Upload
trantram
View
255
Download
9
Embed Size (px)
Citation preview
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
Validasi Metode Analisis Etil p-metoksisinamat dalam
Plasma secara In Vitro menggunakan Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (KCKT)
SKRIPSI
ANI KURNIAWATI
1112102000042
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
JULI 2016
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
Validasi Metode Analisis Etil p-metoksisinamat dalam
Plasma secara In Vitro menggunakan Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (KCKT)
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi
ANI KURNIAWATI
1112102000042
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
JULI 2016
v
ABSTRAK
Nama : Ani Kurniawati
Program Studi : Farmasi
Judul Skripsi : Validasi Metode Analisis Etil p-metoksisinamat
dalam Plasma secara In Vitro Menggunakan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
Etil p-metoksisinamat (EPMS) merupakan salah satu metabolit sekunder yang
terdapat pada tanaman kencur (Kaempferia galanga. L) dari family Zingiberaceae.
Senyawa ini memiliki aktivitas farmakologinya sebagai antiinflamasi dan
analgesik. Tujuan penelitian ini adalah memperoleh optimasi kondisi analisis dan
metode yang tervalidasi untuk analisis EPMS dalam plasma secara in vitro
menggunakan KCKT dengan Diode Array Detector (DAD). EPMS diekstraksi
dari plasma dengan metode pengendapan protein menggunakan metanol. Metanol
dimasukkan ke dalam plasma dengan perbandingan 4:1 kemudian divortex selama
20 detik, dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Analisis
dilakukan dengan isokratik pada kolom C18 fase terbalik Acclaim®
Polar
Advantage II (4,6 x 150 mm, 3µm) dan fase gerak metanol-aquabidestilata
(60:40v/v) pada laju alir 1,0 mL/menit. Deteksi dilakukan pada panjang
gelombang 308 nm dan volume penyuntikan 20 µL. Pada rentang konsentrasi
2,02-40,4 µg/mL dihasilkan kurva kalibrasi yang linier dengan koefesien korelasi
(r) sebesar 0,9989. Nilai %diff akurasi metode ini berada diantara -12,4507% dan
10,5212% dengan nilai presisi (KV) antara 0,1417% dan 7,5913% serta uji
perolehan kembali antara 87,5493% dan 110,5212%.
Kata kunci: Etil p-metoksisinamat, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
pengendapan protein, validasi metode.
vi
ABSTRACT
Name : Ani Kurniawati
Programme Study : Farmasi
Title : Analytical Method Validation of Ethyl P-
methoxycinnamate Plasma In Vitro using High
Performance Liquid Chromatography
Ethyl p-metoxycinnamate (EPMC) is one of secondery metabolite which is found
in kencur (Kampferia galangal Linn) family Zingiberaceae. These compounds
have biological activity as anti-inflammatory and analgetic. The aim of this study
was to obtin the optimum conditions and validated methods for analysis of EPMC
in plasma in vitro. The method of analysis using High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) with Diode Array Detector. EPMC was extracted from
plasma by protein deproteination method using methanol. A mixture of plasma
and methanol (1:4 (v/v)) is shaked with vortex for 20 seconds and centrifuged on
3000 rpm for 10 minutes. The analysis was done by using isocratic technique on
reverse phase C18 column Acclaim®
Polar Advantage II (4,6 x 150 mm, 3µm) and
mobile phase consisted methanol-aquabidest (60:40v/v) at flow rate of 1,0
mL/min. Samples were detected at a wavelength of 308 nm and injection volume
is 20 µL. Linierity was established for range concentration of 2,02-40,4 µg/mL
with correlation (r) of 0,9989. Accuracy (%diff) of this method is between -
12,4507% to 10,5212% with precision between 0,1417% to 7,5913% and test
relative recovery between 87,5493% to 110,5212%.
Keywords: Ethyl p-metoxycinnamate, High Performance Liquid Chromatography.
protein deproteination, method validation.
\
vii
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, puji dan syukur senantiasa penulis panjatkan kehadirat
Allah SWT, karena berkat rahmat dan hidayah-Nya yang telah dilimpahkan serta
segala anugerah-Nya yang telah diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan
skripsi ini. Salawat serta salam senantiasa penulis curahkan kepada Nabi
Muhammdad SAW, keluarga, sahabat, dan para pengikutnya. Skripsi ini berjudul
Validasi Metode Analisis Etil p-metoksisinamat dalam plasma secara In Vitro
menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang telah diajukan sebagai
persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi Program Studi Farmasi
FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Dalam penyelesaian skripsi ini, penulis mendapatkan bantuan dari
berbagai pihak berupa ilmu pengetahuan, pengarahan, semangat, bantuan materi,
dan motivasi. Oleh karena itu, dengan tulus penulis ingin mengucapkan banyak
terimakasih kepada nama-nama yang telah terlulis dibawah ini, semoga Allah
senantiasa melimpahkan rahmat dan karunia-Nya kepada:
1. Bapak Supandi, M.Si., Apt selaku Pembimbing I dan Ibu Zilhadia,
M.Si., Apt selaku Pembimbing II yang telah meluangkan waktunya
untuk memberikan bimbingan, saran, bantuan dan dukungan kepada
penulis serta kesabaran dan kepercayaanya selama penelitian dan
penyusunan skripsi ini.
2. Dr. H. Arif Sumantri, SKM, M.Kes, selaku Dekan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan banyak motivasi dan
bantuan.
3. Ibu Dr.Nurmeilis, M.si.,Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi
Falkutas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta.
4. Ibu/Bapak Dosen dan Staf Akademika Program Studi Farmasi Falkutas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif hidayatullah Jakarta.
x
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i
HALAMAN PERSYARATAN ORISINILITAS .............................................. ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. iv
ABSTRAK ........................................................................................................... v
ABSTRACT ......................................................................................................... vi
KATA PENGANTAR ......................................................................................... vii
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .................... ix
DAFTAR ISI ....................................................................................................... x
DAFTAR TABEL…………………………………………………………….. xiii
DAFTAR GAMBAR………………………………………………………….. xiv
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………….. xvi
BAB I PENDAHULUAN ................................................................................... 1
1.1 LatarBelakang .................................................................................... 1
1.2 PerumusanMasalah ............................................................................ 2
1.3 TujuanPenelitian ................................................................................ 3
1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................. 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................ 4
2. 1. Etil p-metoksisinamat...................................................................... 4
2. 2. Plasma ............................................................................................ 5
2. 3. Analisis Obat dalam Plasma............................................................. 6
2. 4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ................................................... 8
2.4.1 Pendahuluan………………………………………………….8
2.4.2 Keuntungan KCKT…………………………………………..9
2.4.3 Cara Kerja .............................................................................. 9
2.4.4 Instrumentasi KCKT ............................................................... 10
2.4.4.1Wadah Fase Gerak pada KCKT .................................. 11
2.4.4.2 Fase Gerak KCKT ....................................................... 11
2.4.4.3 Pompa pada KCKT ..................................................... 12
xi
2.4.4.4 Penyuntikan (injector) sampel pada KCKT ................ 12
2.4.4.5 Kolom pada KCKT ..................................................... 12
2.4.4.6 Fase Diam KCKT ........................................................ 13
2.4.4.7 Detektor KCKT ........................................................... 14
2.4.4.8 Intergrator .................................................................... 16
2.4.5 Penggunaan KCKT dalam Analisis Farmasi .......................... 16
2.4.6 Analasis Kuantitatif ................................................................. 16
2.4.6.1 Metode Baku Eksternal ............................................... 16
2.4.6.2 Metode Baku Internal .................................................. 17
2.4.6.3 Metode Presentase Tinggi/Lebar Puncak atau
Metode Normalisasi Internal ....................................... 17
2. 5. Validasi Metode Analisis ................................................................. 18
2.5.1 Ketepatan (Akurasi) ................................................................ 19
2.5.2 Presisi ...................................................................................... 20
2.5.3 Perolehan Kembali (%Recovery) ............................................ 20
2.5.4 Kurva Kalibrasi ....................................................................... 21
2.5.4.1 Linieritas ..................................................................... 21
2.5.4.2 Batas Deteksi (limit of detection, LOD) ...................... 21
2.5.4.3 Batas Kuantifikasi (limit of quantification, LOQ) ...... 22
2.5.5 Selektivitas .............................................................................. 22
2.5.6 Uji Kesesuaian Sistem............................................................. 23
2.5.7 Stabilitas .................................................................................. 23
2.5.7.1 Stabilitas Beku dan Cair .............................................. 23
2.5.7.2 Stabilitas Suhu Jangka Pendek .................................... 24
2.5.7.3 Stabilitas Jangka Panjang ............................................ 24
2.5.7.4 Stabilitas Larutan Stok ................................................. 24
2.5.7.5 Stabilitas Post-Preparatif ............................................. 25
BAB III METODE PENELITIAN .................................................................... 26
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................ 26
3.2 Bahan dan Alat ................................................................................... 26
3.2.1 Bahan ...................................................................................... 26
3.2.2 Alat .......................................................................................... 26
xii
3.3 Prosedur Kerja .................................................................................... 26
3.3.1 Pembuatan Larutan Induk EPMS ............................................ 26
3.3.2 Pembuatan Fase Gerak ............................................................ 27
3.3.3 Tahapan Optimasi ................................................................... 27
3.3.3.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ............... 27
3.3.3.2 Pemilihan Komposisi Fase Gerak ............................... 27
3.3.3.3 Uji Kesesuaian Sistem ................................................ 28
3.3.3.4 Penetapan Metode Ekstraksi ....................................... 28
3.3.4 Validasi Metode Analisis EPMS dalam Plasma ..................... 28
3.3.4.1 Pengukuran LLOQ ...................................................... 28
3.3.4.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi ........................................ 29
3.3.4.3 Selektivitas .................................................................. 29
3.3.4.4 Uji Akurasi .................................................................. 30
3.3.4.5 Uji Presisi .................................................................... 30
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 31
4.1 Penetapan Panjang Gelombang Analisis ............................................. 31
4.2 Optimasi Kondisi Analisis .................................................................. 32
4.2.1 Pemilihan Komposisi Fase Gerak .............................................. 32
4.2.2 Uji Kesesuaian Sistem................................................................ 34
4.2.3 Penetapan Metode Ekstraksi ...................................................... 34
4.3 Validasi Metode Analisis EPMS dalam Plasma In Vitro .................... 36
4.3.1 Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ) ....................... 36
4.3.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi ....................................................... 37
4.3.3 Uji Selektivitas ........................................................................... 38
4.3.4 Uji Akurasi ................................................................................. 39
4.3.5 Uji Presisi ................................................................................... 40
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 41
5.1 Kesimpulan ....................................................................................... 41
5.2 Saran .................................................................................................. 42
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 43
LAMPIRAN ......................................................................................................... 46
xiii
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
Tabel 3.1 Komposisi Fase Gerak ........................................................................27
Tabel 4.1 Hasil Penetapan Komposisi Fase Gerak .............................................33
Tabel 4.2 Hasil Uji Rata-rata Kesesuain Sistem EPMS ......................................34
Tabel 4.3 Hasil Optimasi Pengendapan Protein Plasma .....................................35
Tabel 4.4 Data Hasil Uji Selektivitas ..................................................................39
Tabel 5.1 Uji Kesesuaian Sistem ........................................................................48
Tabel 5.2 Data Hasil Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ) ..............49
Tabel 5.3 Data Hasil Uji Linieritas .....................................................................50
Tabel 5.4 Data Hasil Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi
(LOQ) .................................................................................................52
Tabel 5.5 Data Hasil Uji Akurasi dan Presisi Hari ke-1 .....................................53
Tabel 5.6 Data Hasil Uji Akurasi dan Presisi Hari ke-2 .....................................53
Tabel 5.7 Rumus-rumus......................................................................................54
xiv
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
Gambar 2.1 Struktur Kimia EPMS .....................................................................4
Gambar 2.2 Diagram Alir KCKT .......................................................................10
Gambar 4.1 Spektrum Serapan Gelombang Maksimum EPMS .........................31
Gambar 4.2 Kromatogram EPMS Murni pada Fase Gerak Metanol 100% ........33
Gambar 4.3 Kromatogram EPMS Murni pada Fase Gerak Metanol-Air
(80:20 v/v) ......................................................................................33
Gambar 4.4 Kromatogram EPMS Murni pada Fase Gerak Metanol-Air
(70:30 v/v) ......................................................................................33
Gambar 4.5 Kromatogram EPMS Murni pada Fase Gerak Metanol-Air
(60:40 v/v) ......................................................................................33
Gambar 4.6 Kromatogram Blangko Plasma dengan Perbandingan Metanol-
Plasma (1:1) ...................................................................................36
Gambar 4.7 Kromatogram EPMS pada Perbandingan Metanol dalam Plasma
(1:1) ................................................................................................36
Gambar 4.8 Kromatogram Blangko Plasma dengan Perbandingan Metanol-
Plasma (4:1) ...................................................................................36
Gambar 4.9 Kromatogram EPMS pada Perbandingan Metnaol dalam Plasma
(4:1) ................................................................................................36
Gambar 4.10 Kurva Kalibrasi EPMS dalam Plasma ..........................................37
Gambar 5.1 Kromatogram Sampel Plasma Kosong (Blangko) ..........................47
Gambar 5.2 Kromatogram EPMS dalam Sampel Plasma ...................................47
Gambar 5.3 Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ...........................................55
Gambar 5.4 Overlay dari Beberapa Kromatogran pada Kurva Kalibrasi ...........56
Gambar 5.5 Plasma .............................................................................................57
Gambar 5.6 EPMS dalam Plasma Setelah Divortex ...........................................57
Gambar 5.7 Vial KCKT ......................................................................................57
Gambar 5.8 Pot Penyimpanan Sampel EPMS ....................................................57
Gambar 5.9 Penyaringan Fase Gerak ..................................................................57
xv
Gambar 5.10 Kolom KCKT ................................................................................57
Gambar 5.11 Sentrifugator ..................................................................................58
Gambar 5.12 Sonikator .......................................................................................58
Gambar 5.13 Vortex ............................................................................................58
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
Lampiran 1 Alur Penelitian .................................................................................46
Lampiran 2 Kromatogram Hasil Analisa ............................................................47
Lampiran 2 Uji Kesesuaian Sistem .....................................................................48
Lampiran 3 Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ) ............................49
Lampiran 4 Uji Linearitas dan Pembuatan Kurva Kalibrasi ...............................50
Lampiran 5 Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ...........................................52
Lampiran 6 Uji Akurasi dan Presisi ....................................................................53
Lampiran 7 Rumus-rumus ..................................................................................54
Lampiran 8 Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ...........................................55
Lampiran 9 Overlay Kromatogram Kurva Kalibrasi ..........................................56
Lampiran 10 Dokumentasi Penelitian .................................................................57
1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Etil p-metoksisinamat merupakan senyawa hasil isolat dari kencur
(Kaempferia galanga. L) yang termasuk kedalam spesies tumbuhan dari suku
zingiberaceae, bagian yang sering digunakan ialah rimpangnya. Senyawa Etil p-
metoksisinamat (80,05%) merupakan kandungan utama yang terdapat didalam
ekstrak kencur (Umar et al., 2012).
Etil p- metoksisinamat telah dilaporkan memiliki aktivitas sebagai anti-
tuberkulosis, nematisidal, penolak nyamuk, larvasidal, antineoplastik dan potensi
sebagai antimikroba (Umar et al., 2014). Selain itu, Etil p-metoksisinamat telah
terbukti berperan penting dalam efek farmakologinya sebagai antiinflamasi.
Dalam studi in vitro, etil p-metoksisinamat secara non-selektif mampu
menghambat aktivitas COX-1 dan COX-2, dengan masing-masing 1,12 µM dan
0,83 µM. Hasil ini memvalidasi aktivitas antiinflamasi kencur yang dihasilkan
oleh penghambatan COX-1 dan COX-2 (Umar et al., 2012). Hasil penelitian baru-
baru ini yang dilakukan oleh Umar et al, (2014) menunjukkan bahwa EPMS
memiliki efek analgesik dan antiinflamasi melalui mekanisme penghambatan
sintesis sitokin pro-inflamasi meliputi TNF-α dan IL-1 secara in vivo dan in vitro.
Efek ini juga melibatkan penghambatan vital sel endogen seperti proliferasi,
sistesis dan migrasi dari vascular endotel growth factor.
Aktivitas antiinflamasi EPMS dapat digunakan untuk pengembangan obat
baru. Dalam pengembangan obat tradisional, kandidat obat tersebut akan melalui
serangkaian uji yaitu uji praklinik dan uji klinik sebelum diresmikan sebagai obat
oleh badan pemberi izin. Uji praklinik merupakan persyaratan uji untuk
memperoleh informasi tentang efikasi (efek farmakologi), profil farmakokinetik
dan toksisitas kandidat obat. Setelah dinyatakan memenuhi persyaratan uji
praklinik, suatu senyawa kandidat obat selanjutnya akan diuji pada manusia (uji
klinik) (Sukandar., 2006).
Dalam pengembangan obat baru, tahap penting yang harus dilakukan
adalah analisis obat pada cairan biologis atau biasa disebut bioanalisis. Dari data
2
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang diperoleh dalam bioanalisis akan menjadi pedoman untuk studi klinis dan
studi keamanan obat (Harahap., 2010). Analisis dapat dilakukan apabila metode
yang digunakan telah divalidasi sehingga didapatkan metode bioanalisis yang
valid berdasarkan pada Food and Drug Administration, Guidance for Industry:
Bioanalytical Method Validation, 2001. Selain itu, validasi perlu dilakukan agar
hasil analisis yang diperoleh terpercaya, cermat, handal dan dapat dipertanggung
jawabkan secara ilmiah (Ganjar & Rohman., 2007). Parameter-parameter penting
dalam validasi metode bioanalisis adalah linearitas, limit of detection (LOD), limit
of quantification (LOQ), selektivitas, akurasi dan presisi.
Metode analisis yang dipilih adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT) dimana telah digunakan secara luas untuk penemuan dan pengembangan
metode analisis baru (Evans., 2004). Salah satu keuntungan dari KCKT adalah
dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah sehingga dapat
digunakan untuk konsentrasi obat dalam plasma yang diukur mencapai level
mikrogram sampai nanogram atau pikogram (Johnson & Stevenson., 1991). Cara
ini ideal untuk analisis beragam obat dalam cairan biologis karena selektif,
sederhana dan kepekaannya tinggi (Parwa., 1991).
Pada penelitian ini, akan dilakukan validasi metode analisis EPMS dalam
plasma secara in vitro menggunakan KCKT dimana pemisahan pada kromatografi
menggunakan fase diam C18 (Oktadesil silika atau ODS). Fase diam tersebut
paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi (Gandjar & Rohman., 2007).
Penyiapan sampel plasma dilakukan dengan menggunakan metanol. Fase gerak
yang digunakan adalah metanol dan akuabidestilata yang dilakukan secara
isokratis. Pemilihan fase gerak didasarkan pada senyawa EPMS yang mampu larut
dalam beberapa pelarut dengan kepolaran bervariasi seperti metanol, air, etanol,
etil asetat dan heksana (Taufikhurohmah, 2008). Detektor yang digunakan adalah
DAD (Diode Array Detector).
1.2 Perumusan masalah
a. Bagaimanakah optimasi kondisi analisis EPMS menggunakan KCKT?
3
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
b. Bagaimanakah metode ekstraksi untuk analisis EPMS dalam plasma
menggunakan KCKT?
c. Apakah analisis EPMS dalam plasma secara in vitro menggunakan KCKT
memiliki nilai validitas yang sesuai dengan persyaratan?
1.3 Tujuan Penelitian
a. Mendapatkan optimasi kondisi analisis EPMS menggunakan KCKT.
b. Mendapatkan metode ekstraksi untuk analisis EPMS dalam plasma
menggunakan KCKT.
c. Memperoleh metode yang tervalidasi untuk analisis EPMS dalam plasma
secara in vitro menggunakan KCKT.
1.4 Manfaat penelitian
Hasil dari penelitian ini diharapkan mampu mendapatkan metode yang
valid untuk analisis EPMS dalam plasma menggunakan KCKT.
4 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Etil p-metoksisinamat (EPMS)
EPMS merupakan senyawa hasil isolat dari rimpang kencur (Kaempferia
galanga. L). EPMS merupakan senyawa yang mampu larut dalam beberapa
pelarut dengan kepolaran bervariasi seperti metanol, air, etanol, etil asetat dan
heksana. Hal ini disebabkan karena karena EPMS bersifat non polar yang
merupakan suatu ester yang mengandung cincin benzene dan gugus metoksi.
Selain itu, bersifat agak polar karena mengandung gugus karbonil yang mengikat
etil (Taufikhurohmah, 2008).
Gambar 2.1 Struktur kimia Etil p-metoksisinamat
[www.chemicalbook.com]
EPMS memiliki rumus molekul C12H14O3 dan berat molekul 206,4 g/mol
yang berbentuk kristal berwarna putih, berbau aromatik khas lemah dan memiliki
titik lebur 49oC (Umar et al., 2012).
EPMS termasuk kedalam turunan asam sinamat, dimana asam sinamat
termasuk kedalam turunan senyawa fenil propanoad yang sebelumnya
dimanfaatkan sebagai bahan tabir surya (Windono et al., 1997). Pada dekade
terakhir penelitian lebih lanjut mengenai efek farmakologi EPMS banyak
dilakukan. Etil p- metoksisinamat telah dilaporkan memiliki aktivitas sebagai anti-
tuberkulosis, nematisidal, penolak nyamuk, larvasidal, antineoplastik dan potensi
sebagai antimikroba (Umar et al., 2014). Selain itu, Etil p-metoksisinamat telah
terbukti berperan penting dalam efek farmakologinya sebagai antiinflamasi.
5
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Mekanisme kerja EPMS sebagai antiinflamasi melalui penghambatan non-
selektif pada aktivitas COX-1 dan COX-2 secara in vitro dimana enzim ini
berguna dalam pembentukan mediator inflamasi yaitu prostaglandin (Umar et al.,
2012). Hasil penelitian baru-baru ini yang dilakukan oleh Umar et al. (2014)
menunjukkan bahwa EPMS memiliki efek analgesik dan antiinflamasi melalui
mekanisme penghambatan sintesis sitokin pro-inflamasi meliputi TNF-α dan IL-1
secara in vivo dan in vitro. Efek ini juga melibatkan penghambatan vital sel
endogen seperti proliferasi, sistesis dan migrasi dari vaskular endotel growth
factor.
2.2 Plasma
Darah membentuk sekitar 8% dari berat badan tubuh total dan memiliki
volume rata-rata 5 liter pada wanita dan 5,5 liter pada pria. Darah terdiri dari tiga
jenis unsur sel khusus yang terendam dalam cairan kompleks plasma, yaitu
eritrosit dalam jumlah yang besar, leukosit dalam jumlah yang relatif sangat
sedikit 2 permil dari jumlah eritrosit dan trombosit yang memiliki fungsi penting
pada penggumpalan darah (Sherwood.,1996).
Apabila suatu sampel darah utuh ditaruh dalam sebuah tabung reaksi dan
diberi zat antikoagulan, unsur-unsur sel yang lebih berat akan secara perlahan
mengendap di dasar dan plasma yang lebih ringan naik kebagian atas. Proses ini
dipercepat oleh pemusingan (sentrifugasi), yang dengan cepat menyebabkan sel-
sel mengendap di dasar tabung (Sherwood.,1996). Bobot jenis darah bervariasi
antara 1,054-1,060, sedangkan bobot jenis plasma darah sekitar 1,024-1,028
(Poedjaji., 1994)
Hampir 90% plasma darah terdiri dari air, disamping itu terdapat pula zat-
zat lain yang terlarut didalamnya (Syaifuddin., 2006). Volume rata-rata plasma
pada wanita adalah 58% dan pada pria 55% dari volume darah. Plasma akan
membeku pada saat terpapar oleh udara karena plasma mengandung suatu
senyawa pembeku. Sehingga plasma dapat ditambahkan suatu antikoagulan
seperti sitrat atau heparin untuk mencegah pembekuan tersebut (Sherwood.,
1996).
6
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.3 Analisis Obat dalam Plasma
Penentuan kadar obat dalam sampel biologis merupakan hal yang sangat
penting dalam evaluasi dan interpretasi data farmakokinetika. Cairan biologis
yang umum digunakan untuk analisis adalah darah, plasma (serum), dan urin.
Analisis konsentrasi obat dalam darah biasanya tidak digunakan dalam
farmakokinetik karena darah merupakan sistem fisik kompleks yang mengandung
sel darah merah, sel darah putih dan platelet yang tersuspensi dalam plasma.
Darah dengan elemen selular yang telah dihilangkan dengan sentifugasi (plasma)
atau pembekuan (serum) lebih disukai (Rosenbaun., 2011). Sampel biologis yang
paling umum digunakan adalah plasma karena hubungan konsentrasi obat dalam
plasma dengan efek terapetik yang ditimbulkan baik (Kelly., 1992).
Pemeriksaan kadar obat dalam plasma merupakan suatu metode yang
sesuai untuk pemantauan pengobatan dan memungkinkan untuk penyesuaian
dosis obat dan mengoptimasi terapi (Shargel., 2005). Salah satu keuntungan dari
KCKT adalah dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah
sehingga dapat digunakan untuk konsentrasi obat dalam plasma yang diukur
mencapai level mikrogram sampai nanogram atau pikogram (Johnson &
Stevenson., 1991).
Pada matriks biologis seperti plasma mengandung sejumlah besar
komponen endogen yang dapat menggangu analisis dimana sebagian besar obat
akan berikatan dengan protein plasma sehingga harus dibebaskan terlebih dahulu.
Oleh karena itu, diperlukan preparasi sampel dengan tujuan agar dapat
memisahkan atau mengisolasi obat yang akan ditentukan dari komponen endogen
plasma yang dapat mengganggu analisis, membebaskan obat dari sisi pengikatan
protein dan memekatkan obat agar diperoleh analisis yang sensitif. Kegiatan
preparasi sampel merupakan hal penting dalam bioanalisis (Harahap., 2010).
Beberapa teknik preparasi sampel yang digunakan untuk mengisolasi obat dari
matriks biologis antara lain:
a. Pengendapan protein
Pada metode ini, dapat dilakukan dengan cara penambahan asam atau
pelarut organik untuk mendenaturasi dan mengendapkan protein. Penambahan
asam pada kosentrasi 5-20% seperti asam trikloroasetat (TCA) dan asam perkolat,
7
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sangat efesien untuk mengendapkan protein. Penambahan larutan yang berisi ion
logam berat atau penambahan pelarut organik seperti metanol, etanol, asetonitril
dan aseton kedalam sampel biologis telah digunakan secara luas dalam bioanalisis
karena kompatibilitasnya dengan fase gerak KCKT, meskipun memiliki efesiensi
yang relatif rendah dalam memisahkan protein. Pelarut organik akan
mengendapkan protein bedasarkan prinsip polaritas dan menurunkan solubilitas
protein. (Evans., 2004; Harahap., 2010)
b. Ultrafiltrasi
Larutan bebas protein dapat diperoleh melalui proses penyaringan dengan
melewatkan larutan pada suatu membran semipermeabel yang selektif dengan
menggunakan tekanan hidrostatik (1-10 atm) untuk memberikan dorongan dalam
proses pemisahan. (Harahap, 2010)
c. Ekstraksi cair-cair (Liquid-liquid Extraction)
Ekstraksi cair-cair adalah proses pemindahan atau pemisahan suatu
komponen dari satu fase ke fase lainnya yang tidak saling bercampur satu sama
lain, proses ini disebut partisi atau distribusi. Salah satu fasenya yaitu fase
aqueous dan fase lainnya merupakan pelarut organik. Larutan aqueous yang dapat
digunakan adalah air, larutan yang bersifat asam/basa, garam dan lainnya. Pelarut
organik yang dapat digunakan adalah heksan, etil asetat, toluene dan lainnya.
Pelarut organik non polar untuk mengekstraksi senyawa yang bersifat lipofil,
sedangkan senyawa hidrofil lebih mudah larut dalam pelarut organik yang relatif
polar.
Metode ekstraksi dengan pelarut organik merupakan cara yang paling
umum digunakan untuk pemisahan parsial. pH fase air harus dioptimasi agar
diperoleh bentuk tidak terionisasi, karena obat dapat terekstraksi dalam pelarut
organik apabila dalam bentuk tidak terionisasi. Optimasi dapat dilakukan dengan
menghitung atau menentukan pKa obat.
Penguapan dapat menggunakan bantuan evaporator vakum atau diuapkan
pada temperatur kamar. Untuk mempercepat penguapan, dapat ditambahkan
beberapa tetes etanol, dan penambahan sedikit natrium sulfat anhidrat pada saat
8
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
penyaringan dapat menghilangkan air dari fase organik. Selanjutnya hasil
penguapan direkonstitusi menggunakan pelarut yang sesuai. Kelemahan dari
metode yaitu terjadinya pembentukan emulsi dan tidak dapat diaplikasikan
kesemua analit, contohnya metode ini sulit digunakan untuk analit yang bersifat
sangat polar (Evans 2004.; Harahap., 2010)
d. Ekstraksi fase padat (Solid Phase Extraction)
Prinsip mekanisme pemisahan dan isolasi yang digunakan dalam
pemisahan fase padat yaitu fase terbalik, fase normal dan ion exchange sama
seperti yang digunakan dalam KCKT. Metode ekstraksi fase padat ini berdasarkan
prinsip kromatografi. Prinsip umum dari ekstraksi fase padat yaitu adsorpsi obat
dari larutan kedalam adsorben atau fase diam. Partikel silika berukuran 40-60 µm
merupakan adsorben yang sering digunakan berkaitan dengan membentuk fase
hidrokarbon. Adsorben yang paling baik kapasitasnya dalam mengadsorbsi analit
adalah C18.
Pada metode ini, digunakan kolom berukuran kecil (catridge) dengan
adsorben yang memiliki sifat mirip dengan sifat analit yang diperiksa. Ekstraksi
fase padat adalah suatu teknik yang dapat mengatasi beberapa masalah yang
ditemui pada ekstraksi cair-cair. Secara umum SPE menggunakan 5 tahap yaitu
pengkondisian, penyeimbangan fase diam, memasukkan sampel, pencucian untuk
menghilangkan senyawa pengganggu, dan elusi sampel (Evans., 2004; Harahap.,
2010).
2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
2.4.1 Pendahuluan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut
dengan HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography) merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang. KCKT dikembangakan
pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. KCKT merupakan metode
yang tidak destrukstif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan
kuantitatif.
9
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-
senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-
protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif
obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi
dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari
lingkungan; memurnikan senyawa dalam suatu campuran; memisahkan
polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran;
kontrol kualitas; dan mengikuti jalnnya reaksi sintesis.
Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa,
kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS) dan
apabila sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
(Gandjar & Rohman., 2007)
2.4.2 Keuntungan KCKT
KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik
kromatografi dengan fase gerak cairan dan fase diam cairan atau padat.
Adapun keuntungan dari KCKT, yaitu : cepat, daya pisah baik, peka, detektor
unik, pemilihan kolom dan eluen sangat bervariasi, dapat menghitung sampel
dengan kadar yang sangat rendah, kolom dapat dipakai kembali, ideal untuk
molekul besar dan ion, mudah memperoleh kembali cuplikan, mampu
memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, mudah melaksanakannya,
dapat dihindari terjadinya dekomposisi atau kerusakan bahan yang dianalisis,
dan resolusi yang baik (Johnson & Steveson., 1991; Effendy., 2004).
2.4.3 Cara kerja KCKT
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk
bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel
diantara suatu fase gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan fase diam
yang juga bisa berupa cairan ataupun padatan (Effendy., 2004). KCKT
merupakan teknik yang mana solut atau zat–zat terlarut terpisah oleh
perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase
10
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair secara sukses terhadap
suatu masalah yang dihadapi membutuhkan penggabungan secara tepat dari
berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang
dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran
sampel (Gandjar & Rohman., 2007).
2.4.4 Instrumentasi KCKT
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen
pokok yaitu: wadah fase gerak, alat untuk memasukkan sampel, kolom,
detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, dan
suatu komputer atau integrator atau perekam (Gandjar & Rohman., 2007).
.
Keterangan: 1 = Tempat fase gerak + penyaring; 2 = saluran penghubung dengan frit; 3 = pompa
(dengan monometer); 4 = injector sampel (autosampler); 5 = kolom (dengan thermostat) ; 6 =
detektor; 7 = pembuangan; 8 = pengolah data
Gambar 2.3 Diagram Alir KCKT
(Meyer., 2010)
11
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.4.4.1 Wadah Fase Gerak pada KCKT
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah
pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai
wadah fase gerak. Wadah yang digunakan dapat menampung fase gerak
antara 1 sampai 2 liter. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan
degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya
gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan
detektor sehingga akan mengganggu analisis (Gandjar & Rohman.,
2007).
2.4.4.2 Fase gerak pada KCKT
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang
dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan
resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen
sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari fase gerak),
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase
gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase
gerak berubah-ubah selama elusi). Elusi bergradien digunakan untuk
meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel
mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan
dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol
atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase
normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase
normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik (Gandjar &
Rohman., 2007).
12
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Fase gerak adalah salah satu variabel yang mempengaruhi
pemisahan. Oleh karena itu setidaknya fase gerak harus murni (tidak
terdapat kontaminan), tidak bereaksi dengan wadah (packing), sesuai
dengan detektor, melarutkan sampel, memiliki viskositas rendah, bila
diperlukan memudahkan “sample recovery”, dan diperdagangan dapat
diperoleh dengan harga murah (reasonable price) (Johnson & Steveson.,
1991).
2.4.4.3 Pompa pada KCKT
Pompa berfungsi untuk menggerakan fase gerak melalui kolom
(Johnson & Steveson., 1991). Tujuan penggunaan pompa adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Pompa yang cocok
untuk KCKT adalah pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, telfon, dan
batu nilam. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu : pompa dengan
tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan
sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan
alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit (Gandjar
& Rohman., 2007).
2.4.4.4 Penyuntikan (injektor) sampel pada KCKT
Injektor berfungsi memasukkan sampel-sampel cair dan larutan
kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom. Alat
penyutik terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang
dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal
(Gandjar & Rohman., 2007). Ada dua ragam utama : aliran henti dan
pelarut mengalir. Jenis-jenis dasar injektor, yaitu : aliran henti, septum,
katup jalan-kitar (Johnson & Steveson., 1991).
13
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.4.4.5 Kolom pada KCKT
Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau
kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja
yang tepat. Kolom berfungsi untuk memisahkan masing-masing
komponen. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok, yaitu (Johnson
& Steveson., 1991) :
1. Kolom analitik : Diameter dalam 2-6 mm. Panjang kolom tergantung
pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular,
panjang yang digunakan adalah 50-100 cm. Untuk kemasan poros
mikropartikulat, 10-30 cm.
2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih
besar dan panjang kolom 25 -100 cm.
2.4.4.6 Fase Diam pada KCKT
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang
dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, polimer-
polimer stiren dan divinilbenzen. Permukaan silika adalah polar dan
sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan
reagen-reagen seperti klorosilan yang akan bereaksi dengan gugus
silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil
terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si).
Silika yang dimodifikasi ini mempunyai karakteristik kromatografik dan
selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak
dimodifikasi.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang
paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa
dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi (Gandjar &
Rohman., 2007).
14
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.4.4.7 Detektor KCKT
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen
sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya
(analisis kuantitatif) (Johnson & Steveson., 1991). Detektor pada KCKT
dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu : detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, tidak
bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrofotometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya
akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-
Vis, detektor flouresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai
berikut (Gandjar & Rohman., 2007) :
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel,
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil,
3. Stabil dalam pengoperasiannya,
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentraasi solut
pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier), dan
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254
nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi
banyak senyawa dengan rentang yang lebih luas. Detektor indeks
refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi
eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan
detektor UV (Johnson & Steveson, 1991). Beberapa detektor yang sering
digunakan pada KCKT (Gandjar & Rohman, 2007) :
a. Detektor Spektofotometri UV-Vis
Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan radiasi
ultraviolet (UV) dan sinar tampak (Vis) pada kisaran panjang gelombang
190-800 nm oleh spesies solut yang mempunyai struktur-struktur atau
15
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
gugus-gugus kromofik. Detektor spektrofotometri UV-Vis dapat berupa
detektor dengan panjang gelombang tetap (merupakan detektor yang
paling sederhana) serta detektor dengan panjang gelombang bervariasi.
b. Detektor Photodiode-array (PDA)
Detektor PDA meruapakan detektor UV-Vis dengan berbagai
keistimewaan. Detektor ini mampu memberikan kumpulan kromatogram
secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda pada sekali
proses (single run). Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada
panjang gelombang yang diinginkan (biasanya antara 190-400) dapat
ditampilkan.
c. Detektor Flouresensi
Flouresensi merupakan fenomena luminisensi yang terjadi ketika
suatu senyawa menyerap sinar UV atau visible lalu mengemisikannya
pada panjang gelombang yang lebih besar. Tidak semua senyawa obat
mempunyai sifat flouresen sehingga detektor flouresensi ini sangat
spesifik. Disamping itu, detektor ini juga sangat sensitif dibandingkan
dengan detektor UV.
d. Detektor Indeks Bias
Detektor ini akan merespon setiap perbedaan indeks bias antara
analit (zat terlarut) dengan pelarutnya (fase geraknya). Penggunaan
detektor ini terutama untuk senyawa-senyawa yang tidak mempunyai
gugus kromofor.
e. Detektor Elektrokimia
Detektor ini bekerja bedasarkan oksidasi dan reduksi senyawa
organik (termasuk obat) secara elektrokimia pada elektroda yang cocok.
Kelebihan detektor ini adalah terkait dengan kepekaannnya yang tinggi,
sementara kelemahannya membutuhkan keterampilan dan latihan yang
16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
cukup untuk mengoperasikannya supaya didapatan garis dasar (baseline)
yang stabil.
2.4.4.8 Intergrator
Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh
detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang
selanjutnya dievaluasi oleh analisis (pengguna). Alat pengumpul data
seperti komputer, integrator, atau rekorder, dihubungkan dengan detektor
(Gandjar & Rohman, 2007).
2.4.5 Penggunaan KCKT dalam Analisis Farmasi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu metoda
pemisahan canggih dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji
identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk
analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada
suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas (Effendy.,
2004). Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk
menetapkan kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan maupun dalam
sampel hayati. Hal ini disebabkan KCKT merupakan metode yang
memberikan sensitifitas dan spesifitas yang tinggi (Gandjar & Rohman.,
2007).
2.4.6 Analisis Kuantitatif
Mengukur luas puncak dari suatu komponen zat yang dianalisis
merupakan dasar perhitungan kuantitatif. Beberapa metode yang dapat
digunakan, yaitu :
2.4.6.1 Metode Baku Eksternal
Metode yang paling umum untuk menetapkan konsentrasi
senyawa yang tidak diketahui konsentrasinya dalam suatu sampel adalah
menggunakan plot kalibrasi menggunakan baku eksternal. Larutan-
larutan baku eksternal ini dirujuk sebagai baku eksternal karena larutan-
larutan baku eksternal ini disiapkan dan dianalisis secara terpisah dari
17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kromatogram senyawa tertentu yang ada dalam sampel. Sampel yang
mengandung senyawa tertentu yang akan ditetapkan konsentrasinya dan
telah disiapkan, selanjutnya diinjeksikan dan dianalisis dengan cara yang
sama (Gandjar dan Rohman., 2007).
2.4.6.2 Metode Baku Internal
Sejumlah baku internal ditambahkan pada sampel dan standar.
Baku internal dapat menghilangkan pengaruh karena adanya perubahan-
perubahan pada ukuran sampel atau konsentrasi karena variasi
instrumen. Salah satu alasan utama digunakan baku internal adalah jika
suatu sampel memerlukan suatu perlakuan sampel yang sangat
signifikan sehingga dapat mengakibatkan berkurangnya sampel. Jika
baku internal ditambahkan pada sampel sebelumnya dilakukan preparasi
sampel, maka baku internal dapat mengoreksi hilangnya sampel-sampel
ini. Syarat-syarat suatu senyawa dapat digunakan sebagai baku internal
adalah (Gandjar dan Rohman., 2007):
1. Terpisah dengan baik dari senyawa yang dituju atau puncak-puncak
yang lain.
2. Mempunyai waktu retensi yang hampir sama dengan analit.
3. Tidak terdapat dalam sampel.
4. Memiliki kemiripan sifat-sifat dengan analit dalam tahapan-tahapan
penyiapan sampel.
5. Tidak mempunyai kemiripan sifat kimiawi dengan analit.
6. Tersedia dalam perdagangan dengan kemurnian yang tinggi.
7. Stabil dan tidak reaktif dengan sampel atau dengan fase gerak.
8. Mempunyai respon detektor yang hampir sama dengan analit pada
konsentrasi yang digunakan.
2.4.6.3 Metode Presentase Tinggi/Lebar Puncak atau Metode
Normalisasi Internal
Untuk analisis kuantitatif diasumsikan bahwa lebar atau tinggi
Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan kadar/konsentrasi zat
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang menghasilkan puncak. Dalam metoda yang paling sederhana diukur
lebar atau tinggi puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa
setiap lebar atau tinggi puncak diekspresikan sebagai suatu persentase
dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi puncak memberikan
komposisi dari campuran yang dianalisis.
Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu: Kita harus yakin
bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap
komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada
kromatogram. Komponen-komponen dapat berkoelusi, atau ditahan di
dalam kolom, atau terelusi tanpa terdeteksi. Kemudian, Kita harus
mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk
setiap komponen. Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor
diperlukan (Gandjar dan Rohman., 2007).
2.5 Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita.,
2004).
Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa
parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis,
karenanya suatu metode harus divalidasi, ketika (Gandjar dan Rohman., 2007) :
a. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis
tertentu.
b. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan
atau karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa
metode baku tersebut harus direvisi.
c. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah
berubah seiring dengan berjalannya waktu.
d. Metode baku digunakan dilaboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh
analisis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda.
19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
e. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara
metode baru dan metode baku.
Pada validasi metode bioanalisis terdapat tiga tipe dan tingkatan validasi,
yaitu (Food and Drug Administration, Guidance for Industry: Bioanalytical
Method Validation., 2001) :
a. Validasi lengkap (full validation)
Validasi lengkap ini sangat penting apabila ingin mengembangkan metode
dan mengimplementasikan metode bioanalisis untuk pertama kalinya. Validasi ini
penting untuk obat baru dan untuk penentuan metabolitnya.
b. Validasi parsial (partial validation)
Validasi parsial merupakan modifikasi dari metode bioanalisis yang yang
sudah divalidasi.
c. Validasi silang (cross validation)
Validasi silang dilakukan dengan membandingkan parameter-parameter
validasi apabila digunakan dua atau lebih metode bioanalisis untuk mendapatkan
data pada studi yang sama atau pada studi yang berbeda. Pada validasi ini
digunakan metode validasi yang original sebagai pembanding dan metode
bioanalisis lainnya sebagai komparator.
Validasi metode analisis yang dilakukan dalam matriks biologi biasanya
disebut sebagai validasi metode bioanalisis. Validasi metode bioanalisis ini
digunakan pada studi farmakologi klinis, pengujian bioavaibilitas (BA) dan
bioekuivalensi (BE), serta uji farmakokinetika (PK). Metode analisis yang selektif
dan sensitif untuk evaluasi obat dan metabolitnya (analit) secara kuantitatif sangat
berpengaruh terhadap kesuksesan studi farmakologi pre-klinik dan klinik.
Parameter-parameter penting dalam validasi metode bioanalisis adalah akurasi,
presisi, selektivitas, sensitivitas, reprodusibilitas, dan stabilitas. Pengembangan
metode analisis meliputi evaluasi selektivitas, akurasi, presisi, uji perolehan
kembali (%recovery), kurva kalibrasi, dan stabilitas (Harahap, 2010).
2.5.1 Ketepatan (Akurasi)
Akurasi menggambarkan kedekatan rata-rata hasil pengujian dengan
kadar analit yang sebenarnya. Akurasi ditentukan oleh analisis berulang dari
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sampel yang mengandung analit dalam jumlah yang diketahui. Akurasi
dilakukan minimal lima kali pengukuran untuk setiap konsentrasi. Minimal
dari tiga konsentrasi didalam rentang konsentrasi yang direkomendasikan,
yaitu pada konsentrasi rendah, sedang dan tinggi. Pengukuran akurasi
memenuhi syarat jika nilai rata-rata berada pada 15% nilai sebenarnya, kecuali
jika pengukuran dilakukan pada kadar LLOQ maka tidak boleh melebihi 20%.
Perbedaan nilai rata-rata dan nilai yang sebenarnya menentukan akurasi (US
FDA., 2001; Harahap., 2010)
2.5.2 Presisi
Presisi menggambarkan kedekatan hasil pengukuran individual analit
yang satu dengan yang lainnya. Presisi diukur menggunakan sedikitnya lima
kali pengukuran untuk setiap konsentrasi dan menggunakan minimal tiga
kosentrasi yaitu rendah, sedang, tinggi. Pengukurannya dapat dilakukan intra
assay (dalam satu kali analisis) dan inter assay (dilakukan analisis selama 5
hari). Pengukuran presisi pada setiap level konsentrasi, harus memiliki nilai
koefesien variasi (KV) tidak lebih dari 15%, kecuali LLOQ dimana nilai KV
tidak boleh lebih dari 20% (US FDA., 2001; Harahap., 2010)
2.5.3 Perolehan kembali (%Recovery)
Uji perolehan kembali (%Recovery) merupakan pengujian respon
detektor yang diperoleh dari sejumlah analit yang ditambahkan dan diekstraksi
dari matriks biologi, dibandingkan dengan respon detektor yang diperoleh dari
konsentrasi yang sebernarnya dari standar murni. Perolehan kembali dari
analit tidak perlu 100% tetapi perolehan kembali dari analit dan baku dalam
harus konsisten, presisi, dan reprodusibel. Uji perolehan kembali harus
dilakukan dengan membandingkan hasil analisis dari sampel yang diekstraksi
pada tiga konsentrasi (rendah, sedang, dan tinggi) dengan standar yang tidak
diekstraksi yang mewakili perolehan kembali 100% (US FDA., 2001)
21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.5.4 Kurva Kalibrasi
Kurva kalibrasi merupakan hubungan antara respon instrumen dengan
konsentrasi analit yang diketahui. Kurva kalibrasi harus terdiri dari 1 sampel
blanko (matriks tanpa baku dalam), 1 sampel zero (matriks dengan baku
dalam) dan 6-8 sampel non-zero yang mencakup kisaran konsentrasi
pengukuran (termasuk konsentrasi pada LLOQ).
Kurva kalibrasi dapat diterima jika memenuhi persyaratan berikut:
20% simpangan dari nilai LLOQ, 15 % simpangan dari standar selain LLOQ
dan setidaknya empat dari enam sampel non zero memenuhi persyaratan
tersebut, termasuk LLOQ dan kosentrasi tinggi pada kurva kalibrasi.
2.5.4.1 Linearitas
Linearitas suatu metode bioanalisis harus diuji untuk mengetahui
adanya hubungan yang linier antara kadar zat dengan respon detektor.
Liniearitas diperoleh dari koefesien korelasi (r) pada analisis regresi
linear yang didapat dari kurva kalibrasi. Dengan dilakukan uji ini, maka
dapat diketahui batas-batas konsentrasi dari analit yang memberikan
respon detektor yang linier. Analisis harus dilakukan pada konsentrasi
yang termasuk batas-batas linier dari konsentrasi yang telah dilakukan
(Harahap., 2010)
2.5.4.2 Batas Deteksi (limit of detection, LOD)
Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah
dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat
dikuantifikasi. Definisi batas deteksi yang paling umum digunakan
dalam kimia analisis adalah bahwa batas deteksi merupakan kadar analit
yang memberikan respon sebesar respon blangko (yb) ditambah dengan 3
simpangan baku blangko (3Sb).
ICH menggunakan 2 metode pilihan untuk menentukan LOD
yakni: metode non instrumental visual dimana pada teknik kromatografi
lapis tipis dan metode titrimetri. Kemudian metode perhitungan
bedasarkan pada standar deviasi (SD) respon dan kemiringan (slope, S)
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kurva baku pada level yang mendekati LOD sesuai dengan rumus, LOD
= 3 (SD/S). Standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan pada
standar deviasi blanko, pada standar deviasi residual dari garis regresi,
atau standar deviasi intersep y pada garis regresi (Gandjar dan Rohman.,
2007).
2.5.4.3 Batas Kuantifikasi (limit of quantification, LOQ)
Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai kosentrasi analit
terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi
yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.
ICH menggunakan 2 metode untuk menentukan LOQ yaitu: metode non
instrumental visual dan metode perhitungan bedasarkan pada standar
deviasi respon (SD) dan kemiringan (slope, S) kurva baku sesuai dengan
rumus, LOQ = 10 (SD/S). Standar deviasi respon dapat ditentukan
berdasarkan pada standar deviasi blanko, pada standar deviasi residual
dari garis regresi, atau standar deviasi intersep y pada garis regresi
(Gandjar dan Rohman., 2007).
Batas kuantifikasi terendah (Lower limit of quantification,
LLOQ) adalah analit terkecil yang dapat ditentukan dengan ketelitian
dan akurasi tertentu (Harahap, 2010). Standar terendah pada kurva
kalibrasi harus diterima sebagai LLOQ jika: respon analit pada LLOQ
minimal lima kali respon sampel blanko dan puncak analit dapat
diidentifikasi, tidak ada gangguan, reprodusibel dengan presisi 20% dan
akurasi 80-120% (US FDA.,2001).
2.5.5 Selektivitas
Selektivitas merupakan kemampuan metode analisis untuk
membedakan dan mengukur kadar analit dengan adanya komponen-komponen
lain dalam sampel (cairan biologis). Pada uji selektivitas pada sampel blanko
matriks biologi yang sesuai dilakukan pada 6 blangko dari dari sumber yang
berbeda. Setiap sampel blanko sebaiknya diuji terhadap adanya gangguan atau
23
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
interferensi dan selektivitas pada lower limit of quantification (LLOQ) (US
FDA,2001).
2.5.6 Uji Kesesuaian Sistem
Uji kesesuaian sistem didefinisikan sebagai serangkaian uji untuk
menjamin bahwa metode tersebut dapat menghasilkan akurasi dan presisi yag
dapat diterima. Seorang analisis harus memastikan bahwa sistem dan prosedur
yang digunakan harus mampu memberikan data yang dapat diterima.
United State Pharmacopeia (USP) menentukan parameter yang dapat
digunakan untuk menetapkan kesesuaian sistem sebelum analisis. Parameter-
parameter yang digunakan meliputi: bilangan lempeng teori (N), faktor tailing,
kapasitas (k’ atau α) dan nilai standar deviasi relative (RSD) tinggi puncak dan
luas puncak dari serangkaian injeksi. Pada umumnya ada 2 kriteria yang
biasanya dipersyaratkan untuk kesesuaian sistem suatu metode yaitu jika nilai
RSD < 1% untuk 5 kali injeksi larutan baku pada pengujian komponen yang
jumlahnya banyak (komponen mayor) dan untuk senyawa-senyawa dengan
kadar sekelumit, nilai RSD dapat diterima jika antara 5-15% (Gandjar dan
Rohman., 2007).
2.5.7 Stabilitas
Stabilitas obat dalam cairan biologis adalah fungsi dari kondisi
penyimpanan, sifat kimia obat, matriks dan sistem penyimpanan.
Penyimpanan dapat membuat obat yang ada didalam matriks biologis dapat
terurai sehingga tidak dapat terdeteksi sewaktu sampel dianalisis.
Semua penentuan stabilitas harus menggunakan sampel yang disiapkan
dari larutan stok analit yang dibuat baru, dalam matriks biologis yang bebas
analit dan bebas gangguan. Larutan stok dari analit untuk pengujian stabilitas
harus disiapkan dalam bahan pelarut yang tepat pada konsentrasi yang
diketahui. Jenis-jenis uji stabilitas, yaitu (US FDA., 2001) :
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.5.7.1 Stabilitas Beku dan Cair (Freeze and Thaw Stability)
Stabilitas analit harus ditentukan setelah tiga siklus beku dan
cair. Setidaknya tiga aliquot dari masing-masing kosentrasi rendah dan
tinggi disimpan pada suhu penyimpanan yang diinginkan selama 24 jam
dan dicairkan pada suhu kamar. Ketika mencair seluruhnya, sampel
dibekukan kembali selama 12-24 jam pada kondisi yang sama. Siklus
beku cair diulang sebanyak dua kali, kemudian analisis dilakukan pada
siklus ketiga. Jika analit tidak stabil pada suhu yang diinginkan, maka uji
dapat dilakukan dengan menyimpan sampel pada suhu -70OC selama
tiga siklus beku dan cair.
2.5.7.2 Stabilitas Suhu Jangka Pendek (Short-Term Temperature
Stability)
Tiga aliquot dari masing-masing konsentrasi rendah dan tinggi
harus diberikan pada suhu kamar dan disimpan pada suhu ini selama 4-
24 jam (atau berdasarkan durasi yang diinginkan dimana sampel akan
dijaga pada temperature ruang sesuai dengan uji yang diinginkan)
kemudian dianalisis.
2.5.7.3 Stabilitas Jangka Panjang (Long-Term Stability)
Waktu penyimpanan pada evaluasi stabilitas jangka panjang
harus melebihi waktu antara pengumpulan sampel pertama kali dan
sampel terakhir dianalisis. Stabilitas jangka panjang ditentukan dengan
menyimpan sedikitnya tiga aliquot dari masing-masing konsentrasi
rendah dan tinggi pada kondisi yang sama seperti uji sampel.
Konsentrasi dari semua sampel harus dibandingkan dengan rata-rata nilai
perolehan kembali yang sesuai dengan konsentrasi standar dari hari
pertama uji stabilitas jangka panjang.
2.5.7.4 Stabilitas Larutan Stok (Stock Solution Stability)
Stabilitas larutan stok dari obat dan baku dalam harus dievaluasi
pada suhu ruang selama minimal enam jam. Jika larutan stok dibekukan
25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
selama periode tertentu, stabilitas harus terdokumentasi. Setelah
tercapainya waktu penyimpanan yang diinginkan, stabilitas harus diuji
dengan membandingkan respon instrument terhadap larutan baru yang
telah disiapkan.
2.5.7.5 Stabilitas Post-Preparatif
Stabilitas sampel yang diproses, termasuk waktu selama sampel
berada di dalam autosampler harus ditentukan. Stabilitas obat dan baku
dalam harus ditetapkan selama waktu analisis untuk ukuran batch dalam
validasi sampel, dengan menentukan konsentrasi berdasarkan kalibrasi
standar.
26 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia,
Laboratorium Kimia Obat, Laboratorium Penelitian 1 dan Laboratorium
Penelitian 2 Program Studi Farmasi FKIK Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta pada Februari 2016 sampai Juni 2016.
3.2 Bahan dan Alat
3.2.1 Bahan
Etil p-metoksisinamat (hasil isolasi), metanol (Merck), akuabides
(Otsuka), plasma (PMI DKI Jakarta)
3.2.2 Alat
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Dionex UltiMate® 3000) yang
terdiri dari; pompa, autosampler, kolom Acclaim®
Polar Advantage II (C18; 3
µm; 4,6 x 150 mm), detektor DAD (Diode Array Detector), program
komputer PC (Chormeleon®). Spektrofotometer Ultraviolet-Visibel (Hitachi
U-2910), vortex, sentrifugator (Eppendorf Centrifuge 5417R) dengan tabung
sentrifugasi, syringe filter (Sartorius, RC 0,45 µm), pompa vakum (Welch®),
timbangan analitik (AND-6H202), Suntikan (Terumo), mikropipet (Rainin),
tabung vacutainer, lemari pendingin, dan sonikator (Elmasonic 5), alat-alat
gelas.
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Pembuatan Larutan Induk EPMS Konsentrasi 1000 µg/mL
Ditimbang sebanyak 50,5 mg EPMS. Dilarutkan ke dalam metanol
hingga volume akhir 50 mL sehingga diperoleh konsentrasi 1010 µg/mL.
Konsentrasi 1010 µg/mL digunakan sebagai larutan induk.
27
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.2 Pembuatan Fase Gerak
Berbagai perbandingan komposisi fase gerak dibuat dengan
mencampurkan metanol dan akuabides. Fase gerak yang telah dibuat
kemudian disaring menggunakan vakum dan filter 0,45 µm. Gas yang terdapat
di dalam larutan dihilangkan menggunakan sistem penghilang gas (degasser).
Perbandingan komposisi fase gerak dapat dilihat pada Tabel 3.1.
Tabel 3.1 Komposisi Fase Gerak
No. Metanol Akuabides
1 100 -
2 80 20
3 70 30
4 60 40
3.3.3 Tahapan Optimasi
3.3.3.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum untuk Analisis
Larutan induk EPMS diencerkan hingga diperoleh konsentrasi
5,05 µg/mL dengan metanol. Masing-masing larutan tersebut diukur
nilai serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm menggunakan.
Spektrofotometri UV-Visibel, ditentukan panjang gelombang
maksimumnya.
3.3.3.2 Pemilihan Komposisi Fase Gerak
Larutan induk EPMS diencerkan hingga konsentrasi 10,1 µg/mL
dengan metanol. Kemudian diinjeksikan sebanyak 20 µL pada komposisi
fase gerak metanol-akuabides pada perbandingan tertentu dengan
kecepatan laju alir 1,0 mL/menit. Kemudian dideteksi pada panjang
gelombang terpilih. Dicatat waktu retensi, luas puncak, dihitung jumlah
plat teoritis, HETP (Height Equivalent Theoritical Plate), dan
asimetrisitas.
28
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.3.3 Uji Kesesuaian Sistem
Larutan EPMS dengan konsentrasi 10,1 µg/mL diinjeksikan
sebanyak 20 µL ke alat KCKT dengan kondisi analisis terpilih, diulangi
sebanyak lima kali. Kemudian dihitung jumlah plat teoritis, HETP
(Height Equivalent Theoritical Plate), asimetrisitas dan %RSD (Relative
Standard Deviation).
3.3.3.4 Penetapan Metode Ekstraksi (Polson, 2002)
Kedalam tabung sentrifus dimasukkan 0,5 ml plasma dan
dicampur metanol dengan perbandingan 1:1 dan 1:4. Kemudian dikocok
dengan vortex selama 20 detik. Setelah itu, disentrifugasi pada 3000 rpm
selama 10 menit. Lalu supernatan diambil dan disaring menggunakan
syringe filter 0,45 µm. Kemudian diinjeksikan supernatan sebanyak 20
µL ke alat KCKT. Kemudian dianalisis kromatogram dari masing-
masing perbandingan untuk mengetahui kondisi kromatogram blanko
plasma.
Setelah itu, dibuat larutan dalam plasma yang mengandung
larutan EPMS dengan konsentrasi 10,1 µg/mL. Kemudian diambil
sebanyak 0,5 mL dari larutan tersebut, diekstraksi menggunakan metanol
dalam plasma dengan perbandingan 1:1 dan 1:4. Sebanyak 20 µL
diinjeksikan ke alat KCKT kemudian dicatat waktu retensi dan luas
puncak, asimetrisitas dan resolsinya.
3.3.4 Validasi Metode Analisis EPMS dalam Plasma
3.3.4.1 Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ)
Larutan EPMS dalam plasma dengan konsentrasi 5,05; 10,1;
15,15; 20,2; 25,25; 40,4 µg/mL disiapkan. Setelah itu dipreparasi sesuai
prosedur. Kemudian sebanyak 20 µL dari masing-masing larutan
tersebut disuntikkan ke alat KCKT pada kondisi analisis terpilih. Setelah
itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak terhadap konsentrasi
29
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
EPMS dalam plasma dari masing-masing konsentrasi dan dibuat kurva
kalibrasinya. Dari data pengukuran kemudian dihitung nilai LOQ.
Setelah nilai batas kuantitasi (LOQ) diperoleh, nilai LLOQ
diperoleh dari konsentrasi setengah atau seperempat nilai LOQ.
3.3.4.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas dalam Plasma In
Vitro
Dibuat larutan blangko plasma dan 7 sampel yaitu larutan EPMS
dengan konsentrasi 2,02; 5,05; 10,1; 15,15; 20,2; 25,25; 40,4 µg/mL
dimana dalam rentang konsentrasi tersebut terdapat LLOQ didalamnya,
Kemudian dipreprasi sesuai prosedur. Lalu supernatan masing-masing
sebanyak 20 µL diinjeksikan ke alat KCKT pada kondisi analisis
terpilih. Setelah itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak terhadap
konsentrasi EPMS dalam plasma dari masing-masing konsentrasi dan
dibuat kurva kalibrasi dengan persamaan garis regresi linier (y=a + bx).
Dihitung koefesien korelasi (r) dari kurva tersebut. Kemudian dihitung
LOQ (limit batas kuantitasi) dan LOD (limit batas deteksi).
LOQ (limit batas kuantitasi) dihitung melalui persamaan garis
regresi linier dari kurva kalibrasi, dengan rumus :
LOQ = 10 (
𝑆𝑦
𝑥)
𝑏
Sedangkan nilai batas deteksi (LOD) diperoleh dengan rumus :
LOD =3 (
𝑆𝑦
𝑥)
𝑏
Dimana (Sy/x) adalah simpangan baku residual, b adalah slope dari
persamaan regresi.
3.3.4.3 Uji Selektivitas
Sebanyak 20 µL supernatan sampel plasma hasil deproteinasi
yang mengandung EPMS pada konsentrasi LLOQ (2,02 µg/mL)
disuntikkan kedalam instrument KCKT dengan kondisi terpilih, yang
diulang sebanyak 6 kali menggunakan enam plasma dari sumber yang
30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
berbeda. Kemudian dihitung nilai % KV (Koefesien Variasi) dengan
nilai < 20% dan akurasinya (%diff) dengan nilai + 20%.
3.3.4.4 Uji Akurasi
Dibuat larutan EPMS dengan 3 kosentrasi. Konsentrasi rendah (3
kali LLOQ) yaitu 6,06 µg/mL; konsentrasi sedang yaitu 18,18 µg/mL
dan konsentrasi tinggi yaitu 30,3 µg/mL bedasarkan kurva kalibrasi.
Setelah itu dipreparasi sesuai prosedur. Supernatan sebanyak 20 µL
diinjeksikan ke alat KCKT dengan kondisi terpilih, yang diulangi
sebanyak 3 kali. Kemudian dihitung presentase akurasi (%diff) dan
perolehan kembali (% recovery) dari masing-masing konsentrasi larutan
tersebut. Nilai rata-rata %diff disyaratkan + 15% dari nilai sebenarnya.
Sedangkan nilai perolehan kembali dihitung dengan cara
membandingkan konsentrasi EPMS dalam darah yang diperoleh dari
hasil ekstraksi dengan konsentrasi EPMS yang sebenarnya dikalikan
dengan 100%. Perolehan kembali tidak harus 100%, tetapi tingkat
perolehan kembali analit dan baku dalam harus konsisten, presisi, dan
reprodusibel.
3.3.4.5 Uji Presisi
Dibuat larutan EPMS dengan 3 kosentrasi. Konsentrasi rendah (3
kali LLOQ) yaitu 6,06 µg/mL; konsentrasi sedang yaitu 18,18 µg/mL
dan konsentrasi tinggi yaitu 30,3 µg/mL bedasarkan kurva kalibrasi.
Setelah itu dipreparasi sesuai prosedur. Supernatan sebanyak 20 µL
diinjeksikan ke alat KCKT dengan kondisi terpilih, yang diulangi
sebanyak 3 kali. Dilakukan pengukuran selama 2 hari berturut-turut,
kemudian dihitung persentase koefesien variasinya atau %KV pada
masing-masing konsentrasi dengan nilai < 15%.
31 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penetapan Panjang Gelombang Analisis
Pada penelitian ini, pemilihan panjang gelombang analisis dilakukan
menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis. Senyawa aktif EPMS pada
konsentrasi 5,05 µg/mL diukur pada panjang gelombang 200 hingga 400 nm,
dimana senyawa EPMS memiliki gugus kromofor di dalam molekulnya sehingga
dapat diperoleh spektrum serapannya. Spektrum serapan yang dihasilkan
menunjukkan bahwa EPMS berada panjang gelombang sinar UV yaitu 308 nm.
Sehingga didapatkan panjang gelombang maksimum untuk analisis yaitu 308 nm.
Hal ini sesuai dengan literatur, dimana analisis EPMS dideteksi pada panjang
gelombang 308 nm (Salkar,2014). Pemilihan panjang gelombang analisis ini
berguna untuk meningkatkan selektivitas dan sensitifitas analisis dari sampel yang
digunakan. Data spektrum serapan senyawa zat aktif EPMS dapat dilihat pada
Gambar 4.1 dibawah ini.
Gambar 4.1 Spektrum serapan panjang gelombang maksimum EPMS konsentrasi 5,05 µg/mL
pada spektrofotometer UV-Vis
32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.2 Optimasi Kondisi Analisis
4.2.1 Pemilihan Komposisi Fase Gerak
Analisis EPMS dalam plasma secara in vitro menggunakan
kromatografi cair kinerja tinggi dilakukan pada kondisi optimum dengan laju
alir 1 mL/menit, panjang gelombang analisis 308 nm, volume penyuntikan 20
µL dan menggunakan kolom Acclaim® (C18) 150 mm. Sistem kromatografi
yang digunakan adalah sistem isokratik dengan komposisi fase gerak metanol
dan air dalam berbagai perbandingan. Fase gerak tersebut bersifat polar
sehingga dapat memisahkan senyawa EPMS yang memiliki molekul-molekul
bersifat polar.
Komposisi fase gerak sebagai kondisi awal yang digunakan adalah
metanol 100%. Pada fase gerak metanol 100% diperoleh kromatogram
senyawa EPMS yang memiliki waktu retensi (tR) 2,077 menit. Kemudian
komposisi fase gerak diubah dengan penambahan air dalam perbandingan
metanol-air (80:20 v/v); (70:30 v/v) dan (60:40 v/v). Dimana pada komposisi
fase gerak tersebut menghasilkan waktu retensi secara berurutan yaitu (tR)
3,393 menit, 6,440 menit dan 10,037 menit. Pengubahan fase gerak metanol
100% dengan penambahan air pada komposisi fase gerak dilakukan untuk
menghasilkan puncak EPMS pada waktu retensi diatas menit kedua, karena
pengotor dalam plasma umumnya muncul pada menit kedua sehingga
nantinya dapat mengganggu puncak dari senyawa EPMS.
Metode yang dipilih adalah pada kondisi metanol-air (60:40 v/v),
dikarenakan tidak ada puncak pengganggu pada waktu retensi EPMS yang
dapat dilihat dari kromatogram plasma blangko dan kemungkinan memiliki
daya pisah yang baik antara senyawa aktif EPMS dengan pengotor pada
plasma. Dalam hasil percobaan, komposisi fase gerak tersebut memberikan
luas puncak yang lebih besar yaitu 21,4820 dan jumlah lempeng teoritis (N)
yang lebih besar yaitu 245 (> 2500), nilai HETP yang diperoleh lebih kecil
yaitu 0,6122 dan asimetrisitas yang baik yaitu 1,86 (<2,5). Data dapat dilihat
pada tabel 4.1 dan data kromatogram hasil analisis tercantum dalam Gambar
4.2-4.5 dibawah ini.
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 4.1 Hasil penetapan komposisi fase gerak pada konsentrasi 10,1 µg/mL, kecepatan alir 1
mL/menit, panjang gelombang 308 nm, dan volume penyuntikan 20 µL.
Fase gerak (v/v) TR
(menit)
Luas puncak
(mAU)
N HETP Asimetrisitas
Metanol 2,077 23,4096 165 0,9090 1,52
Metanol-Air (80:20) 3,393 22,7340 86 1,7442 0,98
Metanol-Air (70:30) 6,440 20,4664 129 1,1628 2,16
Metanol-Air (60:40) 10,037 21,4820 245 0,6122 1,86
Gambar 4.2 Kromatogram EPMS murni pada
konsentrasi 10,1 µg/mL dengan fase gerak
metanol 100%, kecepatan alir 1 mL/menit,
panjang gelombang 308 nm dan volume
penyuntikan 20 µL.
Gambar 4.3 Kromatogram EPMS murni pada
konsentrasi 10,1 µg/mL dengan komposisi fase
gerak metanol-air (80:20 v/v), kecepatan alir 1
mL/menit, panjang gelombang 308 nm dan
volume penyuntikan 20 µL.
Gambar 4.4 Kromatogram EPMS murni pada
konsentrasi 10,1 µg/mL dengan komposisi fase
gerak metanol-air (70:30 v/v), kecepatan alir 1
mL/menit, panjang gelombang 308 nm dan
volume penyuntikan 20 µL.
Gambar 4.5 Kromatogram EPMS murni pada
konsentrasi 10,1 µg/mL dengan komposisi fase
gerak metanol-air (60:40 v/v), kecepatan alir 1
mL/menit, panjang gelombang 308 nm dan
volume penyuntikan 20 µL.
34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.2.2 Uji Kesesuaian Sistem
Sebelum metode analisis yang terpilih akan digunakan perlu dilakukan
uji kesesuaian sistem. Dimana uji kesesuaian sistem ini dilakukan untuk
memastikan bahwa sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu
memberikan data yang dapat diterima. Dalam uji kesesuaian sistem terdapat
beberapa parameter-parameter, yaitu plat teoritis (N) dengan syarat > 2500,
asimetrisitas dengan syarat < 2,5 dan syarat utama yaitu nilai koefesien variasi
luas puncak dengan syarat %RSD < 2 % dari pengulangan injeksi. Suatu
metode dapat diterima apabila dari uji kesesuaian sistem terdapat minimal dua
parameter yang memenuhi persyaratan (Gandjar & Rohman., 2007).
Dari hasil analisis 5 kali penyuntikan, didapatkan luas puncak dari zat
aktif EPMS. Nilai koefesien variasi yang diperoleh dari luas puncak adalah
sebesar 1,2491% dan nilai koefesien variasi yang diperoleh dari waktu retensi
adalah sebesar 0,8924 %. Uji kesesuaian sistem yang telah dilakukan telah
memenuhi persyaratan yang ditetapkan, kecuali pada parameter plat teoritis
(N). Keefesienan kolom dapat dilihat beberapa diantaranya pada nilai
bilangan plat teoritis, HETP dan asimetrisitas. Dari data yang diperoleh plat
teoritis yang dihasilkan tidak memenuhi persyaratan hal ini menunjukkan
bahwa kondisi kolom yang digunakan kurang baik. Data dapat dilihat pada
Tabel 4.2 dan data selengkapnya tercantum dalam Lampiran 2 Tabel 5.1.
Tabel 4.2 Hasil uji rata-rata kesesuaian sistem EPMS pada konsentrasi 10,1 µg/mL
dengan komposisi fase gerak metanol-air (60:40 v/v) pada kecepatan alir 1 ml/menit, panjang
gelombang 308 nm dan volume penyuntikan 20 µL.
Parameter Syarat Hasil yang diperoleh Kesimpulan
%RSD waktu retensi < 2% 0,8924% √
%RSD Luas puncak < 2% 1,2491% √
Lempeng Teoritis (N) > 2500 153 X
Asimetrisitas < 2,5 0,934 √
4.2.3 Penetapan Metode Ekstraksi
Metode ektraksi yang dilakukan bertujuan untuk memisahkan EPMS
dari gangguan yang terdapat didalam plasma seperti protein dan senyawa
endogen lainnya. Metode ekstraksi EPMS dalam plasma dilakukan dengan
35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
cara pengendapan protein menggunakan pelarut organik untuk mendenaturasi
dan mengendapkan protein. Pelarut organik akan mengendapkan protein
bedasarkan prinsip polaritas dan menurunkan solubilitas protein. Penambahan
volume pelarut organik perlu dioptimasi agar EPMS terekstraksi dengan baik.
Didalam prosedur penetapan metode ekstraksi adanya perlakuan vortex adalah
untuk mencampurkan plasma yang telah ditambahkan dengan pelarut organik
dan perlakuan sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan pelarut pengestrak
dengan protein-protein plasma setelah pengocokan. Pelarut organik yang
digunakan adalah metanol dengan perbandingan metanol dalam plasma 1:1
dan 4:1. Setelah dilakukan pengamatan, dari dua perbandingan tersebut, tidak
ada puncak pengotor protein yang mengganggu pada waktu retensi EPMS
yang dilihat dari kromatogram blangko plasma. Gambar dapat dilihat pada
Gambar 4.6 dan 4.8.
Kemudian dilakukan pengamatan pada kromatogram plasma yang
mengandung EPMS dengan melakukan metode ekstraksi yang sama. Data
hasil analisis menunjukkan bahwa komposisi metanol sebanyak 4 kali bagian
plasma merupakan metode pengendapan protein yang baik, dikarenakan
menghasilkan asimetrisitas yang baik dan nilai resolusi yang paling besar
sehingga dapat memisahkan puncak pengotor plasma dengan EPMS jika
dibandingkan dengan perbandingan komposisi metanol sebanyak 1 kali bagian
plasma. Data dapat dilihat pada Tabel 4.3 dan Gambar 4.7 dan 4.9.
Tabel 4.3 Hasil optimasi pengendapan protein plasma
Perbandingan Pelarut
Metanol dengan plasma
Luas puncak
(mAu)
N Resolusi Asimetrisitas
1:1 3,8328 442 0,96 1,67
4:1 3,4680 235 5,45 1,07
36
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.3 Validasi Metode Analisis EPMS dalam Plasma In Vitro
4.3.1 Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ)
Validasi diawali dengan pengukuran batas kuantitasi (LOQ) dan batas
kuantitasi terendah (LLOQ). Rentang konsentrasi dalam plasma yang
digunakan adalah 5,05-40,4 µg/mL. Dari rentang konsentrasi tersebut
didapatkan persamaan regresi linear Y=0,4215x-0,4924. Kemudian dihitung
nilai LOQ, nilai LOQ yang diperoleh adalah 5,3767 µg/mL. data perhitungan
dapat dilihat selengkapnya pada Lampiran 3 Tabel 5.2. Kemudian dihitung
nilai LLOQ dengan melakukan pengenceran konsentrasi LOQ menjadi
Gambar 4.6 Kromatogram blangko plasma
pada perbandingan metanol dalam plasma 1:1
dengan fase gerak metanol-air (60:40v/v),
kecepatan alir 1 mL/menit, panjang gelombang
308 nm dan volume penyuntikan 20 µL.
Gambar 4.8 Kromatogram blangko plasma
pada perbandingan metanol dalam plasma 4:1
dengan fase gerak metanol-air (60:40v/v),
kecepatan alir 1 mL/menit, panjang gelombang
308 nm dan volume penyuntikan 20 µL.
Keterangan: A. Pengotor plasma dan B. EPMS
Gambar 4.9 Kromatogram EPMS pada
perbandingan metanol dalam plasma 4:1 dengan
fase gerak metanol-air (60:40v/v), kecepatan alir
1 mL/menit, panjang gelombang 308 nm dan
volume penyuntikan 20 µL.
Keterangan: A. Pengotor plasma dan B. EPMS
Gambar 4.7 Kromatogram EPMS pada
perbandingan metanol dalam plasma 1:1 dengan
fase gerak metanol-air (60:40v/v), kecepatan alir
1 mL/menit, panjang gelombang 308 nm dan
volume penyuntikan 20 µL.
A
B
A
B
37
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
setengah atau seperempatnya, sehingga nilai LLOQ yang diperoleh dari
setengah atau seperempat LOQ adalah sekitar 2,02 µg/mL. Setelah nilai
LLOQ diperoleh, maka dilakukan pembuatan kurva kalibrasi dan uji linearitas
EPMS dalam plasma dengan rentang konsentrasi 2,02-40,4 µg/mL dimana
didalamnya terdapat konsentrasi LLOQ.
4.3.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi
Analisis EPMS dalam plasma dibuat plasma blanko dan 7 konsentrasi
EPMS dalam plasma (termasuk LLOQ). Seri konsentrasi EPMS dalam plasma
yang dibuat adalah 2,02 µg/mL; 5,05 µg/mL, 10,1 µg/mL; 15,15 µg/mL; 20,2
µg/mL; 25,25 µg/mL dan 40,4 µg/mL.
Berdasarkan hasil perhitungan luas puncak yang didapatkan persamaan
kurva kalibrasi yang diperoleh, yaitu Y = 0,4226x - 0,5206; dimana x adalah
konsentrasi EPMS dan y adalah rata-rata luas puncak EPMS. Kurva kalibrasi
dari persamaan garis dapat dilihat pada Gambar 4.10 dibawah ini dan data
hasil percobaan selengkapnya tercantum pada Lampiran 4.
Gambar 4.10 Kurva kalibrasi EPMS dalam plasma
Uji Linearitas diperoleh dari kurva kalibrasi EPMS dalam plasma.
Linieritas EPMS dalam plasma dapat dilihat pada Gambar 4.10. Metode
analisis EPMS dalam plasma dengan rentang konsentrasi 2,02-40,4 µg/mL
y = 0,4226x - 0,5206
R² = 0,9989
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 10 20 30 40 50
Rat
a-ra
ta L
uas
Punca
k m
Au
Konsentrasi (µg/mL )
Kurva Kalibrasi EPMS dalam Plasma
Series1
Linear (Series1)
38
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
memenuhi kriteria uji linearitas dan dapat diterima untuk suatu metode
analisis yang valid dikarenakan dalam pembuatan kurva kalibrasi, diperoleh
persamaan regresi linier Y = 0,4226x-0,5206 dengan koefesien korelasi r =
0,9989. Dimana kriteria linearitas untuk sediaan dalam matriks biologis adalah
r = 0,95 atau lebih (FDA, 1998). Maka dapat disimpulkan bahwa metode telah
memenuhi persyaratan kurva kalibrasi yang baik.
Dengan menggunakan kurva kalibrasi diatas, kemudian dihitung Limit
Deteksi (LOD) dan Limit Kuantifikasi (LOQ). LOD adalah konsentrasi analit
terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu
dapat dikuantifikasi. LOQ adalah kosentrasi analit terendah dalam sampel
yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada
kondisi operasional metode yang digunakan. Nilai LOD yang didapatkan
adalah 1,4511 µg/mL dan nilai LOQ yang didapatkan adalah 4,8370 µg/mL.
Data perhitungan nilai LOD dan LOQ dapat dapat dilihat selengkapnya pada
Lampiran 5.
4.3.3 Uji Selektivitas
Selektivitas dilakukan untuk mengetahui bahwa metode yang
ditetapkan dapat membedakan dan mengukur kadar analit dengan adanya
komponen-komponen lain dalam sampel (cairan biologis). Persyaratan untuk
uji selektivitas yaitu %KV dengan nilai tidak lebih dari 15%, kecuali LLOQ
dimana nilai KV tidak boleh lebih dari 20% dan akurasi nya (%diff) dengan
nilai + 15% dari nilai sebenarnya (FDA, 2001).
Dari hasil uji selektivitas yang dilakukan terhadap enam blangko
plasma manusia yang berbeda pada konsentrasi LLOQ yaitu 2,02 µg/mL,
diperoleh nilai %KV sebesar 4,1112% dan % diff antara -11,1933% sampai -
0,5684% serta tidak adanya gangguan dari senyawa lain atau pengotor plasma
pada kromatogram analisis. Data hasil uji selektivitas dapat dilihat pada Tabel
4.4. Dari hasil percobaan, uji selektivitas yang telah dilakukan untuk analisis
EPMS dalam plasma sudah memenuhi kriteria yang dipersyaratkan.
39
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 4.4 Data hasil uji selektivitas
Konsentrasi
(µg/mL)
Plasma
Luas
puncak
(mAu)
Konsentrasi
terukur
(µg/mL)
SD
% KV
% diff
2,02
A 0,3032 1,9494
0,0779
4,1112
-3,4970
B 0,2628 1,8538 -8,2296
C 0,2614 1,8504 -8,3936
D 0,2375 1,7939 -11,1933
E 0,3282 2,0085 -0,5684
F 0,2909 1,9203 -4,9378
Rata-rata 1,8960 -6,1366
4.3.4 Uji Akurasi
Uji akurasi dilakukan dengan menggunakan plasma yang mengandung
EPMS dengan 3 konsentrasi yaitu rendah, sedang dan tinggi (FDA, 2001). Uji
akurasi ini bertujuan untuk memperoleh data kedekatan hasil pengujian
dengan kadar sebenarnya. Konsentrasi rendah merupakan tiga kali dari nilai
konsentrasi LLOQ. Konsentrasi sedang merupakan 50% dari konsentrasi
tertinggi pada rentang kurva kalibrasi. Sedangkan konsentrasi tinggi adalah
setidaknya 75% dari konsentrasi tertinggi pada rentang kurva kalibrasi
(European Medicines Agency, 2011). Dari perhitungan, didapatkan
konsentrasi rendah 6,06 µg/mL, konsentrasi sedang 18,18 µg/mL dan
konsentrasi tinggi 30,3 µg/mL. Analisis pada konsentrasi tersebut dilakukan
pengulangan sebanyak 3 kali untuk masing-masing konsentrasi.
Untuk uji akurasi, persyaratan yang harus dipenuhi yaitu nilai rata-rata
%diff disyaratkan + 15% dari nilai sebenarnya, kecuali jika pengukuran
dilakukan pada kadar LLOQ maka tidak boleh melebihi 20% dan nilai dari uji
perolehan kembali berada dalam rentang 80-120% (FDA, 2001).
Hasil rata-rata % diff yang diperoleh untuk uji akurasi pada hari
pertama konsentrasi 6,06 µg/mL; 18,18 µg/mL dan 30,3 µg/mL adalah sebesar
1,8903%; 1,7745% dan 3,2315% dengan rata-rata %recovery sebesar
101,8903%; 101,7745% dan 103,2315%. Sedangkan, hasil rata-rata % diff
yang diperoleh untuk uji akurasi pada hari kedua konsentrasi 6,06 µg/mL;
18,18 µg/mL dan 30,3 µg/mL adalah sebesar -9,0847%; -0,8829% dan -
2,9914% dengan rata-rata %recovery sebesar 90,9153%; 99,1171% dan
40
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
97,0086%. Dari hasil percobaan, uji akurasi yang telah dilakukan untuk
analisis EPMS dalam plasma sudah memenuhi kriteria yang dipersyaratkan.
Data % diff dan %recovery untuk uji akurasi selengkapnya dapat dilihat pada
Lampiran 6 Tabel 6.5 dan 6.6.
4.3.5 Uji Presisi
Uji Presisi dilakukan dengan menggunakan plasma yang mengandung
EPMS dengan 3 konsentrasi yaitu rendah, sedang dan tinggi (FDA,2001). Uji
presisi ini menggambarkan kedekatan hasil pengukuran individual analit yang
satu dengan yang lainnya. Konsentrasi rendah merupakan tiga kali dari nilai
konsentrasi LLOQ. Konsentrasi sedang merupakan 50% dari konsentrasi
tertinggi pada rentang kurva kalibrasi. Sedangkan konsentrasi tinggi adalah
setidaknya 75% dari konsentrasi tertinggi pada rentang kurva kalibrasi
(European Medicines Agency, 2011). Dari perhitungan, didapatkan
konsentrasi rendah 6,06 µg/mL, konsentrasi sedang 18,18 µg/mL dan
konsentrasi tinggi 30,3 µg/mL. Analisis pada konsentrasi tersebut dilakukan
pengulangan sebanyak 3 kali untuk masing-masing konsentrasi yang
dilakukan pengukuran selama 2 hari berturut-turut.
Pengukuran presisi pada setiap level konsentrasi, harus memiliki nilai
koefesien variasi (KV) tidak lebih dari 15%, kecuali LLOQ dimana nilai KV
tidak boleh lebih dari 20% (FDA, 2001; Harahap., 2010)
Dari percobaan ini, diperoleh nilai %KV untuk konsentrasi 6,06
µg/mL; 18,18 µg/mL dan 30,3 µg/mL pada hari pertama masing-masing
adalah sebesar 7,5913%; 2,5043%; dan 4,8409%. Untuk hari kedua, nilai
%KV yang diperoleh adalah 4,9695%; 0,7743%; dan 0,1417%. Hasil uji
presisi selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 6 Tabel 5.5 dan 5.6. Dari
hasil percobaan, uji presisi yang telah dilakukan untuk analisis EPMS dalam
plasma sudah memenuhi kriteria yang dipersyaratkan.
41 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
5.1.1 Kondisi optimasi metode analisis Etil p-metoksisinamat dalam plasma
secara in vitro menggunakan KCKT dengan detektor DAD, kolom
Acclaim® (C18) dengan panjang kolom 4,6 x 150 mm ukuran partikel
3 µm adalah dengan menggunakan fase gerak metanol-akuabidestilata
(60:40v/v) dengan laju alir 1,0 mL/menit yang dianalisis pada panjang
gelombang 308 nm untuk Etil p-metoksisinamat.
5.1.2 Proses optimasi ekstraksi Etil p-metoksisinamat dalam plasma untuk
metode analisis dalam KCKT adalah dengan menggunakan metanol
dalam plasma 4:1, waktu vortex selama 20 detik dan sentrifugasi
selama 10 menit pada kecepatan 3000 rpm.
5.1.3 Persyaratan untuk validasi yaitu kriteria linearitas untuk sediaan dalam
matriks biologis adalah r = 0,95 atau lebih. Uji selektivitas dengan
%KV dengan nilai tidak lebih dari 15%, kecuali LLOQ dimana nilai
KV tidak boleh lebih dari 20% dan akurasi nya (%diff) dengan nilai +
15% dari nilai sebenarnya. Untuk uji perolehan kembali berada dalam
rentang 80-120%. Dari hasil validasi diperoleh pada rentang
konsentrasi 2,02-40,4 µg/mL dihasilkan kurva kalibrasi yang linier
dengan koefesien korelasi sebesar 0,9989. Pada uji selektivitas
diperoleh nilai %KV sebesar 4,1112% dan % diff antara -11,1933%
sampai -0,5684%. Nilai %diff akurasi pada metode ini berada diantara
-12,4507% dan 10,5212% dengan nilai presisi (KV) antara 0,1417%
dan 7,5913% serta uji perolehan kembali antara 87,5493% dan
110,5212%. Dari hasil validasi menunjukkan bahwa metode analisis
yang digunakan telah memenuhi persyaratan linieritas, selektivitas,
akurasi dan presisi yang berlaku.
42
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
5.2 Saran
Untuk penelitian selanjutnya, disarankan untuk dapat melakukan
pengembangan metode validasi analisis Etil p-metoksisinamat dalam plasma
secara in vitro sehingga diharapkan hasil analisa menjadi lebih sempurna dan
dapat juga dilakukan uji in vivo.
43 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
Arief, Indra Akbar. 2013. Penetapan Kadar Etil p-metoksisinamat dalam Ekstrak
Etanol Rimpang Kencur (Kampferia galanga L.) secara Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi. Falkutas Farmasi. Universitas Pancasila Jakarta.
Skripsi.
Chemical Book. Akses online via http://www.chemicalbook.com/ (Diakses pada
tanggal 18 Januari 2016).
Evans, G. 2004. A Handbook of Bioanalysis and Drug Metabolism. USA: CRC
Press.
Effendy 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi. USU.
European Medicines Agency. 2011. Guideline on bioanalytical method
validation. Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP).
Food and Drug Administration. 1998. Guidance for Industry: Bioanalytical
Method Validation for Human Studies. Rockville: Center for Drug
Evaluation and Research
Food and Drug Administration. 2001. Guidance for Industry: Bioanalytical
Method Validation. Rockville: Center for Veterinary Medicine.
Gandjar, I. G., & Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka
Pelajar.
Harahap, Y. 2010. Peran Bioanalisis dalam Penjaminan Kualitas Obat dan
Peningkatan Kualitas Hidup Pasien. Jakarta: UI Press.
44
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Harahap, Y. 2009. Validasi Metode Analisis Rebamipid dalam Plasma secara
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi-Ultraviolet. Majalah Ilmu Kefarmasian
Vol. I. No. 3 hal. 156-167.
Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara
Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian Vol. I. No. 3 hal. 117-135.
Johnson, E.L. dan R. Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Terj. Kosasih
Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB Press.
Kelly, M.T. 1992. Drug Analysis in Biological Fluids. Dalam: Chemical Analysis
in Complex Matrices. New York: Ellis Horwood.
Meyer, Veronika R. 2010. Practical High-Performance Liquid Chromatography
5th
Edition. Chichester: Wiley.
Parwa, B. 1991. Analisis Farmasi: Metode Modern. Surabaya : Airlangga
University Press.
Poedjaji, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI Press.
Polson, Cara; Pratibha Sarkar; Bev Incledon; Vanaja Raguvaran; Russell Grant.
2003. Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of
protein removal and ionization effect in liquid chromatography– tandem
mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 785 (2003) 263-275.
Rosenbaum, Sara. 2011. Basic Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. USA:
John Wiley and Sons.
Shargel, L. dan Andrew B.C.Yu. 2005. Biofarmasetika dan Farmakokinetika
Terapan. Terj. Siti Sjamsiah. Surabaya: Universitas Airlangga Press.
45
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Sheerwood, Lauralee. 1996. Fisiologi Manusia dari Sel ke Sistem Edisi Kedua.
Terj. Brahm U. Pendit. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Sukandar, E. Y. 2006. Tren dan Paradigma Dunia Farmasi, Industri-Klinik-
Teknologi Kesehatan, disampaikan dalam orasi ilmiah Dies Natalis ITB.
Syaifuddin. 2006. Anatomi Fisiologi untuk Mahasiswa Keperawatan Edisi 3.
Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Taufikurohmah, T; Rusmini; Nurhayati. 2008. Pemilihan Pelarut dan Optimasi
Suhu pada Isolasi Etil Para Metoksisinamat (EPMS) dari Rimpang
Kencur sebagai Bahan Tabir Surya pada Industri Kosmetik.
Umar, Muhammad I; Mohd Zaini Asmawi; Amirin Sakudin; Item J. Atangwho I;
Mun Fei Yam; Rabia Altaf; Ashaq Ahmed. 2012. Bioactivity-Guided
Isolation of Ethyl-p-methoxycinnamate, an Anti-inflammatory
Constituent, from Kampferia galangal L. Extracts. Molecules, 17, 8720-
8734.
Umar, Muhammad I; Mohd Zaini Asmawi; Amirin Sakudin; Item J. Atangwho I;
Mun Fei Yam; Rabia Altaf; Ashaq Ahmed. 2014. Ethyl-p-
methoxycinnamate Isolated from Kampferia galangal L. Inhibits
Inflammation by Suppressing Interleukin-1, Tumor Necrosis Factor-α, and
Angiogenesis by Blocking Endothelial Functions. Clinics 2014;69(2);134-
144.
Windono, Tri; Jany, Widji Surartri. 1997. Aktivitas Tabir Matahari Etil p-
metoksisinamat yang diisolasi dari Rimpang Kencur. Warta Tumbuhan
Obat Indonesia Volume 3 No.4.
46
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 1. Alur Penelitian
Etil p-
metoksisinamat
(EPMS)
Analisis EPMS dalam plasma
menggunakan KCKT
Optimasi kondisi analisis EPMS
Penetapan panjang gelombang
optimum analisis
Pemilihan fase
gerak
Uji kesesuaian sistem
Penyiapan sampel EPMS dalam plasma
Validasi metode analisis
Uji
Selektivitas
Uji LOD
& LOQ
Uji
linearitas
Uji
Akurasi
Uji
Presisi
Penetapan metode ekstraksi
Terbukti memiliki
aktivitas sebagai
antiinflamasi
Senyawa isolat
dari rimpang
kencur
(Kaempferia
galanga. L)
Analisis EPMS
dalam plasma
47
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 2. Kromatogram Hasil Analisa
Gambar 5.1 Kromatogram sampel plasma kosong (blangko) dengan komposisi fase gerak
metanol:air (60:40 v/v), kecepatan alir 1 mL/menit, panjang gelombang 308 nm dan volume
penyuntikan 20 µL.
Gambar 5.2 Kromatogram EPMS dalam sampel plasma pada konsentrasi 20 µg/mL dengan
komposisi fase gerak metanol:air (60:40 v/v), kecepatan alir 1 mL/menit, panjang gelombang 308
nm dan volume penyuntikan 20 µL.
48
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 3. Uji Kesesuaian Sistem
Tabel 5.1 Uji kesesuaian sistem EPMS pada konsentrasi 10,1 µg/mL dengan komposisi
fase gerak metanol:air (60:40 v/v) pada kecepatan alir 1 ml/menit, panjang gelombang 308 nm dan
volume penyuntikan 20 µL.
Konsentrasi
(µg/mL)
Waktu Luas Area
(mAu)
N HETP Asimetri
10,1 10,060 23,2469 248 0,6048 0,90
10,1 10,197 22,6231 91 1,6484 0,88
10,1 10,000 23,0969 180 0,8333 1,00
10,1 10,037 23,1422 172 0,8721 1,00
10,1 10,187 22,675 75 2 0,89
Rata-rata 10,096 22,9568 153 1,1917 0,934
SD 0,0901 0,2868 - - -
KV % 0,8924% 1,2491% - - -
Syarat KV <2% KV<2% > 2500 < 1 < 2,5
Kesimpulan √ √ X X √
49
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 4. Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ)
Tabel 5.2 Data Hasil Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ)
Konsentrasi
(µg/mL)
Rata-rata
Luas Puncak
(mAu)
Luas puncak
berdasarkan
persamaan
regresi linear
(Y-Y’)
(Y-Y’)2
5,05 1,6736 1,6151 0,0585 0,0034
10,1 3,5159 3,7226 -0,2067 0,0427
15,15 5,6731 5,8301 -0,157 0,0246
20,2 8,1607 7,9376 0,2231 0,0498
25,25 10,2894 10,0451 0,2443 0,0597
40,4 16,2089 16,3676 -0,1587 0,0252
Jumlah (Y-Y’)2 0,2054
Persamaa regresi linear : Y=0,4215x-0,4924
S (y/x) = √∑(𝑌−𝑌′)2
𝑛−2= √
0,2054
4 = 0,2266
LOQ = 10 𝑥 𝑆(
𝑦
𝑥)
𝑏 =
10𝑥 0,2266
0,4215 = 5,3767 µg/mL
LLOQ = ½ LOQ = 2,6883 µg/mL
= ¼ LOQ = 1,3442 µg/mL
50
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 5. Uji Linearitas dan Pembuatan Kurva Kalibrasi
Tabel 5.3 Data hasil uji linearitas
Konsentrasi
(µg/mL)
Luas Puncak
(mAU)
Rata-rata Luas Puncak
(mAu)
2,02
0,2909
0,2772 0,2634
5,05
1,6822
1,6736 1,6649
10,1
3,4680
3,5159 3,5637
15,15
5,8701
5,6731 5,4761
20,2
8,2559
8,1607 8,0655
25,25
10,4337
10,2894 10,1361
40.4
16,3614
16,2089 16,0564
y = 0,4226x - 0,5206
R² = 0,9989
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 10 20 30 40 50
Rat
a-ra
ta L
uas
Punca
k m
Au
Konsentrasi (µg/mL )
Kurva Kalibrasi EPMS dalam Plasma
Series1
Linear (Series1)
51
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Kondisi Analisis
Kolom : Dionex C18 150 x 4,6 x 3 µm
Fase gerak : Metanol -Air dengan perbandingan 60:40 v/v
Laju alir : 1 ml/menit
Teknik : Isokratik
Panjang Gelombang : 308 nm
Volume Injeksi : 20 µl
Suhu kolom : Ambient
52
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 6. Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Tabel 5.4 Data hasil perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)
Konsentrasi
(µg/mL)
Rata-rata
Luas Puncak
(mAu)
Luas puncak
berdasarkan
persamaan
regresi linear
(Y-Y’)
(Y-Y’)2
2,02 0,2772 0,3246 -0,0474 0,0022
5,05 1,6736 1,5924 0,0812 0,0066
10,1 3,5159 3,7054 -0,1895 0,0359
15,15 5,6731 5,8184 -0,1453 0,0211
20,2 8,1607 7,9314 0,2293 0,0526
25,25 10,2894 10,0444 0,2450 0,0600
40,4 16,2089 16,3834 -0,1745 0,0305
Jumlah (Y-Y’)2 0,2089
Persamaan regresi linear : Y=0,4226x-0,5206
S (y/x) = √∑(𝑌−𝑌′)2
𝑛−2= √
0,2089
5 = 0,2044
LOD = 10 𝑥 𝑆(
𝑦
𝑥)
𝑏 =
3𝑥0,2044
0,4226 = 1,4511 µg/mL
LOQ = 10 𝑥 𝑆(
𝑦
𝑥)
𝑏 =
10𝑥 0,2044
0,4226 = 4,8370 µg/mL
53
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 7. Akurasi dan Presisi
Tabel 5.5 Data Hasil Uji Akurasi dan Presisi (Hari ke-1)
Konsentrasi
(µg/mL)
Luas
puncak
(mAu)
Konsentrasi
terukur
(µg/mL)
%
recovery
% diff SD %KV
6,06
1,9273 5,7925 95,5854 -4,4146
0,4687
7,5913 2,0292 6,0336 99,5644 -0,4356
2,3098 6,6976 110,5212 10,5212
Rata-rata - 6,1745 101,8903 1,8903 - -
18,18
7,4736 18,9167 104,0523 4,0523
0,4634
2,5043 7,3351 18,5890 102,2496 2,2496
7,0871 18,0021 99,0216 -0,9784
Rata-rata - 18,5026 101,7745 1,7745 - -
30,3
13,0515 32,1157 105,9924 5,9925
1,5142
4,8409
11,9593 29,5312 97,4628 -2,5372
13,0831 32,1905 106,2392 6,2392
Rata-rata - 31,2791 103,2315 3,2315 - -
Tabel 5.6 Data Hasil Uji Akurasi dan Presisi (Hari ke-2)
Konsentrasi
(µg/mL)
Luas
puncak
(mAu)
Konsentrasi
terukur
(µg/mL)
%
recovery
% diff SD %KV
6,06
1,7215 5,3055 87,5493 -12,4507
0,2738
4,9695
1,7624 5,4023 89,1464 -10,8536
1,9392 5,8206 96,0501 -3,9499
Rata-rata - 5,5095 90,9153 -9,0847 - -
18,18
7,1527 18,1574 99,8755 -0,1245
0,1395
0,7743 7,0958 18,0227 99,1348 -0,8651
7,0348 17,8784 98,3409 -1,6591
Rata-rata - 18,0195 99,1171 -0,8829 - -
30,3
11,9155 29,4276 97,1208 -2,8792
0,0416
0,1417 11,8815 29,3471 96,8552 -3,1448
11,9064 29,4061 97,0497 -2,9503
Rata-rata - 29,3936 97,0086 -2,9914 - -
54
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 8. Rumus-rumus
Tabel 5.7 Rumus-rumus
Nama Rumus Formula
Simpangan baku residual
Batas Deteksi
Batas Kuantitasi
%diff
% recovery
Simpangan Deviasi
Relative Standar Deviation
N (Jumlah Lempeng Teoritis)
Height Equivalent to A
Theorotical Plate
Asimetrisitas
Resolusi (R)
S(y/x) = √∑(𝑌−𝑌𝑖)2
𝑛−2
LOD = 3,3 S(y/x)
𝑏
LOQ = 10 S(y/x)
𝑏
%diff = 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠−𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎
% recovery = 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎𝑥 100%
RSD = 𝑆𝐷
𝑋𝑥 100%
N= 16 (𝑡𝑅
𝑊)2
HETP = 𝐿
𝑁
Tf = 𝑊 0,05
2𝑓
R = 2 (𝑡𝑅2−𝑡𝑅1)
𝑊1+𝑊2
55
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 9. Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Keterangan Gambar :
A. Wadah penampung fase gerak
B. Pompa
C. Injector
D. Kolom C18; 3µm 4,6 X 150 mm (Dionex, Acclaim® Polar Advantage II)
E. Detektor (Diode Array Detector)
F. Komputer dengan perangkat lunak Chormeleon
Gambar 5.3 Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dionex Ultimate ® 3000
A
B
C
E
C
D
C
F
56
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 10. Overlay Kromatogram Kurva Kalibrasi
Gambar 5.4 Overlay dari Beberapa Kromatogram pada Kurva Kalibrasi
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 17.0
-2.0
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
15.0
1 - KURVAKALIBRASI #7 2 PPM UV_VIS_1
2 - KURVAKALIBRASI #6 5 PPM UV_VIS_1
3 - KURVAKALIBRASI #5 10 PPM UV_VIS_1
4 - KURVAKALIBRASI #4 15 PPM UV_VIS_1
5 - KURVAKALIBRASI #3 20 PPM UV_VIS_1
6 - KURVAKALIBRASI #2 40 PPM UV_VIS_1
7 - KURVAKALIBRASI #1 25 PPM UV_VIS_1mAU
min
7654321
1 - 1.4002 - 1.590
3 - 5.400 4 - 10.407
WVL:308 nm
57
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 11. Dokumentasi Penelitian
Gambar 5.5 Plasma
Gambar 5.7 Vial KCKT
Gambar 5.9 Penyaringan Fase gerak
Gambar 5.6 EPMS dalam plasma setelah
divortex
Gambar 5.8 Pot penyimpanan sampel EPMS
Gambar 5.10 Kolom KCKT
58
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 5.11 Sentrifugator
Gambar 5.13 Vortex
Gambar 5.12 Sonikator