanamycine. Il est possible que le COWT calculé pour la kanamycine (22

mm) ne soit pas assez précis, du fait du faible nombre de souches utilisées pour le calculer, ou que le

diamètre mesuré soit dans l’incertitude de mesure de 2 mm (Barry et al. 1979). En outre, au vu du

nombre important d‘enzymes possédant des mécanismes d’action différents pouvant inactiver les

molécules antibiotiques de la famille des aminosides, il est possible d’avoir une enzyme non décrite

et présente dans le milieu aquatique (Shaw et al. 1993). Ces enzymes sont le principal mécanisme de

résistance acquise des bactéries du genre Staphylococcus et elles sont associées à des transposons,

ce qui facilite leur diffusion au sein des populations bactériennes (Shaw et al. 1993).

En conclusion, nous avons montré que toutes les espèces de Staphylococcus isolées de nos

produits ont pu acquérir des résistances pour la plupart des antibiotiques testés. De plus, la présence

de souches résistantes à la méticilline reste à confirmer. De plus, il pourrait être intéressant d’étudier

les mécanismes de résistance présents dans les souches ayant acquis des résistances.


140

III.4. Exiguobacterium

III.4.A. Contexte

Les bactéries du genre Exiguobacterium sont des bacilles Gram positif isolés

d’environnements variés (glaciers, eau marines, sources chaudes, …) (Vishnivetskaya et al. 2009). Les

souches Exiguobacterium spp. peuvent croître dans une gamme de température comprise entre -

12°C et 55°C. Les espèces de ce genre sont divisées en deux groupes, le groupe I contient les espèces

isolées d’environnements froids (permafrost, glacier,…) et le groupe II contient les espèces isolées

d’environnement plus chaud (eaux de mer, sources chaudes,…) (Vishnivetskaya et al. 2009). De plus,

il a été montré que certaines souches étaient capables d’acquérir des résistances aux métaux lourds

comme le mercure (Petrova et al. 2002). Cependant, les résistances naturelles ainsi que les capacités

d’acquisition de résistance aux antibiotiques des espèces du genre Exiguobacterium ne sont pas

connues.


Au total, 40 souches Exiguobacterium ont été sélectionnées pour l’étude de la résistance aux

antibiotiques. Les souches E. acetylicum (n=2) appartenaient au groupe I et les souches E. aestuarii

(n=14), E. profundum (n=4), E. marinum (n=2) et E. aurantiacum (n=1) appartenaient au groupe II.

Enfin, 17 souches n’ont pas été identifiées à l’espèce.


Il existe aucun seuil clinique ni seuil épidémiologique pour ce genre bactérien. Cependant,

nous avons pu déterminer des seuils épidémiologiques expérimentaux pour 15 antibiotiques

(Tableau 24). Les distributions des diamètres d’inhibition sont dans l’annexe V.


141

Tableau 24: Population bactérienne Exiguobacterium spp. (n=40) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.

Antibiotiques COwt (mm) Nombre de souches non-sauvages

Pénicilline 30 20 Céfoxitine 31 7

Ciprofloxacine 19 0

Kanamycine 21 0 Tobramycine 20 3 Gentamicine 21 1

Erythromycine 22 2 Clindamycine 21 0

Vancomycine 16 1

Linézolide 17 0

Acide fusidique ND -

Sulfamides 23 1 triméthoprime 15 3

Tétracycline 26 1

Chloramphénicol 21 0

Rifampicine 23 0

Il n’y a que pour l’acide fusidique que nous n’avons pas pu déterminer de COwt car la

distribution ne suivait pas une loi normale.

Des résistances acquises ont été observées pour 9 antibiotiques. La pénicilline était

l’antibiotique pour lequel le plus de souches étaient résistantes. Vingt de ces souches avaient acquis

un phénotype non sauvage pour la pénicilline, et deux populations étaient bien distinctes (Figure 13).

Figure 13 : Distribution des diamètres d’inhibition pour Exiguobacterium pour la pénicilline. La ligne rouge représente le COWT.

0

2

4

6

8

10

12

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E. acetylicum

E. marinum

E. profundum

E. aurantiacum

E. aestuarii

Exiguobacterium sp.


142

De même, deux sous-populations ont été observées pour le triméthoprime(Figure 14). Le

COwt a été calculé en ne prenant pas en compte la sous-population de souches avec des diamètres

d’inhibition supérieures à 24 mm (n=6).

Figure 14 : Distribution des diamètres d’inhibition pour Exiguobacterium pour le triméthoprime. La ligne rouge représente le COWT.


Parmi toutes les souches testées, 55 % avaient acquis au moins un phénotype de résistance

(Tableau 25).

Tableau 25: Cumul de phénotype-non sauvage pour Exiguobacterium spp. (n = 22)


phénotype non-sauvage

Antibiotiques Nombre de souches Espèces bactériennes

1 β-lactamines 13

5 E. aestuarii 2 E. acetylicum 1 E. profundum

5 Exiguobacterium sp.

ISF* 1 1 Exiguobacterium sp.

2

β-lactamines-Aminosides

3 2 E. aestuarii 1 E. marinum

β-lactamines- Macrolide

1 1 E. profundum

β-lactamines-ISF 1 1 E. aestuarii

Macrolide-ISF 1 1 E. aurantiacum

β-lactamines-Glycopeptide

1 1 Exiguobacterium sp.

3 β-lactamines -ISF-

Tétracycline 1 1 Exiguobacterium sp.

*Inhibiteurs de la synthèse des folates.

0

2

4

6

8

10

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6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E. acetylicum

E. marinum

E. profundum

E. aurantiacum

E. aestuarii

Exiguobacterium sp.


143

Treize souches avaient cumulé des résistances à des familles d’antibiotiques différentes : 7

souches avaient acquis des résistances à 2 classes antibiotiques et 1 souche à 3 classes

d’antibiotiques (multi-résistante). Cette dernière a été identifiée au genre Exiguobacterium sp. .

III.4.E. Discussion

La résistance aux antibiotiques n’a jamais été étudiée pour le genre Exiguobacterium. Ces

travaux étaient les premiers à établir des seuils épidémiologiques pour ce genre bactérien pour 15

antibiotiques. Seuls les résultats de l’acide fusidique n’ont pas pu être interprétés. De plus, notre

étude n’a pas mis en évidence de résistance naturelle de ce genre bactérien pour les antibiotiques

testés. Cependant, une sensibilité naturelle différente d’Exiguobacterium semble exister en fonction

des espèces du groupe I (psychrophile) ou au groupe II (mésophile, thermophile).

Des populations non-sauvages ont été observées pour les β-lactamines (50 % des souches),

les inhibiteurs de la synthèse des folates (10 % des souches), les aminosides (5 % des souches), les

macrolides (5 % des souches), les glycopeptides (2,5 %) et les tétracyclines (2,5 %). Deux populations

bien distinctes ont pu être mises en évidence sans influence de l’espèce d’Exiguobacterium. De plus,

certaines souches ont également acquis une résistance à la céfoxitine. Les mécanismes connus de

résistance aux β-lactamines pour les bactéries Gram positif sont variés : production de β-lactamases,

mutation au niveau des PLPs ou acquisition de PLP non sensible aux β-lactamines. Une étude plus

approfondie des phénotypes de résistance de ces souches à d’autres molécules de la famille des β-

lactamines : pénicillines, céphalosporines et carbapénèmes pourrait être faite. De plus, la production

de β-lactamase peut être vérifiée par un test à la nitrocéfine. Une étude moléculaire permettrait

d’identifier de potentielles β-lactamases, des mutations dans les séquences de PLP ou des

mécanismes comme la cassette SCCmec connu dans le genre Staphylococcus.

Des phénotypes de résistance aux aminosides ont été observés. Comme pour

Staphylococcus, aucune population non-sauvage pour la kanamycine n’a été mise en évidence, alors


144

que des populations non-sauvages ont été détectées pour la tobramycine et la gentamicine. Ces

phénotypes ne correspondaient pas à des mécanismes de résistance

Une souche non-sauvage pour la vancomycine a été détectée. Cet antibiotique est classé par

l’OMS comme hautement prioritaire parmi les antibiotiques d’importance critique (OMS 2017b).

Toutefois, le diamètre d’inhibition de cette souche est à un millimètre du seuil épidémiologique.

Cette différence est considérée comme non significative : la lecture de l’antibiogramme dépend de

l’expérimentateur, le CLSI considère qu’une variation de plus ou moins 2 mm est acceptable entre

deux lectures (CLSI 2018). L’éventuel phénotype non-sauvage de cette souche (AF16-48-CCCH1) pour

la vancomycine devra être confirmé par une autre méthode de détection phénotypique (CMI) ou

moléculaire. Les différents mécanismes connus sont une accumulation de mutations qui vont

entrainer une modification complexe du métabolisme de la synthèse de la paroi bactérienne

(épaississement de la paroi, surproduction des précurseurs de la paroi) et l’acquisition d’opérons de

résistance aux glycopeptides de type Van (EUCAST 2017). Les opérons de type Van sont détectables

par PCR ou séquençage du génome total (Dutka-Malen et al. 1995).

Enfin, nous avons détecté une souche multi-résistante (AF16-19-CCCH2) aux antibiotiques

suivant : tétracycline, pénicilline et sulfamide. Une autre souche identifiée Exiguobacterium sp

porteuse de gènes homologues aux gènes mec, tet, aad, fex, mph et dhfr sur différents plasmides a

été isolée de sédiments d’une ferme d’aquaculture en Chine (Yang et al. 2014). Les mécanismes de

résistance associés aux souches de la population non-sauvage sont toujours inconnus. Cependant, les

potentiel de transferts horizontaux de gènes de ce genre bactériens est peu décrit (Vishnivetskaya et

al. 2009). La description de plasmides est rare (Jakubauskas et al. 2009).

En conclusion, en absence de résistance naturelle aux antibiotiques testés, la méthode de

diffusion en milieu gélosé pour les 16 antimicrobiens testés ici semble pertinente pour détecter des

résistances acquises pour les bactéries du genre Exiguobacterium.


145

III.5. Pseudomonas

III.5.A. Contexte

Les bactéries du genre Pseudomonas sont ubiquistes, elles sont isolées de nombreux

biotopes (Silby et al. 2011). De plus, ce genre bactérien est fréquemment isolé dans les poissons,

crustacés et différents invertébrés marins (Heinsz et al. 1988, Harris 1993, Austin 2006).

Pseudomonas est également reconnu pour altérer les aliments à base de poissons (Bjørkevoll et al.

2003, Parlapani et al. 2015).

Les résistances naturelles pour l’ensemble des bactéries du genre Pseudomonas sont peu

connues (Lupo et al. 2018). En revanche, celles de l’espèce P. aeruginosa sont abondamment décrites

dans la littérature scientifique (Leclercq et al. 2013, Dreier et Ruggerone 2015, Lupo et al. 2018).

Cette espèce est naturellement résistante aux pénicillines, inhibiteurs de β-lactamines,

céphalosporines 1ère et 2ème génération, certaines céphalosporines 3ème génération, certains

carbapénèmes (ertapénème), inhibiteurs de la synthèse des folates, macrolides, quinolones 1ère

génération, phénicolés, tétracyclines, certains aminosides (kanamycine)(Leclercq et al. 2013).


L’étude de la résistance de 54 souches Pseudomonas spp. a été réalisée. Les souches que

nous avons identifiées à l’espèce appartenaient majoritairement au groupe P. fluorescens : P.

brenneri (n=7), P. helmanticiencis (n=2), P. libanensis (n=1), P. weihenstephanensis (n=1) et P. fragi

(n=2). Les autres souches identifiées à l’espèce étaient du groupe P. putida (n=2) : P. mosseli (n=1) et

P. putida (n=1) et une souche appartenait au groupe P. syringae : P. chicorii (n=1). La souche

identifiée P. alcaliphila n’appartenait à aucun groupe de Pseudomonas. Enfin, 41 souches ont été

identifiées qu’au genre.


146

Dans des études préliminaires au laboratoire, une partie des souches de Pseudomonas

isolées des produits aquatiques ne poussaient pas à 35°C, la température classiquement utilisée pour

incuber les antibiogrammes. Pour étudier la résistance aux antibiotiques des bactéries de ce genre,

les conditions d’incubation décrites dans le M02 du CLSI ont donc été appliquées (28°C/24h) (CLSI

2006a).


Les seuils cliniques et épidémiologiques présents dans les référentiels du CLSI et de l’EUCAST

pour Pseudomonas spp. n’étaient pas exploitables dans cette étude car ils ont été définis dans

d’autres conditions expérimentales (35 °C/16-20 h). Les distributions des diamètres d’inhibition sont

dans l’annexe VI. Des seuils épidémiologiques expérimentaux ont été calculés pour 5 antibiotiques

(ceftazidime, cefotaxime, ciprofloxacine, streptomycine, gentamicine) car la distribution des

diamètres d’inhibition suivait une loi normale (Tableau 26).

Tableau 26 : Population bactérienne Pseudomonas spp. (n =54) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.

Antibiotiques COWT (mm) Nombre de

souches non-sauvages

Pénicilline ND - Témocilline ND -

Amoxicilline-acide clavulanique

ND -

Céfalotine ND - Céfoxitine ND -

Ceftazidime 23 13 Cefotaxime 15 15

Acide nalidixique 2 - Ciprofloxacine 27 0

Streptomycine 9 16 Gentamicine 19 2

Azithromycine ND -

Cotrimoxazole ND -

Chloramphénicol ND -

Tétracycline ND -

Avec ces seuils, nous avons pu déterminer que 50 % des souches avaient acquis un

phénotype non sauvage pour au moins un antibiotique. La population non-sauvage pour la


147

streptomycine représentait 30 % des souches, 4 % pour la gentamicine, 28 % pour le cefotaxime et

24 % pour la ceftazidime.

Pour 5 des β-lactamines testées (ampicilline, témocilline, amoxicilline/clavulanate, céfalotine,

céfoxitine) l’ensemble des souches de Pseudomonas spp présentaient une croissance au contact du

disque d’antibiotique (Figure 15).

Figure 15:Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour l’ampicilline

Pour l’azithromycine, le cotrimoxazole, le chloramphénicol et la tétracycline, la distribution

des diamètres d’inhibition ne suivait pas une loi normale (Figure 16).

Figure 16 : Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour la tétracycline

Le seuil épidémiologique expérimental calculé pour l’acide nalidixique était de 2 mm (Figure

17). Sachant que le plus petit diamètre qui peut être mesuré est celui du disque d’antibiotique, 6

mm, toutes les souches ont été considérées comme faisant parti de la population sauvage. Le COWT

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6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

No

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ou

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s


P. alcaliphilaP. putidaP. mosseliiP. cichoriiP. weihenstephanensisP. marginalisP. helmanticiensisP. brenneriP. libanensisP. fragiP. fluorescensPseudomonas sp.

0

2

4

6

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10

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6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

No

mb

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ou

che

s




148

calculé pour l’acide nalidixique n’a pas pu être exploité pour détecter des résistances acquises à cet

antibiotique.

Figure 17: Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour l’acide nalidixique


Huit souches avaient cumulé des phénotypes de résistance à des classes d’antibiotiques

différentes (Tableau 27). Elles avaient acquis des résistances aux céphalosporines 3èmes génération

et/ou aux aminosides.

Tableau 27 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Pseudomonas spp. (n = 27).


phénotype non-sauvage Classes d’antibiotiques

Nombre de souches


1

Aminoside 8 1 P. mosseli

7 Pseudomonas spp.

β-lactamines 11

2 P. helmanticiencis 3 P. brenneri

1 P. marginalis 5 Pseudomonas spp.

2 β-lactamines - Aminoside 8 2 P. fluorescens 1 P. libanensis

5 Pseudomonas spp.

Les souches de Pseudomonas ont acquis des résistances aux aminosides et aux β-lactamines.

0

2

4

6

8

10

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6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

No

mb

re d

e s

ou

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s




149

De plus, pour 13 souches, nous avons détecté un antagonisme entre la ceftazidime et la

céfoxitine (Figure 18a et 18b) en sachant que la céfoxitine induit un mécanisme de résistance à la

ceftazidime. Il faut également noter que pour 8 d’entre elles le mécanisme de résistance à la

ceftazidime semblait être aussi induit par l’association amoxicilline/clavulanate (Figure 18b) et que

sept de ces souches appartenaient au groupe P. fluorescens. Les souches présentant ces phénotypes

ont été isolées, pour 14 de cabillauds et pour 2 de poissons plats.

Figure 18: Antibiogrammes des souches de Pseudomonas spp. présentant un phénotype d’induction de résistance à la ceftazidime. a) Souche AF16-309PEPE3. b) Souche AF16-280PECF1. Les antibiotiques écrits en rouge sont ceux impliqués dans le phénotype. Ampicilline (AMP), amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF), céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine (GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL), ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST).

III.5.E. Discussion

Les souches de Pseudomonas spp. de notre collection ne poussaient pas dans les conditions

recommandées dans les référentiels CLSI et EUCAST (35°C, 16-18 h). Nous avons donc utilisé les

conditions expérimentales définies dans le M42-A le CLSI pour les bactéries isolées des animaux

aquatiques (28°C, 24h) et nous avons calculé des COWT pour 5 molécules testées. Il y avait une

population non-sauvage pour les céphalosporines 3ème génération (35 % des souches) et les

aminosides (30 % des souches).

FOX FOX AMP AMP AMC AMC CAZ CAZ

CEF CEF CTX CTX TMC TMC CHL CHL

STR STR GEN GEN SXT SXT TET TET

AZM AZM NAL NAL CIP CIP CST CST

a) b)


150

En outre, un phénotype d’induction de résistance à la ceftazidime pour les souches du

groupe P. fluorescens a été détecté, il pourrait être dû à la présence d’une céphalosporinase

inductible, comme cela a été montré pour les bactéries de l’espèce P. aeruginosa mais avec un

système d’induction différent (Bagge et al. 2002). Il pourrait également s’agir d’un mécanisme de

résistance acquise. Le(s) mécanisme(s) responsable(s) de ce phénotype restent à déterminer.

Les souches de Pseudomonas spp. ont eu une croissance au contact des disques de

pénicillines, inhibiteur de β-lactamines, céphalosporines 1ère et 2ème génération, inhibiteur de la

synthèse des folates, macrolides et quinolones 1ère génération, phénicolés et tétracyclines. Il semble

que Pseudomonas spp. soit naturellement résistant à ces classes d’antibiotiques. Ce résultat est en

accord avec les résistances intrinsèques de P. aeruginosa décrites dans le référentiel EUCAST

(Leclercq et al. 2013).

De plus, le changement de protocole, en diminuant la température d’incubation des

antibiogrammes, a pu entraîner une moins bonne diffusion des antibiotiques. Une perte de précision

dans la mesure des diamètres pourrait être observée, accentuant la difficulté à établir des seuils

épidémiologiques expérimentaux (Smith et Kronvall 2015, Smith et al. 2018). Les distributions des

diamètres d’inhibition au niveau du genre n’ont pas montré l’apparition de sous-population liée à

des espèces de Pseudomonas. Les COWT calculés pour Pseudomonas spp. apparaissent pertinent pour

l’ensemble des molécules testées, excepté pour les céphalosporines 3ème génération.


151

III.6. Vibrio

III.6.A. Contexte

Les bactéries du genre Vibrio sont naturellement présentes dans le milieu aquatique. Ces

bactéries ont deux chromosomes, des plasmides et sont réputées pour leur plasticité génétique. Elles

possèdent des intégrons chromosomiques pouvant cumuler jusqu’à 180 cassettes de gènes (Rowe-

Magnus et al. 2003). De plus, Les souches de Vibrio peuvent acquérir des éléments génétiques

mobiles comme des plasmides ou des ICEs (Waldor et al. 1996, Makino et al. 2003, Hazen et al.

2010). Elles ont donc un potentiel d’acquisition de gènes de résistance. Les résistances naturelles des

souches de ce genre bactérien sont peu décrites. Dans le référentiel du CLSI, il est indiqué que les

souches de Vibrio halophiles sont souvent résistantes aux sulfamides, pénicillines et céphalosporines

1ère génération (CLSI 2015).


La résistance aux antibiotiques a été testée pour 46 souches de Vibrio spp. donc 33 souches

qui n’étaient pas identifiées à l’espèce, 8 identifiées V. metschnikovii, 4 identifiées V. alginolyticus, et

1 identifiée V. natriegens.

III.6.C. Etude de la résistance aux antibiotiques

Il n’existe pas d’ECOFF pour le genre Vibrio. Il y avait 9 antibiotiques pour lesquels des seuils

cliniques ont été définis dans le référentiel du CLSI. Les distributions de diamètres d’inhibitions sont

présentées dans l’annexe VII. De plus, nous avons pu déterminer des COWT pour 9 antibiotiques pour

Vibrio spp. (Tableau 28).


152

Tableau 28: Population bactérienne Vibrio spp. (n=46) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.

Antibiotiques

Seuils épidémiologiques Seuils cliniques Nombre maximal de

souche ayant

acquis une résistance

COwt

(mm) Vibrio spp.

Nombre de souches non-sauvages (%)

Seuil S/IR (mm) CLSI

Nombre de souches avec un

diamètre inférieur au seuil S/IR

Ampicilline ND - 16 23 23 Témocilline 16 1 0 Amoxicilline

acide clavulanique

SP - 17 0 0

Céfalotine SP - - Céfoxitine 15 0 17 1 0

Cefotaxime 28 0 25 0 0 Ceftazidime 21 1 20 0 0

Acide nalidixique EC - - Ciprofloxacine EC - 20 0 0

Streptomycine 8 0 0 Gentamicine 12 0 14 0 0

Azithromycine EC - -

Chloramphénicol 25 0 18 0 0

Tétracycline 22 0 14 0 0

Cotrimoxazole 24 0 15 0 0

Au total, 50 % des souches étaient résistantes à l’ampicilline et il y avait une seule souche,

identifiée Vibrio spp., avec un phénotype non-sauvage pour la témocilline et la ceftazidime. En

étudiant les diamètres d’inhibition, nous avons remarqué que leur distribution pour l’ampicilline ne

suivait pas une loi normale (Figure 19) et que pour 3 antibiotiques (acide nalidixique, ciprofloxacine

et azithromycine), les écart-types étaient trop grands pour valider le COWT.


153

Figure 19: Distribution des diamètres d'inhibition de Vibrio spp pour l'ampicilline.

De plus, pour la céfalotine et l’association amoxicilline/clavulanate, deux sous-populations

distinctes ont pu être observées. La première constituée de V. metschnikovii et la seconde, avec des

diamètres d’inhibition plus faibles, constitués par les autres Vibrio identifiées à l’espèce (Figure 20).

Les effectifs des souches n’étaient pas assez élevés pour déterminer des seuils épidémiologiques

pour chaque sous-population.

Figure 20 : Distribution des diamètres d’inhibition de Vibrio spp. a) amoxicilline/clavulanate, b) céfalotine.

III.6.D. Discussion

Nous n’avons pas détecté d’acquisition de résistance des souches de Vibrio spp. isolées des

produits aquatiques analysés. Les résistances naturelles et acquises des bactéries du genre Vibrio

sont peu décrites dans la littérature scientifique, exceptées des taux élevés (supérieurs à 80 %) de

0

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V. metschnikovii

V. natriegens

V. alginolyticus

Vibrio sp.

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6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

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a) Vibrio sp V. alginolyticus V. natriegens V. metschnikovii

0

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7

8

9

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40Diamètre d'inhibition (mm)

b) Vibrio sp V. alginolyticus V. natriegens V. metschnikovii


154

souches présentant des CMI supérieures à 256 µg.mL-1 aux pénicillines pour les souches des espèces

V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi et V. ichthyoenteri (Joseph et al. 1978, Teo et al.

2000, Lee et al. 2012). Nos résultats ont montré que V. metschnikovii et la plupart des Vibrio spp. que

nous avons isolés étaient également tous résistants à l’ampicilline. Les génomes séquencés des

souches V. alginolyticus, V. splendidus, V. campbelli, V. angustum, V. shilonii, V. coralliiitycus et V.

parahaemolyticus contiennent des β-lactamases chromosomiques de type carbénicillinase

responsables de la résistance intrinsèque des Vibrio spp. aux pénicillines (Fosse 2012, Chiou et al.

2015). La variabilité de ces séquences protéiques et de leur expression explique les niveaux de

résistance aux β-lactamines plus ou moins grands observés pour Vibrio spp. (Chiou et al. 2015). Enfin,

la précision de mesure des diamètres d’inhibition est de ±2 mm (Barry et al. 1979, CLSI 2012, Smith

et al. 2018). Les souches, dont les diamètres d’inhibition sont proches des seuils épidémiologiques (±

2 mm), soit ont acquis un mécanisme de résistance, soit avait un phénotype sauvage et le diamètre

mesuré était dans l’incertitude de mesure. Des études plus approfondies de recherche des

mécanismes de résistance permettrait de savoir s’il y a la présence de mécanisme de résistance

(mécanismes peu efficaces, mal exprimés, inconnus) ou si nous étions dans la limite de précision de

la méthode. La question se pose notamment pour les souches ayant acquis un phénotype non-

sauvage pour le chloramphénicol et la témocilline. De plus, il n’a pas été possible de valider des COWT

pour les macrolides et les quinolones pour le genre Vibrio car il faudrait calculer des COWT par

espèces de Vibrio mais notre collection ne contenait pas assez de souches par espèce espèce pour

calculer des COWT.

Enfin, le disque de streptomycine n’est pas pertinent à tester in vitro. Le COWT calculé est très

bas et ne permet pas de détecter une population non -sauvage de Vibrio. Pourtant de nombreuses

études ont mis en évidence, par des méthodes phénotypiques comme génotypiques, l’acquisition de

mécanismes de résistance à la streptomycine par Vibrio spp. (Bier et al. 2015, Baron et al. 2017b). Si


155

la streptomycine n’est pas une molécule d’intérêt pour le traitement des zoonoses alimentaires, son

intérêt comme marqueur épidémiologique pour évaluer la richesse d’un réservoir en gène de

résistance est moins contestée. Il pourrait être intéressant de tester des disques de streptomycine

avec une charge plus élevée que celle recommandée dans le CLSI (10 µg), en testant par exemple les

disques chargés à 300 µg, utilisés habituellement pour caractériser les phénotypes de résistance aux

aminosides des entérocoques (CLSI 2016b).


156

III.7. Proteus

III.7.A. Contexte

La classification bactérienne des espèces au sein de l’ordre des Enterobacteriales a été

redéfinie récemment (Adeolu et al. 2016). L’ordre s’intitule Enterobacterales et 7 familles

bactériennes ont été définies : Enterobacteriaceae, Hafniaceae, Morganellaceae, Erwiniaeceae,

Yersiniaceae, Pectobacteriaceae et Budviciaeae. Nous avons étudié plus spécifiquement le genre

Proteus. Ces bactéries sont naturellement résistantes aux pénicillines et céphalosporines 1ère

génération sauf l’espèce P. mirabilis. De plus, les souches de Proteus spp. sont naturellement

résistantes aux tétracyclines, polymyxines et nitrofuranes (Leclercq et al. 2013, CLSI 2016b).


L’étude de la résistance aux antibiotiques a été réalisée pour les souches de Proteus spp. car

c’était le seul genre bactérien pour lequel il y avait plus de 30 souches. Vingt-une n’ont pas

d’identification à l’espèce, 6 étaient identifiées comme P. vulgaris, 3 comme P. hauseri et 2 comme P.

terrae.

III.7.C. Etude de la résistance aux antibiotiques

Il n’y avait pas d’ECOFF défini pour Proteus spp. ou les espèces que nous avons identifiées.

Des seuils cliniques existaient dans les référentiels du CLSI et de l’EUCAST (Tableau 29). Les

distributions des diamètres d’inhibitions sont présentées dans l’annexe VIII.


157

Tableau 29: Population bactérienne Proteus spp. (n=32) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données.

Antibiotiques

Seuils épidémiologiques

Seuils cliniques

Nombre de

souches maximal

COwt

(mm)

Nombre de

souches non-

sauvage

Seuil S/IR (mm)

EUCAST


diamètre inférieur seuil S/IR

Seuil S/IR (mm) CLSI


diamètre inférieur seuil S/IR

Ampicilline ND - 14 29 16 29 29 Témocilline 23 0 0 Amoxicilline

acide clavulanique

SP - 19 0 17 0 0

Céfalotine ND - - Céfoxitine 14 0 19 0 17 0 0

Cefotaxime 27 0 17 0 0 Ceftazidime 30 0 25 0 0

Acide nalidixique 23 0 18 0 0 Ciprofloxacine 33 14 26 0 20 0 14

Streptomycine 17 0 14 0 0 Gentamicine 22 1 17 0 14 0 1

Azithromycine 6 0 0

Chloramphénicol SP - 17 1 17 2 2

Tétracyclinea SP - 14 26 26

cotrimoxazole 23 0 14 0 15 0 0

a) Résistance naturelle

Au total, 29 souches étaient classées résistantes à l’ampicilline et 26 souches étaient

considérées résistantes à la tétracycline. Dans les référentiels, les bactéries du genre Proteus spp.

sont naturellement résistantes à ces antibiotiques.

Deux souches avaient acquis une résistance au chloramphénicol et une seule à la

gentamicine.

De plus, le COwt calculé pour la ciprofloxacine a permis de détecter une population non-

sauvage pour 14 souches, or aucune de ces souches n’avait de phénotype non-sauvage pour l’acide

nalidixique. Ce phénotype de résistance est impossible et le seuil défini pour la ciprofloxacine n’a pas

été pris en compte pour la suite de l’analyse des résultats.


158

Dans le référentiel de l’EUCAST, il n’y a pas d’ECOFF pour le genre Proteus donc des COWT ont

été calculés pour tous les antibiotiques. Pour l’ampicilline et la céfalotine, la population bactérienne

avait majoritairement une croissance au contact du disque et donc aucun seuil n’a pu être calculé

(Figure 21).

Figure 21 : Distribution des diamètres d’inhibition de Proteus spp. pour l’ampicilline.

Pour l’association amoxicilline/clavulanate, la tétracycline et le chloramphénicol, des sous-

populations d’espèces de résistance différentes ont été observées (Figure 22) ce qui fait que nous

n’avons pas pu calculer de seuils épidémiologiques expérimentaux pour ces antibiotiques.

Figure 22 : Distribution des diamètres d'inhibition du chloramphénicol pour Proteus spp

0

5

10

15

20

25

30

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


P. terrae

P. hauseri

P.vulgaris

Proteus sp.

0

1

2

3

4

5

6

7

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


P. terrae

P. hauseri

P.vulgaris

Proteus sp.


159

III.7.D. Discussion

Trois souches ont été montrées pour avoir acquis des résistances aux aminosides ou aux

phénicolés mais les mécanismes restent à déterminer.

Les résistances naturelles des bactéries de la famille des Enterobacteriales sont décrites dans

la littérature. Les bactéries du genre Proteus, excepté P. mirabilis, produisent naturellement une

céphalosporinase inductible (Bonnet 2012). Cela confère une résistance naturelle aux pénicillines et

aux céphalosporines 1ère génération (Bonnet 2012, Leclercq et al. 2013). De plus, les bactéries du

genre Proteus sont également naturellement résistantes à la tétracycline. Cela explique, pour ces

antibiotiques, que la quasi-totalité des souches soient catégorisées résistantes ou intermédiaires

cliniquement pour ces antibiotiques. Le phénotype de résistance naturelle n’a pas été observée pour

3 souches de P. hauseri, 2 souches de P. vulgaris et 1 Proteus sp. Il est possible les mécanismes de

résistance ne soient pas exprimés ou alors que l’identification bactérienne ne soit pas bonne.

Néanmoins, ces souches ont été identifiées par séquençage de l’ADNr 16S, ce gène n’est pas

pertinent pour identifier les Enterobacteriales. L’identification bactérienne de ces souches peut être

erronée.

Pour les quinolones, nous avons détecté des souches ayant acquis des résistances à la

ciprofloxacine mais pas à l’acide nalidixique. Ces phénotypes de résistance sont impossibles car les

mécanismes connus pour cette famille d’antibiotiques affectent d’abord l’activité des quinolones 1ère

génération et ensuite les fluoroquinolones (Soussy 2012). Il est possible que le faible nombre de

souches, l’hétérogénéité de sensibilité des espèces ait artificiellement augmenté la valeur du COwt. Il

est également possible que l’étude de l’acide nalidixique par diffusion par disque ne permette pas de

différencier les populations bactériennes sauvages des populations non-sauvages ayant acquis des

résistances.


160

IV. Antibiorésistance et produits de la pêche et de l’aquaculture

IV.1. Contexte

Les bactéries étudiées ont été isolées de matrices alimentaires de différentes catégories

(poissons, crustacés, mollusques). De même, ces matrices provenaient soit de la pêche au niveau

européen (cabillaud et poissons plats) ou international (homards, noix de Saint-Jacques) soit de

l’aquaculture au niveau européen (moules et huîtres) ou international (crevettes). Après avoir

analysé les résultats des antibiogrammes par genre bactérien, nous avons analysé ces mêmes

résultats en fonction de la catégorie des produits et de leur origine géographique afin de déterminer

si ces facteurs avaient un impact sur la présence spécifique ou non de souches/ genres bactériens

résistants à certains antibiotiques.

IV.2. Résultats

Un total de 30 % des souches bactériennes étudiées en antibiorésistance (Enterococcus spp.,

Staphylococcus spp., Exiguobacterium spp., Pseudomonas spp., Vibrio spp. et Proteus spp.) avait un

phénotype non-sauvage pour au moins une classe d’antibiotique, 13 % pour au moins deux classes

d’antibiotiques, 2 % pour 3 classes d’antibiotiques et 1 % pour 4 classes d’antibiotiques. En regardant

le mode de production des animaux dans lesquels ces bactéries résistantes ont été détectées, 73 %

des isolats étaient présents dans des produits provenant de l’aquaculture (crevettes, moules et

huîtres) contre 35 % dans des animaux provenant de la pêche en mer (cabillauds, poissons plats, noix

de Saint-Jacques et homards) (Figure 23).


161

Figure 23: Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par genres bactériens étudiés en fonction du mode de production des matrices d’isolement. Les produits issus de la pêche sont les cabillauds, poissons plats, noix de Saint-Jacques et homards. Les produits issus d’aquaculture sont les crevettes, moules et huîtres. St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium, Pr=Proteus, Ps=Pseudomonas, Vr=Vibrio.

Les proportions de souches résistantes isolées des produits de la pêche étaient de 35 %. Les

proportions de souches résistantes étaient comprises de 0 % pour le genre Vibrio à 85 % pour le

genre Enterococcus. La population bactérienne non-sauvage représentait 73 % des souches isolées

des animaux d’élevage, de 0 % pour le genre Vibrio à 95 % pour le genre Exiguobacterium. La

différence de taux de bactéries résistantes, en fonction du mode de production des matrices, était

plus importante pour les genres Exiguobacterium et Pseudomonas par rapport aux autres genres. En

effet, les populations non-sauvages dans les produits issus de la pêche étaient de 15 % des souches

pour Exiguobacterium et 41 % pour Pseudomonas contre 95 % des souches d’Exiguobacterium et 79

% des souches de Pseudomonas dans les produits d’aquaculture. Par contre, pour le genre

Staphylococcus, la proportion de population non-sauvage représentait 74 % des souches isolées des

produits de la pêche contre 52 % des souches isolées des produits de l’aquaculture. Enfin, il est

important de noter que des souches multi-résistantes du genre Enterococcus (6/7 souches) ont été

isolées dans des produits issus de la pêche et des genres Enterococcus (1/7 souches) et la souche

multi-résistante Exiguobacterium a été isolée des produits de l’aquaculture.

En outre, les populations bactériennes non-sauvages étaient équivalentes dans les produits

importés (crevettes, homards et noix de Saint-Jacques) et dans les produits français (cabillauds,

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

St En Ex Pr Ps Vr St En Ex Pr Ps Vr

pêche aquaculture

Tau

x d

e s

ou

che

s

Genres bactériens selon le mode de production des matrices alimentaires

résistant à 4 classes



résistant à 1 classe

phénotype sauvage


162

poissons plats, moules et huîtres) où elles représentaient 47 % et 43 % des souches résistantes

respectivement (Figure 24). Les proportions de souches résistantes allaient de 0% pour le genre

Vibrio à 91 % pour le genre Enterococcus dans les produits importés et de 0 % pour le genre Vibrio à

80 % pour le genre Enterococcus dans les produits français. Enfin, il est important de noter que des

souches multi-résistantes des genres Enterococcus (5/7souches) et la souche multi-résistante

Exiguobacterium ont été isolées dans des produits importés et le genre Enterococcus (2/7 souches)

isolées des produits français.

Figure 24 : Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par genres bactériens étudiés selon le lieu de production. Les produits importés sont les crevettes, Saint-Jacques et homards. La production Européenne comprend les cabillauds, poissons plats, moules et huîtres. St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium, Ps=Pseudomonas, Pr=Proteus, Vr=Vibrio.

En revanche, si nous regardons les proportions de souches résistantes aux antibiotiques par

genre bactérien et par nature de produits de la pêche et de l’aquaculture, celles-ci étaient distribuées

de manière très hétérogène (Figure 25).

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

St En Ex Pr Ps Vr St En Ex Pr Ps Vr

Importé Production française

Tau

x d

e s

ou

che

s

Genre bactériens isolés en fonction du lieu de production de la matrice




résistant à 1 classe

phénotype sauvage


163

Figure 25 : Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par matrice alimentaire et par genres bactériens étudiés. St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium, Ps=Pseudomonas, Pr=Proteus, Vr=Vibrio.

Il faut noter que tous les genres bactériens étudiés en antibiorésistance n’ont pas été isolés

dans toutes les matrices alimentaires analysées. En effet, les 6 genres bactériens ont été détectés

dans 3 matrices alimentaires (cabillaud, poissons plats, noix de Saint-Jacques) alors qu’il y avait 4-5

genres dans les crevettes, homards et moules et seulement le genre Staphylococcus dans les huîtres.

Globalement, la proportion la plus importante de souches ayant acquis une résistance était dans la

matrice crevettes (88 %) avec les genres Staphylococcus, Enterococcus, Exiguobacterium et

Pseudomonas. Les proportions des souches résistantes dans les autres produits étaient plus faibles,

de 0 % dans les huîtres à 50 % dans les échantillons de moules et très dépendant des genres

bactériens. En effet, la totalité des souches de Staphylococcus spp. isolées des noix de Saint-Jacques

(2/2 souches) et des homards (1/1 souches) étaient résistantes à au moins une classe d’antibiotiques.

De même, la totalité des souches du genre Enterococcus isolées des homards (2/2 souches) et des

crevettes étaient résistantes à au moins un antibiotique ainsi que 81 % de celles isolées des poissons

plats. Des souches multi-résistantes du genre Enterococcus ont également été détectées dans les

poissons plats (2/7 souches), les crevettes (1/7 souches ), les homards (1/7 souches) et des noix de

Saint-Jacques (3/7 souches). Presque toutes les souches du genre Exiguobacterium isolées des

échantillons de crevettes avaient acquis au moins une résistance (19/20 souches). Dans les autres

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

St En Ex Ps Pr Vr St En Ex Ps Pr Vr St En Ex Ps Pr Vr St En Ex Ps Pr Vr St En Ex Ps Pr Vr St En Ex Ps Pr Vr St En Ex Ps Pr Vr

Cabillaud Poisson plat Crevette Homard Saint-Jacques Moule Huître

Tau

x d

e s

ou

che

s

Genres bactériens par matrice alimentaire

phénotype sauvage résistant à 1 classe résistant à 2 classes résistant à 3 classes résistant à 4 classes


164

produits où ce genre bactérien a été isolé les proportions de souches résistantes étaient plus faibles :

2/7 souches dans les homards et 1/9 dans les cabillauds. En revanche, la souche multi-résistante du

genre Exiguobacterium a été isolée dans les crevettes. Enfin, les proportions de Pseudomonas spp.

ayant acquis une résistance était plus importante dans les échantillons de moules (5/6 souches), de

cabillauds (12/23 souches) et de crevettes (5/7 souches) que dans les autres matrices alimentaires.

IV.3. Discussion

Nous avons observé que les animaux provenant de l’aquaculture étaient plus contaminés (70

%) par des bactéries résistantes aux antibiotiques avec même deux genres bactériens multi-résistants

(Enterococcus, Exigobacterium) que les animaux de capture (26 %) dans lesquels un genre bactérien

multi-résistant a été isolé (Enterococcus). De plus, le taux de bactéries résistantes isolées des

crevettes était plus élevé que dans les autres matrices. Un certain nombre de produits aquatiques

importés sont issus de l’aquaculture dont les pratiques d’usage des antibiotiques ne sont toujours

pas bien connues. Les données françaises relatives aux ventes d’antibiotiques indiquent que 0.5% des

antibiotiques sont utilisées en élevage piscicole. D’autres données sont très variables selon les pays

mais il a été montré par exemple une augmentation de la consommation des quinolones et

fluoroquinolones au Chili pour un usage principalement en aquaculture. Certaines molécules

antibiotiques sont stables et se dégradent très lentement si bien que ces pratiques peuvent

engendrer un relarguage très important de principe actif dans l’environnement aquatiques, on

estime que 80% des antibiotiques utilisés se retrouvent de façon active dans l’environnement

potentiellement à l’origine de sélection de bactéries résistantes dans le milieu (Cabello et al. 2013).

Les crevettes sont des animaux principalement élevées dans les pays en développement tropicaux

dont 87 % se fait en Asie (ifremer 2011). En effet, Boss et al. (2016) ont remarqué que des pangas et

des crevettes, élevés en Asie, étaient contaminés avec des bactéries multi-résistantes (E. coli, E.

faecalis et S. aureus) alors que des saumons et des huîtres, élevés dans des pays tempérés, ne

l’étaient pas. Les causes de ces différences de contamination entre les produits d’élevage de pays

tropicaux ou de pays tempérés restent à déterminer : différences dans l’usage des antibiotiques


165

utilisés en aquaculture, eaux chaudes favorisant plus le développement bactérien et/ ou de certains

genres bactériens que les eaux tempérées. En outre, dans les pays en tropicaux, des crues ou des

inondations causées par des pluies importantes lors de la saison humide (ouragans, tempêtes

tropicales, moussons) peuvent favoriser l’apport massif de bactéries fécales humaines et animales et

donc de leurs résistances vers le milieu aquatique (Yu et al. 2018). Cela pourrait favoriser la

dissémination des bactéries résistantes et de leurs gènes de résistance entre les milieux terrestre et

aquatique. De plus, l’aquaculture intégré, utilisé notamment en Asie est également un facteur de

transmission et de sélection de résistance aux antibiotiques dans le milieu aquatique (Petersen et

Dalsgaard 2003). En outre, ces dernières années, des crevettes d’aquaculture importées d’Asie du

sud-est et du Viêt-Nam, porteuses de bactéries Vibrio et Enterobacter productrices des

carbapénémases VCC-1, NDM-1 et IMI-1 ont été décrites (Mangat et al. 2016, Briet et al. 2018,

Brouwer et al. 2018). Il est estimé que 80 % des antibiotiques données en aquaculture partent

directement dans le milieu aquatique environnant, créant une pression de sélection favorisant les

bactéries résistantes dans l’eau et les sédiments autour des fermes d’élevage (Cabello et al. 2016,

Watts et al. 2017). De plus, les courants marins peuvent également disséminer les antibiotiques et

les bactéries résistantes présentes autour des fermes d’élevage aquatique.

D’ailleurs, une proportion non négligeable de souches résistantes a été observée dans les

produits marins de capture. L’origine de ces contaminations reste à déterminer. En effet, ces

bactéries peuvent être naturellement présentes sur les animaux ou alors provenir de bactéries

résistantes provenant du milieu terrestre. En effet, l’eau et les sédiments marins, notamment des

estuaires et des côtes sont soumis à de fortes pressions anthropiques. Des résidus de médicaments

utilisés en médecine humaine ou vétérinaire et des bactéries porteuses de résistance aux

antibiotiques peuvent se retrouver directement ou indirectement dans l’environnement via les

stations d’épuration qui n’éliminent que partiellement les micro-organismes et les substances


166

médicamenteuses, via les rejets des fermes aquacoles, ou via les eaux de ruissellement dans le milieu

agricole(Abraham 2010, Davies et Davies 2010, Bousquet-Mélou et Madec 2012), et peuvent

contaminer les animaux marins et les oiseaux comme décrit par Bogomolni et al. (2008). Une étude

sur l’estuaire de la Seine, un fleuve subissant une forte pression anthropique et agricole, a montré

que 50 % des souches E. coli isolées avaient acquis des résistances à au moins une classe

d’antibiotiques (Laroche et al. 2009). Cependant, des questions se posent toujours sur le devenir de

ces bactéries résistantes et de leur résistance, une fois arrivée dans le milieu marin (disparition par

prédation par les phages et les protozoaires, l’intégration dans un biofilm, dissémination des gènes

de résistance aux bactéries aquatiques, présence d’un effet de dilution, …). De plus, des études ont

montré que des bactéries comme Enterococcus spp. pouvaient adhérer et persister dans un état

viable non cultivable sur du plancton (Signoretto et al. 2004). En parallèle, d’autres études ont

montré que les particules inorganiques comme des microplastiques présentes dans le milieu

aquatique pouvaient servir de support pour la formation de biofilms bactériens (Zettler et al. 2013,

Ogonowski et al. 2018) et donc se posent la question de la présence possible de bactéries avec des

résistances acquises au sein de ces biofilms qui sont mixtes. De plus, des bactéries résistantes (et

leurs gènes de résistance) charriées par les effluents terrestres, pourraient se loger dans des biofilms

sédimentaires ou sur des particules organiques ou inorganiques en suspension et se déplacer au gré

des courants marins (Cabello et al. 2016). Les animaux marins sauvages peuvent être contaminés par

des bactéries résistantes en contact avec ces particules en suspensions ou les sédiments marins.

Il est également possible que certaines résistances que nous avons considérées comme

acquises étaient des résistances naturelles. Cette question s’est posée principalement pour les

souches de Pseudomonas spp. vis-à-vis des céphalosporines 3èmes génération. En effet, un phénotype

d’induction de résistance à la ceftazidime par la cefoxitine a été remarqué pour certaines souches qui

étaient identifiées comme faisant partie du clade P. fluorescens. Malheureusement, le taux


167

d’identification à l’espèce était faible et il n’a pas été possible de déterminer si ce mécanisme était

une résistance naturelle spécifique à des espèces de ce clade ou une acquisition de résistance. Il est

possible qu’il y ait eu une surestimation du nombre de résistances acquises.

De même, les produits importés comportaient plus de bactéries résistantes que les produits

français ce qui est très lié à la catégorie de produits analysés. En effet, les produits importés étaient

principalement constitués des crevettes issus de l’aquaculture par rapport aux produits français qui

étaient plus issus de la pêche (cabillauds, poissons plats, moules et huîtres). Cependant, la notion de

produits français est vague pour les produits de la pêche car les produits ont été obtenus auprès de

bateaux de pêche sous pavillon français. Cependant, des espèces comme le cabillaud ne sont pas

pêchées dans les eaux territoriales françaises mais dans les eaux de pays membres de l’Union-

Européenne ou internationales. Par exemple, certains échantillons de cabillauds ont été pêchés par

un bateau français, puis débarqués en Ecosse et transportés en camion jusque Boulogne sur mer.

En conclusion, la présence de bactéries ayant acquis des résistances à au moins une classe

d’antibiotiques, dont deux genres bactériens (Enterococcus et Exigobacterium) avec des souches

multi-résistantes, montrent que les produits marins, qu’ils proviennent d’élevage ou de la pêche,

sont un réservoir de bactéries résistantes aux antibiotiques. D’autres études font le même constat,

pour des produits importés en Suisse ou produits au Japon (Ahmed et al. 2015, Boss et al. 2016).

V. Bactérie (s) candidate(s) potentielle(s) indicatrice(s) de la

résistance aux antibiotiques dans les produits de la pêche et de

l’aquaculture

V.1. Contexte

Il est important de pouvoir surveiller des bactéries indicatrices dans le milieu terrestre mais

également dans le milieu marin. En effet, les bactéries aquatiques autochtones représentent des


168

vecteurs intermédiaires potentiels permettant le transfert de gènes de résistance présents

naturellement dans les bactéries environnementales vers les bactéries zoonotiques. Ainsi de

nombreuses résistances bactériennes identifiées et largement disséminés parmi les pathogènes de

l’Homme et des animaux terrestres, proviennent initialement de bactéries aquatiques. Cela

comprend par exemple, l’émergence de la résistance aux quinolones d’origine plasmidique, portée

par les gènes qnr (Plasmid mediated quinolone resistance) identifié pour la première fois chez Vibrio,

Shewanella et Aeromonas(Poirel et al. 2005, Cattoir et al. 2008, Xia et al. 2010), la détection de

nouvelles β-lactamases présentes chez Photobacterium damselae (Morii et al., 2004) et

Oceanobacillus iheyensis (Toth et al. 2010), la détection d’un nouveau déterminant de la résistance à

la fosfomycine isolé de l’environnement aquatique (Xu et al. 2011), la très large dissémination du

gène floR parmi les bactéries pathogènes chez l’Homme (Arcangioli et al. 1999, Bolton et al. 1999,

Cloeckaert et al. 2000, Cloeckaert et al. 2001) et encore d’autres gènes de résistance au

chloramphénicol identifiés à partir de bactéries aquatiques telles que Photobacterium, Vibrio,

Shewanella (Van Hoek et al. 2011, Roberts et al. 2012). La sélection de bactéries résistantes dans le

milieu aquatique peut survenir de plusieurs façons, comme par sélection spontanée de bactéries

mutantes au sein de l’environnement aquatique présentant une densité importante de bactéries,

cette densité augmente considérablement en aquaculture ce qui va favoriser la sélection, les

transferts et diffusion de bactéries résistantes d’autant plus que le milieu pourra contenir des doses

sub-inhibitrices d’antibiotiques. Ces échanges et transferts peuvent notamment avoir lieu au sein du

tractus gastro-intestinal des espèces aquatiques qui vont alors encore amplifier la diffusion via divers

éléments génétiques mobiles. D’autres facteurs peuvent intervenir dans la sélection de bactéries

résistantes comme l’alimentation apportée aux espèces élevées en aquaculture. Mais à ce jour, pour

le milieu aquatique, il n’y a pas de genres bactériens définis comme bactéries indicatrices comme

dans le milieu terrestre avec Escherichia coli, Enterococcus faecium et E. faecalis. La question se pose

de savoir s’il est pertinent de surveiller les mêmes bactéries indicatrices dans le milieu terrestre et


169

dans le milieu aquatique car ce sont deux milieux très différents au niveau par exemple de la

diversité des animaux, de la possibilité de dissémination des bactéries et/ ou gènes de résistance.

De plus, pour être reconnue comme bactérie(s) indicatrice(s) de la résistance aux

antibiotiques dans les produits aquatiques, le(s) genre(s) ou espèce(s) bactérienne(s) doivent

respecter plusieurs critères :

En premier lieu, les bactéries indicatrices doivent être isolées facilement d’une grande

majorité des échantillons analysés. Dans les plans de surveillance de la résistance aux antibiotiques

des animaux de rentes, E. coli est isolée de 95 à 100 % des échantillons de fèces tandis que les taux

d’isolement pour Enterococcus spp. des fèces est plus faible, près de 50 % des échantillons de fèces

de volailles (EFSA 2014). Dans le cas contraire, il faudrait un nombre trop importants d’échantillons

pour avoir un plan d’échantillonnage robuste.

Dans un deuxième temps, l’identification de l’espèce bactérienne doit être facile. Certaines

résistances naturelles sont liées aux espèces, et pour interpréter un antibiogramme correctement, il

est nécessaire de connaitre les résistances naturelles.

Dans un troisième temps, il faut qu’elles puissent être cultivées dans les conditions classiques

de l’antibiogramme (gélose Mueller-Hinton, 35 °C) et qui ne dégradent pas l’antibiotique.

Enfin, la bactérie indicatrice de la résistance aux antibiotiques doit être capable d’acquérir et

perdre des mécanismes de résistance. Cela se traduit par une diversité de profil de résistances et une

richesse des mécanismes de résistance.

Si une espèce bactérienne ne respecte pas ces critères, il ne sera pas possible de mettre en

place une surveillance de la résistance aux antibiotiques pertinente. Il serait également intéressant


170

d’avoir une bactérie indicatrice Gram positif et une Gram négatif car elles n’ont pas les mêmes

mécanismes de résistance.

Dans l’idéal, il faudrait que des critères d’interprétation épidémiologiques soient disponibles.

Ce critère n’est pas rédhibitoire comme les autres ; en effet, ces seuils sont définis pour un nombre

restreint d’espèces et de genres bactériens, notamment les espèces pathogènes (www.eucast.org).

Pourtant, les seuils épidémiologiques permettent de s’affranchir du facteur pharmacodynamie

(patient/hôte) pour la détection de résistance. En effet, dans un but d’études épidémiologiques, de

surveillance de l’évolution et de l’émergence des résistances aux antibiotiques, il est important de

prendre en compte la résistance microbiologique des bactéries à un antibiotique, sans prendre en

compte l’éventuel impact clinique.

Dans cette partie, nous avons discuté de la pertinence des 6 genres bactériens dont la

résistance aux antibiotiques a été étudiée (Enterococcus, Staphylococcus, Exiguobacterium,

Pseudomonas, Vibrio et Proteus).

V.2. Résultats

Chaque genre bactérien dont la résistance aux antibiotiques a été étudiée respecte à

différents degrés les différents critères définis (Tableau 30).

Tableau 30: Caractéristiques des genres bactériens dont la résistance aux antibiotiques a été étudiée selon les critères pour être une bactérie indicatrice de la résistance aux antibiotiques. ECOFF= seuils épidémiologiques définis pas EUCAST.

Genres bactériens

Prévalence dans les types de produits Taux

d’identification à l’espèce

Conditions antibiogramm

e

Nombre profil de résistanc

e

ECOFF existants

. Po*

(n=30)

Cr* (n=106

)

Mo* (n=45

)

Enterococcus 50 % 11 % 33 % 89 % 35 °C 18-20h 19 Oui Staphylococcus 73 % 9 % 20 % 82 % 35 °C 18-20h 10 Oui Exiguobacteriu

m 43 % 28 % 2 % 80 % 35 °C 18-20h 8 Non

Pseudomonas 87 % 3 % 8 % 39 % 28 °C-24h 3 Non Vibrio 13 % 4 % 27 % 49 % 35 °C 18-20h 0 Non

Proteus 33 % 2 % 9 % 63 % 35 °C 18-20h 2 Non

*Po=poissons, Cr= crustacés, Mo=mollusques

http://www.eucast.org/


171

Aucun des genres bactériens n’a été isolé dans plus de 50 % des échantillons de crustacés ou

de mollusques. Par contre, les genres bactériens Enterococcus, Staphylococcus et Pseudomonas ont

été isolés dans plus de 50 % des échantillons de poissons. Mais le genre Pseudomonas est éliminé car

les conditions d’antibiogramme sont particulières. En outre, les techniques d’identification utilisées

dans ces travaux étaient efficaces pour identifier les espèces des genres Enterococcus,

Staphylococcus et Exiguobacterium mais non pertinentes pour obtenir les espèces de Pseudomonas,

Vibrio et Proteus. De même le nombre de profils de résistance différents détectés était le plus

important pour Enterococcus (19 profils). Au contraire, les genres bactériens Vibrio, Proteus et

Pseudomonas avaient un nombre de résistance de profil de résistance faible, de 0 à 3

respectivement. Enfin, il y avait 8 à 10 profils de résistance différents pour les autres genres

bactériens. Au final, seul le genre Staphylococcus remplissait les différents critères pour être de

potentielles bactéries indicatrices de la résistance aux antibiotiques, mais uniquement pour les

poissons.

V.3. Discussion

A ce jour, pour le milieu aquatique, il n’y a pas de genres bactériens définis comme bactéries

indicatrices comme dans le milieu terrestre avec comme bactérie Gram négatif Escherichia coli, et

comme bactérie Gram positif Enterococcus faecium et E. faecalis.

Dans cette étude, les bactéries Gram négatif qui ont été étudiées en antibiorésistance étaient

Pseudomonas, Vibrio et Proteus. Le genre Vibrio a été une piste envisagée comme indicatrice de la

résistance aux antibiotiques dans le milieu aquatique (Baron et al. 2017b). Cependant, malgré une

plasticité génétique, aucun mécanisme de résistance acquis n’a été détecté dans notre étude. Des

travaux dans l’estuaire de la Rance ont montré que 9 %, 16 % et 8 % des souches de V. cholerae

avaient acquis des résistances aux sulfamides, à la streptomycine et l’ampicilline respectivement

(Baron et al. 2017b). Les gènes de résistance associés étaient sul1 et sul2 pour la résistance aux


172

sulfamides et les gènes strA et strB pour la résistance à la streptomycine. Des souches de V. cholerae

avec des profils de résistance similaires (11 % pour l’ampicilline et 2 % pour la streptomycine) ont été

isolées dans la mer Baltique (Bier et al. 2015). De plus, des souches productrices de

céphalosporinases et carbapénémases ont été décrites ; par exemple le gène blaCMY-2 a été trouvé

dans des souches alimentaires de V. parahaemolyticus et V. alginolyticus (Li et al. 2015, Ye et al.

2016). De même, une nouvelle carbapénèmase blaVCC-1 a été décrite dans une souche de V. cholerae

isolée de crevettes (Mangat et al. 2016). De plus, ces bactéries sont capables de transmettre des

résistances aux Enterobacteriales par conjugaison (Abe et al. 1966). Vibrio spp. peut donc

transmettre des résistances acquises à la flore intestinale des consommateurs. Le genre Vibrio

semble donc intéressant pour surveiller la résistance dans le milieu aquatique, mais d’autres études

sur la résistance aux antibiotiques des Vibrio spp. sont nécessaires en ciblant peut être plutôt une

espèce de Vibrio que le genre.

Ensuite, les bactéries du genre Pseudomonas ont, comme pour l’espèce Pseudomonas

aeruginosa, de nombreuses résistances naturelles à de nombreuses familles d’antibiotiques (Leclercq

et al. 2013). Cela limiterait la surveillance à quelques classes d’antibiotiques comme certaines β-

lactamines (carbapénèmes, céphalosporines 3ème génération), les aminosides ou les quinolones. De

plus, les bactéries de l’espèce P. aeruginosa sont capables d’acquérir des résistances par de

nombreux mécanismes, dont des mécanismes non transférables comme des surexpressions de

pompes d’efflux MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM conférant des résistances à

plusieurs familles d’antibiotiques ou des mutations de la porine OprD2 conférant une résistance aux

carbapénèmes (Nordmann et Naas 2012, Dreier et Ruggerone 2015). Cependant, ces résistances sont

connues pour l’espèce P. aeruginosa, mais l’extrapolation de ces résistances pour l’ensemble des

bactéries du genre Pseudomonas n’est pas démontrée. De plus, les conditions d’incubation de

Pseudomonas, que nous avons utilisées, ont été modifiées par rapport aux conditions classiques d’un

antibiogramme par diffusion (M42 du CLSI (CLSI 2006a)) car les souches ne poussaient pas. De plus,

un autre inconvénient de l’utilisation de ces conditions d’incubation est le faible nombre de contrôle


173

qualité existants à 28 °C. Sur les 16 molécules antibiotiques que nous avons testées pour

Pseudomonas spp. , il n’existe qu’un contrôle qualité pour l’ampicilline (10 µg), la gentamicine (10

µg) et le cotrimoxazole (25 µg) (CLSI 2016a). La diffusion des autres antibiotiques n’a pas pu être

validée pour les autres molécules testées. Les bactéries du genre Pseudomonas ont surtout été

associées aux poissons et pourraient être des indicateurs de la résistance aux antibiotiques des flores

bactériennes de cette catégorie de produit, à condition de revoir les conditions de culture, si elles

sont espèces dépendantes, et de définir les résistances naturelles et les espèces ou groupe d’espèces

d’intérêt.

Enfin, le genre Proteus a été principalement isolé des poissons plats et des cabillauds. Les

souches ont été isolées d’autres animaux aquatiques comme des crustacés : homards, crabes,

crevettes (Drzewiecka 2016). Le nombre de souches de Proteus spp. était faible (n=32) et une seule

souche résistante a été observée. D’autres études, optimisant l’isolement de ces bactéries, sont

nécessaires pour estimer leur prévalence dans les produits aquatiques et déterminer s’il serait un

bon indicateur.

En outre, les bactéries Gram positif, que nous avons étudiées en antibiorésistance, étaient

Staphylococcus, Enterococcus et Exigobacterium. À part Staphylococcus, les autres genres bactériens

Gram positif étudiés ne semblaient pas pertinent pour être des bactéries indicatrices de la résistance

aux antibiotiques dans les produits aquatiques. Il a été isolé de toutes les catégories de produits, les

espèces de ce genre ont été facilement identifiées, des ECOFFs existent dans le référentiel EUCAST et

des souches avec des profils de résistance variés ont été détectées. Cependant, les bactéries du

genre Staphylococcus sont associées aux animaux à sang-chaud et aliments fermentés et sont

considérées comme des marqueurs d’hygiène dans les produits alimentaires aquatiques (Hammad et

al. 2012, Becker et al. 2014).Il n’est pas possible de certifier que la contamination des produits de la


174

pêche par Staphylococcus spp. soit naturelle du milieu aquatique ou faite par l’homme (Hammad et

al. 2012).

Pour le genre Enterococcus, il est déjà utilisé avec les espèces, Enterococcus faecium et E.

faecalis, comme bactéries indicatrices de la résistance aux antibiotiques du milieu terrestre (EFSA

2012). D’après nos travaux, les espèces à étudier dans les produits aquatiques serait plutôt E. faecalis

et/ ou E. thailandicus ce qui a été également proposé par Boss et al. (2016) pour E. faecalis.

Cependant, des seuils épidémiologiques sont à définir pour les différentes espèces de ce genre

bactérien.

Enfin, l’étude de la résistance aux antibiotiques du genre Exiguobacterium dans les

conditions classiques d’un antibiogramme par diffusion a été possible. Des seuils épidémiologiques

expérimentaux ont pu être calculés. Pour autant, les résistances naturelles des espèces de ce genre

ne sont pas connues et il semble qu’une sensibilité soit différentes selon si les souches sont

psychrophiles (groupe I) ou mésophiles/thermophiles (groupe II). D’autres études sur la prévalence

de ce genre bactérien dans les produits aquatiques et son potentiel d’acquisition de résistance aux

antibiotiques sont nécessaires pour valider l’intérêt d’utiliser ce genre bactérien comme indicateur.

De plus, les conditions d’enrichissement et d’isolement utilisés dans l’étude ont été choisies

pour sélectionner la flore mésophile cultivable dans différents buts :

pouvoir réaliser des antibiogrammes à 35°C (conditions indiquées dans les référentiels),

étudier une flore qui pourra être un risque pour la santé du consommateur. En effet, les

bactéries aquatiques autochtones représentent des vecteurs intermédiaires potentiels permettant le

transfert de gènes de résistance présents naturellement dans les bactéries environnementales vers

les bactéries zoonotiques. Ainsi de nombreuses résistances bactériennes identifiées et largement


175

disséminés parmi les pathogènes de l’Homme et des animaux terrestres, proviennent initialement de

bactéries aquatiques.

De plus, une seule colonie de chaque morphologie a été sélectionnée. Ces conditions de

sélection ont entrainé un biais sur la flore bactérienne isolée des différents produits, même si des

spécificités ont pu être observées (Pseudomonas/poissons, Vibrio/noix de Saint-Jacques, …). Il

faudrait optimiser les conditions d’enrichissement (température, durée, milieu,…) et sélectionner

plusieurs colonies de chaque morphologie pour avoir un meilleur aperçu de la prévalence des

bactéries pouvant être de potentielles indicatrices de la résistance aux antibiotiques dans les

produits de la pêche et de l’aquaculture. Par exemple, pour optimiser l’isolement du genre

Enterococcus, les échantillons pourraient être enrichis à 37 °C pendant 18 à 28h, comme cela est fait

pour isoler ces bactéries des fèces de volaille (EFSA 2008).

En outre, tous les échantillons étudiés ont été conservés à -20 °C entre le prélèvement et

l’étape d’enrichissement. Ce stress thermique change les capacités de croissance des bactéries et

donc modifie la flore bactérienne cultivable d’un échantillon (Semanchek et Golden 1998, Ghafir et

Daube 2007). Il s’agit probablement d’une des raisons pour lesquelles des bactéries attendues,

comme Vibrio spp. ou Aeromonas spp., n’ont pas ou peu été isolées. Pour ces raisons, il faudrait

optimiser les conditions d’enrichissement et d’isolement de ces genres bactériens.

En parallèle, les seuils épidémiologiques ont été définis pour les genres bactériens. Pourtant,

l’observation de la distribution des diamètres d’inhibition selon les espèces bactériennes laisse

penser que les seuils épidémiologiques peuvent être établis au niveau du genre ou en fonction du

groupement d’espèce au sein du genre bactérien, selon le couple antibiotique/bactérien considéré.

D’autres auteurs ont montré que pour Aeromonas spp., les seuils épidémiologiques ont pu être

définis au niveau du genre bactérien (Smith et al. 2012, Baron et al. 2017a). Cependant, ces auteurs

ont également montré que pour certaines molécules comme les quinolones et les céphalosporines,

les seuils n’ont pas pu être définis au niveau du genre et qu’il faudrait les définir pour les différentes


176

espèces Aeromonas. De même, le calcul de seuils épidémiologiques au niveau du genre bactérien

s’est révélé être peu pertinent pour les β-lactamines principalement et pour d’autres classes

d’antibiotiques (quinolones) où la sensibilité étaient différentes selon les espèces (Enterococcus,

Staphylococcus, Vibrio, …). En général, cela est dû à des résistances naturelles et des sensibilités

spécifiques selon les espèces. Pour les β-lactamines, l’identification des souches bactériennes à

l’espèce et le calcul des seuils pour les espèces bactériennes est donc indispensable.

Enfin, le nombre de souches dont la résistance aux antibiotiques a été étudiée par genre

bactérien était faible, de 32 à 58 souches. La faible diversité des profils de résistance peut s’expliquer

par la collection de souches étudiées. D’autres études sont nécessaires pour confirmer la faible

diversité des profils de résistance de Vibrio spp. et Proteus spp.

Finalement, des études complémentaires sont nécessaires pour valider l’intérêt des genres

Enterococcus, Exiguobacterium, Staphylococcus, Pseudomonas, Vibrio et Proteus en tant que bactérie

indicatrice de la résistance aux antibiotiques dans les produits de la pêche et de l’aquaculture.


177

- Établir des seuils épidémiologiques expérimentaux (COWT) nécessite d’identifier les espèces

bactériennes.

- Les résistances naturelles des espèces Exiguobacterium, Vibrio et Pseudomonas sont à

déterminer.

- Les crevettes étaient porteuses de plus de bactéries résistantes aux antibiotiques que les

autres produits.

- Les produits d’aquaculture étaient porteurs de plus de bactéries résistantes que ceux issus

de la pêche.

- Une souche Exiguobacterium et trois souches Enterococcus multi-résistantes ont été isolées

de deux crevettes et d’un poisson plat.

- Staphylococcus (Gram positif) peut être une bonne bactérie indicatrice de la résistance aux

antibiotiques dans le milieu aquatique.

179

Chapitre 3 : E tude de la re sistance aux antibiotiques de Vibrio

parahaemolyticus isole s de produits de la pe che et de l’aquaculture

Chapitre3 : Etude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture

180

I. Contexte de l’étude

Vibrio parahaemolyticus est une bactérie Gram négatif naturellement présente dans le milieu

marin, dans des eaux présentant une température supérieure à 15°C (Su et Liu 2007b). Cette bactérie

est responsable de toxi-infections alimentaires liées à la consommation de produits aquatiques, et

plus spécifiquement à la consommation de coquillages et de crustacés (Su et Liu 2007b). Elle est

également un des agents étiologiques de la diarrhée du voyageur (Diemert 2006a). En Europe, les

données de surveillance sur la présence de Vibrio spp dans les produits aquatiques importés ou

locaux sont rares et l’incidence des toxi-infections alimentaires à V. parahemolyticus est

probablement sous-estimée car cette bactérie n’est pas systématiquement recherchée en cas de

gastro-entérites (Baker‐Austin et al. 2010). Toutefois, des infections liés à la consommation de

produits importés ont été décrites en Espagne, où suite à un banquet sur un bateau de croisière, 100

personnes ont été contaminées par V. parahaemolyticus (Martinez-Urtaza et al. 2016) et en France

en 1997, où 44 personnes ont été infectées suite à l’ingestion de crevettes ou de moules importées

d’Asie (Lemoine et al. 1999). D’autre part, des études montrent sa présence dans les eaux côtières de

Galice, de France et dans la mer Baltique (Baker-Austin et al. 2017) et sur des crabes élevés dans la

Tamise(Wagley et al. 2009). Avec le réchauffement des océans, cette espèce bactérienne devient un

risque émergent dans les zones tempérées (Vezzulli et al. 2016).

Les bactéries du genre Vibrio sont connues pour avoir une certaine plasticité génétique grâce

à la présence d’intégrons chromosomiques, d’îlots génétiques d’ICEs et de plasmides (Hazen et al.

2010). Cependant, la diversité et l’évolution des éléments génétiques mobiles dans le genre Vibrio

sont encore peu connus (Iwanaga et al. 2004, Ceccarelli et al. 2006) et elle est capable de transférer

des gènes de résistance aux antibiotiques par conjugaison avec les bactéries de la famille

Enterobacterieaceae (Abe et al. 1966). Ces caractéristiques semblent indiquer que les bactéries du

genre Vibrio, dont V. parahaemolyticus, pourraient être un réservoir de gènes de résistance et/ou un

vecteur de ces gènes entre le milieu marin et la flore digestive de l’homme.


181

Les études sur la résistance aux antibiotiques de l’espèce V. parahaemolyticus sont peu

nombreuses et les seuls seuils définis pour Vibrio spp. Sont des seuils cliniques dans le référentiel du

CLSI. En sachant que ces seuils cliniques sont dérivés de ceux des Enterobacteriaceae (CLSI 2015). Les

résistances naturelles sont également peu décrites dans la littérature, le CLSI signale que Vibrio spp

halophiles, dont V. parahaemolyticus, sont généralement résistants à l’ampicilline, aux

céphalosporines première et deuxième génération, ainsi qu’aux sulfamides (CLSI 2015).

Le but de ces travaux a été d’étudier la résistance aux antibiotiques d’un panel de souches de

V. parahaemolyticus isolées de produits de la pêche et de l’aquaculture.

Dans une première partie, nous avons d’abord testé les familles d’antibiotiques permettant

de détecter des mécanismes de résistance pour des familles d’antibiotiques d’importance critiques

pour la santé humaine définie par l’OMS : β-lactamines, dont les pénicillines, céphalosporines 1ère,

2ème , 3ème et 4ème génération, carbapénèmes, quinolones, aminosides, macrolides, phénicolés,

tétracyclines, inhibiteurs de la synthèse des folates (OMS 2017a). Pour chaque molécule testée, nous

avons établi des seuils épidémiologiques selon la méthode décrite par Kronvall et al. (Kronvall et al.

2003). A partir de ces seuils, nous avons ensuite cherché la présence d’intégrons de classe 1,2 et 3 et

des ICE SXT/R391 pour les souches présentant des phénotypes non-sauvages.

Dans une deuxième partie, nous avons caractérisé les mécanismes de résistance rencontrés

dans la collection et leur capacité de diffusion au sein d’autres bactéries.


182

II. Définition des seuils épidémiologiques avec la recherche des

intégrons/SXT

II.1. Contexte

Dans la première partie de ces travaux sur le souchier V. parahaemolyticus, nous avons

déterminé des seuils épidémiologiques pour 15 antibiotiques. Les antibiotiques testés ont été les

mêmes que ceux utilisés pour étudier la résistance aux antibiotiques des bactéries Gram négatif

isolées des produits de la pêche et de l’aquaculture dans le chapitre 2. Ensuite, pour les souches

présentant un phénotype non-sauvage pour au moins un antibiotique, la présence des marqueurs

épidémiologiques des intégrons de classe 1,2 et 3 et des ICE SXT/R391 ont été recherchés par PCR

(Barraud et al. 2010, Bioteau et al. 2018).


183

II.2. Matériel et méthodes

II.2.A. Sélection des souches

Les souches ont été collectées au laboratoire dans le cadre des travaux de référence et de

recherche de l’unité. Elles ont été isolées selon la norme NF ISO/TS 21872 relative à la recherche de

Vibrio spp. potentiellement entéropathogène dans les coquillages et les produits de la pêche. Elles

ont été conservées en cryotube dans du bouillon cœur cervelle (BCC) avec 20 % de glycérol à -80°C.

II.2.B. Antibiogramme par diffusion

À partir d’un cryotube, la souche a été ensemencée sur une gélose nutritive salée à 2 % (GNS)

et incubée à 37°C pendant 24h. Les antibiogrammes ont été effectués selon les recommandations du

M45 du référentiel CLSI (CLSI 2015). Des colonies ont été suspendues dans de l’eau physiologique

(Biomérieux) pour obtenir une culture bactérienne à 0,5 McFarland de turbidité. La suspension était

ensuite étalée sur une gélose Mueller-Hinton (Biorad) à l’aide d’un écouvillon stérile. Les disques

d’antibiotiques étaient ensuite déposés et la gélose était incubée pendant 16 à 18h à 35°C. Nous

avons veillé à ne pas dépasser un délai de 15 minutes entre la préparation de la suspension et l’étape

d’ensemencement, l’étape d’ensemencement et le dépôt des disques, et le dépôt des disques et

l’incubation de la gélose. La souche E. coli ATCC 25922 a été utilisée comme contrôle qualité de

l’antibiogramme. Les disques d’antibiotiques (Biorad) testés ont été les suivants : ampicilline (10 µg),

témocilline (30 µg), amoxicilline-acide clavulanique (20/ 10 µg), , céfalotine (30 µg), céfoxitine (30

µg), ceftazidime (30 µg), céfotaxime (30 µg), acide nalidixique (30 µg), ciprofloxacine (5 µg),

streptomycine (10 µg), gentamicine (10 µg), azithromycine (15 µg), chloramphénicol (30 µg),

tétracycline (30 µg), triméthoprime-sulfamétoxazole (1,25/3,75 µg) et colistine (10 µg). Le disque de

colistine a été utilisé dans un but de qualité, pour s’assurer de la pureté de la culture. Les diamètres

d’inhibition ont été mesurés avec un appareil Biomic®V3 (Gilles scientific).


184

II.2.C. Interprétation des résultats

Il n’existe pas d’ECOFF définis pour V. parahaemolyticus. Les résultats ont été analysés pour

définir des seuils épidémiologiques expérimentaux (COWT) et pour définir les populations sauvages et

non-sauvages.

Nous avons déterminé des seuils selon la méthode normalized resistance interpretation

(NRI), décrite par Kronvall et al. (Kronvall et al. 2003). La méthode NRI a été utilisée avec la

permission du détenteur du brevet européen No 1383913 et américain 7,465,559 (Bioscand AB,

TÄBY, Sweden). Pour chaque antibiotique, la distribution des souches selon le diamètre d’inhibition

de croissance a été réalisée. Lorsque cette distribution suivait une loi normale, nous avons déterminé

la moyenne et l’écart-type. La valeur entière la plus proche de la moyenne moins 2,5 fois l’écart-type

a été définie comme étant le COWT. Les COWT ont été comparés aux seuils cliniques disponibles pour

Vibrio spp dans la table 20 du M45 du CLSI (CLSI 2015). Nous avons utilisé une feuille de calcul Excel,

mis à disposition gracieusement par P. Smith, W. Finnegan et G. Kronvall, pour calculer les COWT. Les

souches ayant acquis des résistances à 3 classes d’antibiotiques et plus sont dites multi-résistantes

(Magiorakos et al. 2012).

II.2.D. Recherche des intégrases des intégrons de type 1, 2 et 3 et de l’intégrase

des ICE SXT/R391 par PCR

A partir d’un cryotube, la souche a été repiquée sur une GNS et incubée à 37°C pendant 24h.

Plusieurs colonies ont été suspendues dans 200 μL d’InstageneTM matrix (Bio-rad) dans un tube

Eppendorf. La suspension était incubée pendant 30 min à 56°C puis agitée pendant 10 s et incubée

pendant 8 min à 100°C. Enfin, les tubes étaient centrifugés pendant 5 min à 13 000 x g. Les solutions

d’ADN pouvaient être utilisées immédiatement ou conservées à -20°C. Par contre pour les solutions

congelées, elles devaient être agitées et centrifugées 5 min à 13 000 x g avant leur utilisation. Ensuite

les PCR ont été réalisés comme suit en fonction des gènes ciblés :


185

- Le mélange réactionnel de la PCR pour la recherche des intégrases IntI1, IntI2 et IntI3

était préparée avec 41,40 µL de nuclease free water (Qiagen), 5 µL de tampon 5X

(Qiagen), 1 µL de dNTP à 100mM (Eurobio), 0,20 µL d’amorces du gène cible (Tableau

311) (Eurobio, Les Ulis, France) et 0,20 µL de Hot Start Taq DNA Polymerase à 5 U.µL-1

(Qiagen). Le mélange réactionnel était réparti dans une plaque et 2 µL de l’extrait d’ADN

étaient ajoutés.

- Le mélange réactionnel de la PCR pour la détection de l’intégrase de l’ICE SXT/R391 était

préparé avec 40,75 µL de nuclease free water (Qiagen), 5 µL de tampon 5X (Qiagen), 1 µL

de dNTP à 100mM (Eurobio), 0,25 µL pour chaque amorce (Tableau 311) et 0,25 µL de

Hot Start Taq DNA Polymerase à 5 U.µL-1 (Qiagen). Le mélange réactionnel était réparti

dans une plaque et 2,5 µL d’extrait d’ADN étaient ajoutés.

- Le mélange réactionnel de la PCR pour l’amplification du gène R72H était fait à partir de

35,75 µL de nuclease free water (Qiagen), 5 µL de tampon 5X (Qiagen), 1 µL de dNTP à

100mM (Eurobio), 3 µL de MgCl2 à 25 mM (Qiagen), 1 µL d’amorces du gène cible

(Tableau 311) et 0,25 µL de Hot Start Taq DNA Polymerase à 5 U.µL-1 (Qiagen). Le

mélange réactionnel était réparti dans une plaque et 2 µL de contrôle interne

d’amplification et 1 µL d’extrait d’ADN étaient ajoutés. L’amplification du gène R72H,

spécifique de l’espèce V. parahaemolyticus, a été effectuée pour valider l’étape

d’extraction d’ADN (Lee et al. 1995).

Les conditions de PCR utilisées sont décrites dans le tableau 32.

Tableau 31: Amorces pour la détection des intégrons de type 1, 2 et 3 et l’intégrase des ICE SXT/R391 et la confirmation de l’espèce V. parahaemolyticus.

Gènes cibles

Amorces Taille attendu de l’amplicon (pb)

Références

IntI1 Int1F6 : (5’-GCATCCTCGGTTTTCTGG-3’) 457 (Shibata et al. 2003)

Int1R6 : (5’-GGTGTGGCGGGCTTCGTG-3’)

IntI2 Int2F (5’-GTAGCAAACGAGTGACGAAATG-3’) 798 (Dillon et al. 2005)

Int2R (5’- CACGGATATGCGACAAAAAGGT-3’)

IntI3 Int3F (5’-GCCTCCGGCAGCGACTTTCAG-3’) 979


186

Int3R (5’- ACGGATCTGCCAAACCTGACT-3’)

ICE SXT SXT-F (5’-GCTGGATAGGTTAAGGGCGG-3’) 592 (Ceccarelli et al. 2006) SXT-B (5’- CTCTATGGGCACTGTCCACATTG-3’)

R72H VP32(5’-CGAATCCTTGAACATACGCAGC-3’) 387 320 si délétion

(Lee et al. 1995)

VP33(5’-TGCGAATTCGATAGGGTGTTAACC-3’)

Tableau 32: Conditions de PCR pour la détection des intégrons de type 1, 2 et 3 et de l’intégrase SXT.

Gènes Conditions de PCR

IntI1 94°C-5 min, 35 x (94°C-1 min, 55°C-1 min, 72°C-1 min 30s), 72°C-10 min

IntI2 et IntI 3

95°C-15 min, 35 x (94°C-1 min, 59°C-1 min, 72°C-1 min), 72°C-10 min

SXT 94°C-5 min, 35 x (94°C-30 s, 60°C-1 min, 72°C-2 min), 72°C-10 min

R72H 95°C-15 min, 35 x (94°C-1 min, 60°C-1 min, 72°C-1 min), 72°C-5 min

Quinze µL de l’amplicon était mélangé à du tampon de charge (Eurobio) puis déposé dans un

gel d’agarose (Eurobio) à 0,8% (m/v) préparé avec du tampon Tris-Borate-EDTA 10X (Eurobio)

préalablement dilué au 1/10 auquel était ajouté du bromure d’éthidium à 1% (v/m) (BET, Eurobio).

La migration s’effectuait à 125 V pendant 90 min puis le gel était visualisé sous UV avec l’appareil

Quantum (Neuilly-sur-Seine, France).

La souche E. coli DH5α/pTRC99A :intI1/intI2/intI3 ampR (E. coli pTRC), qui a été utilisée comme

témoin positif pour les intégrases intI1, intI2 et intI3, a été fournie par M. Olivier Barraud (Université

de Limoges, France). Une souche E. coli contenant l’ICE SXT a été utilisée comme témoin positif pour

l’intégrase des ICE SXT/R391 et a été fournie par M. Didier Mazel (Institut Pasteur, Paris). Enfin les

souches V. parahaemolyticus CIP 70.63 et CNRVC 089+ ont été utilisées comme témoin pour la PCR

R72H.


187

II.3. Résultats

II.3.A. Origine des souches

Entre 2012 et 2016, 384 souches de V. parahaemolyticus ont été obtenues à partir de

différents produits de la pêche et de l’aquaculture. La majorité ont été isolées dans des crevettes

(n=304) et des gambas (n=28) et pour 49 souches la matrice d’origine n’était pas renseignée (Figure

26).

Figure 26: Matrices d'origine des souches des souches de V. parahaemolyticus.

De plus, l’origine géographique des matrices alimentaires des souches n’était pas toujours

documentée. Toutefois, pour 44 % des souches, cette information avait été enregistrée et elles

provenaient d’Amérique (n=72), d’Asie (n=70) et d’Afrique (n=32) et plus spécifiquement de

l’Équateur (n=54) et du Vietnam (n=45) (Figure 27).

79%

7%

2%1% 11%

crevette

gambas

poisson

autre (calamar, homard,huître, friture, langouste)

inconnue


188

Figure 27: Origines géographiques des matrices dans lesquelles les souches de V. parahaemolyticus ont été isolées.

II.3.B. Définition des seuils épidémiologiques expérimentaux (COWT)

La distribution des diamètres d’inhibition a été faite pour tous les antibiotiques sauf la

colistine (annexe IX). Sur les 15 antibiotiques testés, 14 seuils épidémiologiques expérimentaux ont

pu être établis (Tableau 33).

12%

4% 1%

1%

5%

2%1%

14%

3%1%1%

55%

Vietnam

Inde

Indonésie

autre Asie (Thaïlande, Malaisie)

Madagascar

Nigeria

autre Afrique (Afrique du Sud,Sénégal)Equateur

Honduras

Nicaragua

autre Amérique (Panama,Argentine, Pérou, États-unis)inconnue


189

Tableau 33: Définition des COwt de V. parahaemolyticus et des populations non-sauvages (n = 384). ND non déterminé.

Classes d’antibiotiques Antibiotiques COWT

(mm)

Nombre de souches non-

sauvages

β-lactamines

Ampicilline ND ND Témocilline 24 3

Amoxicilline/clavulanate 18 1 Céfalotine 15 9 Cefoxitine 15 1

Cefotaxime 26 1 Ceftazidime 23 1

Quinolones Acide nalidixique 23 3

Ciprofloxacine 20 1

Aminosides Streptomycine 9 6 Gentamicine 14 0

Macrolides Azithromycine 18 3

Phénicolés Chloramphénicol 26 8

Tétracyclines Tétracycline 22 49

Inhibiteur de la synthèse des folates

cotrimoxazole 19 13

Plusieurs cas de figure ont été observés :

- La distribution des diamètres pour l’ampicilline ne suivait pas une loi normale, et un seuil

épidémiologique expérimental n’a pas pu être défini (Figure 28 a),

- Pour les autres antibiotiques, la distribution des diamètres suivait une loi normale et des

seuils épidémiologiques ont pu être établis (annexe IX),

- Pour la gentamicine, toute la population avait un phénotype sauvage (Figure 28 b),

- Pour les autres antibiotiques analysés, une partie de la population de V. parahaemolyticus

présentait un phénotype non-sauvage plus ou moins proche du COWT défini (Figure 28 c et 28 d

annexe IX).


190

Figure 28: Distribution des diamètres d'inhibition de V. parahaemolyticus par antibiotiques a) ampicilline ; b) gentamicine ; c) tétracycline ; d) chloramphénicol. Les histogrammes représentent la population sauvage et les histogrammes représentent la population non-sauvage. Le trait rouge représente le COwt.

Tous antibiotiques confondus, la population non-sauvage de V. parahaemolyticus

représentait 16 % des souches. Les antibiotiques, pour lesquels le plus de souches avec un phénotype

non-sauvage ont été observées, étaient la tétracycline (13 %), le cotrimoxazole (3 %), la céfalotine (3

%) et le chloramphénicol (2 %). Parmi ces souches, 43 avaient une résistance acquise à un

antibiotique donc 34 à la tétracycline. De plus, 17 isolats avaient cumulé plusieurs résistances

(Tableau 34) :

- 6 souches avaient un phénotype non-sauvage pour deux antibiotiques appartenant à deux

classes différentes,

0

20

40

60

80

100

120

6 8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


0

20

40

60

80

100

120

6 8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

No

mb

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e s

ou

che

s


0

20

40

60

80

100

120

6 8

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34

36

38

40

No

mb

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e s

ou

che

s


0

20

40

60

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100

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6 8

10

12

14

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20

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24

26

28

30

32

34

36

38

40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


b)

d) c)

a)


191

- 4 souches avaient un phénotype non-sauvage pour 3 antibiotiques (= multi-résistantes): les

antibiotiques appartenaient à 3 classes différentes pour 3 souches et les antibiotiques appartenaient

à deux classes différentes pour une souche,

- 6 souches avaient un phénotype non-sauvage pour 4 antibiotiques (= multi-résistantes)

appartenant à 4 classes différentes,

-1 souche avait un phénotype non-sauvage pour 9 antibiotiques (= multi-résistantes)

appartenant à 5 classes différentes.

Tableau 34: Phénotypes non-sauvages des souches de V. parahaemolyticus (n = 60).

Nombre de classes d’antibiotiques avec un phénotype non-

sauvage

Antibiotiques avec un phénotype non-sauvage Nombre de

souches

1

Tétracycline 34

Céfalotine 4

Témocilline 3

Cotrimoxazole 2

2

Tétracycline-cotrimoxazole 5

Tétracycline-acide nalidixique 1

Tétracycline-acide nalidixique-ciprofloxacine 1

3

Tétracycline-céfalotine-chloramphénicol 1

Tétracycline-azithromycine-céfalotine 1

Céfalotine-azithromycine-chloramphénicol 1

4

Tétracycline-cotrimoxazole-streptomycine-chloramphénicol 4

Tétracycline-cotrimoxazole-streptomycine-acide nalidixique 1

Tétracycline-chloramphénicol-azithromycine-céfalotine 1

5 Tétracycline-cotrimoxazole-streptomycine-chlorampénicol-amoxicilline/clavulanate-céfalotine-céfoxitine-ceftazidime-

cefotaxime 1

Onze des 18 souches qui ont cumulées des résistances avaient un phénotype non-sauvage

pour la tétracycline et le cotrimoxazole. Six de ces 11 souches cumulaient des phénotypes non-

sauvages pour la tétracycline, le cotrimoxazole et la streptomycine. Parmi ces souches, 5 souches

avaient un phénotype non-sauvage supplémentaire pour le chloramphénicol. Enfin, la souche multi-

résistante, 16-B3PA-006, présentait un phénotype non-sauvage pour la tétracycline, le


192

cotrimoxazole, la streptomycine, le chloramphénicol et toutes les β-lactamines testées sauf la

témocilline (Figure 29).

Concernant l’origine des souches avec une population non-sauvage, tous antibiotiques

confondus, 88% ont été isolées de crevettes, 1,5 % de rouget, 1,5 % de fritures et pour 8 % la matrice

alimentaire n’était pas renseignée. Les produits, dans lesquels les souches résistantes de V.

parahaemolyticus ont été isolées, provenaient principalement d’Equateur (16 %), du Vietnam (13 %),

d’Inde (5 %), du Nicaragua (3 %), d’Indonésie (1,5 %) et de Madagascar (1,5 %). Pour les souches

multi-résistantes, à au moins 3 classes d’antibiotiques, elles ont été isolées de crevettes (70 %) et de

rouget (10 %). La matrice alimentaire n’était pas connue pour 20 % des isolats. Les origines

géographiques des matrices n’étaient pas connues pour 60 % des souches et 30 % et 10 % des

matrices étaient originaires du Vietnam et d’Indonésie respectivement. Une souche était multi-

résistante à 9 antibiotiques et elle a été isolée de crevettes provenant du Vietnam.

Les COWT calculés et les seuils cliniques présents dans le référentiel CLSI ont pu être

comparés pour 8 antibiotiques (Tableau 35). Il n’y avait pas de seuils cliniques pour Vibrio spp. pour

GEN

CIP

AMC FOX

TEM

AMP

SXT STR

AZM NAL CST

CTX

CAZ

CHL

TET

CEF

AMC FOX

TEM

AMP

SXT STR

AZM NAL CST

CTX

CAZ

CHL

TET

CEF

GEN

CIP

Figure 29: Antibiogramme de la souche de V. parahaemolyticus 15-B3PA-0752 présentant un phénotype sauvage à gauche et de la souche 16-B3PA-006 à droite présentant un phénotype non-sauvage pour 9 molécules testées (en rouge). Ampicilline (AMP), amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF), céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine (GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL), ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST).


193

la témocilline, la céfalotine, l’acide nalidixique, la streptomycine, l’azithromycine et le

chloramphénicol.

Tableau 35: Comparaison des COWT et seuils cliniques du CLSI pour V. parahaemolyticus (CLSI 2015). ND : COWT non déterminé, S : sensible, I : intermédiaire, R : résistant. Les cases bleues représentent l’absence de seuil.

Classes d’antibiotiques

Antibiotiques COWT

(mm)

Seuils cliniques du CLSI (mm)

S≥ I R≤

β-lactamines

Ampicilline ND 17 14-16 13 Témocilline 24

Amoxicilline/clavulanate 18 18 14-17 13 Céfalotine 15 Cefoxitine 15 18 14-17 14

Cefotaxime 26 26 23-25 22 Ceftazidime 23 22 18-21 17

Quinolones Acide nalidixique 23

Ciprofloxacine 20 21 16-20 15

Aminosides Streptomycine 9 Gentamicine 14 15 13-14 12

Macrolides Azithromycine 18

Phénicolés Chloramphénicol 26

Tétracyclines Tétracycline 22 15 12-15 11

Inhibiteur de la synthèse des folates

cotrimoxazole 19 16 11-16 10

Nous n’avons pas pu déterminer de COWT pour l’ampicilline alors que des seuils cliniques

existent. Nous avons remarqué que pour 5 antibiotiques (amoxicilline/clavulanate, cefotaxime,

ceftazidime, ciprofloxacine et gentamicine), les COWT étaient identiques ou à un 1 mm d’écart avec

les seuils cliniques sensibles/ intermédiaires. Le même nombre de souches ont été décrites comme

non sauvage et résistante/intermédiaire pur ces antibiotiques. Le COWT et le seuil

intermédiaire/résistant de la cefoxitine était différent de 1 mm, et le même nombre de souche était

non sauvage et résistantes cliniquement. Pour la tétracycline et le cotrimoxazole, le COWT était plus

élevé que les seuils sensibles intermédiaires de 7 et 3 mm respectivement, donc plus de souches ont

été classées comme non sauvage (49 et 13 souches respectivement) que comme

intermédiaire/résistantes (44 et 12 souches respectivement).


194

Les COWT calculés pour le genre Vibrio dans le chapitre 2 et ceux calculés pour la collection de

V. parahaemolyticus étaient le plus souvent cohérents (Tableau 36).

Tableau 36: Comparaison des COWT pour Vibrio spp. et pour V. parahaemolyticus. ND : COWT non déterminé, SP : présence sous-population dans la distribution, EC : écart-type non validé. Les cases vertes montrent les antibiotiques pour lesquels les COWT de Vibrio spp. et V. parahaemolyticus étaient identiques ou avaient une différence inférieure à l’incertitude de mesure (±2 mm). Les cases roses représentent les antibiotiques pour lesquels les COWT de Vibrio spp. et V. parahaemolyticus avaient une différence supérieure à l’incertitude de mesure (±2 mm).

Antibiotiques

COwt (mm)

V. parahaemolyticus Vibrio spp.

Ampicilline ND ND Témocilline 24 17

Amoxicilline/ acide clavulanique 18 SP Céfalotine 15 SP Céfoxitine 15 12

Cefotaxime 26 26 Ceftazidime 23 22

Acide nalidixique 23 EC Ciprofloxacine 20 EC Streptomycine 9 6 Gentamicine 14 12

Azithromycine 18 EC Chloramphénicol 26 24

Tétracycline 22 23 cotrimoxazole 19 19

Les COWT définis pour la céfotaxime et le cotrimoxazole étaient identiques pour Vibrio spp. et

V. parahaemolyticus. Les COWT définis pour la ceftazidime, la gentamicine, le chloramphénicol et la

tétracycline étaient différents pour Vibrio spp. et V. parahaemolyticus. Ces différences étaient

inférieures ou égales à l’incertitude de mesure de la méthode (±2 mm). Pour les autres antibiotiques

les COwt étaient plus bas pour Vibrio spp que pour V. parahaemolyticus de 3 à 7 mm.

II.3.C. Recherche d’intégrons

La présence d’intégrons de classe 1,2 et 3 et l’ICE SXT/R391 a été recherchée pour les 60

souches de V. parahaemolyticus qui avait au moins une résistance. Toutes les souches testées étaient

négatives pour les intégrons de classe 2 et 3 et seule la souche 16-B3PA006 était positive pour

l’intégron de classe 1 (Figure 30). De plus, 3 souches étaient positives pour la présence de l’intégrase


195

de SXT, 2 souches présentaient le phénotype de résistance souvent associé à cet ICE : streptomycine,

cotrimoxazole et chloramphénicol. L’autre souche positive n’avait pas de phénotype de résistance

pour le chloramphénicol. Les trois autres souches montrant un phénotype non-sauvage à la

streptomycine, au cotrimoxazole et au chloramphénicol étaient négatives pour l’ICE SXT.

Figure 30: Exemple de PCR de détection de l'intégrase intI1. La souche E. coli pTRC99A était le témoin positif de la réaction. Les souches E. coli SXT, V. parahaemolyticus CIP 70.63 et CNRVC 089 étaient les témoins négatifs. Les puits avec le mélange réactionnel étaient des témoins de contamination de la PCR. MP : marqueur de poids moléculaire en paire de base.

II.4. Discussion

Des COWT ont pu être calculés pour 14 des 15 antibiotiques testés avec la méthode

d’antibiogramme de diffusion en milieu gélosé. Des populations bactériennes non-sauvages ont pu,

in vitro, être discriminées des populations sauvages. En effet, la grande majorité des souches de V.

parahaemolyticus était de phénotype sauvage cependant des résistances acquises aux β-lactamines,

quinolones, aminosides, macrolides, tétracyclines, phénicolés et inhibiteurs de la synthèse des

folates ont été détectées. Des souches de V. parahaemolyticus résistantes à ces familles

d’antibiotiques ont été décrites mais à des fréquences variables, 0 à 12 % des souches de V.


196

parahaemolyticus pour le chloramphénicol (Baker-Austin et al. 2008, Zavala-Norzagaray et al. 2015),

0 à 17 % pour les tétracyclines (Jiang et al. 2014, Tan et al. 2017), 0 à 3 % des souches pour les

quinolones (Baker-Austin et al. 2008, Jiang et al. 2014, Lopatek et al. 2018), 0,3% à 15 % pour les

inhibiteurs de la synthèse des folates (Baker-Austin et al. 2008, Zavala-Norzagaray et al. 2015) et 3 à

46 % pour les aminosides (Baker-Austin et al. 2008, Tan et al. 2017, Lopatek et al. 2018). Par contre,

la résistance aux macrolides de Vibrio spp. est rarement testée et les référentiels ne donnent pas de

seuils. Comme il n’existe pas de seuils épidémiologiques, les seuils cliniques définis pour V.

parahaemolyticus par le CLSI sont utilisés dans de nombreux travaux pour interpréter les résultats

des antibiogrammes (Ronholm et al. , Baker-Austin et al. 2008, Jiang et al. 2014, Zavala-Norzagaray et

al. 2015, Tan et al. 2017, Lopatek et al. 2018 , Zhao et al. 2018). Pour autant, certains seuils cliniques,

comme pour la streptomycine, ont été définis pour les Enterobacteriaceae et ont été repris pour

Vibrio spp. (CLSI 2015). Pour les Enterobacteriaceae, le seuil clinique de la streptomycine entre

sensible et intermédiaire est à 15 mm et celui entre intermédiaire/résistant est à 11 mm. Dans nos

travaux, d’un point de vue épidémiologique, la distribution des diamètres d’inhibition du panel de

souches V. parahaemolyticus a permis de conclure que nous avions une population sauvage. Mais

lorsque nous comparons nos résultats aux seuils cliniques, une partie de la population sauvage de

V. parahaemolyticus était classée comme intermédiaire et l’autre partie comme résistante. Cela peut

entraîner une surestimation du nombre de souches résistantes de V. parahaemolyticus à la

streptomycine. Par exemple, dans les travaux Tan et al. (2017), 53 % de souches V. parahaemolyticus

isolées de maquereaux en Malaisie ont été classées cliniquement résistantes à la streptomycine. Des

précautions sont donc nécessaires pour interpréter des résultats d’antibiogrammes de couples

antibiotiques/ bactéries dont les seuils n’existent pas dans les référentiels ou lorsqu’ils sont extrapolé

d’un autre ordre/ genre bactérien. Une étude de la distribution des diamètres/ CMI serait plus

judicieuse que d’utiliser des seuils définis pour un autre couple antibiotique/bactérie.


197

En ce qui concerne la famille des β-lactamines, en utilisant les seuils cliniques, des études ont

montré un fort taux de résistance à différentes molécules de la famille des pénicillines comme

l’ampicilline ou la pénicilline G de 75 % à 100 % des souches de V. parahaemolyticus testés (Ronholm

et al. , Baker-Austin et al. 2008, Jiang et al. 2014, Zavala-Norzagaray et al. 2015, Tan et al. 2017,

Lopatek et al. 2018, Zhao et al. 2018). Dans nos travaux, la distribution des populations bactériennes

de V. parahaemolyticus pour l’ampicilline ne suivait pas une loi normale donc nous n’avons pas pu

calculer de COWT et il n’existe pas d’ECOFF. Pourtant des génomes séquencés de souches du genre

Vibrio ont montré la présence de β-lactamases chromosomiques de type carbénicillinase (Fosse 2012,

Chiou et al. 2015). Il semblerait que V. parahaemolyticus soit naturellement résistant aux pénicillines

et que les pénicillines ne sont pas pertinentes à tester dans les antibiogrammes pour cette espèce

bactérienne.

En outre, la témocilline, classée parmi les carboxypénicillines, n’a pas permis d’établir de

valeurs de COWT cohérentes entre les résultats que nous avons obtenus sur le genre Vibrio et ceux

obtenus sur l’espèce V. parahaemolyticus. La variabilité des séquences de la β-lactamase

chromosomique des Vibrio spp., souvent qualifiées aussi de carbenicillinases, est probablement à

l’origine de la variation des valeurs des COWT de la témocilline entre les différentes espèces de Vibrio.

De même, la variation de la valeur des COWT observée de la cefoxitine (C2G) entre Vibrio spp. et V.

parahaemolyticus peut être causé par des spectres d’activité différents des différentes

carbénicillinases chromosomiques. Cependant, des études plus approfondies sur le spectre d’action

de cette enzyme, le gène blaCARB-17 et son environnement génétique, pourraient permettre de mieux

comprendre le phénotype naturel de résistance de V. parahaemolyticus aux β-lactamines. En effet,

nous avons décrit 12 souches avec des résistances acquises à la céfalotine ou à la témocilline et des

mutations ou une surproduction de cette enzyme pourrait être une explication de ces phénotypes.

De plus, dix souches étaient multi-résistantes car elles avaient acquis des résistances pour au

moins 3 classes d’antibiotiques (Magiorakos et al. 2012). La souche avec le plus de résistances (9),


198

16-B3PA-006, était la seule souche à avoir un phénotype non-sauvage pour toutes les β-lactamines

testées, sauf la témocilline. Cette souche a été étudiée plus en détail dans la seconde partie de ce

chapitre. La description de souche de V. parahaemolyticus avec un phénotype multi-résistant a été

décrite mais leur nombre est probablement surestimé (Baker-Austin et al. 2008, Jiang et al. 2014, Tan

et al. 2017, Lopatek et al. 2018). En effet, dans ces travaux, les souches multi-résistantes de V.

parahaemolyticus étaient résistantes aux pénicillines (probablement une résistance naturelle) et à la

streptomycine (seuils cliniques des Enterobacteriaceae qui ne sont pas adaptés). Cependant, des

souches multi-résistantes ont été décrites, comme une souche portant sur un plasmide conjugatif les

gènes de résistance aux β-lactamines (blaPER-1), aux quinolones (qnrVC6), aux aminosides (aacA3,

aadA1), aux phénicolés (catB2), et aux inhibiteurs de la synthèse des folates (dfrA1) (Liu et al. 2013)

et une autre souche portant, sur un plasmide conjugatif, les gènes de résistance aux β-lactamines

(blaVEB-2, blaOXA-10), aux aminosides (aadB, aadA1, strA et strB), aux phénicolés (cmlA, floR), aux

tétracyclines (tetA, tetR ) et aux inhibiteurs de la synthèse des folates (sul1) (Li et al. 2016). De ce fait,

nous avons voulu voir quels mécanismes d’acquisition de résistance étaient associés avec les

souches-multi-résistantes que nous avions observées. Une seule souche ayant acquis des résistances

portait un intégron de classe 1. La faible prévalence d’intégrons de classe 1 et l’absence d’intégron de

classe 2 et 3 dans les génomes de V. parahaemolyticus a également été constatée dans d’autres

études (Taviani et al. 2008, Ottaviani et al. 2013). De plus, lorsque des intégrons de classe 1 ont été

identifiés, ils étaient vides ou n’étaient pas sur des éléments génétiques transférables (Ceccarelli et

al. 2006, Jiang et al. 2014).

En outre, pour les souches multi-résistantes, les phénotypes de résistance concernaient les

tétracyclines, les aminosides, les phénicolés et les inhibiteurs de la synthèse des folates. Ce motif de

résistance est typique des ICE SXT/R391 décrits dans le genre Vibrio et, lors de sa description, cet

élément génétique mobile pouvait porter les gènes de résistance tet(A), strA, strB, floR, sul2, dfrA1 et

dfrA18 (Iwanaga et al. 2004, Ceccarelli et al. 2006). Cependant, ces ICEs sont peu décrits pour V.

parahaemolyticus et peu de nos souches ayant acquis des résistances ou ayant le phénotype des ICEs


199

SXT/R391 étaient positives pour leurs intégrases (Ceccarelli et al. 2006, Taviani et al. 2008, Jiang et al.

2014). Récemment, une comparaison de la structure génétique des ICEs SXT/R391 a montré une

variabilité du gène de l’intégrase, qui est utilisé comme leur marqueur épidémiologique. Cela

pourrait entrainer une sous-estimation de la prévalence des ICEs SXT/R391 dans les génomes

bactériens, notamment pour les souches avec le phénotype de résistance classique de ces éléments

génétique. Les auteurs recommandent l’utilisation d’un autre marqueur plus conservé comme setCD

(Bioteau et al. 2018).

En outre, dans cette étude, une majorité des souches a été isolée de crevettes issues de

l’aquaculture. Les classes d’antibiotiques pour lesquels des résistances ont été détectées étaient

celles dont un usage en aquaculture a été déclaré à l’OIE : phénicolés, tétracyclines, macrolides,

quinolones et inhibiteurs de la synthèse des folates (OIE 2017b). Les phénicolés et les tétracyclines

sont les antibiotiques les plus utilisés en aquaculture, 65,9 % et 23,6 % des usages respectivement.

Ces valeurs sont à prendre avec précaution car les données d’usages d’antibiotiques dans

l’aquaculture ne sont pas systématiquement reportées à l’OIE. De plus, la plupart des souches ayant

acquis des résistances sont originaires de pays faisant partie de l’association des nations d’Asie du

sud-est (ASEAN), où un document préconise l’utilisation d’antibiotiques de ces classes sauf les

phénicolés en aquaculture (ASEAN 2013). L’usage de ces antibiotiques entraîne un risque de

sélection des résistances dans des bactéries naturellement présentes dans l’eau, les sédiments et sur

les animaux. Ces résistances peuvent être naturellement présentes dans le milieu aquatique ou être

issues d’un apport exogène aux bassins d’aquaculture ; via des bactéries résistantes provenant du

milieu aquatique ou du milieu terrestre par ruissèlement. Les résistances observées pourraient être

liées à la pression de sélection causée par l’utilisation de ces familles d’antibiotiques.


200

De plus, V. parahaemolyticus est un des agents étiologique de la diarrhée du voyageur. Pour

traiter ces infections les fluoroquinolones ou l’azithromycine sont prescrits en première intention

(Diemert 2006a, CDC 2017a). Dans nos travaux, la prévalence des souches de V. parahaemolyticus

ayant acquis des résistances à ces antibiotiques était faible, le constat était le même dans d’autres

travaux scientifiques (Baker-Austin et al. 2008, Jiang et al. 2014, Lopatek et al. 2018). Une utilisation

importante de ces molécules, tant en médecine humaine que vétérinaire pourrait entrainer

l’apparition et la dissémination de résistance à ces antibiotiques.


201

III. Caractérisation des résistances de la souche V. parahaemolyticus

16-B3PA-006

III.1. Contexte

La souche 16-B3PA-006 avait un phénotype non-sauvage pour 5 classes d’antibiotiques

testées : la tétracycline, la streptomycine, le chloramphénicol, le cotrimoxazole et l’ensemble des β-

lactamines testées sauf la témocilline. Le phénotype de résistance aux β-lactamines suggère la

présence d’une céphalosporinase ou de l’action combinée de plusieurs enzymes comme d’une

céphalosporinase et d’une BLSE. Nous avons d’abord caractérisé plus précisément le mécanisme de

résistance aux β-lactamines en testant sa sensibilité à d’autres β-lactamines et en effectuant un test

enzymatique. Un criblage génétique par puce à ADN a également été réalisé pour identifier la classe

de la β-lactamase présente dans la souche. Enfin, nous avons séquencé le génome total pour

identifier les gènes de résistance portés par la souche et les structures génétiques portant ces gènes

de résistance. En parallèle de ces travaux, nous avons regardé la capacité de dissémination des

résistances en effectuant une conjugaison bactérienne.


202

III.2. Matériel et méthodes

III.2.A. Caractérisation du mécanisme de résistance aux β-lactamines

III.2.A.a. Activité vis-à-vis des β-lactamines

III.2.A.a.i Sensibilité aux β-lactamines

Un antibiogramme par diffusion en milieu gélosé a été réalisé comme décrit dans le chapitre

II.2.B. . Des disques de céfépime (30 µg) (céphalosporine de 4ème génération) et d’imipénème (10 µg)

(carbapénème) (Biorad) ont été utilisés. Les diamètres d’inhibition ont été interprétés selon la table

20 du M45 du CLSI (CLSI 2015).

III.2.A.a.ii Carbapenemase Inactivation Method

Cette méthode a été appliquée selon le protocole décrit par van der Zwaluw (van der Zwaluw

et al. 2015). La souche de V. parahaemolyticus a été resuspendue dans 400 µL d’eau physiologique.

Un disque d’antibiotique contenant 10 µg de méropénème (Biorad) a été plongé dans la suspension

et celle-ci a été incubée pendant au moins 2h à 35°C. Après cette incubation, le disque a été déposé

sur une gélose Mueller-Hinton (Biorad) préalablement ensemencée avec une suspension à 0,5

McFarland d’une souche E. coli ATCC 25922 sensible aux carbapénèmes, puis incubée une nuit à

35°C. Si la souche testée produit une carbapénèmase, le méropénème contenu dans le disque est

hydrolysé pendant la première incubation. Il ne reste plus d’antibiotique pour inhiber la culture de la

souche E. coli sensible pendant la deuxième incubation. La souche sensible E. coli peut alors croître

au contact du disque : le test est positif. Dans le cas contraire, le méropénème n’a pas été inactivé

pendant la première incubation et une zone d’inhibition de croissance sera visible sur la culture E.

coli sensible : le test est négatif. La souche V. parahaemolyticus 15-B3PA-775 a été utilisée comme

témoin négatif.


203

III.2.A.b. Criblage d’enzyme par puce à ADN

Deux puces à ADN, check-MDR CT 101 et check MDR CT 103XL (Check-Point, Wageningen,

Pays-Bas), ont été utilisées selon les recommandations du fabricant.

III.2.B. Séquençage et analyse du génome total

III.2.B.a. Séquençage

Le séquençage du génome total a été effectué par la plateforme iGenSeq (Institut de la

Moëlle et du Cerveau, Hôpital Pitié Salpêtrière, Paris, France) sur un appareil NextSeq (Illumina, San

Diego, CA, USA).

III.2.B.b. Assemblage

Les reads bruts ont été triés avec une taille minimum de 35 pb et un score de qualité de 0,03.

L’assemblage a été effectué par le logiciel CLC Genomics Workbench 7.5.1. Nous avons d’abord

alignée l’ensemble des reads contre les deux chromosomes du génome de référence de V.

parahaemolyticus RIMD 2210633. Les reads appariés restants ont été considérés comme faisant

partie du matériel génétique acquis et ont été assemblés de novo.

III.2.B.c. Analyse du génome total

Les gènes de résistance aux antibiotiques, la présence de plasmides et la séquence type (ST)

de la souche 16-B3PA-006 contigs obtenus ont été identifiés grâce aux outils de la plateforme du CGE

(The Center for Genomic Epidemiology server, https://cge.cbs.dtu.dk/services/). La séquence

assemblée de la souche 16-B3PA-006 a été déposée dans Resfinder (Zankari et al. 2012),

PlasmidFinder (Carattoli et al. 2014) et MLST (Larsen et al. 2012).

III.2.C. Conjugaison bactérienne

La souche V. parahaemolyticus 16-B3PA-006 a été utilisée comme donneuse et la souche E.

coli UB5201, résistante à l’acide nalidixique, a été utilisée comme la souche réceptrice. Une souche E.

coli porteuse de l’ICE SXT et résistante au chloramphénicol, la tétracycline, au cotrimoxazole et la

https://cge.cbs.dtu.dk/services/


204

streptomycine et la souche V.parahaemolyticus 15-B3PA-0752 ont été utilisée comme témoin

d’efficacité de la fabrication des milieux gélosés de sélection des transconjuguants.

À partir des cryotubes, les suspensions bactériennes ont été diluées au 1/10 dans 2 ml

d’EPSA et incubée pendant la nuit à 37 °C. La culture de nuit a été diluée au 1/100 dans de l’EPSA. Le

volume final pour les cellules donneuses était de 2 mL et pour la souche réceptrice il était de 10 mL.

Elles ont été incubées à 37 °C pendant 3 h. Puis, 200 µL de la suspension de la souche réceptrice ont

été mélangés avec 200 µL de la suspension de la souche donneuse dans un tube Eppendorf stérilisé.

En parallèle, des filtres en esters de celluloses (Millipore, Darmstadt, Allemagne) de 25 mm de

diamètre et avec une maille de 0,45 µm ont été déposés sur une gélose GNS. Chaque suspension

bactérienne a été déposée sur un filtre et incubée pendant 4 h à 37 °C. Le filtre a été récupéré et

placé dans un tube falcon de 15 mL contenant 5 mL d’EPSA. Les tubes ont été agités pendant 30 s,

puis les suspensions ont été diluées 4 fois de suite au 1/10. Cent microlitres de la solution mère et de

la dilution 1/100 ont été étalés avec l’ensemenceur automatique easyspiral® (Interscience, Saint

Nom, France) sur GNS avec de l’acide nalidixique (Sigma-Aldrich, Lyon, France) et un des

antibiotiques (Sigma-Aldrich) testés (Tableau 37). Cent microlitres des dilutions 1/100 et 1/10 000

ont été étalés avec l’ensemenceur spiral sur une gélose GNS contenant un des antibiotiques testés et

sur une GNS contenant de l’acide nalidixique et l’antibiotique testé. Les géloses ont été incubées à

37°C pendant 24h.

Tableau 37: Concentrations d'antibiotiques utilisées pour la conjugaison bactérienne.

Antibiotiques Concentrations (µg.mL-1)

Acide nalidixique 30

Méropénème 2

Triméthoprime 15

Streptomycine 30

Chloramphénicol 15

Tétracycline 8

Les colonies ont été dénombrées avec un compteur de colonies Scan 500 (Interscience). La

fréquence de conjugaison a été calculée avec la formule suivante :


205

𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑐𝑜𝑛𝑔𝑢𝑎𝑛𝑡

𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒𝑑𝑜𝑛𝑛𝑒𝑢𝑠𝑒 𝑒𝑡 𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑐𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑛𝑡𝑒 − 𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑐𝑜𝑛𝑔𝑢𝑎𝑛𝑡

Les colonies dénombrées sur la gélose contenant l’antibiotique testé correspondaient au

nombre de souches donneuses et transconjugantes. Les colonies dénombrées sur la gélose

contenant l’acide nalidixique et l’autre antibiotique correspondaient au nombre de transconjugants.

Trois colonies ont été prélevées des géloses contenant l’acide nalidixique et l’antibiotique

testé et dilués chacune dans une goutte d’eau. Chaque suspension a été étalée sur gélose Mueller-

Hinton avec un écouvillon stérile et les antibiotiques utilisés dans le chapitre II.2.B. ont été déposés.

La boite a été incubée à 35 °C pendant 16-18 h. Pour chaque profil de résistance différent, un

antibiogramme a été réalisé d’après le protocole du chapitre II.2.B. et chaque souche a été

conservée à-80°C dans du BCC avec 20 % de glycérol.

III.3. Résultats

III.3.A. Caractérisation du mécanisme de résistance aux β-lactamines

Le diamètre d’inhibition pour l’imipénème était de 24 mm, et celui pour le céfépime était de

14 mm ; la souche 16-B3PA006 était donc catégorisée sensible à l’imipenème et résistante au

céfépime. Cependant, seul un gène de la famille des carbapénèmases blaNDM a été détecté par les

deux puces à ADN et le CIM test a confirmé la production d’une carbapénèmase par cette souche

(Figure 31).

Figure 31: Résultats du CIM test.


206

III.3.B. Séquençage du génome total et analyse bio-informatique

Un total de 190 contigs, dont la taille variait entre 990 pb et 238 282 pb ont été obtenus.

Soixante n’avaient pas d’homologie avec le génome de référence et faisaient partis du matériel

génétique acquis. Par typage MLST, la souche 16-B3PA-006 était classée ST864. L’intégrase intI1 était

sur le contig 12. De plus, nous avons identifié grâce à Resfinder, 9 gènes de résistance : blaNDM-1, strA,

strB, aadA2, sul1, sul2 et dfrA16 avec 100% d’identité et tet(A) et florR avec, respectivement, 98,19 %

et 99,83 % d’identité. Le gène strB était sur le contig 29, les gènes strA et sul2 ont été assemblés sur

le contig 53 et étaient contigus, de même pour les gènes aadA2 et dfrA16 qui étaient localisés sur le

contig 12 juste en aval du gène de l’intégrase de l’intégron de classe 1. Les gènes blaNDM-1 et sul1

étaient sur le contig 11 mais à une distance de 14 kb. Enfin les gènes floR et tet(A) étaient assemblés

sur le contig 20 et leurs séquences se chevauchaient. Une analyse par Blastn de ces contigs a permis

d’identifier une partie du transposon Tn125 : ΔISAba125, blaNDM-1, ble, trpF, tat, dct, groS, groL et

IS91 sur le contig 11. Aucune autre structure génétique n’a été identifiée sur les autres contig portant

des gènes de résistance aux antibiotiques identifiés. Cependant, Plasmidfinder a identifié un

plasmide IncA/C2 sur le contig 2 mais aucun gène de résistance n’était présent sur ce contig.

III.3.C. Conjugaison bactérienne

Les sélectivités des géloses supplémentées en méropénème, streptomycine, triméthoprime

et les géloses supplémentées avec ces antibiotiques et l’acide nalidixique ont été validées. Pour le

chloramphénicol et la tétracycline, les sélectivités des géloses n’ont pas été validées et les géloses

supplémentées avec ces antibiotiques n’ont pas été utilisées pour la suite des expérimentations.

Nous avons observé la présence de transconjugants pour les 3 antibiotiques sélectifs testés.

Le phénotype de résistance observé était identique pour les trois antibiotiques: résistance à toutes

les β-lactamines testées, au cotrimoxazole et à la streptomycine. Cependant, le phénotype était plus

prononcé lorsque la sélection était faite sur la streptomycine (Figure 32). Le phénotype de résistance


207

le moins prononcé a été appelé phénotype A et le phénotype de résistance le plus prononcé a été

appelé phénotype B.

Les fréquences de conjugaison étaient, pour la sélection au méropénème de 10-1, pour la

sélection au triméthoprime de 10-4 et pour la sélection à la streptomycine de 10-7.

Figure 32: Antibiogrammes de la souche E. coli réceptrice UB 5201 et les deux phénotypes obtenus après la conjugaison avec V. parahaemolyticus 16-B3PA-006. Ampicilline (AMP), amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF), céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine (GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL), ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST).

AMP

CST

STR

CHL TEM CTX CEF

FOX CAZ AMC

CIP NAL AZM

TET SXT GEN

AMP

CST

STR

CHL TEM CTX CEF

FOX CAZ AMC

CIP NAL AZM

TET SXT GEN

AMP

CST

STR

CHL TEM CTX CEF

FOX CAZ AMC

CIP NAL AZM

TET SXT GEN

Phénotype A Phénotype B

E. coli UB 52210


208

III.4. Discussion

La séquence type ST864 que nous avons utilisé a été associée à une souche

environnementale décrite en Chine. Le phénotype multi-résistant de la souche V. parahaemolyticus

16-B3PA-006 a été confirmé par l’étude génotypique. En effet, au moins un gène de résistance était

détecté pour chaque résistance acquise observée phénotypiquement. Ces gènes de résistance

étaient dispersés sur 5 contigs différents et il n’a pas été possible d’associer ces contigs au

chromosome ou à des éléments transférables par conjugaison bactérienne (plasmides, ICE).

La souche portait le transposon Tn125, qui a déjà été partiellement décrit dans une souche

clinique de V. fluvialis, mais il n’était pas complet (Chowdhury et al. 2016). Ce transposon, contenant

blaNDM-1, a été décrit dans d’autres souches cliniques d'Enterobacteriaceae et d’Acinetobacter. Ce

transposon semble diffuser parmi un grand nombre d’espèces bactériennes de la classe des γ-

Proteobacteria (Poirel et al. 2012a). Cela montre la capacité de dissémination de ce transposon et de

la carbapénèmase qu’il contient à travers des espèces bactériennes et des biotopes divers : milieu

marin, sol, tube digestif. Elle portait également un intégron de classe 1 avec deux cassettes de gènes

de résistance : aadA2 et dfrA16. Dans les travaux, de Ceccarelli et al. (2006) des intégrons de classe 1

ont également été identifiés et ils portaient le gène de résistance dfrA15.

Le phénotype de résistance aux β-lactamines, aux aminosides et aux inhibiteurs de la

synthèse des folates a été transféré entre V. parahaemolyticus et E. coli. L’observation d’un même

phénotype de résistance aux antibiotiques plus accentué et une fréquence de conjugaison différente

semble indiquer que certains gènes de résistance aux β-lactamines, aux aminosides et aux inhibiteurs

de la synthèse des folates soient sur des éléments génétiques conjugatifs et/ou mobilisables

différents. Un des éléments conjugatifs portant certains gènes, dont blaNDM-1, donnait le phénotype

A. Le phénotype B a pu être obtenu par un élément conjugatif qui conjuguait moins fréquemment

que celui donnant le phénotype A. Il a pu être également obtenu par un élément génétique, portant

d’autres gènes de résistance ou une pompe favorisant l’efflux d’antibiotiques, mobilisés lors du


209

transfert d’un élément conjugatif. Nous n’avons pas observé de transfert des phénotypes de

résistance à la tétracycline et au chloramphénicol en sélectionnant avec un carbapénème, un

aminoside ou un inhibiteur de la synthèse des folates, ces gènes sont certainement présents sur

d’autres éléments génétiques. La présence de ces deux gènes sur un même contig semble appuyer

cette hypothèse. La sélection sur ces antibiotiques pourrait être intéressante pour étudier la capacité

de dissémination des gènes tet(A) et floR. Le séquençage des souches transconjugantes permettrait

de comparer et aider à la reconstitution des éléments génétiques conjugatifs présents dans la souche

16-B3PA-006.

Même si la souche 16-B3PA-006 portait le gène blaNDM-1, elle était sensible cliniquement pour

l’imipénème selon les critères du CLSI et sauvage pour la témocilline. De plus, la croissance de la

souche V.parahaemolyticus 16-B3PA-006 était faible sur la gélose sélective contenant 2 µg.mL-1 de

méropénème. Elle était résistante à bas niveau pour les carbapénèmes et la concentration en

méropénème dans les géloses sélectives devait être trop élevée pour permettre une croissance

optimale de cette souche. D’où la fréquence de conjugaison calculée très élevée. En outre, les

caractéristiques phénotypiques de cette souche n’orientaient pas la recherche d’une

carbapénèmase. Ce sont des tests complémentaires (criblage moléculaire et tests enzymatiques) qui

ont montré une activité enzymatique de type carbapénèmase. Des souches V. fluvialis isolées de

selles de patients en Inde étaient productrices de NDM-1 (Chowdhury et al. 2016). Les CMI pour

l’imipenème de ces souches étaient supérieures à 4 µg.mL-1 et elles étaient résistantes cliniquement

à l’imipenème. De même, des souches de V. parahaemolyticus et V. vulnificus productrices de NDM-1

isolées d’eau de baignade au Nigeria étaient résistantes cliniquement à l’imipenème et à

l’ertapénème (Oyelade et al. 2018). Leurs CMI pour ces carbapénèmes étaient supérieures à 4 µg.mL-

1. Des souches de V. cholerae, productrices de NDM-1 ont été également isolées dans des

échantillons cliniques ou environnementaux, mais leur sensibilité in vitro aux carbapénèmes n’a pas

été décrite à ce jour (Walsh et al. 2011, Darley et al. 2012, Diep et al. 2015).


210

En revanche, les antibiogrammes par diffusion ne semblent pas pertinents pour détecter in

vitro l’activité de la carbapénèmase NDM-1 pour V. parahaemolyticus. Les marqueurs de détection

utilisés, comme la témocilline ou l’imipénème ne semble pas efficace pour détecter ces enzymes par

antibiogramme en milieu gélosé. Dans le référentiel du CLSI, les seuils cliniques de l’imipénème pour

Vibrio spp. sont dérivés de ceux des Enterobacteriales. La production de NDM-1 aurait peut-être été

détectée par antibiogramme par diffusion pour V. parahaemolyticus si des seuils épidémiologiques

avaient été définis. Des souches bactériennes productrices de carbapénèmase et sensibles aux

carbapénèmes ont également été décrites pour des Enterobacteriales (Nordmann et al. 2012a). Dans

tous les cas, une confirmation de la présence de carbapénèmases par des tests enzymatiques et/ou

génotypiques est nécessaire. NDM-1 a été décrit pour la première fois en 2009 dans une souche de

Klebsiella pneumoniae chez un patient revenant d’Inde (Yong et al. 2009). Depuis, le gène blaNDM-1 a

été détecté dans de nombreuses de souches Gram négatif (Enterobacteriales, Acinetobacter,

Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas,…) isolées d’échantillons environnementaux, humains et

alimentaires (Jovcic et al. 2011, Walsh et al. 2011, Darley et al. 2012, Diep et al. 2015, Chowdhury et

al. 2016, Janecko et al. 2016, Khan et al. 2017, Wang et al. 2017b).

Le sous-continent Indien semble être le réservoir d’origine du gène blaNDM-1, les Balkans et le

Moyen Orient semble également être des réservoirs secondaires (Dortet et al. 2014). Les voyageurs,

colonisés par des bactéries porteuses de blaNDM-1, sont des acteurs dans la dissémination du gène

blaNDM-1 depuis des régions où ce gène est endémique, vers des régions où ce gène est non

endémique (van der Bij et Pitout 2012).

L’Homme peut également être exposé à des bactéries produisant des carbapénémases par

son alimentation. Des souches de Salmonella et Enterobacter cloacae produisant NDM-1 ont été

isolées de viandes de poulet et de palourdes respectivement (Wang et al. 2017b). De même des

souches de Salmonella et E. coli produisant VIM-1 ont été isolées de viande de porc et de praires

(Borowiak et al. 2017, Roschanski et al. 2017). C’est la première description d’une souche de V.


211

parahaemolyticus produisant NDM-1 isolée de crevettes importées d’Asie du Sud-Est. Dans les

travaux de Janecko et al. (2016) et Roschanski et al. (2017), les souches E. cloacae et E. coli ont été

isolées de produits aquatiques importés d’Asie du Sud-Est ou d’Italie (Janecko et al. 2016, Roschanski

et al. 2017). L’importation d’aliment devrait également pris en considération comme un vecteur

potentiel de dissémination de carbapénèmase comme NDM-1. Le rôle du commerce international ne

devrait pas être sous-estimé comme une route alternative pour la dissémination des

carbapénémases.

Le phénotype carbapénèmase a pu diffuser de V. parahaemolyticus à E. coli et être

sélectionné par des antibiotiques qui ne font pas partis de la famille des β-lactamines. La sélection

croisée des résistances, notamment de mécanismes ayant un impact en santé publique comme les

carbapénèmases, est un phénomène favorisant la diffusion de ces mécanismes de manière sous-

jacente et discrète. Ce problème de co-sélection de résistance devrait être pris en compte pour

encourager les bonnes pratiques visant à réduire l’exposition des animaux et des hommes aux

antibiotiques.


212

- Des seuils épidémiologiques expérimentaux ont été définis pour V. parahaemolyticus pour

tous les antibiotiques testés, sauf l’ampicilline et la colistine.

- 60 souches (16 %) avaient un phénotype non-sauvage pour au moins une classe

d’antibiotique.

- L’intégrase de l’ICE SXT/R391 a été détectée dans 3 souches résistantes et un intégron de

classe 1 a été détectée dans une seule souche résistante.

- 10 souches (2,5 %) étaient multi-résistantes, dont 4 souches résistantes aux tétracyclines,

aux inhibiteurs de la synthèse es folates, aux aminosides et aux phénicolés.

- La souche 16-B3PA-006 était multi-résistante à 5 classes d’antibiotiques (β-lactamines,

tétracyclines, inhibiteurs de la synthèse des folates, aminosides, phénicolés) et elle produisait

une carbapénèmase NDM-1.

- Le phénotype de résistance aux β-lactamines, aux inhibiteurs de la synthèse des folates et

aux aminosides a été transféré de la souche 16-B3PA-006 à E. coli par conjugaison.

215

Conclusion et perspectives


216

L’objectif de ces travaux était de faire un état des lieux de la flore bactérienne mésophile

cultivable présente dans des produits de la pêche et de l’aquaculture et d’étudier sa résistance aux

antibiotiques. Les différentes catégories de produits analysés étaient des poissons (poissons plats,

cabillauds), crustacés (crevettes, homards) et mollusques (moules, huîtres et noix de Saint-Jacques).

Pour la partie étude de la flore bactérienne, nous avons employé différentes températures

d’incubation, bouillons d’enrichissement, géloses sélectives, et temps d’incubation pour isoler le

maximum de bactéries mésophiles cultivables de ces produits. Le nombre d’isolats de

caractéristiques morphologiques (forme, couleur, taille) différentes prélevé sur les géloses était très

variable, comme par exemple pour les milieux ChromID® qui allait de 6 colonies différentes sur la

gélose ChromID®OXA-48 à 78 colonies sur la gélose ChromID®MRSA. Au total, 1882 souches ont été

isolées de 181 produits aquatiques. Ensuite, les techniques MALDI-TOF et l’amplification et le

séquençage de gènes de ménage (ADNr 16S, gyrB, rpoB, et tuf) ont été utilisées et nous a permis

d’identifier 86 % des isolats. Ces techniques étaient complémentaires mais leurs bases de données

étaient un point critique qui ne permettait pas toujours d’identifier les isolats. Il est donc important

d’employer au moins deux techniques pour obtenir une identification fiable au moins au genre

bactérien si ce n’est à l’espèce.

Une grande diversité dans la flore bactérienne a été observée avec l’identification de 57

genres bactériens et 150 espèces, dont la majorité n’était pas ciblée par les géloses sélectives

utilisées (colonies non caractéristiques). Des différences de flores ont été observées, certaines

étaient spécifiques à des produits ou à des catégories de produits (poissons, crustacés, mollusques)

qui pouvaient être liés au mode de vie des animaux étudiés (benthique, filtreurs, migrateurs,…).

Néanmoins, 5 genres bactériens ont été isolés de l’ensemble des matrices : Enterococcus, Bacillus,

Staphylococcus, Vibrio et Psychrobacter. Les genres Aerococcus, Vagococcus, Pseudomonas,

Brevundimonas et Staphylococcus étaient les plus abondants dans les échantillons de poissons,

Bacillus et Exiguobacterium dans les échantillons de crustacés et Aeromonas, Enterococcus et Vibrio


217

les échantillons de noix de Saint-Jacques. Il n’y avait pas de genre bactérien majoritaire ni spécifique

aux moules ou aux huîtres.

Pour la partie antibiorésistance de ces travaux, nous avons réalisé une étude

épidémiologique de la résistance de la flore mésophile présente dans les produits en déterminant les

populations sauvages et non-sauvages de 6 genres bactériens. Des critères d’interprétation

épidémiologiques (ECOFFs) des antibiogrammes des genres Enterococcus, Staphylococcus,

Exiguobacterium, Pseudomonas, Proteus et Vibrio ne sont pas toujours définis dans les référentiels

du CLSI ou l’EUCAST. Nous avons alors calculé des COWT au niveau du genre bactérien car les

techniques d’identification n’ont pas permis une bonne identification des isolats à l’espèce. En effet,

l’identification au genre était bonne pour les 2 techniques employées (entre 81 % et 91%) sur le

panel de souches étudiées mais moins performant (entre 37% et 50%) pour identifier à l’espèce

bactérienne. Nous avons observé la présence de population non-sauvage pour des couples genre

bactérien/ antibiotique mais pour être plus précis dans nos observations, il aurait été important

d’aller à une identification de l’espèce bactérienne. En effet, pour certains antibiotiques, il y a avait

plusieurs sous-populations dans un genre bactérien qui étaient liées à des résistances différentes en

fonction d’espèces bactériennes. En outre, la présence de bactéries résistantes et même multi-

résistantes a quand même puis être détectée dans toutes les catégories de produits analysés, sauf

dans les huîtres, et il y en avait plus dans les produits importés que dans les produits français. Nous

nous sommes intéressés plus spécifiquement à l’espèce V. parahaemolyticus qui est naturellement

présente dans le milieu aquatique et qui part ses caractéristiques physiologiques est un potentiel

vecteur de résistance. Nous avons défini 14 COWT et la présence de population non-sauvage pour

16% des souches, tous antibiotiques confondus, avec 11 souches multi-résistantes. Dans ces 11

souches, la souche 16-B3PA-006, isolée de crevettes, était résistante à 5 classes d’antibiotiques et

elle était productrice de la carbapénèmase NDM-1.


218

Les produits de la pêche et de l’aquaculture présentent donc une voie de transmission de

bactéries résistantes aux antibiotiques entre l’environnement aquatique et l’Homme. Le risque

semble plus important avec les produits d’aquaculture importés des pays tropicaux comme les

crevettes. Les échanges commerciaux internationaux sont donc une voie possible de dissémination

de la résistance aux antibiotiques.

Pour continuer ces travaux, il est important de pouvoir identifier les isolats à l’espèce

bactérienne car les résistances aux antibiotiques sont souvent spécifiques à celle-ci. Pour cela, il faut

utiliser plusieurs techniques d’identification pour aller à l’espèce bactérienne comme celles que nous

avons utilisé et qu’il faut compléter par l’utilisation du séquençage d’autres gènes de ménages (rpoA,

rpoC, rpoD, gyrA, recA, recN,…) ou pyrH pour Vibrio pourrait aider à identifier les espèces

bactériennes de ces genres bactériens (Das et al. 2014). Le point faible de toutes les techniques

d’identification était leurs bases de données qui manquent de profils de référence de bactéries de

l’environnement. En effet, nous avons remarqué que la base de données de spectres de référence de

la technique MALDI-TOF n’était pas complète pour identifier toutes les espèces bactériennes isolées

des produits de la pêche et de l’aquaculture, notamment celles du genre Exiguobacterium. Nous

pourrions utiliser notre collection de souches pour créer des spectres de référence des espèces

comme celle d’Exiguobacterium et compléter la base de données du MALDI-TOF. Il est donc

important de travailler en collaboration avec d’autres équipes scientifiques pour l’amélioration de

ces bases. De plus, des espèces bactériennes potentiellement pathogènes alimentaires pour l’homme

(E. coli, S. aureus et B. cereus) ont été isolées des produits analysés sans résistances acquises. Les

gènes de pathogénicité de ces espèces n’ont pas été recherchés dans ces souches. Il serait

intéressant de se rapprocher d’équipes de recherches spécialisés et/ou des laboratoires nationaux de

références de ces espèces pour caractériser le risque que représentent ces bactéries pour le

consommateur.


219

De même, les espèces E. coli, E. faecalis, E. faecium et Staphylococcus spp. donc S. aureus

sont des marqueurs de contaminations fécales et/ou humaines. Cependant, les espèces des genres

Enterococcus et Staphylococcus ont été isolées de la plupart des produits analysés et cela questionne

sur l’origine de ces genres bactériens sur les produits de la pêche et de l’aquaculture « Sont-elles

naturellement présentes dans le milieu aquatique ? Sont-elles des contaminants provenant du milieu

terrestre? ». Les animaux marins peuvent être contaminés par ces bactéries par les effluents ou dans

la chaîne de production à partir de la récolte/pêche jusqu’à l’arrivée au laboratoire (bateau de pêche,

opérateurs, bassins de purification, glace, …). Il serait intéressant de typer (MLST, PFGE, …) les

souches Enterococcus et Staphylococcus isolées des produits aquatiques et de les comparer avec des

souches humaines ou d’animaux terrestres. Des profils de typage proches indiqueraient une

potentielle origine commune et des profils différents indiqueraient des origines différentes.

De plus, dans nos travaux, nous nous sommes focalisés sur la flore cultivable mésophile. Un

isolat de chaque morphologie sur 14 milieux sélectifs a été sélectionné. Les compositions des flores

bactériennes obtenues ne reflètent qu’une partie de la flore présente sur les produits. Des études

métagénomiques de la composition de la flore bactérienne des produits de la pêche permettraient

de mieux appréhender la composition de la flore bactérienne des produits aquatiques, notamment

de la flore bactérienne non cultivable. En outre, cela aidera à mieux comprendre les facteurs

influençant la composition de la flore bactérienne des animaux aquatiques (physiologie,

alimentation, migrations, place de l’animal dans la colonne d’eau,…). De plus, le développement

d’outils moléculaires de diagnostic plus performants (rapide, spécifique, peu coûteux) doit être

poursuivie sur des échantillons complexes et diversifiés provenant du milieu aquatique (poissons et

prélèvements d’eau douce/ eau de mer). Cela pourra servir à l’analyse d’échantillons biologiques

complexes qui seront prélevés de l’amont, eau de rivière, (eau douce/ pisciculture) à l’aval, le milieu

marin (eau mer/ poisson de pêche). Le but de ces analyses sera de quantifier et de caractériser le

résistome bactérien présent dans l’environnement aquatique.


220

La résistance aux antibiotiques des bactéries présentes dans le milieu marin est peu connue,

les distributions des diamètres d’inhibition des souches dont les espèces bactériennes ont été

identifiées pourront être envoyées aux référentiels du CLSI et de l’EUCAST. Cela enrichirait leurs

bases de données et pourrait contribuer à l’établissement de seuils épidémiologiques pour des

couples antibiotiques/bactéries pour lesquels il n’existe pas d’ECOFF, comme pour Vibrio. Il pourrait

également être intéressant d’étudier la résistance aux antibiotiques des genres bactériens comme

Bacillus et Vagocccus, qui étaient également isolés des matrices analysées (poissons, crustacés et

mollusques), en étudiant les concentrations minimales inhibitrices par microdilution. Après une

identification à l’espèce de tous les isolats de la collection que nous avons créée, celle-ci pourra être

étudiée en réalisant des antibiogrammes pour déterminer de nouvelles résistances naturelles et

acquises.

Dans ces travaux de thèse, la résistance aux antibiotiques a été détectée phénotypiquement

pour toutes les souches sauf pour la souche V. parahemolyticus 16-B3PA-006. Les antibiotiques

testés dans cette étude ont été utilisés pour détecter des résistances à un nombre important

d’antibiotiques pour des bactéries Gram positif et Gram négatif. Il serait intéressant de développer

des antibiogrammes spécifiques pour les genres bactériens étudiés comme Enterococcus et

Pseudomonas. De même, les phénotypes de résistance pourraient être confirmés en étudiant les

concentrations minimales inhibitrices de ces genres par microdilution.

Il serait également intéressant d’identifier les mécanismes de résistance et les supports

génétiques présents dans les souches non-sauvages détectées, comme cela a été fait pour la

collection de V. parahaemolyticus. Nous pourrions chercher par PCR des marqueurs de résistance de

gènes de résistance connus comme la cassette SCCmec pour détecter la présence du gène

responsable de la résistance à la méticilline pour la population de Gram positif non-sauvage pour la

céfoxitine. Un séquençage du génome total, comme cela a été réalisé pour la souche de


221

V. parahemolyticus 16-B3PA-006, pourrait également être effectué sur les souches multi-résistantes

des genres Enterococcus, Exiguobacterium et de l’espèce V. parahaemolyticus. Par exemple, le

séquençage du génome total des souches de V. parahaemolyticus multi-résistantes aiderait à

comprendre les mécanismes d’acquisition des résistances aux antibiotiques car les questions qui se

posent sont : les connait-on ? (plasmides, transposons,…) Sont-ils des intégrons autres que ceux

étudiés ? Sont-ils des intégrons chromosomiques ou d’autres structures génétiques comme des ICEs

ou des IMEs peu ou non décrits ? De même, la localisation plasmidique ou chromosomique du gène

blaNDM-1 et des autres gènes de résistance pour la souche V. parahemolyticus 16-B3PA-006 n’ont pas

été determinés. Une extraction plasmidique et leur séquençage permettrait de répondre à cette

interrogation. En outre, le génome des souches E. coli transconjugantes pourrait être séquencé. En

effet, nous avons observé deux phénotypes de résistance pour ces souches et le séquençage du

génome total et des plasmides présents dans ces souches permettraient d’identifier le matériel

génétique qui a transféré depuis la souche 16-B3PA-006. De plus, en comparant les résultats de

séquençage entre les deux souches transconjugantes, nous pourrions identifier des éléments

génétiques expliquant les différences de phénotype de résistance comme des éléments génétiques

mobilisables ou éléments génétiques conjugatifs avec des fréquences de conjugaison différentes.

Nous pourrions également caractériser phénotypiquement les résistances des différentes

espèces de Pseudomonas et Vibrio vis-à vis des β-lactamines en testant les sous-familles de cette

classe d’antibiotique : aminopénicillines, carboxypénicillines, uréïdopénicillines, monobactam et les

carbapénèmes. Cela permettrait de mieux comprendre les phénotypes de résistance naturelle aux β-

lactamines de ces genres bactériens. De plus, l’identification et la caractérisation des β-lactamases et

de leur contexte génétique pourrait aider à mieux comprendre le déterminisme de ces résistances,

notamment la carbénicillinase chromosomique de Vibrio qui été caractérisée que pour

V. parahaemolyticus. De plus, il serait important d’élargir l’étude faite pour V. parahaemolyticus,

(définition de seuils épidémiologique, caractérisation des mécanismes de résistances et les supports

génétiques) aux autres espèces de Vibrio pathogènes alimentaires pour l’homme comme V. cholerae


222

et V. vulnificus et des espèces pathogènes pour les animaux aquatiques comme V. harveyi et V.

anguillarum.

Sur du plus long terme, nous pourrions cumuler des souches de différentes espèces

bactériennes isolées de produits aquatiques (comme les espèces des genres Enterococcus,

Exiguobacterium, Vibrio, Pseudomonas,…), par le biais de projets de recherche, afin de pouvoir

calculer des seuils épidémiologiques expérimentaux pour des couples espèces

bactériennes/antibiotiques. Cela nous aiderait à définir des résistances naturelles des différentes

espèces bactériennes du milieu aquatique, et les antibiotiques pertinents à tester pour des études

futures.

Notre étude a porté sur l’étude la flore bactérienne et des résistances aux antibiotiques

associés de produits aquatiques frais. Il y a deux approches possibles pour continuer ce projet : la

première porte sur le risque lié à l’antibiorésistance de la pêche au consommateur, et la deuxième

question porte sur le risque de bioaccumulation dans les réseaux trophiques.

En effet, certains de ces produits sont disponibles directement à la consommation, en vente

directe ou chez les poissonniers, mais d’autres vont subir des transformations en atelier agro-

alimentaire. Les transformations peuvent être plus ou moins importantes (filetage, empaquetage

sous atmosphère modifiée, congélation, cuisson, fumaison, salaison, appertisation…). Toutefois, la

résistance aux antibiotiques des flores bactériennes des ateliers agro-alimentaires n’est pas étudiée.

Pourtant, un transfert de bactéries ou de gènes de résistance est possible depuis les matières

premières vers la flore des ateliers agro-alimentaires. De plus, l’impact des produits utilisés dans les

procédures des nettoyage/désinfection des ateliers sur le maintien de ces résistances est peu étudié.

Plusieurs questions se posent « Comment évolue les résistances aux antibiotiques entre le

prélèvement du produit depuis le milieu aquatique et le moment où il est disponible à la


223

consommation ?, Le risque pour le consommateur d’ingérer des bactéries résistantes aux

antibiotiques est-il plus important avec des produits frais ou des produits transformés ? ».

Des études de la résistance aux antibiotiques de la flore bactérienne présente sur une filière

de production entière pourraient être intéressantes pour estimer le risque pour le consommateur. La

filière du saumon serait un bon exemple. Ce poisson est consommé sous différentes formes : cru,

surgelé, fumé, cuisiné… Des comparaisons pourraient être faites sur les différents produits finaux et

les différents procédés de fabrication. Il y a également la possibilité de pouvoir comparer entre les

différentes sources de production du saumon : sauvage, élevage Européen (Norvège, Royaume-Uni),

élevage d’Amérique du Sud (Chili).

De plus, les résistances aux antibiotiques de la flore bactérienne dans la filière de production

de crevettes pourraient également être intéressantes à étudier. En effet, au travers de cette étude le

taux de bactéries résistantes aux antibiotiques étaient plus importants dans les bactéries isolées des

crevettes importées de pays tropicaux. Une spécificité dû à la nature de ces animaux, leur mode

d’élevage (intégré, bassins terrestres) est peut être à l’origine de cette contamination élevée en

bactéries résistantes aux antibiotiques. Un moyen de comparer serait d’étudier plus en détails la

présence de bactéries résistantes sur des crevettes d’élevage et de comparer avec des poissons

élevés de la même manière comme les siluriformes (panga et poisson-chats). Une comparaison entre

les différents pays de production des crevettes (Inde, Madagascar, Equateur, Thaïlande, …) pourrait

également être faite.

Enfin, il existe des campagnes d’échantillonnages annuelles en mer, comme IBTS conduite

par l’IFREMER. Le but de cette campagne est d’estimer les stocks de poissons présents en

Manche/mer du Nord. Dans la suite de nos travaux, des filtres d’eaux de mer et des poissons ont été

obtenus grâce à la campagne IBTS de 2017. Des analyses sont en cours au laboratoire pour comparer

les flores bactériennes et leurs résistances entre l’eau de mer filtrées et les espèces de poissons

pêchés. De plus, une comparaison entre les zones de prélèvement (estuaires, côte, pleine mer) est


224

possible. La participation à des campagnes scientifiques annuelles comme celle-ci permettrait

d’étudier des réseaux trophiques benthiques et pélagiques en prélevant différentes espèces de

poissons, zooplanctons, phytoplanctons, animaux brouteurs et eau de mer. Le but serait de suivre

dans le temps l’évolution les flores bactériennes de ces échantillons et également d’examiner la

position et la présence de bactéries qui ont cumulé des résistances tout au long de réseaux

trophiques benthiques et pélagiques. La position d’organismes autotrophiques et/ ou de poissons

dans les réseaux est un facteur majeur qui peut expliquer la bioaccumulation de bactéries résistantes

aux antibiotiques et le risque potentiel que cela peut poser aux consommateurs finaux de ces

produits.

Ces travaux préliminaires ont montré que les genres bactériens étudiés en antibiorésistance,

Enterococcus, Staphylococcus et Exiguobacterium, pourraient être de bonnes bactéries indicatrices

de la résistance aux antibiotiques dans les produits de la pêche, principalement des poissons. Au

contraire les genres Pseudomonas, Proteus et Vibrio ne semblent pas pertinentes. Cependant,

aucune bactérie commune à tous les animaux aquatiques n’a été identifiée et plusieurs bactéries

pourraient être nécessaire pour surveiller la résistance aux antibiotiques des produits de la pêche et

de l’aquaculture. Afin de confirmer cette hypothèse d’autres études sont nécessaires. Il serait

intéressant d’étudier la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées d’autres poissons (thons,

saumons, lieus, maquereaux, sardines, pangas….), crustacés (crabes, écrevisses,…), mollusques

(calmars, palourdes,…).

225

Valorisation des travaux de the se

Valorisation des travaux de thèse

226

Publications

A. Briet, N. Helsens, S. Delannoy, S. Debuiche, A. Brisabois, G. Midelet-Bourdin, S.A. Granier (2018)

NDM-1-producing Vibrio parahaemolyticus isolated from imported seafood. Journal of

antimicrobial chemotherapy doi: 10.1093/jac/dky200

Communications Orales

A. Briet, N. Helsens, S. Delannoy, S. Copin, A. Brisabois, G. Midelet-Bourdin, S.A Granier (2017)

NDM-1 producing Vibrio parahaemolyticus isolated from shrimps.

- Colloque international francophone Environnement et Santé (CES, Dunkerque 2017).

- 7th symposium sur la résistance aux antibiotiques dans l’environnement et chez les animaux

(ARAE, Brunschweig 2017). Présentation flash (180seconds)

Présentation affichée

A. Briet, N. Helsens, S. Delannoy, S. Debuiche, A. Brisabois, G. Midelet-Bourdin, S.A. Granier

NDM-1 producing Vibrio parahaemolyticus isolated from shrimps.

- Réunion Interdisciplinaire de Chimiothérapie Anti-Infectieuse (RICAI, Paris 2016) - Congrès de la société américaine de microbiologie (ASM, Nouvelle-Orleans 2017)

- Congrès de la société française de microbiologie (SFM, Paris 2017)

- Challenges and new concepts in antibiotics research at the Pasteur institute (Paris, 2018)

- 7th symposium sur la résistance aux antibiotiques dans l’environnement et chez les animaux

(ARAE, Brunschweig, 2017)

A. Briet, N. Helsens, L. Guillier, S. Debuiche, A. Brisabois, , S.A. Granier, G. Midelet-Bourdin Antimicrobial resistance of Vibrio parahaemolyticus

- Congrès de la société française de microbiologie (SFM, Paris 2017)

- Challenges and new Concepts in antibiotics research at the Pasteur institute (Paris, 2018)

A. Briet, S. Trigueros, S.A Granier, B. Gassilloud, G. Midelet-Bourdin

Identification of microbial flora isolated from seafood by PCR and/or Malditof technics.

- Congrès de la société française de microbiologie (SFM 2017)

227

Re fe rences bibliographiques

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255

Annexes

Annexes

256

Table des Annexes

ANNEXE I : Nombre d’isolats de chaque espèce bactérienne par gélose sélective ............................ 257

ANNEXE II : Nombre d’isolats de chaque espèces bactérienne par matrice ....................................... 262

ANNEXE III : Distribution des diamètres d’inhibition pour Enterococcus spp. .................................... 268

ANNEXE IV : Distribution des diamètres d’inhibition pour Staphylococcus spp à coagulase négatif . 274

ANNEXE V : Distribution des diamètres d’inhibition pour Exiguobacterium spp. ............................... 280

ANNEXE VI : Distribution des diamètres d’inhibition pour Pseudomonas spp. .................................. 286

ANNEXE VII : Distribution des diamètres d’inhibition pour Vibrio spp ............................................... 291

ANNEXE VIII : Distribution des diamètres d’inhibition pour Proteus spp. .......................................... 297

ANNEXE IX : Distribution des diamètres d’inhibition de Vibrio parahaemolyticus ............................. 302

ANNEXE X : Article “NDM-1 producing Vibrio parahaemolyticus isolated from imported seafood” 307

Annexes

257

ANNEXE I : Nombre d’isolats de chaque espèce

bactérienne par gélose sélective Tableau du nombre d'isolats de chaque genre bactérien identifié par milieux gélosés utilisés. TB=TBX, SA= brillance Salmonella, PE= PEMBA, SL=gélose selon Slanetz et Bartley, AL= ALOA, CF=CFC, TC= TCBS, CH=Chapman, GS= GSP, OX= chromID OXA-48, ES= ChromID ESBL, CA= ChromID Carba, VR= ChromID VRE, MR=ChromID MRSA. Les cases grises représentent l’absence d’isolats.

Genres Bactériens Espèces bactériennes Géloses sélectives ChromID® Total

souche TB SA PE SL AL CF TC CH GS OX ES CA VR MR

Acinetobacter

A. guillouiae 1 1

A. puyangensis 3 5 2 2 12

Acinetobacter sp. 1 1 1 7 1 11

Aerococcus

A. urinaeequi 10 9 2 11 28 3 63

A. viridans 3 4 2 9

Aerococcus sp. 6 15 5 26

Aeromonas A. salmonicida 1 1

Aeromonas sp. 2 12 2 13 4 33

Arthrobacter

A. soli 1 1

A. woluwensis 1 1 2

Arthrobacter sp. 2 10 12

Bacillus

B. altitudinis 1 2 3

B. aquimaris 1 1

B. cereus 12 6 8 5 17 48

B. drentensis 1 1

B. firmus 5 5

B. flexus 1 1

B. horikoshii 1 1

B. infantis 1 1

B. invictae 1 1


B. marisflavii 5 5

B. megaterium 1 1

B. nealsonii 3 3


B. oshimensis 1 1

B. paralicheniformis 1 1 2

B. pumilus 8 3 6 17

B. safensis 1 1


B. subtilis 7 1 8

B. thuringiensis 2 1 3

B. vallismortis 1 1

B. xianamensis 1 1

Bacillus sp. 59 5 1 28 2 5 100

Annexes

258



Brevundimonas

B. diminuta 1 8 9

B. naejangsanensis 6 1 9 16

Brevundimonas sp. 5 1 4 10

Brochotrix B. thermosphacta 4 4

Carnobacterium C. maltaromaticum 1 1

Carnobacterium sp. 7 7

Cellulosimicrobium C. cellulans 1 1

Cellulosimicrobium sp. 1 1

Chryseobacterium Chryseobacterium sp. 2 2

Citrobater

C. braakii 1 2 1 4

C. farmeri 1 1

C. freundii 1 1 1 3

C. gillenii 1 1

Citrobacter sp. 1 4 1 6

Desemzia D. incerta 1 13 15 1 30

Enterobacter E. cloacae 2 1 1 4

Enterobacter sp. 1 1

Enterococcus

E. aquamarinus 1 1 2


E. durans 1 1

E. faecalis 2 7 29 3 5 4 3 9 62

E. faecium 1 3 6 1 11

E. gallinarum 2 2

E. italicus 1 1 2

E. malodoratus 1 5 6

E. thailandicus 7 21 5 1 1 1 1 2 2 41

Enterococcus sp. 5 5 2 1 3 16

Escherichia

E. coli 3 2 5

E. hermannii 1 1

Escherichia sp. 1 1 2

Exiguobacterium

E. acetylicum 2 4 6

E. aestuarii 4 33 30 1 1 69

E. aurantiacum 4 2 6

E. marinum 3 4 7

E. profundum 1 3 5 9

Exiguobacterium sp. 1 11 12 24

Hafnia H. halvei 1 1 2

Hafnia sp. 1 1

Halobacillus Halobacillus sp. 3 3

Halomonas

H. alkaphila 2 2

H. glacei 1 1 2

Halomonas sp. 1 1 2

Klebsiella K. oxytoca 1 1

Annexes

259



Klebsiella sp. 1 1 2

Kluyvera K. intermedia 3 2 1 6

Kocuria K. palustris 1 1

Kurthia K. gibsoni 2 5 7

K. zopfii 1 1

Lactococcus

L. garvieae 3 8 2 1 14

L. lactis 4 1 1 6

L. raffinolactis 1 1

Lactococcus sp. 2 1 1 4

Lelliottia L. amnigena 3 3

Lysinibacillus

L. boronitolerans 1 1

L. fusiformis 1 1

L. sphaericus 1 1

Lysinibacillus sp. 8 5 1 14

Macrococcus M. caseolyticus 12 8 1 21

Macrococcus sp. 4 3 7

Microbacterium

M. arborescens 1 1

M. esteraromaticum 2 2

M. paraoxydans 4 4

Microbacterium sp. 1 1

Micrococcus M. aloeverae 1 1

M. luteus 2 1 3

Moellerella M. wisconensis 1 1 1 3

Morganella

M. morganii 10 6 2 1 3 22

M. psychrotolerans 2 2

Morganella sp. 1 4 4 2 6 17

Myroides

M. odoratimimus 2 2

M. phaeus 1 3 4

Myroides sp. 1 1 2

Oceanimonas Oceanimonas sp. 2 2

Ochrobactrum O. tritici 1 1

Ochrobactrum sp. 1 1

Paenibacillus P. lactis 1 1

Pantoea P. agglomerans 4 4

Pantoea sp. 1 1

Planococcus P. maritimus 1 1

Proteus

P. cibarius 1 1

P. hauseri 4 1 5

P. terrae 4 2 4 1 2 13

P. vulgaris 5 7 12 10 5 1 40

Proteus sp. 1 10 8 7 3 5 34

Providencia P. rettgeri 3 1 1 1 1 7

P. vermicola 1 1 1 3

Annexes

260



Providencia sp. 2 3 1 6

Pseudochrobactrum P. asaccharolyticum 2 2

Pseudolalteromonas Pseudoalteromonas sp. 1 1

Pseudomonas

P. alcaliphila 1 1

P. brenneri 1 1 4 1 4 11

P. cichorii 2 1 2 5

P. fluorescens 2 5 7

P. fragi 1 1 2

P. frederikbergensis 1 1

P. helmanticensis 2 1 1 4

P. libanensis 1 1

P. marginalis 2 2 4

P. mendocina 1 1

P. mosselii 1 1

P. putida 3 1 1 5

P. stutzeri 2 1 3

P.tolaasii 1 1 2

P. trivialis 1 1

P. weihenstephanensis 1 1 2

Pseudomonas sp. 1 1 7 30 1 12 6 12 9 79

Psychrobacter

P. arenosus 1 1

P. celer 3 3

P. faecalis 1 1

P. maritimus 1 2 3

Psychrobacter sp. 2 10 5 17

Rahnella R. inusitata 1 1

Rahnella sp. 1 1

Rothia Rothia sp. 5 1 1 7

Salinicoccus Salinicoccus sp. 1 1

Savagea Savagea sp. 1 1

Serratia

S. fonticola 2 2 3 7

S. glossinae 1 1

S. marcesens 3 3

S.quinivorans 2 1 3

Serratia sp. 3 3 3 1 1 4 15

Shewanella

S. algae 5 2 7

S. haliotis 1 7 2 5 15

S. indica 4 5 2 11

S. putrefaciens 1 1

Shewanella sp. 1 4 1 5 11

Sphingobacterium S. mizutaii 2 2

Staphylococcus S. aureus 2 1 2 3 8

S. cohnii 3 1 4

Annexes

261




S. equorum 3 4 7


S. hominis 1 1

S. lentus 3 5 7 1 16

S. pasteuri 5 3 8

S. saprophyticus 1 2 1 4

S. sciuri 2 3 4 2 11

S. stepanovicci 1 1

S. warneri 1 3 4

S. xylosus 2 2 4

Staphylococcus sp. 3 5 8 16

Stenotrophomonas

S. maltophilia 1 1 4 3 1 10

S. rhizophila 3 1 2 4 10

Stenotrophomonas sp. 1 4 2 7

Streptococcus S. parauberis 2 2

Streptococcus sp. 2 7 9

Vagococcus

V. carniphilus 6 6

V. fluvialis 26 5 7 6 22 66

V. lutrae 2 2

V. penaei 2 2 1 5

Vagococcus sp. 13 6 2 1 4 26

Vibrio

V. alginolyticus 5 3 8

V. casei 1 1

V. metschnikovii 10 6 8 24

V. mytili 1 1

V. natriegens 2 2

Vibrio sp. 14 16 8 38

Virgibacillus V. halodenitrificans 2 2

Virgibacillus sp. 1 4 5

Yersinia Y. massiliensis 1 1 2

Yersinia sp. 1 1 2

Non identifiées 1 11 45 9 13 34 34 38 41 15 10 4 3 258

Total souche 27 78 392 145 114 155 236 345 174 6 55 41 37 77 1882

Annexes

262

ANNEXE II : Nombre d’isolats de chaque

espèces bactérienne par matrice Tableau du nombre d’isolats de chaque espèce bactérienne selon les matrices d’isolements (n=1182). Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases grises représentent l’absence d’isolats (n=978).

Genres Bactériens Espèces bactériennes Matrice d’isolement

Cr (n=91) Ho (n=15) Ca (n=15) Pp (n=15) St (n=15) Mo (n=15) Hu (n=15)

Acinetobacter

A. guillouiae 1

A. puyangensis 1

Acinetobacter sp. 19 1 2

Aerococcus

A. urinaeequi 1 57 5

A. viridans 5 1 3

Aerococcus sp. 4 2 14 6

Aeromonas A. salmonicida 1

Aeromonas sp. 4 1 3 23 2

Arthrobacter

A. soli 1

A. woluwensis 2

Arthrobacter sp. 3 8 1

Bacillus

B. altitudinis 3

B. aquimaris 1

B. cereus 45 3

B. drentensis 1

B. firmus 5

B. flexus 1

B. horikoshii 1

B. infantis 1

B. invictae 1


B. marisflavii 5

B. megaterium 1

B. nealsonii 3


B. oshimensis 1

B. paralicheniformis 1

B. pumilus 14 1 2

B. safensis 1


B. subtilis 8

B. thuringiensis 1 2

B. vallismortis 1

Annexes

263



B. xianamensis 1

Bacillus sp. 83 12 1 2 2

Brevundimonas

B. diminuta 3 6

B. naejangsanensis 12 4

Brevundimonas sp. 4 6

Brochotrix B. thermosphacta 2 1 1

Carnobacterium C. maltaromaticum 1

Carnobacterium sp. 1 1 2 3

Cellulosimicrobium C. cellulans 1

Cellulosimicrobium sp. 1

Chryseobacterium Chryseobacterium sp. 2

Citrobater

C. braakii 1 1 2

C. farmeri 1

C. freundii 3

C. gillenii 1

Citrobacter sp. 6

Desemzia D. incerta 30

Enterobacter E. cloacae 2 2

Enterobacter sp. 1

Enterococcus

E. aquamarinus 2


E. durans 1

E. faecalis 3 7 1 26 25

E. faecium 4 3 4

E. gallinarum 1 1

E. italicus 2

E. malodoratus 4 2

E. thailandicus 5 33 2 1

Enterococcus sp. 1 7 1 6 1

Escherichia

E. coli 3 2

E. hermannii 1

Escherichia sp. 2

Exiguobacterium

E. acetylicum 6

E. aestuarii 37 6 15 9 2

E. aurantiacum 2 4

E. marinum 7

E. profundum 4 4 1

Exiguobacterium sp. 9 3 8 4

Hafnia H. halvei 2

Hafnia sp. 1

Annexes

264



Halobacillus Halobacillus sp. 3

Halomonas

H. alkaphila 1 1

H. glacei 2

Halomonas sp. 2

Klebsiella K. oxytoca 1

Klebsiella sp. 1 1

Kluyvera K. intermedia 1 4 1

Kocuria K. palustris 1

Kurthia K. gibsoni 7

K. zopfii 1

Lactococcus

L. garvieae 12 2

L. lactis 6

L. raffinolactis 1

Lactococcus sp. 1 1 2

Lelliottia L. amnigena 1 2

Lysinibacillus

L. boronitolerans 1

L. fusiformis 1

L. sphaericus 1

Lysinibacillus sp. 4 1 2 7 1

Macrococcus M. caseolyticus 7 12 1 1

Macrococcus sp. 5 1

Microbacterium

M. arborescens 1

M. esteraromaticum 1 1

M. paraoxydans 4

Microbacterium sp. 1

Micrococcus M. aloeverae 1

M. luteus 2 1

Moellerella M. wisconensis 3

Morganella

M. morganii 4 18

M. psychrotolerans 2

Morganella sp. 3 14

Myroides

M. odoratimimus 2

M. phaeus 3 1

Myroides sp. 2

Oceanimonas Oceanimonas sp. 1 1

Ochrobactrum O. tritici 1

Ochrobactrum sp. 1

Paenibacillus P. lactis 1

Pantoea P. agglomerans 4

Pantoea sp. 1

Annexes

265



Planococcus P. maritimus 1

Proteus

P. cibarius 1

P. hauseri 1 2 2

P. terrae 5 2 3 3

P. vulgaris 11 4 25

Proteus sp. 13 2 15 1 3

Providencia

P. rettgeri 4 3

P. vermicola 2 1

Providencia sp. 2 4

Pseudochrobactrum P. asaccharolyticum 1 1

Pseudolalteromonas Pseudoalteromonas sp. 1

Pseudomonas

P. alcaliphila 1

P. brenneri 9 2

P. cichorii 1 4

P. fluorescens 6 1

P. fragi 2

P. frederikbergensis 1

P. helmanticensis 4

P. libanensis 1

P. marginalis 4

P. mendocina 1

P. mosselii 1

P. putida 1 4

P. stutzeri 3

P.tolaasii 2

P. trivialis 1

P. weihenstephanensis 2

Pseudomonas sp. 9 31 31 8

Psychrobacter

P. arenosus 1

P. celer 1 2

P. faecalis 1

P. maritimus 3

Psychrobacter sp. 3 3 7 1 2 1

Rahnella R. inusitata 1

Rahnella sp. 1

Rothia Rothia sp. 7

Salinicoccus Salinicoccus sp. 1

Savagea Savagea sp. 1

Serratia S. fonticola 2 5

S. glossinae 1

Annexes

266



S. marcesens 3

S.quinivorans 3

Serratia sp. 1 4 10

Shewanella

S. algae 2 5

S. haliotis 7 8

S. indica 1 1 6 3

S. putrefaciens 1

Shewanella sp. 2 8 1

Sphingobacterium S. mizutaii 1 1

Staphylococcus

S. aureus 7 1

S. cohnii 3 1


S. equorum 1 2 4


S. hominis 1

S. lentus 1 13 2

S. pasteuri 1 1 2 4

S. saprophyticus 4 3 1

S. sciuri 1 1 2 4

S. stepanovicci

S. warneri 1 3

S. xylosus 2 2

Staphylococcus sp. 2 8 3 1 2

Stenotrophomonas

S. maltophilia 10

S. rhizophila 5 5

Stenotrophomonas sp. 1 2 4

Streptococcus S. parauberis 1 1

Streptococcus sp. 1 2 6

Vagococcus

V. carniphilus 4

V. fluvialis 9 10 39 8

V. lutrae 1 1

V. penaei 2 3

Vagococcus sp. 3 8 6 5 6

Vibrio

V. alginolyticus 1 1 5 1

V. casei 1

V. metschnikovii 1 23

V. mytili 1

V. natriegens 2

Vibrio sp. 2 6 28 1

Virgibacillus V. halodenitrificans 2

Annexes

267



Virgibacillus sp. 5

Yersinia Y. massiliensis 2

Yersinia sp. 1 1

Non identifiées 33 13 75 110 14 10 4

Total souche 425 135 459 512 251 83 17

Annexes

268

ANNEXE III : Distribution des diamètres

d’inhibition pour Enterococcus spp.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la pénicilline d’Enterococcus

Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine d’Enterococcus

Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine d’Enterococcus

0

2

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E. casseliflavius

E. aquamarinus

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E. faecalis

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E. faecium

E. gallinarum

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E. aquamarinus

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Enterococcus sp.

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E. gallinarum

E. casseliflavius

E. aquamarinus

E. italicus

E. thailandicus

Enterococcus sp.

Annexes

269

Distribution des diamètres d’inhibition pour la kanamycine d’Enterococcus

Distribution des diamètres d’inhibition pour la tobramycine d’Enterococcus. La ligne rouge représente le COWT

Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine d’Enterococcus

0

2

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E. faecalis

E. durans

E. faecium

E. gallinarum

E. casseliflavius

E. aquamarinus

E. italicus

E. thailandicus

Enterococcus sp.

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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

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E. faecalis

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E. faecium

E. gallinarum

E. casseliflavius

E. aquamarinus

E. italicus

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Enterococcus sp.

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E. casseliflavius

E. aquamarinus

E. italicus

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Enterococcus sp.

Annexes

270

Distribution des diamètres d’inhibition pour la vancomycine d’Enterococcus

Distribution des diamètres d’inhibition pour le linézolide d’Enterococcus. La ligne rouge représente le COWT

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’érythromycine d’Enterococcus. La ligne rouge représente le COWT

0

2

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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

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E. faecalis

E. durans

E. faecium

E. gallinarum

E. casseliflavius

E. aquamarinus

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E. thailandicus

Enterococcus sp.

0

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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

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E. faecium

E. gallinarum

E. casseliflavius

E. aquamarinus

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E. thailandicus

Enterococcus sp.

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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

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E. casseliflavius

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E. italicus

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Enterococcus sp.

Annexes

271

Distribution des diamètres d’inhibition pour la clindamycine d’Enterococcus

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide fusidique d’Enterococcus. La ligne rouge représente le COWT

Distribution des diamètres d’inhibition pour la rifampicine d’Enterococcus

0

2

4

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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

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Enterococcus sp.

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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

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E. gallinarum

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E. aquamarinus

E. italicus

E. thailandicus

Enterococcus sp.

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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

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E. durans

E. faecium

E. gallinarum

E. casseliflavius

E. aquamarinus

E. italicus

E. thailandicus

Enterococcus sp.

Annexes

272

Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénicol d’Enterococcus

Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline d’Enterococcus. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour le triméthoprime d’Enterococcus

0

2

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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

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E. gallinarum

E. casseliflavius

E. aquamarinus

E. italicus

E. thailandicus

Enterococcus sp.

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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

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E. faecalis

E. durans

E. faecium

E. gallinarum

E. casseliflavius

E. aquamarinus

E. italicus

E. thailandicus

Enterococcus sp.

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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

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E. faecalis

E. durans

E. faecium

E. gallinarum

E. casseliflavius

E. aquamarinus

E. italicus

E. thailandicus

Enterococcus sp.

Annexes

273

Distribution des diamètres d’inhibition pour les sulfamides d’Enterococcus

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

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E. faecalis

E. durans

E. faecium

E. gallinarum

E. casseliflavius

E. aquamarinus

E. italicus

E. thailandicus

Enterococcus sp.

Annexes

274

ANNEXE IV : Distribution des diamètres

d’inhibition pour Staphylococcus spp à

coagulase négatif

Distribution des diamètres d’inhibition pour la pénicilline de Staphylococcus.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.

0

2

4

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S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

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S. saprophyticus

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Staphylococcus sp.

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S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

Annexes

275

Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la kanamycine de Staphylococcus. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la tobramycine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.

0

2

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S. warneri

S. epidermidis

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S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

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S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

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S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

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S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

Annexes

276

Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la vancomycine de Staphylococcus. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour le linézolide de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.

0

2

4

6

8

10

12

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

0

2

4

6

8

10

12

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

Annexes

277

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’érythromycine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la clindamycine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide fusidique de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.

0

2

4

6

8

10

12

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

0

2

4

6

8

10

12

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

0

2

4

6

8

10

12

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

Annexes

278

Distribution des diamètres d’inhibition pour la rifampicine de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.

Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénicol de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline de Staphylococcus. La ligne bleue représente l’ECOFF.

0

2

4

6

8

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12

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

0

2

4

6

8

10

12

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

0

2

4

6

8

10

12

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

Annexes

279

Distribution des diamètres d’inhibition pour le triméthoprime de Staphylococcus.

Distribution des diamètres d’inhibition pour les sulfamides de Staphylococcus.

0

2

4

6

8

10

12

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp

0

2

4

6

8

10

12

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


S. warneri

S. epidermidis

S. pasteuri

S. xylosus

S. saprophyticus

S. lentus

S. sciuri

S. hominis

S. haemolyticus

Staphylococcus sp.

Annexes

280

ANNEXE V : Distribution des diamètres

d’inhibition pour Exiguobacterium spp.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la pénicilline d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E. acetylicum

E. marinum

E. profundum

E. aurantiacum

E. aestuarii

Exiguobacterium sp.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E. acetylicum

E. marinum

E. profundum

E. aurantiacum

E. aestuarii

Exiguobacterium sp.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.acetylicum

E.marinum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

Annexes

281

Distribution des diamètres d’inhibition pour la kanamycine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT

Distribution des diamètres d’inhibition pour la tobramycine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.marinum

E.acetylicum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.acetylicum

E.marinum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.acetylicum

E.marinum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

Annexes

282

Distribution des diamètres d’inhibition pour la vancomycine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour le linézolide d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’érythromycine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.acetylicum

E.marinum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.acetylicum

E.marinum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.acetylicum

E.marinum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

Annexes

283

Distribution des diamètres d’inhibition pour la clindamycine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide fusidique d’Exiguobacterium.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la rifampicine d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.acetylicum

E.marinum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.acetylicum

E.marinum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.acetylicum

E.marinum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

Annexes

284

Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénicol d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la pénicilline d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.acetylicum

E.marinum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.acetylicum

E.marinum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E. acetylicum

E. marinum

E. profundum

E. aurantiacum

E. aestuarii

Exiguobacterium sp.

Annexes

285

Distribution des diamètres d’inhibition pour les sulfamides d’Exiguobacterium. La ligne rouge représente le COWT.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


E.acetylicum

E.marinum

E.profundum

E.aurantiacum

E.aestuarii

Exiguobacterium sp.

Annexes

286

ANNEXE VI : Distribution des diamètres

d’inhibition pour Pseudomonas spp.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’ampicilline de Pseudomonas.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la témocilline de Pseudomonas.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’association amoxicilline/clavulanate de Pseudomonas.

0

10

20

30

40

50

60

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


P. alcaliphila

P. putida

P. mosselii

P. cichorii


P. marginalis

P. helmanticiensis

P. brenneri

P. libanensis

P. fragi

P. fluorescens

Pseudomonas sp.

0

10

20

30

40

50

60

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


P. alcaliphila

P. putida

P. mosselii

P. cichorii


P. marginalis

P. helmanticiensis

P. brenneri

P. libanensis

P. fragi

P. fluorescens

Pseudomonas sp.

0

5

10

15

20

25

30

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


P. alcaliphila

P. putida

P. mosselii

P. cichorii


P. marginalis

P. helmanticiensis

P. brenneri

P. libanensis

P. fragi

P. fluorescens

Pseudomonas sp.

Annexes

287

Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfalotine de Pseudomonas.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine de Pseudomonas.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la ceftazidime de Pseudomonas. La ligne rouge représente le COWT.

0

10

20

30

40

50

60

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


P. alcaliphila

P. putida

P. mosselii

P. cichorii


P. marginalis

P. helmanticiensis

P. brenneri

P. libanensis

P. fragi

P. fluorescens

Pseudomonas sp.

0

10

20

30

40

50

60

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


P. alcaliphila

P. putida

P. mosselii

P. cichorii


P. marginalis

P. helmanticiensis

P. brenneri

P. libanensis

P. fragi

P. fluorescens

Pseudomonas sp.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


P. alcaliphila

P. putida

P. mosselii

P. cichorii


P. marginalis

P. helmanticiensis

P. brenneri

P. libanensis

P. fragi

P. fluorescens

Pseudomonas sp.

Annexes

288

Distribution des diamètres d’inhibition pour le céfotaxime de Pseudomonas. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide nalidixique de Pseudomonas.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine de Pseudomonas. La ligne rouge représente le COWT.

0

2

4

6

8

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6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

No

mb

re d

e s

ou

che

s


P. alcaliphila

P. putida

P. mosselii

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P. marginalis

P. helmanticiensis

P. brenneri

P. libanensis

P. fragi

P. fluorescens

Pseudomonas sp.

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No

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e s

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P. alcaliphila

P. putida

P. mosselii

P. cichorii


P. marginalis

P. helmanticiensis

P. brenneri

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P. fluorescens

Pseudomonas sp.

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No

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P. mosselii

P. cichorii


P. marginalis

P. helmanticiensis

P. brenneri

P. libanensis

P. fragi

P. fluorescens

Pseudomonas sp.

Annexes

289

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’azithromycine de Pseudomonas.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la streptomycine de Pseudomonas. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine de Pseudomonas. La ligne rouge représente le COWT.

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P. fluorescens

Pseudomonas sp.

Annexes

290

Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénicol de Pseudomonas.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline de Pseudomonas.

Distribution des diamètres d’inhibition pour le cotrimoxazole de Pseudomonas.

0

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P. cichorii


P. marginalis

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P. putida

P. mosselii

P. cichorii


P. marginalis

P. helmanticiensis

P. brenneri

P. libanensis

P. fragi

P. fluorescens

Pseudomonas sp.

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P. alcaliphila

P. putida

P. mosselii

P. cichorii


P. marginalis

P. helmanticiensis

P. brenneri

P. libanensis

P. fragi

P. fluorescens

Pseudomonas sp.

Annexes

291

ANNEXE VII : Distribution des diamètres

d’inhibition pour Vibrio spp

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’ampicilline de Vibrio.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la témocilline de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.

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V. metschnikovii

V. natriegens

V. alginolyticus

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V. metschnikovii

V. natriegens

V. alginolyticus

Vibrio sp

Annexes

292

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’association amoxicilline/clavulanate de Vibrio.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfalotine de Vibrio.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.

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V. natriegens

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V. metschnikovii

V. natriegens

V. alginolyticus

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V. metschnikovii

V. natriegens

V. alginolyticus

Vibrio sp

Annexes

293

Distribution des diamètres d’inhibition pour le ceftazidime de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour le céfotaxime de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide nalidixique de Vibrio.

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V. natriegens

V. alginolyticus

Vibrio sp

Annexes

294

Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine de Vibrio.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’azithromycine de Vibrio.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la streptomycine de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.

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V. natriegens

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V. natriegens

V. alginolyticus

Vibrio sp

Annexes

295

Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT..

Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénicol de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.

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V. natriegens

V. alginolyticus

Vibrio sp

Annexes

296

Distribution des diamètres d’inhibition pour le cotrimoxazole de Vibrio. La ligne rouge représente le COWT.

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V. metschnikovii

V. natriegens

V. alginolyticus

Vibrio sp

Annexes

297

ANNEXE VIII : Distribution des diamètres

d’inhibition pour Proteus spp.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’ampicilline de Proteus.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la témocilline de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’association amoxicilline/clavulanate de Proteus.

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Proteus sp.

Annexes

298

Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfalotine de Proteus.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine de Proteus. La ligne rouge représente le COWT La ligne rouge

représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour le ceftazidime de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.

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Proteus sp.

Annexes

299

Distribution des diamètres d’inhibition pour le céfotaxime de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide nalidixique de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.

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P. hauseri

P.vulgaris

Proteus sp.

Annexes

300

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’azithromycine de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la streptomycine de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine de Proteus. La ligne rouge représente le COWT.

0

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Annexes

301

Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénciol de Proteus.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline de Proteus.

Distribution des diamètres d’inhibition pour le cotrimoxazole de Proteus. La ligne rouge représente le COWT

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Annexes

302

ANNEXE IX : Distribution des diamètres

d’inhibition de Vibrio parahaemolyticus

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’ampicilline de Vibrio parahaemolyticus.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la témocilline de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’association amoxicilline/clavulanate de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.

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303

Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfalotine de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la céfoxitine de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la ceftazidime de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.

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304

Distribution des diamètres d’inhibition pour le céfotaxime de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.

Distribution des diamètres d’inhibition pour l’acide nalidixique de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la ciprofloxacine de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage

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Distribution des diamètres d’inhibition pour l’azithromycine de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la streptomycine de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la gentamicine de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage.

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Distribution des diamètres d’inhibition pour le chloramphénicol de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.

Distribution des diamètres d’inhibition pour la tétracycline de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage.

Distribution des diamètres d’inhibition pour le cotrimoxazole de Vibrio parahaemolyticus. La ligne rouge représente le COWT. Les barres bleues représentent la population sauvage, les barres rouges la population non sauvage

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ANNEXE X : Article “NDM-1 producing Vibrio

parahaemolyticus isolated from imported

seafood”

NDM-1 producing Vibrio parahaemolyticus isolated from imported seafood

Arnaud BRIET 1 ; Nicolas HELSENS 1 1; Sabine DELANNOY 2 ; Sabine DEBUICHE 1 ; Anne

BRISABOIS 1 , Grazie l la MIDELET-BOURDIN1 , Sophie A. GRANIER 2 2

1 Anses, Laboratory for food safety, F -62200 Boulogne-sur-Mer, France

2 Université Paris-Est, Anses, Laboratory for food safety, F -94700 Maisons-

Alfort, France

Short running t it le: NDM-1 producing Vibr io parahaemolyticus

1 Present address : SECALIM, INRA, Oniris, Université Bretagne Loire, F-44307 Nantes, France 2Corresponding author: ANSES, 14 rue Pierre et Marie Curie, F-94701 Maisons-Alfort, France;

[email protected] , tel: +33 6 26 45 32 18

mailto:[email protected]

Annexes

308

Sir,

Vibrio parahaemolyt icus is a marine microorganism, frequent ly isolated from

seafood, at water temperatures above 15°C .(Su et L iu 2007a) It is also a foodborne

pathogen, often l inked to consumption of raw or uncooked seafood, mostly

encountered in patients in Asia or the USA.(Su et L iu 2007a) Ingestion of V.

parahaemolyt icus -contaminated seafood can lead to gastroenterit is. S ymptoms are

abdominal cramps, nausea, diarrhoea, fever, headache and chi l ls . (Su et L iu 2007a)

In most cases, V. parahaemolyt icus infect ions are seIf - l imit ing, but, in pat ients

with underlying diseases, V. parahaemolyticus can cause septicaemia. (Su et L iu

2007a) To treat severe or prolonged infections, antibiotics such as

f luoroquinolones, azithromycin or r i famixin can be prescribed. (Diemert 2006b)

Wild-type V. parahaemolyticus are characterized as being susceptible to al l

antibiotic c lasses, except penici l l ins . (Chiou et al . 2015)

V. parahaemolyticus strain 16-B3PA-006 was isolated in January 2016, from a

shelled shr imp tai l imported from Vietnam to France. Ant imicrobial susceptibi l ity

was tested by the disk di ffusion method (Bio-Rad, Marne-La-Coquette, France) ,

fol lowing the CLSI recommendations. (Cl inical and Laboratory Standards Inst itute

2015) Genomic characterizat ion of the isolate was performed by WGS on a NextSeq

(I l lumina, USA). The raw reads were trimmed (minimum length, 35 bp; quality

score, 0.03) and assembled in CLC Genomics Workbench 7.5.1 by, f irst, mapping

chromosome 1 and 2 from the V. parahaemolyticus reference genome (Vibrio

parahaemolyt icus RIMD 2210633), and then, de novo assembly of the remaining

paired-end reads. A total of 190 contigs were obtained including 60 contigs that

did not map the reference genome, indicating presence of acquired genetic

material . The CGE server (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ last access October

https://cge.cbs.dtu.dk/services/

Annexes

309

30th, 2017) was used to ident ify acquired antimicrobial resistance genes

(Resfinder) , p lasmid presence (PlasmidFinder) and sequence type (MLST) .

Strain 16-B3PA-006 was ass igned to V. parahaemolyt icus ST-864. PlasmidFinder

ident if ied a unique IncA/ C2 plasmid. V. parahaemolyt icus strain 16-B3PA-006 was

phenotypically res istant to amoxici l l in -clavulanate, cefoxit in, cefotaxime,

ceftazidime, cefuroxime, cefepime and trimethoprim-sulfamethoxazole, but

remained susceptible to imipenem, tetracycline, c iprofloxacin and gentamicin .

Resfinder identif ied with 100% identity the resistance genes: blaN D M - 1 , sul1, sul2,

dfrA16, strA, strB, aadA2 . Moreover, f loR and tet(A) were detected with 98.19%

and 99.83% of identity, respectively. No resistance gene was neighbouring

bla N D M - 1 , only sul1 was on the opposite side of the cont ig, at a distance of 14kb. A

Blastn analysis of this contig with the NCBI nucleotide database ident if ied a part

of transposon Tn125 : Δ ISAba125, bla N D M - 1 , b le , trpF, tat, dct, groS, groL, IS91 , but

there was no evidence of plasmidic or chromosomal location. Despite the apparent

suscept ibi l ity to imipenem, the CIM test was posit ive, confirming carbapenemase

production by this strain .(van der Zwaluw et al. 2015) The carbapenemase

phenotype had been transferred by conjugation assays to E. col i UB5201 strain.

V. parahaemolyt icus 16-B3PA-006 was conf irmed to be mult idrug resistant, by both

genotype and phenotype, as being resistant to more than three antibiotic classes :

β- lactams, folate pathway inhibitors , phenicols, aminoglycosides and tetracycl ines .

The tn125 transposon, carried by strain 16-B3PA-006, has been partia l ly descr ibed

in a cl inical case of Vibr io f luvial is , but the transposon was not

complete.(Chowdhury et al . 2016)

Since its f i rst descr iption in 2009 in a pat ient returning from India, NDM-1 had

been descr ibed in a lmost al l parts of the world and is considered as one of the

Annexes

310

most cl inical ly signif icant carbapenemases. (Nordmann et Poire l 2014) In many of

the f i rst cases reported, patients were reporting recent inter -country travel

history, not only to the Indian subcontinent, but a lso to the Balkans states, the

Arabian Peninsula and North Africa; some of them having been repatr iated on

medical purposes. (Nordmann et Poire l 2014) NDM-1-producing Vibrio spp. have

been reported to a lesser extend in V. f luvial is and V . cholerae c l in ical or

environmental samples .(Walsh et al . 2011, Darley et al. 2012, Diep et al. 2015,

Chowdhury et al . 2016) This report is the f irst description of a V. parahaemolyt icus

strain producing NDM-1 isolated from a food item. Other carbapenemase-

producing bacteria isolated from foodstuff have already been reported: NDM -1-

producing Salmonella and Enterobacter cloacae from chicken and c lam; VIM-1-

producing Salmonella and E. col i f rom pork and Venus c lam.(Nicol et al. 2016,

Borowiak et al. 2017, Roschanski et al . 2017, Wang et al . 2017a) Food products

from Nicol et al . and Roschanski et al . reports were being imported. (Nicol et al .

2016, Roschanski et al . 2017)

Interest ingly, strain 16 -B3PA-006 was proved to both carry blaN D M - 1 gene and

display in v itro carbapenemase act ivity , nonetheless ant ibiogram categorized it as

cl in ical ly susceptible to imipenem according to the CLSI criteria. In vitro

suscept ibi l ity to any carbapenem had not been described previously in NDM -1

producing Vibr io spp. (Walsh et al. 2011, Darley et al . 2012, Diep et al . 2015,

Chowdhury et al. 2016) Cl inical microbio logists should be aware that NDM -1

carbapenemase activity in V. parahaemolyt icus might be challenging to evidence

through routine susceptibi l ity tests.

It is generally assumed that travel lers, colonized by carbapenamase -producing

bacteria, import it f rom endemic to non-endemic parts of the world .(van der Bij et

Annexes

311

Pitout 2012) However, imported food should also be taken into consideration as a

potentia l vector of dissemination of cl inical ly signif icant carbapenemases such as

NDM-1. The role of global food trade should certainly not be underestimated

anymore as an alternative route for carbapenemase disseminat ion.

Nucleotide sequence accession number

Strain 16-B3PA-006 sequence is available under GenBank Accession Number

PETB00000000.

Acknowledgment

Authors would l ike to thank Stéphanie Copin, Virginie Raguenet, Guylaine Leleu

and Régine Quenu for their assistance. Authors are especia l ly grateful to Didier

Mazel for his ass istance in the conjugaison assay and for providing rec ipient

strain. Authors would l ike to thank the iGenSeq core faci l ity (Brain & Spine

Inst itute, Hôpital Pit ié Salpêtrière , Par is, France) for excel lent sequencing

services.

Funding

This work was supported by a doctoral fe l lowship from Région Haut -de-France and

by the French national effort to reduce antimicrobial resistance in veterinary

medicine called “EcoAntibio2017” from the Ministry of Agriculture.

Transparency declarat ion

None to declare

Annexes

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References

1. Su Y-C, Liu C. Vibrio parahaemolyticus: a concern of seafood safety. Food Microbiol 2007; 24: 549-58. 2. Diemert DJ. Prevention and self-treatment of traveler's diarrhea. Clin Microbiol Rev 2006; 19: 583-94. 3. Chiou J, Li R, Chen S. CARB-17 family of beta-lactamases mediates intrinsic resistance to penicillins in Vibrio parahaemolyticus. Antimicrob Agents Chemother 2015; 59: 3593-5. 4. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for antimicrobial dilution and disk suseptibility testing for infrequently isolated or fastidious bacteria M45-3rd ed. CLSI, Wayne, PA, USA, 2015. 5. van der Zwaluw K, de Haan A, Pluister GN et al. The carbapenem inactivation method (CIM), a simple and low-cost alternative for the carba NP test to assess phenotypic carbapenemase activity in Gram-negative rods. PLOS ONE 2015; 10: e0123690. 6. Chowdhury G, Pazhani GP, Sarkar A et al. Carbapenem resistance in clonally distinct clinical strains of Vibrio fluvialis isolated from diarrheal samples. Emerg Infect Dis 2016; 22: 1754-61. 7. Nordmann P, Poirel L. The difficult-to-control spread of carbapenemase producers among Enterobacteriaceae worldwide. Clin Microbiol Infect 2014; 20: 821-30. 8. Darley E, Weeks J, Jones L et al. NDM-1 polymicrobial infections including Vibrio cholerae. Lancet 2012; 380: 1358. 9. Diep TT, Nguyen NT, Nguyen TN et al. Isolation of New Delhi metallo-beta-lactamase 1-producing Vibrio cholerae non-O1, non-O139 strain carrying ctxA, st and hly genes in southern Vietnam. Microbiol Immunol 2015; 59: 262-7. 10. Walsh TR, Weeks J, Livermore DM et al. Dissemination of NDM-1 positive bacteria in the New Delhi environment and its implications for human health: an environmental point prevalence study. Lancet Infect Dis 2011; 11: 355-62. 11. Borowiak M, Szabo I, Baumann B et al. VIM-1-producing Salmonella Infantis isolated from swine and minced pork meat in Germany. J Antimicrob Chemother 2017; 72: 2131-3. 12. Nicol J, Sarah-Lynn M, Brent PA et al. Carbapenem-resistant Enterobacter spp. in retail seafood imported from Southeast Asia to Canada. Emerg Infect Dis 2016; 22: 1675. 13. Wang W, Baloch Z, Peng Z et al. Genomic characterization of a large plasmid containing a bla NDM-1 gene carried on Salmonella enterica serovar Indiana C629 isolate from China. BMC Infect Dis 2017; 17: 479. 14. Roschanski N, Guenther S, Vu TTT et al. VIM-1 carbapenemase-producing Escherichia coli isolated from retail seafood, Germany 2016. Eurosurveillance 2017; 22: 17-00032. 15. van der Bij AK, Pitout JDD. The role of international travel in the worldwide spread of multiresistant Enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother 2012; 67: 2090-100.

Résumé La résistance aux antibiotiques est un enjeu de santé publique mondiale. L’alimentation est une des voies de

contamination des bactéries résistantes aux antibiotiques entre l’environnement et l’Homme. Toutefois, les

données concernant les bactéries résistantes aux antibiotiques dans les produits aquatiques sont rares.

L’objectif de ces travaux a été d’étudier la flore bactérienne et sa résistance aux antibiotiques dans les produits

de la pêche et de l’aquaculture. Dans un premier temps, la flore bactérienne mésophile cultivable a été isolée

de 9 matrices différentes puis identifiée par la technique MALDI-TOF et/ ou du séquençage de différents gènes

de ménage. Au final, 1882 isolats bactériens ont été obtenus, et 150 espèces et 57 genres bactériens ont été

identifiés. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la résistance aux antibiotiques des genres bactériens

les plus fréquemment isolés de ces produits. La résistance aux antibiotiques des genres Enterococcus,

Staphylococcus, Exiguobacterium, Pseudomonas, Vibrio and Proteus a donc été étudiée. Au total, 46 % des

isolats étaient résistants aux antibiotiques et 3 % étaient multi-résistants. Les crevettes étaient le produit dans

lequel le plus de souches résistantes aux antibiotiques ont été identifiée. Et dans un troisième temps, la

résistance aux antibiotiques d’une collection de souches de Vibrio parahaemolyticus, espèce bactérienne

pathogène alimentaire pour l’homme, a été étudiée. Concernant V. parahaemolyticus, 15 % des souches

étaient résistantes et 3 % des souches étaient multi-résistantes. Une souche, 16-B3PA-006, isolées de crevettes

importées d’Asie du Sud-Est produisait une carbapénèmase NDM-1 et était résistante à 5 classes

d’antibiotiques.

Abstract Antimicrobial resistance is a threat to global public health. Human can be contaminated by antibiotic resistant

bacteria through food. However, data on antimicrobial resistant bacteria in seafood are scarce. The aim of this

thesis was to study seafood bacterial flora and its antimicrobial resistance. First, mesophilic flora was obtained

from 9 matrixes and MALDI-TOF and housekeeping genes sequencing technics were used to identify isolates.

Antimicrobial resistance of most frequently bacteria were tested. In total, 1882 isolates were obtained and 150

bacterial species and 57 genera were identified. Enterococcus, Staphylococcus, Exiguobacterium, Pseudomonas,

Vibrio and Proteus were most frequently isolated and their antimicrobial resistance was studied. Antibiotic

resistant bacteria accounted for 46 % of isolates and multidrug resistant bacteria accounted for 3 % of isolates.

Antimicrobial resistant bacteria were mostly isolated from shrimps. On a side study, antimicrobial resistance of

a V. parahaemolyticus strain collection isolated from seafood was characterized. Antimicrobial resistant strains

accounted for 15 % and multi-drug resistant bacteria accounted for 3 %. A NDM-1-producing multidrug

resistant strain, 16-B3PA-006 was identified from shrimps imported from South-East Asia.

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Étude de la flore bactérienne et de sa résistance aux