TUGAS KHUSUS

TUGAS KHUSUS

METODE PEMBIAKAN BAKTERI

Membiakkan bakteri dapat dilakukan dengan berbagi cara, salah satunya pengembangbiakan dalam media cawan petri. Pengembangbiakan dalam cawan ini ada beberapa metode, yaitu:

Metode Cawan Gores ( Streak Plate)

Metode cawan gores cukup sulit bagi pemula, terutama mahasiswa semester awal yang baru mengambil mata praktikum mikrobiologi. Kesulitan dari metode ini, yaitu proses penggoresan yang cukup lama dan sulit, sehingga memudahkan terjadinya kontaminasi dan kegagalan. Prinsip metode ini, yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi.

Cara ini dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan dilekatkan pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal di satu sisi cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores.Pada metode ini, goresan di sisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak jarang dan begitu pula selanjutnya, sehingga didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah dengan koloni lain. Seluruh tahap hendaknya dilakukan secara aseptik agar tak terjadi kontaminasi.

Metoda ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan ketrampilan yang memadai yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metoda cawan gores yang dilaksanakan dengan baik akan menyebabkan terisolasinya mikroba seperti yang diinginkan. Namun, ada dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan terutama bagi yang baru melakukan pekerjaan adalah:

Tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik-baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroba menjadi kurang lanjut.

Cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan. Gambar 1. Metode cawan gores

Sumber: http://muhammadr078.student.ipb.ac.idBerikut adalah cara kerja metode cawan gores:

Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras.

Bakar jarum ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup (ujung) sampai berpijar merah.

Bakar bibir tabung reaksi yang berisi kultur bakteri dengan cara memutar tabung sehingga semua bagian bibir tabung terkena api.Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung reaksi, lalu segera keluarkan. Usahakan ketika memasukkan jarum ose jangan sampai menyentuh dinding tabung dan lakukan di dekat pembakar bunsen.Bagi tiga bidang permukaan atas cawan petri yang akan distreak dengan spidol atau lainnya.

Streak ke atas permukaan agar dengan perlahan-lahan. Ingat, usahakan jangan sampai agar hancur atau tergores

Arah streak pada permukaan agar menurut pembagian bidang tadi. Kemudian inkubasi dan amati koloninya.

Metode Cawan Tuang (Pour Plate)

Metode cawan tuang sangat mudah dilakukan karena tidak membutuhkan keterampilan khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan sumber isolat yang telah diketahui beratnya ke dalam 9 ml garam fisiologis (NaCl 0.85%) atau larutan buffer fosfat. Larutan ini berperan sebagi penyangga pH agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya pH lingkungan.

Teknik pour plate (lempeng tuang) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stok kultur bakteri. Teknik ini biasa digunakan pada uji TPC (Total Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar. Pengenceran dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhu cawan (biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan). Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam cawan petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur (nutrien agar) steril hangat (40-50oC) kemudian ditutup rapat dan diletakkan dalam inkubator (37oC) selama 1-2 hari.

Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak terjdi kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak diinginkan (di laboratorium, kontaminasi biasanya terjadi akibat tumbuhnya kapang, seperti Penicilium dalam biakan). Media yang dituang hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan (media panas sebabkan tangan jadi panas juga), media panas masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. pada metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam inkubator.

Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran mikroba ialah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang telah disterilkan dan dicairkan kemudian didinginkan 50C yang kemudian dituang ke cawan. Karena kadar sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang- kurangnya satu di antara cawan-cawan tersebut mengandung koloni-koloni terpisah di atas permukaan ataupun di dalam agar. Metoda ini memboroskan bahan dan waktu, namun tidak memerlukan ketrampilan yang terlalu tinggi.

Adapun cara kerja metode ini adalah sebagai berikut:

Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendakiAduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali.

Pipet larutan dilusi tadi sebanyak + 1 ml ke dalam cawan petri.

Tuang media agar yang masih cair (suhu + 50oC) ke dalam cawan petri tadi.Putar cawan petri secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba.Inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri.3. Metode Cawan Sebar (Spread Plate)

Pada metode cawan sebar, 0.1 ml suspensi bakteri yang telah diencerkan (metode 3) disebar pada media penyubur steril yang telah disiapkan. Selanjutnya, suspensi dalam cawan diratakan dengan batang drygalski agar koloni tumbuh merata pada media dalam cawan tersebut, kemudian diletakkan dalam inkubator (37oC) selama 1-2 hari. Metode ini cukup sulit terutama saat meratakan suspensi dengan batang drygalski. Alih-alih koloni tumbuh merata, biakan justru terkontaminasi. Oleh karena itu, batang drygalski harus benar-benar steril, yaitu dengan mencelupkannya terlebih dahulu dalam alkohol kemudian dipanaskan dengan api bunsen. Perlu diingat, batang drygalski, yang masih panas akibat pemanasan dengan api bunsen, dapat merusak media agar, sehingga harus didinginkan terlebih dahulu dengan meletakkannya di sekitar api bunsen (15 cm).

Teknik spread plate (lempeng sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau mengapuskannya di atas media agar yang telah memadat. Bedanya dengan pour plate adalah, pencampuran stok kultur bakteri dilakukan setelah media agar memadat sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan media agar. Dengan metode ini, satu sel bakteri akan tumbuh dan berkembang menjadi satu koloni bakteri. Satu koloni bakteri yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media, diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni dan permukaan koloni.

Koloni yang tumbuh terpisah ditumbuhkan kembali untuk mendapatkan isolat murni. Isolasi murni dilakukan dengan mengoleskan ose steril pada koloni dalam kultur campuran yang benar-benar terpisah satu sama lain. Olesan tersebut digores pada media padat agar miring dalam tabung reaksi. Koloni yang tumbuh dalam media ini merupakan isolat murni, yang hanya berasal dari satu jenis bakteri saja. Koloni yang tumbuh dapat dikarakerisasi berdasarkan tipe pertumbuhannya pada media agar miring.

Gambar 2. Growth patterns on slants

Sumber: http://biologid.blogspot.com/2011/10/medium-pembiakan-bakteri.htmlAdapun cara kerja metode cawan sebar ini ada dua macam, yaitu cara kerja dengan pipetting:Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras.Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki.Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali.Pipet larutan dilusi tadi sebanyak + 1 ml ke dalam cawan petri.Putar cawan petri secara perlahan-lahan di atas meja untuk meratakan larutan dilusi tadi di atas permukaan media agar.Inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri.

Cara lain berupa cara kerja dengan menggunakan swab atau apus

Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras.Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki.Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali.Masukkan swab stick (tangkai apus) steril ke dalam tabung reaksi hingga bagian kapasnya tenggelam di dalam larutan dilusi. Usahkan memasukkan tangkai apus jangan sampai menyentuh dinding tabung reaksi.Apus ke atas permukaan agar dengan perlahan-lahan secara merata. Ingat, usahakan jangan sampai agar hancur atau tergores.Inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri.Seluruh kultivasi atau penanaman sebaiknya dilakukan di dalam laminar air flow yang tertutup, untuk mengurangi resiko kontaminasi. LAF dilengkapi dengan lampu fluorescent, sinar UV dan kipas angin. Lampu fluorescent digunakan apabila kondisi cahaya di dalam LAF dan kamar isolasi kurang memadai. Sinar UV bersifat germisida yang dapat membunuh bakteri yang tidak diinginkan, sehingga dapat menurunkan resiko kontaminasi. Sebelum penanaman (kultivasi), alat - alat yang digunakan sebaiknya dikenai sinar UV selama 5 menit.

Beberapa jenis plate agar yang sering digunakan adalah sel darah merah di sebuah piring agar-agar digunakan untuk mendiagnosis infeksi. Di sebelah kiri adalah positif Staphylococcus infeksi, di sebelah kanan positif Streptococcus budaya. Jenis plate agar-agar darah di mana sel darah telah segaris dengan memanaskan sel untuk 56C. Selain itu, terdapat agar cokelat. Agar Cokelat digunakan untuk tumbuh rewel bakteri pernafasan, seperti Haemophilus influenzae. Tidak ada coklat sebenarnya terkandung dalam piring, itu adalah nama untuk pewarnaan saja. Terakhir adalah agar- agar jenis darah. Agar-agar ini berisi darah mamalia (biasanya domba atau kuda), biasanya pada konsentrasi 5-10%. Pembenihan bakteri/pembiakan bakteri ada dua jenis, yaitu pembenihan pada medium cair yang dimulai oleh Louis Pasteur dan pembenihan pada medium padat yang dimulai oleh Robert Koch.1. Air peptonPepton adalah hasil pemecahan protein sehingga bakteri sudah dipermudah, tidak usah mengeluarkan energi untuk memecahkan protein menjadi pepton. Pepton oleh bakteri akan diuraikan menjadi asam amino, kemudian diserap untuk digunakan sebagai sumber energi dan membangun sitoplasma. NaCl diperlukan untuk memberikan tekanan osmotik tertentu. Bila pembenihan dibuat tanpa NaCl ataupun dengan NaCl berkadar tinggi, pertumbuhan bakteri akan berkurang sampai terhenti. Air diperlukan untuk semua reaksi dalam makhluk hidup.2. Kaldu (Bulyon)

Susunannya sama dengan pepton, hanya aquadestnya diganti dengan kaldu. Kaldu banyak mengandung protein dan mineral yang diperlukan bagi kehidupan bakteri. Kaldu ini dibuat dari daging sapi atau kerbau. Dari 1kg sapi tanpa lemak dibuat 2 liter kaldu.3. Pembenihan gula-gula

Pembenihan pada medium ini terdiri atas air pepton ditambah suatu gula. Maksud penambahan gula ini untuk mengetahui apakah bakteri yang sedang diselidiki mampu menguraikan gula yang diberikan atau tidak. Gula yang ditambahkan adalah glukosa, laktosa, maltosa, mannitol dan saccharosa. Gula ini ditambahkan secara terpisah dalam sederetan tabung pembenihan air pepton. Karena pada penguraian gula oleh bakteri selalu dihasilkan asam maka untuk mengetahui apakah gulanya diuraikan atau tidak, ditambahkan indikator asam basa.

Pada bakteri tertentu, penguraian gula, disamping dihasilkan asam, juga dihasilkan gas. Untuk mengetahui dihasilkan atau tidaknya gas, pada medium diletakkan tabung durham yang diletakkan terbalik, untuk menampung gas yang terbentuk. Sifat dapat menguraikan gula ataupun dapat menghasilkan gas ini adalah tetap untuk setiap jenis bakteri, sehingga dapat dipakai untuk identifikasi bakteri.4. Pembenihan Taroszi

Pembenihan pada medium ini khusus untuk menumbuhkan bakteri anaerob, misalnya Clostridium tetani. Pembenihan ini terdiri atas kaldu hati sapi/kerbau yang mengandung glukosa 5%. Digunakan kaldu hati dimaksudkan untuk mendapatkan enzim peroksida yang terdapat di dalam hati. Enzim peroksida ini perlu untuk hidupnya bakteri, terutama bagi bakteri anaerob, karena bakteri ini tidak bisa membuat peroksida sendiri. Pada pmebenihan ini ditambahakan pula potongan hati rebus untuk cadangan peroksida bila yang di dalam kaldu sudah habis. Glukosa 5% sebagai sumber karbohidrat.

Pada penguraian glukosa oleh bakteri selalu dihasilkan asam sedangkan peroksida tidak dapat bekerja bila ada asam. Untuk menetralkan asam yang terbentuk ini maka pada pembenihan ditambahkan serbuk CaCo3. Agar oksigen tidak masuk ke dalam pembenihan, pada permukaan diapungkan parafin liquidum (lilin cair) dan tabung pembenihan di tutup dengan kapas yang diberi parafin solidum (lilin padat). Selain dengan pembenihan Taroszi masih banyak cara lain untuk menumbuhkan bakteri secara anaerob. Misalnya: menempatkan pembenihan dalam ruang tertutup kemudian oksigennya diisap dengan zat kimia, misalnya dengan pyrogallic acid.

Dengan pembenihan padat di dapat beberapa keuntungan, antara lain dapat membuat biakan murni, dapat melihat bentuk koloni dari sertiap jenis bakteri. Macam macam medium pembenihan padat yaitu:1. Bulyon Agar (Lempeng Agar)

Susunannya sama dengan pembenihan bulyon (cair) hanya ditambah dengan 2% agar-agar. Pembenihan ini ketika masih panas (masih cair) dituangkan ke dalam tabung reaksi atau cawan petri/petri dish. Bila sudah dingin, akan menjadi padat. Koloni dari setiap jenis bakteri selalu mempunyai bentuk yang tetap, sehingga dengan melihat bentuk koloninya saja, sudah dapat di duga jenis bakteri yang sedang diselidikinya. Misalnya koloni Vibrio cholera bening seperti tetes air embun, koloni Staphylococcus dan Streptococcus pyogenes keruh seperti nanah di mana koloni Staphylococcus besar-besar sedangkan koloni Streptococcus kecil-kecil, koloni Vibrio cholera baik pinggir maupun permukaannya licin disebut smooth colony (koloni S) sedangkan koloni Corynebacterium diptheriae tidak rata (bergerigi) dan disebut rough colony (koloni R)2. Bulyon Agar Darah (Lempeng Agar Darah)

Terdiri atas pembenihan bulyon agar, ditambahkan darah kambing yang tidak beku sebanyak 10%. Penambahan darah ini dimaksudkan untuk mempersubur pembenihan pada medium. Lempeng agar darah dipakai untuk menumbuhkan bakteri yang sukar tumbuh pada pembenihan biasa. Dengan pembenihan agar darah, bakteri dapat dibagi dalam 2 golongan, yaitu bakteri yang bersifat hemolisis (haemopepsi). Bakteri yang terasuk golongan ini akan memakan habis eritrosit, baik selaput maupun isinya, sehingga tempat di mana koloni ini tumbuh tampak bening. Contoh: Streptococcus haemolyticus dan Vibrio el-tor. Kedua adalah bakteri yang bersifat haemidigesti (haemoglobinopepsi). Dalam hal ini bakteri menghasilkan toxin yang menyebabkan keluarnya Hb (hemoglobin) dari eritosit, kemudian karena adanya H202, warnanya berubah manjadi kehijau-hijauan, karena itu koloni bakteri-bakteri ini akan dikelilingi zona kehijau-hijauan. Contoh: Vibrio cholera, dan Diplococcus pneumonia3. Endo Agar

Terdiri atas bulyon agar ditambah natrium sulfit, laktosa dan fuchsin. Fuchsin dengan natrium sulfit akan membentuk persenyawaan yang tidak erat, berwarna merah muda yang disebut leucofuchsin. Endo agar dipakai untuk menentukan (determinasi) bakteri-bakteri yang hidup di dalam usus (terdapat dalam feses). Hal ini disebabkan di dalam feses selalu terdapat bakteri Escherichia coli, baik pada orang sehat maupun sakit, karena Escherichia coli merupakan flora normal dari koloni. Semua bakteri patogen yang hidup di dalam usus, tidak dapat menguraikan laktosa sedangkan Escherichia coli bisa. Pada penguraian laktosa oleh Escherichia coliakan dihasilkan asam dan formaldehid yang akan melepaskan ikatan leucofuchsin menjadi natrium sulfit dan fuchsin kembali, dan akan menimbulkan warna merah. Pada pembenihan ini akan terlihat koloni Escherichia coli berwarna merah sedangkan koloni bakteri patogen berwarna merah muda. Penguraian leucofuchsin ini selain dipengaruhi oleh asam dan formaldehid, juga diuraikan oleh sinar matahari sehingga harus disimpan di dalam tempat yang gelap.4. Pembenihan Levithal

Pembenihan levithal ini susunannya sama dengan lempeng agar darah, hanya sebelum dituangkan ke dalam cawan petri, di panaskan dahulu 90 C, maksudnya adalah menghilangkan semua faktor yang ada di dalam darah yang mempunyai daya pertumbuhan bakteri. Kedua, untuk mengeluarkan zat-zat yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri yang dikeluarkan dari darah, yaitu X faktor dan V faktor. X faktor terdiri atas haemin yang penting untuk pembentukan enzim katalase yang sangat dibutuhkan bakteri untuk hidup secara aerob, Sifatnya thermostabil (tidak rusak pada pemanasan 100 C).V faktor terdiri atas nikotin-amida-adenin-difosfat bersifat thermolabil (rusak pada pemanasan 100 C. V faktor sangat penting untuk pertumbuhan Haemiphilus sp. misalnya Haemophilus influenza, dan Haemophilus ducreyi.

Selain medium-medium tersebut, terdapat pula medium pembiakan bakteri jenis lain, yaitu empedu esculin agar-agar (BEA). BEA digunakan untuk isolasi enterococci serta Group D Streptococcus Agar CLED ( Sisteina Laktosa elektrolit agar-agar) CLED agar-agar digunakan untuk mengisolasi dan membedakan bakteri saluran kemih, karena menghambat Proteus spesies mengerumuni dan dapat membedakan antara fermentor laktosa dan non-fermentor. Medium lain berupa Hektoen Entrik Agar-agar (HEA). Agar ini terutama bermanfaat dalam mengisolasi Salmonella dan Shigella . Dirancang untuk mengisolasi dan memulihkan bakteri kotoran milik Enterobacteriaceae.

Sebuah selektif dan diferensial media yang digunakan untuk membedakan antara Gram negatif bakteri sementara menghambat pertumbuhan Gram positif bakteri. Penambahan garam empedu dan ungu kristal untuk agar-agar menghambat pertumbuhan bakteri gram positif, membuat agar-agar MacConkey selektif. Laktosa dan netral merah ditambahkan untuk membedakan fermentor laktosa yang membentuk koloni merah muda, dari nonfermenters laktosa yang membentuk koloni jelas.Sebuah media alternatif, metilen biru eosin (EMB) melayani tujuan yang sama.

Medium lain berupa manitol garam agar (MSA) yang juga merupakan media yang selektif dan diferensial. Manitol menunjukkan organisme fermentasi manitol bahwa: fermentasi manitol menghasilkan asam laktat , menurunkan pH dan memutar plat kuning. Garam adalah memilih untuk halophiles , organisme yang tidak dapat menahan kandungan garam yang tinggi tidak akan dapat tumbuh dengan baik. Selain itu, ada pula medium Mueller Hinton Agar-agar(MHA). MHA infus berisi daging sapi, pepton , dan pati dan digunakan terutama untuk uji kerentanan antibiotik.Hara agar-agar biasanya digunakan untuk pertumbuhan organisme non-pemilih dan pengawasan produksi pigmen. Hal ini aman digunakan di laboratorium sains sekolah karena tidak selektif tumbuh patogen bakteri. Agar nz memungkinkan bakteriologis diagnosis cepat lebih sebagai Salmonella dan Shigella koloni dapat dengan jelas dan terpercaya dibedakan dari Enterobacteriaceae lainnya.

Tryptic(Trypticase) Soy Agar(TSA) juga termasuk medium tempat pembiakan bakteri. TSA merupakan media tujuan umum dihasilkan melalui pencernaan enzimatik kedelai makan dan kasein . TSA sering media dasar dari jenis agar-agar lain. Misalnya, darah piring agar-agar dibuat dengan memperkaya pelat TSA dengan pemanfaatan media darah. Selanjutnya, agar-agar cetrimide merupakan jenis agar digunakan untuk isolasi selektif dari bakteri gram-negatif, Pseudomonas aeruginosa . Sabouraud agar-agar digunakan untuk budaya jamur dan memiliki rendah pH yang menghambat pertumbuhan bakteri, tetapi juga berisi antibiotik gentamisin secara khusus menghambat pertumbuhan Gram-negatif bakteri. Ada pula medium yang berasal dari agar kentang dekstroksa yang digunakan untuk jenis tertentu budaya jamur dan ekstrak malt agar-agar memiliki kandungan tinggi pepton dan asam. Hal ini pada dasarnya digunakan dalam isolasi jamur.

DAFTAR PUSTAKAFarah, Setia. 2011. Medium Pembiakan Bakteri. http://biologid.blogspot.com/20

11/10/medium-pembiakan-bakteri.html (diakses 25 Februari 2015)Surya, Saga. 2012. Definisi dan Prinsip Pembiakan Bakteri. http://suka-suka-sursurya.blogspot.com/2012/10/definisi-prinsip-kelebihan-dan bakter.html (diakses Pada 25 Februari 2015)Muhammad, Azham. 2010. Metode Isolasi Bakteri Dengan Cawan. http://muham

madstudent.ipb.ac.id/2010/06/20/metode-isolasi-bakteri-dengan-cawan/ (diakses 25 Februari 2015)Hanifah, Fatima. 2011. Medium Pembiakan. http://biologid.blogspot.com/2011/

10/01medium-pembiakan-bakteri.html (diakses 25 Februari 2015)