Upload
others
View
18
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM Aspergillus oryzae
TERHADAP BIOFILM Klebsiella pneumoniae
SKRIPSI
Oleh:
WALIMATUS SYA’DIYAH
17910003
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU
KESEHATAN
UIN MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG
2021
II
UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM Aspergillus oryzae
TERHADAP BIOFILM Klebsiella pneumoniae
SKRIPSI
Diajukan Kepada:
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim
Malang
Untuk Memenuhi Salah Satu Persyaratan dalam
Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran (S.Ked)
Oleh:
WALIMATUS SYA’DIYAH
17910003
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU
KESEHATAN
UIN MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG
2021
III
UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM Aspergillus oryzae
TERHADAP BIOFILM Klebsiella pneumoniae
SKRIPSI
Oleh:
WALIMATUS SYA’DIYAH
17910003
Telah Diperiksa dan Disetujui untuk Diuji
Tanggal: 24 Juni 2021
Pembimbing I Pembimbing II
dr. Iwal Reza Ahdi, Sp.PD dr. Ana Rahmawati, M.Biomed
NIP. 198607202018011002 NIP. 197412032009122001
Mengetahui,
Ketua Program Studi Pendidikan Dokter
dr. Ana Rahmawati, M.Biomed
NIP. 197412032009122001
IV
UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM Aspergillus oryzae
TERHADAP BIOFILM Klebsiella pneumoniae
SKRIPSI
Oleh:
WALIMATUS SYA’DIYAH
17910003
Telah dipertahankan di Depan Dewan Penguji Skripsi dan Dinyatakan
Diterima Sebagai Salah Satu Persyaratan untuk Memperoleh Gelar
Sarjana Kedokteran (S.Ked)
Tanggal: 24 Juni 2021
Penguji Utama dr. Lailia Nur Rachma, M.Biomed
NIP. 198406232011012009
Ketua Penguji dr. Ana Rahmawati, M.Biomed
NIP. 197412032009122001
Sekretaris
Penguji
dr. Iwal Reza Ahdi, Sp.PD
NIP. 198607202018011002
Mengesahkan,
Ketua Program Studi Pendidikan Dokter
dr. Ana Rahmawati, M.Biomed
NIP. 197412032009122001
V
VI
KATA PENGANTAR
Assalamualaikum Wr. Wb
Puji syukur penulis haturkan kehadirat Allah Swt. yang telah
melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Antibiofilm
Aspergillus oryzae Terhadap Biofilm Klebsiella pneumoniae” dengan
baik dan sesuai dengan waktu yang direncanakan dalam rangka
memenuhi sebagian persyaratan dalam memperoleh gelar Sarjana
Kedokteran (S.Ked) pada Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Maulana
Malik Ibrahim Malang.
Selanjutnya penilis haturkan ucapan terima kasih seiring doa
kepada semua pihak yang telah membantu terselesaikannya skripsi ini.
Ucapan terima kasih ini penulis sampaikan kepada:
1. Prof. Dr. H. Abd. Haris, M.Ag, selaku rektor UIN Maulana Malik
Ibrahim Malang.
2. dr. Ana Rahmawati, M.Biomed. selaku Ketua Program Studi
Pendidikan Dokter FKIK UIN Maulana Malik Ibrahim Malang dan
selaku dosen pembimbing II yang telah banyak memberikan
pengarahan, bimbingan, dan pengalaman yang sangat berharga.
VII
3. dr. Iwal Ahdi Reza, Sp.PD selaku dosen pembimbing I yang telah
memberikan pengarahan, bimbingan, dan pengalaman yang sangat
berharga.
4. Segenap civitas akademika Program Studi Pendidikan Dokter,
terutama seluruh dosen dan laboran yang telah membantu penulis dalam
menyelesaikan tugas ini.
5. Bapak Safa’un dan Ibu Susilowati tercinta yang senantiasa
memberikan doa dan restunya kepada penulis dalam menuntut ilmu.
6. Saudara kandung saya yang bernama Zainal Azhar, Sendiko Ady
Putra, dan Ayu Intan Safitri yang senantiasa memberikan semangat dan
motivasinya selama proses pengerjaan skripsi ini.
7. Semua pihak yang ikut membantu dalam menyelesaikan laporan ini
baik berupa material maupun moral.
Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih
terdapat banyak kekurangan dan penulis berharap semoga skripsi ini
bisa memberikan manfaat kepada para pembaca khususnya bagi penulis
secara pribadi. Aamiin Yaa Rabbal Alamin.
Wassalamu’alaikum Wr. Wb.
Batu, 12 Juni 2021
Penulis
VIII
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL…………………………………...……………II
HALAMAN PERSETUJUAN……………………………………..III
HALAMAN PENGESAHAN………………………………………IV
HALAMAN PERNYATAAN……………………………………….V
KATA PENGANTAR………………………..………………..……VI
DAFTAR ISI ……………………………………………………..VIII
DAFTAR TABEL …………………………………………..…....XIV
DAFTAR GAMBAR ……………………………...………………XV
ABSTRAK………………………………………………………..XVII
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ……………………………………………………1
1.2 Rumusan Masalah ………………………………………………...7
1.2.1 Rumusan Masalah Umum ……………………………………7
1.2.2 Rumusan masalah Khusus …………………………………...7
1.3 Tujuan Penelitian ………………………………………………….7
1.3.1 Tujuan Umum ………………………………………………..7
1.3.2 Tujuan Khusus ………………………………………………..8
1.4 Manfaat Penelitian ………………………………………………...8
1.4.1 Manfaat Akademik …………………………………………...8
1.4.2 Manfaat Aplikatif ……………………………………………8
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pneumonia ………………………………………...………………9
IX
2.1.1 Pneumonia Akibat Klebsiella pneumoniae ………………….12
2.2 Klebsiella pneumoniae …………………………………………...13
2.2.1 Taksonomi Klebsiella pneumoniae ……………………..…..13
2.2.2 Karakteristik Klebsiella pneumoniae ………………...……...13
2.2.3 Faktor virulensi Klebsiella pneumoniae …………………….15
2.2.4 Identifikasi Karakteristik Klebsiella pneumoniae …………...17
2.2.4.1 Uji pewarnaan Gram …………………………………….17
2.2.4.2 Uji Biokimia …………………………………………….19
2.2.4.3 Biakan Pada Medium Diferensial ……………………….22
2.3 Biofilm …………………………………………………………...22
2.3.1 Mekanisme Pembentukan Biofilm ……….…………………23
2.3.2 Quorum sensing ……………………………………………..25
2.3.3 Pembentukan Biofilm dan Quorum sensing K. pneumoniae ...25
2.3.4 Biofilm Sebagai Penyebab Resistensi Antibiotik …………...27
2.3.5 Uji Pembentukan Biofilm …………………………………...27
2.3.5.1 Metode Tabung …………………………………………27
2.3.5.2 Metode Congo Red Agar ………………………………..28
2.3.5.3 Metode Microtiter Plate ………………...........…………29
2.4 Aspergillus oryzae ……………………………………………….30
2.4.1 Taksonomi Aspergillus oryzae ……………………………...30
2.4.2 Karakteristik Aspergillus oryzae …………………….……...31
2.4.3 Kurva Pertumbuhan Aspergillus oryzae …………………….32
2.4.4 Identifikasi Karakteristik Aspergillus oryzae ………….……32
X
2.4.4.1 Uji Makroskopis ………………………………………...32
2.4.4.2 Uji Mikroskopis …………………………………………33
2.4.5 Mekanisme Inhibitor Quorum sensing (IQS) ………………..33
2.4.6 Aspergillus oryzae sebagai Antibiofilm ……………………..34
2.5 Kerangka Teori ………………………………………………......37
BAB III KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS
3.1 Kerangka Konsep ………………………………………………...40
3.2 Hipotesis Penelitian ……………………………………………...42
BAB IV METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian ……………………………………………43
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian …………………………………….43
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian …………………………………43
4.3.1 Populasi Penelitian ………………………………………….43
4.3.2 Sampel Penelitian …………………………………………..43
4.4 Variabel Penelitian ………………………………………………44
4.4.1 Variabel bebas ………………………………………………44
4.4.2 Variabel Terikat …………………………………………….44
4.5 Jumlah Pengulangan ……………………………………………..44
4.6 Definisi Operasional ……………………………………………..45
4.7 Kriteria Penelitian ……………………………………………….47
4.7.1 Kriteria Inklusi …………………………………………….47
4.7.2 Kriteria Eksklusi …………………………………………...47
4.8 Alat dan Bahan Penelitian ………………………………………..47
XI
4.8.1 Alat Penelitian ……………………………………………..47
4.8.2 Bahan Penelitian …………………………………………...48
4.8.2.1 Bahan Uji ………………………………………………48
4.8.2.2 Bakteri Uji ……………………………………………..48
4.8.2.3 Bahan lainnya ………………………………………….48
4.9 Prosedur Penelitian ………………………………………………48
4.9.1 Pembuatan Media Pertumbuhan Aspergillus oryzae ………48
4.9.2 Pembuatan Supernatan Aspergillus oryzae ………………...49
4.9.3 Pembuatan Seri Konsentrasi Supernatan A. oryzae ……...…49
4.9.4 Identifikasi Aspergillus oryzae ………………………...…..50
4.9.4.1 Uji Makroskopis ……………………………………….50
4.9.4.2 Uji Mikroskopis ………………………………………..50
4.9.5 Uji Kurva Pertumbuhan …………………………………..51
4.9.6 Pembuatan Media Pertumbuhan Klebsiella pneumoniae ….51
4.9.7 Pembuatan Suspensi Klebsiella pneumoniae ……………..52
4.9.8 Identifikasi Klebsiella pneumoniae ……………………….52
4.9.8.1 Uji Pewarnaan Gram …………………………………..52
4.9.8.2 Uji Mac Conkey ………………………………………..53
4.9.8.3 Uji Urease ……………………………………………...53
4.9.8.4 Uji Methyl Red ………………………………………...54
4.9.8.5 Uji Indol, Voges Preskauer, Simmon’s Citrate (IMViC) 54
4.9.9 Denah Uji Perlakuan Aktivitas Antibiofilm ………………55
XII
4.9.10 Uji Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh
Minimum (KBM) ………………………………………….56
4.9.11 Uji Pertumbuhan Biofilm ………………………………….57
4.9.12 Uji Aktivitas Antibiofilm Aspergillus oryzae terhadap
Klebsiella pneumoniae …………………………………….59
4.9.12.1 Uji Aktivitas Pencegahan Perlekatan Biofilm ……….59
4.9.12.2 Uji Aktivitas Penghambatan Pertumbuhan Biofilm ….61
4.9.12.3 Uji Aktivitas Penghancuran Biofilm …………………62
4.10 Alur Penelitian …………………………………………………65
4.11 Analisis Data …………………………………………………...66
BAB V HASIL
5.1 Uji Karakteristik Aspergillus oryzae……………………………...67
5.2 Uji Karakteristik Klebsiella pneumoniae…………………………68
5.3 Uji Kurva Pertumbuhan Aspergillus oryzae………………………69
5.4 Uji Kadar Hambat Minimum……………………………………..70
5.5 Uji Kadar Bunuh Minimum………………………………………70
5.6 Uji Pertumbuhan Biofilm Klebsiella pneumoniae ……………….70
5.7 Presentase Aktivitas Antibiofilm Aspergillus oryzae ……………71
5.7.1 Uji Pencegahan Perlekatan Biofilm Klebsiella pneumonia…..72
5.7.2 Uji Penghambatan Pembentukan Biofilm Klebsiella
pneumonia……………………………………………………..73
5.7.3 Uji Penghancuran Biofilm Klebsiella pneumoniae…………...73
5.8 Hasil Analisis Data……………………………………………….74
XIII
5.8.1 Uji Pencegahan Perlekatan Biofilm Klebsiella pneumoniae….74
5.8.2 Uji Penghambatan Pembentukan Biofilm Klebsiella
pneumoniae……………………………………………………77
5.8.3 Uji Penghancuran Biofilm Klebsiella pneumoniae…………...80
BAB VI PEMBAHASAN
6.1 Identifikasi Karakteristik Aspergillus oryzae dan Klebsiella
pneumoniae…………………………………………………………..84
6.2 Pengukuran Kurva Aspergillus oryzae……………………………85
6.3 Pembuatan Supernatan Aspergillus oryzae……………………….85
6.4 Pembuatan Suspensi Klebsiella pneumoniae……………….…….86
6.5 Uji KHM dan KBM………………………………………….……87
6.6 Uji Pertumbuhan Biofilm…………………………………………88
6.7 Uji Aktivitas Antibiofilm Aspergillus oryzae…………………….90
6.8 Analisis Data……………………………………………….……..92
6.9 Integrasi Menurut Al-qur’an dan Hadist………………………….96
BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpulan……………………………………………………….99
7.2 Saran……………………………………………………………...99
DAFTAR PUSTAKA …………………………………….……......100
Lampiran……………………………………………………………111
XIV
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Interpretasi kekuatan bakteri pembentuk biofilm .................30
Tabel 4.1 Interpretasi kekuatan bakteri pembentuk biofilm .................59
Tabel 5.1 Hasil uji biokimia Klebsiella pneumoniae………………….69
Tabel 5.2 Hasil uji Post Hoc Tukey pencegahan perlekatan biofilm……76
Tabel 5.3 Hasil uji Post-Hoc Tukey penghambatan pembentukan biofilm….79
Tabel 5.4 Hasil uji Post-Hoc Tukey pada penghancuran biofilm……………82
XV
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Perbedaan alveoli …………………………………………9
Gambar 2.2 Patofisiologi pneumonia ………………………………...12
Gambar 2.3 Skema faktor virulensi dan pembentukan biofilm ……….17
Gambar 2.4 Pewarnaan Gram pada bakteri …………………………..19
Gambar 2.5 Uji IMViC pada Klebsiella pneumoiae ………………….21
Gambar 2.6 Koloni K. pneumoniae pada medium Mac conkey ……....22
Gambar 2.7 Metode Tabung .................................................................29
Gambar 2.8 Metode Congo Red Agar ..................................................30
Gambar 2.9 Metode microtiter plate ....................................................31
Gambar 2.10 Struktur Aspergillus oryzae dilihat dari mikroskop ……33
Gambar 2.11 Bentukan koloni Aspergillus oryzae …………………..33
Gambar 2.12 Struktur Aspergillus oryzae ……………………………37
Gambar 2.13 Asam lemak sebagai antibiofilm ……………………….38
Gambar 4.1 Metode Pewarnaan Gram ……………………………….53
Gambar 4.2 Denah perlakuan pada microplate 96 wells .......…………55
Gambar 5.1 Hasil pengamatan mikroskopis jamur…………………...67
Gambar 5.2 Hasil uji makroskopis pada jamur Aspergillus oryzae…...67
Gambar 5.3 Tampilan koloni pada media dan mikroskopis…….…….68
Gambar 5.4 Hasil uji kurva pertumbuhan jamur Aspergillus oryzae….69
Gambar 5.5 Hasil Uji Kadar Hambat Minimum (KHM)……………...70
Gambar 5.6 Hasil uji pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae.....70
Gambar 5.7 Presentase aktivitas antibiofilm………………………….71
XVI
Gambar 5.8 Hasil uji pencegahan perlekatan biofilm…………………72
Gambar 5.9 Hasil uji penghambatan pembentukan biofilm…………..73
Gambar 5.10 Hasil uji penghancuran biofilm………………………...74
XVII
ABSTRAK
UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM Aspergillus oryzae
TERHADAP BIOFILM Klebsiella pneumoniae
Pneumonia masih menjadi masalah kesehatan di Indonesia dengan
peningkatan kasus tiap tahunnya. Salah satu penyebabnya adalah Klebsiella
pneumoniae. Bakteri ini memiliki kemampuan membentuk biofilm yang dapat
meningkatkan resistensi antibiotik. Aspergillus oryzae memiliki kandungan β-
glucosidase dan asam lemak (asam palmitate, asam strearat, asam oleic, dan
asam linoleic) yang dapat dijadikan sebagai antibiofilm alternativ. Penelitian
ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas Aspergillus oryzae sebagai pencegah
perlekatan, penghambat pembentukan, dan penghancuran biofilm Klebsiella
pneumoniae. Metode yang digunakan adalah tissue culture plate dengan serial
konsentrasi. Hasil penelitian ditentukan dari nilai OD (Optical Density) pada
Microplate-reader dan dilanjutkan analisis statistik dengan SPSS. Pada uji
pencegahan didapatkan aktivitas tertinggi pada konsentrasi 50% dengan
presentase 41,5%, uji penghambatan pembentukan pada konsentrasi 100%
sebesar 77%, dan uji penghancuran pada konsentrasi 100% sebesar 47%. Pada
uji pencegahan dan pembentukan menunjukan tidak adanya pengaruh besar
aktivitas terhadap nilai OD. Sedangkan pada uji penghancuran menunjukkan
adanya pengaruh besar aktivitas terhadap nilai OD.
Kata Kunci: Biofilm Klebsiella pneumoniae, Antibiofilm Aspergillus oryzae,
Quorum Sensing.
XVIII
ABSTRACT
ANTIBIOFILM ACTIVITY TEST OF Aspergillus oryzae
AGAINST BIOFILM OF Klebsiella pneumoniae
Pneumonia is still a health problem in Indonesia that increase every year. One
of the causes is Klebsiella pneumoniae. This bacterium has ability to form
biofilms that can increase antibiotic resistance. Aspergillus oryzae contains β-
glucosidase and fatty acids (palmitic acid, stearic acid, oleic acid, and linoleic
acid) which can be used as alternative antibiofilms. This study aims to
determine the activity of Aspergillus oryzae as a preventative attachment,
inhibition, and to determine the biofilm of Klebsiella pneumoniae. This research used plate tissue culture with serial concentrations methode. The
results were determined from the value of OD (Optical Density) on the
Microplate-reader and continued with statistical analysis by SPSS. In the
prevention test, the highest activity was found at a concentration of 50% with
a percentage of 41.5%, in formation inhibition test at a concentration of 100%
was 77%, and destruction test at a concentration of 100% was 47%. In the test
of prevention and value formation, there was no significant effect of activity
on OD. Meanwhile, the test shows that there is a large influence of activity on
OD.
Keywords: Biofilm Klebsiella pneumoniae, Antibiofilm Aspergillus oryzae,
Quorum Sensing.
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pneumoniae merupakan suatu penyakit saluran pernafasan akut
yang ditandai adanya infeksi pada alveoli paru (Dirjen P2PL Kemenkes
RI, 2012). Pneumoniae ini menyebabkan besarnya angka kematian pada
anak umur dibawah 5 tahun mencapai 70% di dunia. Kejadian
pneumoniae tiap tahunnya mengalami peningkatan hampir satu juta
penderita. Pada tahun 2017 angka kematian pada anak usia 5 tahun
sebanyak 878.829 jiwa. World Health Organization (WHO) melaporkan
banyaknya kematian yang disebabkan pneumoniae terutama di negara
berkembang. Klebsiella pneumoniae menjadi penyebab terbanyak
kedua setelah e.coli dalam hal menyerang orang yang berusia lanjut
(Samirah et al,2014). Negara yang paling banyak menyumbang angka
kematian adalah Negara India sejumlah 158.176, diikuti Nigeria
diurutan kedua dengan angka 140.520 dan Pakistan diurutan ketiga
sebanyak 62.782 kematian. Sementara Indonesia menduduki urutan
ketujuh dengan total kematian 20.084 jiwa (WHO,2018). Data
Riskesdas menyatakan bahwa prevalensi pneumoniae di Indonesia
mengalami peningkatan dari tahun 2017 ke tahun 2018 yaitu dari 3.55%
di tahun 2017 menjadi 4% di tahun 2018. Kemenkes RI juga
menyebutkan, bahwa Jawa Barat menduduki penderita terbanyak
pertama dalam temuan kasus pneumoniae kemudian disusul oleh Jawa
Timur dan juga Jawa Tengah. Presentase kasus pneumoniae pada balita
2
sebesar 46,34% sebanyak 447.431 kasus. Angka kematian balita akibat
pneumoniae berasal dari Jawa Timur, Sulawesi Tenggara dan Jawa
Barat (Kemenkes RI, 2018).
Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri penyebab
pneumoniae. Klebsiella termasuk dalam opportunistic pathogen pada
pasien dengan penyakit pernafasan akut dan rhinoscleroma. Klebsiella
akan mudah menyerang orang dengan sistem pertahanan tubuh yang
terganggu, seperti penurunan kesadaran, diabetes mellitus, penyakit
jantung, kanker dan penyakit kronis lainnya. Selain itu, banyaknya
bakteri serta keganasan pathogen yang masuk ke tubuh dapat
menentukan terinfeksi atau tidaknya (Jawetz,2007). Sumber penularan
paling sering melalui feses, dan diikuti oleh alat terkontaminasi
Klesbiella pneumoniae (Podschun, 1998; Sarathabu, 2012). Klebsiella
pneumoniae merupakan patogen oportunistik gram negatif yang sering
ditularkan secara nosokomial. Terjadinya infeksi akan memicu
kolonisasi pertama kali di gastrointestinal. . (Damien Balestrino et al.,
2005)
Klebsiella pneumoniae memiliki kapsul yang dapat melindungi
dirinya dari fagositosis dan bakterisidal serum (Tarina dkk, 2017).
Berbeda dengan bakteri lainnya, Klebsiella pneumoniae memiliki faktor
kepatuhan untuk membentuk biofilm pada permukaan abiotik. Dalam
studi sebelumnya penginderaan kuorum basil gram negatif diketahui
terlibat dalam virulensi dan pembentukan biofilm (karakterisasi
penginderaan). Pembentukan biofilm Klebsiella pnemoniae diregulasi
3
oleh kepadatan sel melalui “Quorum sensing” dengan cara melepaskan
molekul pengatur autoinduser tipe-2 (AI-2) di kompartemen
ekstraseluler (Balestrino et al., 2005). AI-2 merupakan sinyal bakteri
nonspesifik pada bakteri gram negative dan gram positif yang disintesis
oleh S-ribosylhomocysteine lyase (LuxS) (Schauder et al., 2001 ).
Melalui matriks polisakarida, biofilm bertindak sebagai alat komunikasi
antar sel. Biofilm terbentuk dari beberapa mikroorganisme yang sel
selnya terikat satu sama lain. Mikroorganisme ini berdiferensiasi dan
berkembangbiak membentuk morfologi baru secara kompleks menjadi
biofilm (O’toole, Kaplan and Kolter, 2000). Biofilm berfungsi sebagai
sistem pertahanan bakteri dan dapat melindungi bakteri dari antibiotik
yang diberikan sehingga menyebabkan resistensi pada antibiotik
terutama pada infeksi kronis. Biofilm memiliki struktur alami yang
dapat melindungi selnya dari antimikroba serta dapat mempertahankan
sel hostnya. Tidak hanya itu, struktur biofilm dapat melindunginya dari
kondisi ekstrim seperti kekeringan, syok osmotik, radiasi sinar UV dan
paparan senyawa toksik (Paraje, 2011).
Beberapa jenis Klebsiella pneumoniae dapat diobati dengan
antibiotik yang mengandung cincin beta-laktam (Anderson,
K.F.,Patel,J.B. & Wong, B.,2009). Dalam penelitian menunjukkan
bahwa bakteri ini memiliki sensitivitas 98,4% terhadap meropenem,
98% terhadap imipenem, 92,5% terhadap kloramfenikol, 80% terhadap
siprofloksasin, dan 2% terhadap ampisilin. Selain itu Klebsiella
pneumoniae juga resisten terhadap antibiotik jenis penisilin,
4
sefalosporin, dan azetreonam dikarenakan bakteri ini juga dapat
memproduksi enzim urease dan enzim sitrat permiase serta enzim ESBL
(Extended Spektrum Beta Lactamase) (Katzung, 2002). Akan tetapi
dengan berjalannya waktu bakteri ini resisten terhadap beberapa
antibiotik (Beesley, T., Gascoyne, N.&KnottHunziker, V., 1983). Hal
itu disebabkan karena strain baru Klebsiella dapat memproduksi enzim
beta-laktamase sehingga dapat menghidrolisis cincin beta-laktam yang
terdapat pada antibiotik tersebut, apabila cincin tersebut lisis maka
resistensi bakteri akan meningkat (Muhajir at al., 2016). Oleh karena itu
bakteri semakin kebal dan sulit untuk dilumpuhkan (Keith,
Miller.Immunocytochemical Techniques, 2002).
Untuk mengatasi permasalahan biofilm ini perlu dilakukan
strategi yang dapat menghambat dan merusak lapisan biofilm. Salah satu
cara yang dapat dilakukan yaitu dengan menggunakan antimikroba yang
disertai zat kimia, sehingga antimikroba dapat mencapai target
membunuh bakteri (Cortés et al., 2011). Strategi alternatif terbaru
mengembangkan upaya untuk melawan infeksi bakteri dengan
mengidentifikasi senyawa baru yang menarget pada proses
pembentukan bakteri, termasuk Quorum sensing dan pembentukan
biofilm (Brackman G et al., 2014; Wang Y-M., 2019). Seperti telah
ditemukannya enzim “quorum quenching” yang dapat menonaktifkan
molekul AI-2 serta menghambat pembentukan biofilm dalam Klebsiella
pneumoniae (Weiland-Bräuer N et al., 2016). Berpendapat bahwa
pembentukan biofilm Klebsiella pneumoniae berkurang karena adanya
5
suplementasi karbohidrat. Dari hasil sintesis eksopolisakarida yang
ditingkatkan dapat berpotensi menghambat pemaparan dan perlekatan
faktor perekat seperti fimbriae. Kelebihan nutrisi juga dapat
menyebabkan perubahan regulasi dengan memicu pertumbuhan
planktonik dan menghambat pertumbuhan biofilm (Stanley NR.,
Lazazzera BA., 2004). Dari hasil penelitian yang telah dilakukan
menyatakan bahwa konsentrasi gula yang tinggi seperti glukosa dapat
menghambat pembentukan biofim (Jackson DW et al., 2002 ; Sutrina
SL et al., 2015). Adanya interferensi pembentukan kapsul bakteri
dengan adhesion akan mempengaruhi perlekatan bakteri sehingga
pembentukan biofilm akan berkurang (Schembri MA et al., 2004).
Aspergillus oryzae terbukti dapat memproduksi glukosa, hal tersebut
ditunjukkan dengan tingginya kadar glukosa Aspergillus oryzae pada
substrat pati ubi di hari ke 8 fermentasi sebesar 222,33 mg/ml
Rachmawaty (2010). Pembentukan glukosa ini atas peranan enzim β-
glucosidase. Enzim ini memotong ikatan β-D-glukosidik beberapa
senyawa yang melepaskan glukosa sebagai produk akhir (Bhatia Y.,
Mishra S., Bisaria V., 2002)
Berbeda dengan Aspergillus flavus, Jamur ini tidak dapat
menghasilkan aflatoksin (Varga dkk. 2011; Frisvad dkk. 2018).
Aflatoksin merupakan zat beracun yang terkandung pada jamur yang
biasa dikenal sebagai mikotoksin (Sutriswati, 2020). Sebaliknya, jamur
ini merupakan penghasil metabolit sekunder yang baik. Banyak industri
yang mengolahnya untuk dijadikan bahan pangan. BAUA (German
6
Federal Institute for Occupational Safety and Health) juga menyatakan
bahwa Aspergillus niger dan Aspergillus oryzae diklasifikasikan sebagai
agen biologis yang aman. Aspergillus oryzae diketahui dapat
menghasilkan beberapa senyawa yang dapat digunakan sebagai
antibiofilm. Asam lemak dapat berperan sebagai antibiofilm dengan
menghambat proses perlekatan, adhesi, EPS, fimbriae, pembentukan
biofilm, serta maturasi biofilm (Kumar P et al, 2020). Aspergillus oryzae
memiliki kandungan asam lemak yang dapat menghambat pembentukan
biofilm yaitu asam strearat, asam palmitate, asam linoleic dan asam
oleic. Aspergillus oryzae banyak ditemukan di Indonesia, jamur ini
dapat ditemukan di tanah dan tanaman terutama padi. Jamur ini juga
dapat tumbuh pada jagung (K Gomi, 2014). Dari hasil penelitian
menunjukan bahwa Aspergillus oryzae juga ditemukan di gaplek
singkong (H.A Oramahi. et al, 2006). Dimana ubi kayu termasuk
tanaman produksi terbanyak ketiga setelah padi dan jagung (Kementrian
pertanian, 2016). Hasil pertanian yang disimpan terlalu lama akan
menjadi tempat pertumbuhan jamur (H.A Oramahi. et al, 2006). Dari
sini diharapkan jamur tersebut dapat diambil manfaatnya sebagai obat
alternative penghambat dan perusak biofilm Klebsiella pneumoniae.
Oleh karena itu peneliti ingin mencari solusi dengan
mengidentifikasi antibiofilm yang dapat menghancurkan biofilm pada
Klebsiella pneumoniae. Dengan berpatokan pada hadist muslim yang
berbunyi :
لكل داء دواء، فإذا أصيب دواء الداء برأ بإذن الل
7
Yang memiliki arti "Semua penyakit ada obatnya. Apabila sesuai antara
obat dan penyakitnya, maka (penyakit) akan sembuh dengan izin Allah
SWT." Hadist itu membuat peneliti bersemangat untuk mencari
solusinya. Didukung dengan teori yang telah ada peneliti ingin
membuktikan apakah Aspergillus oryzae dapat dijadikan sebagai
antibiofilm Klebsiella pneumoniae dan harapannya dapat menurunkan
angka pneumonia khususnya di Indonesia.
1.2 Rumusan Masalah
1.2.1 Rumusan Masalah Umum
Bagaimana aktivitas antibiofim Aspergillus oryzae terhadap
biofilm Klebsiella pneumoniae?
1.2.2 Rumusan masalah Khusus
1. Bagaimanakah aktivitas antibiofim Aspergillus oryzae terhadap
perlekatan pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae?
2. Bagaimanakah aktivitas antibiofim Aspergillus oryzae terhadap
penghambatan pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae?
3. Bagaimanakah aktivitas antibiofim Aspergillus oryzae terhadap
penghancuran pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae?
1.3 Tujuan Penelitian
1.3.1 Tujuan Umum
Mengetahui aktivitas antibiofim Aspergillus oryzae terhadap
penghambatan pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae?
1.3.2 Tujuan Khusus
8
1. Mengetahui aktivitas antibiofim Aspergillus oryzae terhadap
perlekatan pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae?
2. Mengetahui aktivitas antibiofim Aspergillus oryzae terhadap
penghambatan pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae?
3. Mengetahui aktivitas antibiofim Aspergillus oryzae terhadap
penghancuran pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae?
1.4 Manfaat Penelitian
1.4.1 Manfaat Akademik
Memberikan informasi tambahan guna pengembangan ilmu
kesehatan mengenai manfaat Aspergillus oryzae sebagai antibiofilm
pada Klebsiella pneumoniae.
1.4.2 Manfaat Aplikatif
1. Penelitian ini dapat digunakan sebagai pilihan obat alternatif
dalam pengobatan penyakit yang disebabkan oleh infeksi
Klebsiella pneumoniae.
2. Penelitian ini dapat digunakan sebagai sumber informasi tentang
pemanfaatan Aspergillus oryzae sebagai antibiofilm pada
Klebsiella pneumoniae.
3. Penelitian ini dapat digunakan sebagai pertimbangan penelitian
lebih lanjut.
9
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pneumonia
Pneumonia adalah infeksi akut pada organ pernapasan
khususnya alveoli, infeksi ini disebabkan oleh mikroorganisme seperti
virus, bakteri dan jamur (Kemenkes, 2020). Pada pemeriksaan fisik
biasanya di dapatkan penurunan suara napas, rales, fremitus taktil dan
crakles. Takipnea dan hipotensi juga dapat ditemukan pada pasien
dengan pneumonia, gejala tersebut memerlukan evaluasi segera (Jain. et
al, 2015). Diagnosis pneumonia perlu dicurigai pada pasien yang
menunjukan gejala demam dengan onset akut atau menggigil dan batuk.
Juga sering ditemukan adanya kelelahan, anoreksia, dan nyeri dada
pleuritik yang merupakan gejala tambahan pada pneumonia. Riwayat
perjalanan terakhir, riwayat penyakit paru-paru, dan riwayat merokok
juga perlu dievaluasi sebagai rangkaian diagnostik (Kaysin A & Viera
AJ, 2016)
Gambar 2.1 Perbedaan alveoli pada orang dengan pneumonia (kiri) dan
orang sehat (kanan)
(Sumber: Nurarif & Kusuma, 2016)
10
Bakteri yang masuk ke tubuh tidak akan menyebabkan infeksi
jika tidak ada reseptor yang mengenalinya. Bakteri pathogen dapat
menghasilkan produk berupa Pathogen Associated Molecular Pattern
(PAMP) yang akan dikenali oleh Toll Like Receptor (TLR). TLR berada
di permukaan makrofag alveolar, kemudian NFκβ akan aktif dan akan
melepaskan sitokin pro-inflamasi yang berupa interleukin IL-6, IL-8,
IL-1β, Tumor Necrosis Factor (TNF- α), dan IFN- α (Martinez, et al,
2011; Moldoveanu, et al, 2009). Sitokin pro-inflamasi akan meningkat
tajam seiring dengan terjadinya infeksi mikroba. Sitokin ini juga akan
memicu pelepasan procalcitonin (PCT) dan kemudian menyebabkan
terjadinya ekstravasasi neutrophil ke jaringan (Medzhitov R, 2010).
Pada saat tubuh mengalami penurunan sistem imun seperti adanya
pengaruh penyakit, usia tua, dan malnutrisi bakteri pneumonia akan
berkembang dengan cepat dan menginfeksi jaringan paru. Jaringan paru
yang rusak merupakan akibat dari respon imun dan peradangan oleh
pejamu. Zat toksin yang dihasilkan oleh bakteri dapat merusak sistem
pernafasan bawah secara langsung. Jika infeksi pada jaringan paru tidak
segera ditangani, akan memicu penyebaran infeksi ke seluruh tubuh
melalui darah (Corwin EJ, 2009). Pneumonia masih menjadi penyebab
utama komplikasi penyakit dan kematian meskipun penelitian tentang
antibiotik terus dilakukan hingga saat ini. Tingginya angka kematian
disebabkan oleh tingginya respon inflamasi. Respon inflamasi
ditunjukan sebagai proses perlawanan terhadap bakteri, namun
inflamasi yang berlebih akan menimbulkan kerusakan lokal sampai
11
kerusakan sitemik secara berulang (Meijvis SCA, et al, 2012). Inflamasi
yang berlebihan memicu terjadinya kerusakan paru. Oleh karena itu
diperlukan terapi antiinflamasi yang ideal dan dapat mengurangi
komplikasi dari respon inflamasi sistemik tanpa memicu proses
inflamasi lokal lain. Sel sel inflamasi akan terus diaktifkan selama
proses inflamasi berlangsung. Proses tersebut akan mendorong sitokin
dan mediator inflamasi untuk dikeluarkan (Reviono, 2017).
Antiinflamasi yang diberikan pertama kali adalah golongan
kortikosteroid. Kortikosteroid disebut sebagai inhibitor untuk inflamasi
yang cara kerjanya membunuh gen yang mengkode sitokin antiinflamasi
(Reviono, 2017). Terapi suportif juga perlu dilakukan disamping
pemberian terapi antibiotik. Terapi suportif ditujukan sebagai
penghilang dari gejala pneumonia, pemberian terapi suportif bisa
dengan menggunakan antipiretik, mukolitik, ekspektoran, terapi
oksigen, terapi cairan serta memberikan anjuran untuk istirahat yang
cukup (Reviono, 2017).
12
Gambar 2.2 Patofisiologi pneumonia
(Sumber: Nurarif & Kusuma, 2016)
2.1.1 Pneumonia Akibat Klebsiella pneumoniae
Bakteri patogen pneumonia sering tidak terdeteksi (Grief &
Loza, 2018). Oleh karena itu identifikasi bakteri patogen penyebab
pneumonia penting untuk dilakukan. Identifikasi ini merupakan upaya
yang sulit untuk dilakukan dan memakan waktu yang lama. Identifikasi
etiologi bertujuan untuk mengkonfirmasi patogen penyebab, sehingga
pemberian terapi dapat dilakukan secara tepat guna mengurangi
penggunaan antimikroba yang berlebihan (Irawan dkk, 2019).
Organisme patogen yang sering menjadi penyebab pneumonia antara
lain: Pseudomonas aeruginosa, spesies Klebsiella, Staphylococcus
aureus, Haemopbilus influenzae, Staphylococcus pneumoniae, serta
13
basilus Gram negatif, jamur, dan virus yang sering terjadi pada anak
anak (Brunner & Suddarth, 2011). Pneumonia karena Klebsiella dapat
ditandai dengan adanya demam tinggi, lesu dan batuk kering. Batuk
kering kemudian akan berlanjut menjadi batuk produktif yang disertai
dengan sputum darah dan purulent. Jika tidak segera ditangani akan
menyebabkan terjadinya abses, nekrosis dan fibriosis pada jaringan paru
(Wulandari & Asih, 2017).
2.2 Klebsiella pneumoniae
2.2.1 Taksonomi Klebsiella pneumoniae
Taksonomi K. pneumoniae menurut Jawetz (2005) adalah
sebagai berikut:
Kingdom : Bacteria
Phylum : Proteobacteria
Class : Gamma Proteobacteria
Order : Enterobacteriales
Family : Enterobacteriaceae
Genus : Klebsiella
Species : K. pneumonia
2.2.2 Karakteristik Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae adalah bakteri Gram-negatif, memiliki
bentuk batang pendek dengan ukuran 0,5-0,5 x 1,2 μL. Bakteri ini tidak
memiliki flagel dan tidak dapat membentuk spora. Klebsiella
pneumoniae tidak dapat bergerak namun dapat memfermentasikan
karbohidrat menjadi asam dan gas. Tidak hanya itu bakteri ini juga dapat
14
memfermentasikan laktosa. Bakteri ini termasuk bakteri fakultatif
anaerob yang dapat tumbuh baik pada lingkungan dengan oksigen atau
tanpa oksigen (Greenwood et al., 2012). Klebsiella pneumoniae
memiliki kapsul yang dapat melindungi dirinya dari fagositosis dan
bakterisidal serum. Klebsiella pneumoniae dapat ditemukan di sampel
darah, urin, cairan pleura (Tarina dkk, 2017). Bakteri spesies ini juga
ditemukan di permukaan mukosa hewan dan berada di lingkungan
seperti air, tanah dll (Wang G, 2020). Klebsiella pneumoniae banyak
terkonsentrasi di saluran pencernaan dan sedikit di nasofaring. Bakteri
ini bergabung dalam sirkulasi darah lalu ke jaringan dan kemudian
menyebabkan infeksi (Wang G, 2020).
Klebsiella pneumoniae termasuk bagian dari keluarga
Enterobacteriaceae. Secara klasik bakteri ini dianggap sebagai
pathogen opportunistic, karena menyebabkan infeksi pada orang yang
dirawat di rumah sakit dan atau dengan kekebalan tubuh yang menurun.
Bakteri ini juga menjadi penyebab utama pneumonia terkait ventilator
(VAP) di ruang perawatan intensive ( Kalanuria et al., 2014; Selina dkk.,
2014 ). K. pneumoniae mempunyai banyak genom aksesori, genom ini
berasal dari plasmid dan lokus gen kromosom. Dari genom aksesori ini
membagi K. pneumoniae menjadi tiga jenis strain, yaitu oportunistik,
hipervirulen dan multidrug-resisten (MDR) (Martin & Bachman, 2018).
Bakteri ini menjadi penyebab infeksi pada pernapasan, infeksi saluran
kemih, infeksi nosocomial, serta menyebabkan kematian pada manusia
hingga 10% (Tarina & Kusuma, 2017).
15
2.2.3 Faktor virulensi Klebsiella penumoniae
Setiap mikrooganisme patogen memiliki faktor virulensi. Faktor
virulensi berguna untuk meningkatkan kemampuan patogenitas suatu
bakteri. K. pneumoniae memiliki beberapa faktor virulensi antara lain,
yaitu lipopolisakarida (LPS), kapsul, pili (tipe 1 dan tipe 3), dan
pembawa zat besi atau dikenal sebagai siderofor (Shon. Et al, 2013).
Lipopolisakarida (LPS) merupakan komponen utama
pembentuk membran luar bakteri gram negatif. LPS juga disebut
sebagai mediator paling kuat dari penyebab syok septik karena bakteri
(Martin, 2018). LPS tersusun dari antigen lipid A, inti, dan O-
polisakarida yang berguna sebagai sistem pertahanan diri dari
komplemen. Dan CPS dikenal sebagai faktor virulensi K. pneumoniae
yang berada pada lapisan luar pathogen yang mengandung sel
polimorfonuklear yang berguna sebagai faktor resistensi terhadap
adanya fagositosis (Shakib. et al, 2018). Bakteri genus Klebsiella
memiliki struktur antigen yang kompleks, sehingga spesies K.
pneumoniae juga memiliki struktur antigen yang sama. Genus
Klebsiella terdiri dari 2 tipe struktur antigen di permukaannya, yaitu
antigen O dan antigen K. Antigen O berada di bagian paling luar dari
dinding sel lipopolisakarida yang terdiri dari unit polisakarida yang
berlapis. Antigen O dapat tahan pada lingkungan yang panas dan
alkohol,antigen ini dapat dideteksi dengan proses aglutinasi bakteri
(Rufaldi, 2016). Antigen O dilapisi lagi oleh Antigen K, antigen K
merupakan casular polysacharida (CPS). Klebsiella dilindungi oleh
16
kapsul besar yang berupa polisakarida yang menutupi antigen somatik
O dan H, antigen ini dapat dideteksi melalui tes pembengkakan kapsul
menggunakan antiserum khusus (Rufaldi, 2016).
Kapsul dan pili berperan penting dalam proses patogenitas dan
ketahanan hidup dan disebut sebagai komponen struktural yang
prominen dari bakteri Klebsiella pneumoniae (Rufaldi, 2016). Kapsul
K.pneumoniae bagian luar terbentuk dari susunan polisakarida dan
lipoprotein. Kapsul ini menghalangi proses bakterisidal dan mencegah
fagositosis, tidak hanya itu kapsul ini juga dapat menghambat
complement mediated lysis and opsonization dan mengurangi respon
inflamasi (Paczosa & Mecsas, 2016). Pili tipe 1 dan tipe 3 berfungsi
sebagai adhesi bakteri ke epitel, sel imun, dan permukaan abiotik (Wang
G. et al, 2020). Pili tipe 1 memiliki bentuk tipis dan mempunyai tonjolan
di permukaannya yang menyerupai benang. Pili ini di aktifkan oleh
bakteri melalui isyarat lingkungan. Pili ini aktif ketika berada di saluran
kemih, bukan di saluran GI atau paru paru, oleh karena itu pili ini sangat
berpengaruh terhadap terjadinya ISK. Pili tipe 3 memiliki bentukan
filamen menyerupai helix dan berfungsi dalam proses pengikatan pada
sel bukal, sel trakea, dan organ paru.
Besi berguna dalam proses pertumbuhan bakteri. K. pneumoniae
memiliki kemampuan untuk memperoleh zat besi. Terdapat 4 molekul
yang berfungsi untuk menyerap zat besi, yaitu : enterobactin,
yersiniabactin, salmochelin, dan aerobactin. Enteromycin merupakan
strain yang tipikal dan sangat virulen, strain ini memiliki kemampuan
tinggi dalam menyerap besi sehingga disebut sebagai penyerap besi
utama (Wang G. et al, 2020). Berbeda dengan enteromycin, gastrin dan
yersinide lebih banyak ditemukan pada hvKp daripada cKp (Defense,
2016 ; Happel. et al, 2005). Aerobaktin menjadi faktor virulensi paling
17
penting di hvKp, strain ini juga berperan sebagai pembawa zat besi dan
pertumbuhan (Wang G. et al, 2020). Salmochelin menjadi penyebab
infeksi komunitas yang berbahaya, strain ini menjadi pencetus abses hati
dan pneumonia (Lam. et al, 2018). Dibandingkan strain non-virulen,
strain hvKp menghasilkan molekul penyerap besi yang lebih besar dan
lebih aktif dalam hal menyebabkan virulensi dan patogenitas (Russo. et
al, 2011)
Gambar 2.3 Skema faktor virulensi dan pembentukan biofilm pada
Klebsiella pneumonia
(Sumber: Wang et al, 2020)
2.2.4 Identifikasi Karakteristik Klebsiella penumoniae
2.2.4.1 Uji pewarnaan Gram
Secara makroskopis identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan
pewarnan gram dan kapsul (Rahayu & Gumilar, 2017). Pewarnaan gram
dapat menunjukkan bentuk, ukuran dan susunan bakteri (Abidah, 2020).
Pewarnaan gram juga dapat menentukan bakteri berdasarkan sifat
gramnya, apakah termasuk dalam gram positif atau gram negatif. Saat
18
bakteri gram negatif diberikan decolorization agent (alkohol),
komponen kristal violet akan mudah terlepas dari ikatannya sehingga
bakteri akan kehilangan warna dari kristal violet. Dan kemudian bakteri
akan menyerap warna dari pewarna lain seperti safranin, sehingga sel
akan tampak berwarna kemerahan atau pink. Hal tersebut dikarenakan
lapisan peptidoglikan yang lebih tipis. Berbeda dengan bakteri gram
positif yang memiliki peptidoglikan yang lebih tebal, sehingga bakteri
dapat mempertahankan pewarna kristal violet dan sel akan berwarna
ungu (Post & Songer, 2005). Secara mikroskopis, identifikasi Klebsiella
pneumoniae memperlihatkan bakteri berwarna merah yang
menunjukkan bahwa bakteri ini masuk dalam golongan bakteri gram
negatif (Rahayu & Gumilar, 2017). Selain itu dari pewarnaan
menunjukkan bahwa K. pneumoniae berbentuk batang pendek dan tidak
berkoloni (Wulandari & Asih, 2017).
Metode pewarnaan gram merupakan metode yang dapat
dilakukan dengan cara sederhana dan murah serta dapat mendiagnosis
infeksi dengan cepat. Metode ini lebih cepat dibandingkan dengan kultur
bakteri, sehingga cara tersebut dapat digunakan sebagai pedoman awal
untuk memutuskan pemilihan terapi antibiotik sambil menunggu bukti
definitif bakteri pathogen secara spesifik. Metode ini memiliki
kekurangan yaitu hanya dapat mengetahui ukuran, bentuk dan struktur
bakteri dengan mengandalkan zat warna saja. Padahal kondisi
pewarnaan gram dapat berubah akibat penggunaan terapi antimikroba
(Bulele. et al, 2019). Bentuk batang pada gram negatif dapat berubah
19
menjadi filament dan pleomorfik sedangkan bakteri gram positif dapat
menjadi bervariasi (Nagata. et al, 2010).
Gambar 2.4 Pewarnaan Gram pada bakteri. Gram negative
menghasilkan warna pink (kiri) dan Gram positif berwarna violet (kanan).
Sumber: www.medicallabscientist.org
2.2.4.2 Uji Biokimia
Untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi sifat fisiologi suatu
biakan murni dapat dilakukan dengan uji biokimia (Rahayu & Gumilar,
2017). Proses biokimia bakteri memperlihatkan cara kerja metabolisme
sel, proses tersebut menunjukkan reaksi kimiawi yang dilakukan sel
untuk menghasilkan energi maupun saat menggunakan energi untuk
sintesis dan kegiatan seluler lainnya. Uji biokimia dapat dilakukan
dengan beberapa metode, yakni Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Urea
test, dan Indol, Methyl red, Voges Preskauer, Simmon’s Citrate
(IMViC).
Triple Sugar Iron Agar (TSIA) bertujuan untuk mengidentifikasi
suatu bakteri sesuai dengan karakter spesifiknya. Media TSIA
mengandung zat zat seperti : laktosa 1%, sukrosa 1%, glukosa 0,1 %,
ekstrak jaringan (substrat pertumbuhan protein), ferosulfat (untuk
mengidentifikasi produksi H2S), dan indikator PH (fenol merah). Zat zat
20
tersebut dapat menunjukkan kemampuan bakteri dalam
memfermentasikan glukosa, sukrosa, laktosa dan mereduksi sulfur
(Abidah, 2020). Kemudian media ini dimasukkan pada tabung dengan
posisi miring dan bakteri di tumbuhkan pada bagian dalam pangkal
(Khotimah, 2020). Pada Klebsiella sp. menunjukkan warna kuning pada
bagian dalam pangkal yang berarti bakteri ini menghasilkan reaksi asam,
tidak ditemukan H2S dan menunjukkan adanya produksi gas (Hart, 2004
; Kusuma, 2013 ; Brooks et al 2015).
Uji urease, bertujuan untuk mendeteksi kemampuan organisme
dalam menghasilkan enzim urease dengan cara menghidrolisis urea.
Warna merah muda mengiterpretasikan hasil positif yang ditunjukkan
bahwa bakteri mampu menghasilkan enzim urease, dan negatif ketika
tidak menunjukkan perubahan warna. Pada Klebsiella Pneumonia
menunjukkan hasil yang positif (Hart, 2004; Brooks et al, 2015).
Uji indol, bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri
dalam menggunakan enzim tryptophanase untuk menghasilkan indol.
Indol dapat terbentuk karena adanya tryptophan di dalam media.
Tryptophan merupakan hasil akhir dari oksidasi asam amino esensial
bakteri yang berguna untuk proses pembentukan indol, asam piruvat,
dan ammonia (Hemraj. V, 2013). Warna merah menujukkan adanya
pembentukkan indol dan warna kuning tidak. Pada Klebsiella
pneumoniae menghasilkan warna kuning, itu menunjukkan bahwa
bakteri tidak dapat menghasilkan indol (Hart, 2004).
21
Uji Voges Proskauer (VP), bertujuan untuk mengetahui
kemampuan bakteri dalam menghasilkan acetonin. Untuk menentukan
adanya acetonin diperlukan kultur cair bakteri. Kultur bakteri terbuat
dari kaldu voges proskauer yang diinokulasi dengan bakteri dan
kemudian ditambahkan alphanaftol dan kalium hidroksida. Hasil positif
akan berwarna merah, dan hasil negatif berwarna kuning coklat atau
tidak berwarna. Pada uji VP bakteri K. pneumoniae akan menghasilkan
warna merah (Hart, 2004).
Uji sitrat, bertujuan untuk mengidentifikasi sumber karbon dan
energi yang digunakan bakteri. Bakteri dapat mengubah medium dari
hijau menjadi biru apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber
karbonnya. K. pneumoniae mampu mengubah warna hijau menjadi biru,
hal itu menunjukkan bahwa bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber
karbonnya (Hart, 2004; Gray W, 2016)
Gambar 2.5 Uji IMViC pada Klebsiella pneumoiae. Urut dari kiri Indole,
Methyl Red, Voges Proskauer, dan Citrate acid.
(Sumber: www.researchgate.net )
22
2.2.4.3 Biakan Pada Medium Diferensial
Medium diferensial dapat menunjukkan tampilan khas suatu
koloni dari bakteri. Media Mac Conkey berbentuk seperti agar yang
mengandung Kristal violet dan garam empedu, media ini diketahui dapat
menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif (Waluyo, 2010). Hal ini
menunjukkan bahwa tidak semua bakteri dapat tumbuh, media ini hanya
dapat ditumbuhi oleh bakteri Gram negatif (Kambuono & Fanggidae,
2017). Uji Mac Conkey juga dapat digunakan untuk mengetahui
kemampuan bakteri dalam memfermentasikan laktosa. Bakteri yang
dapat memfermentasikan laktosa dapat merubah kultur bakteri menjadi
berwarna merah (Kambuono & Fanggidae, 2017). Pada K. pneumoniae
menunjukkan hasil kultur berwarna merah yang berarti positif
memfermentasikan laktosa dan menunjukkan koloni berukuran besar
mengkilap (Baban, 2017).
Gambar 2.6 Koloni Klebsiella pneumoniae pada medium Mac conkey.
(Sumber www.researchgate.net)
2.3 Biofilm
Biofilm merupakan sekumpulan mikroorganisme yang
terbungkus oleh glikokaliks. Dengan adanya glikokaliks
23
mikroorganisme dapat menempel diberbagai permukaan baik hidup atau
mati. Biofilm yang menempel pada lambung kapal dapat meningkatkan
hambatan pada kapal tersebut, sehingga menambah penggunaan bahan
bakar. Pada manusia, biofilm dapat melekat pada perangkat medis dan
dapat ditemukan pada permukaan mukosa. Mikroorganisme yang paling
umum membentuk biofilm adalah bakteri dan jamur, namun virus dan
parasite juga dapat membentuk biofilm ( Bisson et al., 2018 ; Pais-
Correia et al., 2010 ). EPS (Extracellular Polymeric Substances)
merupakan bahan organik utama yang membentuk matriks biofilm. EPS
terdiri dari eksopolisakarida, protein, DNA ekstraseluler, humic acids
dan lipid yang berguna untuk membentuk biofilm yang heterogen
(Chew & Yang, 2016)
2.3.1 Mekanisme Pembentukan Biofilm
Proses pembentukan biofilm dimulai dengan interaksi antar
bakteri untuk melakukan perlekatan pada permukaan. Interaksi
diperantai oleh sistem adhesi spesifik (flagela, fimbria, lipopolisakarida,
atau protein adhesi), interaksi ini dapat dilakukan secara hidrofilik
ataupun hidrofobik yang memyebabkan perlekatan menjadi irreversibel
(Gupta et al, 2015). Dalam pembentukan biofilm lingkungan yang padat
dan cair dapat mendukung pertumbuhan dan perlekatan biofilm (Jamal
et al, 2015).
Setelah melekat secara irreversibel bakteri akan akan melakukan
quorum sensing sebagai komunikasi untuk mengkoordinir pertumbuhan
mikro-koloni. Quorum sensing ini diperantai oleh sinyal peptida dan
24
molekul lainnya seperti competence stimulating peptide, 3,5- cyclic
diguanylic acids (c-di-GMP), rhamnolipid, farnesol, modulin yang larut
dalam fenol, dan lan sebagainya (Kumar et al., 2017). Dalam
pembentukan mikrokoloni, bakteri membutuhkan EPS yang berguna
untuk melekatkan bakteri satu dengan yang lain (Gunardi, 2014). Tidak
hanya itu, EPS juga mampu melindungi sel-sel bakteri dari perubahan
lingkungan yang disebabkan antimikroba, sistem imun inang, oksidasi
dan kation logam (Jamal et al, 2015). Mikrokoloni akan terus
berkembang menjadi makrokoloni yang memiliki fluid-filled channel
sebagai saluran pertukaran produk sisa dalam biofilm (Gupta et al.,
2015).
Proses pembentukan bofilm selanjutnya adalah maturasi.
Meningkatnya kepadatan dan kompleksitas biofilm menunjukkan awal
terjadinya proses maturasi. Ketika biofilm telah berada pada titik
keseimbangan dinamik yang stabil, persediaan nutrisi dan pH akan
berkurang serta akan menyebabkan terjadinya akumulasi tekanan O2
yang dapat menyebabkan toksik metabolik. Hal tersebut menyebabkan
bakteri mengalami dispersi.
Pada proses dispersi akan menyebabkan penurunan produksi
ekspopolisakarida atau pili, serta akan meningkatkan regulasi gen yang
mengode protein kamotaktik dan flagela guna kehidupan sel planktonik
yang baru (Kumar et al., 2017). Planktonik akan terlepas dari biofilm
dan membentuk biofilm dengan siklus yang baru (Toyofuku et al, 2015)
25
2.3.2 Quorum sensing
Mikroorganisme telah mengembangkan kemampuan
berkomunikasi di dalam sel agar mikroorganisme dapat bereproduksi
dan tetap bertahan hidup meskipun terdapat perbedaan lingkungan
(Barriuso, Hogan, Keshavarz, & Martínez, 2018). Komunikasi antar sel
ini biasa disebut dengan Quorum sensing. Quorum sensing (QS)
merupakan sistem komunikasi mikroorganisme yang bergantung pada
kepadatan sel, QS ini mampu memicu terjadinya pembentukan biofilm
dan faktor virulensi. QS berperan terhadap pembentukan biofilm dengan
mendegradasi material, fouling, kontaminasi dan dapat menyebabkan
infeksi (Elias & Banin, 2012 ; Mieszkin et al. al., 2013 ; Wu dkk., 2015).
Autoinduser memiliki peran penting dalam komunikasi antar sel
(quorum sensing). Akumulasi autoinduser intra dan ekstraseluler dapat
meningkatkan bakteri dalam mendeteksi kepadatan sel. Hal ini dapat
mempengaruhi regulasi gen dalam mengkoordinasi peningkatan
kepadatan sel untuk proses patogenitas dan formasi biofilm ( Barriuso,
Hogan, Keshavarz, & Martínez, 2018 ). Autoinduser pada bakteri gram
negative adalah asil-homoserin lakton (AHL), pada gram positif dengan
autoinduser autoinducing peptides (AIP), dan autoinduser-2 (AI-2) pada
kedua gram (Liu et al., 2012 ; Du et al., 2014 ; Brackman dan Coenye,
2015 ).
2.3.3 Pembentukan Biofilm dan Quorum sensing K. pneumonia
Pembentukan biofilm dan quorum sensing merupakan dua jenis
perilaku koloni mikroorganisme. Quorum sensing merupakan transmisi
26
sinyal penginduksi antar sel untuk mendeteksi kepadatan bakteri, dan
biofilm merupakan hasil agregasi sel (Passos da Silva, Schofield,
Parsek, & Tseng, 2017). Biofilm yang dibentuk K. pneumoniae dapat
menyebabkan kolonisasi bakteri di saluran pernapasan, gastrointestinal,
dan saluran kemih, serta dapat meningkatkan terjadinya infeksi invasif
pada orang dengan penurunan imun. Biofilm K.pneumoniae secara
klinis sering ditemukan pada kateter dan permukaan alat medis lainnya.
Biofilm K. pneumonia ini dapat menghambat antibodi, efek
komplemen, peptide antimikroba dan fagositosis (Fux et al, 2005).
Pembentukan biofilm K. pneumonia diawali oleh adhesi sel pada
permukaan benda keras dan membentuk suatu mikro-koloni matur yang
dapat memperbanyak sel dan akan dilepaskan secara bebas. K.
pneumoniae dapat membentuk biofilm karena adanya produksi EPS
yang mengakumulasi sel. EPS merupakan struktur kompleks yang
terdiri dari polisakarida, protein, dan DNA. Tidak hanya itu, pili tipe 3
dan kapsul polisakarida juga berperan penting terhadap pembentukan
biofilm K. pneumoniae (Hall-Stoodley et al, 2004). Pili berperan
membentuk adhesi yang stabil, dan kapsul polisakarida mempengaruhi
struktuktur biofilm dan komunikasi antar sel. Adanya perubahan
lingkungan yang progresif memicu bakteri untuk mengubah ekspresi
gen secara cepat dan ekstensif. Ekspresi gen tersebut diregulasi dan
dikontrol oleh quorum sensing. Fungsi biofilm dapat dipengaruhi oleh
adanya mutasi (Mostavi et al, 2018).
27
2.3.4 Biofilm Sebagai Penyebab Resistensi Antibiotik
Mikroorganisme yang terbungkus biofilm akan mengalami
peningkatan resistensi 1000 kali terhadap terapi antimikroba
dibandingkan dengan padanan planktonik lainnya (Ceri dkk). Penyebab
resistensi biofilm terhadap antimikroba bersifat multifaktorial,
kemungkinan dapat disebabkan oleh struktur pembentukan biofilm dan
kombinasi faktor lainnya. Mikroba yang terbungkus biofilm memiliki
kemampuan memblokir respon imun yang dapat menyebabkan
kerusakan sel inang (Dongari-Bagtzoglou, 2008). Resistensi antibiotik
diperantarai oleh beberapa mekanisme yaitu intrinsik, didapat, dan
adaptif (Moradali dkk, 2017). Mekanisme intrinsik atau mekanisme
melekat terjadi secara alami dengan mengkode mekanisme resistensi
tertentu. Resistensi yang didapat disebabkan oleh aktivitas mikroba
lainnya dengan melakukan mutasi gen atau transfer horizontal. Dan
resistensi adaptif disebabkan karena stressor antimikroba atau pengaruh
lingkungan. Oleh karena itu penggunaan antibiotik sebagai terapi pada
infeksi merupakan suatu tantangan.
2.3.5 Uji Pembentukan Biofilm
2.3.5.1 Metode Tabung
Metode tabung adalah metode kualitatif yang dapat dilakukan
untuk mendeteksi biofilm. Biofilm akan terlihat pada bagian dasar dan
dinding tabung membentuk garis yang menyerupai cincin. Pembentukan
biofilm dinyatakan positif ketika terdapat garis pada bagian dasar dan
dinding tabung. Pembentukan biofilm dapat dinilai berdasarkan
28
kekuatan pembentukannya. Skor 1 menunjukkan lemah / tidak terbentuk
biofilm, skor 2 berarti sedang, dan skor 3 menyatakan biofilm kuat
(Kirmusaoglu, 2019). Metode ini dapat memperlihatkan pertumbuhan
bakteri uji meskipun dengan kadar terendah larutan uji antibakteri
(Ruchi et al., 2015)
Gambar 2.7 Metode Tabung. Tabung kiri menunjukkan strong-biofilm
producer, tabung tengah menunjukkan weak-biofilm producer, tabung kanan
menunjukkan non-biofilm producer
(Sumber: Ruchi et al., 2015)
2.3.5.2 Metode Congo Red Agar
Metode Congo Red Agar (CRA) merupakan uji pembentukan
biofilm secara kualitatif yang dapat diamati melalui perubahan warna
yang dihasilkan. Metode ini menggunakan medium yang terdiri dari
brain heart infusion broth (37 g/L), sukrosa (50 g/L), agar no 1 (10 g/L)
dan Congo Red (8 g/L). Setelah bakteri ditanam pada plate CRA,
kemudian plate dimasukkan ke inkubator selama 24 jam dengan suhu
37oC. Selanjutnya diamati perubahan warna yang terjadi. Bakteri yang
dapat membentuk biofilm akan menunjukkan warna hitam (positif) dan
29
bakteri yang tidak dapat membentuk biofilm akan tetap berwarna merah
(negatif) (Kirmusaoglu, 2019).
Gambar 2.8 Metode Congo Red Agar. Koloni sebelah kanan menunjukan
CRA positif dan koloni sebelah kiri menunjukkan CRA negatif
(Sumber : www.researchgate.net)
2.3.5.3 Metode Microtiter Plate
Microtiter plate adalah alat yang digunakkan untuk mendeteksi
kemampuan mikroorganisme dalam membentuk biofilm. Metode ini
merupakan metode kuantitatif yang mudah dan efisien yang dapat
digunakan untuk menguji aktivitas antibiofilm terhadap biofilm suatu
bakteri. Diperlukan OD blank sebagai nilai ukur ada tidaknya
pembentukan biofilm. Nilai OD didapatkan dari pengukuran well-plate
dengan microplate reader. Adanya pembentukan biofilm ditunjukkan
dengan nilai OD isolat lebih tinggi dibandingkan OD blank
(Kirmusaoglu, 2019). Interpretasi nilai OD terhadap produksi biofilm
sesuai tabel 2.1 berikut.
30
Tabel 2.1 Interpretasi kekuatan bakteri pembentuk biofilm
Sumber: Ramadan et al., 2017
ODcut = Optical Density Cut-off value = rata-rata OD kontrol negatif +
3x standar deviasi (SD) kontrol negatif
Gambar 2.9 Metode microtiter plate
(Sumber: www.researchgate.net)
2.4 Aspergillus oryzae
2.4.1 Taksonomi Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae diklasifikasikan sebagai berikut (GBIF,
2019).
Domain : Eukaryota
Kerajaan : Fungi
Divisi : Ascomycota
Kelas : Eurotiomycetes
Ordo : Eurotiales
2Rata-rata nilai OD Kekuatan penghasil biofilm
ODisolat ≤ Odcut Non-biofilm producer
ODcut < ODisolat ≤ 2x Odcut Weak-biofilm producer
2x ODcut < ODisolat ≤ 4x Odcut Moderate- biofilm producer
4x ODcut < ODisolat Strong- biofilm producer
31
Famili : Trichocomaceae
Genus : Aspergillus
Spesies : A. oryzae
2.4.2 Karakteristik Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae merupakan jamur yang diisolasi dari tanah
dan tanaman. Jamur ini dapat tumbuh dengan optimal pada rentang suhu
32-36oC dan pada pH 2-8. Aspergillus oryzae tumbuh secara vegetatif
dengan membentuk filamen multinukleat haploid, hifa atau miselia.
Jamur ini memproduksi spora secara aseksual dan menghasilkan
konidiofor yang dikenal sebagai konidia. Stipes konidiofor tidak
memiliki warna dan memiliki tekstur yang didominasi kasar hingga
halus. Pada media agar, koloni yang awalnya berwarna putih akan
berubah menjadi hijau kekuningan yang menandakan banyaknya
pertumbuhan konidia. Konidia memiliki ukuran yang besar dan
membentuk oval dengan diameter 5-8 μm. Kepala konidia berbentuk
bulat dengan diameter 100-200 μm. Dinding konidia sebagian besar
memiliki tekstur halus hingga kasar. Dan pada vesikula dapat ditemukan
beberapa phialides dan metulae (Chang P et al, 2014).
Gambar 2.10 Struktur Aspergillus oryzae dilihat dari mikroskop.
32
(Sumber: Chang P et al, 2014)
2.4.3 Kurva Pertumbuhan Aspergillus oryzae
Kurva pertumbuhan merupakan tahapan yang menunjukkan
pertumbuhan mikroorganisme mulai dari fase awal sampai tidak dapat
tumbuh lagi. Fase pertumbuhan jamur dimulai dari fase lag yang
merupakan fase penyesuaian sel jamur dengan lingkungannya. Sel sel
tersebut akan membelah secara aktif pada fase akselerasi, dan akan
memperbanyak diri di fase eksponensial. Pada fase eksponensial juga
akan terjadi peningkatan aktivitas sel. Setelah pada fase deselerasi sel
akan mengurangi aktivitas pembelahan aktifnya dan akan meninggalkan
sisa senyawa yang tidak lagi diperlukan. Jumlah sel yang mati sama
dengan jumlah sel yang hidup menandakkan pertumbuhan jamur pada
fase stasioner dan ditandai dengan garis horizontal pada kurva. Pada fase
ini akan ditemukan banyak senyawa metabolit sekunder yang
dihasilkan. dan yang terakhir adalah fase kematian yang ditandai
penurunan kurva pertumbuhan semakin tajam. Kurva pertumbuhan
dapat diamati dengan menghitung tingkat kekeruhan pada media jamur.
Tingkat kekeruhan dihitung dengan nilai OD yang dihasilkan dari
spektrofotometer (Gandjar, 2006).
2.4.4 Identifikasi Karakteristik Aspergillus oryzae
2.4.4.1 Uji Makroskopis
Uji makroskopis pada Aspergilus oryzae dapat dilakukan dengan
menumbuhkan jamur pada suatu medium. Hal yang perlu diidentifikasi
antara lain: bentuk koloni, warna koloni, permukaan koloni dan bentuk
spora (Ade FY, 2013). Media yang dapat digunakan untuk identifikasi
33
jamur secara makroskopis adalah dengan medium PDA (Potato
Dextrose Agar) (Fathoni dkk, 2019).
Gambar 2.11 Bentukan koloni Aspergillus oryzae pada medium MEA
(kanan) dan ATB (kiri).
(Sumber: Ade FY, 2013)
2.4.4.2 Uji Mikroskopis
Uji mikroskopis Aspergillus oryzae dapat dilakukan dengan
menggunakan mikroskop. Pada uji ini yang perlu diperhatikan adalah
bentuk, warna, jumlah (tunggal atau tidak) dan posisi konidiofor atau
sporangiofor (Ade FY, 2013)
Gambar 2.12 Tampak struktur Aspergillus oryzae pada pengamatan
mikroskopis perbesaran 400X.
(Sumber: Ade FY, 2013)
2.4.5 Mekanisme Inhibitor Quorum sensing (IQS)
Quorum sensing merupakan hal terpenting dalam pembentukan
biofilm, oleh karena itu menganggu proses komunikasi sel merupakan
cara yang menarik untuk mencegah sekaligus menghambat
34
pembentukan biofilm. Untuk mengacaukan komunikasi sel dapat
dicapai dengan menargetkan sintesis, pengenalan atau pengangkutan
autoinduser. Selain itu juga dapat dilakukan dengan menurunkan atau
memodifikasi molekul persinyalan sehingga dapat mengacaukan system
komunikasi bakteri pathogen. Quorum sensing inhibitor memiliki peran
untuk menghambat biofilm dan menghancurkan patogenitas bakteri
pathogen tanpa membunuh bakteri normal atau menganggu fungsi
fisiologis bakteri dengan cara mengacaukan sistem komunikasi bakteri
pathogen (Borges et al, 2017; Nazzaro, Fratianni, & Coppola, 2013).
2.4.6 Aspergillus oryzae sebagai Antibiofilm
Penggunaan antibiotik secara tidak tepat dapat meningkatkan
potensi resistensi (Santhakumari, 2015; Defoirdt T, 2018). Sebuah studi
menunjukkan bahwa asam lemak memiliki potensi besar dalam
menghambat dan menganggu pembentukan biofilm pada berbagai
mikroba misalnya Staphylococcus aureus (Davies & Marques, 2009;
Kim Y et al, 2018). Asam lemak merupakan komponen penting dalam
proses sintesis triasilgliserida, ester,fosfolipid, dan kolesterol (Desbois
& Smith, 2010). Bakteri, alga, ragi, serangga, ikan, tumbuhan, dan
organisme lain dapat mensintesis asam lemak jenuh atau tak jenuh dan
memanfaatkannya sebagai pelindung dari bakteri patogen yang berada
disekitarnya (Santhakumari et al, 2017; Iglesias et al, 2019 ) Asam
lemak dapat menurunkan motilitas, adhesi, virulensi, flagellar serta
mengaktifkan regulasi stress yang memicu penghancuran biofilm,
sehingga bakteri rentan terhadap antimikroba (Nicol M et al, 2018;
35
Teper D et al, 2019). Berbagai asam lemak jenuh dan tak jenuh dapat
menghambat pertumbuhan biofilm dengan mempengaruhi proses
perlekatan, mengubah fluiditas membran sel, mengurangi EPS,
menganggu pembentukan fimbriae dan megacaukan system QS.
Dalam penelitian yang telah dilakukan oleh Tamano et al (2013)
menyatakan bahwa terdapat empat gen Aspergillus oryzae yang dapat
mensitesis asam lemak secara berlebih, sehingga dapat meningkatkan
produksi asam lemak. Asam lemak intraselular utama yang dihasilkan
adalah asam palmitate, asam strearat, asam oleic dan asam linoleic
(Tamano et al, 2015). Penggunaan senyawa alami memiliki beberapa
keunggulan dibandingkan obat antimikroba sebagai bahan penghambat
biofilm, seperti tingkat toksisitas yang rendah atau bahkan tidak
memiliki risiko resistensi terhadap mikroorganisme. Pada penelitian
yang dilakukan oleh Han-S. Kim, dkk menunjukkan bahwa asam
linoleic mampu menurunkan volume dan ketebalan biofilm
Pseudomonas aeruginosa sebesar 47% dan 33%. Asam linoleic juga
mampu menghambat pembentukan bakteri E. coli dengan aksi surfaktan
yang dapat meningkatkan permeabilitas membrane sehingga akan
mengakibatkan kematian sel (CLSI, 2010). Selain itu Namazi M (2004)
juga menyatakan bahwa asam linoleic memiliki aktivitas anti-biofilm
yang kuat pada Klebsiella pneumoniae. Asam linoleic memiliki potensi
menurunkan biofilm Klebsiella pneumoniae sebesar 80% pada dosis 31-
84 μ g / ml (Ramanathan et al, 2017).
36
Asam oleic yang berasal dari S. maltophilia diketahui dapat
menghambat motilitas perlekatan pada proses pembentukan biofilm dan
menghambat produksi pyocyanin pada bakteri P. aeruginosa, asam oleic
ini dapat berinteraksi dengan protein aktivator transkripsi LuxR yang
selanjutnya akan memblokir QS yang dimediasi AHL (Singh V.K. et al,
2013). Pada penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa asam
palmitate yang di kultur pada Vibrio spp dapat menurunkan regulasi QS
pada luxS dan luxR, menghambat produksi EPS dan menganggu
pembentukan biofilm. Asam palmitate diketahui tidak menganggu
pertumbuhan planktonik, namun dapat mengacaukan proses adhesi
patogen (Santhakumari S et al, 2017). Secara khusus asam strearat dan
asam palmitate dapat menghambat ekspresi hemolisin, EPS, dan
produksi biofilm melalui RsbA (Liaw SJ et al, 2004). Pada proses
fermentasi, Aspergillus oryzae dapat memproduksi enzim ekstraseluler
seperti enzim α-amilase, β-glukosidase dan xilanase yang berfungsi
untuk mendegradasi bahan lignoselulosa dan dapat mensintesis senyawa
fenolik (Sa’nchez, 2009). Enzim β-glukosidase diketahui dapat
dijadikan sebagai antibiofilm (Oda et al, 2006). Dan fenolik memiliki
kemampuan sebagai Inhibitor Quorum sensing (IQS) (Damayanti,
2017).
37
Gambar 2.13 Asam lemak sebagai antibiofilm dengan menghambat proses
per, adhesi, EPS, fimbriae, pembentukan biofilm, serta maturasi biofilm.
(Sumber: Kumar P et al, 2020)
2.5 Kerangka Teori
Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri penyebab
pneumonia. Pneumonia karena Klebsiella dapat ditandai dengan adanya
demam tinggi, lesu dan batuk kering. Batuk kering kemudian akan
berlanjut menjadi batuk produktif yang disertai dengan sputum darah
dan purulent. Jika tidak segera ditangani akan menyebabkan terjadinya
abses, nekrosis dan fibriosis pada jaringan paru (Wulandari & Asih,
2017. Untuk mengidentifikasi Klebsiella pneumoniae dapat dilakukan
dengan pewarnaan gram, pewarnaan kapsul, biakan di medium
38
diferensial dan uji biokim. Klebsiella pneumoniae termasuk bagian dari
keluarga Enterobacteriaceae. Klebsiella pneumoniae adalah bakteri
Gram-negatif, memiliki bentuk batang pendek dengan ukuran 0,5-0,5 x
1,2 μL. Bakteri ini tidak memiliki flagel dan tidak dapat membentuk
spora. Klebsiella pneumoniae tidak dapat bergerak namun dapat
memfermentasikan karbohidrat menjadi asam dan gas. Tidak hanya itu
bakteri ini juga dapat memfermentasikan laktosa.
Quorum sensing (QS) merupakan sistem komunikasi
mikroorganisme yang bergantung pada kepadatan sel, QS ini mampu
memicu terjadinya pembentukan biofilm dan faktor virulensi.K.
pneumoniae memiliki beberapa faktor virulensi antara lain, yaitu
lipopolisakarida (LPS), kapsul, pili (tipe 1 dan tipe 3), dan pembawa zat
besi atau dikenal sebagai siderofor (Shon. Et al, 2013). Faktor virulensi
berguna untuk meningkatkan kemampuan patogenitas suatu bakteri.
Lipopolisakarida (LPS) merupakan komponen utama pembentuk
membran luar bakteri gram negatif. LPS juga disebut sebagai mediator
paling kuat dari penyebab syok septik karena bakteri (Martin, 2018).
LPS tersusun dari antigen lipid A, inti, dan O-polisakarida yang berguna
sebagai sistem pertahanan diri dari komplemen. Dan CPS dikenal
sebagai faktor virulensi K. pneumoniae yang berada pada lapisan luar
pathogen yang mengandung sel polimorfonuklear yang berguna sebagai
faktor resistensi terhadap adanya fagositosis (Shakib. et al, 2018).
Kapsul K.pneumoniae bagian luar terbentuk dari susunan polisakarida
dan lipoprotein. Kapsul ini menghalangi proses bakterisidal dan
39
mencegah fagositosis, tidak hanya itu kapsul ini juga dapat menghambat
complement mediated lysis and opsonization dan mengurangi respon
inflamasi (Paczosa & Mecsas, 2016). Pili tipe 1 dan tipe 3 berfungsi
sebagai adhesi bakteri ke epitel, sel imun, dan permukaan abiotik (Wang
G. et al, 2020). Besi berguna dalam proses pertumbuhan bakteri. K.
pneumoniae memiliki kemampuan untuk memperoleh zat besi. Terdapat
4 molekul yang berfungsi untuk menyerap zat besi, yaitu : enterobactin,
yersiniabactin, salmochelin, dan aerobactin. Dalam pembentukan biof,
bakteri membutuhkan EPS yang berguna untuk melekatkan bakteri satu
dengan yang lain (Gunardi, 2014). Tidak hanya itu, EPS juga mampu
melindungi sel-sel bakteri dari perubahan lingkungan yang disebabkan
antimikroba, sistem imun inang, oksidasi dan kation logam (Jamal et al,
2015).
QS dapat dihambat dengan mengacaukan komunikasi sel yang
menargetkan sintesis, pengenalan atau pengangkutan autoinduser.
Quorum sensing inhibitor memiliki peran untuk menghambat biofilm
dan menghancurkan patogenitas bakteri pathogen tanpa membunuh
bakteri normal atau menganggu fungsi fisiologis bakteri. Aspergillus
oryzae diketahui memiliki enzim yang dapt menghambat pembentukan
biofilm yaitu Enzim β-glukosidase, enzim ini dapat mensintesis fenolik
yang dapat mengacaukan quorum sensing. Aspergillus oryzae juga dapat
memproduksi asam lemak berupa asam linoleic, asam oleic, asam
palmitate, dan asam strearat yang berpotensi menurunkan pembentukan
biofilm K. pneumoniae.
40
BAB III
KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS
3.1 Kerangka Konsep
Pembentukan biofilm K. pneumoniae diawali oleh adhesi sel,
yaitu proses perlekatan sel planktonik pada permukaan biotik atau
abiotik secara reversibel. Sel planktonik ini akan membentuk perlekatan
yang irreversible dengan bantuan sistem adhesi spesifik seperti flagela,
41
fimbriae, lipopolisakarida dan protein adhesi. Setelah terbentuk
perlekatan yang irreversible, bakteri akan mengirimkan sinyal sebagai
sistem komunikasi untuk mengkoordinir pembentukan mikrokoloni.
Dalam pembentukan mikrokoloni juga diperlukan EPS untuk perlekatan
antar bakteri (Gunardi, 2014). Pembentukan biofilm yang matur ditandai
oleh tingginya kepadatan dan kompleksitas struktur biofilm. Setelah
berada pada puncak pembentukan biofilm, akan terjadi penurunan
eksopolisakarida dan bakteri akan mengalami dispersi.
Aspergillus oryzae memiliki kandungan asam lemak yang dapat
menghambat pembentukan biofilm yaitu asam strearat, asam palmitate,
asam linoleic dan asam oleic. Asam linoleic secara khusus memiliki
potensi menurunkan biofilm Klebsiella pneumoniae sebesar 80% pada
dosis 31-84 μ g / ml. Selain itu asam linoleat memiliki aktivitas anti-
biofilm yang kuat pada Klebsiella pneumoniae (Namazi M, 2004).
Asam oleic diketahui dapat menghambat motilitas perlekatan pada
proses pembentukan biofilm, asam oleic ini juga dapat berinteraksi
dengan protein aktivator transkripsi LuxR yang selanjutnya akan
memblokir QS yang dimediasi AHL. Asam palmitate juga dapat
memiliki kemampuan untuk menurunkan regulasi QS pada luxS dan
luxR, serta menghambat produksi EPS dan menganggu pembentukan
biofilm. Asam palmitate tidak menganggu proses pertumbuhan
planktonik, namun asam ini dapat mengacaukan proses adhesi patogen.
Sedangkan asam strearat dan asam palmitate memiliki fungsi untuk
42
menghambat ekspresi hemolisin, EPS, dan produksi biofilm melalui
RsbA.
Pada proses fermentasi, Aspergillus oryzae dapat memproduksi
enzim ekstraseluler seperti enzim α-amilase, β-glukosidase dan xilanase
yang berfungsi untuk mendegradasi bahan lignoselulosa dan dapat
mensintesis senyawa fenolik. Enzim β-glukosidase diketahui dapat
dijadikan sebagai antibiofilm. Dan fenolik memiliki kemampuan
sebagai Inhibitor Quorum sensing (IQS).
Oleh karena itu dengan adanya kandungan Aspergillus oryzae
dapat dijadikan sebagai antibiofilm dengan menghambat faktor adhesi,
EPS, dan Quorum Sensing (QS). Sehingga akan menganggu proses
pembentukan biofilm.
3.2 Hipotesis Penelitian
H0: Aspergillus oryzae tidak memiliki aktivitas antibiofilm pada
Klebsiella pneumoniae.
H1: Aspergillus oryzae memiliki aktivitas antibiofilm pada Klebsiella
pneumoniae.
43
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Desain penelitian berupa penelitian eksperimental. Penelitian ini
menggunakan metode tissue culture plate/microtiter plate biofilm assay
yang nantinya akan di isi kelompok uji pada masing-masing well plate.
Kelompok pada uji ini adalah kontrol positif, kontrol negatif, kontrol
media dan supernatan Aspergillus oryzae dengan berbagai konsentrasi.
Metode ini untuk mempermudah mengukur nilai Optic Density (OD)
setiap kelompok uji dengan menggunakan Microplate reader.
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian uji aktivitas antibiofilm Aspergillus oryzae terhadap
biofilm Klebsiella pneumoniae dilakukan di laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Maulana Malik Ibrahim
Malang. Penelitian ini akan dilakukan selama rentang waktu Januari -
Maret tahun 2021
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian
4.3.1 Populasi Penelitian
Penelitian menggunakan biakan bakteri dari spesies Klebsiella
pneumonia sebagai populasi.
4.3.2 Sampel Penelitian
Sampel pada penelitian ini menggunakan koloni Klebsiella
pneumoniae yang diperoleh dari Laboratorium Wiyasa Mandiri
Malang.
44
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah nilai konsentrasi
supernatan Aspergillus oryzae. Pada penelitian ini akan digunakkan 5
kelompok konsentrasi, yaitu 100%, 50%, 25%, 12,5% dan 6,25%.
4.4.2 Variabel Terikat
Variabel terikat pada penelitian ini adalah nilai optical density
(OD) antibiofilm yang diukur dengan Microplate reader. Nilai OD yang
diukur adalah OD pencegahan perlekatan biofilm, OD penghambatan
pertumbuhan biofilm,dan nilai OD penghancuran biofilm pada bakteri
K. pneumoniae.
4.5 Jumlah Pengulangan
Pada penelitian ini digunakan rumus Federer untuk menentukan
jumlah pengulangan. Pengulangan dilakukan untuk mendapatkan data
yang valid. Rumus Federer adalah sebagai berikut (Dewi et al,2013)
Keterangan :
r = banyaknya pengulangan
t = banyaknya perlakuan
(t – 1) (r – 1) ≥ 15
(8 – 1) (r – 1) ≥ 15
7 (r – 1) ≥ 15
7r – 7 ≥ 15
7r ≥ 22
R ≥ 3,14
45
Dari perhitungan Rumus Federer diatas maka dapat disimpulkan
bahwa pengulangan pada setiap perlakuan penelitian dilakukan
sebanyak 3 kali.
4.6 Definisi Operasional
1. Jamur Aspergillus oryzae yang digunakan adalah jamur telah
diinokulasi pada media PBD yang diinkubasi selama 3 hari dengan
suhu 28oC.
2. Klebsiella pneumoniae yang digunakan adalah Klebsiella
pneumoniae yang dapat membentuk biofilm. Bakteri yang
menunjukkan karakteristik Klebsiella pneumoniae pada uji
pewarnaan gram, uji biokimia, dan uji biofilm. Bakteri Klebsiella
pneumoniae yang diperoleh dari Laboratorium Fakultas Kedokteran
UIN Maulana Malik Ibrahim Malang.
3. Supernatan Aspergillus oryzae adalah substansi hasil sentrifugasi
Aspergillus oryzae yang memiliki berat jenis yang lebih rendah.
4. Optical Density (OD) adalah nilai yang dihasilkan dari pengukuran
Microplate reader untuk mengetahui nilai kuantitatif dari
pembentukan biofilm dari Klebsiella pneumoniae.
5. Microtiter plate biofilm assay merupakan metode yang digunakan
untuk mendeteksi pembentukan biofilm. Metode ini dilakukan
dengan mikrodilusi cair pada microplate dan kemudian diukur nilai
OD dari aktivitas antibiofilm Aspergilus oryzae terhadap biofilm
Klebsiella pneumoniae.
6. Kelompok uji adalah kelompok yang mendapatkan perlakuan
46
dengan penambahan supernatan Aspergillus oryzae dengan
konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%.
7. Kelompok kontrol merupakan kelompok uji yang tidak mendapat
perlakuan pemberian supernatan Aspergillus oryzae. Kelompok
kontrol terdiri dari control positif yang berisi gentamisin +
Klebsiella pneumoniae, kontrol negatif yang berisi TSB + Klebsiella
pneumoniae, dan kelompok kontrol media yang berisi PDB + TSB.
8. Uji pertumbuhan biofilm adalah uji yang bertujuan untuk
mendeteksi kemampuan Klebsiella pneumoniae dalam membentuk
biofilm. Apakah termasuk non-biofilm producer, weak-biofilm
producer, moderate-biofilm producer, atau sebagai strong-biofilm
producer.
9. Uji pencegahan perlekatan biofilm merupakan uji yang digunakan
untuk mengetahui kemampuan Aspergillus oryzae dalam mencegah
perlekatan biofilm dari Klebsiella pneumoniae.
10. Uji penghambatan pembentukan biofilm adalah upaya untuk
mengetahui kemampuan Aspergillus oryzae dalam menghambat
pembentukan biofilm dari Klebsiella pneumoniae.
11. Uji penghancuran biofilm merupakan uji yang digunakan untuk
mengetahui kemampuan Aspergillus oryzae dalam menghancurkan
perlekatan biofilm dari Klebsiella pneumoniae.
12. Kadar Hambat Minimum (KHM) adalah konsentrasi terendah yang
mampu menghambat pertumbuhan bakteri.
13. Kadar Bunuh Minimum (KBM) adalah konsentrasi terendah yang
47
mampu membunuh 99% atau 100% bakteri.
4.7 Kriteria Penelitian
4.7.1 Kriteria Inklusi
1. Jamur Aspergillus oryzae yang diisolasi dari tanah atau tanaman.
2. Klebsiella pneumoniae yang diperoleh dari Laboratorium Wiyasa
Mandiri Malang.
3. Klebsiella pneumoniae yang diisolasi dari pasien dengan
pneumonia.
4. Koloni Klebsiella pneumoniae yang dapat membentuk biofilm kuat
pada tissue culture plate.
4.7.2 Kriteria Eksklusi
1. Jamur Aspergillus oryzae yang terkontaminasi mikroorganisme lain.
2. Koloni Klebsiella pneumoniae yang terkontaminasi koloni bakteri
lain.
3. Koloni Klebsiella pneumonia yang tidak dapat membentuk biofilm
kuat.
4.8 Alat dan Bahan Penelitian
4.8.1 Alat Penelitian
Alat alat yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah autoklaf,
microplate reader, mikroskop, object glass, elenmeyer, tabung reaksi,
gelas beaker, falcon, kertas saring whatman nomer 42, filter paper 0,22
μm, mikropipet, vortex, sentrifugasi, incubator shaker, inkubator,
Eppendorf, spektrofotometer, mikrotip kuning, colony-counter,
mikrotip biru, rak tabung, baskom, cawan petri steril, cotton swab,
48
mikroplate merk biologix, ice-pack, kuvet, spektrofotometer, ose,
bunsen, kain lap, timbangan analitik, vortex, sentrifugasi, gunting,
kertas alumunium foil, plastik wrap.
4.8.2 Bahan Penelitian
4.8.2.1 Bahan Uji
Dari penelitian ini bahan yang akan diujikan adalah jamur
Aspergillus oryzae. Jamur yang digunakan adalah jamur yang telah
diinokulasi dan diinkubasi sesuai dengan masa stasioner pertumbuhan
jamur.
4.8.2.2 Bakteri Uji
Bakteri yang diujikan adalah koloni bakteri Klebsiella
pneumoniae yang berasal dari Laboratorium Fakultas Kedokteran dan
Ilmu kesehatan UIN Maulana Malik Ibrahim Malang.
4.8.2.3 Bahan lainnya
Bahan yang digunakan sebagai penunjang perlakuan lainnya
adalah medium agar Mac Conkey, larutan glukosa, alkohol, aquades,
Phosphate-Buffered Saline (PBS), Tryticase Soy Broth (TSB), Potato
Dextrose Broth (PDB), Triple Sugar Iron Agar (TSIA), safranin,
gentamisin, Kristal violet, dan asam asetat.
4.9 Prosedur Penelitian
4.9.1 Pembuatan Media Pertumbuhan Aspergillus oryzae (Safitri,
Fauzana, Fauziah. 2011)
Pembuatan media pertumbuhan Aspergillus oryzae digunakan
media Potato Dextrose Broth (PDB) yang ditambahkan glukosa 2%.
49
Sebelum ditambahkan larutan glukosa, media PDB disterilkan dengan
autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121oC. Media PDB dibuat dari
campuran PDB bubuk yang ditambahkan dengan aquades dengan
perbandingan 24 gr : 1000 mL.
4.9.2 Pembuatan Supernatan Aspergillus oryzae (Modifikasi
Prateeksha et al, 2019; Hasiani, Ahmad, Rijai. 2015)
Untuk membuat supernatan diperlukan pembuatan inokulum
jamur terlebih dahulu. Inokulum jamur dibuat dari 5 mL suspensi
Aspergillus oryzae yang ditambahkan 45 mL PDB steril dan 1 mL
larutan glukosa dengan konsentrasi 2%. Setelah itu dimasukkan ke
dalam inkubator shaker selama 3 hari dengan suhu 28oC. Langkah
selanjutnya dengan menyaring hasil inokulum jamur dengan kertas
Whatman no. 2 dan ditampung pada falcon. Kemudian hasil saringan
dimasukkan pada tabung eppendorf dan di frezzer beberapa saat sampai
muncul kristal es untuk menghindari kerusakan protein jamur. Setelah
itu dilakukan sentrifugasi untuk memisahkan supernatan dengan
peletnya. Langkah berikutnya dengan melakukan penyaringan
supernatan dengan menggunakan filter paper 0,22 μm dan supernatan
siap digunakan.Supernatan harus selalu dalam kondisi dingin untuk
mencegah terjadinya kerusakan protein.
4.9.3 Pembuatan Seri Konsentrasi Supernatan Aspergillus oryzae
Pembuatan seri konsentrasi supernatan dilakukan dengan
menggunakan metode mikrodelusi. Mikrodelusi merupakan metode
yang sering digunakan dalam penentuan efektivitas antimikroba.
50
Metode ini dibuat dengan menginokulasikan bakteri uji dengan volume
yang rendah ke dalam wadah yang disebut microplate 96-well dan
dihasilkan konsentrasi dengan tingkatan menurun (Balouri dkk, 2016).
Seri konsentrasi dibuat menggunakan metode mikrodelusi
dengan memasukkan supernatan jamur sebanyak 100 μL dan media
PDB 100 μL kemudian dilakukan pengenceran bertingkat sampai
didapatkan seri konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%.
Setelah itu diambil 100 μL larutan dari well-plate konsentrasi 6,25%,
sehingga didapatkan total volume sebanyak 100 μL pada setiap well-
plate. (Modifikasi Rollando dkk, 2019).
4.9.4 Identifikasi Aspergillus oryzae
4.9.4.1 Uji Makroskopis
Pengamatan secara makroskopis dilakukan dengan inokulasi
pada media PDA yang telah dipadatkan pada cawan petri. Pengestreakan
dilakukan menggunakan swab steril. Langkah selanjutnya adalah
dengan memasukkan cawan petri dalam inkubator selama 5-7 hari dan
dilakukan pengamatan terhadap koloni yang tumbuh (Fathoni R dkk,
2017)
4.9.4.2 Uji Mikroskopis
Uji mikroskopis dilakukan dengan menggunakan alat
mikroskop. Hal pertama yang dilakukan adalah dengan membuat
preparat. Preparat dibuat dengan menyiapkan object glass, lalu ditetesi
aquades dengan pipet. Setelah itu meletakkan koloni jamur di atas
object glass yang telah ditetesi aquades dan ditutup dengan cover glass.
51
Dan yang terakhir meletakkan preparat pada mikroskop lalu dilakukan
pengamatan (Shofiana dkk, 2015)
4.9.5 Uji Kurva Pertumbuhan
Untuk menentukan kurva pertumbuhan pada Aspergillus oryzae
langkah pertama yang dilakukan adalah dengan menyiapkan tabung
reaksi yang berisi 3 ml PBD steril. Setelah itu memasukkan koloni
jamur pada tabung dengan menggunakan ose, lalu dihomogenkan dan
dimasukkan pada incubator shaker selama 24 jam. Langkah selanjutnya
yaitu melakukan pengenceran sampai dihasilkan OD ≤ 0,05. Kemudian
diambil 1,5 ml jamur dan dimasukkan ke dalam kuvet. Setelah itu
diletakkan ke inkubator shaker dan dilakukan pengukuran OD setiap 5
jam (Modifkasi Safitri, Fauzana, Fauziah. 2011).
4.9.6 Pembuatan Media Pertumbuhan Klebsiella pneumoniae
Media yang digunakan untuk menumbuhkan Klebsiella
pneumonia adalah media Trypticase Soy Broth (TSB) yang telah
dicampurkan glukosa dengan konsentrasi 5%. Sebelum ditambahkan
larutan glukosa, TSB disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121oC
selama 15 menit. Media TSB dibuat dari campuran TSB bubuk yang
ditambahkan dengan aquades dengan perbandingan 30 gr : 1000 mL.
Di penelitian ini juga diperlukan media padat untuk
menumbuhkan bakteri yaitu dengan media Trypticase Soy Agar (TSA).
Media ini terbuat dari campuran TSB dan agar dengan perbandingan
40gr : 10gr yang kemudian dilarutkan dengan mengunakan aquades
sebanyak 1 liter. Setelah itu dihomogenkan dan dipanaskan di atas hot
52
plate, lalu disterilisasi dengan autoklaf (Purwanti NU & Susanti R.
2016)..
4.9.7 Pembuatan Suspensi Klebsiella pneumoniae
Pada pembuatan suspensi bakteri diperlukan 1 ose Klebsiella
pneumoniae yang diinokulasikan pada tabung reaksi yang berisi
campuran media TSB 3 mL dan larutan glukosa 5% sebanyak 60 μL.
Setelah itu dihomogenkan dan di masukkan ke inkubator selama 18 jam
dengan suhu 37oC. Selanjutnya ditambahkan lagi TSB 2 mL dan
glukosa 5% sebanyak 40 uL, kemudian dihomogenkan dan di inkubasi
selama 18 jam dengan suhu 37oC. Langkah selanjutnya yaitu dengan
mengukur kepadatan suspensi bakteri sampai menunjukkan nilai OD
0,4-0,6.
4.9.8 Identifikasi Klebsiella pneumoniae
4.9.8.1 Uji Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram dilakukan dengan menyiapkan preparat pada
object glass pada permulaan pengujian. Cara membuat preparat dimulai
dengan meneteskan aquades steril pada object glass, kemudian
diberikan 1 ose koloni bakteri Klebsiella pneumoniae pada object glass
yang telah diberi aquades dan disebar secara merata. Kemudian
ditunggu sampai benar benar kering. Setelah itu object glass di ayunkan
di atas bunsen sampai terasa hangat. Setelah itu preparat di tetesi dengan
larutan Kristal violet (Gram A), lalu tunggu selama 2 menit, kemudian
dicuci menggunakan aquades dan dikeringkan. Langkah selanjutnya
preparat ditetesi dengan larutan iodium (Gram B) lalu diamkan selama
53
2 menit, kemudian dicuci menggunakan aquades dan dikeringkan.
Setelah itu preparat ditetesi dengan larutan ethanol 96% (Gram C),
biarkan selama 30 detik kemudian dibilas dengan aquades dan
dikeringkan. Dan yang terakhir preparat ditetesi dengan larutan safranin
(Gram D), tunggu 30 detik dan dibilas menggunakan aquades lalu
keringkan. Setelah proses pewarnaan dilakukan pengamatan dengan
menggunakan mikroskop (Khotimah, 2020).
Gambar 4.1 Uji Pewarnaan Gram. 1) Pewarnaan dengan kristal violet, 2)
Pemberian larutan iodin, 3) Pembilasan dengan decolorizing agent, 4)
Pemberian Safranin
(Sumber: www.medicallabscientist.org)
4.9.8.2 Uji Mac Conkey
Pada uji Mac Conkey yang pertama dilakukan adalah dengan
menyiapkan media agar Mac Conkey, setelah itu dilakukan inokulasi
Klebsiella pneumoniae pada agar tersebut dan kemudian di inkubasi
pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Setelah diinkubasi dilakukan
identifikasi pada pada media agar untuk mengetahui perubahan warna
(Khusnul, 2020)
4.9.8.3 Uji Urease
Pada uji urease yang pertama dilakukan adalah dengan
menyiapkan media agar urea, media agar dibuat dengan posisi miring
54
setelah itu dilakukan inokulasi Klebsiella pneumoniae pada agar
tersebut dan kemudian di inkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam.
Setelah diinkubasi dilakukan identifikasi pada pada media agar untuk
mengetahui perubahan warna (Khusnul, 2020)
4.9.8.4 Uji Methyl Red
Pada uji Methyl Red yang harus dilakukan pertama adalah
dengan menyiapkan medium MRVP broth pada tabung reaksi sebanyak
4 mL. Setelah itu ditambahkan 1 ose koloni Klebsiella pneumoniae dan
diinkubasi dengan suhu 37oC selama 24 jam. Selanjutnya diberikan
reagen Methyl Red sebanyak 3-4 tetes (Al-Baer et al, 2017).
4.9.8.5 Uji Indol, Voges Preskauer, Simmon’s Citrate (IMViC)
a. Uji Indol
Langkah pertama pada uji indole adalah dengan menyiapkan
medium tryptone broth pada tabung reaksi sebanyak 5 ml. Setelah
itu ditambahkan 1 ose koloni Klebsiella pneumoniae dan diinkubasi
dengan suhu 37oC selama 24 jam. Setelah keluar dari inkubator
kemudian diberikan reagen Kovac’s sebanyak 5 tetes untuk
mendeteksi produksi indole.
b. Uji Voges Proskauer (VP)
Langkah pertama pada uji Voges Proskauer adalah dengan
menyiapkan medium MRVP broth pada tabung reaksi sebanyak 4
mL. Setelah itu ditambahkan 1 ose koloni Klebsiella pneumoniae
dan diinkubasi dengan suhu 37oC selama 24 jam. Setelah keluar dari
inkubator kemudian diberikan reagen VP A yang berisi napthol
55
sebanyak 5 tetes dan diberikan reagen VP B yang berisi KOH, lalu
dihomogenkan. Kemudian ditunggu selama 15 menit dan diamati
perubahan warna yang terjadi (Arifin, 2013)
c. Uji Simmon’s Citrate
Langkah pertama pada uji Simmon’s Citrate adalah dengan
menyiapkan medium Simmon sitrat agar. Setelah itu digoreskan 1
ose koloni Klebsiella pneumoniae pada media agar dan diinkubasi
dengan suhu 37oC selama 24-48 jam. Selanjutnya amati perubahan
warna yang terjadi (Al-Baer et al, 2017).
4.9.9 Denah Uji Perlakuan Aktivitas Antibiofilm
Gambar denah penggunaan well-plate untuk uji aktivitas antibiofilm
pada microplate 96 wells sebagai berikut:
Gambar 4.2 Denah perlakuan pada microplate 96 wells
Keterangan:
56
4.9.10 Uji Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh
Minimum (KBM)
Nilai Kadar Hambat Minimum (KBM) dapat digunakan sebagai
acuan dalam pengujian antibiofilm dan time-kill assay. Aktivitas
pembentukan biofilm juga dapat ditentukan melalui nilai konsentrasi
dibawah nilai KHM. Hal itu dapat menunjukkan adanya bakteri yang
masih tumbuh dan mampu membentuk biofilm. Sehingga dapat
ditentukan nilai penghambatan biofilm dan dapat diamati efek
pemberian ekstrak (Fitria dkk, 2018).
Pada uji KHM diperlukan kelompok uji dengan berbagai macam
konsentrasi, yaitu dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan
6,25%. Kemudian memasukan PDB dan supernatan jamur dengan
berbagai konsentrasi pada well plate, lalu ditambahkan juga 100 μL
suspensi Klebsiella pneumoniae pada well-plate kelompok uji.
Antibiotik gentamisin 25 μL/mL dan suspensi K. pneumoniae
57
ditambahkan pada well plate kelompok kontrol positif masing masing
sebanyak 100μL. Media TSB 100 μL dan suspensi K. pneumoniae
sebanyak 100 μL dimasukkan pada well plate kelompok kontrol negatif.
Dan memasukkan 100 μL PDB dan 100 μL TSB pada kelompok kontrol
media. Setelah semua dimasukkan pada Microplate, kemudian tutup
microplate dan lapisi menggunakan alumunium foil dan plastik wrap.
Microplate dimasukkan pada inkubator selama 24 jam dengan suhu
37oC.
Setelah diinkubasi selama 24 jam mikroplate diukur OD-nya
dengan microplate-reader untuk menentukkan nilai KHM. Nilai KHM
diperoleh dari konsentrasi antimikroba terendah yang mampu
menghambat pertumbuhan mikroba. Untuk menentukan konsentrasi
yang digunakan dalam KBM, didapatkan dari media cair yang memiliki
tingkat kekeruhan terendah setelah diinkubasi. Penentuan nilai KBM
dapat menggunakan nilai KHM yang telah diamati sebelumnya. Larutan
KHM diambil sebanyak 3 μL dan digores pada cawan petri yang berisi
media TSA. Langkah selanjutnya yaitu memasukkan cawan petri
kedalam inkubator selama 24 jam dan amati pertumbuhan koloni bakteri
pada media TSA. Hasil KBM diambil dari pengamatan visual secara
langsung dengan bantuan colony counter. (Modifikasi Rollando dkk,
2019)
4.9.11 Uji Pertumbuhan Biofilm (Modifikasi Abidah, 2020;
Cadavid et al, 2018)
Pada uji pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae dilakukan
58
untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam membentuk biofilm.
Langkah pertama dengan memasukkan 200 μL suspensi Klebsiella
pneumoniae pada well-plate sebagai kelompok uji. Dan memasukkan
200 μL TSB yang telah diberi larutan glukosa dengan konsentrasi 5%
pada kelompok kontrol media. Setelah semua dimasukkan pada
Microplate, kemudian tutup microplate dan lapisi menggunakan
alumunium foil dan plastik wrap. Microplate dimasukkan pada
inkubator selama 24 jam dengan suhu 37oC. Sesudah diinkubasi, isi
yang ada di microplate di buang dan dicuci dengan PBS steril 3x.
Setelah kering microplate diberi larutan kristal violet 0,1% sebanyak
200 μL dan kemudian diinkubasi dengan suhu ruang selama 15 menit.
Kemudian keluarkan kristal violet dan dicuci dengan aquades sebanyak
3x pengulangan untuk menghilangkan sel yang menyerap warna namun
tidak menempel pada microplate. Ketika microplate sudah kering
langkah selanjutnya adalah memasukkan 200 μL asam asetat 30% pada
semua well-plate dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit dan
langkah terakhir adalah dengan mengukur nilai OD dengan
menggunakan microplate reader dengan panjang gelombang 595 nm.
Kekuatan biofilm bakteri dapat ditentukan dengan
membandingkan nilai ODisolat dengan ODcut. Nilai OD dihasilkan dari
rata-rata ODisolat dikurangi nilai ODcut (OD = rata-rata nilai ODisolat –
ODcut). ODcut didapat dari rumus sebagai berikut:
Keterangan:
ODcut = Optical Density cut-off
59
ODc = Optical Density control
Interpretasi nilai kekuatan bakteri pembentuk biofilm
Rata-rata nilai OD Kekuatan penghasil biofilm
ODisolat ≤ ODcut Non-biofilm producer
ODcut <ODisolat ≤ 2x ODcut Weak-biofilm producer
2x ODcut <ODisolat ≤ 4x ODcut Moderate- biofilm producer
4x ODcut <ODisolate Strong- biofilm producer
Tabel 4.1 Interpretasi kekuatan bakteri pembentuk biofilm
Sumber: (Ramadan et al., 2017)
ODcut = Optical Densitycut,
ODisolat = Optical Density isolat
4.9.12 Uji Aktivitas Antibiofilm Aspergillus oryzae terhadap
Klebsiella pneumoniae
4.9.12.1 Uji Aktivitas Pencegahan Perlekatan Biofilm (Modifikasi
Abidah, 2020; Cadavid, 2018; Paula-Ramos, 2016; Pratiwi et
al, 2015)
Pada uji pencegahan perlekatan biofilm Klebsiella pneumoniae
diperlukan kelompok uji dengan berbagai macam konsentrasi
supernatan jamur, yaitu dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%,
dan 6,25%. Kemudian memasukan 200 μL supernatan jamur dengan
berbagai konsentrasi pada well plate kelompok uji. Antibiotik
gentamisin 25 μL/mL dimasukkan pada well plate kelompok kontrol
positif sebanyak 200 μL dan diinkubasi selama 60 menit dengan suhu
37oC. Langkah selanjutnya yaitu membuang isi mikroplate, kemudian
dicuci dengan larutan PBS sebanyak 3 kali pengulangan dan tunggu
60
hingga kering. Setelah itu suspensi Klebsiella pneumoniae dimasukkan
pada well-plate kelompok uji, kelompok kontrol pisitif dan kelompok
kontrol negatif masing-masing 200 μL. Tambahkan PDB dan TSB yang
dicampurkan dengan larutan glukosa 5% dimasukkan pada kelompok
kontrol media. Kemudian tutup microplate dan lapisi menggunakan
alumunium foil dan plastik wrap. Microplate dimasukkan pada
inkubator selama 72 jam dengan suhu 37oC.
Sesudah diinkubasi, isi yang ada di microplate di buang dan
dicuci dengan PBS steril 3x. Setelah microplate kering, ditambahkan
200 μL kristal violet 0,1% pada semua well-plate dan diamkan selama
15 menit pada suhu ruang dan gelap. Kemudian keluarkan kristal violet
dan dicuci dengan aquades sebanyak 3x pengulangan untuk
menghilangkan sel yang menyerap warna namun tidak menempel pada
microplate. Ketika microplate sudah kering langkah selanjutnya adalah
memasukkan 200 μL asam asetat 30% pada semua well-plate dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit dan langkah terakhir adalah
dengan mengukur nilai OD dengan menggunakan microplate reader
dengan panjang gelombang 595 nm (Modifikasi Abidah, 2020). Dan
dihitung dengan menggunakan rumus pencegahan perlekatan biofilm
sebagai berikut:
% 𝐏𝐏𝐁𝐚 =𝑶𝑫𝒌𝒏−𝑶𝑫𝒔𝒆
𝑶𝑫𝒌𝒏 X 100%
Keterangan :
PPBa = Persentase pencegahan perlekatan biofilm
ODkn = Nilai OD kontrol negatif
61
ODse = Nilai OD sampel eksperimen
4.9.12.2 Uji Aktivitas Penghambatan Pertumbuhan Biofilm
(Modifikasi Abidah, 2020; Cadavid et al, 2018; Paula-
Ramos, 2016; Pratiwi et al, 2015)
Pada uji penghambatan pertumbuhan biofilm Klebsiella
pneumoniae diperlukan kelompok uji dengan berbagai macam
konsentrasi, yaitu dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan
6,25%. Kemudian memasukan PDB dan supernatan jamur dengan
berbagai konsentrasi pada well plate, lalu ditambahkan juga 100 μL
suspensi Klebsiella pneumoniae pada well-plate kelompok uji.
Antibiotik gentamisin 25 μL/mL dan suspensi K. pneumoniae
ditambahkan pada well plate kelompok kontrol positif masing masing
sebanyak 100μL. Media TSB 100 μL dan suspensi K. pneumoniae
sebanyak 100 μL dimasukkan pada well plate kelompok kontrol negatif.
Dan memasukkan 100 μL PDB dan 100 μL TSB pada kelompok kontrol
media. Setelah semua dimasukkan pada Microplate, kemudian tutup
microplate dan lapisi menggunakan alumunium foil dan plastik wrap.
Microplate dimasukkan pada inkubator selama 72 jam dengan suhu
37oC.
Sesudah diinkubasi, isi yang ada di microplate di buang dan
dicuci dengan PBS steril 3x. Setelah microplate kering, ditambahkan
200 μL kristal violet 0,1% pada semua well-plate dan diamkan selama
15 menit pada suhu ruang dan gelap. Kemudian keluarkan kristal violet
dan dicuci dengan aquades sebanyak 3x pengulangan untuk
62
menghilangkan sel yang menyerap warna namun tidak menempel pada
microplate. Ketika microplate sudah kering langkah selanjutnya adalah
memasukkan 200 μL asam asetat 30% pada semua well-plate dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit dan langkah terakhir adalah
dengan mengukur nilai OD dengan menggunakan microplate reader
dengan panjang gelombang 595 nm. Dan dihitung dengan menggunakan
rumus penghambatan pertumbuhan biofilm sebagai berikut :
% 𝐏𝐏𝐁𝐛 =𝑶𝑫𝒌𝒏 − 𝑶𝑫𝒔𝒆
𝑶𝑫𝒌𝒏 X 100%
Keterangan :
PPBb = Persentase penghambatan pertumbuhan biofilm
ODkn = Nilai OD kontrol negatif
ODse = Nilai OD sampel eksperimen
4.9.12.3 Uji Aktivitas Penghancuran Biofilm (Modifikasi Abidah,
2020; Cadavid et al, 2018; Paula-Ramos, 2016; Pratiwi et al,
2015)
Pada uji penghancuran biofilm Klebsiella pneumoniae yang
pertama dilakukan adalah memasukkan suspensi Klebsiella pneumoniae
sebanyak 200 μL kedalam well-plate kelompok uji, kelompok kontrol
positif dan kelompok kontrol negatif. Dan memasukkan 100 μL PBD
dan 100 μL TSB yang telah dicampur dengan larutan glukosa 5% pada
well-plate kelompok kontrol media dan diinkubasi selama 72 jam
dengan suhu 37oC. Langkah selanjutnya yaitu membuang isi mikroplate,
kemudian dicuci dengan larutan PBS sebanyak 3 kali pengulangan dan
63
tunggu hingga kering. Setelah itu memasukkan supernatan jamur
dengan berbagai konsentrasi (100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%)
sebanyak 200 μL pada well-plate kelompok uji. Antibiotik gentamisin
25 μL/mL dimasukkan pada well-plate kelompok kontrol positif
sebanyak 200 μL dan memasukkan suspensi Klebsiella pneumoniae
pada well-plate kelompok kontrol negatif. Dan yang terakhir
memasukkan 100 μL PDB dan 100 μL TSB yang telah dicampur dengan
larutan glukosa 5% pada well-plate kelompok kontrol media. Setelah
semua dimasukkan pada Microplate, kemudian tutup microplate dan
lapisi menggunakan alumunium foil dan plastik wrap. Microplate
dimasukkan pada inkubator selama 60 menit dengan suhu 37oC.
Sesudah diinkubasi, isi yang ada di microplate di buang dan
dicuci dengan PBS steril 3x. Setelah microplate kering, ditambahkan
200 μL kristal violet 0,1% pada semua well-plate dan diamkan selama
15 menit pada suhu ruang dan gelap. Kemudian keluarkan kristal violet
dan dicuci dengan aquades sebanyak 3x pengulangan untuk
menghilangkan sel yang menyerap warna namun tidak menempel pada
microplate. Ketika microplate sudah kering langkah selanjutnya adalah
memasukkan 200 μL asam asetat 30% pada semua well-plate dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit dan langkah terakhir adalah
dengan mengukur nilai OD dengan menggunakan microplate reader
dengan panjang gelombang 595 nm. Dan dihitung dengan menggunakan
rumus penghancuran biofilm sebagai berikut:
64
% 𝐏𝐏𝐁𝐜 =𝑶𝑫𝒌𝒏 − 𝑶𝑫𝒔𝒆
𝑶𝑫𝒌𝒏 X 100%
Keterangan :
PPBc = Presentase penghancuran biofilm
ODkn = Nilai OD kontrol negatif
ODse = Nilai OD sampel eksperimen
65
4.10 Alur Penelitian
66
4.11 Analisis Data
Analisis data yang digunakan pada penelitian ini yaitu
dengan aplikasi IBM SPSS Stastistic analisis pertama yaitu menentukan
jenis analisis statistik data termasuk parametrik atau non parametrik.
Data parametrik adalah data yang terdistribusi secara normal dengan
skala interval atau rasio, sedangkan data non-parametrik adalah data
yang tidak terdistribusi normal yang ditunjukkan dengan skala data
nominal atau ordinal (Santoso, 2019). Apabila data memenuhi syarat
parametrik maka dilanjutkan dengan analisis menggunakan uji oneway
ANOVA. Namun apabila data tidak memenuhi syarat parametrik, maka
dilakukan analisis statistik non parametrik dengan Kruskal Wallis Test.
Hasil data dengan nilai p-value < 0,05 menunjukkan terdapat
perbedaaan yang signifikan antar konsentrasi. Setelah dihasilkan
perbedaan yang sisgnifikan, maka dilanjutkan analisis dengan Post-Hoc
Tukey HSD untuk mengetahui perbedaan signifikan antar masing
masing data kelompok. Analisa terakhir dengan uji korelasi Pearson
untuk mengetahui hubungan antar konsentrasi supernatan jamur dalam
mencegah perlekatan biofilm, penghambatan pertumbuhan biofilm, dan
penghancuran biofilm dengan menggunakan nilai OD (Abidah, 2020)
67
BAB V
HASIL
5.1 Uji Karakteristik Aspergillus oryzae
5.1.1 Uji Mikroskopis
Gambar 5.1 Hasil pengamatan mikroskopis perbesaran 100X
Pada pengamatan karakteristik Aspergillus oryzae secara
mikroskopis pada perbesaran 100X dapat ditemukan gambaran antara
lain : conidiophore, konidia, vesikula. Sesuai dengan ciri ciri yang
disebutkan oleh Chang P et al (2014) maka jamur ini dapat dikatakan
sebagai jamur Aspergillus oryzae.
5.1.2 Uji Makroskopis
Gambar 5.2 Hasil uji makroskopis pada jamur Aspergillus oryzae
Pengamatan secara makroskopis yang dilakukan dengan
inokulasi pada media PDA yang telah dipadatkan pada cawan petri.
a
a
68
Pada pengamatan ini dapat ditemukan bahwa jamur membentuk hifa
yang berupa miselium. Seperti yang ditunjuk pada panah, jamur ini
berwarna kuning yang menunjukkan banyaknya pertumbuhan konidia
yang dihasilkan.
5.2 Uji Karakteristik Klebsiella pneumoniae
Gambar 5.3 Tampilan koloni K. pneumoniae pada media Mac Conkey Agar
(Kiri) dan Hasil uji mikroskopis K. pneumoniae (Kanan).
Uji karakteristik pada Klebsiella pneumoniae juga dilakukan
secara makroskopis dan mikroskopis. Pada uji makroskopis koloni
bakteri ditanam pada media Mac Conkey Agar (MCA), pada media ini
menunjukkan bahwa koloni Klebsiella pneumoniae memiliki bentuk
bulat dengan elevansi cembung, berwarna merah muda dan
berkonsistensi mucoid.
Pengamatan secara mikroskopis, bakteri harus diberikan
pewarnaan gram terlebih dahulu sebelum diamati di mikroskop. Dalam
uji pewarnaan gram diperoleh hasil bakteri yang berbentuk basil dan
berwarna merah. Hal tersebut menunjukkan bahwa Klebsiella
pneumoniae merupakan bakteri gram negatif.
69
Sedangkan pada uji biokimia didapatkan hasil seperti pada tabel
dibawah ini :
No Uji Biokimia Hasil
1. TSIA Glukosa + (Positif)
H2S – (Negatif)
2. Indole - (Negatif)
4. VP + (Positif)
5. Sitrat + (Positif)
6. Urease + (Positif)
Tabel 5.1 Hasil uji biokimia Klebsiella pneumoniae
5.3 Uji Kurva Pertumbuhan Aspergillus oryzae
Gambar 5.4 Hasil uji kurva pertumbuhan jamur Aspergillus oryzae
Hasil uji kurva pertumbuhan dapat dilihat pada grafik diatas.
Dari grafik tersebut menunjukkan bahwa fase stasioner jamur ada di jam
ke 35 atau dihari ke 3.
0
15
20
35
40
5560
7580
951000
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 20 40 60 80 100 120
Op
tica
l De
nsi
ty
Jam Pertumbuhan
OD Pertumbuhan Jamur
70
5.4 Uji Kadar Hambat Minimum
Gambar 5.5 Hasil Uji Kadar Hambat Minimum (KHM)
Pada uji KHM yang dilakukan dengan menggunakan Microplate
v button menunjukkan bahwa semua kelompok sampel memiliki titik
pada dasar microplate. Hal ini menunjukkan bahwa jamur tidak
memiliki kemampuan untuk menghambat bakteri Klebsiella
pneumoniae.
5.5 Uji Kadar Bunuh Minimum
Uji Kadar Bunuh Minimum merupakan konsentrasi terendah
yang mampu membunuh 99% atau 100% bakteri. Uji ini dilakukan
setelah mendapatkan hasil dari Uji Kadar Hambat Minimum. Dan
dikarenakan pada uji KHM menyatakan bahwa jamur ini tidak memiliki
KHM, maka penulis tidak melakukan uji KBM.
5.6 Uji Pertumbuhan Biofilm Klebsiella pneumoniae
0.197
0.6260.752
1.287
0
0.5
1
1.5
Kekuatan Biofilm
km 24 48 72
71
Gambar 5.6 Hasil uji pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae
Uji pertumbuhan biofilm digunakan campuran PDB dan TSB +
glukosa 5% sebagai kontrol negatif. Pada uji ini dilakukan dengan
pengukuran OD pada jam ke 24, 48, dan 72. Selanjutnya dipilih jam
pertumbuhan biofilm dengan nilai OD yang paling tinggi. Untuk
menentukan kekuatan biofilm dapat diukur dengan membandingkan
nilai ODcut dengan nilai ODsuspensi. Diketahui nilai ODsuspensi sebesar
1.287 dan untuk mencari nilai ODcut dapat dicari dengan memasukkan
nilai OD pada rumus ODcut = ODkontrol negatif + 3(standar deviasi ODkontrol
negatif).
ODcut = 0.197+ 3(0.038)
= 0.197+ 0.114
= 0.331
Setelah itu dapat disimpulkan bahwa uji pertumbuhan biofilm memenuhi
persamaan 4x ODcut ≤ ODsuspense hal ini berarti Klebsiella pneumoniae merupakan
bakteri yang mampu membentuk biofilm yang kuat.
5.7 Presentase Aktivitas Antibiofilm Aspergillus oryzae
29
87
51
14.7
77
4741.5
70
31.4
0
65.3
24
0
65
28.725.7
70.4
25.9
0
20
40
60
80
100
Aktivitas Antibiofilm
k+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25%
72
Gambar 5.7 Presentase aktivitas antibiofilm Aspergillus oryzae terhadap
biofilm Klebsiella pneumoniae. Dari kiri pencegahan perlekatan,
penghambatan pembentukan dan penghancuran biofilm.
Dari hasil ketiga uji didapatkan masing – masing presentase
besarnya aktivitas antibiofilm pada konsentrasi 100%, 50%, 25.5%,
12.5%, 6.25% dan kontrol positif seperti yang tertera di grafik tersebut.
Untuk menentukan besarnya aktivitas antibiofilm diperlukan nilai OD
kontrol negatif dan OD kelima konsentrasi. Selanjutnya nilai OD
dimasukkan pada rumus :
ODkontrol negatif − ODkonsentrasi
ODkontrol negatif! X 100%
5.7.1 Uji Pencegahan Perlekatan Biofilm Klebsiella pneumonia
Hasil perbandingan nilai OD kelompok uji, kontrol negatif,
kontrol media, dan kontrol positif pada uji aktivitas antibiofilm
Aspergilus oryzae terhadap pencegahan perlekatan biofilm Klebsiella
pneumoniae sebagai berikut.
Gambar 5.8 Hasil uji pencegahan perlekatan biofilm Klebsiella pneumoniae
0.194 0.192
0.232
0.159
0.294
0.337
0.202
0.272
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
km k+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25% k-
Optical Density
±0.018±0.042 ±0.022
±0.032
±0.05
±0.095
±0.008
±0.066
73
5.7.2 Uji Penghambatan Pembentukan Biofilm Klebsiella
pneumonia
Hasil perbandingan nilai OD kelompok uji, kontrol negatif,
kontrol media, dan kontrol positif pada uji aktivitas antibiofilm
Aspergilus oryzae terhadap penghambatan pembentukan biofilm
Klebsiella pneumoniae sebagai berikut.
Gambar 5.9 Hasil uji penghambatan pembentukan biofilm Klebsiella
pneumoniae
5.7.3 Uji Penghancuran Biofilm Klebsiella pneumoniae
Hasil perbandingan nilai OD kelompok uji, kontrol negatif,
kontrol media, dan kontrol positif pada uji aktivitas antibiofilm
Aspergilus oryzae terhadap penghancuran biofilm Klebsiella
pneumoniae sebagai berikut.
0.153 0.1650.295
0.3740.446 0.448
0.38
1.287
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
km k+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25% k-
Optical Density
0.033 0.001
0.0660.048
0.054 0.0720.072
0.113
74
Gambar 5.10 Hasil uji penghancuran biofilm Klebsiella pneumoniae
5.8 Hasil Analisis Data
5.8.1 Uji Pencegahan Perlekatan Biofilm Klebsiella pneumoniae
5.8.1.1 Uji Normalitas
Uji normalitas pada penelitian ini menggunakan uji normalitas
Shapiro-wilk. Hal ini dikarenakan jumlah sampel kurang dari 50. Data
dianggap normal ketika nilai p-value (sig) > 0.05. Uji normalitas
digunakan untuk menentukan analisis statistik yang akan digunakan.
Data dengan distribusi normal dapat dianalisis dengan uji parametrik
dan data dengan distribusi yang tidak normal dapat dilakukan dengan
analisis non-parametrik.
Dari hasil uji normalitas yang tertera pada lampiran 7
menunjukkan bahwa nilai signifikan > 0.05. Hal ini dapat disimpulkan
bahwa data terdistribusi normal.
0.119
0.3050.335
0.4340.481
0.451 0.469
0.633
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
km k+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25% k-
Optical Density
0.024
0.0090.01
0.0650.051 0.086
0.009
0.132
75
5.8.1.2 Uji Homogenitas
Uji homogenitas pada penelitian ini menggunakan uji
homogenitas Lavene. Hal ini dikarenakan jumlah sampel kurang dari
50. Data dianggap homogen ketika nilai p-value (sig) > 0.05. Uji
homogenitas juga digunakan untuk menentukan analisis statistik yang
akan digunakan. Data yang homogen dapat dianalisis dengan uji
parametrik dan data yang tidak homogen dilakukan dengan analisis non-
parametrik.
Dari hasil uji homogenitas menunjukkan bahwa nilai signifikan
< 0.05. Hal ini dapat disimpulkan bahwa data tidak homogen. Oleh
karena itu perlu dilakukan transformasi data terlebih dahulu.
5.8.1.3 Uji One Way Anova
Uji One Way Anova merupakan uji analisis parametrik yang
digunakan untuk mengetahui adanya perbedaan data secara signifikan.
Nilai p-value (sig) < 0.05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang
signifikan, sedangkan p-value (sig) > 0.05 menunjukkan bahwa data
tidak memiliki perbedaan yang signifikan.
Dari hasil uji yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa data
memiliki perbedaan secara signifikan. Hal ini ditunjukkan dengan nilai
sig sebesar 0.006 (p-value < 0.05 ).
5.8.1.4 Uji Post Hoc Tukey
Uji Post Hoc Tukey digunakan untuk mengetahui perbedaan
masing masing kelompok data satu dengan yang lain. Nilai p-value (sig)
< 0.05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan,
76
sedangkan p-value (sig) > 0.05 menunjukkan bahwa data tidak memiliki
perbedaan yang signifikan.
K+ K- 100% 50% 25% 12.5
%
6.25
%
KM
K+ .597 .944 .976 .326 .032 1.000 1.000
K- .597 .994 .162 1.000 .605 .821 .704
100% .944 .994 .475 .909 .232 .995 .978
50% .976 .162 .475 .068 .005 .865 .940
25% .326 1.000 .909 .068 .869 .541 .417
12.5% .032 .605 .232 .005 .869 .069 .046
6.25% 1.000 .821 .995 .865 .541 .069 1.000
KM 1.000 .704 .978 .940 .417 .046 1.000
Tabel 5.2 Hasil uji Post Hoc Tukey pada aktivitas pencegahan
perlekatan biofilm klebsiella pneumonia
Dari hasil uji yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa data
memiliki perbedaan secara signifikan antar kelompok. Hal ini
ditunjukkan dengan nilai p-value (sig) < 0.05. Terdapat perbedaan yang
signifikan pada konsentrasi 12.5% terhadap kontrol positif dan kontrol
media.
5.8.1.5 Uji Korelasi Pearson
Uji korelasi memiliki tujuan untuk mengukur derajat hubungan
antar variabel, arah hubungan antar konsentrasi dan besar nilai OD
(Optical Density). Nilai p-value (sig) < 0.05 menunjukkan bahwa data
memiliki korelasi bermakna secara statistik, sedangkan p-value (sig) >
77
0.05 menunjukkan bahwa data tidak memiliki korelasi yang bermakna
secara statistik. Untuk menentukan derajat hubungan uji korelasi dapat
dikelompokan Sarwono (2006) sebagai berikut :
0 : Tidak ada korelasi antara dua variabel
>0 – 0,25: Korelasi sangat lemah
>0,25 – 0,5: Korelasi cukup
>0,5 – 0,75: Korelasi kuat
>0,75 – 0,99: Korelasi sangat kuat
1: Korelasi sempurna
Kekuatan dan arah hubungan dapat berupa hasil yang positif atau
negatif. Korelasi positif yang berarti memiliki arah yang sama atau
berbanding lurus dengan variabel dan korelasi negatif memiliki arah
yang berlawanan atau berbanding terbalik antar variabel.
Dari hasil uji korelasi dapat diambil kesimpulan bahwa
hubungan korelasi antar konsentrasi dengan OD memiliki korelasi yang
tidak signifikan karena nilai p > 0.05. Nilai Pearson correlation = 0.244
menunjukkan bahwa antar konsentrasi dengan OD memiliki derajat
korelasi yang sangat lemah. Arah korelasi bertanda positif yang
menunjukkan semakin besar nilai tingkat konsentrasi CFS maka
semakin besar pula nilai OD-nya.
5.8.2 Uji Penghambatan Pembentukan Biofilm Klebsiella
pneumoniae
5.8.2.1 Uji Normalitas
78
Uji normalitas pada penelitian ini menggunakan uji normalitas
Shapiro-wilk. Hal ini dikarenakan jumlah sampel kurang dari 50. Data
dianggap normal ketika nilai p-value (sig) > 0.05. Uji normalitas
digunakan untuk menentukan analisis statistik yang akan digunakan.
Data dengan distribusi normal dapat dianalisis dengan uji parametrik
dan data dengan distribusi yang tidak normal dapat dilakukan dengan
analisis non-parametrik.
Dari hasil yang tertera pada tabel menunjukkan bahwa nilai
signifikan > 0.05. Hal ini dapat disimpulkan bahwa data terdistribusi
normal.
Dari hasil uji normalitas yang tertera pada lampiran 8
menunjukkan bahwa nilai signifikan > 0.05. Hal ini dapat disimpulkan
bahwa data terdistribusi normal.
5.8.2.2 Uji Homogenitas
Uji homogenitas pada penelitian ini menggunakan uji
homogenitas Lavene. Hal ini dikarenakan jumlah sampel kurang dari
50. Data dianggap homogen ketika nilai p-value (sig) > 0.05. Uji
homogenitas juga digunakan untuk menentukan analisis statistik yang
akan digunakan. Data yang homogen dapat dianalisis dengan uji
parametrik dan data yang tidak homogen dilakukan dengan analisis non-
parametrik.
Dari hasil uji homogenitas yang tertera pada lampiran 8
menunjukkan bahwa nilai signifikan > 0.05. Hal ini dapat disimpulkan
bahwa data homogen.
79
5.8.2.3 Uji One-way ANOVA
Uji One Way Anova merupakan uji analisis parametrik yang
digunakan untuk mengetahui adanya perbedaan data secara signifikan.
Nilai p-value (sig) < 0.05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang
signifikan, sedangkan p-value (sig) > 0.05 menunjukkan bahwa data
tidak memiliki perbedaan yang signifikan.
Dari hasil uji yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa data
memiliki perbedaan secara signifikan. Hal ini ditunjukkan dengan nilai
sig sebesar 0.00 (p-value < 0.05 ).
5.8.2.4 Uji Post-hoc Tukey
Uji post-hoc tukey digunakan untuk mengetahui perbedaan
masing masing kelompok data satu dengan yang lain. Nilai p-value (sig)
< 0.05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan,
sedangkan p-value (sig) > 0.05 menunjukkan bahwa data tidak memiliki
perbedaan yang signifikan.
K+ K- 100% 50% 25% 12.5
%
6.25
%
KM
K+ .000 .502 .076 .009 .008 .063 1.000
K- .000 .000 .000 .000 .000 .000 .000
100% .502 .000 .913 .326 .315 .875 .405
50% .076 .000 .913 .941 .934 1.000 .055
25% .009 .000 .326 .941 1.000 .964 .006
12.5% .008 .000 .315 .934 1.000 .959 .006
6.25% .063 .000 .875 1.000 .964 .959 .045
80
KM 1.000 .000 .405 .055 .006 .006 .045
Tabel 5.3 Hasil uji Post-Hoc Tukey pada aktivitas penghambatan
pembentukan biofilm Klebsiella pneumoniae
Pada tabel hasil uji post-hoc diatas menunjukkan bahwa terdapat
perbedaan nilai yang signifikan pada ke lima kelompok konsentrasi
(100%, 50%, 25%, 12.5%, dan 6.25%), kelompok kontrol media dan
kelompok kontrol positif terhadap kelompok kontrol negatif. Pada
kontrol positif terdapat perbedaan nilai yang signifikan pada kontrol
negatif, konsentrasi 25% dan konsentrasi 12.5%. Pada kontrol media
juga ditemukan adanya terdapat perbedaan nilai yang signifikan
terhadap konsentrasi 25%, 12.5%, dan 6.25%.
5.8.2.5 Uji Korelasi
Dari hasil uji korelasi dapat diambil kesimpulan bahwa
hubungan korelasi antar konsentrasi dengan OD memiliki korelasi yang
tidak signifikan karena nilai p > 0.05. Nilai pearson correlation = 0.413
menunjukkan bahwa antar konsentrasi dengan OD memiliki derajat
korelasi yang cukup. Arah korelasi bertanda positif yang menunjukkan
semakin besar nilai tingkat konsentrasi CFS maka semakin besar pula
nilai OD-nya.
5.8.3 Uji Penghancuran Biofilm Klebsiella pneumoniae
5.8.3.1 Uji Normalitas
Uji normalitas pada penelitian ini menggunakan uji normalitas
Shapiro-wilk. Hal ini dikarenakan jumlah sampel kurang dari 50. Data
dianggap normal ketika nilai p-value (sig) > 0.05. Uji normalitas
digunakan untuk menentukan analisis statistik yang akan digunakan.
81
Data dengan distribusi normal dapat dianalisis dengan uji parametrik
dan data dengan distribusi yang tidak normal dapat dilakukan dengan
analisis non-parametrik.
Dari hasil uji normalitas yang tertera pada lampiran 9
menunjukkan bahwa nilai signifikan > 0.05. Hal ini dapat disimpulkan
bahwa data terdistribusi normal.
5.8.3.2 Uji Homogenitas
Uji homogenitas pada penelitian ini menggunakan uji
homogenitas Lavene. Hal ini dikarenakan jumlah sampel kurang dari
50. Data dianggap homogen ketika nilai p-value (sig) > 0.05. Uji
homogenitas juga digunakan untuk menentukan analisis statistik yang
akan digunakan. Data yang homogen dapat dianalisis dengan uji
parametrik dan data yang tidak homogen dilakukan dengan analisis non-
parametrik.
Dari hasil uji homogenitas menunjukkan bahwa nilai
signifikansi < 0.05. Hal ini dapat disimpulkan bahwa data tidak
homogen. Sehingga harus dilakukan transformasi data terlebih dahulu.
Ketika data sudah memenuhi syarat parametrik, kemudian dilanjutkan
dengan uji ANOVA.
5.8.3.3 Uji One Way ANOVA
Uji One Way ANOVA merupakan uji analisis parametrik yang
digunakan untuk mengetahui adanya perbedaan data secara signifikan.
Nilai p-value (sig) < 0.05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang
82
signifikan, sedangkan p-value (sig) < 0.05 menunjukkan bahwa data
memiliki perbedaan yang signifikan.
Pada uji ini menyatakan bahwa terdapat perbedaan yang
signifikan. Hal ini ditunjukkan dengan nilai p-value < 0.05
5.8.3.4 Uji Post-Hoc Tukkey
Uji post-hoc tukey digunakan untuk mengetahui perbedaan
masing masing kelompok data satu dengan yang lain. Nilai p-value (sig)
< 0.05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan,
sedangkan p-value (sig) > 0.05 menunjukkan bahwa data tidak memiliki
perbedaan yang signifikan.
K+ K- 100% 50% 25% 12.5
%
6.25
%
KM
K+ .002 .999 .349 .099 .239 .131 .006
K- .002 .005 .124 .415 .192 .335 .000
100% .999 .005 .681 .263 .527 .332 .002
50% .349 .124 .681 .992 1.000 .998 .000
25% .099 .415 .263 .992 .999 1.000 .000
12.5% .239 .192 .527 1.000 .999 1.000 .000
6.25% .131 .335 .332 .998 1.000 1.000 .000
KM .006 .000 .002 .000 .000 .000 .000
Tabel 5.4 Hasil uji Post-Hoc Tukey pada aktivitas penghancuran biofilm
Klebsiella pneumoniae
83
Pada tabel hasi uji post hoc ini menunjukkan bahwa terdapat
perbedaan nilai yang signifikan pada kelompok kontrol negatif terhadap
kontrol positif, kontrol media dan konsentrasi 100%. Tidak hanya itu
kontrol media juga memiliki perbedaan nilai yang signifikan terhadap
kontrol positif, kontrol negatif dan semua konsentrasi.
5.8.3.5 Uji Korelasi
Dari hasil uji korelasi dapat diambil kesimpulan bahwa
hubungan korelasi antar konsentrasi dengan OD memiliki korelasi yang
signifikan karena nilai p < 0.05. Nilai correlation = 0.553 menunjukkan
bahwa antar konsentrasi dengan OD memiliki derajat korelasi yang
sangat kuat. Arah korelasi bertanda positif yang menunjukkan semakin
besar nilai tingkat konsentrasi CFS maka semakin besar pula nilai OD-
nya.
84
BAB VI
PEMBAHASAN
6.1 Identifikasi Karakteristik Aspergillus oryzae dan Klebsiella
pneumoniae
Identifikasi jamur dan bakteri sangat diperlukan sebelum
melakukan penelitian. Jamur yang digunakan dalam penelitian ini
adalah jamur yang berspesies Aspergillus oryzae. Hal tersebut
ditunjukkan dari hasil uji makroskopis dan mikroskopis yang telah
disesuaikan dengan ciri ciri Aspergillus oryzae yang disebutkan oleh
Chang P et al., (2014) dan Ade FY (2013). Bakteri yang digunakan
adalah Klebsiella pneumoniae. Pada pengamatan secara makroskopis
didapatkan koloni Klebsiella pneumoniae yang memiliki bentuk bulat
dengan elevansi cembung, berwarna merah muda dan berkonsistensi
mucoid. Sedangkan pada pengamatan secara mikroskopis diperoleh
hasil bakteri yang berbentuk basil dan berwarna merah yang
menunjukkan bahwa Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri gram
negatif. Dan pada uji biokimia TSIA dihasilkan bahwa bakteri ini dapat
menghasilkan gula dan tidak ditemukan adanya H2S. Pada uji indole
menghasilkan warna kuning yang berarti negatif. Dan memberikan hasil
positif pada uji Voges Praskauer yang ditandai dengan warna merah.
Pada uji sitrat bakteri ini mengubah medium dari hijau menjadi biru
yang berarti bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya.
Pada uji urease Klebsiella pneumoniae menghasilkan warna merah
85
muda yang mengiterpretasikan hasil positif yang berarti bakteri mampu
menghasilkan enzim urease.
6.2 Pengukuran Kurva Aspergillus oryzae
Setelah sudah dilakukan uji identifikasi karakteristik bakteri dan
jamur. Langkah selanjutnya yaitu dilakukan pengukuran kurva jamur
untuk menentukan waktu inkubasi saat pembuatan inokulum jamur.
Pengukuran kurva dilakukan setiap 5 jam. Dikarenakan keterbatasan
waktu maka pengukuran dilakukan dua kali dalam sehari namun tetap
dalam rentang per lima jam. Pada jam pertama merupakan fase lag, yaitu
fase dimana jamur menyesuaikan dengan lingkungannya. Pada hari
kedua jamur mulai membelah secara aktif dan mulai memperbanyak diri
hal itu ditunjukkan dengan kurva yang semakin meningkat tajam. Di
hari ketiga kurva mulai mengalami penurunan perlahan yang dapat
dipastikan jamur berada pada fase stasioner. Dan fase selanjutnya adalah
fase kematian yang ditandai penurunan kurva pertumbuhan yang
semakin tajam.
6.3 Pembuatan Supernatan Aspergillus oryzae
Selanjutnya yaitu pembuatan supernatan jamur. Supernatan
Aspergillus oryzae dibuat melalui penyaringan inokulum jamur yang
telah diinkubasi selama 3 hari. Diinkubasi selama 3 hari karena
bertepatan dengan fase stasioner pertumbuhan jamur. Hal ini bertujuan
untuk mengambil senyawa metabolit sekunder yang ada pada fase
stasioner jamur. Pada fase ini ditandai dengan bentuk kurva yang mulai
86
mendatar dan selanjutnya akan semakin menurun pada fase kematian
(Gandjar, 2006).
Konsentrasi supernatan dibuat menggunakan metode
mikrodelusi dengan melakukan pengenceran bertingkat sampai
didapatkan seri konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%.
Pemilihan konsentrasi ini didasarkan pada studi pendahuluan yang telah
dilakukan untuk menentukan besarnya konsentrasi yang akan digunakan
dalam penelitian. Digunakan kelima konsentrasi tersebut dikarenakan
pada konsentrasi terendah setelahnya supernatan tidak menunjukkan
adanya efek yang dihasilkan.
Pada kontrol media digunakan campuran PDB dan TSB yang
telah ditambahkan glukosa 2%. Perpaduan kedua media tersebut atas
dasar media PDB yang digunakan sebagai media jamur dan TSB sebagai
media Klebsiella pneumoniae. Pada kontrol negatif menggunakan
suspensi Klebsiella pneumoniae dan TSB sebagai media
pertumbuhannya. Dan untuk kontrol positif digunakan gentamisin
sebagai antibiotik.
6.4 Pembuatan Suspensi Klebsiella pneumoniae
Pada pembuatan suspensi bakteri diperlukan koloni bakteri
Klebsiella pneumoniae, media TSB dan larutan glukosa 5%. Media TSB
biasa digunakan sebagai media isolasi bakteri patogen, media ini
mengandung beberapa zat yang baik untuk pertumbuhan
mikroorganisme. TSB juga mengandung glukosa dengan konsentrasi
0,25% yang dapat mendukung pertumbuhan biofilm (Mladenovic et al.,,
87
2019). Hasil penelitian menyebutkan berbagai konsentrasi glukosa
dapat merangsang pembentukan biofilm pada Klebsiella pneumoniae
(Mladenovic et al.,, 2019). Pada penelitian ini digunakan penambahan
konsentrasi glukosa sebesar 5% merujuk pada penelitian yang dilakukan
oleh Aileen (2018). Penambahan konsentrasi glukosa 5% juga dilakukan
untuk menginduksi pembentukan biofilm Pseudomonas aeruginosa
(Wahyudi D & Silviani Y, 2015). Dengan penambahan konsentrasi
glukosa ini diharapkan dapat merangsang pembentukan biofilm yang
lebih besar. Setelah diinkubasi suspensi selanjutnya diukur dengan
Spectrofotometer untuk mendapatkan nilai OD sebesar 0.5 sesuai
dengan standar Mc Farland. Mc Farland 0,5 merupakan standar yang
paling sering digunakan untuk pengujian antimikroba di laboratorium
mikrobiologi klinik dalam kinerja media kultur (DALYNN Biological,
2014)
6.5 Uji KHM dan KBM
Aktivitas pembentukan biofilm dapat ditentukan melalui nilai
konsentrasi dibawah nilai KHM (Fitria dkk, 2018). Oleh karena itu
sebelum melakukan beberapa uji biofilm, peneliti melakukan uji kadar
hambat minimum terlebih dahulu. Pada hasil Uji KHM Aspergillus
oryzae terhadap Klebsiella pneumoniae menyatakan bahwa jamur ini
tidak memiliki efektivitas menghambat bakteri. Hal itu dikarenakan
senyawa antibiofilm menghambat pembentukan biofilm tanpa
menganggu proses pertumbuhan planktonik. Sehingga dapat dipastikan
bahwa bakteri masih dapat tumbuh dan membentuk biofilm.
88
Dikarenakan pada uji KHM menyatakan jamur ini tidak memiliki KHM,
maka penulis tidak melakukan uji KBM.
6.6 Uji Pertumbuhan Biofilm
Setelah memastikan bahwa bakteri masih dapat tumbuh dan
dapat membentuk biofilm, selanjutnya dilakukan uji pertumbuhan
biofilm. Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
membentuk biofilm dan menilai kekuatan biofilm Klebsiella
pneumoniae. Pada uji ini dilakukan pengukuran pada jam ke- 24, 48 dan
72. Dengan hasil pada jam ke-24 rata – rata nilai OD biofilm sebesar
0.626, jam ke-48 dengan nilai OD 0.752 dan pada jam ke-72 didapatkan
nilai OD sebesar 1.287. Kemudian dipilih waktu yang menunjukkan
kemampuan pembentukan biofilm paling kuat. Dan hasil yang didapat
menunjukan bahwa pertumbuhan biofilm terbesar pada jam ke 72. Hal
ini bertujuan untuk mengamati efektivitas pemberian supernatan
Aspergillus oryzae pada biofilm Klebsiella pneumoniae paling kuat
sekalipun. Untuk menentukan kekuatan biofilm dapat diukur dengan
membandingkan nilai ODcut dengan nilai ODsuspensi lalu dimasukkan
dalam persamaan seperti yang ada pada tabel 4.1. Dan hasil dari uji
pertumbuhan biofilm ini memenuhi persamaan 4x ODcut ≤ ODsuspensi
yang berarti Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri yang mampu
membentuk biofilm yang kuat. Seperti halnya hasil penelitian yang
dilakukan oleh Galdiero et al.,., (2020), menyatakan bahwa Klebsiella
pneumoniae merupakan bakteri pembentuk biofilm kuat.
89
Untuk mengetahui adanya biofilm maka diperlukan proses
pencucian dan pewarnaan. Proses pencucian dilakukan sebelum dan
sesudah pewarnaan dengan menggunakan cairan PBS dan juga aquades.
Pencucian sebelum pewarnaan dilakukan dengan tujuan menghilangkan
planktonik dan sel sel yang yang tidak menempel pada well-plate.
Pencucian ini dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan dengan larutan
PBS. Penggunaan PBS dipilih karena cairan ini bersifat isotonic dan
non-toxic sehingga mencegah sel bakteri pecah. PBS juga mengandung
sel sel air dan ion anorganik yang penting untuk metabolisme sel normal
sehingga biofilm tidak rusak (Rosdiana, 2016). Sedangkan pada
pencucian sesudah pewarnaan bertujuan untuk menghilangkan sel yang
terwarnai oleh kristal violet namun tidak menempel pada well-plate
(Azeredo,2016). Pencucian ini juga dilakukan sebanyak 3 kali
pengulangan dengan menggunakan cairan aquades. Penggunaan
aquades dipilih karena memiliki harga yang terjangkau, mudah didapat,
serta sangat efisien.
Penggunaan kristal violet sebagai pewarna sudah menjadi hal
yang umum dilakukan dalam pengujian biofilm. Hal itu dikarenakan
pewarna ini memiliki kemampuan mengikat komponen seluler bakteri
melalui interaksi ionic (Coffey & Anderson, 2014). Pengikatan ini
terjadi pada permukaan molekul yang bermuatan negative non spesifik
seperti polisakarida dan eDNA dalam matriks seluler (Shukla & Rao,
2017). Kristal violet akan menempel pada komponen penyusun matriks
biofilm serta mewarnai sel yang hidup dan sel yang mati, sehingga
90
pewarna ini sangat cocok untuk mewarnai biomassa biofilm (Azeredo,
2016). Seperti halnya pada penelitian yang telah dilakukan Kining et al.,
(2016), pada penelitian ini juga dilakukan pewarnaan menggunakan
kristal violet dengan konsentrasi 0,1% dan didiamkan selama 15 menit.
Sebelum pembacaan nilai OD dengan Microplate reader, penggunaan
asam asetat 30% bertujuan untuk melarutkan biofilm yang terwarnai
kristal violet sebelum dilakukan pembacaan dengan Microplate reader.
Penggunaan asam asetat sebagai zat pelarut juga dilakukan pada
penelitian Paula-Ramos (2016) dan zaba (2016).
6.7 Uji Aktivitas Antibiofilm Aspergillus oryzae terhadap Klebsiella
pneumoniae
Selanjutnya dilakukan pengujian terhadap tiga aktivitas
antibiofilm yaitu uji pencegahan perlekatan, uji penghambatan
pembentukan biofilm, dan uji penghancuran biofilm. Pembentukan
biofilm terdiri dari beberapa tahap yaitu perlekatan pada permukaan,
pembentukan mikro-koloni, maturasi dan dispersi (Jamal et al.,, 2015).
Hal yang berperan penting dalam pembentukan biofilm adalah Quorum
Sensing (QS). Autoinduser memiliki peran penting dalam komunikasi
antar sel (quorum sensing). Bakteri gram negatif menggunakan asil-
homoserin lakton (AHL) sebagai autoinduser. Sedangkan bakteri gram
positif menggunakan autoinduser autoinducing peptides (AIP). Dan
autoinduser-2 (AI-2) ada pada kedua gram (Liu et al.,., 2012 ; Du et al.,.,
2014 ; Brackman dan Coenye, 2015 ).
91
Menurut Tamano et al.,., (2015), Aspergillus oryzae memiliki
kandungan asam lemak, antara lain asam palmitate, asam strearat, asam
oleic, dan asam linoleic. Asam lemak ini dapat dijadikan sebagai
antibiofilm dengan menghambat proses adhesi, fimbriae, EPS,
pembentukan dan maturasi biofilm (Kumar P et al.,., 2020). Asam
linoleic dapat menurunkan biofilm Klebsiella pneumoniae sebesar 80%
pada dosis 31-84 μg / ml (Ramanathan et al.,, 2017). Asam palmitate
yang di kultur pada Vibrio spp dapat menurunkan regulasi QS pada luxS
dan luxR, menghambat produksi EPS dan menganggu pembentukan
biofilm. S-ribosylhomocysteine lyase (LuxS) dapat mensintesiskan
Autoinduser tipe 2 (AI-2) sebagai autoinduser pada bakteri gram positif
dan negatif (Schauder et al.,., 2001). Asam palmitate diketahui tidak
menganggu pertumbuhan planktonik, namun dapat mengacaukan proses
adhesi patogen (Santhakumari S et al.,, 2017). Hal itu menyebabkan
adanya perbedaan pengaruh aktivitas antibiofilm dan kadar hambat
minimum. Aspergillus oryzae juga mengandung enzim ekstraseluler
seperti β-glukosidase yang dapat mensintesis senyawa fenolik
(Sa’nchez, 2009). Senyawa ini juga dapat berperan sebagai Inhibitor
Quorum sensing (IQS) (Damayanti, 2017).
Pada uji pencegahan perlekatan, dihasilkan data presentase yang
tercantum pada gambar 5.7. Hasil paling tinggi terletak pada konsentrasi
50% dengan presentase 41,5% dan hasil terendah pada konsentrasi 25%
dan 12,5% dengan presentase 0%. Kemudian pada uji aktivitas
penghambatan didapatkan hasil seperti yang ada pada gambar 5.7. Pada
92
gambar ini menunjukkan kontrol positif memiliki aktivitas
penghambatan pembentukan biofilm tertinggi dengan presentase
sebesar 87% dan konsentrasi terendah pada konsentrasi 12,5% dengan
presentase sebesar 65%. Dan hasil uji penghancuran biofilm juga pada
gambar 5.7 yang menyatakan bahwa konsentrasi tertinggi pada kontrol
positif dengan presentase 51% dan konsentrasi 25% menunjukkan
konsentrasi paling rendah dengan nilai presentase sebesar 24%.
6.8 Analisis Data
6.8.1 Analisis Data Uji Aktivitas Pencegahan Perlekatan Biofilm
Analisis data yang digunakan pada penelitian ini yaitu dengan
aplikasi IBM SPSS Stastistic. Analisis pertama yaitu menentukan jenis
analisis statistik data termasuk parametrik atau non parametrik dengan
uji normalitas dan homogenitas. Pada uji pencegahan perlekatan
menunjukkan bahwa data terdistribusi normal dan tidak homogen. Oleh
karena itu diperlukan transformasi data untuk mengubah skala
pengukuran data asli menjadi bentuk lain yang memenuhi asumsi
analisis ragam. Setelah data homogen kemudian dilanjutkkan dengan uji
One Way ANOVA. Dari hasil uji ini menunjukkan terdapat perbedaan
signifikan yang ditandai dengan nilai p-value < 0.05. Kemudian
dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tukey. Dari hasil uji yang dilakukan
dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan pada
konsentrasi 12.5% terhadap kontrol positif dan kontrol media. Dan yang
terakhir dilakukan uji korelasi dengan Pearson. Dari hasil uji korelasi
menunjukkan korelasi antar konsentrasi dengan OD memiliki korelasi
93
yang tidak signifikan karena nilai p > 0.05. Hal ini dapat disebabkan
oleh faktor adhesi yaitu hidrofobisitas planktonik terhadap permukaan
well-plate yang terbuat dari polystyrene (Berlanga et al,. 2018).
Hidrofobisitas yang tinggi dapat meningkatkan kemampuan molekul
untuk melekat pada polystyrene. Sedangkan dalam pengukuran OD
hanya berpacu pada tingkat kekeruhan suspensi tanpa mengetahui
penyebab kekeruhan. Dengan demikian dimungkinkan dapat
menganggu proses pengukuran OD (Optical Density) biofilm. Nilai
Pearson correlation = 0.244 menunjukkan bahwa antar konsentrasi
dengan OD memiliki derajat korelasi yang cukup. Arah korelasi
bertanda positif yang menunjukkan semakin besar nilai tingkat
konsentrasi CFS maka semakin besar pula nilai OD-nya.
6.8.2 Analisis Data Uji Aktivitas Penghambatan Pembentukan
Biofilm
Hasil analisis uji penghambatan pembentukan biofilm
menunjukan bahwa data terdistribusi normal dengan nilai p-value >
0.05. Dan uji homogenitas menunjukan data bersifat homogen dengan
nilai p-value > 0.05. Setelah memenuhi syarat parametrik maka
dilanjutkan dengan analisis menggunakan uji oneway ANOVA. Pada uji
oneway ANOVA menunjukkkan nilai p-value < 0.05 yang berarti data
memiliki perbedaan yang signifikan. Kemudian dilanjutkan dengan uji
Post-Hoc Tukey. Dari uji ini terdapat perbedaan nilai yang signifikan
pada ke lima kelompok konsentrasi (100%, 50%, 25%, 12.5%, dan
6.25%), kelompok kontrol media dan kelompok kontrol positif terhadap
94
kelompok kontrol negatif. Pada kontrol positif terdapat perbedaan nilai
yang signifikan pada kontrol negatif, konsentrasi 25% dan konsentrasi
12.5%. Pada kontrol media juga ditemukan adanya terdapat perbedaan
nilai yang signifikan terhadap konsentrasi 25%, 12.5%, dan 6.25%. Dan
kemudian dilanjutkan dengan uji korelasi pearson untuk mengetahui
tingkat kekuatan hubungan dan arah hubungan. Hasil uji korelasi
menunjukkan tidak adanya hubungan korelasi antar konsentrasi dengan
OD karena nilai p > 0.05. Hasil serupa juga terjadi pada penelitian yang
dilakukan Khotimah (2020), menunjukkan tidak adanya hubungan
korelasi antara tingkat konsentrasi dengan nilai OD pada uji
penghambatan aktivitas antibiofilm ekstrak daun mulberi hitam (Morus
nigra L.) terhadap biofilm Klebsiella pneumoniae. Hal ini dapat
dipengaruhi oleh beberapa faktor. Salah satunya dimungkinkan karena
pengunaan Spectrofotometer dalam pengukuran OD yang tidak melihat
penyebab dari kekeruhan. Hasil tersebut juga dimungkinkan
dipengaruhi oleh permeabilitas membran luar Klebsiella pneumoniae.
Membran luar bakteri negatif yang kaya akan molekul lipopolisakarida
memiliki fungsi sebagai penghalang permeabilitas yang hanya dapat
dilewati oleh molekul hidrofilik ukuran kecil (Witkowska et al, 2013).
Sehingga konsentrasi yang kecil dapat berpenetrasi dengan baik ke
dalam bakteri. Selain itu membran luar juga membatasi laju molekul
antimikroba tertentu. Bakteri ini memiliki pompa resisten multi-obat
untuk menyeleksi senyawa antimikroba melewati penghalang membran.
Hal tersebut yang membuat bakteri gram negatif lebih resisten terhadap
95
antimikroba (Lambert, 2002 & Ramli et al., 2017). Nilai pearson
correlation = 0.413 menunjukkan bahwa antar konsentrasi dengan OD
memiliki derajat korelasi yang cukup. Arah korelasi bertanda positif
yang menunjukkan semakin besar nilai tingkat konsentrasi CFS maka
semakin besar pula nilai OD-nya.
6.8.3 Analisis Data Aktivitas Penghancuran Biofilm
Hasil analisis uji penghancuran biofilm menunjukan bahwa data
terdistribusi normal dengan nilai p-value > 0.05. Dan uji homogenitas
menunjukan data tidak homogen dengan nilai p-value < 0.05. Oleh
karena itu diperlukan transformasi data untuk mengubah skala
pengukuran data asli menjadi bentuk lain yang memenuhi asumsi
analisis ragam. Setelah data homogen kemudian dilanjutkkan dengan uji
One Way ANOVA. Dari hasil uji ini menunjukkan terdapat perbedaan
signifikan yang ditandai dengan nilai p-value < 0.05. Selanjutnya
dilakukan uji Post-Hoc Tukey. Dari hasil analisis ini menunjukkan
terdapat perbedaan nilai yang signifikan pada kelompok kontrol negatif
terhadap kontrol positif, kontrol media dan konsentrasi 100%. Tidak
hanya itu kontrol media juga memiliki perbedaan nilai yang signifikan
terhadap kontrol positif, kontrol negatif dan semua konsentrasi. Dan
yang terakhir dilakukan uji korelasi pearson untuk mengetahui tingkat
kekuatan hubungan dan arah hubungan Dari hasil uji korelasi
menunjukkan adanya hubungan korelasi antar konsentrasi dengan OD
memiliki korelasi yang signifikan karena nilai p < 0.05. Nilai pearson
correlation = 0.553 menunjukkan bahwa antar konsentrasi dengan OD
96
memiliki derajat korelasi yang sangat kuat. Arah korelasi bertanda
positif yang menunjukkan semakin besar nilai tingkat konsentrasi CFS
maka semakin besar pula nilai OD-nya.
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa
Aspergillus oryzae memiliki aktivitas antibiofilm terhadap bakteri
Klebsiella pneumoniae dalam mencegah perlekatan, pembentukan dan
penghancuran biofilm. Oleh karena itu diharapkan dengan adanya
peningkatan pengembangan penelitian Aspergillus oryzae dapat
dijadikan sebagai antibiotik alami yang dapat membunuh bakteri dengan
baik seperti antibiotik kimia. Sehingga Aspergillus oryzae dapat
dijadikan sebagai antibiofilm alternative untuk mengurangi tingkat
resistensi penggunaan antibiotik kimia.
Pada penelitian ini terdapat beberapa keterbatasan yaitu
identifikasi kandungan Aspergillus oryzae secara spesifik. Oleh karena
itu penulis berharap pada penelitian selanjutnya dapat menguraikan
kandungan spesifik Aspergillus oryzae. Penulis juga berharap penelitian
ini dapat memberikan dorongan kepada peneliti lainnya untuk
meningkatkan minat dalam melakukan penelitian dengan
memanfaatkan kekayaan alam di Indonesia khususnya jamur
Aspergillus oryzae. Peneliti juga berharap masyarakat mengetahui
bahwa jamur dapat memberikan manfaat jika dikelola dengan tepat.
6.9 Integrasi Menurut Al-qur’an dan Hadist
Sebagai manusia diharapkan dapat mensyukuri atas nikmat yang
telah diberikan dan dapat memanfaatkan kekayaan alam dengan
97
sebaiknya. Semua itu merupakan salah satu bukti kebesaran dan kasih
sayang Allah yang menciptakan alam semesta beserta isinya
sebagaimana Allah menciptakan tumbuhan dengan berbagai manfaat
yang terkandung didalamnya. Pernyataan ini sesuai dengan firman Allah
dalam surat Thahaa ayat 53 yang berbunyi :
ماء ماء فأخرجنا به أزواجا الذي جعل لكم الأرض مهدا وسلك لكم فيها سبلا وأنزل من الس
من نبات شتى
Artinya : “(Allah SWT) yang telah menjadikan bagimu bumi
sebagai hamparan dan yang telah menjadikan bagimu di bumi itu jalan-
jalan, dan menurunkan dari langit air hujan. Maka Kami tumbuhkan
dengan air hujan itu berjenis-jenis dari tumbuh-tumbuhan yang
bermacam-macam”.
Berdasarkan ayat tersebut dapat diketahui banyaknya jenis
tanaman yang dapat diambil manfaatnya khususnya di Indonesia.
Banyaknya tanaman yang tumbuh berpotensi tinggi dalam pemanfaatan
bahan alam sebagai obat tradisional dan salah satunya adalah
Aspergillus oryzae. Peneliti juga percaya bahwa setiap penyakit selalu
ada obatnya. Hal itu sesuai dengan hadis yang diriwayatkan oleh Abu
Daud (An-Najjar, 2006) yang berbunyi : “Sesungguhnya Allah
menurunkan penyakit beserta obatnya, dan menciptakan obat untuk
setiap penyakit, maka berobatlah kalian namun jangan berobat dengan
yang haram”. Hadis tersebut memberikan dorongan untuk terus
berusaha mencari obat dengan memanfaatkan bahan alam yang
berpotensi sebagai obat seperti Aspergillus oryzae. Tidak hanya itu,
98
Allah juga menjanjikan surga bagi orang yang bersungguh – sungguh
dalam mencari ilmu (HR. Muslim, no. 2699). Oleh karenanya peneliti
semakin bersemangat dalam meningkatkan ilmu pengetahuannya guna
mencari ridho dari Allah SWT.
99
BAB VII
KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpulan
1. Aspergillus oryzae memiliki aktivitas pencegahan perlekatan
terhadap biofilm Klebsiella pneumoniae dengan presentase aktivitas
tertinggi pada konsentrasi 50 % sebesar 41,5%.
2. Aspergillus oryzae memiliki aktivitas terhadap penghambatan
pembentukan biofilm Klebsiella pneumoniae dengan presentase
aktivitas tertinggi pada konsentrasi 100 % sebesar 77 %.
3. Aspergillus oryzae memiliki aktivitas terhadap penghancuran
biofilm Klebsiella pneumoniae dengan presentase aktivitas tertinggi
pada konsentrasi 100 % sebesar 47%.
4. Aspergillus oryzae tidak memiliki Kadar Hambat Minimum (KHM)
dan Kadar Bunuh Minimum (KBM) terhadap Klebsiella pneumoniae.
7.2 Saran
1. Perlu dilakukan penelitian perihal kandungan Aspergillus oryzae
yang lebih spesifik.
2. Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk menentukan besarnya
dosis yang mampu menghambat aktivitas biofilm dengan efektif.
100
DAFTAR PUSTAKA
Abidah, Hafshah Yasmina 2020. Uji aktivitas antibiofilm ekstrak daun
murbei hitam (Morus nigra L.)terhadap biofilm Escherichia coli.
Undergraduate thesis, Universitas Islam Negeri Maulana Malik
Ibrahim.
Ade FY. 2013. Isolasi Dan Identifikasi Jamur-Jamur Pendegradasi
Amilosa Pada Empelur Tanaman Sagu (Metroxylon sagu
Rottb.). Jurnal Ilmiah Edu Research Vol.2 No.1 Juni 2013
Aileen Prisca Suciadi, 021511133113 (2018) deteksi protein biofilm
candida albicans yang diinduksi glukosa, laktosa, protein
kedelai, dan zat besi serta analisis densitas protein. Skripsi thesis,
Universitas Airlangga.
Al-Baer, Ali saadi and Hussein, Asmaa A. 2017. Isolation and
Identification of Escherichia coli Producing Cytosine
Deaminase from Iraqi patients, Int. J. Adv. Res. Biol. Sci, 4(11):
1-6.
Anderson, K.F., Patel, J.B. & Wong, B., 2009. Characterization of
Enterobacteriaceae with a false positive modified Hodge test,
Abstracts of the Forty-ninthInter science Conference on
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. AmericanSociety for
Microbiology, pp.719-41.Beesley, T., Gascoyne, N. &
KnottHunziker, V., 1983. The Inhibition of class C ß-lactamases
by boronic acids. Biochem J , 209, pp.229-33.
Ayuningtyas, F. 2016. Identifikasi Klebsiella pneumoniae sebagai
penyebab pneumonia.
Azeredo, J., Azevedo, N.F., Briandet, R., Cerca, N., Coenye, T., Costa,
A.R., Desvaux, M., Bonaventura, G.D., Hebraud, M., Jaglic, Z.,
Kacanovia, M., Knochel, S., Lourenco, A., Mergulhao, F.,
Meyer, R.L, Nuchas, G., Simoes, M., Tresse, O., Sternberg, C.,
2016. Critical Review on Biofilm Methods. Critical Reviews in
Microbiology., 43 (3), 313-351.
Baban, Soza. 2017. Prevalence and Antimicrobial Susceptibility of
Extended Spectrum Beta-Lactamase-Producing Klebsiella
pneumoniae isolated from Urinary Tract Infection.
Balestrino D, Haagensen JAJ, Rich C, Forestier C. 2005.
Characterization of type 2 quorum sensing in Klebsiella
pneumoniae and relationship with biofilm formation. J
Bacteriol. 187:2870–2880.
Balouiri, M. 2016. Methods for in Vitro Evaluating Antimicrobial
Activity: A Review. Elsevier. Journal of Pharmaceutical
Analysis (6): 71-79.
Barriuso, J., Hogan, D. A., Keshavarz, T., & Martínez, M. J. (2018).
Role of quorum sensing and chemical communication in fungal
biotechnology and pathogenesis. FEMS microbiology reviews,
42(5), 627–638.
Berlanga, M., Domenech, O., Guerrero, R., 2014, Biofilm Formation on
polystyrene in detached vs planktonik cells of
101
polyhydroxyalkanoate accumulating Halomonas venusta,
International Microbiology, 17(4), 205-212
Bhatia, Y., Mishra, S. and Bisaria, V.S. (2002) Microbial beta-
glucosidases: Cloning, properties, and applications. Crit. Rev.
Biotechnol. 22, 375–407.
Borges, A., Sousa, P., Gaspar, A., Vilar, S., Borges, F., & Simoes, ˜ M.
(2017). Furvina inhibits the 3-oxo-C12-HSL-based quorum
sensing system of Pseudomonas aeruginosa and QS-dependent
phenotypes. Biofouling, 33(2), 156–168.
Brackman G, Coenye T. 2014. Quorum sensing inhibitors as Anti-
Biofilm agents. Curr Pharm. 21:5–11.
Brackman G., Coenye T. (2015). Quorum sensing inhibitors as anti-
biofilm agents. Curr. Pharm. Des. 21, 5–11.
10.2174/1381612820666140905114627
Brooks, G.F., Butel, J.S, and S.A. Morse. 2008. Jawetz, Melnich JL,
Adelberg,sEA. Mikrobiologi Kedokteran. 20th Ed. Jakarta:
Salemba Medika.528 hlm.
Brunner & Suddarth. 2011. Keperawatan Medikal-Bedah. Jakarta : EGC
Bulele T, Rares F E S, Porotu’o J. 2019. Identifikasi Bakteri dengan
Pewarnaan Gram pada Penderita Infeksi Mata Luar di Rumah
Sakit Mata Kota Manado. Jurnal e-Biomedik (eBm), Volume 7,
Nomor 1, Januari-Juni 2019
Cadavid, E., Robledo, S., Quiñones, W., & Echeverri, F.
(2018). Induction of Biofilm Formation in Klebsiella
pneumoniae ATCC 13884 by Several Drugs: The Possible Role
of Quorum Sensing Modulation. Antibiotics, 7(4),
103. doi:10.3390/antibiotics7040103
Chang, P-K., Horn, B.W., Abe, K., Gomi, K. 2014. Aspergillus:
introduction. In: Batt, C.A., Tortorello, M.L. (Eds.).
Encyclopedia of Food Microbiology. Volume 1. Elsevier Ltd,
Academic Press. p. 77-82.
Chew, S. C., & Yang, L. 2016. Biofilms. Encyclopedia of Food and
Health, 407–415. doi:10.1016/b978-0-12-384947-2.00069-6
Coffey, B. M., & Anderson, G. G. (2014). Biofilm Formation in the 96-
Well Microtiter Plate. Pseudomonas Methods and Protocols,
631–641. doi:10.1007/978-1-4939-0473-0_48
Cortes ME, Consuegra J, Sinisterra RD (2011) Bioflm formation,
control, and novel strategies for eradication. Sci Against
Microbial Pathog Commun Curr Res Technol Adv 2:896–905
Corwin EJ. 2009. Buku Saku Patofisiologi. Edisi 3. EGC. Jakarta.
Dalynn. 2014. McF Standard. Dalynn Biological Catalogue No. TM50
– TM60: Canada.
Damayanti E., Istiqomah L., Saragih J. E., Purwoko T. and Sardjono.
(2017). Characterization of lactic acid bacteria as poultry
probiotic candidates with aflatoxin B1 binding activities. IOP
Conf. Ser. Earth Environ. Sci. 101:012030 10.1088/1755-1315/
102
Davies, D.G. and Marques, C.N.H. (2009) A fatty acid messenger is
responsible for inducing dispersion in microbial biofilms. J.
Bacteriol. 191, 1393 – 1403
Defoirdt, T. (2018). Quorum-Sensing Systems as Targets for
Antivirulence Therapy. Trends in Microbiology, 26(4), 313–
328. doi:10.1016/j.tim.2017.10.005
Desbois, A.P. and Smith, V.J. (2010) Antibacterial free fatty acids:
activities, mechanisms of action and biotechnological potential.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 1629 – 1642
Dongari-Bagtzoglou, A. (2008). Pathogenesis of mucosal biofilm
infections: challenges and progress. Expert Review of Anti-
Infective Therapy, 6(2), 201–208.
doi:10.1586/14787210.6.2.201
Du Y., Li T., Wan Y., Liao P. (2014). Signal molecule-dependent
quorum-sensing and quorum-quenching enzymes in
bacteria. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 24, 117–132.
10.1615/CritRevEukaryotGeneExpr.2014008034
Fathoni R, Radiastuti N, Wijayanti F. 2017 – Identifikasi Jenis
Cendawan pada Kelelawar (Ordo Chiroptera) di Kota Tangerang
Selatan. Jurnal Mikologi Indonesia 1(1), 28-37.
Fitria A, Nugraha AT, Meliani Y, Choiriah A. 2018. The Bactericidal
and Antibiofilm Activity of Stem Bark of Jatropha multifida L.
Against Staphylococcus aureus and MRSA. Eksakta: Jurnal
Ilmu-ilmu MIPA. Vol. 8. p. ISSN: 1411-1047 e. ISSN: 2503-
2364. doi: 10.20885/eksakta.vol18.iss1.art5
Frisvad JC, Hubka V, Ezekiel CN, Hong S-B, Nováková A, Chen AL,
Arzanlou M, Larsen TO, Sklenár F, Mahakarnchanakul W,
Samson RA, Houbraken J. 2019. Taxonomy of Aspergillus
section Flavi and their production of aflatoxins, ochratoxins and
other mycotoxins. Stud Mycol ;93:1–63. doi:
10.1016/j.simyco.2018.06.001.
Fux CA, Costerton JW, Stewart PS, Stoodley P. 2005. Survival
strategies of infectious biofilms. Trends Microbiol; 13: 34-40.
Galdiero, E., Di Onofrio, V. D., Maione, A., Gambino, E., Gesuele, R.,
Menale, B., … Guida, M. (2020). Allium ursinum and Allium
oschaninii against Klebsiella pneumoniae and Candida albicans
Mono- and Polymicrobic Biofilms in In Vitro Static and
Dynamic Models. Microorganisms, 8(3), 336.
doi:10.3390/microorganisms8030336
Gandjar, I & Sjamsuridzal, W. 2006. Mikologi: Dasar dan Terapan.
Jakarta: EGC.
GBIF Secretariat (2019). Aspergillus oryzae (Ahlb.) E.Cohn . GBIF
Backbone Taxonomy. Diakses via GBIF.org pada 2020-11-29
https://doi.org/10.15468/39omei
Greenwood, D., Barer, M., Slack, R., & Irving, W. (2012). Medical
Microbiology (Eighteenth).
103
Grief, S. N., & Loza, J. K. (2018). Guidelines for the Evaluation and
Treatment of Pneumonia. Primary Care: Clinics in Office
Practice, 45(3), 485–503. doi:10.1016/j.pop.2018.04.001
Gunardi, W. (2014). Peranan Biofilm dalam Kaitannya dengan Penyakit
Infeksi. Jurnal Kedokteran Meditek, 15(39A).
https://doi.org/10.36452/jkdoktmeditek.
Gupta, Ankit. 2015. Biofilm Quantification and Comparative Analysis
of MIC (Minimum Inhibitory Concentration) & MBIC
(Minimum Biofilm Inhibitory Concentration) Value for
Different Antibiotics against E. coli.
Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci 4(2): 198-224
Happel, K.I.; Dubin, P.J.; Zheng, M.; Ghilardi, N.; Lockhart, C.;
Quinton, L.J.; Odden, A.R.; Shellito, J.E.; Bagby, G.J.; Nelson,
S.; et al. Divergent roles of IL-23 and IL-12 in host defense
against Klebsiella pneumoniae. J. Exp. Med. 2005, 202, 761–
769.
Hart, T. 2004. Color Atlas of Medical Microbiology Second Edition.
London : Licensing Agency. pp. 83.
Hasiani VV, Ahmad I, Rijai L. 2015. Isolasi Jamur Endofit dan Produksi
Metabolit Sekunder Antioksidan dari Daun Pacar (Lawsonia
inermis L.). Jurnal Sains dan Kesehatan. Vol 1.No 4. 146p-
ISSN:2303-0267, e-ISSN:2407-6082
Hemraj, V., 2013. A review on Commonly Used Biochemical Test For
Bacteria. India: Departement of Pharmacy, L R Intitute of
Pharmacy, Solan (H.P).
Iglesias, M. J., Soengas, R., Probert, I., Guilloud, E., Gourvil, P., Mehiri,
M., … Ortiz, F. L. (2019). NMR characterization and evaluation
of antibacterial and antiobiofilm activity of organic extracts from
stationary phase batch cultures of five marine microalgae
(Dunaliella sp., D. salina, Chaetoceros calcitrans, C. gracilis and
Tisochrysis lutea). Phytochemistry, 164, 192–205.
doi:10.1016/j.phytochem.2019.05.001
Irawan R, Reviono, Harsini. 2019. Korelasi Kadar Copeptin dan Skor
PSI dengan Waktu Terapi Sulih Antibiotik Intravena ke Oral dan
Lama Rawat Pneumonia Komunitas. J Respir Indo, 39(1): 44-
53.
Jackson DW, Simecka JW, Romeo T. 2002. Catabolite repression of
Escherichia coli biofilm formation. J Bacteriol 184:3406 –3410.
http://dx .doi.org/10.1128/JB.184.12.3406-3410.2002.
Jain S, Self WH, Wunderink RG, et al. Community-acquired pneumonia
requiring hospitalization among U.S. adults. N Engl J Med
2015;373(5):415–27.
Jamal M, Tasneem U, Husssain T, Andleeb S. 2015. Bacterial Biofilm:
Its Composition, Formation and Role in Human
Infections.National University of Sciences and Technology
(NUST). vol 4. e-ISSN:2320-3528p-ISSN:2347-2286
Jawetz E., J.L. Melnick, E.A. Adelberg.
2007. Mikrobiologi Kedokteran. EGC
104
Press.Jakarta. 513 hlm.Keith, Miller. Immunocytochemical
Techniques. Theory and Practice of HistologicalTechniques. 5
edition. Toronto; 2002; 421-458
Jawetz, Melnick, dan Adelberg’s. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi
23. Alih Bahasa: Huriwati Hartanto et al. Jakarta: Penerbit Buku
Kedokteran EGC.
K. Gomi. 2014. Aspergillus oryzae. Encyclopedia of Food Microbiology
(Second Edition),
Kalanuria, A., Zai, W., & Mirski, M. (2014). Ventilator-associated
pneumonia in the ICU. Critical Care, 18(2), 208.
doi:10.1186/cc13775
Kambuno, T dan Fanggidae, D. 2017. Identifikasi Bakteri Gram Negatif
Galur Extended Spectrum Beta Lactamase Pada Ruang NICU
RSUD Prof. DR. W. Z. Johannes Kupang Norma. Jurnal Info
Kesehatan Vol 15, No.2, Desember 2017, pp. 333-345 P-ISSN
0216-504X, E-ISSN 2620-536X
Katzung, B. G. (2002). Farmakologi dasar dan klinik. Jakarta: EGC.
Kaysin A, Viera AJ. Community- acquired pneumonia in adults:
diagnosis and management. Am Fam Physician 2016;94(9):698–
706.
Kementerian Kesehatan RI. (2020). Profil Kesehatan Indonesia Tahun
2019. Jakarta : Kementerian Kesehatan
Kementrian Kesehatan RI. (2018). Profil Kesehatan Indonesia Tahun
2017. Jakarta.
Kementrian Pertanian. 2016. Statistik Produksi Hortikultura. Jakarta
Khanifah, F. 2015. Efek Pemberian Air Perasan Jeruk Nipis terhadap
Pencegahan Pembentukan, Penghambatan Pertumbuhan, dan
Penghancuran Biofilm Staphylococcus aureus Secara In Vitro.
Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif
Hidayatullah, Jakarta.
Khotimah, Alif RH. 2020. Uji aktivitas ekstrak daun murtbei hitam
(Morus nigra L.) sebagai antibiofilm Klebsiella pneumoniae.
Undergraduate thesis, Universitas Islam Negeri Maulana Malik
Ibrahim.
Kim, Y., Kraft, P., & Asgari, M. M. (2018). Using a Mendelian
randomization approach to explore a causal relationship between
vitamin D and nonmelanoma skin cancer. British Journal of
Dermatology, 178(6), 1241–1242. doi:10.1111/bjd.16599
Kinning, E., Falah, S., Nurhidayat, N., 2016. The In Vitro Antibiofilm
Activity of Water Leaf Extract of Papaya (Carica papaya L.)
against Pseudomonas aeruginosa. Current Biochemistry., 2 (3),
150-163.
Kirmusaoglu, Sahra. 2019. The Method for Detection of Biofilm and
Screening Antibiofilm Agents. Antimicrobial, Antibiotic
Resistance, Antibiofilm Strategies and Activity Methods,
IntechOpen, p. 1-17.
105
Koresy, Dennis (2018) Efek Ekstrak Etanol Teh Hijau (Camellia sinensis var. assamica) Sebagai Penghambat Pembentukan Biofilm Klebsiella pneumoniae Secara In Vitro. Sarjana thesis, Universitas Brawijaya
Kumar, P., Lee, J.-H., Beyenal, H., & Lee, J. (2020). Fatty Acids as
Antibiofilm and Antivirulence Agents. Trends in Microbiology.
doi:10.1016/j.tim.2020.03.014
Lam, M.M.C.; Wyres, K.L.; Judd, L.M.; Wick, R.R.; Jenney, A.; Brisse,
S.; Holt, K.E. Tracking key virulence loci encoding aerobactin
and salmochelin siderophore synthesis in Klebsiella
pneumoniae. Genome Med. 2018, 10, 77.
Lambert PA. 2002. Cellular impermeability and uptake of biocides and
antibiotics in Gram-positive bacteria and mycobacteria. J Appl
Microbiol. 92 Suppl():46S-54S.
Li, B., Zhao, Y., Liu, C., Chen, Z., & Zhou, D. (2014). Molecular
pathogenesis ofKlebsiella pneumoniae. Future Microbiology,
9(9), 1071–1081. doi:10.2217/fmb.14.48
Liaw, S.-J., Lai, H.-C., & Wang, W.-B. (2004). Modulation of
Swarming and Virulence by Fatty Acids through the RsbA
Protein in Proteus mirabilis. Infection and Immunity, 72(12),
6836–6845. doi:10.1128/iai.72.12.6836-6845.2004
Liu L., Tan X., Jia A. (2012). Relationship between bacterial quorum
sensing and biofilm formation–a review. Wei Sheng Wu Xue
Bao 52, 271–278.
Martin, R.M.; Bachman, M.A. Colonization, Infection, and the
Accessory Genome of Klebsiella pneumoniae. Front. Cell.
Infect. Microbiol. 2018, 8, 4.
Martinez R, Menedez R, Reyes S, Polverino E, Cilloniz C, Martinez A,
et al. 2011. Factors associated with inflammatory cytokine
patterns in communityacquired pneumonia. Eur Respir J. vol. 37.
hlm. 393-9.
Medzhitov R. 2010. Inflammation 2010: new adventures of an old
flame. Cell. vol. 140. hlm. 771-6.
Meijvis SCA, Van de Garde EMW, Rijkers GT, Bos WJW. 2012.
Treatment with anti-inflammatory drugs in community acquired
Pneumonia. J Intern Med. vol. 272. hlm. 25–35.
Mladenovć, K. G. ; Muruzović, M. ; Vasić, S. M. ; Čomić, L. R. 2019.
The symbiotic effect of temperature and sugars on the planktonic
growth and biofilm formation of Klebsiella spp. isolated from
traditionally made cheese. Romanian Biotechnological Letters.
Vol.24 No.3 pp.400-406 ref.24. 10.25083/rbl/24.3/400.406
Moldoveanu B, Otmishi P, Jani P, Walker J, Sarmiento X, Guardiola J,
et al. 2009. Inflammatory mechanisms in the lung. Journal of
inflammation research. vol.2. hlm. 1-11.
Moradali, M. F., Ghods, S., & Rehm, B. H. A. (2017). Pseudomonas
aeruginosa Lifestyle: A Paradigm for Adaptation, Survival, and
Persistence. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 7.
doi:10.3389/fcimb.2017.00039
106
Mostafavi, M.; Wang, L.; Xie, L.; Takeoka, K.T.; Richie, D.L.; Casey,
F.; Ruzin, A.; Sawyer, W.S.; Rath, C.M.; Wei, J.R.; et al. 2018.
Interplay of Klebsiella pneumoniae fabZ and lpxC Mutations
Leads to LpxC InhibitorDependent Growth Resulting from
Loss of Membrane Homeostasis. mSphere, 3.
Muhajir, A. S., Purwono, P. B., & Handayani, S. (2016). Gambaran
terapi dan luaran infeksi saluran kemih oleh bakteri penghasil
Extended Spectrum Beta Lactamase pada anak di RSUD Dr.
Soetomo Surabaya. Sari Pediatri, 18(2), 111-116.
Nagata K, Mino H, Yoshida S. 2010. Usefulness and limit of Gram
staining smear examination. Rinsho Byori. 58(5):490-7.
Nazzaro, F., Fratianni, F., & Coppola, R. (2013). Quorum sensing and
phytochemicals. International journal of molecular sciences,
14(6), 12607–12619.
Nicol, M., Alexandre, S., Luizet, J.-B., Skogman, M., Jouenne, T.,
Salcedo, S., & Dé, E. (2018). Unsaturated Fatty Acids Affect
Quorum Sensing Communication System and Inhibit Motility
and Biofilm Formation of Acinetobacter baumannii.
International Journal of Molecular Sciences, 19(1), 214.
doi:10.3390/ijms19010214
Nurarif & Kusuma, 2016. Aplikasi Asuhan Keperawatan Berdasarkan
Daignosa Medis &.Nanda Nic-Noc. Yogyakatra : MediAction
Oda K., et al. 2006. Proteomic analysis of extracellular proteins from
Aspergillus oryzae grown under submerged and solid-state
culture conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72:3448–3457
Oramahi H.A, Sumardiyono C, Pusposendjojo N, Haryadi. 2006.
Identifikasi Jamur Aspergillus Pada Gaplek di Kabupaten
Gunung Kidul. Jurnal Tanaman Indonesia. Vol 12. No 1. 25-23
O'Toole, G. A., 2011. Microtiter dish biofilm formation assay. Journal
of visualized experiments: JoVE., 47 (1).
Paraje, M. G., 2011. Antimicrobial Resistance in Biofilms.
FORMATEX, 736-744.
Passos da Silva, D., Schofield, M., Parsek, M., & Tseng, B. (2017). An
update on the sociomicrobiology of quorum sensing in Gram-
negative biofilm development. Pathogens, 6(4), 51.
Paula-Ramos, L., da Rocha Santos, C. E., Camargo Reis Mello, D.,
Nishiama Theodoro, L., De Oliveira, F. E., Back Brito, G. N., …
de Oliveira, L. D. (2016). Klebsiella pneumoniae Planktonic and
Biofilm Reduction by Different Plant Extracts: In Vitro Study.
The Scientific World Journal, 2016, 1–
5. doi:10.1155/2016/3521413
Podschun, R., and Ullmann, U. 1998. Klebsiella spp. as nosocomial
pathogens: epidemiology, taxonomy, typing methods, and
pathogenicity factors. Clin. Microbiol. Rev. 11, 589–603.
Post, K W. And Songer, GJ. 2005. MICROBIOLOGY Bacterial and
Fungal Agent of Animal Disease. Elsevier Saunders:
Philadelphia
107
Prateeksha, Bajpai, R., Yusuf, M. A., Upreti, D. K., Gupta, V. K., &
Singh, B. N. (2019). Endolichenic fungus, Aspergillus
quandricinctus of Usnea longissima inhibits quorum sensing and
biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa PAO1. Microbial
Pathogenesis, 103933. doi:10.1016/j.micpath.2019.103933
Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: EGC.
Purwanti NU, Susanti R. 2016. Uji Aktivitas Antibakteri dan Antifungal
Ekstrak Etanol Rimpang Acorus sp. Jurnal Kesehatan
Khatulistiwa. Volume 2. Nomor 1. Januari 2016
Rachmawaty. 2010. Produksi Glukosa Jamur Tanah Aspergillus oryzae
Dan Aspergillus niger Pada Beberapa Jenis Substrat
Pati. Working Paper. Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam.
Rahayu SA & Gumilar MH. 2017. Uji Cemaran Air Minum Masyarakat
Sekitar Margahayu Raya Bandung Dengan Identifikasi Bakteri
Escherichia coli. IJPST Volume 4, Nomor 2
Rahayu, S. A., Gumilar. 2017. Uji Cemaran Air Minum Masyarakat
Sekitar Margahayu Raya Bandung Dengan Identifikasi Bakteri
Escherichia coli. JPST, Volume 4, Nomor 2
Ramanathan, S., Ravindran, D., Arunachalam, K., & Arumugam, V. R.
(2017). Inhibition of quorum sensing-dependent biofilm and
virulence genes expression in environmental pathogen Serratia
marcescens by petroselinic acid. Antonie van Leeuwenhoek,
111(4), 501–515. doi:10.1007/s10482-017-0971-y
Reviono. 2017. PNEUMONIA : Adakah tempat untuk pemberian
antiinflamasi ?. Surakarta. UNS Press
Ristiari NPN, Julyasih KSM, Suryanti IAP. 2018. Isolasi Dan
Identifikasi Jamur Mikroskopis Pada Rizosfer Tanaman Jeruk
Siam (Citrus nobilis Lour.) DI KECAMATAN KINTAMANI,
BALI. Jurnal Pendidikan Biologi Undiksha. Volume 6 Nomor 1.
p-ISSN : 2599-1450 e-ISSN : 2599-1485
Rollando R, Prasetyo YSA, Sitepu R. 2019. Uji Antimikroba Minyak
Atsiri Masoyi (Massoia aromatica) terhadap Bakteri
Streptococcus mutans. Majalah Farmasi dan Farmakologi.
Vol 23(2):52-57. DOI: https://doi.org/10.20956/mff.v23i2.6585
Rosdiana, N. & Nasution, A.I. 2016. Hubungan Biofilm Streptococcus
Mutans Terhadap Resiko Terjadinya Karies Gigi .Rosdiana N et
al/J Syiah Kuala Dent Soc, Vol. 1, No. 1, Hal. 43 – 50.
Ruchi T., Sutaja B., Anuradha D. 2015. Comparison of Phenotypic
Methods for The Detection Of Biofilm Production in Uro-
Pathogens in a Tertiary Care Hospital in India, International
Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 4 (9):
840-849.
Rufaldi, C. D. 2016. Klebsiellla pneumoniae.
Russo, T.A.; Shon, A.S.; Beanan, J.M.; Olson, R.; MacDonald, U.;
Pomakov, A.O.; Visitacion, M.P. Hypervirulent K. pneumoniae
secretes more and more active iron-acquisition molecules than
108
“classical” K. pneumoniae thereby enhancing its virulence.
PLoS ONE 2011, 6, e26734.
S´ anchez, C. (2009). Lignocellulosic residues: Biodegradation and
bioconversion by fungi. Biotechnology Advances, 27(2), 185–
194. https://doi.org/10.1016/j. biotechadv.2008.11.001
Safitri, Fauzana, Fauziah. 2011. Pembuatan Starter Inokulum Jamur
Aspergillus oryzae, Rhizopus oligosporus dan Trichoderma
viridae untuk Bibit Fermentasi Kulit Pisang Kepok (Musa
balbisiana Colla). Program Studi Pemuliaan Tanaman Fakultas
Pertanian Universitas Padjajaran. ISBN 978-602-18209-0-2
Samirah., Darwati., Windarwati., & Hardjoeno. (2014). Pola dan
sensitifitas kuman di penderita infeksi saluran kemih. Indonesian
Journal of Clinical Pathology and Medical Laboratory, 12(3),
110-113.
Santhakumari, S., Kannappan, A., Pandian, S. K., Thajuddin, N.,
Rajendran, R. B., & Ravi, A. V. (2015). Inhibitory effect of
marine cyanobacterial extract on biofilm formation and
virulence factor production of bacterial pathogens causing
vibriosis in aquaculture. Journal of Applied Phycology, 28(1),
313–324. doi:10.1007/s10811-015-0554-0
Santhakumari, S., Nilofernisha, N. M., Ponraj, J. G., Pandian, S. K., &
Ravi, A. V. (2017). In vitro and in vivo exploration of palmitic
acid from Synechococcus elongatus as an antibiofilm agent on
the survival of Artemia franciscana against virulent vibrios.
Journal of Invertebrate Pathology, 150, 21–31.
doi:10.1016/j.jip.2017.09.001
Sarathbabu, R.,V.T. Ramani, B.K. Rao, and S. Panda. 2012. Antibiotic
susceptibilitypattern of Klebsiella pneumoniae isolated
from sputum, urine and pussamples. IOSRJPBS.1(2) : 04-09.
Sarwono J, 2006. Metode Penelitian Kuantitatif dan Kualitatif, Graha
Ilmu,Yogyakarta, hal. 129
Schauder, S., Shokat, K., Surette, M. G., & Bassler, B. L. (2001). The
LuxS family of bacterial autoinducers: Biosynthesis of a novel
quorum-sensing signal molecule. Molecular microbiology,
41(2), 463–476.
Schembri MA, Dalsgaard D, Klemm P. 2004. Capsule shields the
function of short bacterial adhesins. J Bacteriol ;186:1249–1257.
Shakib, P., Kalani, M., Ramazanzadeh, R., Ahmadi, A., Rouhi, S. 2018.
Molecular detection of virulence genes in Klebsiella
pneumoniae clinical isolates from Kurdistan Province, Iran.
Biomedical Research and Therapy. 5(8), 2581-2589.
doi.org/10.15419/bmrat.v5i8.467
Shofiana RS, Sulistyowati L, Muhibuddin A. 2015. Eksplorasi Jamur
Endofit Dan Khamir Pada Tanaman Cengkeh (Syzygium
Aromaticum) Serta Uji Potensi Antagonismenya Terhadap
Jamur Akar Putih (Rigidoporus microporus). Jurnal HPT
Volume 3 Nomor 1
109
Shon, A.S.; Bajwa, R.P.; Russo, T.A. Hypervirulent
(hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae: A new and
dangerous breed. Virulence 2013, 4, 107–118.
Shukla SK, Rao T S. Staphylococcus aureus biofilm removal by
targeting biofilm-associated extracellular proteins. Indian J Med
Res 2017;146, Suppl S1:1-8
Singh, V. K., Kavita, K., Prabhakaran, R., & Jha, B. (2013). Cis-9-
octadecenoic acid from the rhizospheric
bacteriumStenotrophomonas maltophiliaBJ01 shows quorum
quenching and anti-biofilm activities. Biofouling, 29(7), 855–
867. doi:10.1080/08927014.2013.807914
Stanley NR, Lazazzera BA. 2004. Environmental signals and regulatory
pathways that influence biofilm formation. Mol Microbiol.
52:917–924.
Sutrina SL, Daniel K, Lewis M, Charles NT, Anselm CKE, Thomas N,
Holder N. 2015. Biofilm growth of Escherichia coli is subject to
cAMPdependent and cAMP-independent inhibition. J Mol
Microbiol Biotechnol 25:209 –225.
http://dx.doi.org/10.1159/000375498.
Sutriswati rahayu endang. 2020. Aspergillus flavus dan Para Saudara
Dekatnya. Pusat Studi Pangan dan gizi Universitas Gajah Mada.
Yogyakarta
Tamano K, Bruno KS, Karagiosis SA, Culley DE, Deng S, Collett JR,
Umemura M, Koike H, Baker SE, Machida M (2013) Increased
production of fatty acids and triglycerides in Aspergillus oryzae
by enhancing expressions of fatty acid synthesis-related genes.
Appl Microbiol Biotechnol 97(1):269 – 281
Tamano, K., Bruno, K. S., Koike, H., Ishii, T., Miura, A., Umemura, M.,
… Machida, M. (2015). Increased production of free fatty acids
in Aspergillus oryzae by disruption of a predicted acyl-CoA
synthetase gene. Applied Microbiology and Biotechnology,
99(7), 3103–3113. doi:10.1007/s00253-014-6336-9
Tarina, N.T.I., Kusuma, S.A.F. 2017. Deteksi Bakteri Klebsiella
pneumoniae. Farmaka. Suplemen Vol 15 no 2
Teper, D., Zhang, Y., & Wang, N. (2019). TfmR, a novel TetR‐family
transcriptional regulator, modulates the virulence of
Xanthomonas citri in response to fatty acids. Molecular Plant
Pathology. doi:10.1111/mpp.12786
Varga J, Frisvad JC, Samson RA. 2011. Two new aflatoxin producing
species and an overview of Aspergillus section Flavi. Stud
Mycol. 2011;69:57–80. doi: 10.3114/sim.69.05
Wahyudi D, Silviani Y-. 2015. Jurnal Kesehatan Kusuma Husada, 2015.
penghambatan produksi eksoprotease dan biofilm pada
pseudomonas aeruginosa oleh ekstrak apium graveolens l. Jurnal
Kesehatan Kusuma Husada
Waluyo Lud. 2010. Teknik metode dasar dalam Mikrobiologi.
Universitas Muhamadiayah Malang
110
Wang Y-M, Dong W-L, Odah KA, Kong L-C, Ma H-X et al. 2019.
Transcriptome analysis reveals AI-2 relevant genes of multi-
drug resistant Klebsiella pneumoniae in response to eugenol at
Sub-MIC. Front Microbiol ;10:1159.
Wang, G., Zhao, G., Chao, X., Xie, L., & Wang, H. 2020. The
Characteristic of Virulence, Biofilm and Antibiotic Resistance
of Klebsiella pneumoniae. International Journal of
Environmental Research and Public Health, 17(17), 6278.
doi:10.3390/ijerph17176278
Wang, H. S., Ren, P. F., Mang, L., Shen, N., Chen, J. R., & Zhang, Y.
W. (2019). In vitro fermentation of novel microwave-
synthesized non-digestible oligosaccharides and their impact on
the composition and metabolites of human gut microbiota.
Journal of Functional Foods, 55, 156–166.
https://doi.org/10.1016/j.jff.2019.02.030
Wang, J., Yang, X., Yang, Y., Liu, Y., Piao, X., & Cao, Y. (2020).
Characterization of a protease-resistant α-galactosidase from
Aspergillus oryzae YZ1 and its application in hydrolysis of
raffinose family oligosaccharides from soymilk. International
Journal of Biological Macromolecules.
doi:10.1016/j.ijbiomac.2020.04.256
Weiland-Bräuer N, Kisch MJ, Pinnow N, Liese A, Schmitz RA. 2016.
Highly effective inhibition of biofilm formation by the first
metagenome-derived AI-2 quenching enzyme. Front Microbiol.
7:1098.
WHO 2019. Pneumonia. https://www.who.int/news-room/ fact-
sheets/detail/pneumonia - diaksespada Oktober 2020.
Witkowska A. M., Hickey D. K., Alonso-Gomez M., Wilkinson M.
2013. Evaluation of antimicrobial activities of commercial herb
and spice extracts against selected food-borne bacteria. Journal
of Food Research (JFR);2(4):P. 37. doi: 10.5539/jfr.v2n4p37.
Wulandari D, dan Asih IJ. 2017. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun
Suruhan (Peperomia pellucida L. Kunth) terhadap Klebsiella
pneumonia. Jurnal Farmasi Indonesia, Maret 2017, hal 33 - 39
Vol. 15 No. 1 ISSN: 1693-8615 EISSN : 2302-4291
111
Lampiran 1. Etik Penelitian
112
Lampiran 2. Identifikasi Bakteri
113
Lampiran 3. Pembuatan Supernatan Aspergillus oryzae
Inokulum jamur dibuat
dari 5 mL suspensi
Aspergillus oryzae yang
ditambahkan 45 mL PDB
steril dan 1 mL larutan
glukosa dengan
konsentrasi 2%
114
Setelah itu dimasukkan
ke dalam inkubator
shaker selama 3 hari
dengan suhu 28oC
Langkah selanjutnya
dengan menyaring hasil
inokulum jamur dengan
kertas Whatman no. 2
dan ditampung pada
falcon. Dan diberikan es
batu disekitar falcon.
Kemudian hasil saringan
dimasukkan pada tabung
eppendorf dan di frezzer
beberapa saat sampai
muncul kristal es untuk
menghindari kerusakan
protein jamur. Setelah itu
dilakukan sentrifugasi
untuk memisahkan
115
supernatan dengan
peletnya.
Supernatan siap
digunakan.
Lampiran 4. Prosedur Uji Aktivitas Antibiofilm
Siapkan berbagai macam
konsentrasi supernatan,
yaitu dengan konsentrasi
100%, 50%, 25%, 12,5%,
dan 6,25%. Siapkan juga
kontrol positif, kontrol
negatif, dan kontrol media
116
Masukkan masing masing
kelompok kedalam
microplate dan diinkubasi
selama 72 jam.
Setelah itu dilakukan
pencucian dengan PBS
sebanyak 3x. kemudian
diberikan kristal violet
0,1% dan dibilas dengan
aquades 3x pengulangan.
Selanjutnya microplate
dikeringkan dan
ditambahkan asam asetat
30%.
Ukur microplate
menggunakan microplate
reader dengan panjang
gelombang 595 nm.
117
Lampiran 5. Uji Pertumbuhan Biofilm
Lampiran 6. Hasil Uji Aktivitas Antibiofilm
1. Uji Pencegahan Perlekatan Biofilm
km k+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25% k-
0.176 0.235 0.257 0.143 0.334 0.571 0.196 0.216
0.218 0.135 0.202 0.13 0.31 0.351 0.214 0.236
0.188 0.205 0.236 0.204 0.239 0.265 0.195 0.366
Rata - rata
0.194 0.192 0.232 0.159 0.245 0.245 0.202 0.272
Standar Deviasi
0.018 0.042 0.022 0.032 0.05 0.095 0.008 0.066
Aktivitas Pencegahan Perlekatan Biofilm
29% 14.7% 41.5% 0% 0% 25.7%
Km 24 Jam 48 Jam 72 Jam
0.203 0.624 0.842 1.141
0.242 0.631 0.747 1.303
0.147 0.625 0.668 1.417
Standar Deviasi
0.038 0.003 0.071 0.113
Rata - rata
0.197 0.626 0.752 1.287
118
2. Uji Penghambatan Pembentukan Biofilm
km K+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25% k-
0.121 0.167 0.218 0.307 0.429 0.388 0.458 1.141
0.14 0.165 0.286 0.395 0.391 0.551 0.298 1.303
0.2 0.163 0.381 0.42 0.52 0.406 0.386 1.417
Rata - rata
0.153 0.165 0.295 0.374 0.446 0.448 0.38 1.287
Standar Deviasi
0.033 0.001 0.066 0.048 0.054 0.072 0.065 0.113
Aktivitas Penghambatan Pembentukan
87%
77% 70% 65.3% 65% 70.4%
3. Uji Penghancuran Biofilm
km K+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25% k-
0.086 0.299 0.333 0.497 0.411 0.425 0.459 0.476
0.144 0.318 0.349 0.462 0.499 0.567 0.482 0.799
0.128 0.298 0.324 0.343 0.533 0.361 0.468 0.624
Rata - rata
0.119 0.305 0.335 0.434 0.481 0.451 0.469 0.633
Standar Deviasi
0.024 0.009 0.01 0.065 0.051 0.086 0.009 0.132
Aktivitas Penghancuran Biofilm
51% 47% 31.4% 24% 28.7% 25.9%
119
Lampiran 7. Analisis Pencegahan Perlekatan Biofilm
1. Uji Normalitas
Tests of Normality
Perlakuan
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
OD Pencegahan
perlekatan
k+ .269 3 . .949 3 .567
k- .340 3 . .848 3 .235
100% .229 3 . .982 3 .741
50% .324 3 . .877 3 .316
25% .291 3 . .925 3 .469
12.5% .234 3 . .979 3 .720
6.25% .369 3 . .789 3 .089
km .276 3 . .942 3 .537
a. Lilliefors Significance Correction
2. Uji Homogenitas
Test of Homogeneity of Variances
transform_OD
Levene
Statistic df1 df2 Sig.
2.084 7 16 .106
120
3. Uji One Way ANOVA
ANOVA
transform_OD
Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
Between
Groups .317 7 .045 4.455 .006
Within Groups .163 16 .010
Total .479 23
4. Uji Post Hoc Tukey
121
Multiple Comparisons
transform_OD
Tukey HSD
(I)
Perlaku
an
(J)
Perlaku
an
Mean
Difference (I-
J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower
Bound Upper Bound
k+ k- -.15256 .08230 .597 -.4375 .1324
100% -.09168 .08230 .944 -.3766 .1932
50% .07808 .08230 .976 -.2068 .3630
25% -.19345 .08230 .326 -.4784 .0915
12.5% -.30401* .08230 .032 -.5889 -.0191
6.25% -.03318 .08230 1.000 -.3181 .2517
km -.01499 .08230 1.000 -.2999 .2699
k- k+ .15256 .08230 .597 -.1324 .4375
100% .06088 .08230 .994 -.2240 .3458
50% .23065 .08230 .162 -.0543 .5156
25% -.04089 .08230 1.000 -.3258 .2440
12.5% -.15145 .08230 .605 -.4364 .1335
6.25% .11938 .08230 .821 -.1655 .4043
km .13757 .08230 .704 -.1474 .4225
100% k+ .09168 .08230 .944 -.1932 .3766
k- -.06088 .08230 .994 -.3458 .2240
50% .16976 .08230 .475 -.1152 .4547
25% -.10177 .08230 .909 -.3867 .1832
12.5% -.21233 .08230 .232 -.4973 .0726
6.25% .05850 .08230 .995 -.2264 .3434
km .07669 .08230 .978 -.2082 .3616
50% k+ -.07808 .08230 .976 -.3630 .2068
k- -.23065 .08230 .162 -.5156 .0543
100% -.16976 .08230 .475 -.4547 .1152
25% -.27153 .08230 .068 -.5565 .0134
12.5% -.38209* .08230 .005 -.6670 -.0972
6.25% -.11126 .08230 .865 -.3962 .1737
122
km -.09307 .08230 .940 -.3780 .1919
25% k+ .19345 .08230 .326 -.0915 .4784
k- .04089 .08230 1.000 -.2440 .3258
100% .10177 .08230 .909 -.1832 .3867
50% .27153 .08230 .068 -.0134 .5565
12.5% -.11056 .08230 .869 -.3955 .1744
6.25% .16027 .08230 .541 -.1247 .4452
km .17846 .08230 .417 -.1065 .4634
12.5% k+ .30401* .08230 .032 .0191 .5889
k- .15145 .08230 .605 -.1335 .4364
100% .21233 .08230 .232 -.0726 .4973
50% .38209* .08230 .005 .0972 .6670
25% .11056 .08230 .869 -.1744 .3955
6.25% .27083 .08230 .069 -.0141 .5558
km .28902* .08230 .046 .0041 .5739
6.25% k+ .03318 .08230 1.000 -.2517 .3181
k- -.11938 .08230 .821 -.4043 .1655
100% -.05850 .08230 .995 -.3434 .2264
50% .11126 .08230 .865 -.1737 .3962
25% -.16027 .08230 .541 -.4452 .1247
12.5% -.27083 .08230 .069 -.5558 .0141
km .01819 .08230 1.000 -.2667 .3031
km k+ .01499 .08230 1.000 -.2699 .2999
k- -.13757 .08230 .704 -.4225 .1474
100% -.07669 .08230 .978 -.3616 .2082
50% .09307 .08230 .940 -.1919 .3780
25% -.17846 .08230 .417 -.4634 .1065
12.5% -.28902* .08230 .046 -.5739 -.0041
6.25% -.01819 .08230 1.000 -.3031 .2667
*. The mean difference is significant at the 0.05
level.
123
5. Uji Korelasi Pearson
Correlations
penghancuran
Biofilm
konsentrasi
CFS
Pencegahan
Perlekatan Biofilm
Pearson
Correlation 1 .244
Sig. (2-tailed) .381
N 15 15
konsentrasi CFS Pearson
Correlation .244 1
Sig. (2-tailed) .381
N 15 15
124
Lampiran 8. Analisis Penghambatan Pembentukan Biofilm
1. Uji Normalitas
2. Uji Homogenitas
Test of Homogeneity of Variances
penghambatan pembentukan
Levene
Statistic df1 df2 Sig.
1.655 7 16 .191
Tests of Normality
Perlak
uan
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
penghambatan
pembentukan
k+ .175 3 . 1.000 3 1.000
k- .213 3 . .990 3 .809
100% .210 3 . .991 3 .818
50% .305 3 . .906 3 .405
25% .272 3 . .947 3 .555
12.5% .349 3 . .832 3 .193
6.25% .193 3 . .997 3 .890
km .297 3 . .918 3 .444
a. Lilliefors Significance Correction
125
3. Uji OneWay ANOVA
ANOVA
penghambatan pembentukan
Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
Between
Groups
2.712 7 .387 62.022 .000
Within Groups .100 16 .006
Total 2.812 23
4. Uji Post Hoc Tukey
126
Multiple Comparisons
penghambatan pembentukan
Tukey HSD
(I)
Perlaku
an
(J)
Perlaku
an
Mean
Difference (I-
J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower
Bound Upper Bound
k+ k- -1.122000* .064529 .000 -1.34541 -.89859
100% -.130000 .064529 .502 -.35341 .09341
50% -.209000 .064529 .076 -.43241 .01441
25% -.281667* .064529 .009 -.50508 -.05826
12.5% -.283333* .064529 .008 -.50674 -.05992
6.25% -.215667 .064529 .063 -.43908 .00774
km .011333 .064529 1.000 -.21208 .23474
k- k+ 1.122000* .064529 .000 .89859 1.34541
100% .992000* .064529 .000 .76859 1.21541
50% .913000* .064529 .000 .68959 1.13641
25% .840333* .064529 .000 .61692 1.06374
12.5% .838667* .064529 .000 .61526 1.06208
6.25% .906333* .064529 .000 .68292 1.12974
km 1.133333* .064529 .000 .90992 1.35674
100% k+ .130000 .064529 .502 -.09341 .35341
127
k- -.992000* .064529 .000 -1.21541 -.76859
50% -.079000 .064529 .913 -.30241 .14441
25% -.151667 .064529 .326 -.37508 .07174
12.5% -.153333 .064529 .315 -.37674 .07008
6.25% -.085667 .064529 .875 -.30908 .13774
km .141333 .064529 .405 -.08208 .36474
50% k+ .209000 .064529 .076 -.01441 .43241
k- -.913000* .064529 .000 -1.13641 -.68959
100% .079000 .064529 .913 -.14441 .30241
25% -.072667 .064529 .941 -.29608 .15074
12.5% -.074333 .064529 .934 -.29774 .14908
6.25% -.006667 .064529 1.000 -.23008 .21674
km .220333 .064529 .055 -.00308 .44374
25% k+ .281667* .064529 .009 .05826 .50508
k- -.840333* .064529 .000 -1.06374 -.61692
100% .151667 .064529 .326 -.07174 .37508
50% .072667 .064529 .941 -.15074 .29608
12.5% -.001667 .064529 1.000 -.22508 .22174
6.25% .066000 .064529 .964 -.15741 .28941
km .293000* .064529 .006 .06959 .51641
12.5% k+ .283333* .064529 .008 .05992 .50674
128
k- -.838667* .064529 .000 -1.06208 -.61526
100% .153333 .064529 .315 -.07008 .37674
50% .074333 .064529 .934 -.14908 .29774
25% .001667 .064529 1.000 -.22174 .22508
6.25% .067667 .064529 .959 -.15574 .29108
km .294667* .064529 .006 .07126 .51808
6.25% k+ .215667 .064529 .063 -.00774 .43908
k- -.906333* .064529 .000 -1.12974 -.68292
100% .085667 .064529 .875 -.13774 .30908
50% .006667 .064529 1.000 -.21674 .23008
25% -.066000 .064529 .964 -.28941 .15741
12.5% -.067667 .064529 .959 -.29108 .15574
km .227000* .064529 .045 .00359 .45041
km k+ -.011333 .064529 1.000 -.23474 .21208
k- -1.133333* .064529 .000 -1.35674 -.90992
100% -.141333 .064529 .405 -.36474 .08208
50% -.220333 .064529 .055 -.44374 .00308
25% -.293000* .064529 .006 -.51641 -.06959
12.5% -.294667* .064529 .006 -.51808 -.07126
6.25% -.227000* .064529 .045 -.45041 -.00359
129
5. Uji Korelasi Pearson
Correlations
penghambatan
pembentukan
biofilm konsentrasi CFS
penghambatan
pembentukan biofilm
Pearson Correlation 1 .413
Sig. (2-tailed) .126
N 15 15
konsentrasi CFS Pearson Correlation .413 1
Sig. (2-tailed) .126
N 15 15
130
Lampiran 9. Analisis Penghancuran Biofilm
1. Uji Normalitas
2. Uji Homogenitas
Test of Homogeneity of Variances
penghancuran biofilm
Levene
Statistic df1 df2 Sig.
2.306 7 16 .079
Tests of Normality
Perlakuan
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
OD
Penghancuran
biofilm
k+ .369 3 . .787 3 .085
k- .189 3 . .998 3 .908
100% .240 3 . .975 3 .694
50% .302 3 . .910 3 .417
25% .279 3 . .939 3 .522
12.5% .264 3 . .954 3 .589
6.25% .224 3 . .984 3 .762
km .280 3 . .937 3 .516
a. Lilliefors Significance Correction
131
3. Uji One Way ANOVA
ANOVA
penghancuran biofilm
Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
Between
Groups .376 7 .054 17.335 .000
Within Groups .050 16 .003
Total .425 23
4. Uji Post Hoc Tukey
132
Multiple Comparisons
penghancuran biofilm
Tukey HSD
(I)
Perlaku
an
(J)
Perlaku
an
Mean
Difference (I-
J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower
Bound Upper Bound
k+ k- -.239038* .045440 .002 -.39636 -.08172
100% -.026805 .045440 .999 -.18412 .13051
50% -.104578 .045440 .349 -.26190 .05274
25% -.140314 .045440 .099 -.29763 .01700
12.5% -.116376 .045440 .239 -.27370 .04094
6.25% -.133082 .045440 .131 -.29040 .02424
km .208705* .045440 .006 .05139 .36602
k- k+ .239038* .045440 .002 .08172 .39636
100% .212233* .045440 .005 .05491 .36955
50% .134461 .045440 .124 -.02286 .29178
25% .098724 .045440 .415 -.05859 .25604
12.5% .122662 .045440 .192 -.03466 .27998
6.25% .105956 .045440 .335 -.05136 .26328
km .447743* .045440 .000 .29042 .60506
100% k+ .026805 .045440 .999 -.13051 .18412
k- -.212233* .045440 .005 -.36955 -.05491
50% -.077772 .045440 .681 -.23509 .07955
25% -.113509 .045440 .263 -.27083 .04381
12.5% -.089571 .045440 .527 -.24689 .06775
6.25% -.106276 .045440 .332 -.26360 .05104
km .235511* .045440 .002 .07819 .39283
50% k+ .104578 .045440 .349 -.05274 .26190
k- -.134461 .045440 .124 -.29178 .02286
100% .077772 .045440 .681 -.07955 .23509
25% -.035737 .045440 .992 -.19306 .12158
12.5% -.011799 .045440 1.000 -.16912 .14552
133
6.25% -.028504 .045440 .998 -.18582 .12881
km .313283* .045440 .000 .15596 .47060
25% k+ .140314 .045440 .099 -.01700 .29763
k- -.098724 .045440 .415 -.25604 .05859
100% .113509 .045440 .263 -.04381 .27083
50% .035737 .045440 .992 -.12158 .19306
12.5% .023938 .045440 .999 -.13338 .18126
6.25% .007233 .045440 1.000 -.15009 .16455
km .349020* .045440 .000 .19170 .50634
12.5% k+ .116376 .045440 .239 -.04094 .27370
k- -.122662 .045440 .192 -.27998 .03466
100% .089571 .045440 .527 -.06775 .24689
50% .011799 .045440 1.000 -.14552 .16912
25% -.023938 .045440 .999 -.18126 .13338
6.25% -.016705 .045440 1.000 -.17402 .14061
km .325082* .045440 .000 .16776 .48240
6.25% k+ .133082 .045440 .131 -.02424 .29040
k- -.105956 .045440 .335 -.26328 .05136
100% .106276 .045440 .332 -.05104 .26360
50% .028504 .045440 .998 -.12881 .18582
25% -.007233 .045440 1.000 -.16455 .15009
12.5% .016705 .045440 1.000 -.14061 .17402
km .341787* .045440 .000 .18447 .49911
km k+ -.208705* .045440 .006 -.36602 -.05139
k- -.447743* .045440 .000 -.60506 -.29042
100% -.235511* .045440 .002 -.39283 -.07819
50% -.313283* .045440 .000 -.47060 -.15596
25% -.349020* .045440 .000 -.50634 -.19170
12.5% -.325082* .045440 .000 -.48240 -.16776
6.25% -.341787* .045440 .000 -.49911 -.18447
*. The mean difference is significant at the 0.05
level.
134
5. Uji Korelasi Pearson
Correlations
penghancuran
Biofilm
konsentrasi
CFS
penghancuran
Biofilm
Pearson
Correlation 1 .553*
Sig. (2-tailed) .032
N 15 15
konsentrasi CFS Pearson
Correlation .553* 1
Sig. (2-tailed) .032
N 15 15
*. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed).