UE 2V311 GENETIQUE 1

L2 S3 Cours

2014-2015

Année 2014-2015

UE 2V311 GENETIQUE 1

SECTIONS : A, B, C, D, E et AHA

---------------------------- Responsables : Antoine Boivin et Thierry Robert

antoine.boivin@upmc.fr et thierry.robert@upmc.fr

Secrétariat d’enseignement de l’UE : bâtiment K, 1er étage

Documents en ligne : http://www.edu.upmc.fr/biomedia/ Suivre Ressources en ligne puis Documents de cours

puis Licence, puis Génétique, et enfin 2V311

mot de passe : 2V311G2014

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MODALITES DU CONTROLE DES CONNAISSANCES Pour toutes les sections (A, B, C, D, E et AHA)

1- Examen réparti : 40% de la note finale

Le Lundi 20 octobre 2014 de 18h45 à 19h45 (Durée 1h)

Programme de l’examen réparti : TD1 à TD4 et cours associés. 2- Examen final : 60% de la note finale - 1ère session entre le 15 et le 21 décembre 2014 (2h) - 2ème session entre le 1er et le 5 juin 2015 (2h)

Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

d'après J. D Watson, M. Gilman, J. Witkowski et M. Zoller, "ADN recombinant" (Eds DeBoeck-Wesmael, 1ere édition)

Etapes de la PCR (a) On part d'un ADN double brin comprenant la séquence recherchée à amplifier. (b) Deux amorces de 20 à 25 nucléotides, dont les séquences sont complémentaires de sites de liaison situés aux extrémités 3' de la séquence recherchée sur les deux brins, sont choisies ou synthétisées. Les brins d'ADN sont séparés par dénaturation thermique (chauffage à 90°C pendant environ 1 mn), de manière à pouvoir permettre aux amorces de s'apparier à leurs sites de liaisons complémentaires. Pour cela, le mélange réactionnel est refroidi à 50°C pendant environ 1 mn. Les amorces appariées flanquent donc la séquence recherchée. (c) La Taq polymérase (ADN polymérase thermostable extraite de Thermus aquaticus, bactérie thermostable vivant dans des sources chaudes à environ 90°C) synthétise une première paire de brins complémentaires à 70°C en 2 mn environ. Ces deux brins ont des longueurs variables, puisqu'ils ne contiennent pas de signaux de terminaison communs. Ils s'étendent donc généralement au-delà des limites de la séquence cible définies par les sites de liaison des amorces. (d) Les duplex obtenus sont dénaturés (chauffage à 90°C pendant environ 1 mn) et exposent 4 sites de liaison aux amorces. (NB : pour la clarté du schéma, seuls les brins néo-synthétisés sont représentés). Après refroidissement à 50°C, deux amorces se lient à nouveau à leurs séquences complémentaires aux extrémités de la séquence cible. (e) La Taq polymérase synthétise à nouveau deux brins complémentaires à 70°C. Bien que les brins servant de matrice soient de longueurs variables à ce stade, les deux brins synthétisés qui leur sont complémentaires ont précisément la longueur de la séquence recherchée. Ceci est dû au fait que chaque nouveau brin commence au site de liaison de l'amorce à l'une des extrémités de la séquence cible, et se prolonge jusqu'à ce que la matrice fasse défaut, à l'autre extrémité de la séquence. (f) Chaque brin néo-synthétisé débute par une séquence amorce et se termine par la séquence complémentaire de l'autre amorce. Après la séparation des brins (90°C), les amorces s'apparient à nouveau (50°C) et les brins sont prolongés jusqu'à la longueur de la séquence désirée (70°C). Les brins de longueurs variables du point (c) contribue également à la formation de brins de longueur voulue. (g) La technique peut être répétée indéfinément, chaque cycle créant deux molécules d'ADN double brin identiques à la séquence cible. Ainsi, pour 30 cycles de PCR, à partir d'un fragment double brin, on doit obtenir 230 = 1 073 741 824 fragments double-brin.

1

Endonucléases de restriction

A. Exemples d'endonucléases de restriction

B. Différents types d'hydrolyse

Des enzymes de restriction différentes reconnaissent des sites différents et coupent également le site reconnu de différentes manières et génèrent des extrémités : • extrémités franches (ex : Hpa I) • extrémités cohésives 5' sortantes (ex : EcoR I, Hind III) • extrémités cohésives 3' sortantes (ex : Pst I)

C. Principe de l'établissement d'une carte de restriction Un fragment d'ADN est soumis à une hydrolyse totale avec une (simple digestion) ou deux (double digestion). Les fragments de restriction obtenus sont séparés, en fonction de leur taille (longueur en paires de bases) par électrophorèse sur gel d'agarose. Après migration, le gel est coloré au bromure d'éthidium (BEt) et analysé sous rayonnemment UV.

sens des migration

Nomenclature utilisée pour désigner une endonucléase de restriction : EcoRI

1ere lettre : majuscule, initiale de l'espèce bactérienne dont est extraite l'endonucléase : E pour Escherichia 2 lettres suivantes : minuscules, désignant le genre dont provient l'endonucléase : co pour coli lettre supplémentaire : majuscule (facultative), désignant la souche dont provient l'endonucléase : R pour RY13 chiffre romain : numéro d'ordre d'isolement de l'enzyme dans une même espèce bactérienne : I pour 1ere

2

Carte de restriction indiquant la position des différents sites de coupure pour les endonucléases utilisées, sur le fragment d'ADN étudié.

(cette carte est établie d'après les données du profil de digestion ci-dessus)

Profil électrophorétique des produits de digestion d'un fragment d'ADN après hydrolyse avec les endonucléases de restriction HindIII et/ou BamHI.

(la longueur des différents fragments, déterminnée par comparaison avec des marqueurs de taille, est indiquée en kilobases kb)

Vecteur de clonage : plasmide pUC19

Structure et fonctionnement du plasmide bactérien puC19 : le crible "blanc-bleu"

Principales étapes de clonage d'un fragment d'ADN dans un plasmide pUC19

3

bactérie transformée avec vecteur recombiné

bactérie transformée avec vecteur non recombiné

bactérie non transformée

polylinker

Les bactéries transformées deviennent résistantes à l'ampicilline è croissance sur un milieu avec de l'ampicilline

bactéries transformées par un vecteur avec insert è pas d'expression du gène lacZ

è formation de colonies blanches sur milieu avec X-gal

bactéries transformées par un vecteur sans insert è expression du gène lacZ

è formation de colonies bleues sur milieu avec X-gal

1. Obtention du fragment à cloner par hydrolyse avec une enzyme de restriction X

2. Ouverture du vecteur par hydrolyse avec l’enzyme de restriction X ou une autre générant des extrémités compatibles

3. Ligation = insertion du fragment dans le vecteur. Obtention de vecteurs recombinés et non recombinés (enzyme : ADN ligase)

4. Transformation bactérienne : introduction des vecteurs dans les bactéries compétentes

5. Sélection sur milieu + ampicilline +X-gal : (1) des bactéries transformées (colonies bleues) (2) des bactéries transformées par un vecteur recombiné (colonies blanches). Les bactéries non transformées ne peuvent pas pousser.

d'après P. Raven et al. "Biologie" (Eds de Boeck, 2009)

Principales étapes de la construction d'une banque d'ADN génomique

Isolement et purification de l'ADN génomique (très grand nombre de cellules)

Découpage de l'ADN en fragments (digestion enzymatique ménagée

ou fragmentation mécanique)

Insertion de chaque fragment dans un vecteur = LIGATION obtention de vecteurs recombinés et non recombinés

Gène β-lactamase

Gène lacZ

Site de clonage (polylinker)

Origine de réplication

Promoteur-opérateur lacZ

Plasmide pUC19 (2 686 pdb)

Ouverture du vecteur de clonage (ici un plasmide) au niveau d'un site unique

du polylinker (flèche noire)

3 gènes différents

Intégation de chaque vecteur dans une cellule-hôte adaptée = TRANSFORMATION obtention de cellules transformées et non transformées

Sélection des cellules transformées avec un vecteur par un crible adapté

Sélection des cellules transformées avec un vecteur recombiné par un crible adapté

Culture des cellules sélectionnées : formation de clones cellulaires l'ensemble des clones forme une banque d'ADN génomique,

représentative de toutes les séquences de ce génome

…

Clone A

…

Clone D

…

Clone C

…

Clone B

…

Clone E 4

Criblage d'une banque génomique

Technique de Southern blot

La technique d'hybridation en Southern blot permet la détection de fragments d'ADN qui ont été séparés par électrophorèse en gel d'agarose selon leur taille, à l'aide d'une sonde spécifique.

d'après T. Strachan et A. P. Read "Génétique moléculaire humaine" (Eds Médecines-Sciences/Flammarion, 1998)

5

Etapes du traitement du filtre de nitrocellulose :

(1) lyse des bactéries à la soude NaOH 0,5 N (2) neutralisation de la soude (3) traitement à la protéinase K (4) lavages (5) chauffage à 80°C : - dénaturation de l'ADN - fixation de l'ADN au filtre

(1') hybridation avec une sonde radio-active, marquée au 32P (2') autoradiographie

Séquençage de l'ADN

Séquençage de l'ADN par la méthode de Sanger

Séquençage de l'ADN automatisé

Utilisation de différents fluorochromes couplés aux ddNTP

6

tube T (+ddTTP

)

tube A (+ddATP)

tube C

(+ddCTP)

tube G (+ddGTP)

Electrophorégramme

- Migration du mélange réactionnel (capillaires) - Détection par des lasers des différents fluorochromes incorporés

Eléments de quelques génomes

Espèce Helicobacter pylori (bactérie)

Saccharomyces cerevisiæ (champignon)

Homo sapiens (mammifère)

• Nombre de chromosomes

• Forme des chromosomes • Longueur d'un centromère

1

circulaire pas de centromère

2 x 16 *

linéaire 110 pdb

2 x 23

linéaire > 106 pdb

• Séquences transcrites : % du génome transcrit (incluant les gènes codant les protéines et tous les ARN non codants

au moins 95% au moins 85% entre 80 et 95% (à l'échelle de l'organisme, en moyenne 15% du génome serait transcrit dans une "cellule-type")1

Gènes codant des protéines :

• % codant du gènome

• densité en gènes

• longueur moyenne d'un gène • % de gènes morcelés

91%

1 gène/1 kb

945 pdb 0

72%

1 gène/2,5 kb

1 450 pdb 4%

entre 1 et 2% (20 à 30% avec les

introns)1

1 gène/100 kb 20 kb environ

quasiment tous

Séquences produisant des ARN non codants :

• ARN ribosomiques

• ARN de transfert • autres ARN non codants

0,7%

7 clusters, 12 gènes isolés entre 6 et 12 prédits

(80 identifiés chez E. coli)2

5%

262 copies au moins 2 000 identifiés3

0,4%

1 300 copies plus de 20 000 identifiés ou prédits (soit 50 à 80 % des séquences transcrites)1

Séquences répétées :

• hautement répétées • moyennement répétées

0%

<1% (17 éléments IS)

0% 1,2% (30 copies de Ty)

10% 44%

* : génome de Saccharomyces cerevisiae considéré à l'état diploïde

Abréviations : pdb : paires de bases kb : kilobases (103 paires de bases) IS : séquences d'élements transposables bactériens Ty : transposon de levure Références :

1 : Kapranov P. et al. (2007). Genome-wide transcription and the implications for genomic organization. Nat Rev Genet, 8, 413-423 ENCODE Project Consortium (2007). Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project.. Nature, 447, 799-816.

Cheng J. et al. (2005). Transcriptional maps of 10 human chromosomes at 5-nucleotide resolution. Science, 308, 1149-1154.

2 : Livny J. et al. (2008). High-throughput, kingdom-wide prediction and annotation of bacterial non-coding RNAs. PLoS One, 3, e3197. Livny J. et Waldor M. K. (2007). Identification of small RNAs in diverse bacterial species. Curr Opin Microbiol.,10, 96-101.

3 : Neil H. et al. (2009). Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature, 457, 1038-104

d'après J.-L. Rossignol et al. "Génétique : gènes et génomes" (Eds Dunod, 2004)

Séquençage de génomes

I. Quelques génomes séquencés : taille et nombre de gènes

Phyllum Espèce Taille du génome en Mb (106 pdb)

Nombre de gènes codant des protéines

PROCARYOTES

Bactéries

Archées

Mycoplasma genitalium (1995)* Helicobacter pylori (1997) Hæmophilus influenzae (1995) Bacillus subtilis (1997) Mycobacterium tuberculosis (1998) Escherichia coli (1997)

Nanoarchaeum equitans (2003) Methanococcus maripaludis (2004) Methanosarcina acetivorans (2002)

0,58 1,67 1,83 4,21 4,41 4,6

0,49 1,6

5,75

468 1 590 1 850 4 100 4 402 4 288

643 1779 4853

EUCARYOTES

Protozoaires

Champignons

Arthropodes

Nématodes

Mammifères

Plantes

Plasmodium falciparum (2002)

Saccharomyces cerevisiae (1997)

Drosophila melanogaster (2000)

Cænorhabditis elegans (1998)

Mus musculus (2002) Homo sapiens (2002)

Arabidopsis thaliana (2001) Oryza sativa (2002)

23

13

180

97

2 500 3 300

125 420

5 268

6 294

14 100

19 099

24 174 26 966

25 499 50 000

* : année de publication des séquences

Le plus grand génome connu actuellement est celui d'Amobea dubia (protozoaire) : taille estimée = 675 000 Mb, soit environ 200 fois la taille du génome humain!!!!!!!

II. Etat du séquençage de génomes en juillet 2013

2 560 génomes séquencés et publiés (2 165 en 2012, 1 822 en 2011)

Archées Bactéries Eucaryotes

153 (126)* 2 256 (1 881)* 151 (133)*

* : données en août 2013

4 009 génomes en cours de séquençage

Sites Web : • http://genomesonline.org • http://ensembl.org

7

Structure et expression d'un gène procaryote

Gène simple

Opéron

Exemple : opéron lactose d'Escherichia coli (cf. UE 1V002)

8

!

promoteur unité de transcription opérateur

terminateur

ADN

nucléotide +1

TRANSCRIPTION

séquence codante

ARNm

AUG "stop"

5'UTR 3'UTR

TRADUCTION

NH2 COOH protéine

5' 3'

5'

5'

3'

3'

!

promoteur unité de transcription

opérateur

terminateur

ADN

nucléotide +1

TRANSCRIPTION

NH2 COOH

TRADUCTION

protéines

5'

5'

3'

3'

ARNm

5'UTR 3'UTR

séquence codante 1

AUG "stop" 5' 3'

AUG "stop"

séquence codante 2

NH2 COOH

protéine A

protéine B

Structure et expression d'un gène eucaryote

Vision "classique" sur l'exemple d'un gène codant une protéine

3’OH 5’P

Promoteur

CAAT TATA

Séquences de régulation

ATG STOP

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Intron 1 Intron 2

T

polyA TSS Sens de transcription

Région transcrite du gène

C

5’P 3’OH Exon 1 Exon 2 Exon 3 Intron 1 Intron 2

Ct Nt

Nt Ct

3’ UTR

AAAAAAAAA... 3’OH Exon 3 OHGP Exon 1 Exon 2

5’ UTR CDS

AUG STOP

Brin non transcrit (sens)

Brin transcrit (antisens)

5’P

3’OH

Précurseur protéique

Protéine mature

ARN messager mature

Excision/épissage nucléaires

Transcription nucléaire

Traduction cytoplasmique

Maturation cytoplasmique

ARN prémessager avec coiffe et queue poly A

GENE (ADN chromosomique)

OHGP Exon 1 Intron 1 Intron 2 AAAAAAAAA... 3’OH Exon 3 Exon 2

AUG STOP

SD SA PB SD SA PB

Définitions basiques : • Exon : fragment d'un gène dont la séquence se retrouve dans les ARNm matures. Les exons ne codent pas toujours pour une séquence protéique (voir 5’UTR et 3’UTR). • Intron : fragment d'un gène situé entre deux exons. Présents dans l'ARN pré-messager et absents dans l'ARNm mature. • Brin codant : c’est la séquence d’ADN qui correspond à la séquence de l’ARN. Aussi appelé brin sens ou brin non transcrit. • Brin matrice : c’est la séquence qui sert de matrice à l'ARN polymérase. Aussi appelé brin anti-sens ou brin transcrit. Eléments de contrôle de la transcription : • "CAAT" et "TATA" : éléments cis-actifs de base du promoteur, récepteurs de facteurs trans-actifs nécessaires à la transcription. • TSS "Transcription Start Site", dit aussi site d'initiation : point de démarrage de la transcription par l'ARN polymérase. • T : site de terminaison (terminateur), point d'arrêt de la transcription par l'ARN polymérase. Eléments de maturation des transcrits primaires : • C : site de clivage de la partie 3’ de l’ARN, utilisé juste après la terminaison de la transcription. • OHGP : coiffe ("cap") 7-méthylguanosine, fixée à l'extrémité 5'P de l'ARN en cours de transcription. • polyA : site de polyadénylation, séquences riches en AU reconnues par la machinerie de terminaison de la transcription et de clivage/polyadénylation et permettant l'addition d'une longue queue polyA à l'extrémité 3'OH de l'ARN pré-messager. Eléments d'excision des introns et d'épissage des exons : SD : site donneur; SA : site accepteur; BP : point de branchement, permettant la formation du "lasso" Eléments de traduction de l'ARN messager mature (mRNA) : • 5'AUG3' (ATG sur l’ADN): codon d'initiation de la traduction. • STOP : codon de terminaison de la traduction (5'UAG3', 5'UAA3' ou 5'UGA3') • CDS ("coding sequence") : région traduite de l'ARN messager mature • 5'UTR et 3'UTR : régions non traduites (UnTRanslated) 5' et 3' de l'ARN messager mature. Eléments de maturation des protéines : : site de clivage de la pré- ou préproséquence. : sites de modifications chimiques (glycosylations, phosphorylations, ...).

9

Caryotypes humains

Remaniements chromosomiques

Translocation : déplacement d�un fragment plus ou moins long d�ADN

Délétion : perte d�un fragment plus ou moins long d�ADN

a b c d e f a b e f

a b c d e f

g h i j

a b c d

g h i e f

j

Duplication : dédoublement d�un fragment plus ou moins long d�ADN

a b c d e f b c a b c d e f

Inversion : retournement d�un fragment plus ou moins long d�ADN

a b c d e f a b c e d f

Insertion : intégration d�une séquence d�ADN étrangère dans le chromosome

a b c d e f a b c d e f

transposon

Caryotype normal d'une femme (46, XX) Caryotype normal d'un homme (46, XY)

Caryotype d'un individu atteint du syndrome de Turner (45, X0)

(un chromosome X en moins)

Caryotype d'un individu atteint du syndrome de Klinefelter (47, XXY)

(un chromosome X supplémentaire)

Caryotype d'un enfant atteint du syndrome de Down ou trisomie 21 (47, +21)

(un chromosome 21 supplémentaire)

Caryotype d'un enfant atteint du syndrome du "cri du chat" (46, -5p)

(absence d'une courte région du bras court d'un chromosome 5)

10

Les marqueurs RFLP

(RFLP = restriction fragment length polymorphism)

Un marqueur RFLP est un fragment cloné d'ADN génomique humain qui, lorsqu'il est utilisé comme sonde sur un Southern blot d'ADN génomique humain digéré par une enzyme de restriction, détecte des fragments dont la taille est différente d'un individu à l'autre. Ce polymorphisme de taille peut être dû à :

- généralement : à "l'état" des sites de restriction : "sauvage" ou "muté" (cf. allèle m1) - plus rarement : à la localisation des sites de restriction dans le génome : ces variations sont provoquées

par la présence de séquences répétées en nombre variable (micro- ou minisatellites) entre deux sites de restriction (cf. allèle m2).

Différents allèles d'un locus RFLP : Révélation du polymorphisme par Southern blot :

La ségrégation d'un marqueur RFLP peut être suivi parmi les membres d'une même famille. Pour cela, on réalise un génotypage par Southern blot à partir de l'ADN génomique des individus de cette famille. Les marqueurs RFLP peuvent donc être utilisés comme marqueurs dans l'établissement de cartes génétiques.

Mise en évidence du polymorphisme des microsatellites

• Chaque microsatellite correspond à un locus unique dans le génome, défini par les séquences qui bordent le motif répété. • Ces séquences "bordantes" sont utilisées pour caractériser le polymorphisme des microsatellites par la technique de PCR.

BamHI BamHI BamHI

Allèle m2 Sonde

BamHI BamHI

Allèle m1 Sonde

BamHI BamHI BamHI

Allèle de référence Sonde

Allèle de référence -

Allèle m2 -

Allèle m1 -

1/2

1/2 R/2 2/2 2/2 R/2 2/2 R/2 1/2

R/2

Electrophorèse en gel résolutif

62 pb

1 2 -

+

56 pb

dépôt

ADN génomique

5’

3’

3’

5’ Individu 1

(CA)8

5’ O1

(GT)8

5’ O1

5’

3’

3’

5’ Individu 2

5’ O1

(CA)11

(GT)11

5’ O1

chromosome

11

Fluorescent in situ hybridization (FISH)

Comparative genome hybridization (CGH)

Principe de la technique

FISH sur cellules interphasiques FISH sur chromosomes métaphasiques

"Chromosome painting" sur cellules normales et tumorales

genomic tumor DNA labeled with FITC (green)

genomic reference DNA labeled with TRITC (red)

Cot-1 DNA

Hybridization

metaphase chromosomes

CGH

BAC DNAs

Array-CGH

gain of DNA shifts color to green

loss of DNA shifts color to red

ratio profile

12

La mitose et la méiose : conséquences cellulaires et chromosomiques

d'après P. Raven et al. "Biologie" (Eds de Boeck, 2009)

13

✓ La mitose implique une seule division nucléaire après la réplication de l'ADN. Elle produit donc deux cellules-filles contenant chacune le nombre originel de chromosomes.

✓ Le méiose implique deux divisions nucléaires sans réplication de l'ADN entre elles. Elle produit donc quatre cellules-filles possédant chacune la moitié du nombre originel de chromosomes.

Caractéristiques de la mitose et de la méïose

Analyse comparée des principales caractéristiques de la mitose et de la méïose

Cycles biologiques

Exemple de cycle haplo-diplobiontique : la levure, Saccharomyces cerevisiae

Il y a deux types de cellules haploïdes de signes sexuels différents : Mat a ou Mat α . Le croisement entre deux cellules haploïdes ne donnera naissance à un zygote que si ces cellules sont de signes sexuels différents.

Exemple de cycle diplobiontique : l'homme, Homo sapiens

spermatozoïde

ovocyte

zygote

embryon, puis fœtus

nouveau-né

♀

♂

MEI

OS

E

FEC

ON

DA

TIO

N n

n 2n

2n

2n

2n

2n

Phase n

Phase 2n

14

Analyse de ségrégation 1

15

Résultat : 4 cellules haploïdes à n chromosomes, réparties en 2 cellules de génotype a+ et 2 cellules de génotype a1

1ere d

ivision

de m

éios

e 2e

me di

vision

de

méios

e

Phase S du cycle cellulaire Duplication de chaque chromosome homologue en 2 chromatides reliées entre elles

au niveau du centromère

Zygote diploïde à 2n chromosomes a+

a1

Appariemment des chromosomes homologues : formation d'un bivalent

Migration de chaque chromosome homologue vers l'un des pôles du fuseau sans clivage des centromères

(le fuseau méiotique n'est pas représenté)

a+

a+

a1

a1

a+

a1

a+

a+

a1

a1

a+

Chaque cellule-fille reçoit 1 chromosome homologue dupliqué

en 2 chromatides

Migration de chaque chromatide vers l'un des pôles du fuseau avec clivage des centromères

(le fuseau méiotique n'est pas représenté)

a+

a+

a+

a+

a+

a1

a1

a1

a1

a1

a+

a+

a1

a1 a1

a+ a1 Fécondation

Cellule haploïde à n chromosomes

génotype a+ phénotype [+]

Cellule haploïde à n chromosomes

génotype a1 phénotype [m]

Analyse de ségrégation 2

Ségrégation de deux couples d'allèles localisés sur 2 chromosomes différents au cours de la méïose.

Analyse de ségrégation 3

Ségrégation de deux couples d'allèles localisés sur le même chromosome au cours de la méïose.

4 spores ou gamètes de type parental

4 spores ou gamètes de type recombiné

1 spore ou gamète de chaque type

• absence de crossing-over

• crossing-over entre 2 chromatides portant le gène a

• crossing-over entre 2 chromatides portant le gène b

croisement zygote

duplication de l'ADN

OU (brassage interchromosomique)

4 spores ou gamètes de type parental

4 spores ou gamètes de type recombiné

1/4 des cas

1 spore ou gamète de chaque type

croisement zygote

duplication de l'ADN

4 spores ou gamètes de type parental

1/4 des cas

1 spore ou gamète de chaque type

1/2 des cas

• absence de crossing-over

• 1 crossing-over

• 2 crossing-over • 2 chromatides sur 4 sont remaniées

• 4 chromatides sur 4 sont remaniées

• 3 chromatides sur 4 sont remaniées

OU

16

Fréquence de recombinés et distance génétique en cM

Cartographie génétique chez la levure

Analyse des spores issues de croisements entre deux souches haploïdes de levure

de phénotype [ade-]

Croisement Spores poussant sur m.m. + ade Spores poussant sur m.m.

m1 x m2 1 000 246

m1 x m3 1 000 251

m1 x m5 1 000 193

m1 x m6 1 000 227

m2 x m4 1 000 24

m3 x m5 1 000 62

m3 x m6 1 000 16

m4 x m5 1 000 259

m5 x m6 1 000 53

Correspondance entre mutants et gène muté :

m1 : mutation dans le gène a

m2 : mutation dans le gène b

m3 : mutation dans le gène c

m4 : mutation dans le gène d

m5 : mutation dans le gène e

m6 : mutation dans le gène f

Carte génétique correspondante

% rec d (cM)

0,00 0,00 1,00 1,01 2,00 2,04 3,00 3,09 4,00 4,17 5,00

5,27

6,00 6,39 7,00 7,54 8,00 8,72 9,00

9,92

10,00 11,16

11,00 12,42 12,00 13,72 13,00 15,06 14,00 16,43 15,00 17,83 16,00 19,28 17,00 20,78 18,00 22,31 19,00 23,90 20,00 25,54 21,00 27,24 22,00 28,99 23,00 30,81 24,00 32,70 25,00 34,66 26,00 36,70 27,00 38,83 28,00 41,05 29,00 43,38 30,00 45,81 31,00 48,38 32,00 51,08 33,00 53,94 34,00 56,97 35,00 60,20 36,00 63,65 37,00 67,35 38,00 71,36 39,00 75,71 40,00 80,47 41,00 85,74 42,00 91,63 43,00 98,31 44,00 106,01 45,00 115,13 46,00 126,29 47,00 140,67 48,00 160,94 49,00 195,60

d = -50 [Ln(1 - 2θ)]

avec θ = fréquence de recombinaison) θ = (R1 + R2)/(P1 + P2 + R1 + R2)

% recombinaison

dist

ance

en

cM

%rec (e-c) < %rec (e-f)+%rec (c-f)

?  f e b c d a

4,8% 10,6% d > 10,6 cM

38,6% d > 38,6 cM

3,2%

12,4% d > 12,4 cM

45,4% d > 45,4 cM

≈ 50% : indépendance génétique d > 50 cM

≈ 50% : indépendance génétique d > 50 cM

49,2% : indépendance

génétique d > 50 cM

d = 4,8 cM

d = 3,2 cM

17

Types de mutations pouvant affecter un gène codant une protéine

18

5'...CCCAGUUACUGGAAACUCAAUGCU...3'

NH2...pro-ser-tyr-trp-lys-leu-asn-ala...COOH

Conséquences Expression génique normale

Transcription

Séquences de régulation

Promoteur Unité de transcription

intron exon ADN

Cap 5'

Queue polyA 3'

Maturation

Cap

5'

Queue polyA

3'

Traduction

ARN pré-messager

ARN messager

protéine

Types de mutations

• mutation dans le promoteur • mutation dans les séquences régulatrices

• mutation dans les signaux de maturation (SA, SD, point de branchement)

• mutation dans la séquence codante

5'...CCCAGUUACUGGAGACUCAAUGCU...3'

NH2...pro-ser-tyr-trp-arg-leu-asn-ala...COOH

substitution : mutation faux-sens

Modification majeure du gène

ARN absent ou

peu abondant

ARN non transloqué ou instable

Protéine non modifiée

Protéine avec un acide

aminé différent

Protéine tronquée

Protéine modifiée à partir

du site muté

• mutation dans la séquence 5' UTR

Ribosomes non fixés

5'...CCCAGUUAGUGGAAACUCAAUGCU...3'

NH2...pro-serCOOH

substitution : mutation non-sens

5'...CCCAGUAUACUGGAAACUCAAUGCU...3'

NH2...pro-ser-ile-leu-glu-thr-gln-cys...COOH

insertion : décalage du cadre de lecture

5'...CCCAGUUACUGGAAACUGAAUGCU...3'

NH2...pro-ser-tyr-trp-lys-leu-asn-ala...COOH

substitution : mutation silencieuse

NH2

COOH

délétion

inversion

duplication

insertion

Relation génotype-phénotype 1

Des génotypes différents peuvent conduire au même phénotype.

Exemple 1 : chaîne de biosynthèse de l'adénine chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Test de complémentation fonctionnelle (TCF)

Croissance sur milieu minimum (Mm) des cellules diploïdes réalisées en croisant entre eux les différents mutants (m1 à m12) haploïdes de phénotype [ade-] et avec la souche haploïde de référence (+) de phénotype [ade+] + : le diploïde pousse sur milieu minimum - : le diploïde ne pousse pas sur milieu minimum

m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 m11 m12 + m1' - m2' + - m3' + + - m4' + + + - m5' + + + + - m6' + + + + + - m7' - + + + + + - m8' + + + - + + + - m9' + - + + + + + + - m10' + + + - + + + - + - m11' - - - - - - - - - - - m12' + - + + + - + + - + - -

+ + + + + + + + + + + - + + n : souche de signe sexuel a n' : souche de signe sexuel α

Interprétation du test de complémentation fonctionnelle

PRPP

ade4

enz1

PRA

ade5

enz2

GAR

ade3 ade8

enz3

FGAR

ade6

enz4

FGAM

ade7

enz5

AIR

ade2

enz6

CAIR

enz7

ade1

(pigment rouge)

SAICAR

enz8

ade13

AICAR

enz9

FAICAR

enz10

IMP

enz11

ade12

ADS

enz12

ade13

AMP

gène

enzyme

Produits de la chaîne de biosynthèse de l'adénine :

• PRPP : 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate • PRA : 5-phosphoribosyl-1-amine • GAR : glycinamide ribonucléotide • FGAR : formylglycinamide ribonucléotide • FGAM : formyl glycinamide ribonucléotide • AIR : 5-aminoimidazole ribonucléotide (pigment rouge) • CAIR : 5-aminoimidazole-4-carboxylate ribonucléotide • SAICAR : 5-aminoimidazole-4-succinocarboxamide ribonucléotide • AICAR : 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucléotide • FAICAR : 5-formamido-imidazole-4-carboxamide ribonucléotide • IMP : inosine monophosphate • ADS : adénylosuccinate • AMP : adénosine monophosphate (adénylate)

Zygote diploïde à 2n chromosomes a1

a2

a1 a2 Fécondation

mutant m1 haploïde génotype a1

phénotype [m]

mutant m7 haploïde génotype a2

phénotype [m]

Résultat : deux allèles mutés du même gène dans la cellule diploïde phénotype muté

Zygote diploïde à 2n chromosomes

Fécondation mutant m2 haploïde

génotype b1 c+

phénotype [m]

mutant m3 haploïde génotype b+ c1 phénotype [m]

Résultat : complémentation pour chaque couple d'allèles (si allèle muté à effet récessif)

c+ b1 c1 b+

c+

c1

b1

b+

19

Relation génotype-phénotype 2

Des génotypes différents peuvent conduire au même phénotype.

Exemple 2 : synthèse des pigments d'œil chez la drosophile Drosophila melanogaster

Les yeux des drosophiles de souche sauvage contiennent plusieurs pigments appartenant à deux familles chimiques différentes, la famille des ptéridines, de couleur jaune à rouge (chaîne de biosynthèse 1), et celle des ommochromes, de couleur brune (chaîne de biosynthèse 2).

Différents phénotypes d'œil (phénotype sauvage de référence à droite)

Relation génotype-phénotype 3

Un génotype donné peut conduire à différents phénotypes.

Exemple : mutation dans le gène β-globine chez l'homme

L'anémie falciforme (hématies en "forme de faucille") est dûe à une mutation dans le gène β-globine (allèle S), entraînant une substitution glutamate valine en position 6 (E6V) dans la protéine, avec de nombreuses conséquences phénotypiques.

Répartitions comparées entre la fréquence de l'allèle S et la présence du paludisme

Fréquence de l'allèle S Localisation géographique du paludisme

20

Croisement de type "back cross" dans le cas d'un simple mutant

Croisement de type "back cross" dans le cas de doubles mutants

21

2 types de gamètes 1 type de gamètes

= 1/2 a+

descendance F1

X  a

+

a+    a

+

a1  

 a+

a1    

a1

a1  X

= 1/2 a1

= 1/2 = 1/2

descendance F2 : les 2 génotypes des parents F1 en proportions égales

ségrégation 1/2 - 1/2  

   a1

a1

a+

a1

a1

a+ c+

a+ c+

a1 c1

a1 c1

X

femelle F1

a1 c1

a+ c+

a1 c1

a1 c1

X

4 types de gamètes

a+ c+ P1 ≥ 1/4

a1 c1 P2 ≥ 1/4

a+ c1 R1 ≤ 1/4

a1 c+ R2 ≤ 1/4 a1 c1

1 type de gamètes

descendance F2 4 génotypes

a1 c1

a+ c+

≥ 1/4

a1 c1

a1 c1

≥ 1/4

a1 c1

a+ c1

≤ 1/4

a1 c1

a1 c+

≤ 1/4

Recombinaison par brassage intrachromosomique

P ≥ R

a+ b+

a+ b+

a1 b1

a1 b1

X

femelle F1

a1 b1

a+ b+

a1 b1

a1 b1

X

4 types de gamètes

a+ b+ P1 = 1/4

a1 b1 P2 = 1/4

a+ b1 R1 = 1/4

a1 b+ R2 = 1/4 a1 b1

1 type de gamètes

descendance F2 4 génotypes

a1 b1

a+ b+

= 1/4

a1 b1

a1 b1

= 1/4

a1 b1

a+ b1

= 1/4

a1 b1

a1 b+

= 1/4

Recombinaison par brassage interchromosomique

P = R

Analyse de généalogies

Cartes génétiques et cartes physiques

Cartes génétiques de trois chromosomes humains déduites des fréquences de recombinaison observées dans les méioses mâle et femelle, comparées aux cartes physiques correspondantes

(au centre).

22

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 2 I

II

III

Autosomique dominant

I

II

III

IV

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2

Liaison à l'X dominant

I

II

III

IV

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6

1 2

Liaison à l'X récessif

0 cM

0 cM

96,5 cM

125 cM

frec ♂ frec ♀

118 Mb

0 cM 0 cM

95,5 cM 118 cM

frec ♂

frec ♀

81 Mb

frec ♂

frec ♀

0 cM 0 cM

61,5 cM 53,5 cM

45 Mb

chromosome 13

chromosome 18

chromosome 21

I

II

III

IV

1 2

1 2 3 4 5

1 2

1 2 3 4

Autosomique récessif

Gènes candidats

A) Les ADN des membres de familles de malades sont génotypés avec des marqueurs de la carte génétique, afin de construire des groupes de liaison, c'est-à-dire d'identifier ceux qui ségrègent spécifiquement avec le phénotype morbide. Cela permet de déterminer un intervalle de localisation sur le chromosome.

B) La carte physique correspondant à cet intervalle est établie sous la forme d'un assemblage de YAC ou de BAC chevauchants.

C) L'inventaire de l'ensemble des gènes présents dans cette région est dressé. Parmi ceux-ci, on recherche par séquençage celui présentant des mutations qui ségrégent spécifiquement chez les individus malades.

D) La comparaison des séquences du gène trouvé chez les individus sains (a) et malades (b) permet de déterminer la nature de la mutation responsable de la mutation.

Gènes détectés sur une courte région (1 Mb) du bras court du chromosome 21 humain

d'après T. Strachan et A. P. Read "Human Molecular Genetics" (3rd edition, Garland Science, 2004)

Objectifs de l'analyse des génomes

marqueur de la carte génétique

YAC et marqueur de la carte physique

gène

A B C D

1 2

23

Génomique structurale Etude de l'organisation du génome

Génomique comparative Comparaison avec d'autres génomes

Phylogénie Génomique évolutive Etude de l’évolution des génomes

Génomique fonctionnelle Identification de nouveaux gènes

Recherche des fonctions des gènes

Thérapie génique

2V311 planning

semaine cours TD01-sept -07-sept08-sept - 14-sept oui15-sept - 21-sept oui22-sept - 28-sept oui TD129-sept - 05-oct oui TD206-oct - 12-oct oui TD313-oct - 19-oct oui TD420-oct - 26-oct oui non (examen réparti)27-oct - 02-nov non (JOR) non (JOR)03-nov - 09-nov oui TD510-nov - 16-nov non17-nov - 23-nov non24-nov - 30-nov TD601-déc - 07-déc TD708-déc - 14-déc15-déc - 21-déc22-déc - 28-déc29-déc - 04-janv05-janv - 11-janv12-janv - 18-janv

examen réparti lundi 20 octobre 18h45-19h45 amphis A1, A2, B1, B2, B3, F1 et F2

Révisionsexamens S3 première session

vacances

délibérations S3 première session