Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dengan Detektor Indeks Bias

• Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikenal juga dengan istilah High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

• Fungsi utama KCKT pada dasarnya adalah kemampuannya dalam memisahkan berbagai komponen penyusun dalam suatu sampel.

• Kromatografi jenis ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan dengan tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam, tergantung mode kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan.

• HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan. Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern.

Prinsip kerja HLPC

• Dengan bantuan pompa fase gerak dialirkan melalui kolom ke detektor. Sampel yang dilarutkan dalam solvent, dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara injeksi. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen2 campuran perbedaan kekuatan interaksi anatara analat (solut-solut) dengan stationary phase pada kolom.

Lanjutan • Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam

akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya, solut2 yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut2 tsb akan keuar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

• Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram GC jumlah peak menyatakan jumlah komponen; luas area peak menyatakan konsentrasi dalam campuran

• Sisitim HPLC dapat dihubungkan dengan software pada komputer dan dioperasikan secara computerize

Detektor Indeks Bias

• Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.

PENENTUAN KADAR GLUKOSA DAN FRUKTOSA PADAMADU RANDU DAN MADU KELENGKENG DENGAN

METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

BahanBahan-bahan yang digunakan dalampenelitian ini antara lain : air deionisasi, larutanstandar glukosa 5 % dan larutan standar fruktosa5 %. Sampel penelitian adalah madu randu danmadu kelengkeng yang telah memenuhi standarSII dari merk yang sama. Tiap jenis madudigunakan dua buah sampel dan tiap sampeldilakukan pengukuran sebanyak dua kali.

PeralatanAlat-alat yang digunakan dalampenelitian ini antara lain: Seperangkat alatKCKT (buatan ICI Instruments) yang dilengkapidengan detektor indeks bias (Shodex RI SE-61)serta integrator merek Shimadzu CR6AChromatopac; labu ukur 20 mL, 25 mL, 50 mL,pipet volume 1,0 mL, 2,5 mL, 5 mL, 10 mL, 25mL, 2,5 mL, alat sentrifugasi, kertas saring 0,45μm.

Cara KerjaPembuatan Larutan Standar• Larutan standar glukosa dan fruktosa

dibuat dengan konsentrasi masing-masing 5 %b/v.

• Dari konsentrasi tersebut dapat dibuat campurandengan konsentrasi masing-masing 1 % ; 0,5 % ;0,25 % ; dan 0,125 %

• Masing-masing campuran glukosa dan fruktosatersebut disaring dengan kertas saring 0,45 μm.

Penentuan Kondisi KCKT untuk Pemisahan Glukosa dan FruktosaKondisi analisis untuk penentuan kandungan glukosa dan fruktosa pada sampel madu adalah pada kondisi pemisahan yang terbaik. Kondisi tersebut tercapai jika hasil kromatogram masing-masing komponen tidak tumpang tindih satu dengan yang lain. Kromatogram yang tidak tumpang tindih tersebut salah satunya dapat dicapai dengan mengatur suhu kolom dan laju alir dari eluen. Kondisi pemisahan dapat ditentukan pada saat pengukuran larutan standar, di mana eluen yang digunakan adalah air deionisasi pada kolom metacarb 87C dan dideteksi dengan menggunakan detektor indeks bias.

Pembuatan Kurva StandarLarutan standar glukosa dan fruktosa 0,125 % diinjeksikan sebanyak 20 μL dengan menggunakan auto syringe injector. Biarkan sampai semua komponen keluar dan terpisah dari kolom. Waktu retensi untuk masing-masing komponen (glukosa dan fruktosa) dicatat. Langkah tersebut diulangi dengan menginjeksikan 20 μL larutan standar glukosa dan fruktosa 0,25 % kemudian dengan larutanstandar 0,5 % dan 1 %. Plot hubungan antara konsentrasi larutan standar dengan luas puncak dari masing-masing komponen.

Validasi Prosedur Analisisa. Ketepatanb. Ketelitianc. Batas Deteksi

Analisis SampelMasing-masing madu dipipet 0,5 mLdan diencerkan sampai volumenya tepat 50 mLkemudian disentrifugasi selama 30 menit.Sampel tersebut disaring dengan kertas saring0,45 μm. Sampel diinjeksikan sebanyak 20 μLpada alat kromatografi dan sistem dibuat dengankondisi pemisahan terbaik, semua komponendibiarkan terpisah. Hasil yang diperolehdilakukan uji kualitatif dan uji kuantitatif

Perhitungan Kadar Glukosa dan FruktosaKromatogram yang dihasilkan berupa puncak puncak untuk setiap senyawa yang dianalisis. Luas area diukur secara otomatis oleh alat pengolah data. Uji kualitatif untuk komponen glukosa dan fruktosa dalam sampel dilakukan dengan mencocokkan waktu retensi dari masing-masing puncak pada kromatogramsampel dengan waktu retensi senyawa standar. Untuk uji kuantitatif, luas area komponenkomponen yang dianalisis diplot ke dalam persamaan regresi linier

Contoh aplikasi dalam farmasi

• Deteksi karbohidrat baik dalam bahan tambahan tablet atau dalam bahan makanan

• Deteksi asetilkolin dalam sediaan optalmik