Aus der Medizinischen Akadernie in Warschau, Sanitats-Hygienisches Studiurn, Abteilung fur Ernahrungshygiene

Uber den EinfluB der Verabreichungsweise von Vitamin D und von Calcium auf den Verlauf der Ossifikation bei Ratten

ZOPIA KLIMCZAK

Trotz breiter Anwendung von Vitamin D in Prophylaxe und Therapie ist bis jetzt noch nicht entschieden, welche Verabreichungsweise optimal ist, die Verab- folgung von kleineren Dosen iiber langere Zeit hin oder die von groljeren Dosen, die notigenfalls wiederholt werden konnen. Es fehlen auch gesicherte Angaben uber die beste Art der gleichzeitigen Calcium-Zufuhr. Bei Untersuchungen an rachitischen Ratten, denen markiertes Calcium1 verabreicht wurde, erhielt man Ergebnisse, aus denen man den SchluS ziehen kann, daf3 die Verabreichungsweise von Vitamin D einen EinfluS auf den Verknocherungsgrad nicht ausiibt. Langjahrige klinische Er- fahrung zeigt, daLi bei langerem Angebot kleinerer Menge des Vitamins sowie bei an- gepaoter Calcium- und Phosphor-Zufuhr in der Diat Bedingungen geschaffen wer- den, die den normalen Verlauf der Ossifikation sichern. Bei der Verabfolgung des Vitamins aber in der Form von sogenannten StoSdosen sind folgende Moglichkeiten in Betracht zu ziehen :

I. Das Vitamin D wird in Geweben abgelagert ; in diesem Falle wird eine langsame Wirkung mit guten Ergebnissen beobachtet ;

2. wegen ungeniigender Zufuhr von Calcium und Phosphor tritt der erwartete Effekt nicht ein ;

3. die erforderlichen Mineralstoffe werden aus eigenen Geweben bezogen, evtl. von einen Ort zum anderen verschoben, was nicht mit einem vollen therapeu- tischen Ergebnis gleichbedeutend ist.

Beim Angebot van Vitamin D zeigt sich also, daf3 man seither zu wenig Aufrnerk- samkeit den komplexen Bedingungen gewidmet hat,unter denen es zur Wirkung gelangt bzw. gelangen kann. Vor allen Dingen handelt es sich um folgende Fest- stellungen :

I. die Normierung der Calcium- und Phosphormengen '43;

2. das gegenseitige Verhaltnis der beiden Stoffe usw.

HURNI, H. , W. MINDER u. T. GORDONOFF, Int. 2. Vitarninforsch. 28, 68 (1957).

NICOLAYSEN, R., Acta physiol. scand. 36, 114 (1956). * GERSHOFF, S. N., M. A. LEGG u. D. M. HEGSTED, J. Nutrit. 64, 303 (1958).

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Diese Probleme werden in der Literatur immer wieder erortert, und vicle Arbeiten befassen sich mit der Rolle von Vitamin D im Organismus4, seiner Verabreichungs- weise5@ und seiner Relation zum Calcium- und Phosphorumsatz; sie erschopfen jedoch nicht die ganze Frage. Die vorliegende Arbeit hat sich die Beantwortung folgender Fragen Zuni Ziel gesetzt:

a) Wie gestaltet sich die Abhangigkeit zwischen der Hohe der Zufuhr an Calcium, seiner Resorption und der Verknocherung ?

b) Welchen EinfluB ubt darauf die Menge an Vitamin D und seine Verabrei- chungsweise aus ?

c) Wie gestaltet sich unter den obwaltenden Bedingungen die chemische Zu- sammensetzung der Knochen ?

Plan der Versuche Die Versuche werden an weil3en Ratten angestellt, die aus der Zucht der Anstalt

fur Ernahrungshygiene beim Staatlichen Institut fur Hygiene stammen. Die Ratten - Durchschnittsgewicht von 60-100 g - stammen von Muttertieren, die auf ciner Grunddiat geziichtet worden sind. Dieser Kost wird der Lebertran und das FIeisch- und Knochenmehl entzogen. Der Calciumgehalt aber wird anderweitig auf das ubliche Niveau der Grunddiat gebracht. Unter diesen Bedingungen kann die Nachkommenschaft nicht uber groDere Vorrate an Vitamin D in den Geweben verfugen. Auch die jungen Ratten erhalten die gleiche Kost - und zwar von ihrer Geburt an bis zum Beginn der Untersuchung. Dann wird die Diiit geandert. Dic von nun an verabreichte Grunddiat enthalt wenig Calcium (o,07yO) und wenig Phosphor (0,13) %, berechnet auf die Trockensubstanz. Diese Kost hat folgende Zusammensetzung : Trockenfleisch 15, Gluten 10, Kartoffelflocken 20, Starke 20,

Pflanzenol 6, Zucker 28, Mineralsalzmischung o,8yo. Abhangig von der verab- reichten Menge des Calciums werden die Tiere in drei Gruppen zu je 27 Stuck geteilt :

Die Gruppe I bekommt die oben angefuhrte Kost oline zusatzliches Calcium ; das Verhaltnis Ca:P betragt 0,55.

Die Gruppe I1 erhalt neben der Diat zusatzlich 30 nig Calcium taglich; das Ver- haltnis Ca:P stellt sich auf I,I.

Der Gruppc 111 werden neben der Diat 70 mg Calcium taglich verabreicht; hier betragt das Verhaltnis Ca: P gleich 1,2.

Uber die Einteilung der Tiere wahrend der Untersuchung unterrichtet Tab. I. Das Calcium wird den Tieren in Form von Calciumcarbonat mit Hilfe einer Magen- sonde verabreicht. Urn das Verhaltnis Ca:P auf konstantem Niveau - bei etwa I - zu erhalten, wird der Gruppe I1 und I11 in der Diat aul3erdem zusatzlich Phosphol in der Form von sek. Kaliumphosphat verabfolgt. Zur Anpassung der Versuchstiere

CRAMER, J. W., u. H. STEENBOCK, Arch. Biochem. Biophysics 63, g (1956). CARLSSON, A. u . B. LINDQUIST, Acta physiol. scand. 35. I (1953). BALUKIEWICZ, J. u. J. RUDOWSKA, Pediatria Polska 26, 1132 (1951).

Vitamin D und Calcium bei Ossifikation 349

an die Diat und an die veranderte Calciumzufuhr erhalten alle drei Gruppen ihre Kostform (mit den erwahnten zusatzlichen Mengen an Calcium im Falle von Gruppe I1 und 111) 6 Tage lang verabreicht. Nach dieser Zeit wird das Vitamin D angeboten und damit beginnt die eigentliche Versuchsperiode. Jede der 3 Gruppen wird in 3 weitere Gruppen unterteilt, und zwar in die sogenannten A, €3, C-Untergruppen - je nach der Art und Weise sowie der Menge des den Versuchstieren verabfolgten Vitamins D (Tab. I). In jeder Gruppe der Ratten rnit dem angegebenen Calcium- niveau erhalt die Untergruppe A iiberhaupt kein Vitamin D und gilt als Kontroll- gruppe; die Untergruppe B erhalt 25 I. E. an Vitamin D uiid o , ~ ml 01 mit Hilfe einer Magensonde taglich verabreicht ; die Untergruppe C erhalt am ersten Tage der eigentlichen Versuchsperiode mittels Sonde einmalig 250 I. E. an Vitamin D. Diese einmalige Dosis von 250 I. E. wahrend einer g Tage langen Versuchsperiode ist fast so hoch wie die Menge an Vitamin D, die vielmalig verabreicht wird, nHmlich g x 25

I. E. Das herangezogene Vitamin (Vitamin D,) ist polnischer Produktion; seine WirksamkAt ist mit Hilfe der biologischen Methode in der Ernahrungsabteilung des Staatlichen Instituts fur Hygiene bestimmt worden. Die Versuchstiere werden in metabolischen Kafigen gehalten. Die Aufnahme an Futter wird taglich kontrol- liert. Kot und Harn sind von jeder Untergruppe getrennt gesammelt worden.

Die eigentliche Untersuchung dauert g Tage lang. Nach Ablauf dieser Zeit wer- den die Ratten eingeschlafert, getotet und die Schenkelknochen prapariert ; letztere werden mit Athanol im Soxhlet-Apparat extrahiert, weiterhin getrocknet bis zum konstanten Gewicht und dann verascht ; man bestimmt den Gehalt an Calcium. Der gesammelte Kot und der Harn werden gleichfalls getrocknet bzw. eingedampft und zur Ermittlung des Calciumgehaltes verascht.

Metkoden und Ergebnisse Die Bestimmung des Calciums im Kot, Harn und Knochen wird mit Hilfe der

Osalsauremethode ausgefiihrt ; zurTitration wird O,OI n-KMn0,-Losung verwendet. Die analytischen Ergebnisse sind in Tab. I dargestellt. Die 3. Rubrik der Tab. I enthalt Angaben iiber die Verabreichungsweise des

Vitamins D, die 4. erlautert die tagliche Calciumeinnahme, die 5. die im Kot und Harn ausgeschiedene Calciummenge, die 6. und 7. die Menge des ausgenutzten Cal- ciums. Die Rubriken 8-10 geben den Prozentgehalt an Asche und an Calcium in der Trockensubstanz der Schenkelknochen an sowie den Calciumgehalt in der Asche.

Wahrend der Untersuchungen ist die Abhangigkeit zwischen dem Verabrei- chungsniveau des Calciums und seiner Ausnutzung durch die Ratten sehr deutlich hervorgetreten. Je mehr Calcium den Tieren verabreicht wird, desto mehr Calcium wird im Organismus retiniert. Bei unterschiedlicher Mengc an verabreichtem Cal- cium wird eine konstante Ausnutzungsgrenze durch die Ratten nicht festgestellt, iiber die hinaus der gesamte CalciumuberschuS ausgeschieden wird. In der Gruppe I ,

350 KLIMCZAK

Tabelle I

Die Ausnutzung des Calciums bei verschiedener Calciumzufuhr und verschiedener Verabreichungs- weise von Vitamin D bei Ratten

I Unter- ~ P P C

2 - A

B C

A B C

A B C

Vitamin D,

I.E. 3

0

25 taglich 250 einmalig

0

25 taglich 250 einmalig

0

25 taglich 250 einmalig

auf I Ratte taglich

Ca-Aus- nutzung

% 7

~ $ 9 88,6

86,x

64,6

83,0

74*9

48,9

57>5 49.7

I Gehalt in der Trwkensubstanz der Verbiillnis

Schenkelknochens Asche: Ca

bei der die Calcium-Einnahme in den Untergruppen A, B und C 6,ro bzw. 6,95 bzw. 7,27 betraigt, werden an Calcium taglich retiniert 518 bzw. 6,16 bzw. 6,26 mg. Die Untergruppen der Gruppe I1 erhalten taglich 37,go bzw. 36,50 bzw. 37,go mg je I Tag und retinieren 24.50 bzw. 30,30 bzw. 28,40 mg. Die Gruppe I11 nimmt 78,30 bzw. 77,50 bzw. 78,40 mglTag an Calcium auf und retiniert dabei 38,30 bzw. 44,60 bzw. 3g,oo mg (Tab. I, 4. und 6. Rubrik). Diese absoluten, durch die Ratten retinierten Mengen an Calcium gehen nicht parallel mit den Ausnutzungsprozenten. Je mehr Calcium verabreicht wird, desto niedriger gestaltet sich seine Ausnutzung. Dieser Prozentsatz, der fur die Gruppe I mit dem niedrigsten Calciumniveau 84,9 bzw. 88,6 bzw. 86,r betragt, senkt sich mit dem Ansteigen der Zufuhr und in der Gruppe 111, die am meisten Calcium erhalten hat, macht er 48,g bzw. 57,s bzw. 49.7% aus; die absolute Menge des retinierten Calciums ist also im Falle einer groBcn Verabreichung erhoht, der Ausnutzungsprozentsatz aber erniedrigt.

Weiterhin interessiert die Frage, wie das Vitamin D auf die Calcium-Resorption und die Knochenverkalkung einwirkt ; es galt zu untersuchen, welchen EinfluB die verschiedene Verabreichungsweise ausubt. Vitamin D vergroBert die Calcium- Resorption bei jedem Verabreichungsniveau. Tiere - aus allen drei Gruppen - denen das Vitamin verabreicht wird, halten stets mehr Calcium zuruck als diejenigen ohne Vitaminangebot. Diese Wirkung macht sich in der Gruppe I - kleinste Calcium-Zufuhr - am wenigsten bemerkbar; dies bedeutet, daB bei zu kleinem Calcium-Angebot dieser Stoff gut ausgenutzt wird, und zwar ohne Rucksicht auf die Anwesenheit von Vitamin D.

Vitamin D und Calcium bei Ossifikation 35 1

In der Gruppc I1 ist der EinfluB des Vitamins D auf den Ausnutzungsgrad des Calciums am starksten. In der Gruppe I11 dagegen, bei der die Calcium-Verab- reichung iibersteigert hoch ist, wird eine Herabsetzung der Vitamin-D-Einwirkung auf den Ausnutzungsgrad des Calciums manifest.

Bei allgemein erhohter Calcium-Ausnutzung - in Anwesenheit von Vitamin D - bcsteht in jeder einzelnen Gruppe eine Abhangigkeit zwischen der GroBe des Aus- nutzungsgrades und der Verabreichungsweise des Vitamins. Diese Abhangigkeit ist in den Gruppen I1 und I11 augenfallig. In der Gruppe I1 wird das Calcium durcli die Ratten, denen das Vitamin D wiederholt in kleinen Mengen verabreicht worden ist, am besten ausgenufzt (zu 83,0% bei B-Untergruppe) ; schlechter ist die Verwer- tung in der Untergruppe C (zu 74,9%), bei der einmalig eine StoBdosis dieses Vita- mins verabfolgt worden ist; am schlechtesten ist der Effekt (zu 64,6%) bei den Rat- ten der Untergruppe A, die kein Vitamin erhalten. In der Gruppe I11 wird das Cal- cium am besten durch die Tiere der Untergruppe B ausgenutzt (zu 57,5%), die wiederholt Vitamin D erhalten ; bei Tieren aber, denen eine StoBdosis bzw. denen gar kein Vitamin verabfolgt worden ist, stellt sich die Ausnutzung des Calciums fast gleich hoch ein (zu 48,g bzw. 49,7%). Die Ergebnisse sind in Abb. I und z gra- phisch dargestellt.

700 - Yo

90

80

70

60 - 50 - 40-

30

20

70 -

-

-

-

- -

I A B C

Abb. I. Calciumausnutzung in Prozenten bei verschiedenem Calciumniveau und bei verschiedenerVerabreichungsweise von Vitamin D

Gruppe I : tagliche Ca-Einnahme von 6,10 bis 7,z7 mg Gruppe I1 : tagliche Ca-Einnahme von 36,50 bis 37,go mg Gruppe 111: tagliche Ca-Einnahme von 77,50 bis 78,40 mg

Untergruppe A : ohne Vitamin D Untergruppe B: mit taglich 25 I.E. Vitamin D Untergruppe C: mit einmalig 250 I.E. Vitamin D

352

'0C ''g 90

80

70

60

50

40

30

20

70

- -

- -

-

- -

-

-

- I

A 0

KLIMCZAK

-

Abb. 2 . Calciumausnutzung in Prozenten bei verscniedener Verabreichungsweise von Vitamin D und bei verschiedener Calciumeinnahme

Gruppe I : tagliche Ca-Einnahme von 6,ro bis 7 , q mg Gruppe I1 : tagliche Ca-Einnahme von 36,50 bis 37,gO mg Gruppe 111: tagliche Ca-Einnahme von 77.50 bis 78,40 mg

Untergruppe A: ohne Vitamin D Untergruppe B: mit taglich 25 I.E. Vitamin D Untergruppe C : mit einmalig 250 I.E. Vitamin D

Eine erhohte Calciumeinnahme kommt im gewissen MaRe auch in der chemischen Zusammensetzung der Knochen zum Ausdruck. So werden der Asche- und der Calcium-Gehalt in der Trockensubstanz des Schenkelknochens mit der Zunahme des durch die Ratten retinierten Calciums (Tab. I, Rubrik 8 und g sowie Abb. 3 und 4) eindeutig erhoht.

Der EinfluR der Verabreichungsweise des Vitamins D auf den Asche- und Cal- cium-Gehalt der Knochen ist dagegen nicht bedeutend. Man kann eigentlich nur von der Tendenz sprechen in der Richtung, daR der Calcium-Gehalt der Asche bei den Tieren, die Vitamin D verabreicht bekommen, erhoht ist. Dieser Effekt macht sich bei den Ratten, die mittlere oder hohere Calciummengen verabreicht bekom- men, eher bemerkbar als bei denen, die auf kleinste Calcium-Einnahmen gesetzt sind. Es wird aber eine Abhangigkeit zwischen dem Anstieg des Asche- und Calcium- Gehalts in den Knochen und der Verabreichungsweise des Vitamins D nicht fest- gestellt (Tab. I, Rubrik 8 und 9).

Nach der Ermittlung des Calcium-Gehaltes in der Asche des Schenkelknochens behauptet sich dieser auf einem fast konstanten Niveau (bei ca. 36-37%), unab- hiingig von der verabreichten Menge an Calcium und an Vitamin D. Der Gehalt

Vitamin D und Calcium bei Ossifilration 3 53

A@e /o

55 -

50 -

45 -

40 -

I A B C X A 6 C 35

Abb. 3. hschegchalt in Prozenten in der Trockensubstanz der Knochen Gruppe I : tagliche Ca-Einnahme von 6,10 bis 7.27 mg Gruppe I1 : tagliche Ca-Einnahme von 36,50 bis 37.90 mg Gruppe 111: tagliche Ca-Einnahme von 77,50 bis 78,40 mg

Untergruppe A: ohne Vitamin D Untergruppe B: mit taglich 25 I. E. Vitamin D Untergruppe C: mit einmalig 2.50 I. E. Vitamin D

Abb. 4. Calcium in Prozenten in der Trockensubstanz der Knochen Gruppe I : tagliche Ca-Einnahme von G , I O bis 7,27 mg Gruppe I1 : tagliche Ca-Einnahme von 36,50 bis 37,go mg Gruppe 111: tagliche Ca-Einnahme von 77,50 bis 78,40 mg

Untergruppe A: ohne Vitamin D Untergruppe B: mit taglich 25 I. E. Vitamin D Untergruppe C: mit einmalig 250 I. E. Vitamin U

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des ersteren bei der Versuchsgruppe mit dem niedrigsten Calcium-Niveau und ohne Vitamin D (34,12%) sowie derjenige bei Tieren der Gruppe mit dem hochsten Cal- cium-Niveau bei gleichzeitiger Verabreichung des Vitamins D (39,57%) machen hiervon eine Ausnahme.

Zusammenfassung

Systematische Untersuchungen an 3 Gruppen weiBer Ratten, die mittels Diaten ohne Vitamin D bzw. mit Verabfolgung unterschiedlicher Mengen an Calcium gefiittert worden sind, und denen wahrend der Untersuchung Vitamin D in verschiedenen Mengen und verschiedener Weise vcr- abreicht wurde, fiihren zu folgenden Ergebnissen.

I . Mit der Erhohung der verabreichten Menge an Calcium vergroBert sich die Retention. 2. Vitamin-D-Zusatz erhoht die Verwertbarkeit des Calciums, wobei der Ausnutzungsgrad von

der verabfolgten Menge an Calcium abhangt. 3. Die Verabreichungsweise von Vitamin D iibt einen EinfluB auf den Grad der Calcium-Aus-

nutzung aus; sie ist am groaten bei einer vielmaligen Verabreichung von Vitamin D, in Dosen je 25 I.E. tiglich; dieser Effekt ist bei jeder Calciumdosierung bemerkbar.

4. Der Anstieg im Gehalt der Schenkelknochen an Asche und Calcium hangt in erster Linie von der Ausnutzung des Calciums ab.

5 . Der Zusatz von Vitamin D verursacht bei den einzelnen Versuchsgruppen nur einen kleinen Anstieg im Gehalt an Asche und Calcium in der Trockensubstanz der Schenkelknochen; eine Einwirkung der Verabreichungsweise des Vitamins auf die analytischen Werte wird nicht beob- achtet.

S u m m a r y

Systematic investigations of 3 series of white rats fed by diets without vitamin D but with

1. By increasing the dispensed quantity of calcium the retention becomes larger. 2. Addition of vitamin D advances the utilization of calcium whereat the degree of utilization

depends on the delivered amount. 3. The manner of dispcnsing vitamin D is affecting the degree of calcium utilization. The latter

is largest when vitamin D, is delivered frequently in daily doses of 25 I. E. (international units) each; this effect is appearing at every dosage of calcium.

4. The increased content of ash and calcium in thigh bones depends in the first place on the utilization of calcium.

5. At the particular test sets addition of vitamin D, is only causing a slight increase of ash-and calcium content in the dry substance of the thigh bones. No influence of the mode of dispensing the vitamin upon the analytic values has been observed.

different doses of calcium give the following results :

Vitamin D und Calcium bei Ossifikation 355

Zofia KLIMCZAK, Medizinische Akademie in Warschau, Sanitats-Hygienisches Studium. Abteilung fur Ernahrungshygiene, Warszawa I 2 , Chocimska 24, Polen.

Eingegangen 25. I. 1960