v. Graefes Archiv ftir OphthMmologie, Bd. 152, S. 514--520 (1952).

Aus der Augenldinik (Vorstand: Prof. Dr. J. B6CK) und dem Physiologisehen Institut (Vorstand: Prof. Dr. R. RIGLEI~) der Universit~t Graz.

Uber den Einflu~ der Pyrazolonderivate auf die Fluorescenz yon Farbstoffen.

Von

Z. :B(iCK u n d l { . ~{LINGENBERG.

Seit PAUL E~RLICI~ zeigte, dal3 in die Blutbahn gebrachtes Fluoreseein ills Kammerwasser des Auges fibertritt, haben zahlreiche Untersucher sich dieser Methode bedient, um damit den Flfissigkeitswechsel des Auges zu studieren. Aus den zahlreichen Versuchen ging hervor, dal~ nur das im Blur frei gelSste Fluorescein ins Kammerwasser fiber- tri t t , w~hrend der an das Plasma adsorbierte Anteil nur im sog. 2. Kammerwasser gefunden wird (FI~IEDEMA:N:N, DE I-~AAN und vAx CI~EVELI), SEIDEL, WESSELY U.a.). Die ursprfingliehe Meinung :EI~R- LlCaS, mit dieser Methode die wesentlichen Fr~geI1 des Flfissigkeits- weehsels des Auges beantworten zu kSnnen, ~mrde von HA~BUI~GER, LEBEI~, L6I~LEI~-, NICATI, W~SSELu U. a. dahingehend eingesehrankt, daft der ~Tbertritt des l~luorescein weitgehend den Gesetzen der Diffusion folgt. Allerdings betont dabei vor allem W~ssELu dab auf Grund seiner Befunde das Kammerwasser nieht als reines Fil trat ionsprodukt angesehen werden kSnne.

Erst der klinische Naehweis der Kammerwasservenen dureh AseHm~ und GOLD~IANN ermSglichte neue und aufschluBreiehe Untersuchungen fiber den Flfissigkeitsweehsel des Auges mi t Hi]fe des Fluorescein- fibertrittes. GOLDMANN konnte sogar damit das Minutenvolumen der menschliehen Vorderkammer best immen und zahlreiche bedeutsame Befunde bei normalen und glaukomatSsen Augen erheben.

Die physikalisch-chemisehen Gesetze des Farbstofffibertri t tes aus dem Blur ins Kammerwasser wurden in Erganzung frfiherer Unter- suchungen yon GAEDERTZ und WITTGE:NSTEYN, sowie F. P. FISCI~EI~ weit- gehend geklart. Sie fanden, dal~ negative, ge]5ste Farbstoffe aus dem Blur ins Kammerwasser gel~ngen kSnnen, positive, gelSste Farbstoffe jedoeh nieht fibertreten. Daneben spielt noch die TeilchengrS~e eine wichtige Rolle, wie ~. P. FlSCHm~ zeigte. Derselbe Autor gab auch an, d a]~ jene Farbstoffe, die infolge ihrer Ladung ins Kammerwasser fiber- treten, das Ciliarepithel nicht anfarben. Farbstoffe jedoch, welehe das Ciliarepithel anf~Lrben, kSnnen infolge ihrer Ladung nicht aus dem Blur ins Kammerwasser gelangen. Eine Diffusionskonstante jedoeh, die es

EinfluB der Pya~zolonderivate auf die Fluorescenz yon ~'arbstoffen. 515

ermSglichen wiirde den Farbstoffiibertritt rechnerisch festzulegen, kann, wie ebenfalls 1% B. FISCHER zeigte, nicht angegeben werden.

I-I~wBURG~R versuchte den Fluoresceinfibertritt ins Kammerwasser bei menschlichen Augen diagnostisch zu verwerten. L I ~ D ~ a und TttIEL untersuchten beim Glaukom den Farbstoffiibertritt. T ~ L teilt mit, dab auch allgemeine Erkrankungen den Fluoresceiniibertritt zu beein- flussen vermSgen. A3ISL]~ und Mitarbeiter entwiekelten dann ein Untersuchungsverfahren, mit dem der l ]bertr i t t des Fluorescein in die Vorderkammer des mensehlichen Auges bei vielen Augenleiden aber auch bei Allgemeinerkrankungen ohne klinisch nachweisbare Mitbetei- ligung des Auges untersucht wurde. Die Methode und die Deutung ihrer Ergebnisse blieben nicht unwidersprochen. So war es vor allem GOLD- ~A~N, der eine Reihe yon Bedenken vorbrachte, die bis jetzt nicht widerlegt wurden.

Es hat auch nicht an Versuchen gefehlt den I]bertri t t des Farbstoffes in das Kammerwasser medikamentSs zu beeinflussen, um so einen SchluB auf die Wirkungsweise bestimmter Medikamente ziehen zu kSnnen. So geben I~OSENOW und STARKENSTEIN an, dab der Fluoresceiniibertritt ins Kammerwasser aus dem Blur durch Calcium verzSgert wird, was sie mit der gefiiBdichtenden Wirkung des Calciums erkli~ren. Auch KIKAI erhob gleichartige Befunde.

B6CK, I~UNITZ und P o P ~ a untersuchten den Einflug des Pyrami- dons auf den Fluoresceintibertritt in das Kammerwasser, wobei sie fanden, dab Pyramidon und seine Derivate den Ubertr i t t des Farbstoffes in das Kammerwasser deutlich verzSgern. Die Wirkung des Pyramidons suchten die genannten Autoren dann noch dig Bestimmung des EiweiB- gehaltes im 2. Kammerwasser klarer zu zeigen, wobei sich ergab, dab durch Pyramidonpriparate der Eiweigiibertritt ins 2. Kammerwasser verzSgert wird. Dieser Einflug des Pyramidons kann nun sowohl auf die zentrale (E. P. PzcK) als auch auf die periphere (Ee~z~gv,~)Wirkung der Pyrazolonderivate zuriickgefiihrt werden.

STARKENSTEIN, sowie STARKENSTEIlg und WEDEN fanden, dag Ato- phan trotz seiner bekannten entztindungshemmenden Wirkung den Ubertr i t t des Fluoresceins in die vordere Augenkammer beschleunigt. Eingehende Studien der genannten Autoren ergaben, daft durch Atophan die elektrostatische Ladung der Gewebe geiindert wird, was den fiber- rasehenden Effekt zu erkliren vermag.

Diese Befunde lassen erkennen, dab die medikamentSse Beeinflussung des Farbstoffiibertrittes aus dem Blur h~s Kammerwasser yon verschie- denen Umst~nden und nicht nur yon der Wirkung des Medikamentes auf die Gefige abh~Lngt. So land YOSHIDA bei Dialysierversuchen mit in Blur gelSstem Fluorescein, dab dureh Zusatz yon Natriumcitrat die Adsorption des Fluoreseeins an die Plasmakolloide gelSst wird und so

516 J . B 6 c K u n d l-I. KLINOENBEI~G:

das Ultrafi l trat eine hShere Konzentrat ion aufweist als bei jenen Ver- suchen, we kein Citrat dem Blur zugesetzt worden war.

Es schien daher zweckm~i~ig zu untersuchen, ob auch andere Stoffe, vor allem Medikamente, wie das Pyramidon, die Bindung der Farbstoffe an die PlasmaeiweiBkSrper zu ~ndern vermSgen und so neben einer ~Tirkung auf die sog. Blutkammerwassersehranke auch dadurch den Farbstofff ibertr i t t beeinflussen kSnnen.

Es wurden daher zuerst die yon ~)n ttAA~ und vg_w C~wVELD bereits mitgeteil ten Versuehe fiber die Diffusion yon Fluorescein aus Serum in physiologische Kochsalzl6sung wiederholt, l~achdem dabei dieselben Ergebnisse erzielt wurden, wie die genannten Autoren sie erhalten hatten,

Tabelle 1.

0,1 rag- % Fluorescein gelSst in

A q u ~ d e s t . . . . . . A q u ~ d e s t . . . . . . A q u a d e s t . . . . . . 4 % i g e G e l a t i n e . . .

P y r a m i d o n rag- %

m

lo

10

Nova lg in Fluorescenz rag- % %

i - - [ 100 - - 42 10 47 - - s e h r s c h w a c h ,

n i c h t m e B b a r

wurden die gleichen Versuche nach Pyramidonzusatz angestellt. Es t ra t dabei der fiberraschende Effekt auf, dab naeh Zusatz yon Pyramidon oder Novalgin zum Serum-Fluoresceingemisch die Fluorescenz der Probe deutlich geringer wurde. Im Dialysat konnte der gleiehe Befund erhoben werden. Untersuehte man dieselbe L6sung mit oder ohne Pyramidon- zusatz nieht im auffallenden sondern im durehfallenden Licht, so war es nieht m5glich, eine Differenz im Farbstoffgehalt festzustellen. Eine Anderung der Bindung des Farbstoffes an die Plasmaeolloide dureh das Pyramidon bzw. Novalgin konnte damit ausgeschlossen werden.

Der Fluoresceingehalt der Proben wurde mit Hilfe des PULF~ICH- schen Stufenphotometers best immt, naehdem vorher eine Eichkurve ermit tel t worden war. Verwendet man dabei das Filter S 47 und 10 m m Schichtdicke, so kSnnen Werte yon 0,01--10 rag-% Fluorescein mi t der gefundenen Eichkurve ohne Schwierigkeiten ermittel t werden. Ffir den Bereich yon 0,01--1 rag-% gilt das LAMB~RT-B~E~sche Gesetz. Bei kleinen Flfissigkeitsmengen wurden Mikrocuvetten mit 0,4 ml InhMt verwendet. Da ffir die noch zu besprechenden Versuehe mi t Kammer- wasser in der l~egel nur 0,2 ml Xammerwasser zur Verfiigung standen, mul~te das fehlende Volumen durch Zusatz einer 0,9%igen KochsMz- 15sung erggnzt werden. Es sei nebenbei erw~hnt, dab die Konzentra- tionen bei u nseren Versuchen durchwegs im Geltungsbereich dos LAM- : B E R T - : B E E R s c h e n Gesetzes lagen.

Einflul~ der Pyrazolonderivate uuf die Fluorescenz yon Farbstoffen. 517

Um sich fiber das AusmaB der bei den Versuchen gefundenen Wirkung des Pyramidons auf die Fluorescenz orientieren zu kSnnen, wurden nachfolgende Proben angesetzt, die in Tabelle 1 wiedergegeben sind, wobei die Fluorescenzminderung im Ultraviolett so bestimmt wurde, dab eine LSsung yon 0,1 mg-% Fluorescein in destflliertem Wasser mit gleich starker FluoresceinlSsung nach Zusatz yon Pyramidon oder Nov- algin vergIichen wurde. Dabei ist die Fluorescenz der Vergleichsl6sung der Einfachheit halber mit 100% angenommen worden.

Wie aus der Tabelle 1 ersichtlich ist, vermindert Pyramidon und Novalgin die l~luorescenz des Farbstoffes auBerordentlich eindrucksvoll.

Bei Versuchen mit Gelatinel6sung, der Fluorescein zugesetzt wurde, konnte nur bei Tageslieht eine stark abgeschwgchte grfinliche Fluorescenz

Tabelle 2.

Se rum-F luo re sce in P y r a m i d o n in X o n z e n t r a t i o n

r a g - % r a g - %

2,5 2,5 2,5 0,25

N o v a l g i n

]lag- %

1

~lnoresce in i m Dialysat

mg-%

0,13 0,13 0,13

Yluorescenz

%

100 20 21

erkannt werden, wahrend im Ultraviolett die blguliche Fluorescenz der Gelatine vorherrschend war.

Bei gleichartigen Versuchen vermochten Antipyrin, Amidopyrin und Natrium salicylicum die Fluorescenz des Fluorescein in wgBriger L5sung deutlich abzuschwgchen. Calciumsalze jedoch beeinfiuBten die Fluores- cenz nicht. Durch Pyramidon wird auch die Fluoreseenz anderer Farb- stoffe vermindert, wie Versuche mit Fuchsin, Neutralrot, Xongorot nnd !VIagdalenrot ergaben.

In weiteren Versuchsreihen wurde Serum mit Fluorescein versetzt und dann mit und ohne Zusatz yon Pyrazolonderivaten gegen eine 0,9%ige Kochsalzl6sung dialysiert, wobei sowohl die Fluoresceinkonzen- t rat ion als auch die Fluorescenz der AuBenlSsung bestimmt wurde.

Tabelle 2 gibt die Ergebnisse eines typischen Versuches wieder. Auch hier wurde die Fluorescenz der AuBenlSsung ohne Pyramidonzusatz mit 100% angenommen.

Die Fluoreseeinkonzentration im Dialysat stimmte mit den yon DE t taaN und vAx C~V~LD erhobenen Befunden fiberein. Die EiweiB- freiheit der Dialysate wurde mit Sulfosalicylsgure kontrolliert.

Es war nur noch zu priffen, ob dieselbe Wirkung der Pyrazolon- derivate auch in vivo nachweisbar ist. Zu diesem Zwecke wurden Kaninchen in Abstgnden yon je 2 Std 0,5 ml einer 50%igen Novalgin- 15sung subcutan injiziert. Insgesamt wurden dabei 2 ml gegeben. 90 min

518 J. BOcK und t-I. KLINGENBERG:

naeh dieser Vorbehandlung wurden 0,05--0,5 ml einer 5 % igen Fluorescein- IqatriumlSsung je Kilogramm KSrpergewicht intraven6s injiziert. Eine Stunde naeh der Fluoreseeininjektion wurde die Vorderkammer in CocainanEsthesie punktiert und der Fluoresceingehalt im durehfallenden Licht in der oben geschilderten Weise bestimmt. Einige Male wurde auch das 2. Kammerwasser entnommen und untersucht. Von quanti- tat iven Messungen der Fluorescenz mul3te wegen der geringen zur Ver- fiigung stehenden Kammerwassermenge Abstand genommen werden. Die Fluorescenzabsehw~chung wurde derart festgestellt, dal3 nach Bestimmung des Fluoresceingehaltes in der Kammerwasserprobe eine wEBrige LSsung g]eicher Fluoresceinkonzentration hergestellt wurde.

~ w

K6rper- Tier gewicht l~Tr" kg

209 2,6

207 2,7 210 2,7 211 1,6 208 1,6

Fluorescein i.v. I n l .

0,15

0,15 0,15 0,75 0,75

Tabelle 3.

Fluoresceingehalt in rag-%

1. K W li.

0,13

0,13 0,13 0,34 0,33

1. K W re.

0,II

0,13 0,13

2. K W

0,80 0,53 0,80 1,00

Fluorescenz

stark ab- geschw~cht

desgl.

Diese wurde mit der Probe im Ultraviolett verglichen. In allen Fs fand sich dabei eine betrKcht]iche Minderung der Fluorescenz des Kammerwassers. In der Tabelle 3 sind die Versuche wiedergegeben, die dabei erhalten wurden.

Das Ergebnis der mitgeteilten Versuche l~Bt sich wohl nur so er- kliiren, dab dureh das Novalgin die Fluorescenz des verwendeten Farb- stoffes, in unseren F/~llen des Fluoreseeins, vermindert wurde. Es blieb ngmlich nach Zusatz yon Pyramidon, bzw. Novalgin die Fluorescein- konzentration in den versehiedensten L6sungsmitteln, wie destilliertem Wasser, Serum, Kammerwasser des Auges und Gelatine unbeeinflugt, wie die Photometrie ergab. Die Fluorescenz jedoch wurde in allen diesen LSsungsmitteln dutch die zugesetzten Pyrazolonderivate abge- schwKcht, wie beim Vergleieh im Ultraviolett gesehen werden konnte. Diese Wirkung des Pyramidons trlt t , wie einige orientierende Versuche ergaben, nicht nur beim Fluorescein, sondern auch bei einigen anderen Farbstoffen ein.

Aueh ist nach diesen Befunden mit groBer Wahrscheinliehkeit anzu- nehmen, dab Pyrazolonderivate, in unseren Versuchen das Novalgin, durch die sog. Blutkammerwasserschranke durchtreten k6nnen, was mit unseren bisherigen Kenntnissen fiber die Permeabilit~t der Blutkammerwasserschranke ffir gelSste Substanzen fibereinstimmt, da

EinfluB der Pyrazolonderivate ~uf die Fluorescenz yon Farbstoffen. 519

die Py razo londe r iva t e ein Molekulargewicht von e twa 300 h a b e n und wie das Nova lg in in ihrem wi rksamen Bes tand te i l als Anion vorl iegen.

Nach den mi tge te i l t en E x p e r i m e n t e n is t es daher unerl/s diesen Ef fek t bei Versuchen zu ber i icksieht igen, die den Einflu[~ yon Medi- kamen ten , speziell des P y r a m i d o n s und seiner Der iva te , aber auch des Ant ipyr ins , Amidopyr ins , Atophans , N a t r i u m sa l ieyl icum und wahr- scheinlieh noch anderer P h a r m a k a auf den S tof faus tausch zwisehen B lu t und Gewebe m i t Hilfe yon f luoreseierenden Subs tanzen prfifen.

Es geni igt dabei n ich t die EHRnic~sehe Linie in der Vorde rk~mmer des Kan inehenauges zu be t r ach t en oder die F g r b u n g des K a m m e r w a s s e r s an der Spa l t l ampe zu beobachten . Man mul~ v ie lmehr t r a c h t e n das K a m m e r w a s s e r aueh im durchfa l lenden L ieh t zu pho tomet r i e ren , u m zu vermeiden, dab Effekte , wie sie oben ana lys i e r t wurden, eine un- r icht ige Farbstoffkonzentra%ion vor t~uschen k5nnen. Vielfach wird es sich n i eh t umgehen lassen andere Methoden heranzuziehen, u m in den Stoff~ustausch zwischen Blur und Gewebe einen k la ren E inb l i ck zu gewinnen.

Diese W i r k u n g von Med ikamen ten auf die F luorescenz is t auch d a n n zu beachten , wenn der Fa rbs to f f t i be r t r i t t ins K a m m e r w a s s e r zu kl inisch d iagnos t i schen Zwecken un te r such t wird oder aber die l~esorpt ion des Fa rbs to f fes aus dem Gewebe gepr i i f t werden sell.

Zusammen/assung. 1. Durch Zusa tz yon Py razo londe r iva t en zum Serum wird die

B indung f luorescierender Fa rbs to f fe an die Serumkol lo ide n ich t be- einflul3t.

2. D u t c h den Zusa tz von Pyrazo londe r iva t en , abe r auch yon An t i - pyr in , Amidopyr in , A tophan und N a t r i u m sa l icyl icum wird die F luo - rescenz des Fluoresce in wei tgehend abgeschw/~cht.

3. Dieser Ef fek t t r i t t n ich t nur in v i t ro sondern auch in r i v e auf, wie Versuche am K a m m e r w a s s e r des K~ninehens zeigen.

Literatur. A~SLER, M., u. A. HU~E~: Graefes Arch. 149, 578 (1946). - - Op.hthalmologica

111, 155 (1946). - - AMSL~, M., A. HvB~R u. F. V]~BREY: Sehweiz. reed. Wschr. 1947, 1321. --ASCnER, K. W.: Amer. J. Ophthalm. 25, 31, 1174, 1309 (1942); 27, 1074 (1944). - - Arch. Ophthalm. 42, 66 (1949). - - BbCK, J., It . KAv~ITZ u. H. PoPP~.R: Arch. exper. Path. u. Pharmakol. 179, 170 (1935). --EmzLiC~, P.: Dtsch. reed. Wschr. 1882, 35. - - : E P P I N G E R , H., H. KAUNITZ 11. I-~. POPPER: Die serSse Entziindung. Wien: Springer 1935. --FlSCJ~]Sl~, F. P.: Arch. Augenheilk. 100/101, 480 (1929); 103, 554 (1930). - - FmS, DV.~ANN, U. : OPP~v,I~ERS Hand- buch der Biochemie, Bd. 1~I/2, S. 282. 1909. - - GAXl)ERTZ, A., u. A. WI~TOEN- STEIN: Graefes Arch. 119, 296 (1929). - - G O L D M A N N , H.: Ophthalmologica 102, 7 (1941); 114, 240 (1947); 117, 240 (1949); 118, 496 (1949); 119, 65, 267 (1950); 120,

520 J. BScK: Einflul~ der Pyr~zolonderivate auf die Fluorescenz yon Farbstoffen.

150 (1950). - - T r a n s . Oph~hatm. Soc. U. Kingd. 69, 455 (1950). - - Documenta ophthalm. 5/6, 278 (1951). - - HAAs, J . DE, U. S. vA~ CRnVELD: Biochem. Z. 124, 172 (1921). - - HA~BVRGE~, C. : FAin. Mbl. Augenheilk. 48, 73 (1910). - - H v B ~ , A., u. J . WALC~: Dermatologica 98, 242 (1949). --Iz~KAI, K. : Arch. Augenheilk. 104, 134 (1931).--LEBen, T~.: Ber. dtsch, ophthalm. Ges. 24, 83 (1895). - - D i e Ern~hrungs- u. Zirkulationsverh~ltnisse des Auges. In Handbuch der gesamten Augenheilkunde yon GRAE~-SAE~ISC~, 2. Aufl., Bd. II . 1903. --LII~DNER, K.: Bet. dtsch, ophthalm. Ges. 4~, 33 (1921). - - L 6 ~ m ~ , W. : Arch. Augenheilk. 65, 318, 417 (1910). - - i~ICATI, W.: Arch. d '0phtalm. ]0, 81 (1890); l l , 24 (1891). - - PICK, E. P. : Zit. n~ch S. H. A v E ~ V c K , Arch. exper. Path. u. Pharmakol, 157, 332 (1930). - - Ros~Now, G. : Z. exper, i~ed. 4, 426 (1916). - - S~n)]~L, E. : Graefes Arch. 113, 347 (1924). - - S ~ K n ~ S T ~ , E. : Mtinch. reed. Wschr. 1919, 205. - - BE~mE-BE~r Handbuch, Bd. XI I I , S. 382. 1929. - - S~ARKE~S~nV, E., u. H. Wv.DE~: Biochem. Z. 234, 205 (1931). - - T ~ L , R.: Klin. Mbl. Augenheilk. 68, 224 (1922); 70, 766 (1923). - - Graefes Arch. 113, 347 (1924). - - WESSELu K. : Erg. Physiol. 4, 565 (1905). - - u u : Arch. Augenheilk. 100/101, 470 (1929).

Prof. Dr. J. B6OK, Gr~z, Univ.-Augenklinik, Auenbruggerplatz 4, und Dr. H. KLINGENBE~G, Graz, Physiologisches Insti tut der

Universit~t, I~arruchgasse 21.