ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİİzole edilen verilere göre enzim deterjanlara dirençli, halofil, ekstrem alkalofil, pH stabil, ultratermofil, indüklenebilir termostabil özellik göstermektedir

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Seçil TATAR

TERMOFİL MODERATELY HALOFİLİK BACİLLUS SP. SUŞLARINDAN AMİLAZ ENZİMİ ÜRETİMİ VE ENDÜSTRİYEL KULLANIM OLANAKLARININ ARAŞTIRILMASI

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2007



TERMOFİL MODERATELY HALOFİLİK BACİLLUS SP. SUŞLARINDAN AMİLAZ ENZİMİ ÜRETİMİ VE ENDÜSTRİYEL KULLANIM

OLANAKLARININ ARAŞTIRILMASI

Seçil TATAR



Bu tez / /2006 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul

Edilmiştir.

İmza……………………. İmza…… ……… İmza…..............………

Prof. Dr. Burhan ARIKAN Prof.Dr. Ömer ÇOLAK Prof. Dr. Osman SERİNDAĞ

DANIŞMAN ÜYE ÜYE

Bu Tez Enstitümüzün Biyoloji Anabilim Dalında Hazırlanmıştır.

Kod No:

Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından

Desteklenmiştir

Proje No:FEF2004YL55 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve sanat eserleri kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ


TERMOFİL MODERATELY HALOFİLİK BACİLLUS SP. SUŞLARINDAN AMİLAZ ENZİMİ ÜRETİMİ VE ENDÜSTRİYEL KULLANIM

OLANAKLARININ ARAŞTIRILMASI

Seçil TATAR




Danışman : Prof. Dr. Burhan ARIKAN

Yıl : 2007, Sayfa: 95

Jüri : Prof. Dr. Burhan ARIKAN

Prof. Dr. Ömer ÇOLAK

Prof. Dr. Osman SERİNDAĞ

Bu çalışmada Bacillus sp. suşlarından haloalkalofilik, termofil ve termostabil amilaz

enzimi izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla katı besiyerinde bakterinin üreme ve enzim sentezleme sıcaklık ve pH aralığı saptanmıştır. Amilaz enzimi ile optimum aktivite sıcaklığı, optimum pH, termal stabilite, pH stabilitesi, Nacl’n aktiviteye etkisi, farklı inhibitör, şelatör, metal iyonları ve deterjanların etkisi ve SDS-PAGE analizleri yapılmıştır. SDS-PAGE analizlerine göre 116.000 ve 97400 Da’luk iki bağımsız band ortaya çıkmıştır.

Bakteriler 20-60˚C aralığında üreme gösterirken enzim sentezi 20-55˚C aralığında gerçekleşmiştir. Bununla birlikte en yüksek üreme ve enzim sentezi ortalama %84 ile 25-55˚C aralığında elde edilmiştir. İzole edilen bakteriler pH 7.0-12.5 aralığında üreme ve enzim sentezi gerçekleştirirken optimum üreme ve sentez pH 8.5 ve 55˚C de elde edilmiştir. SB-28 suşu pH 9.5 ve 55˚C de en yüksek enzim sentezini gerçekleştirmiştir.

SB-28 amilaz enziminin optimum aktivitesini pH 12.5 ve 140˚C de göstermiştir. Enzim pH 9.0-12.0 aralığında 72 saat sonunda %54 koruduğu bulunmuştur. Enzim 120 dakika ön inkübasyondan sonra 140˚C de inaktive olma yerine %408 oranında aktivite göstermiştir. SB-28 amilaz enzimi faklı NaCL konsantrasyonlarında 55˚C de 60 dakika sonunda en yükse aktivitesini %89 ile %10 konsantrasyonda göstermiştir. SB-28 amilaz enzimi EDTA da %65.42, CaCL2 de %70.20, PMSF de %74.23, β-merkaptoethanol de %81.0, SDS de %71.0, Triton X-100 de %82.03, NaSO3 de %80.0, NaC de %74.20, ZnCL2 de %68.10, 1,10-phenantroline de %65.40 ve Üre de %11.20 direnç göstermiştir.

İzole edilen verilere göre enzim deterjanlara dirençli, halofil, ekstrem alkalofil, pH stabil, ultratermofil, indüklenebilir termostabil özellik göstermektedir. Enzim özelikle nişastanın sıvılaştırılması ve tekstil endüstrisinde öncelikli kulanım alanı bulacaktır.

Anahtar Kelimeler: Halofil, Ultratermofil, Alkalofil, Termostabil, SDS dirençli

I

ABSTRACT

MSc THESIS AMYLASE ENZYME PRODUCTION AND INVESTIGATION OF

POSSIBILITIES IN INDUSTRIAL USAGE FROM THERMOPHILE MODERATELY HALOPHILIC BACILLUS SP

Seçil TATAR

DEPARTMENT OF BIOLOGY

INSTITUTE OF NATURAL APPLIED SCIENCES

UNIVERSITY OF CUKUROVA

Supervisor: Prof. Dr. Burhan ARIKAN

Year: 2007 Page: 95

Jury: Prof. Dr. Burhan ARIKAN

Prof. Dr. Ömer ÇOLAK

Prof. Dr. Osman SERİNDAĞ

In this study, haloalkalophile, thermophile and thermostable amylase enzyme from Bacillus sp strains was isolated and characterised. Therefore the temperature and pH range was determined for enzyme production and bacterial growth on solid media. Optimum activity temperature, optimum pH, thermal stability, pH stability of the isolated amylase as well as effect of NaCl, some inhibitors, chelators, metal ions and detergents on enzyme activity were determined. SDS-PAGE analyses were also carried out. Analyses of the enzyme by SDS-PAGE revealed two independent bands (116.000 and 97400 Da.).

While the bacteria grow at between 20-60OC, the enzyme production was occurred between 20-55oC. But the highest growth rate and enzyme production were obtained 25-55oC with an average %84. As isolated strains showed growth and enzyme synthesis at pH 7.0-12.5 range, optimum growth and enzyme production occurred at pH 8.5 and 55oC. Among the strains, SB-28 showed the maximum enzyme synthesis at pH 9.5 and 55oC.

Optimum activity of the SB-28 amylase was at pH12.5 and 140oC. The enzyme was retained it`s activity around %54 at the end of 72 hours between pH 9.0 and 12.0. The enzyme after 120 min preincubation at 140oC was not inactivated, instead activated to be around 408%. On the other hand, the enzyme showed the maximum activity, 89%, on 10% NaCl concentration after 60 min incubation at 55oC. Additionally, SB-28 retained it`s activity in the presence of EDTA, CaCl2, PMSF, 2-Mercaptoetanol, SDS, Triton-X, NaSO3, NaCl, ZnCl2, 1-10Phenantroline and the urea at the rate of 65.42%, 70.20%, 74.23%, 81.0%,71.0%, 82.03%,80.0%,74.20%, 68.10%,65.40% and11.20% respectively.

According to these results, the isolated enzyme is resistand to detergents, and halophile, extreme alkalophile, pH stable, ultrathermophile, and inducible thermostable. As a result this SB-28 amylase enzyme could find an important place for the usage in textile and starch liquefaction industries.

Key Words: Halophile, Ultrathermophile, Alkalophile, Thermostable, SDS resistance

II

TEŞEKKÜR

Öncelikle çalışmalarım sırasında benden her türlü desteğini esirgemeyen

danışman hocam sayın Prof. Dr. Burhan ARIKAN’a, Moleküler Biyoloji Anabilim

Dalı Başkanı sayın Prof. Dr. Ömer ÇOLAK’a, sayın Prof. Dr. Sadık DİNÇER’e, ve

Doç. Dr.Hatice KORKMAZ GÜVENMZ’e, çok teşekkür ederim

Laoratuardaki çalışmalarım sırasında her zaman bana büyük destek veren

özellikle Arş. Grv. sayın Ashabil AYGAN’a, Arş. Grv. sayın Gülcihan

GÜZELDAĞ’a ve diğer yüksek lisans öğrencisi arkadaşlarıma çok teşekkür ederim.

Çalışmalarımı gerçekleştirdiğim Biyoloji Bölüm Başkanı sayın Prof. Dr.

Mehmet TOPAKTAŞ ve bana lisans öğrenciliğim döneminden itibaren emeği geçen

bütün bölüm hocalarıma, bölüm çalışanlarına ve bölüm sekreterimiz sayın Mediha

KURTOĞLU’na teşekkür ederim.

Ayrıca, benden bütün eğitimim süresince maddi manevi her türlü desteğini ve

yardımını esirgemeyen sevgili Annem Nurten TATAR’a, sevgili Babam Cahit

TATAR’a ve kardeşlerime sonsuz teşekkür ederim.

III

İÇİNDEKİLER SAYFA NO

ÖZ.........................................................................................................................................................I

ABSTRACT...................................................................................................................II

TEŞEKKÜR................................................................................................................III

İÇİNDEKİLER.............................................................................................................................IV

ÇİZELGELER DİZİNİ...............................................................................................VII

ŞEKİLLER DİZİNİ.....................................................................................................IX

SİMGELER VE KISALTMALAR............................................................................XI

1. GİRİŞ.........................................................................................................................l

1.1.Enzimler Kaynakları................................................................................................4

1.1.1. Hayvansal Kaynaklı Enzimler......................................................................4

1.1.2. Bitkisel Kaynaklı Enzimle............................................................................4

1.1.3. Mikrobiyal Kaynaklı Enzimler.....................................................................4

1.2. Salgılanma Şekillerine Göre Enzimler...............................................................5

1.2.1. İntraselüler Enzimler................................................................... ................5

1.2.2. Ekstraselüler Enzimler..................................................................................5

1.3. Bacillus Cinsi......................................................................................................6

1.3.1. Hücre Morfolojisi..........................................................................................6

1.3.2. Hücre Duvarının Yapısı................................................................................7

1.3.3. Sporlar...........................................................................................................7

1.3.4. Koloni Özellikleri.........................................................................................7

1.4. Halofil Organizmalar..........................................................................................8

1.5. Termofil Mikroorganizmalar..............................................................................8

1.6. Mikrobiyal Enzimler ve Kullanım Alanları.......................................................9

1.6.1. Proteazlar....................................................................................................10

1.6.2. Ksilenaz .................................................................................................10

1.6.3. Selülaz.........................................................................................................10

1.6.4. Amilazlar.....................................................................................................11

1.6.4.1. Endoamilazlar.......................................................................................12

1.6.4.2. Ekzoamilazlar.......................................................................................12

IV

1.6.4.2.1. İntraselüler Enzimler........................................................................12

1.6.4.2.2. Ekstraselüler Enzimler....................................................................13

1.7. Nişasta..............................................................................................................13

1.7.1. Nişastanın Parçalanması.............................................................................14

1.8. Nişastayı Parçalayan Enzimleri.......................................................................14

1.8.1 Bakteriyel α-Amilazlar..............................................................................14

1.8.2. Bakteriyel β-Amilazlar.............................................................................15

1.9. α-Amilazların Endüstriyel Kullanım Alanları.................................................15

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR.......................................................................................18

3.MATERYAL VE METOD......................................................................................22

3.1. Materyal..........................................................................................................22

3.1.1. Kullanılan Çözeltiler..................................................................................22

3.1.1.1. NaOH Çözeltisi..................................................................................22

3.1.1.2. Etanol.................................................................................................22

3.1.1.3. Potasyum Fosfat Tamponu (0.1 M pH=6.8).....................................22

3.1.1.4. DNS (Dinitro Salisilik Asit)...............................................................22

3.1.1.5. Citrat Tamponu (pH=4-6)..................................................................22

3.1.1.6. Fosfat Tamponu (pH=6-8).................................................................23

3.1.1.7. Glycine-NaOH Tamponu (pH=8.5-10.5)...........................................24

3.1.1.8. NaOH-Borax Tamponu......................................................................24

3.1.1.9. Lugol Solüsyonu ..........................................................................24

3.1.2.Bakteri İzolasyonu ve İdentifikasyonunda

Kullanılan Besiyerleri.........................................................................25

3.1.2.1. M9-Nişasta Agarı..........................................................................25

3.1.2.2.Jeloz Besiyeri.................................................................................25

3.1.2.3. Buyyon....................................................................................................26

3.1.2.4. Jelatin Besiyeri...................................................................................26

3.1.2.5. Kazein Besiyeri..................................................................................27

3.1.2.6. Katalaz...............................................................................................27

3.1.2.7. Simon's Sitrat Besiyeri.......................................................................27

V

3.1.2.8. SİM Besiyeri (Sülfit-İndol-Mobility)..............................................28

3.1.3. Elektroforez İşleminde Kullanılan Çözeltiler.......................................28

3.1.3.1. Solüsyon A...........................................................................................28

3.1.3.2. Solüsyon B (4X)............................................................................29

3.1.3.3. Solüsyon C (4X).............................................................................29

3.1.3.4. Amonyum Persülfat (AMPS)(%10 W/V)......................................29

3.1.3.5. Elektroforez Tamponu (1 L) (pH=8.3) ......................................30

3.1.3.6. Örnek Tamponu (5X)....................................................................30

3.1.3.7. Seperating Jel (%10’luk)................................................................31

3.1.3.8. Toplayıcı Jel....................................................................................31

3.1.3.9. Jel Boyama Solüsyonu...................................................................32

3.1.3.10. Jelden Boyayı Uzaklaştırma Solüsyonu.......................................32

3.1.4.Renatürasyon Solüsyonları................................................................32

3.1.4.1. SOL1..................................................................................................32

3.1.4.2. SOL2..............................................................................................32

3.1.4.3. SOL3..............................................................................................33

3.2. Metod.............................................................................................................33

3.2.1. Bakteri İzolasyonu ve İdentifikasyonu.................................................33

3.2.1.1. Topraktan Bacillus sp. suşlarının İzolasyonu................................33

3.2.2. Bakterilerin İdentifikasyonu.............................................................33

3.2.3. Katı Besiyerinde Amilaz Aktivitesinin

Saptanması .....................................................................................34

3.2.4.Bakterinin Ürediği ve Enzim Sentezinin

Gerçekleştiği pH Aralığının Saptanması............................................34

3.2.5. Amilaz Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma...................................34

3.2.5.1. Enzimin pH Optimumunun Saptanması....................................35

3.2.5.2. Enzimin Optimum Sıcaklık Aktivitesinin

Saptanması..............................................................................35

3.2.5.3. Enzimin Sıcaklık Stabilitesinin Saptanması.............................36

VI

3.2.5.4.Amilaz Enziminin pH Stabilitesinin

Saptanması...............................................................................37

3.2.5.5.NaCl’ün Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi..................................38

3.2.5.6. Enzim Aktivitesi Üzerine İnhibitörlerin

Etkisi .....................................................................................38

3.2.6. Protein Örneklerinin SDS-PAGE Jelinde

Analizi.....................................................................................38

3.2.6.1. Nişastalı Ayırıcı Jelin Hazırlanması

(%10’luk).................................................................................39

3.2.6.2. Dengeleme Jelinin Hazırlanması............................................39

3.2.6.3. Örneklerin SDS-PAGE Jeline Yüklenmesi ve

Yürütülmesi ..........................................................................39

3.2.6.4. SDS-PAGE Jelinin Boyanması..............................................40

3.2.6.5.SDS-PAGE Jelinin Renatürasyonu ve

Zimogram Analiz.....................................................................40

4.BULGULAR VE TARTIŞMA................................................................................41

4.1. Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu.........................................41

4.2. Enziminin Optimum pH Aralığına Ait Bulgular......................................52

4.3. Enzimin Sıcaklık Optimumuna Ait Bulgular..........................................54

4.4.Amilaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Bulgular...............................57

4.5.Amilaz Enziminin pH Stabilitesine Ait Bulgular.....................................66

4.6.NaCL’ün Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi...............................................68

4.7. İnhibitör Maddelerin Enzim Üzerine Etkisine Ait

Bulgular...............................................................................................69

4.8. SDS-PAGE Analiz Sonuçları...................................................................72

5.SONUÇLAR VE ÖNERİLER.................................................................................75

KAYNAKLAR...........................................................................................................84

ÖZGEÇMİŞ................................................................................................................95

VII

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA NO

Çizelge 1. 1. Enzimlerin Sınıflandırılması..............................................................3

Çizelge 4.1.2. Bacillus sp. Bakterilerinin Farklı pH Değerlerine Sahip

Nişastalı M9 Üreme Ortamı ve 55˚C’de Üreme Gösteren

ve Enzim Sentezleyen Suşların % Dağılımı..................................................42

Çizelge 4.1.3. Bacillus sp. Bakterilerinin pH 9.5 Değerine Sahip Nişastalı

M9 Üreme Ortamı ve Farklı Sıcaklık Değerlerinde Üreme

Gösteren ve Enzim Sentezleyen Suşların % Dağılımı..................................45

Çizelge 4.2.4. SB-28 amilaz enziminin pH optimum değerleri................................52

Çizelge 4.3.5. SB-28 Amilaz Enziminin Sıcaklık Optimumuna Ait

Bulgular .......................................................................................................54

Çizelge 4.4.6. SB-28 Suşuna Ait Termal Stabilite Sonuçları (15 dk.).......................58

Çizelge 4.4.7. SB-28 amilaz enzimi termal stabilitesine ait bulgular

(30 dk.)..........................................................................................................59

Çizelge 4.4.8. Amilaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Bulgular

(60 dk)..........................................................................................................61

Çizelge 4.4. 9. SB-28 Amilaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Bulgular

(120 dk).......................................................................................................63

Çizelge 4.5. 10 SB-28 pH stabilite sonuçları.............................................................67

Çizelge 4.6.11. Farklı NaCL Konsantrasyonlarının Enzim

Aktivitesine Etkisi.....................................................................................68

Çizelge 4.7.12. SB-28 amilaz enimi üzerine şelatör, metal iyonları,

deterjanlar ve inhibitörlerin etkisi.............................................................70

VIII

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA NO

Şekil 4.1.1. Katı besiyerinde enzim sentezinin gerçekleştiği pH değerleri...............43

Şekil 4.1.2. Bakterilerin üretildikleri sıcaklık değerleri..............................................46

Şekil 4.1.3. Bakteri üremesi 55° C, pH 7.5 de gerçekleşen enzim

sentezine ait görünümü..............................................................................47

Şekil 4.1.4. Bakteri üremesi 55°C, pH 8 de gerçekleşen enzim sentezine

ait görünüm...............................................................................................48

Şekil 4.1.5 Bakteri üremesi 55°C, pH 8.5 de gerçekleşen enzim

sentezine ait görünüm..........................................................................48

Şekil 4.1.6. Bakteri üremesi 55°C, pH 9 da gerçekleşen enzim

sentezine ait görünüm...............................................................................49

Şekil 4.1.7. Bakteri üremesi 55°C, pH 9.5 de gerçekleşen enzim sentezine

ait görünüm ....................................................................................................49

Şekil 4.1.8. Bakteri üremesi 55°C, pH 10 da gerçekleşen enzim sentezine

ait görünüm......................................................................................50

Şekil 4.1.9. Bakteri üremesi 55°C, pH 10.5 de gerçekleşen enzim

sentezine ait görünüm...........................................................................50

Şekil 4.1.10. Bakteri üremesi 55°C, pH 11 de gerçekleşen enzim

sentezine ait görünüm.......................................................................51

Şekil 4.1.11. Bakteri üremesi 55°C, pH 11.5 de gerçekleşen enzim

sentezine ait görünüm..........................................................................51

Şekil 4.2.12. İzolasyonu pH 9.5’de Yapılan Amilaz Enziminin Rölatif

Aktivite Değerleri...................................................................................53

Şekil 4.3.13. Elde Edilen Amilaz Enziminin Optimum Sıcaklık Grafiği (%)..........56

Şekil 4.3.14. DNS yöntemiyle gerekleştirilen amilaz enzim aktivitesi

(30-150˚C). Optimum aktivite 140˚C de gerçekleşmiştir .....................57

Şekil 4.4.15. Elde Edilen Amilaz Enziminin Termal Stabilite Grafiği

(%) 15 dk...............................................................................................59

IX


(%) 30 dk .................................................................................................60


(%) 60 dk..................................................................................................62


(%) 120 dk...............................................................................................66

Şekil 4.5.19. SB-28 Amilaz enziminin 42 saat ön inkübasyondan

sonraki pH satabilite Verileri.................................................................67

Şekil 4.6.20: Enzim Aktivitesi Üzerine Farklı NaCL Konsantrasyonlarının

Etkisi......................................................................................................67

Şekil 4.7.21. SB-28 amilaz enzimi üzerine şelatör, inhibitör,

metal iyonları, ve deterjanların etkisi.....................................................72

Şekil 4.7.22. SB-28 amilaz enziminin SDS-PAGE sonuçları. SDS-PAGE

analizlerinde %10’luk homojen jel kullanılmıştır. Moleküler ağırlık

marker’ı olarak (Sigma SDS 6H, 205000, 116000, 97400, 66000,

45000 ve 36000 Da.........................................................................................73

X

SİMGELER VE KISALTMALAR SDS: Sodiumdodesilsülfat

EDTA: Etilen diamin tetra asetik asit

AMPS. Amonyum persülfat

PAGE: Polyacrylamid jel

DNS: Dinitro salisilik asit

Rpm: Devir/dakika

TEMED: Tetrametil etilen diamin

ºC: Santigrat derece

NaNO3 :Sodyum sülfit

NaCl: Sodyum klorür

ZnCl2 : Çinko klorür

PMSF: Fenil metil sülfonil florid

XI

1. GİRİŞ Seçil TATAR

1.GİRİŞ

Enzimler kimyasal tepkimelerde katalizör görevi yapan hayvan, bitki ve

mikroorganizmalardan salgılanan protein yapısında moleküllerdir. Enzimler hücre

içerisinde meydana gelen binlerce tepkimenin hızını ve özgüllüğünü kendisi

değişikliğe uğramadan düzenleyebilirler. Her metabolik reaksiyon enzimler

tarafından kontrol edilip hızlandırılır. Reaksiyonun başlangıç aşamasında enzimin

etki ettiği madde substrat, reaksiyon sonucu miktarında artış görülen ve açığa çıkan

madde ise ürün olarak adlandırılır. Enzimler substratın dış yüzeyinden itibaren etki

göstermeye başlayarak şeklini bozar ve ürünü açığa çıkarır. Ürün açığa çıktıktan

sonra enzim başka bir substrat molekülüne işlemi yapmak için hazırlanır. Enzimler

çok yüksek sıcaklıklarda protein yapısı bozunduğu için etkilerini kaybederler (Bhat,

2000).

Endüstriyel kaynaklı enzimler genellikle mikroorganizmalardan elde

edilmektedir. Bunun nedeni mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya

hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olmaları,

istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları ve fazla

miktarda elde edilebilmeleridir (Wiseman, 1987).

Bir enzimin herhangi bir endüstri alanında kullanılabilmesi için maliyet

bakımından ucuz olması, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması ve

en önemlisi enzimin alerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir

olması gerekmektedir (Wiseman, 1987).

Mikrobiyal enzimler arasında en yaygın olarak kullanılanlar α-amilaz,

glikoamilaz, glikoizomeraz ve proteazlardır. α-amilaz enzimi gıda endüstrisinin

farklı alanlarında, meyve suyu endüstrisinde, deterjan üretiminde, eczacılıkta ve

tekstil endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Ticari olarak kullanılan enzimlerin %59’unu proteazlar, %28’ini

karbonhidratazlar, %3’ünü lipazlar ve %10’unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır.

Karbonhidratazlar grubuna giren α-amilaz enzimi %13’lük oran ile önemli bir yer

tutmaktadır (Wiseman, 1987).

1


α-amilaz enzimi endüstriyel boyutlarda ilk kez 1939 yılında Bacillus subtilis

suşu kullanılarak Japonya’da üretilmiştir. 1970 yılında B.subtilis ve B.licheniformis

α-amilaz enzimi üretimi için geniş çapta kullanılmıştır. Termostabil enzimler,

yüksek sıcaklıklarda reaksiyonları daha hızlı yerine getirmekte ve substrat miktarını

azaltıp çözünürlüğüde arttırmaktadırlar. Termostabil enzimlerin tercih edilmelerinin

diğer bir önemli nedeni de yüksek sıcaklıkta çalıştıkları için mikrobiyal

kontaminasyonların azalmasıdır (Anonymous, 1988).

α-amilaz enzimi, nişasta molekülündeki α-1,4 bağlarını parçalayarak glikoz,

maltoz, maltotrioz ve α-limit dekstrinlerin oluşumunu sağlar. Glikoamilaz α-1,3, α -

1,4 ve α -1,6 bağlarını kopararak glikoz molekülüne dönüştürür.

Nişasta, birçok glikoz molekülünün çeşitli şekillerde bağlanmasıyla oluşmuş

polisakkarit özellikte bir bileşiktir. Bazı bakteriler ve mantarlar tarafından üretilen

α-amilaz, β-amilaz, glikoamilaz ve glikoizomeraz gibi enzimler nişastayı parçalama

yeteneğine sahiptirler ( Lee, 1996).

Endüstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler genellikle

mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Bunun nedeni mikroorganizma kaynaklı

enzimlerin bitkisel ve hayvansal kaynaklara göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek

olmaları, daha stabil ve daha ucuz olmaları ve fazla miktarda elde edilebilmeleridir.

Bugüne kadar 2000’den fazla enzim tanımlanmış olup, bunlar arasında yaklaşık 100

tanesi ticari kullanıma uygun bulunmasına rağmen günümüzde sadece 18 tanesi

endüstriyel amaçla kullanılmaktadır (Zeman ve Mcrea, 1985).

Enzimler, peynir ve ekmek yapımı, ilaç üretimi, deterjan katkı maddesi,

alkollü içeceklerin üretimi, dericilik ve meyve sularının yapımı gibi bir çok alanda

yaygın şeklide kullanılmaktadırlar.

2


Çizelge1.1: Enzimlerin Sınıflandırılması (John, 1987). Enzimler Kaynaklar

1. Oksidoreduktazlar (537)a) Glukoz Oksidaz Aspergilhıs niger

Katalaz Aspergilhts niger, Micrococcus lysodelcticıts Pironoz-2-oksidaz Polypoms obtusııs

2. Transferaziar (559)a) 3. Hidrolazlar (490)a)

Bacterial a-amiiaz (300)b) Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus Fungal a-amilaz (10)b) Aspergilhıs oıyzae, Aspergilhıs. niger Giukoamiiaz (300)b) AspergiUııs niger, Aspergillus awamori,

'Endomycopsis sp., Rhizopus sp. p-GIukonaz (licheninase) Bacillus subtilis, Bacillus. amyloliquefaciens

Celulaz kompleks Trichodenna reesei (viri.de), 'A spergillux niger a-l,3-Gluckonaz Trichoderma harzianum

Dckstranaz Penicillhunfuniculosııni. Hemicelulaz Bacillus subtilis, Aspergillus niger Pullulanaz Bacillus sp.

a-Galactosidaz Aspergillus niger, Mortierella vinacea İnvertaz Yeast Lactaz Kluyveromyces fragilis

Bacterial nötral proteaz Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus. subtilis Bacterial alkalin proteaz (500)'" Bacillus licheniformis, Bacillus. subtilis,

Bacillus. Amyloliquefaciens Fungal proteaz (10)b) Aspergillus niger

Rennet (10)b) Mucor miehei, Mucor. Pnsillus, Streptokinaz: Streptococcus sp.

L-Asparaginaz , "Envinio carotövora Urikaz Bacillus fastidiosiis

Fungal pcctinaz kompleks Aspergillus niger, Trichoderma reesei 4. Liy azlar (23 l):l)

Fungal pectinaz kompleks Aspergillus niger 5. îsomerazlar (98)"'

Giucoz isomeraz (50)b) Bacillus coagulans, Actihoplanes missouriens, streptomyces sp.

6. Ligazlar (83)a) I

3


1.1. Enzim Kaynakları

Endüstride kullanılan enzimler genellikle mikroorganizma kaynaklı

olmalarının yanı sıra bitkisel ve hayvansal kaynaklıda olabilirler (John, 1987).

1.1.1. Hayvansal Kaynaklı Enzimler

Hayvansal kaynaklı enzimler genellikle tavuk yumurtalarının beyazı, domuz

midesi, pankreas, geviş getirenlerin karın bölgesi gibi yenilebilen organlardan izole

edilebildiği için insan yiyeceklerinin hazırlanmasında da uzun zamandan beri

kullanılmaktadır (John, 1987).

1.1.2. Bitkisel Kaynaklı Enzimler

Bitkisel kaynaklardan elde edilen enzimler, yenilebilir bitkilerden elde

edilmektedir. Toksik olmayan bu yiyeceklerin kaynaklarının güvenilirliği

doğrulanmıştır. Bu sınıftaki en önemli enzim arpa tohumlarından elde edilen malt

amilazdır. Bu enzim bira üretimi ve ekmek yapımında kullanılmaktadır (John, 1987)

1.1.3. Mikrobiyal Kaynaklı Enzimler

Mikrobiyal enzimler özel mikroorganizmalar tarafından üretilirler. Bu

mikroorganizmalar sadece enzim üretme yeteneklerine göre değil, ayrıca

mikroorganizmaların toksik ve patojen olmamasına göre de seçilirler.

Bira üretimi, fırıncılık ve tekstil endüstrisinde kullanılan enzimler Bacilllus sp.

ve Aspergillus sp. tarafından üretilen amilaz ve β-glukanazlardır. Bacillus ve

Aspergillus’dan izole edilen proteazlar, deterjan üretimi ve dericilikte derinin

yumuşatılması amacı ile de kullanılmaktadır (Demain ve Solomon, 1981).

4


Son on yılda farklı ekolojik koşullarda yaşayan mikroorganizmalar termofilik,

asidofilik ve alkalifik bakteriler şeklinde sınıflandırılmış ve bunlardan üretilen

enzimler çeşitli uygulama alanlarında kullanılmıştır (Zeikus, 1979).

1.2. Salgılanma Şekillerine Göre Enzimler

1.2.1. İntraselüler Enzimler

İntraselüler enzimler, sitoplazmaya dağılmış olarak bulunan ribozomlarda

sentezlenirler.Genelde bu enzimlerin substratları şekerler, aminoasitler, karboksilik

asit gibi küçük molekül ağırlığına sahip, hücre zarından geçebilme yeteneğinde olan

moleküllerdir (John, 1987).

1.2.2. Ekstraselüler Enzimler

Ekstraselüler enzimler, besiyeri ve hücre yaplarının dış kısmı ile bağlantı

halinde olan enzimler olarak tanımlanır.

Escherichia coli gibi gram-negatif bakterilerde proteinler iç ve dış membran

arasındaki periplazmik boşluk arasında kalırlar. Çünkü gram-negatif bakteri

duvarları, gram-pozitif bakterilerde bulunmayan bir dış membrana sahiptirler.

Gram-pozitif bakterilerde ise enzimler doğrudan besiyerine slagılanırlar.

İntrasellüler enzimlerin aksine, ekstraselüler enzimlerin stabilitesi yüksek olup,

çevre koşullarında aktivitelerini uzun süre koruyabilirler (John, 1987).

5


1.3. Bacillus Cinsi

Bacillaceae familyasının bir üyesidir. Hücreler çomak şekilli, düz veya hemen

hemen düze yakın, çoğu olumsuz ortam koşulları için çok dirençli, endospora sahip,

açık havada spor oluşturması engellenmeyen, gram pozitif, peritrik kamçılı, aerobik

veya fakültatif anaerob bir bakteridir. Birçok türünde hücre duvarı çapraz bağlarla

bağlı mezo-diamino pimelik asitten oluşur (Özçelik, 1995). Çoğunlukla mezofilik

olmakla birlikte psikrofilik ve termofilik türleri de vardır (Ayhan, 2000).

1.3.1. Hücre Morfolojisi

Bacilluslar tek veya çok sayıda hücreden oluşan uzun zincirler meydana

getirebilirler. Hücreler parabazal kısım ve protein kristalleri içerebilir. Ana hücrede

bulunan sporun şekli ve sporogoniumun yeri, Bacillus sp. türlerinde karakteristik bir

özellik gösterir. Endosporlar genellikle silindirik, elipsoidal, oval ya da yuvarlaktır.

Sporlar, sporogonium’un içinde merkezde, merkeze yakın, uca yakın, uçta veya

lateralde bulunurlar (Lennete ve ark., 1985). Bacillus türlerinin tanımlanması ve

türler arasındaki farklılıklarının belirlenmesi için spor ve sporogonium morfolojileri

temel alınabilir.

Birinci grup Bacillus türleri kendi içlerinde A ve B olmak üzere ikiye

ayrılılar. Her iki grupta sporogonium şişmemiştir. Sporlar elips veya silindirik

şekilli, santral veya terminal konumludur. Gram pozitif özelliğe sahiptirler. A ve B

grubu arasındaki fark, A grubunda hücre genişliğinin 1µm’den küçük, B grubunda

ise 1µm’den büyük olmasıdır. A grubuna örnek olarak B.megaterium ve B.cereus,

B grubuna örnek olarak ise B.licheniformis, B.subtilis, B.firmus ve B.coagulans

verilebilir.

İkinci grupta yer alan Bacillus türlerinde sporogonium şişmiştir. Sporları

elips, santral veya terminaldir. Bu grupta yer alan türlere örnek olarak B.polymyxa,

B.macerans, B.circulans, B.stearothermophilus, B.alvei, B.laterosporus ve B.brevis

verilebilir. Üçüncü grupta yer alan Bacillus türlerinde de sporogonium şişmiştir.

6


Sporlar küresel, subterminal ve terminal konumludur. B.sphaericus bu gruba

örnektir (Kolaylı, ve Beyatlı, 2003).

1.3.2. Hücre Duvarının Yapısı

Bacillus suşlarında yoğun halde bulunan murein tipi doğrudan birbirine

bağlı mezo-diamino pimelik asit şeklindedir. Bazı Bacillus türlerinde ise hücre

duvarı taykonik asit yapısına sahiptir (Özçelik, 1995). 1.3.3. Sporlar

Sporların şekilleri, sporogonium’daki durumları, sporogonium’a bağlı olan

büyüklüğü, taksonomide kullanılan kriterler arasındadır. Bacillus sporları çok

kompleks bir yapı göstermekte olup, vejetatif hücrede kolayca görülebilirler

(Çetin, 1968).

1.3.4. Koloni Özellikleri

Bacillus suşlarının koloni yüzeylerinin görüntüsü genellikle çevresel

faktörlerle değişmektedir. Bu faktörler arasında en önemlileri kültürün

bulunduğu besiyerinin bileşimi ve inkübasyon sıcaklığıdır. Çevresel faktörlerin

yanısıra besiyeri bileşimine bağlı olarak koloni çapı değişebilir ( Lennete ve ark.

, 1985).

Bazı Bacillus türleri katı besiyerinde, inkübasyondan önce ortamdaki nem

uzaklaştırılmadığı takdirde kümeler halinde bulunma eğilimi gösterirler. Bacillus

türlerin büyük çoğunluğu pigment üretmez. Buna karşılık B.megatherium suşları

özellikle kazein agarda sarı renkte pigment oluştururlar (Lennete ve ark. , 1985).

Bacillus türleri toprakta, suda, fekal materyalde ve çeşitli gıdalarda bulunabilir

(Banwart, 1983).

7


1.4. Halofil Organizmalar

Halofil organizmalar halotolerant, moderately halofil, haloalkalofil ve ekstrem

halofil olmak üzere genelde dört grup içerisinde toplanmaktadırlar. Bu gruptaki

mikroorganizmalar archea adı verilen grup içerisinde değerlendirilirler ve değişik

tuz içeren çevresel ortamlarda yaşamaya uyum sağlamışlardır. Halobacteria grubu

içerisindeki organizmaların optimum üreyebildikleri tuz konsantrasyonu %3 ile

%25 aralığındadır (Kuschner ve Kamekura, 1988; Ventosa ve ark., 1998; Aguiler ve

ark., 1998).

Halofil organizmalar soda gölleri, çöller, bahçe toprağı ve tuzlu yiyecekler gibi

tuz içeren çok değişik habitatlarda bulunmaktadır (Ventosa ve ark., 1998).

Ekstrem olarak adlandırılan birçok mikroorganizma adaptasyon gösterdikleri

ortam koşullarına bağlı olarak çeşitli özelliklere sahiptirler. Bu nedenle bu

organizmaların biyoteknolojik ve ticari önemleri oldukça yüksektir. Halofilik

organizmalar arasında bu güe kadar özellikle gram negatif organizmalarla

çalışılmıştır (Ventosa ve ark.1998).

Gram pozitif organizmalar bu alanda henüz yeni araştırılmaya başlanmış

organizmalardır. Halofil mikroorganizmalar arasında Halobacillus halophilus

(Spring ve ark.,1996), Marinococcus halophilus (Marquez ve ark.,1992), Bacillus

halophilus (Ventosa ve ark.,1998) en fazla bilinen organizmalardır.

Bu organizmalar ekstrasellüler nükleazlar başta olmak üzere birçok enzim ve

ürünü sentezleme yeteneğine sahiptirler (Ventosa ve ark. , 1998). Bu ürünler

arasında bakteriorodopsin ,ectoin, amylase, lipase, cellulase, protease,

biosürfaktanlar, lectinler ve bioplastikler sayılabilir (Adams ve Kelly., 1995; Aguiler

ve ark., 1998; Banat ve ark., 2000).

1.5. Termofil Mikroorganizmalar

Termofil organizmalar termotolerant veya termofil, hipertermofil ve ekstrem

termofil olmak üzere üç grup içerisinde sınıflandırılmaktadırlar. 60-115˚C’ arasında

yaşayan organizmalar genel olarak termofil şeklinde adlandırılırlar. 80 οC veya daha

8


yüksek sıcaklıklarda yaşayan organizmalar ekstrem temofil olarak tanımlanırken,

60-80οC arası hiper termofil, 50-60οC arası termofil veya termotolerant şeklinde

sınıflandırılmaktadır (Burhan ve ark, 2003).

Burada çok enteresan olan normal canlılar için çok uygun ve optimum olan

sıcaklık 37οC’ ye ulaşıldığında bunların metabolizma faaliyetleri durmakta ve

mikroorganizmaların protein hücreleri parçalanmaktadır. Katalizör görevi yapan

enzimler yok olmaktadır.

1.6. Mikrobiyal Enzimler ve Kullanım Alanları

Endüstriyel alanda kullanılan enzimler bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal

kökenli olmakla birlikte, ağırlıklı olarak mikrorganizmalardan elde edilmektedirler.

Bacillus sp. suşları proteolitik enzimler ve özellikle karbonhidratazların önemli

bir kısmını üreen organizma grubudur. Bu arasında proteazlar deterjan endüstrisinin

en önemli katkı maddesi olduğundan en yaygın kullanılan endüstriyel enzimdir

(Aunstrup, 1981).

Diğer bir biyoteknolojik öneme sahip enzim α-amilaz olup Bacillus sp.

grubunda oldukça yaygın bir şekilde bulunur. Bu enzim ekmek ve pastacılık, bira,

peynir gibi gıda endüstrilerinde ,nişastanın maltoza hidroliz edilmesi, maltoz

şuruplarının eldesi ,otomatik çamaşır ve bulaşık makinesinde kullanılan

deterjanlarının üretiminde kullanılmaktadırlar (Igarashı ve ark., 1998 ).

Diğer taraftan gıdalarda tatlandırıcı ve kaliteyi artırıcı olarak (Anonymous,

1988), tekstil endüstrisinde haşıl alma işlemlerinde (Tarakçıoğlu, 1979) ve alkol

fermentasyonunda yaygın bir kullanım alanı vardır (Bailey ve Ollis, 1977).

9


1.6.1. Proteazlar

Proteazlar, doğada bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kalıntıların

dekompozisyonunda önemli rol oynayarak besin döngüsününün sürekliliğini

sağlayarak bitkilerin besinlerini alabilmelerini sağlamaktadır (Aoki, 1995).

Mikrobiyal proteazlar geniş pH aralıklarında aktivite gösterdikleri için asidik,

nötral ve alkali olmak üzere 3 gruba ayrılmışlardır. Proteaz enzimi üretimi birçok

bakteri ve mantarda türnde oldukça yaygındır. Bununla birlikte Bacillus cinsinde

yer alan çeşitli suşlar enzim endüstrisinde çok önemli bir yere sahiptirler (Aunstrup,

1981., Fogarty ve Kelly, 1979).

1.6.2. Ksilenaz

Ksilan, yüksek bitkilerin hücre duvarının hemiselülozik kısmının temel

bileşeni olup kullanılışlığı dikkate alındığında doğada en fazla bulunan ikinci

kaynaktır (Christov ve ark. ,1996; Gessesse, 1998). Pek çok bakteri ve mantar suşu

ksilanı parçalayabilmek için ksilanaz enzimine gereksinim duyarlar (Gamerith ve

ark., 1992; Gessesse ve Gashe, 1997).

Son on yıldır, ksilan ve ksilenaz enzimlerinin endüstriyel uygulamaları

araştırıcıların giderek ilgisini çekmektedir. Enzimin kullanım alanlarına örnek

olarak kağıt hamuru hazırlama sistemleri ve kağıt endüstrileri, gıda ve hayvan yemi

endüstrileri verilebilir (Kulkarni ve ark., 1999).

1.6.3. Selülaz

Selülazlar endüstriyel olarak kullanılan enzimler içerisinde, proteaz ve

amilazlardan sonra üçüncü önemli biyoteknolojik enzimlerdir. Selülozu hidrolize

eden enzimler geniş çapta mantar ve bakterilerden elde edilmektedir. Ticari alnda en

10


fazla tercih edilen selülaz enzimi Trichoderma reseei (Teri ve ark., 1998) suşundan

elde edilmktedir. Bu organizma dışında Aspergillus, Penicillium, Basidiomycetes ve

Bacillus suşlarından da farklı özellikleri olan selülaz enzimleri üretimiştir (Tomme

ve ark. ,1995).

1.6.4. Amilazlar

Karbohidratazların en önemli kaynağını Bacillus cinsindeki organizmalar

oluşturmaktadır. Bir karbohidraz olan α-amilaz enzimi, ticari olarak kullanılan ilk

enzimdir (Radley, 1976). Amilazlar, nişasta ve glikojen moleküllerini hidrolize

ederek glikoz, maltoz, maltotrioz ve α-limit dekstrinlerin oluşmasını sağlayan

ekstraselüler enzimlerdir. Bu enzimler hayvanlar ve bitkiler tarafından da

sentezlenmesine rağmen, uygun koşullarda kısa sürede elde edilmesinden dolayı asıl

kaynağı mikroorganizmalar oluşturmaktadır. Fungal α-amilazların termostabiliteleri

bakteriyel α-amilazlardan daha düşük, araştırmalar daha çok bakteriyel özellikle de

Bacillus amilazları üzerinde yoğunlaşmıştır (Wiseman, 1987).

Bacillus cinsine ait 8 suştan izole edilen α-amilaz enzimi çeşitli araştırıcılar

tarafından tanımlanmış ve bütün özellikleri karakterize edilmiştir. Bu suşlar

B.subtilis (Coleman ve Elliott, 1962., Pazur, 1965., Matsuzaki ve ark., 1974),

B.amyloliquefaciens (Borgia ve Campbell, 1978), B.caldolytcus ( Grootegoed ve

ark .,1973), B.coagulans (Bliesmer ve Hartman., 1973), B.licheniformis (Meer,

1972., Saito, 1973), B.macerans (Lane ve Pirt, 1973), B.stearothermophilus

(Ogasahara ve ark., 1970) ve B.subtilis var. amylosacchariticuc (Matsuzaki ve ark.,

1974)’dur.

Amilolitik enzimler bakteri ve mantarlarda oldukça yaygındır. Eskiden amilaz

terimi amilaz ve amilopektinin α-1,4-glukozidik bağlarını hidrolize eden endo-

amilaz enzimler için kullanılırdı. Günümüzde amilazlar 3 grup altında

sınıflandırılmaktadırlar. Bunlar ekzo-amilaz, endo-amilaz ve dallanma göstermeyen

amilaz enzimleridir (John, 1987).

Sıradışı bakteriyel amilazlar asidofilik, alkalifilik ve termoasidofilik

bakterilerde bulunmuştur (Boyer ve ark., 1979). Termoasidofilik ve alkalifilik

11


bakterilerden elde edilen enzimler ekstrem pH ve sıcaklık koşullarında kullanıma

uygundur (Kindle, 1983). Çok yüksek sıcaklıklarda (80-90οC ) optimal aktiviteye

sahip olan α-amilaz enzimi termofil ortamda üreyen B.licheniformis tarafından

üretilmektedir (John, 1987). 1.6.4.1. Endoamilazlar

Endoamilazlar, nişasta ve glikojendeki α-1,4 bağlarını hidrolize ederler. Çoğu

α-amilaz saf kristal şeklinde üretilebilmektedir. Endo amilazlara örnek olarak

Aspergillus oryzae, B.subtilis, pankreas ve malttan elde edilenler verilebilir.

Endoamilazların moleküler ağırlıkları, sıcaklık stabiliteleri, optimum aktivite

gösterdikleri pH aralıkları ve hidrolitik özelliklerinin farklı olduğu anlaşılmıştır. Bu

özelliklerinden dolayı α-amilazlar zincir uzunlukları birbirinden farklı olan

oligosakkaritler meydana getirirler. Nişastanın tamamen ve çabuk parçalanabilmesi

için prejelatinizasyona ihtiyaç vardır. Bakteriyel α-amilaz jelatinize haldeki nişastayı

normal nişastaya göre 300, mantar α-amilazı 100 kat daha hızlı parçalar (John ve

Sons, 1998).

1.6.4.2. Ekzoamilazlar

1.6.4.2.1. İntraselüler Enzimler

İntraselüler enzimler düşük moleküler ağırlığa sahip substratlar üzerinde

etkilidirler. Bununla birlikte endüstriyel alanda kullanılan hidrolazların çoğu

ekstraselüler enzimler olup, yüksek moleküler ağırlığa sahip substratlarla

kullanılırlar. (John, 1987).

12


1.6.4.2.2. Ekstraselüler Enzimler

Önemli ekstraselüler enzimlerin heme hepsi, yüksek moleküler ağırlığa sahip

substratları parçalayan hidrolazlardır. B.licheniformis’den elde edilen α-amilaz

100οC’nin üstündeki sıcaklıklarda aktivitesini korumaktadır (Madsen ve ark. ,1973).

Diğer ekstraselüler enzimlerin bir çoğu daha az stabil olmakla birlikte 60οC ve daha

yüksek sıcaklıklarda kullanılabilmektedirler (John, 1987).

1.7. Nişasta

Nişasta, bitkilerde karbonhidrat şeklinde depolanan bir polisakkarittir. Ticari

olarak üretilen nişastanın asıl kaynağını mısır oluşturmaktadır. Bununla birlikte,

patates, buğday ve diğer hububat çeşitlerinin nişastalarıda ticari olarak

üretilmektedir. Nişasta, iki tip glikoz polimerinden oluşur. Bunlardan birincisi

amiloz olup, α-D-(1,4)-glikopyranosyl bağlarıyla birbirine bağlanmış, moleküler

ağırlığı yaklaşık 300000 dalton olan lineer bir polimerdir. Diğeri ise amilopektin

olup, dallanmış bir polimer özelliği gösterir. Amilopektin yan zincirleri, ana zincire

α-1,6 ve α-1,4 bağlarıyla bağlı olan glikoz moleküllerinden meydana gelmiştir

(John, 1987).

Nişasta suda çözünebilme özelliğine sahip bir polisakkarittir. Nişasta

granülleri sıcaklığın etkisi ile şişer ve belirli bir sıcaklık derecesinde nişasta

jelatinleşir.Yani şişen nişasta granülleri çözünür ve çözeltinin viskozitesi artar.

Jelatin haline gelen nişasta, bitki, hayvan ve mikrobiyal amilazlar tarafından

hidrolize edilirler (John, 1987).

Nişasta granülleri hidrojen bağları ile birbirine bağlı amiloz ve amilopektin

alt birimlerinden oluşmuştur. Karşılıklı bağların tipleri ve polimerizasyon derecesi,

nişastanın farklı yapılanma özelliğini oluşturur. Nişastanın farklı jelatinleşme

sıcaklığı ve kabarma gücü gibi özelliği ise, onun yiyecek üretimi endüstrisinde çok

önemli olduğunu göstermiştir (John ve Sons, 1998).

13


1.7.1. Nişastanın Parçalanması

Amilazlar, nişasta molekülündeki dekstrin ve şekerlerin 1,4 glikozidik

bağlarını parçalarlar. Endüstride kullanılan amilazlar bakteri ve mantar

kültürlerinden üretilmektedir. Amilazların α ve β olmak üzere iki farklı türevi vardır.

α-amilaz enzimi nişasta zincirlerindeki α –1,4 glikozidik bağları parçalarken, β-

amilaz enzimi ise zincirin sonundaki indirgenmeyen maltozu parçalar. Bazı

aminoglikozidazlar ise zincirin sonunda kalan glikoz artıklarını hidrolize ederler

(John ve Sons, 1998).

1.8. Nişastayı Parçalayan Enzimler

1.8.1 Bakteriyel α-Amilazlar

Bakteriyel α-amilaz enzimleri, anomerik karbon atomunun α-konfigürasyon

yeteneğinin olması sayesinde nişastanın iç bölgelerinin hidrolizinde görev yapar. Bu

enzimler genellikle yüksek sıcaklığa dayanıklıdır. B .subtilis ve B.

amyloliquefaciens birbirine benzer α-amilaz enzimi üretirler, fakat immünolojik

reaksiyonları farklıdır. B.licheniformis (Meer, 1972) ve B.stearahermophilus (Tamurı ve ark., 1981 ) tarafından üretilen termostabil enzimler yüksek sıcaklığa

dayanıklıdır. B. amyloliquefaciens öncelikle maltoheksoz üretirken, B.licheniformis ise maltopentoz ve maltoz meydana getirmektedir.Glikoz ise bu ürünlere göre daha

az miktarda elde edilir.

B .licheniformis’ den izole edilen α-amilaz enzimi ekmek yapımı, nişastadan

etanol, glikoz ve früktoz şuruplarının üretimi ve tekstil sanayisi gibi alanlarda geniş

ölçüde kullanılmaktadır. α-amilaz enzimi, otomatik çamaşır ve bulaşık makinası

deterjanlarının üretiminde de kullanılmaktadır (Igarashı ve ark., 1998).

Bacillus türleri, endüstriyel önemi büyük olan ekstraselüler amilaz ve proteaz

enzimlerini üretirler. Termostabil α-amilaz, mezofil ortamda üreyen B.

licheniformis türünün ürünü olup, geniş bir pH aralığında aktivite gösterir (Morgan

14


ve Priest, 1977).Termostabil α-amilaz enzimi tekstil ve kağıt endüstrisinde,

nişastanın sıvılaştırılmasında, yiyecek, tutkal ve şeker üretiminde kullanılmaktadır

(Bajpai ve Bajpai., 1987).

Enzim, aktivite gösterebilmek için kalsiyum (Ca++) iyonlarına gereksinim

duyduğundan metalloprotein yapısına sahiptir (Manning ve Campbell, 1961).

Enzimin yapısında bulunan kalsiyum, ekstrem pH ve sıcaklıklarda pepsin, tripsin,

papain gibi proteazlara karşı enzimin dayanıklılığını sağlamaktadır. (Stein ve

Fischer, 1958).

Bakır, civa, kurşun gibi ağır metaller enzimi inhibe etmektedirler (Hidake ve

Adachi, 1980.; Kano, 1986). α-amilazlar, aktif merkezlerindeki karboksil ve histidin

gruplarının birlikte etkisi ile substratı parçalarlar (Wiseman, 1987).α-amilaz

enziminin sentezi, ortamda nişasta veya daha düşük moleküler ağırlıklı

oligosakkaritlerin bulunmasına bağlıdır.

1.8.2. Bakteriyel β-Amilazlar

β-amilaz enzimi, amilosakkarit zincirlerindeki α-1,4 glukan bağlarını hidrolize

eder ve β-anomerik konfigürasyon ve β-limit dekstrinlerden maltoz oluşumunu

sağlar.Bu enzimin en önemli özelliği 65οC’nin üzerindeki sıcaklıklarda herhangi bir

aktivite göstermemesidir.

Son zamanlarda, Clostridium thermosulfogenes, B. acidopullulyticus (Uhlig,

1998) ve B.stearothermophilus gibi mikroorganizmaların termostabil ve termoaktif

özelliğe sahip, β-amilaz üretebildikleri gösterilmiştir. β-amilaz enzimi maltoz

üretimi ile yiyecek ve içecek endüstrisinde kullanılmaktadır.

1.9. α-Amilazların Endüstriyel Kullanım Alanları

α-amilaz enzimi ticari olarak kullanılan ilk enzimdir (Radley, 1976). 1905

yılında Japonya’da tekstil endüstrisinde haşıl alma işleminde kullanılan α-amilaz

enzimi Aspergillus oryzaeα kültüründen üretilmiştir. α-amilaz enziminin

endüstriyel boyutlardaki üretimine 1939 yılında ilk kez Japonya’da başlanmış ve B.

15


Subtilis kullanılmıştır. Daha sonraki yıllarda α-amilaz enzimi nişastanın

sıvılaştırılmasında kullanılmıştır. 1959’da α-amilaz ve amiloglikozidaz enzimleri

kullanılarak, nişastadan toz ve kristal dekstroz’un üretimine başlanmıştır

(Anonymous, 1988a). Gıda endüstrisinde, nişastanın α-amilaz enzimi ile hidrolize

edilmesi sonucu açığa çıkan ürünler, yaygın şekilde kullanılmaktadır. Bu ürünlerden

dekstrin, nişastanın glikoza kadar hidrolize olmasından önce oluşan kısa moleküllü

ilk üründür. Dekstrinler çözünürlüğü yüksek ve dayanıklı bir ürün olup, yoğun şurup

kıvamında bir maddedir. Bu maddeler gıdalarda koyulaştırıcı dolgu maddesi olarak

kullanılmaktadır (Keskin, 1982).

Nişasta dekstrinlere kadar parçalandıktan sonra, glikoamilazın ortama ilavesi

ile glikoza kadar ayrışmaktadır. Açığa çıkan glikoz, ya şurup halinde, ya da kristal

toz şeklinde elde edilmektedir. Glikoz şurubuna glikozizomeraz enzimi ilave

edilerek früktozlu şurup üretimi gerçekleştirilmektedir. Bu ürün yüksek düzeyde

tatlılığa sahip olup, meşrubat üretimi, süt üretimi, konservecilik, ekmek, pasta ve

şekerleme yapımı gibi alanlarda kullanılmaktadır (Anonymous, 1988a).

Nişastanın maltoza kadar hidrolizi, nişasta molekülünün öncelikle α-amilaz

enzimi tarafından sıvılaştırılıp, daha sonra da ortama izoamilaz ve pullulanaz

enzimlerinin ilavesi ile sağlanmaktadır. Açığa çıkan yüksek saflıktaki maltoz, reçel,

şekerleme, ekmek ve bira üretiminde kullanıldığı gibi, gıdalarda tatlandırıcı olarak

da kullanılmaktadır. Nişastanın hidrolizi sırasında yan ürün olarak açığa çıkan

maltotetroz ise nem tutucu olarak kullanılmaktadır (Anonymous, 1988a).

Tekstil endüstrisinde dokuma sırasında ipliklerin sağlam ve düzgün olması ve

kopmaması için iplikler nişasta içeren bir çözelti ile muamele edilmektedir. Bu

işleme haşıllama denilmektedir. Kumaş dokunduktan sonra, kumaştaki fazla

nişastanın giderilmesi gerekmektedir. Bu işleme haşıl alma adı verilmektedir. Haşıl

alma ajanı olarak da α-amilaz enzimi kullanılmaktadır (Tarakçıoğlu, 1979).

α-amilaz enzimi alkol üretiminde de kullanılmaktadır. Alkol üretiminde

hammadde olarak kullanılan nişatalı materyaller, α-amilaz ve amiloglikosidaz

enzimleri ile muamele edilmektedir. Nişasta yeterince parçalandıktan sonra ortama

maya aşılanarak fermentasyon işlemine geçilmektedir (Wiseman, 1987).

16


α-amilaz enzimi meyve suyu endüstrisinde de uygulama alanı

bulmuştur.Özellikle elma ve armut sularının berraklaştırılmasında kullanılmaktadır

(Ekşi, 1988).

Son yıllarda özellikle kuru temizleme gibi yeni alanlarda da giderek artan

şekilde kullanım alanı bulmuştur. Nötrofilik özelliğe sahip amilaz enzimleri genel

olarak pH 5-7.5 aralığında aktivite gösterirken, özellikle deterjan sanayisinde

kullanılan amilaz enzimleri pH 8-11 aralığında aktivite göstermekte olup, alkalifilik

Bacillus türlerinden izole edilmektedirler (Igarashi ve ark., 1998; Uhlig, 1998).

Bu çalışmada haloalkalofil, termofil ve termostabil amilaz enzimi üretimi ve

karakterizasyonu ile biyoteknolojik alandai kullanılabilirliğinin araştırlmaı

amaçlanmıştır.

17

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Emel KARADENİZ

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

Fogorth ve ark (1971), Bacillus türlerinin çok çeşitli ekstrasellüler enzim

ürettiklerini ve bunlardan bazılarının, örneğin nötral proteazların, mayalanmada, α-

amilazların nişastanın sıvılaştırılmasında ve mayalanmada endüstriyel öneme sahip

olduklarını belirtmişlerdir.

Boyer ve Ingle (1972), alkali besiyerinde farklı bir amilaz enzimi üreten

Bacillus sp. suşunu izole ederek karakterizsyonunu yapmışlardır. Bu enzimin β

konfigürasyonuna sahip siklomaltoheptozu alkali ortamda hidrolize edebilen,

optimum pH’da aktivite gösteren bir endoamilaz olduğunu belirtmişlerdir

Srivastava (1987), bakterilerin 55º C de üretildiklerinde sentezlenen α-amilaz

enziminin major ve minör olmak üzere 2 farklı tipinin olduğunu saptamışlardır.

Morgan ve Priest (1973) ile Saito (1973), optimum pH 9.2-10.5 arasında

aktivite gösteren, alkali amilaz enzimi üreten Bacillus sp. suşlarıın 40º C ’nin

üzerindeki sıcaklıklarda çok hızlı aktivite kaybettiklerini bularak bu suşların

bazılarında yüksek termostabilite özelliklerinin varlığını araştırmışlardır.

Saito ve Yamamoto (1973), Bacillus licheniformis de α-amilaz üretiminde

etkili olan karbon kaynaklarını araştırmışlardır.

Kelly ve Fogarty (1976) ile Godfrey ve Reichelt (1985), alkali proteazların

deterjan ve yiyecek endüstrisinde önemli uygulama alanlarına sahip olduklarını

belirtmişlerdir.

John (1987), Bacillus subtilis’i tanımlayıp, uygun koşullarda α-amilaz

üretimini ve bakterilerin üreme koşullarını araştırmışlardır.

Bajpai va Bajpai (1987), termostabil α-amilaz üreten Bacillus licheniformis

suşunun izolasyonunu, identifikasyonunu, kültür ve enzim özellilerini

araştırmışlardır. Bajpai ve Bajpai (1987), Bacillus licheniformis TCRDC-B13

suşunun üremesinin pH 3-11 arasında olup, besiyerinin pH’nın arttırılması ile

üremenin azaldığını, enzim üretiminin pH 5 de başladığını pH 10’a kadar devam

ettiğini ve maksimum aktivitenin pH 6-9 arasında olduğunu bulmuşlardır. Bajpai ve

Bajpai (1987), Bacillus licheniformis TCRDC-B13 suşu için enzim üretimi ve üreme

18


sıcaklığının 25-50ºC de ve maksimum ezim üretiminin 35ºC de gerçekleştiğini

bulmuşlardır.

Bajpai ve Bajpai (1987), Bacillus licheniformis TCRDC-B13 suşundan elde

edilen enzimin yüksek sıcaklıkta ve geniş pH aralığında nişastanın sıvılaştırılmasında

kullanışlı olduğunu bulmuşlardır. Bajpai ve Bajpai (1987), termostabil α-amilazın

son birkaç yılda çok fazla kullanım alanına sahip olduğunu, kağıt ve tekstil

endüstrisinde, nişastanın sıvılaştırılmasında, yiyecek endüstrisinde, tutkal

sanayisinde ve şeker üretiminde kullanılabileceğini belirtmişlerdir.

Srivastava (1987), topraktan Bacillus stearothermophilus suşunu izole edip bu

suşta iki tip amilazın varlığını ortaya çıkararak bu enzimleri saflaştırıp

karakterizasyonunu yapmıştır. Srivastava (1987), bakteriyel α-amilazın endüstrinin

değişik alanlardaki kullanımı arttığı için α-amilaz üretme yeteneğine sahip yeni

bakteriyel suşların izolastyonunun önemli olduğunu belirtmiştir.

Sharp ve ark (1989), termostabil α-amilazın şeker endüstrisinde, mayalanmada

ve nişastanın parçalanmasında olduğu gibi, ticari proseslerde de uygulama alanı

bulabileceğini belirtmişlerdir.

Vihinen ve Mantsala (1990), Bacillus stearothermophilus’dan elde edilen α-

amilazın aktivite gösterdiği optimum sıcaklığın 50-70ºC olduğunu

belirtmişlerdir.Yaptıkları çalışmada Bacillus stearothermophilus’da α-amilaz

aktivitesinin en yüksek olduğu sıcaklığın 70-80ºC olduğunu bulmuşlardır.

Jin ve ark (1990), termostabil α-amilaz üreten bazı termofil aerob bakterileri,

Chinese geleneksel koji’den izole edip, bu bakterilerin Çinli’lerin geleneksel

sake’lerinin mayalanmasında kullanarak α-amilaz üretimini çalışmışlardır.

Grant ve Horikoshi (1992), alkali pH’da ksilazın yüksek çözünürlük özelliğine

sahip olmasından dolayı fermente şekerler ile hemiselülozik artıkların hidrolizinde

önemli bir yer teşkil edebileceğini söylemişlerdir.

Fujiwara ve Masui (1993), termostabil alkali proteaz üreten B18 suşunun

termofil alkalifik özelliklerinin taksonomisini, saflaştırılan enzimin diğer alkalifik

bakterilerden elde edilen alkali proteazların özellikleriyle karşılaştırmasını

yapmışlardır.

19


Fujiwara ve Masui (1993), kazeinin 30ºC de proteaz aktivitesi üzerine etkisini

çeşitli pH aralıklarında araştırmışlar ve enzimin 2.5 M CaCl2 varlığında 1 h 40ºC de

inkübe ettikten sonra pH 5-12 arasında stbil olduğunu bulmuşlardır. Fujiwara ve

Masui (1993), kazein varlığında proteaz aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisini pH 10

da ve 10 dakika aralıklardaki periyotlarda çeşitli sıcaklıklarda incelemişlerdir. Ca+2

varlığında yüksek sıcaklıkta proteaz enziminin stabil, enzim aktivitesinin optimum

sıcaklığının 75-85ºC civarında olduğu bulmuşlardır.

Takasaki ve ark (1994) amilazların önemli kullanım alanlarından birinin de

çeşitli nişasta şekerlerinin üretiminde nişastanın sıvılaştırılması olduğunu

belirtmişlerdir.

Wind ve ark (1994), patates üretim merkezinden izole edilen Bacillus

stearothermophilus’a ait çeşitli suşların, optimum üreme sıcaklığını ve α-amilaz

üretimini incelemişlerdir.

Nakamura ve ark (1995), Bacillus sp. TAR-1 suşu tarafından üretilen alkali

ksilinazın optimum 70ºC de pH 9, 75ºC de ise pH 7 de aktivite gösterdiğini

açıklamışlardır.

Gessesse ve Gashe (1997), alkali soda gölünden izole edilen alkalifilik

Bacillus sp. tarafından üretilen alkali ksilinaz üretimini ve saflaştırdıkları enzimin

özelliklerini araştırmışlardır. Gessesse ve Gashe (1997), ksilinaz enziminin

termostabil özelliğe sahip ve alkali pH’larda aktivite gösterdiğini saptamışlar ve

bundan dolayı özellikle kağıt endüstrisinde uygulama alanı bulduğunu

belirtmişlerdir.

Igarashi ve ark (1988), alkalifilik Bacillus kültürlerinden alkali izoamilaz,

alkali rezistant neopullulanaz ve yüksek alkali pullulanaz gibi bazı tek dallı enzimleri

karakterize etmişlerdir. Bu enzimlerin alkali koşullarda α-amilazlarla birlikte

çamaşır ve bulaşık deterjan sanayinde etkili olarak kullanılabilirliğini

göstermişlerdir. Igarashi ve ark (1998), Bacillus sp. KSM-1378’den saflaştırılan

LAMY α-amilazının moleküler ağırlığını SDS-PAGE yöntemi ile yaklaşık 53 kDa

olduğunu tanımlamışlardır.

Igarashi ve ark (1998), 50 mM’lık değişik pH’ya sahip tamponlarda LAMY α-

amilazının maksimum aktivitesinin pH 8-8.5 civarında olduğunu gözlemişlerdir.

20


Igarashi ve ark (1998), özellikle Bacillus licheniformis’den elde edilen sıvılaştırıcı α-

amilazın ekmek yapımı, nişasta materyalinden etanol üretimi, fruktoz ve glukoz

şuruplarının üretimi ve tekstil gibi geniş uygulama alanlarında kullanılmakta

olduğunu belirtmişlerdir. Igarashi ve ark (1998), alkalifilik Bacillus sp KSM 1328

suşundan izole edilen alkali amilopullulanazın çeşitli karbonhidratların α-1,4

bağlarında olduğu gibi pullulananın da α-1,6 bağlarının hidrolizinde etkili olduğunu

bulmuşlardır.

Lin ve ark (1998), Bacillus sp. TS-23 suşunda SDS-PAGE ile, amilolitik

aktivite gösteren moleküler ağırlıkları 150-45 kDa olan iki amilaz bandı

bulmuşlardır. Lin ve ark (1998), enzim sentezinin 42-60ºC sıcaklıkta, optimum 55ºC

de meydana geldiğini Bacillus sp.TS-23 suşunun 55ºC de ürediğini bulmuşlardır.

Bu sonuçlarda amilaz üretimi ve bakteri üremesi için optimum sıcaklığın aynı

olduğunu göstermişlerdir.

Temizkan ve Arda (1999), proteinler için çoğunlukla poliakrilamid jellerin

kullanıldığı SDS poliakrilamid jel elektroforezinin hemen hemen tüm protein

tiplerinin analizlerinde (molekül ağırlığı tayini, alt birim sayısı ve belirleme) başarılı

bir şekilde uygulandığını söylemişlerdir.

Konsula ve Kyriakidis, (2004). Bacillus subtilis α-amylase enziminin optimum

135ºC aktivite gösterdiğini 160ºC de ise %70 aktiviteye sahip olduğunu

belirtmişlerdir.

Daniel ve ark. (1996). P.wosei amilazının yarılanma ömrünün 100ºC de 6 saat,

P.furioruz amilazının yarılanma ömrünün ise 120ºC de 2 saat olduğunu

belirtmişlerdir.

Pomares ve ark. (2003). Haloferax mediterranie α-amylase enziminin 2-4M

NaCL çözeltisinde optimum aktivite gösterdiğini belirtmişler.

21

4. MATERYAL VE METOT Seçil TATAR

3. MATERYAL VE METOT

3.1. Materyal

Aşağıdaki çözelti ve besiyerleri materyal olarak seçilmiş ve kullanılmıştır.

3.1.1. Kullanılan Çözeltiler

3.1.1.1. NaOH Çözeltisi

Besiyerlerinin pH’sını ayarlamak amacı ile 2 N NaOH çözeltisi kullanılmıştır

(Aiba ve ark., 1983).

3.1.1.2. Etanol

İzole edilen enzimin yoğunlaştırılması ve çöktürülmesi amacı ile %96’lık

soğuk etanol kullanılmıştır (Srivastava, 1987).

3.1.1.3. Potasyum Fosfat Tamponu (0.1 M pH=6.8)

Elde edilen enzim çökeltisini çözmek amacı ile kullanılmıştır (Srivastava,

1987).

3.1.1.4. DNS (Dinitro Salisilik Asit)

Enzim aktivitesini durdurmak amacı ve indirgen şeker miktarının saptanması

amacı ile kullanılmıştır (Aiba ve ark., 1983). 1 gr DNS (50 ml de-iyonize su içinde

çözüldükten sonra), 30 gr K-Na-Tartarat ve 20 ml 2N NaOH ilave edilerek, son

hacim distile su ile 100 ml’ye tamamlanır (Aiba ve ark., 1983).

3.1.1.5. Citrat Tamponu (pH=4-6):

Enzimin pH 4-6 arasındaki aktivitesini saptamak amacı ile kullanılmıştır

(Anonymous, 1917). 0.1M Solusyon A (19.21 gr/1000 ml sitrik ait) ve 0.2M

22


solusyon B Na2HPO4x7H2O (53.65 gr/1000 ml) stok çözeltileri hazırlanır ve istenilen

pHdeğerleri için uygun karışımların elde edilmesi amacıyla kullanılır.

PH SolA (ml) SolB (ml) Distile su (ml)

4.0 30.7 19.3 50

4.6 26.7 23.3 50

5.0 24.3 25.7 50

5.6 21.0 29.0 50

6.0 17.9 32.1 50

3.1.1.6. Fosfat Tamponu (pH=6-8):

Enzimlerin Ph 6.0-8.0 arasındaki aktivitelerini saptamak amacı ile

kullanılmıştır (Anonyous, 1917). 0.2M Solusyon A (27.8 gr NaH2PO4/1000 ml) ve

0.2M solusyon B Na2HPO4x7H2O (53.65 gr/1000 ml) stok çözeltileri hazırlanır ve

istenilen pH değerleri için uygun karışımların elde edilmesi amacıyla kullanılır.

PH SolA (ml) SolB (ml) Distilesu ml)

6.0 87.7 12.3 100

6.5 68.5 31.5 100

7.0 39.0 61.0 100

7.5 16.0 84.0 100

8.0 5.3 94.7 100

23


3.1.1.7. Glycine Tamponu (pH=8.5-10.5)

Enzimlerin Ph 8.5-10.5 arasındaki aktivitelerini saptamak amacı ile

kullanılmıştır (Anonyous, 1917). 0.2M Solusyon A (15.01 gr Glisin/1000 ml) ve

0.2M solusyon B (NaOH) stok çözeltileri hazırlanır ve istenilen pH değerleri için

uygun karışımların elde edilmesi amacıyla kullanılır.

PH SolA (ml) SolB (ml) Distile su (ml)

8.6 50 4.0 146

9.0 50 8.8 141.2

9.6 50 22.4 127.6

10.0 50 32.0 118

10.6 50 45.5 104.5

3.1.1.8. Borax Tamponu

Enzimlerin pH 11-13 arasındaki aktivitelerini saptamak amacı ile

kullanılmıştır (Anonyous, 1917). A (0.02 M sodyum boraks), B (0.2M NaOH). Stok

çözeltilerden 50 ml A çözeltisi sabit olmak üzere alınır üzerine, x ml B çözeltisinden

eklenir ve son hacim 200 ml’ye tamamlanır. B çözeltisinin miktarı istenilen pH

değerine göre değişir.

3.1.1.9. Lugol Solüsyonu:

Katı besiyerinde ve PAGE jelinde amilaz aktivitesinin saptanması amacı ile

kullanılmıştır “20kat sulandırılarak kullanılmıştır” (Çetin, 1968).

24


Bileşimi gr

İyot 7

Potasyum iyodür 3

Distile su 100 ml

3.1.2.Bakteri İzolasyonu ve İdentifikasyonunda Kullanılan Besiyerleri

3.1.2.1. M9-Nişasta Agarı: Amilaz aktivitesinin saptanması amacıyla kullanılmıştır.

(Shubuya ve ark., 1986).

Bileşimi gr

Na2HPO4 6

KH2PO4 3

NaCl 0.5

NH4Cl 1

MgSO4 0.24

CaCl2 0.24

Pepton 3

Nişasta 10

Agar 15

Distile su 1000 ml

3.1.2.2. Jeloz Besiyeri: Bakterilerin izolasyon aşamasında üretilmesi amacıyla

kullanılmıştır (Çetin, 1968).

25


Bileşimi gr

Pepton 10

Etözütü 10

NaCl 5

Agar 14

Distile su 1000 ml

3.1.2.3. Buyyon:Bakterilerin üretilmesi amacıyla kullanılan temel bir besiyeridir

(Çetin, 1968).

Bileşimi gr

Pepton 10

Et özütü 10

NaCl 5

Distile su 1000ml

3.1.2.4. Jelatin Besiyeri: Bakterilerin jelatini parçalayıp parçalamadığını saptamak

için kullanılmıştır (Bilgehan, 1995). Buyyon besiyerine (88 ml) 12 gr jelatinin

eklenmesiyle hazırlanır (Bilgehan, 1995).

26


3.1.2.5. Kazein Besiyeri:Bakterilerin kazeinaz aktivitelerinin saptanması amacıyla

kullanılmıştır (Bilgehan, 1995).

Bileşimi gr

Pepton 5

Maya 3

Süt Tozu 1

Agar 12

Distile su 1000 ml

3.1.2.6. Katalaz Tezi:Bakterilerin katalaz reaksiyonlarını saptamak amacıyla

kullanılmıştır (Bilgehan, 1995; MacFaddin, 2000). Saf bakteri kültürü üzerine

%3’lük H2O2 çözeltisinden 1 ml ilave edilir vegaz çıkışı gözlenir. Gaz oluşumu

katalaz reaksiyonunun pozitif olduğunu gösterir.

3.1.2.7. Simon's Sitrat Besiyeri: Sitratın bakteriler tarafından karbon kaynağı olarak

kullanılıp-kullanılmadığının belirlenmesi amacıyla kullanılmıştır (MacFaddin, 2000).

Bileşimi gr

NaCl 5

MgSO4 0.2

NH4H2PO4 1

K2HPO4 1

Na3C6H5O7.2H2O 2

Bromthymol Blue 0.08

Agar 20

Distile su 1000 ml

27


3.1.2.8. SİM Besiyeri (Sülfit-İndol-Mobility):Hidrojensülfür, indol oluşumu ve

hareketin varlığını ölçmek için kullanılan bir besiyeridir (Anonymous,1978).

Bileşimi gr

Kazein Peptonu 2.0

Et Peptonu 6.0

Amonyum Demir III Sitrat 0.2

Amonyum Thiosülfat 0.2

Agar 3.0

Distile su 1000 ml

3.1.3. Elektroforez İşleminde Kullanılan Çözeltiler

3.1.3.1. Solüsyon A

Bileşimi gr

Akrilamid 29.2

Bisakrilamid 0.8

Distile su 100 ml (Bollag ve Edelstein.,

1991)

Not: Akrilamid Monomer Solüsyonu +4ºC’de ve kahverengi şişede

saklanmalıdır.

28


3.1.3.2. Solüsyon B (4X)

Bileşimi ml

Tris-HCl 75

SDS %10 4

Distile su 21 ml (Bollag ve

Edelstein., 1991)

3.1.3.3. Solüsyon C (4X) (Bollag ve Edelstein., 1991)

Bileşimi ml

Tris-HCl 50 ml (pH: 6.8)

SDS %10 4

Distile su 46

3.1.3.4. Amonyum Persülfat (AMPS)(%10 W/V) (Bollag ve Edelstein., 1991)

Bileşimi

Amonyum Persülfat 0.5 gr

Distile su 5 ml

Not: Kullanılmadan önce taze hazırlanmalıdır.

29


3.1.3.5. Elektroforez Tamponu (1 L) (pH=8.3) (Bollag ve Edelstein., 1991)

Bileşimi g/l

Tris 3 gr

Glisin 14.4

SDS %0.1 10 ml

Distile su 1000 ml

3.1.3.6. Örnek Tamponu (5X) (Bollag ve Edelstein, 1991)

Bileşimi ml

Tris Buffer pH(6.8) 0.6

SDS %10 2.0

2-Merkaptoetanol 0.5

Gliserol 5.0

Brom Fenol %1 1.0

Distile su 0.9

30


3.1.3.7. Seperating Jel (%10’luk) (Bollag ve Edelstein, 1991)

Bileşimi ml

SOL A 6.5

SOL B 5.0

Distile su 8.4

AMPS (%10) 66 µl

TEMED 13 µl

Nişastalı jellerde %3’lük nişastadan son hacim 20ml olacak şekilde 1 ml

kullanılmıştır (Bollag ve Edelstein, 1991)

3.1.3.8. Toplayıcı Jel (Bollag ve Edelstein, 1991)

Bileşimi ml

SOL A 1.0

SOL B 1.5

Distile su 3.5

AMPS (%10) 20 µl

TEMED 5 µl

31


3.1.3.9. Jel Boyama Solüsyonu (Bollag ve Edelstein, 1991)

Bileşimi

Comassie Brillanti Blue R-250 1 gr

Metanol 450 ml

Glasial Asetik Asit 100

Distile su 450 ml

3.1.3.10. Jelden Boyayı Uzaklaştırma Solüsyonu (Bollag ve Edelstein,1991)

Bileşimi

Metanol 100 ml

Glasial Asetik Asit 100 ml

Distile su 800 ml

3.1.4.Renatürasyon Solüsyonları

3.1.4.1. SOL1

50 mM sodyumdihidrojenfosfat ve 50 mM disodyumhidrojenfosfat su

içerisinde çözülür ve pH 7.2’ye ayarlandıktan sonra %40 izopropanol olacak şekilde

son hacim ayarlaması yapılır (Lee ve ark. 1994, Ikeda ve ark., 1994).

3.1.4.2. SOL2

50 mM sodyumdihidrojenfosfot ve 50 mM dihidrojenfosfat su içerisinde

çözülür ve pH 7.2’ye ayarlanır (Lee ve ark. 1994, Ikeda ve ark., 1994).

32


3.1.4.3. SOL3

50 mM sodyumdihidrojenfosfat, 50 Mm disodyumhidrojenfosfat, 1Mm

EDTA ve 5 Mm betamerkaptoetanol karıştırılarak,pH 7.2’ye ayarlanır (Lee ve

ark.1994; Ikeda ve ark., 1994)

3.2. METOD

3.2.1. Bakteri İzolasyonu ve İdentifikasyonu

3.2.1.1. Topraktan Bacillus sp. suşlarının İzolasyonu

Gaziantep’in 18 farklı bölgesinden toprak örnekleri alınmış ve bu örneklerden

1’er gr tartılarak 5 ml steril distile su ile karıştırılıp süspansiyon haline getirilmiştir.

İzole etmek istediğimiz Bacillus sp. sporlu bir bakteri olduğundan, elde edilen

süspansiyon 80ºC’de 10 dk inkübe edilerek ısı şoku uygulanmıştır. (Lennete ve ark.,

1985).

Isı şoku uygulamasından sonra tek koloni oluşumunu sağlayabilmek için

örnekten seri sulandırmalar yapılarak, LB agar besiyerine yayma şeklinde ekim

yapılmış ve 55ºC’lik etüve konularak 1 gece süreyle inkübasyona bırakılmıştır.

İnübasyondan sonra besiyerinde tek düşmüş farklı morfolojik görünüme sahip

koloniler seçilmiş ve bu koloniler LB agar besiyerine çizgi şeklinde ekim yapılarak

identifikasyon ve amilaz aktivitelerinin saptanması amacı ile stok kültür şeklinde

saklanmışlardır.

3.2.2. Bakterilerin İdentifikasyonu

Seçilen bakteri örneklerini teşhis edebilmek amacı ile indol, hidrojensülfür,

hareket, asit, katalaz, jelatin ve kazeini kullanma gibi biyokimyasal testler ile spor,

yüzeyde zar oluşturma, dipte çökelti oluşturma ve gram boyama testleri yapılmıştır

(Jin ve ark., 1990).

33


3.2.3. Katı Besiyerinde Amilaz Aktivitesinin Saptanması

Tanımlanmaları yapılan stok Bacillus sp. suşları nişastalı M9 minimal

besiyerine çizgi ekim tekniği kullanılarak aşılanmışlar ve 55ºC’lik etüve konularak 3

gün üremeye bırakılmışlardır.

Amilaz aktivitesinin saptanması için petri kutusunun kapağına iyot çözeltisi

dökülerek üreyen koloniler iyot buharı ile boyanmışlardır. Boyama sonucunda

nişastanın parçalanmadığı bölgeler mavi, amilaz enzim aktivitesi sonucu nişastanın

hidrolize olduğu bölgelerde ise şefaf bir görünüm meydana gelmiştir.

Etrafında şeffaf hidroliz zonu bulunan koloniler amilaz pozitif, diğerleri amilaz

negatif şeklinde değerlendirilmişlerdir. (Hols ve ark., 1994; Burhan ve ark.2003).

3.2.4.Bakterinin Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştiği pH Aralığının

Saptanması

Bu amaçla 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0 ve 12.5 pH

değerlerine sahip nişastalı M9 minimal besiyerlerine, tanımlanması yapılan ve amilaz

pozitif özellik gösteren suşlardan çizgi şeklinde ekim yapılmıştır. Örnekler 55ºC’de

üç gün üretildikten sonra hangi pH değerleri ve pH aralığında üreme gösterdikleri

saptanmıştır.

Besiyerinin içerisinde nişasta bulunduğu için üreyen koloniler iyot buharına

tutularak enzim üretiminin gerçekleştiği pH aralığı ve optimum pH değeri

saptanmıştır (Hols ve ark.,1994; Burhan ve ark. 2003)

3.2.5. Amilaz Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma

Seçilen bakteri örneklerinden S-28 olarak adlandırılan suş enzim retimi için

kullanılmıştır. S-28 suşu pH’sı 9.5 e ayarlanmış nişastalı sıvı M9 besiyerine ekilerek,

3 gün süreyle 55ºC ve 250 devir/dakikalık çalkalama kültür şeklinde üretilmiştir.

Elde edilen karışık kültür +4ºC ve 8000g rpm’de 30 dakika santrifüj edilerek

bakteriler kültürden uzaklaştırılmış ve sıv faz temiz bir kaba aktarılmıştır. Örneğin

üzerine orijinal hacmin %70’i oranında %96’lık soğuk etanol eklenmiş ve –33ºC’de

bir gece bekletilmiştir.

34


Soğuk çöktürme ortamından alınan örnek +4ºC de 30 dakika süreyle 10000

rpm’de santrifüj edilerek çöktürülmüştür. Dipte toplanan enzim çökeltisi 0.1 M’lik

pH’sı 6.8 olan sodyum fosfat tamponunda çözülerek, toplam 250 ml’lik enzim

solusyonu elde edilmiştir (Srivastava, 1987; Burhan ve ark., 2003).

3.2.5.1. Enzimin pH Optimumunun Saptanması

Alkol çöktürme tekniği kullanılarak kısmi saflaştırma işlemi ile elde edilen

enzim çözeltisinin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin saptanması için Na-

fosfat (pH 6.0-8.0), Glisin-NaOH (pH 8.5-10.5) ve Borax-NaOH (pH 11-13)

tamponları kullanılarak %2’lik çözünür nişasta çözeltileri hazırlanmıştır

(Anonymous, 1917).

Aktivite tayini için 0.5 ml enzim çözeltisi ve her pH değerindeki substrat

çözeltisinden 0.5 ml örnek alınarak tüpe konulmuştur. Her pH değeri için üç seri tüp

analiz edilmiştir. Hazırlanan enzim substrat karışımları enzimin üretildiği sıcaklık

olan 55ºC’lik su banyosunda 30 dakika süreyle inkübe edilmişlerdir.

İnkübasyonun sonunda her bir örnek tüpüne eşit miktarda DNS ayıracı

konulmuş (1 ml enzim+substrat, 1 ml DNS) ve 5 dakika süreyle kaynatma işlemi

uygulanmıştır. Tüpler soğutulduktan sonra 540 nm dalga boyu kullanılarak Cecil5500

UV-visible spektrofotometresinde köre karşı (eşit hacımda substrat ve DNS ayıraı

kullanılarak hazırlanmıştır) okuma işlemi yapılmıştır.

En yüksek absorbans değerinin elde edildiği pH değeri 100 kabul edilerek diğer

pH değerleri buna göre oranlanmş ve relatif enzim aktivitesi saptanmıştır (Gessesse

ve Gashe., 1997; Burhan ve ark., 2003).

3.2.5.2. Enzimin Optimum Sıcaklık Aktivitesinin Saptanması

Kısmi saflaştırma sonucu elde edilen enzimin optimum aktivte gösterdiği

sıcaklık değerinin bulunması için 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120,

130,140 ve 150 ºC de inkübasyonlar gerçekleştirilmiş ve relatif aktivite sonuçlarına

bakılmıştır. İnkübasyonlardan 20-90ºC aralığındaki denemeler su banyosunda, 100-

150 ºC aralığındaki denemeler ise yağ banyosunda yapılmıştır.

35


Aktivite tayini için optimum aktivitenin gerçekleştiği pH değerinde hazırlanan

substrat kullanılmıştır. 0.5 ml ezim solusyonu ve 0.5 ml substrat solusyonu

karıştırılarak seçilen sıcaklık değerlerinde 30 dakika süreyle inkübasyon

gerçekleştirilmiştir. İnkübasyon sonunda tüplere eşit hacımda DNS çözeltisi

eklenmiş ve renk reaksiyonunun olşması için 5 dakika süreyle kaynatma işlemi

gerçekleştirilmiştir (Ortamda mono ve disakkaridler nekadar yüksek düzeyde

bulunursa, kaynatma sonucu oluşan renk, açık sarıdan başlayarak koyu kırmızıya-

siyaha doğru kayma gösterir).

Hazırlanan örnekler UV-visible spektrofotometre kullanılarak 540 nm dalga

boyunda köre karşı okunarak absorbans değerleri elde edilir. En yüksek absorbans

değerinin elde edildiği sıcaklık derecesi enzimin en iyi çalıştığı (optimum aktivite

gösterdiği) değer olarak değerlendirilir. Diğer sıcaklık derecelerinden elde edilen

absorbans değerleri optimum absorbans değeriyle oranlanarak relatif enzim aktivitesi

bulunur (Aira ve ark., 1983; Srivastava, 1987; Burhan ve ark., 2003).

3.2.5.3. Enzimin Sıcaklık Stabilitesinin Saptanması

Kısmi saflaştırmaile elde edilen amiaz enziminin sıcaklık stabilitesinin (termal

stabilite) saptanması için 20-150ºC arasındaki sıcaklık değerlerinde 15, 30, 60 ve 120

dakikalık ön inkübasyon gerçekleştirilmiştir (sadece enzim kullanılarak). Ön

inkübasyon uygulamalarında farklı sürelerin seçilmesi ile (15-120 dakika) aynı

zamanda enzimin yarılanma ömrünün saptanması amaçlanmıştır.

Ön inkübasyon işleminden sonra 0.5 ml enzim ve 0.5 ml substrat (pH 12.5)

karışımı kalan enzim aktivitesinin saptanması için optimum aktivitenin gerçekleştiği

sıcaklık derecesinde 30 dakika süreyle inkübe edilmiştir.

İnkübasyon sonunda tüplere örnek hacmı kadar DNS ayıracı ilave edilerek renk

reaksiyonunun oluşması için 5 dakika süreyle kaynatma uygulanmıştır. Soğutulan

örnekler köre karşı UV-visible spektrofotometrede 540 nm dalga boyunda

okunmuştur.

Ön inkübasyon yapılmadan hazırlanmış enzim+substrat karışımı başlangıç

enzim aktivitesinin saptanması için optimum aktivitenin elde edildiği sıcalıkta analiz

36


edilmiş ve spektrofotometrede elde edilen değer 100 olarak (orijinal aktivte)

değerlendirlmiştir. Ön inkübasyon sonucu elde edilen değerler (kalan enzim

aktivtesi), orijinal aktivite ile karşılaştırılarak kalan relatif enzim aktivitesi

bulunmuştur (Aiba ve ark., 1983; Srivastava, 1987; Gessesse ve Gashe, 1997;

Mehrotta ve ark., 1999; Burhan ve ark. 2003).

3.2.5.4.Amilaz Enziminin pH Stabilitesinin Saptanması

Kısmi saflaştırma yöntemiyle izole edilen amilaz enziminin pH stabilitesinin

saptanması için alkali skalada yer alan pH değerleri seçilmiştir. Bu amaçla her pH

değeri için üç seri olacak şekilde 0.5’er ml enzim tüplere konularak 10000 rpm’de

çöktürülmüştür. Üstteki sıvı faz atıldıktan sonra tüplere pH 9.0, 10.0, 11.0 ve 12.0

değerlerine sahip çözelti eklenerek enzim süspansiyon haline getirilmiş ve 55ºC de

42 saat süreyle ön inkübasyon gerçekleştirilmiştir.

İnkübasyondan sonra her pH değerine sahip örneğin üzerine 0.5 l enzim

konulmuş ve optimum aktivitenin gerçekleştiği sıcaklıkta 30 dakika inkübasyon

yapılmıştır. İnkübasyon sonucunda tüplere örnekle eşit hacimde DNS ayıracı ilave

edilmiş ve renk reaksiyonunun olşması için 5 dakikasüreyle kaynatma işlemi

uygulanmıştır. Örnekler soğutulduktan sonra 540 nmdalga boyunda köre karşı

okuma yapılarak kalan enzim aktivtesi saptanmıştır. Kontrol deneyinden elde edilen

sonuç 100 olarak kabul edilmiş, farklı pH eğerlerinden elde edilen sonuçlarla

kıyaslanarak kalan relatif enzim aktivitesi saptanmıştır (Coral ve ark., 2002; Burhan

ve ark., 2003).

3.2.5.5.NaCl’ün Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi

Enzim 0.5 ml’lik hacimlerde tüplere konularak çöktürülmüş, üstteki sıvı faz

döküldükten sonra tüplere %3.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0 ve 20.0 ‘lik NaCL çzeltisinden

eklenerek 55ºC 60 dakika süreyle ön inkübasyon gerçekleştirilmiştir. İnkübasyondan

sonra tülere 0.5 ml substrat ilave edilmiş ve enzimin optimum aktivite gösterdiği

sıcaklıkta 30 dakika süreyle inkübasyon yapılmıştır. Örneklerin üzerine öneklerle eşit

hacimde DNS ayıracı ilave edilerek renk reaksiyonunun oluşması için 5 dakika

37


süreyle kaynatma yapılmıştır. Soğutulan örnekler 540 nmdalga boyunda öre karşı

okunarak absorbans değerleri elde edilmiştir. Kontrol örneğinden elde edilen

absorbans değeri 100 kabul edilerek diğer örneklerdeki kalan relatif enzim aktivitesi

saptanmıştır (Pomares ve ark., 2003).

3.2.5.6. Enzim Aktivitesi Üzerine İnhibitörlerin Etkisi

Stok enzim örneğinden her bir inhibitör için üç seri analiz yapılacak şekilde 0.5

er ml alınarak 10000 rpm’de çöktürülmüştür. Sıvı faz dökülerek eppendof tüpüne

(her tüp için ayrı ayrı olacak şekilde) 0.5 ml uygun konsantrasyonda inhibitör

maddeilave edilerek enzim süspansiyon haline getirilmiş ve 37ºC de 15 dakika

süreyle inkübasyon yapılmıştır. İnhibitör madde olarak 5mM EDTA, 5mM CaCl2,

3mM PMSF, %1v/v β-Merkaptoetanol, %1v/v SDS, %1v/v Triton X-100, 5mM Na-

Sülfide, 5mM NaCl, 5mM ZnCl2, 5mM 1,10-phenantroline ve 8M üre kullanılmıştır.

Ön inkübasyon işleminden sonra 0.5 ml enzim+0.5 ml optimum pH değerinde

hazırlanmış substrat karıştırılarak optimum aktivitenin elde edildiği sıcaklıkta 30

dakika süreyle inkübasyon gerçekleştirilmiştir. İnkübasyonda sonra tüplere örnekle

eşit hacımda DNS ayıracı ilave edilmiş ve renk reaksiyonunun gerçekleşmesi için 5

dakika kaynatma işlemi yapılmıştır.

Soğutulan örnekler 540 nm dalga boyunda köre karşı okuma yapılmıştır.

Başlangıç enzim aktivitesini saptamak için enzim ve substrat karışımı optimum

aktivitenin gerçekletiği sıcaklıkta 30 dakika inkübe edilerek başlangıç enzim

aktivitesi saptanmıştır. Başlangıç testinden elde edilen değer 100 olarak

değerlendirilip inhibitör denemeleri sonucunda elde edilen değerlerle kıyaslanarak

kalan relatifenzim aktivitesi saptanmıştır (Tsujıbo ve ark., 2000; Burhan ve ark.,

2003).

3.2.6. Protein Örneklerinin SDS-PAGE Jel’inde Analizi

Elde edilen enzim örneklerinin moleküler büyüklüklerinin saptanması amacı ile

aşağıda verilen oranlar kullanılarak, %10’luk homojen SDS-PAGE jeli hazırlanmış

ve örnekler analiz edilmiştir.

38


3.2.6.1. Nişastalı Ayırıcı Jel’in Hazırlanması (%10’luk)

1. 6.5 ml Sol A, 5 ml sol B, 1 ml nişasta (%3’lük) ve 7.4 ml distile su 50 ml’lik

cam bir şişe içerisine ilave edilerek moleküler oksijenin uzaklaştırılması amacı ile

vakum pompasıyla 5 dakika degaz işlemi yapılmıştır.

2. Karışıma 66 µl %10’luk AMPS çözeltisinden, 13 µl TEMED (N,N,N,,N,-

tetrametilen-etilendiamin) çözeltisinden ilave edilmiş ve şişe karıştırılmıştır.

3. Hazırlanan solüsyon bir enjektör yardımı ile 1’er mm boşluk sağlanmış cam

plaklar arasına dökülmüştür.

4. Jel yüzeyinin düzgün olması ve atmosferik oksijenin jele difüzyonunu engellemek amacı ile üst yüzey ince bir su tabakası ile kapatılmıştır.

5. Jelin polimerize olabilmesi için, oda sıcaklığında 30-60 dakika bekletilmiştir

(Bollag ve Edelstein, 1991; Coral ve ark., 2002; Burhan ve ark., 2003).

3.2.6.2. Dengeleme Jel’inin Hazırlanması

1 ml Sol A, 1.5 ml Sol C ve 3.5 ml distile su 20 ml’lik cam bir şişe içerisine

konmuş ve vakum pompası ile 5 dakika degaz işlemi yapılmıştır. Karışımın üzerine

20µl AMPS ve 5µl TEMED çözeltisinden ilave edilerek tüp birkaç kez

karıştırılmıştır. Hazırlanan karışım, ayırıcı jelin üzerine döküldükten sonra örnek

gözlerinin oluşturulması için üst taraftan tarak yerleştirilmiştir. Atmosferik oksijen

difüzyonunu önlemek amacıyla üst yüzey su ile kaplanmış ve oda sıcaklığında 30-60

dakika süreyle polimerizasyon gerçekletirilmiştir. Polimerizasyon işlemi

tamamlandıktan sonra tarak jelden çılarılmış ve oluşan gözlere örneklerin daha iyi

yerleşmesi ve gözlerin bozulmaması için 100 µl elektroforez tamponu

doldurulmuştur (Bollag ve Edelstein, 1991; Coral ve ark., 2002; Burhan ve ark.,

2003).

3.2.6.3. Örneklerin SDS-PAGE Jel’ine Yüklenmesi ve Yürütülmesi

Polimerize olmuş jel elektroforez tankına yerleştirilmiş ve yürütme tamponu

tanka doldurulmuştur.Örnek tamponu içerisinde çözülmüş olan enzim örnekleri 30

ve 40 µl olacak şekilde dengeleme jelinde oluşturulan gözlere konulmuştur.

39


Gözlerden birisine moleküler ağırlıkları bilinen (29000, 45000, 66000, 97400,

116000 ve 205000 dalton, SİGMA SDS-6H) markır proteini konmuştur.

Eleektroforezin başlangıcında jele 30 dakika süre ile 60 mA, daha sonra örnek boyası

jelin diğer ucuna ulaşıncaya kadar 30 mA akım uygulaması yapılmıştır (Coral ve

ark., 2002; Burhan ve ark., 2003).

3.2.6.4. SDS-PAGE Jel’inin Boyanması

Elektroforez uygulamasından sonra, jel cam plakalar arasından çıkartılarak

boyama solusyonuna konulmuştur. Ortalama 12 saat boyunca karıştırarak boyama

gerçekleştirilmiştir. Bu işlemden sonra jeldeki boyanın geri alınması için bir gün

destaining uygulaması yapılmıştır.

3.2.6.5.SDS-PAGE Jel’inin Renatürasyonu ve Zimogram Analizi

Boyanın geri alınması işleminden sonra SDS-PAGE jelinde enzim

aktivitesinin saptanması amacı ile renaturasyon işlemleri uygulanmıştır. Jel, solusyon

1 içerisinde 1 saat, solusyon 2 içerisinde 1 saat ve solusyon 3 içerisinde +4ºC de 1

gece bırakılarak pH dengelemesi ve SDS’nin jelden uzaklaştırılması

gerçekleştirilmiştir. Jel enzimin elde edildiği sıcaklıkta streç filmine sarılı olarak 4-5

saat inkübe edilerek renatürasyon işlemi yapılmıştır. Renatürasyondan sonra aktivite

zonlarının saptanması amacı ile jel iyod çözeltisine konularak 5 dakika boyama

işlemi gerçekleştirilmiştir (Coral ve ark., 2002; Burhan ve ark., 2003).

40

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Seçil TATAR

4. BULGULAR

4.1. Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu

Gaziantep ilinin 13 farklı bölgesinden toprak örnekleri alınmıştır. Topraklar

laboratuvar koşullarında 80ºC de 10 dakika süre ile ön işlemden geçirildikten sonra

tek koloni düşecek şekilde seri sulandırma yapılarak, pH’sı 9.5 olan jeloz besiyerine

ekilmişlerdir. 55ºC’lik ortamda bir gecelik inkübasyon sonucu koloni morfolojileri

bir birinden farklı olan toplam 120 suş stok kültür ortamına alınmıştır. Seçilen 68

bakteri suşu gram boyama ve diğer biyokimyasal analizleri yapılarak Bacillus sp.

şeklinde tanımlanmışlardır. İzole edilen bakterilerin enzimatik yeteneklerinin

saptanması amacıyla gerçekleştirilen analizlerde ilk izolasyon sıcaklığı 55˚C, pH ise

9.5 olarak seçilmiştir. Bu parametrelere göre izolasyonu yapılan bütün

organizmaların termofil ve alkaline özelliğe sahip oldukları saptanmıştır. İzolasyonu

ve tanımlanmaları tamamlanan 68 Bacillus sp. suşu farklı sıcaklık ve pH

değerlerindeki üreme ve enzim sentezleme yeteneklerinin saptanması için katı

besiyerlerine çizgi yöntemine göre ekilerek analiz edilmişlerdir. Elde edilen sonuçlar

çizelge 2 de sayısal, şekil 1 de grafiksel olarak verilmiştir.

41


Çizelge 4.1.2: Bacillus sp. Bakterilerinin Farklı pH Değerlerine Sahip Nişastalı M9 Üreme Ortamı ve 55˚C’de Üreme Gösteren ve Enzim Sentezleyen Suşların % Dağılımı

Bakteri Üreme pH’sı

İnkübasyon sıcaklığı

Toplam bakteri

Üreyen bakteri sayısı

Üreyen bakteri %

Amilaz (+) bakteri sayısı

Amilaz (+) % *

Bacillus sp. 7.0 55˚C 68 49 72.1 45 92.0

Bacillus sp. 7.5 55˚C 68 49 72.1 44 90.0

Bacillus sp. 8.0 55˚C 68 49 72.1 45 92.0

Bacillus sp. 8.5 55˚C 68 53 78.0 50 94.0

Bacillus sp. 9.0 55˚C 68 52 76.5 45 86.5

Bacillus sp. 9.5 55˚C 68 52 76.5 40 77.0

Bacillus sp. 10.0 55˚C 68 52 76.5 40 77.0

Bacillus sp. 10.5 55˚C 68 52 76.5 37 71.0

Bacillus sp. 11.0 55˚C 68 52 76.5 36 69.0

Bacillus sp. 11.5 55˚C 68 52 76.5 22 42.0

Bacillus sp. 12.0 55˚C 68 48 70.6 1 21.0

Bacillus sp. 12.5 55˚C 68 17 25.0 0 00.0

*:Üreyen bakteriler arasındaki amilaz pozitif suşların % dağılımı

Üretme pH değeri olarak sırasıyla 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0,

11.5, 12.0 ve 12.5 seçilirken üreme sıcaklığı 55˚C olarak sabit tutulmuştur. Analiz

sonuçlarına göre (Çizelge 2);

pH 7.0 de üreyen bakteri sayısı 49 iken 45 bakteri suşunun amilaz enzimi

ürettiği saptanmıştır. Üreyen bakterilere göre amilaz pozitif suşların oranı %92

düzeyindedir. pH 7.5 de toplam 49 bakteri üremiştir. Üreyen bakterilerin toplam

bakteriler içerisindeki oranı %72.1’dir. Üreyen suşların 44’ü amilaz enzimi üretmiş

olup, amilaz pozitif suşların oranı %90 olarak saptanmıştır. pH 8.0 de yapılan

analizlerde üreyen suş sayısı pH 7.0 e 7.5 ile aynı sayı ve orandadır. pH 8.5 de üreme

53 adetle en yüksek sayıya ulaşmıştır. Bu suşlardan %94’ünün amilaz pozitif özellik

gösterdiği saptanmıştır. pH 9.0 da 52 suş ürerken (%76.5), bunlar içerisinde 45 suş

(%86.5) amilaz pozitif özellik göstermiştir.

İlk izolasyonunda yapıldığı pH 9.5 de üreyen toplam suş sayısı 52 (%76.5),

amilaz pozitif suşların sayısı 40 (%77) düzeyinde bulunmuştur. pH 10.0 elde edilen

sonuçlar gerek üreyen suş sayısı ve gerekse amilaz pozitif suş sayısı açısından pH

9.5 ile tam bir uyum içerisindedir. pH 10.5 de üreyen suşların sayısı 52 (%76.5) iken

42


amilaz pozitif suşların sayısı 37 (%71) olmuştur. pH 11.5 de üreyen suş sayısı pH

9.0-10.5 aralığında üreyenlerle aynı olmakla birlikte amilaz pozitif suşların sayısı 22

(%42)’ye düşmüştür. pH 12.0 de üreyen suşların sayısı 48 (%70.6) iken amilaz

pozitif suşların sayısı 1 (%21)’e düşmüştür. pH 12.5 de toplam 17 (%25) suş üremesi

gerçekleşmiş fakat hiç amilaz pozitif suş saptanmamıştır.

0102030405060708090

100

7 7,5 8 8,5 7 9,5 10 10,5 11 11,5 12 12,5

Katı Besiyerinde Ezim Sentezinin Gerçekleştiği pH değerleri

Katı b

esiy

erin

de 5

5 de

eld

e ed

ilen

enzi

m s

ente

zi (%

)

Şekil 4.1.1. Katı besiyerinde enzim sentezinin gerçekleştiği pH değerleri

Bütün pH değerleri göz önüne alındığında 7.0-11.0 aralığında ortalama 51.1

suş üremesi gerçekleşirken amilaz pozitif oranı %83.2 olarak bulunmuştur. En

yüksek amilaz enzimi üretme oranı %94.0 ile pH 8.5 de elde edilmiştir. PH 8.5-11.5

aralığında üreyen ortalama suş sayısı 52 dir. Bu aralıktaki enzim sentezleme oranı ise

yaklaşık %75 düzeyindedir. PH 11.5-12.5 aralığında ve 55˚C de ortalama 32 suşun

üremesi (yaklaşık %57) izolasyonu yapılan bakteri suşlarının ekstrem alkalofilik ve

termofilik oluğunu göstermektedir. Aynı pH aralığında elde edilen amilaz pozitiflik

oranı ise %21 düzeyinde gerçekleşmiştir.

Çalışmamızda enzim üretimi amacıyla seçtiğimiz ve SB-28 olarak

adlandırdığımız Bacillus sp. suşu farklı pH değerlerinde oldukça iyi üremiştir. pH

7.0 de 30 mm koloni 15 mm aktivite zon çapı, pH 7.5 de 23 mm koloi 17 mm

aktivite zon çapı, pH 8.0 de 10 mm koloni 19 mm aktivite zon çapı, pH 8.5 de 10

mm koloni 20 mm aktivite zon çapı, pH 9.0 da 10mm koloni 26 mm aktivitezonçapı,

pH 9.5 de 10 mm koloni 30 mm aktivite zon çapı, pH 10.0 da 9 mm koloni 25

43


mm aktivite zon çapı, pH 10.5 de 8 mm koloni 20 mm aktivite zon çapı, pH 11.0 de

8 mm koloni 12 mm aktivite zon çapı, pH 11.5 de 7 mm koloni 10 mm aktivite zon

çapı, pH 12.0 de 5 mm koloni 5 mm aktivite zon çapı elde edilmiştir.

Katı besiyerinde yapılan çalışmalar sonucunda en yüksek enzim sentezinin

55°C ve pH 9.0-10.0 aralığında gerçekleştiği, pH 9.5 de ise maksimum düzeye

ulaştığı görülmektedir. Literatürde maksimum amilaz sentezinin pH 10.0 da

gerçekleştiğini amilaz sentezleme pH aralığının ise 5.0-12.0 olduğunu belirtmişlerdir

(Saxena ve ark., 2007).

Çalışmalarımızda izolasyonuyapılan organizmalarımızın büyük çoğunluğu ve

SB-28 suşunun maksimum enzim sentezleme pH değeri ve aralığının literatürle tam

bir uygunluk gösterdiği görülmektedir.

İzole edilen suşlardan 13, 14, 15, 16, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35, 38, 42, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, numaralı örnekler pH 7.0’ de 20 mm’nin üzerinde

koloni çapı oluşturacak şekilde üremişlerdir. Suşlardan 4, 16, 24, 25, 26, 27, 30, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, ve 54 numaralı örnekler pH 7.5’te 20 mm’nin

üzerinde koloni çapı meydana getirerek üremişlerdir. Analiz edilen örneklerden 13,

14, 15, 16, 17, 18, 25, 30, 43, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 59 ve 60 numaralı

suşlar pH 8.0’de 20 mm’den fazla koloni çapı oluşturarak üremişlerdir. pH 8.5’de 3,

4, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 25, 26, 27, 29, 30, 33, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 45, 50, 51,

63 numaralı suşların 20 mm’den daha geniş koloni oluşturdukları saptanmıştır. pH

9.0 da analiz edilen örneklerden 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 26, 33-48 ve 58 numaralı

suşların 20 mm’den geniş koloni meydana getirdikleri gözlenmiştir. pH 9.5’de analiz

edilen örneklerden hiç birisi 20 mm’den daha geniş koloni oluşturmazken 7, 12, 22,

23, 24, 25, 26, 41, 42, 49, 50, 52, 53, 54, 61, 63, 64, 66, 67, 68 numaralı örnekler 10-

15 mm aralığında koloni oluşturarak üremişlerdir. pH 10.0 da analiz edilen suşlar

arasında 10 mm’den daha geniş koloni oluşturan örnekler 7, 12, 21, 22, 53, 59, 63,

67 ve 10 numaralı suşlardır. Diğer örneklerin tamamı 10 mm’den daha küçük koloni

oluşturarak üremişlerdir. pH 10.5’te analiz edilen örnekler arasında 12, 16, 17, 26,

27,34, 53, 56, 58, 59, 60 ve 64 numaralı suşlar 10 mm’den geniş koloni oluşturarak

üremişlerdir. pH 11.0 de analiz edilen örneklerden 7, 12, 21, 24, 51 ve 58 numaralı

suşlar 10 mm’den daha geniş koloni oluşturarak üremişlerdir. pH 11.5 ve 12’de 7,

44


10, 12, 58, 66 numaralı suşlar, pH 12.5’de ise sadece 10 numaralı suş 10 mm’den

daha geniş koloni oluşturarak üremiştir. Alkalifil tanımı, pH 9 ve yukarısında

optimal üreme gösteren veya iyi üreyen, fakat pH 6.5’in altında veya bu değerlerde

üreyemeyen yada çok az üreyen organizmalar için kullanılmaktadır (Horikoshi,

1999).

Analizi yapılan toplam 68 Bacillus sp. suşu pH’sı 9.5 olan ve içerisinde nişasta

bulunan M9 minimal besiyerinde farklı sıcaklık ve sabit pH değeri kullanılarak

bakteri üremesi ve enzim sentezi ile ilgili test edilmişlerdir. Yapılan analizleri

sonucunda elde edilen bulgular çizelge 3 de sayısal, şekil 2 de grafiksel olarak

verilmiştir.

Çizelge 4.1.3: Bacillus sp. Bakterilerinin pH 9.5 Değerine Sahip Nişastalı M9

Üreme Ortamı ve Farklı Sıcaklık Değerlerinde Üreme Gösteren ve Enzim Sentezleyen Suşların % Dağılımı

Bakteri Üreme pH’sı


Toplam bakteri

Üreyen bakteri sayısı

Üreyen bakteri %

Amilaz (+) bakteri sayısı

Amilaz (+) %*

Bacillus sp 9.5 20˚C 68 33 48.5 16 48.5

Bacillus sp 9.5 25˚C 68 34 50.0 29 85.3

Bacillus sp 9.5 37˚C 68 45 66.2 40 88.8

Bacillus sp 9.5 55˚C 68 52 76.5 40 77.0

Bacillus sp 9.5 60˚C 68 57 84.0 00 00.0

*:Üreyen bakteriler arasındaki amilaz pozitif suşların % dağılımı

Analizler sırasında üreme pH değeri, izolasyon değeri olarak seçilen pH 9.5’te

sabitlenirken, üretme sıcaklık değerleri 20, 25, 37, 55 ve 60˚C olarak belirlenmiştir.

Üretme sıcaklığının 20˚C’de tutulduğu analizlerde toplam 33 (4.5) suş üremiş

bunlardan 16’sı (%48.5) amilaz pozitif özellik göstermiştir. Sıcaklığın 25˚C olarak

seçildiği analizlerde toplam 34 (%50) suş ürerken bunların 29’unun amilaz enzimi

üretme yeteneğinde oldukları saptanmıştır (%85.3). İnkübasyon sıcaklığının 37˚C

olarak seçildiği analizlerde 45 (%66.2) bakteri suşu ürerken bunlar arasındaki amilaz

pozitif suşların sayısı 40 (%88.8) olarak saptanmıştır.

İnkübasyon sıcaklığı 55˚C’ye yükseltildiğinde toplam 52 (%76.5) suşun ürediği

ve bunlardan 40 (%77) suşun amilaz enzimi sentezledikleri saptanmıştır. İnkübasyon

45


sıcaklığı 60˚C’ye yükseltildiğinde toplam 57 (%84) suş üremiş fakat hiçbir suşta

amilaz enzim sentezinin gerçekleşmediği saptanmıştır.

pH 9.5 ve 55-60˚C aralığında yaklaşık %80 düzeyinde üreme gerçekleşmesi

izole edilen suşların termofil özellikte olduklarının bir göstergesidir (Lin ve ark.,

1998; Burhan ve ark., 2003; Saxena ve ark., 2007).

0102030405060708090

100

20 25 37 55 60

Bakterilerin üretildikleri sıcaklık değerleri

Katı

besi

yerin

de 5

5 ve

pH

9.5

de

enzi

m s

ente

zi (%

)

Şekil 4.1. 2. Bakterilerin üretildikleri sıcaklık değerleri

İzolasyonu yapılan 68 suşun optimum enzim üretimini pH 9.5 de yaklaşık %89

ile 37˚C de gerçekleştirdiği görülmektedir. Bununla birlikte suşların genel

değerlendirmesi sonucunda 25-55˚C aralığında yaklaşık %84 oranında enzim

üretiminin gerçekleştiği görülmektedir. Saxena ve ark., Bacillus sp. PN5 suşundan

izole edilen amylase enziminin 30-70˚C aralığında sentezlendiğini, optimum enzim

üretiminin 60˚C gerçekleştiğini, bununla birlikte 60˚C’nin üstünde enzim üretiminin

düştüğünü belirtmişlerdir (Saxena ve ar., 2007). Literatürde termofilik ve alkalifilik

Bacillus sp. TS-23 suşu ile yapılan çalışmada izole edilen amilaz enziminin

sentezlenmesiyle ilgili başlangıç pH değerinin 8.5, optimum enzim sentezleme

sıcaklığının ise 55°C olduğu belirtilmektedir (Lin ve ark., 1998). SB-28 suşu ile

yapılan çalışmalarda optimum enzim sentezinin 55˚C de gerçekleştiğinin bulunması

Lin ve arkadaşlarının bulguları ile tam bir uyum göstermektedir.

46


Amilaz enzimi üretmek amacı ile kullandığımız SB-28 suşu dikkate

alındığında ise bakteri üremesinin 20-60˚C aralığında, enzim sentezinin 20-55˚C ler

aralığında gerçekleştiği, optimum enzim üretiminin 55˚C de (7 mm koloni, 30 mm

aktivite zon çapı) meydana geldiği görülmektedir. Bu veriler enzim üretimi için

seçilen suşun ve sentezlenen enzimin termofil ve alkalofil olduğunu göstermektedir.

Katı besiyerinde farklı pH değerleri ve 55˚C de üreyen bakteri suşları ve amilaz

aktiviteleri şekil 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ve 11 da görülmektedir.

Şekil 4.1.3: Bakteri üremesi 55° C, pH 7.5 de gerçekleşen enzim sentezine ait

görünüm.

47


Şekil 4.1.4: Bakteri üremesi 55°C, pH 8 de gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm.

Şekil 4.1.5: Bakteri üremesi 55°C, pH 8.5 de gerçekleşen enzim sentezine ait

görünüm.

48


Şekil 4.1.6: Bakteri üremesi 55°C, pH 9 da gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm.


görünüm.

49


Şekil 4.1.8: Bakteri üremesi 55°C, pH 10 da gerçekleşen enzim sentezine ait

görünüm.


görünüm.

50


Şekil 4.1.10: Bakteri üremesi 55°C, pH 11 de gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm.

Şekil 4.1.11: Bakteri üremesi 55°C, pH 11.5 de gerçekleşen enzim sentezine ait görünüm.

51


4.2. Enziminin Optimum pH Aralığına Ait Bulgular

SB-28 suşuna ait amilaz enziminin pH optimumunun saptanması amacıyla Na-

fosfat (pH 6-8), Glisin-NaOH (pH 8.5-10.5) ve Borax-NaOH (pH 11-13)’dan oluşan

üç farklı tampon sistemi kullanılmıştır. Aktivite analizleri sonunda elde edilen veriler

çizelge 4 de sayısal, şekil 12 de grafiksel olarak verilmişlerdir.

Çizelge 4.2. 4: SB-28 amilaz enziminin pH optimum değerleri

pH İnk.sıc İnk.sür AB1 AB2 ABO % Aktivite 6.0 55˚C 30 dk 1.31 1.56 1.43 53.75 6.5 55˚C 30 dk 1.55 1.84 1.69 63.53 7.0 55˚C 30 dk 1.93 2.31 2.12 80.00 7.5 55˚C 30 dk 2.24 2.46 2.35 88.34 8.0 55˚C 30 dk 2.35 2.50 2.42 91.00 8.5 55˚C 30 dk 2.16 2.41 2.28 85,71 9.0 55˚C 30 dk 2.1 2.45 2.27 85.33 9.5 55˚C 30 dk 2.30 2.2 2.25 84.60

10.0 55˚C 30 dk 2.30 2.24 2.27 85.33 10.5 55˚C 30 dk 2.37 2.25 2.31 86.84 11.0 55˚C 30 dk 2.28 2.40 2.34 88.00 11.5 55˚C 30 dk 2.35 2.34 2.34 88.00 12.0 55˚C 30 dk 2.57 2.52 2.54 95.50 12.5 55˚C 30 dk 2.68 2.63 2.66 100.00 13.0 55˚C 30 dk 2.46 2.38 2.42 91.00

SB-28amilaz enziminin optimum aktivite gösterdiği pH değeri 12.5 olarak

saptanmıştır. Enzim PH 6.0-8.0 aralığında ortalama %71.15 aktiviteye sahipken, pH

8.0 de aktivite %91 düzeyine yükselerek pik oluşturmuştur. Diğer pH değerlerinden

elde edilen verilere göre pH 8.5-12.0 aralığında aktivite ortalama %86.25

düzeylerine ulaşmıştır. pH 12.0 de enzim aktivitesi hızla yükselerek %95.50

değerine çıkarken, pH 12.5 de %100 ile optimum değer elde edilmiştir. Bu pH değeri

enzimimizin ikinci ve en yüksek pik değerini oluşturmaktadır. pH 13.0 de ise

aktivite tekrar %91’e düşmüştür. pH 12.0-13.0 aralığında ortalama %95.50

aktivitenin gerçekleştiği gözlenmiştir.

Bütün pH değerleri dikkate alındığında ise pH 7-13 aralığında 55˚C 30

dakikalık inkübasyon sonunda ortalama %88.43 aktivite saptanmıştır. pH optimumu

ile ilgili yapılan çalışmalar sonucunda pH 8.0 ve 12.5 de iki pik değerinin elde

52


edilmesi amilaz enziminin iki alt birimden oluştuğunu düşündürmektedir. Bu sonuç

SDS-PAGE analizinde iki protein bandının görülmesiyle uyumluluk göstermektedir.

Optimum pH

0

20

40

60

80

100

120

6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 11,5 12 12,5 13

pH Değerleri

Rel

atif

enz

im a

ktiv

itesi

(%

Şekil 4.2.12: İzolasyonu pH 9.5’de Yapılan Amilaz Enziminin Rölatif Aktivite

Değerleri

SB-28 suşuna ait amilaz enziminin optimum pH 12.5 de aktivite göstermesi

nedeniyle enzim ekstrem alkaline özelliktedir. Değişik araştırmacılar yapmış

oldukları farklı çalışmalarda alkaline özellik gösteren amilaz enzimi izole

etmişlerdir. Horikoshi, izole ettiği alkaline amilaz enziminin pH 10.0-10.5 aralığında

çok aktif olduğunu, pH 9.-11.5 aralığında ise yaklaşık %50 aktivite gösterdiğini

belirtmiştir (Horikoshi, 1999).

McTigue ve ark. Bacillus halodurans A-59 (ATCC 21591), Bacillus sp. NCIB

11203 suşu ve Bacillus sp. IMD370 suşlarının üçünden de amilaz enzimi izolasyonu

gerçekleştirmişler ve optimum aktivite görülen pH değerinin 10.0 olduğunu

belirtmişlerdir (McTigue ve ark., 1995). Burhan ve ark., bacillus sp. ANT-6 amilaz

enziminin optimum aktivitesini 10.5 de gösterdiğini pH 9.5-13 aralığında ise yüksek

düzeyde aktiviteye sahip olduğunu belirtmişlerdir (Burhan ve ark., 2003). SB-28

amilaz enzimi, Burhan ve ark.,’nın bulguları ile tam bir uyum içindedir. Değişik

araştırmacılar α-amylase enziminin geniş bir pH aralığında stabil olduğunu

53


belirtmişlerdir (Fogarty ve Kelly, 1979; Vihinen ve Mantsala, 1989; Hamilton ve

ark., 1999; Saito, 1973; Khoo ve ark., 1994).

Çalışmamızda izole ettiğimiz amilaz enziminin optimum aktivitesini pH

12.5’de göstermesi ve pH 8.5-12.0 aralığında aktivitenin ortalama %86.25

düzeylerinde gerçekleşmesi, SB-28 amilaz enziminin Horikoshi ile McTigue ve

arkadaşlarının sonuçlarından çok daha yüksek alkalifilik özellik gösterdiğini ortaya

koymaktadır.

4.3. Enzimin Sıcaklık Optimumuna Ait Bulgular

SB-28 amilaz enziminin en yüksek aktiviteyi gösterdiği sıcaklık değerinin

saptanması amacı ile 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 1300, 140, 150

ve160˚C aralığında aktivite analizleri yapılmıştır. Analizler için kullanılan substrat

en yüksek aktivitenin görüldüğü pH 12.5 değerine sahiptir. Aktivite tayininde

inkübasyon süresi 30 dakika olarak seçilmiştir. Analiz sonucu elde edilen veriler

çizelge 5 de sayısal olarak, şekil 13 de ise grafiksel olarak verilmiştir.

Çizelge 4.3.5: SB-28 Amilaz Enziminin Sıcaklık Optimumuna Ait Bulgular

İnk.Sıc İnk.Sür. İnk. PH’sı AB1 AB2 ABO Kalan aktivite (%)

30˚C 30 dk 12.5 2.09 2.17 2.13 44.93 40˚C 30 dk 12.5 2.15 2.19 2.17 45.80 50˚C 30 dk 12.5 2.10 2.18 2.14 45.14 60˚C 30 dk 12.5 2.08 2.18 2.13 44.93 70˚C 30 dk 12.5 2.15 2.09 2.12 44.72 80˚C 30 dk 12.5 2.11 2.28 2.19 46.20 90˚C 30 dk 12.5 2.25 2.27 2.26 47.70

100˚C 30 dk 12.5 2.30 2.35 2.32 49.10 110˚C 30 dk 12.5 2.60 2.55 2.57 54.21 120˚C 30 dk 12.5 3.46 3.50 3.48 73.41 130˚C 30 dk 12.5 4.10 4.54 4.32 91.13 140˚C 30 dk 12.5 4.76 4.72 4.74 100.00 150˚C 30 dk 12.5 4.38 4.40 4.39 92.61 160˚C 30 dk 12.5 4.08 4.12 4.10 86.50

54


Çalışmalar sonucunda elde edilen verilere göre SB-28 suşuna ait amilaz

enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değeri 140˚C olarak bulunmuştur.

Enzim 30 ile 100˚C aralığında ortalama %46.06 düzeyinde aktivite gösterirken,

aktivitede herhangi bir dalgalanma meydana gelmemiştir.

Buna karşılık 110˚C de %54.21, 120˚C de %73.41 ve 130˚C de %91.13

düzeyinde aktivite değerleri elde edilmiştir. Çizelgeden de görülebileceği gibi

özellikle 110˚C den başlayan bir aktivite artışı söz konusudur. 110-130˚C arasındaki

aktivite artışı 30-100˚C arsındaki değerler dikkate alındığında yaklaşık %50.54

düzeyindedir.

Enzim optimum aktivitesini 140˚C de gösterirken 150˚C de %92.61 ve160˚C

de %86.50 aktivite elde edilmiştir. Optimum aktivitenin gözlendiği 140˚C ile

karşılaştırıldığı zaman 160˚C de yaklaşık %13.5 düzeyinde aktivite düşüşü söz

kunusudur. Enzim optimum aktivitesini 140˚C de göstermekle birlikte 120˚C ile

160˚C aralığında ortalama %88.73 rölatif aktiviteye sahiptir. Bu sonuçlar SB-28

amilaz enziminin ultratermofil bir özellikte olduğunu düşündürmektedir. Konsoula

ve Kyriakides, Bacillus sp. suşundan izole ettikleri amilaz enziminin optimum

aktivitesini 135˚C de gösterdiğinin belirtmişler, 160˚C de ise yaklaşık %70 aktivite

saptamışlardır (Konsoula ve Kyriakides., 2004). Çalışmamızda izole ettiğimiz enzim

150˚C de yaklaşık %86.5 aktiviteye sahiptir. Gerek optimum aktivite sıcaklığı ve

gerekse150˚C de elde edilen aktivite değeri literatür verilerinden çok daha yüksektir.

Bir çok araştırıcı yüksek sıcaklıkta aktivite gösteren amilaz enzimi izolasyonu

gerçekleştirmişlerdir. Goyal ve ark., ( 2005) 70˚C, Saxena ve ark., (2007) 90˚C,

Burhan ve ak., (2003) 80˚C, ve Mamo ve Gessesse, (1999) 80˚C’de optimum

aktivite gösteren bakteriyel amilaz enzimi izolasyonu gerçekleştirdiklerini

belirtmişlerdir. Goyal ve ark. (2005), izolasyonunu gerçekleştirdikleri amilaz

enziminin 50-100ºC aralığında aktiviteye sahip olduğunu, optimum aktivite

sıcaklığının ise 70ºC olduğunu belirtmişlerdir. SB-28 Bacillus sp. suşundan izole

edilen amilaz enzimi optimum aktivitesini 140˚C de gösterirken, şu ana kadar

literatürlerde belirtilen enzimler içerisinde en yüksek aktivite sıcaklığına sahiptir.

55


SB-28 Amilaz Enziminin Optimum aktivite sıcaklığı

0

20

40

60

80

100

120

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160


Rel

ativ

e en

zim

akt

ivite

si (%

)

Şekil 4.3.13: Elde Edilen Amilaz Enziminin Optimum Sıcaklık Grafiği (%)

SB-28 suşunun optimum aktivite analizi DNS yöntemine göre yapılmıştır.

Farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen inkübasyon işleminden sonra reaksiyonun

durdurulması ve renk reaksiyonunun oluşması için tüplere DNA ayıracı eklenmiştir.

Kaynar su içerisinde 5 dakikalık kaynatma işleminden sonra tüplerde oluşan renk

reaksiyonları şekil 14 de görülmektedir. Ortaya çıkan rengin yoğunluğu aktivite

sonucu oluşan ürünün miktarıyla doğru orantılı olarak değişmektedir. Açık renklerde

daha az ürün açığa çıkarken koyu renk daha fazla ürün açığa çıktığını

göstermektedir.

56


Şekil. 4.3.14: DNS yöntemiyle gerekleştirilen amilaz enzim aktivitesi (30-

150˚C). Optimum aktivite 140˚C de gerçekleşmiştir.

4.4. Amilaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Bulgular

Termal stabilitenin saptanması için yapılan çalışmalarda aynı zamanda enzimin

yarılanma ömrünün bulunması amaçlandığı için ön inkübasyon süresi olarak 15, 30,

60 ve 120 dakikalık süreler kullanılmıştır. Bütün inkübasyon çalışmalarında ön

inübasyon sıcaklık aralığı 40-150˚C olarak seçilmiş ve kalan enzim aktivitesinin

saptanması amacı ile inkübasyon 140˚C de gerçekleştirilmiştir. Ön inkübasyon

amacıyla 15 dakikalık sürenin seçildiği çalışma sonucunda elde edilen veriler çizelge

6 da sayısal, şekil 15 de ise grafiksel olarak verilmiştir.

57


Çizelge 4.4. 6: SB-28 Suşuna Ait Termal Stabilite Sonuçları (15 dk.) Ön ink.sıc Ön

ink.sür İnk. Sıc İnk. Sür İnk.

PH AB1 AB2 ABO Kalan

aktivite (%)Kontrol 140˚C 30 dk 12.5 1.67 1.70 1.68 100.00

40˚C 15 dk 140˚C 30 dk 12.5 1.71 1.65 1.68 100.00 50˚C 15 dk 140˚C 30 dk 12.5 1.71 1.64 1.67 99.40 60˚C 15 dk 140˚C 30 dk 12.5 1.64 1.64 1.64 97.32 70˚C 15 dk 140˚C 30 dk 12.5 1.64 1.66 1.65 97.92 80˚C 15 dk 140˚C 30 dk 12.5 1.58 1.66 1.62 96.14 90˚C 15 dk 140˚C 30 dk 12.5 1.60 1.62 1.61 95.54


İnkübasyon işlemleri sonunda 40˚C de %100, 50˚C de %99.40, 60˚C de

%97.32, 70˚C de %97.32, 80˚C de %96.14, 90˚C de %95.54, 100˚C de %93.0,

110˚C de %96.2 kalan enzim aktivitesi elde edilmiştir. Bu sıcaklık aralığında elde

edilen ortalama aktivite değeri ise yaklaşık %98.0 olarak bulunmuştur.

Ön inkübasyon sıcaklığı 120˚C’ye yükseltildiğinde kalan enzim aktivitesi

%103.3, 130˚C de %106, 140˚C de %147.1 değerine ulaşmıştır. Sıcaklık 150˚C ye

yükseltildiğinde ise kalan enzim aktivitesi %106.0 düzeylerine hızlı bir düşüş

göstermiştir.

Ön inkübasyon sıcaklığının130˚C’den 140˚C’ye yükselmesi sırasında kalan

enzim aktivitesinde yaklaşık %30’luk bir artış meydana gelmiştir.

Ön inkübasyon sıcaklığının 140˚C’den 150˚C’ye yükseltilmesi sırasında ise bu

kez kalan enzim aktivitesinin yaklaşık %30 düştüğü görülmüştür.

58


Termal Stabilite (Ön İnkübasyon Süresi 15 Dakika)

0

50

100

150

K 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

Ön İnkübasyon Sıcaklığı

Kala

n En

zim

Akt

ivite

si (%

Şekil 4.4.15: Elde Edilen Amilaz Enziminin Termal Stabilite Grafiği (%) 15 dk.

SB-28 amilaz enziminin termal stabilitesinin saptanması amacıyla ön

inkübasyon süresi olarak 30 dakikanın seçildiği analizler sonucunda elde edilen

veriler çizelge 7 de sayısal, şekil 16 da ise grafiksel olarak gösterilmiştir.

Çizelge 4.4.7: SB-28 amilaz enzimi termal stabilitesine ait bulgular (30 dk.)

Ön ink. sıc

Ö ink. sür

İnk. Sıc İnk.Sür İnk.pH AB1 AB2 ABO Kalan aktivite(%)

Kontrol 140˚C 30 dk 12.5 1.53 1.38 1.45 100.00 40˚C 30 dk 140˚C 30 dk 12.5 1.42 1.45 1.43 99.00 50˚C 30 dk 140˚C 30 dk 12.5 1.44 1.43 1.43 99.00 60˚C 30 dk 140˚C 30 dk 12.5 1.44 1.35 1.39 96.00 70˚C 30 dk 140˚C 30 dk 12.5 1.35 1.41 1.38 95.00 80˚C 30 dk 140˚C 30 dk 12.5 1.35 1.36 1.35 93.10 90˚C 30 dk 140˚C 30 dk 12.5 1.37 1.36 1.36 94.00


Ön ikübasyon süresi olarak 30 dakikanın uygulandığı termal stabilite

çalışmaları sonucunda 40˚C de %99.0, 50˚C de %99.0, 60˚C de %96.0, 70˚C de

59


%95.0, 80˚C de %93.1, 90˚C de %94.0, 100˚C de %92.1 kalan aktivite değeri elde

edilmiştir.

Yapılan değerlendirmeler sonucunda 40-100˚C aralığındaki kalan enzim

aktivitesi ortalama %95.5 olarak gerçekleşmiştir. Bu sıcaklık aralıklarında oldukça

stabil bir davranış söz konusudur.

Ön inkübasyon sıcaklığı 110˚C ye yükseltildiğinde kalan enzim aktivitesi

%101.4, 120˚C de 103.4, 130˚C de %111.3 olarak ölçülmüştür. Ön inkübasyon

sıcaklığı 140˚C ye yükseltildiğinde ise 130˚C ye göre yaklaşık %50’lik bir aktivite

artışı gerçekleşmiş ve kalan enzim aktivitesi değeri %222.0 değerine ulaşmıştır.

Ön inkübasyon sıcaklığı 150˚C ye yükseltildiğinde ise kalan enzim

aktivitesinin 140˚C ye göre yaklaşık %53.0 azalarak %104.0 değerine düştüğü

saptanmıştır.


0

50

100

150

200

250

K 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150


Kal

an E

nzim

Akt

ivite

si (

%)


60



inkübasyon süresi olarak 60 dakikanın seçilmesi sonucu elde edilen veriler çizelge 8

de sayısal, şekil 17 de ise grafiksel olarak gösterilmiştir.

Çizelge 4.4.8: SB-28 Amilaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Bulgular (60 dk)

Ön

İnk.Sıc Ön.İnk sür.

İnk. Sıc. İnk. pH İnk.sür AB1 AB2 ABO Kalan aktivite (%)

Kontrol 140˚C 12.5 30 dk 1.47 1.43 1.45 100.00 40˚C 60 dk 140˚C 12.5 30 dk 1.39 1.41 1.40 97.00 50˚C 60 dk 140˚C 12.5 30 dk 1.39 1.32 1.35 94.50 60˚C 60 dk 140˚C 12.5 30 dk 1.38 1.34 1.36 94.00 70˚C 60 dk 140˚C 12.5 30 dk 1.32 1.42 1.37 93.10 80˚C 60 dk 140˚C 12.5 30 dk 1.34 1.30 1.32 91.03 90˚C 60 dk 140˚C 12.5 30 dk 1.35 1.31 1.33 92.00

100˚C 60 dk 140˚C 12.5 30 dk 1.41 1.41 1.41 97.30 110˚C 60 dk 140˚C 12.5 30 dk 1.49 1.45 1.47 101.40 120˚C 60 dk 140˚C 12.5 30 dk 1.57 1.43 1.50 103.44 130˚C 60 dk 140˚C 12.5 30 dk 3.30 3.36 3.33 230.00 140˚C 60 dk 140˚C 12.5 30 dk 4.62 4.50 4.56 314.50 150˚C 60 dk 140˚C 12.5 30 dk 1.40 1.51 1.45 100.40

Ön inkübasyon süresinin 60 dakika olarak uygulandığı çalışmalar sonunda, 15

ve 30 dakikalık uygulamalarda 40-100˚C aralığında gerçekleşen stabil (yaklaşık

%94.13) aktivite aynı şekilde devam etmiştir.

Ön inkübasyon sıcaklığı olarak seçilen değerlerde yapılan aktivite tayinleri

sonucu 40˚C de %97.0, 50˚C de %94.5, 60˚C de %94.0, 70˚C de %93.1, 80˚C de

%91.0, 9˚C de %92 ve 100˚C de %97.3 kalan enzim aktivitesi saptanmıştır.

Ortam sıcaklığı 110 dereceye yükseltildiğinde %101.4, 120˚C ye

yükseltildiğinde %103.4 aktivite değeri elde edilmiştir. Enzim aktivite ön

inkübasyon sıcaklığı 100˚C’nin üzerinde olduğu halde ortalama %102.4 olarak

stabilliğini korumuştur.

Ön inkübasyon sıcaklığı 130˚C ye yükseltildiğinde kalan enzim aktivitesi

120˚C ye göre yaklaşık %223 düzeyinde artış göstermiştir. Ortam sıcaklığı 140˚C ye

yükseltildiğinde kalan enzim aktivitesi 130˚C’ye göre yaklaşık %137, 120˚C’ye göre

ise yaklaşık %304 oranında artmıştır.

Ön inkübasyon sıcaklığı 150˚C’ye yükseltildiğinde daha önceki test sürelerinde

olduğu gibi kalan enzim aktivitesi hızlı bir azalma göstererek yaklaşık %100.0

61


seviyelerine düşmüştür. Bu sıcaklıktaki aktivite kaybı 140˚C ile karşılaştırıldığında

yaklaşık %313.0 düzeyindedir.

Termal Stabilite (60 Dakikalık Ön İnkübasyon)

050

100150200

250

300350

K 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150


Kal

an E

nzim

Akt

ivite

si (%

)



inkübasyon süresi olarak 120 dakikanın seçilmesi sonucu elde edilen veriler çizelge 9

da sayısal, şekil 18 de ise grafiksel olarak verilmiştir.

62


Çizelge 4.4.9: SB-28 Amilaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Bulgular(120 dk)

Ön İnk.Sıc

Ön.İnk.Sür.

İnk.Sıc İnk. pH İnk.Sür AB1 AB2 ABO Kalan aktivite

(%) Kontrol 140˚C 12.5 30 dk 1.43 1.44 1.43 100.00



Ön inkübasyon sıcaklığı olarak seçilen 40-90˚C arlığında elde edilen kalan

enzim aktivitesi ortalama %97 düzeyinde gerçekleşmiş olup, belirtilen sıcaklık

aralığında enzim stabilitesinde değişiklik meydana gelmemiştir. Bu sıcaklık

aralığında en düşük aktivite değeri %96.0 ile 60-70˚C lerde elde edilirken en yüksek

aktivite %98 ile 90˚C de gerçekleşmiştir. Ön inkübasyon sıcaklığı 100˚C’ye

yükseltildiğinde kalan enzim aktivitesi %102.0, 110˚C’ye yükseltildiğinde ise

%105.2 olmuştur. Bu iki sıcaklık değerinde elde edilen ortalama aktivite değeri

yaklaşık %104.0 dür.

Ön inkübasyon sıcaklığı 120˚C’ye yükseltildiğinde kalan enzim aktivitesin

%148.4’e ulaşmıştır. Aktivitede 110˚C’ye göre yaklaşık %71’lik bir artış meydana

gelmiştir. Ön inkübasyon sıcaklığı 130˚C’ye yükseltildiğinde %310.1’lik aktivite

elde edilmiştir. Bu sıcaklıkta elde edilen aktivite artış 110˚C ile karşılaştırıldığında

yaklaşık %295, 120˚C ile karşılaştırıldığında ise yaklaşık %209’dur.

Ön inkübasyon sıcaklığı 140˚C ye yükseltildiği zaman kalan enzim aktivitesi

%408.4 olurken, elde edilen sonuç yaklaşık olarak 110˚C’ye göre %388, 120˚C ye

göre %275, ve 130˚C ye göre %131 olarak gerçekleşmiştir. Ön inkübasyon sıcaklığı

63


150˚C ye yükseltildiğinde ise kalan enzim aktivitesinde hızlı bir düşme meydana

gelmiş ve %109.4 aktivite elde edilmiştir. Bu sonuç 140˚C de elde edilen aktivite

değeriyle karşılaştırıldığında aktivitenin yaklaşık %374.3 düşme saptanmıştır.

Çalışmada ön inkübasyon için kullanılan 15, 30, 60 ve 120 dakikalık sürelerin

hepsinde de 40-100˚C aralığında sıcaklıklarda kalan enzim aktivitesi yüksek bir

kararlılık göstererek ortalama %96.0 düzeylerinde gerçekleşmiştir. Çalışmalar

sırasında 15, 30 ve 60 dakikalık inkübasyon sürelerinde kalan enzim aktivitesi

130˚C’den itibaren hızlı bir artış trendine girmiş ve 140˚C de maksimuma ulaşmıştır.

Ön inkübasyon süresi olarak 120 dakikanın kullanıldığı çalışmalarda ise aktivite

artışı 120˚C’den itibaren başlamış, 130˚C de hızlı bir artış gerçekleşmiş ve140˚C de

en yüksek değerine ulaşmıştır.

Ön inkübasyon için kullanılan bütün inkübasyon sürelerinde ortak olan nokta

inkübasyon sıcaklığının 150˚C’ye yükseltildiği zaman kalan enzim aktivitesinin

%100’ler düzeyine düşmesidir. Çalışmalar sonucunda elde edilen sayısal veriler

dikkate alındığında ön inkübasyon sürelerindeki artışla birlikte (sırasıyla 15, 30, 60,

120 dakikalık süreler) özellikle hızlı aktivite artışının meydana geldiği 130 ve

140˚C’ler de, absorbans değerlerinde de büyük artışlar meydana gelmiştir. Absorbans

değerlerinde gerçekleşen artış enzim aktivitesi sonucu açığa çıkan ürünlerdeki

kantitatif artışı ifade etmektedir.

Enzimatik reaksiyonun durdurulması için ortama ilave edilen DNS ayıracı

reaksiyon ortamında serbest kalan mono ve oligosakkarid birimlerine bağlanmakta

ve kaynatma sonucunda renk reaksiyonu oluşmaktadır. Ortamda bulunan

polisakkarid yapılarından açığa çıkan mono ve disakkarid miktarı ne kadar fazla ise

oluşan renk o denli yoğun olmakta (açık sarı, kırmızı ve koyu kırmızı şeklinde renk

değişmektedir), dolayısı ile yüksek absorbans değerleri elde edilmektedir. Bir başka

ifade ile absorbans değerindeki artış açığa çıkan ürün artışını göstermektedir.

Enzimin, sıcaklığın yükselmesiyle birlikte aktif merkeze hidrojen bağları ile

bağlanmış çeşitli radikal gruplar kopmaktadır. 140ºC de aktif merkezin tamamen

çıplak kalmasıyla, aktivite maksimuma ulaşmakta, ısının 150 ºC yükseltilmesiyle

kısmi denatürasyonun gerçekleştiği düşünülmektedir.

64


Ortam sıcaklığının 150˚C ye yükseltildiğinde aktivitenin birden bire %100’ler

seviyesine üşmesi korumasız kalan enzimin ısıyla bir noktaya kadar inaktive olurken

aynı zamanda reaktive olduğunu göstermektedir. Aktivitenin %100’lerden daha

aşağıya düşmemesinin nedeni ise enzimin yapısında stabiliteyi sağlayan metal

iyonlarının bulunması (enzimin EDTA ile inaktive olması bunun bir metallo enzim

olduğunun kanıtıdır), moleküldeki hidrojen bağları, disülfid bağı oluşturan amino

asitlerin belirli oranda bulunması (β-merkaptoethanol ile %19 inaktive olması) ile

açıklanabilir.

Bilindiği gibi termofil ve hipertermofil özellikteki enzimlerde termostabiliteyi

etkileyen faktörler; aktif bölgeye yan grupları bağlayan intrinsik hidrojen bağlarının

ve tuz köprülerinin varlığı ve fazlalığı, molekülün özellikle β konformasyonuna sahip

olması, serin ve sistein amino asitlerinin düşük oranda bulunması, Lysine amino

asitinin yüksek oranda bulunması, enzimin hidrofobik özellikte olması ve molekülde

metal iyonlarının bulunması gibi çok çeşitlidir (Kumar ve ark., 2000; Szilagyi ve

Zavodszky., 2000).

Literatürde, bu güne kadar bulunan enzimler arasında yarılanma ömür

çalışmalarında en yüksek değerin 130˚C de 10 dakika süreyle elde edildiği ve

140˚C’nin üzerinde denatürasyon gerçekleştiği belirtilmektedir (Koch ve ark., 1990;

Simpson ve ark., 1991; Daniel ve ark., 1996). Diğer taraftan Daniel ve ark. (1996),

gelecek on yılda 150ºC civarında aktif ve stabil bir enzimin bulunamayacağını iddia

etmişlerdir.

Goyal ve ark. (2005) Bacillus sp. I-3 suşundan izole edilen termostabil amilaz

enziminin 70ºC de 3.5 saat inkübasyondan sonra orijinal aktivitenin %90, 80ºC de

2.5 saat sonunda %80, 90ºC de 0.5 saat sonunda %59 ve 100ºC de 0.5 saat sonunda

%26 oranında korunduğunu belirtmişlerdir. Mamo ve Gessesse (1999), Termofilik

Bacillus’lardan izole ettikleri termostabil amilaz enziminin 80ºC de 4 saatlik

inkübasyon sonunda orijinal aktivitenin %50 korunduğunu belirtmişlerdir. Konsula

ve Kyriakides (2004) Bacillus subtilis suşundan izole ettikleri α-aylase enzimini

optimum aktivitesini 135ºC göstermekle birlikte 60ºC de 2 saatlik inkübasyon

sonunda orijinal aktivitenin %84.6 oranında korunduğunu belirtmişlerdir. Goyal ve

65


ark. (2005), izolasyonunu gerçekleştirdikleri amilaz enziminin 70ºC de 3.5 saat ön

inkübasyondan sonra orijinal aktivitesini %94 koruduğunu belirtmişlerdir.

SB-28 Bacillus sp. suşundan izole ettiğimiz amilaz enzimi optimum aktivitesini

140ºC de gösterirken, yarılanma ömrü (termal stabilite) çalışmalarında 120

dakikalık ön inkübasyon uygulamasından sonra 140ºC de orijinal aktivitesinde

yaklaşık %408 artış meydana gelmiştir.


0

100

200

300

400

500

K 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150


Kal

an E

nzim

Akt

ivite

si (%

)


4.5.Amilaz Enziminin pH Stabilitesine Ait Bulgular

SB-28 amilaz enzminin pH stabilitesi için ön inkübasyon sıcaklığı 55ºC

seçilmiştir. Ön inkübasyon sırasında enzim, pH’sı 9.0, 10.0, 11.0 ve 12.0 olan

Glisin-NaOH ve Borax-NaOH tampon çözeltilerinde süspansiyon haline getirildikten

sonra 72 saat süreyle inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Sonuçlara ilişkin sayısal veriler

çizelge 10’da, grafiksel değerlendirmeler ise şekil 19 da gösterilmiştir.

66


Çizelge 4.5.10:SB-28 pH stabilite sonuçları pH Ön

İnk.Sür. Ön ink.sıc

İnk.Sıc İnk. Sür

AB1 AB2 ABO % Kalan aktivite

Kontrol 140 30 dk. 4.76 4.72 4.74 100.00 9.0 72 h 55ºC 140 30 dk. 2.75 2.65 2.70 57.00 10.0 72 h 55ºC 140 30 dk. 2.63 2.54 2.57 54.00 11.0 72 h 55ºC 140 30 dk. 2.48 2.40 2.44 52.00 12.0 72 h 55ºC 140 30 dk. 2.50 2.46 2.48 52.00

Analizleri sonucunda kalan enzim aktivitesi 72 saatlik ön inkübasyondan sonra

pH 9.0 için %57, pH 10. için %54.0, pH 11.0 için %52 ve pH 12.0 için %52 olarak

bulunmuştur. Bu veriler dikkate alındığı zaman SB-28 amilaz enziminin aynı

zamanda pH stabil özellikte olduğu ve 72 saat süresince aktivitesini ortalama %54.0

oranında koruduğu görülmektedir.

Saxena ve ark. (2007) Bacillus sp. PN5 suşundan izole edilen termostabil

alkaline amilaz enziminin pH 10.0 1 saat sonunda orijinal aktivitesinin %80’ini

koruduğunu belirtmişlerdir. Lo ve ark. (2001), TS-23 α-amylase enziminin pH 9.0

da%100, pH 10.0 da %86 orijinal aktivitesini koruduğunu belirtmişlerdir.

0

20

40

60

80

100

120

Kont 9 10 11 12

pH değerleri

Kal

an re

latf

enzi

m a

ktiv

itesi

(%)

Şekil 4.5.19: SB-28 Amilaz enziminin 42 saat ön inkübasyondan sonraki

pH satabilite verileri

67


4.6. NaCl’ün Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi

SB-28 amilaz enzimi üzerine NaCL’ün etkisini araştırmak için %3.0, %5.0,

%7.0, %10.0, %15.0 ve %20.0’lik konsatrasyonlar seçilmiştir. Amilaz enzimi

belirtilen konsantrasyonlara sahip NaCL çözeltileri içerisinde süspansiyon haline

getirilerek 55ºC de 60 dakika süreyle ön inkübasyona bırakılmıştır. Analizlerden

elde edilen sonuçlar çizelge 11 de sayısal, şekil 20 de ise grafiksel olarak verilmiştir.

Çizelge 4.6.11: Farklı NaCL Konsantrasyonlarının Enzim Aktivitesine Etkisi NaCl Kons. %

Ön ink.sıc

Ön.ink sür

İnk sıc

İnk sür İnk. pH

AB1 AB2 AB0 Kalan aktivite %

Kontrol 140 30 dk 12.5 4.76 4.82 4.80 100.00 3.0 55ºC 60 dk. 140 30 dk 12.5 3.80 3.86 3.83 80.00 5.0 55ºC 60 dk 140 30 dk 12.5 4.00 3.80 3.90 81.30 7.0 55ºC 60 dk 140 30 dk 12.5 4.10 4.00 4.05 84.40 10.0 55ºC 60 dk 140 30 dk 12.5 4.20 4.32 4.26 89.00 15.0 55ºC 60 dk 140 30 dk 12.5 3.60 3.38 3.49 73.00 20.0 55ºC 60 dk 140 30 dk 12.5 3.18 3.14 3.16 66.00

Aktivite tayini sonucunda kalan enzim aktiviteleri %3.0, %5.0, %7.5, %10.0,

%15.0 ve %20.0 NaCL konsantrasyonları için sırasıyla %80.0, %81.30, %84.40,

%89.0, %73.0 ve %66.0 olarak bulunmuştur.

Enzimin optimum %10’luk NaCL konsantrasyonunda aktivite göstermiştir.

Orijinal aktivite ile karşılaştırıldığında %3.0-%10.0 aralığındaki konsantrasyonlarda

60 dakikalık ön inkübasyon işleminden sonra kalan enzim aktivitesinin yaklaşık

%83.7 düzeyinde olduğu görülmektedir. %15 ve %20 konsantrasyonlara çıkıldığında

ise kalan aktivitenin yaklaşık %69.5 düzeyinde gerçekleştiği saptanmıştır.

Konsantrasyon %10’un üzerine çıktığında %3.0-%10.0 aralığına göre aktivitenin

yaklaşık %14.2 azaldığı saptanmıştır.

Wainq ve Ingvorsen, (2003), β-xylanase enziminin %5-%15 NaCl

konsantrasyonlarında optimum aktivite gösterdiğini, 24 saat üreyle %20 NaCL

içerisinde bırakılan enzimin aktivitesini %55 oranında koruduğunu saptamışlardır.

Pomares ve ark, (2003) Halofferax mediterranie’de izole edilen amilaz enziminin 2-

68


4M NaCL konsantrasyonunda aktif estabil olduğunu, maksimum aktivitenin ise 3M

konsantrasyonda gerçekleştiğini belirtmişlerdir.

SB-28 amilaz enzimi 60 dakika süreyle 55ºC de bekletildiğinde 2M NaCL

çözeltisinde maksimum aktivite saptanmıştır (%89). Elde edilen sonuç litaratürle tam

bir uygunluk göstermektedir. Bu veriler SB-28 amilaz enziminin halofil özellikte

olduğunu göstermektedir.

0

20

40

60

80

100

120

Kontrol 3 5 7,5 10 15 20

NaCL Konsantrasyonu (%)

Kala

n R

ölat

ive

Enzi

m A

ktiv

itesi

(%)

Şekil 4.6.20: Enzim Aktivitesi Üzerine Farklı NaCl Konsantrasyonlarının

Etkisi

4.7. İnhibitör Maddelerin Enzim Üzerine Etkisine Ait Bulgular

Enzim aktivitesine şelatör, metal iyonları, inhibitörler ve deterjanların etkisinin

araştırılması amacı ile 5 mM EDTA , 5mM CaCL2, 3 mM PMSF, 5 mM NaSO3,

5mM NaCl, 5 mM ZnCL2, 5 mM 1,10-phenantroline, 8M Üre, %1v/v SDS, %1v/v

69


Triton X-100 ve %1v/v β-merkaptoethanol kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar

sayısal olarak çizelge 12 de grafiksel olarak şekil 21 de gösterilmiştir.

Çizelge 4.7. 12: SB-28 amilaz enimi üzerine şelatör, metal iyonları, deterjanlar

ve inhibitörlerin etkisi. İnhibitörler İnhibitör

kons. Ön

ink.sıcİnkübas.

sıc Ön ink. sür. dk

İnk. sür.

AB1 AB2 ABO (%) kalan aktivite

Kontrol Yok 140ºC 30 3.04 2.86 2.95 100 EDTA 5 mM 55ºC 140ºC 15 1.96 1.90 1.93 65.42 CaCL2 5 mM 55ºC 140ºC 15 30 2.10 2.07 2.10 70.20 PMSF 3 mM 55ºC 140ºC 15 30 2.28 2.11 2.20 74.23 MER %1 v/v 55ºC 140ºC 15 30 2.43 2.33 2.40 81.00 SDS %1 v/v 55ºC 140ºC 15 30 2.13 2.05 2.10 71.00 TRİT %1 v/v 55ºC 140ºC 15 30 2.44 2.40 2.42 82.03

NaSO3 5 mM 55ºC 140ºC 15 30 2.36 2.34 2.35 80.00 NaCL 5 mM 55ºC 140ºC 15 30 2.29 2.09 2.20 74.20 ZnCL2 5 mM 55ºC 140ºC 15 30 2.02 2.01 2.01 68.10

1,10-phen 5 mM 55ºC 140ºC 15 30 1.90 1.96 2.00 65.40 Üre 8 M 55ºC 140ºC 15 30 0.34 0.32 0.33 11.20

30

Analizler sonucunda orijinal enzim aktivitesiyle karşılaştırıldığında kalan

enzim aktivitesi EDTA da %65.42, CaCL2 de %70.20, PMSF de %74.23, β-

merkaptoethanol de %81.0, SDS de %71.0, Triton X-100 de %82.03, NaSO3 de

%80.0, NalL de %74.20, ZnCL2 de %68.10, 1,10-phenantrolin de %65.40 ve Üre de

%11.20 olarak bulunmuştur.

Literatürde Bacillus sp. SPS-0 suşundan izole edilen orta düzeyde

termostabiliteye sahip xylanase enziminin orijinal aktivitesini 1 mM CaCl2 ile %92, ,

5 mM Triton-X100 ile %43, ve 5 mM EDTA ile %93 oranında koruduğu

belirtilmektedir (Bataillon ve ark., 2000). Bu sonuçlardan kullanılan

konsantrasyonlar dikkate alındığında izole ettiğimiz amylase enzimi literatür

verileriyle çok yüksek benzerlik göstermektedir. SDS ile orijinal aktivitenin yaklaşık

%71 oranında korunması enzimin deterjanlara dirençli olduğunun bir göstergesidir.

Bu sonuçlara göre elde edilen enzim 8M üre ile tamamen EDTA ile kısmen

inhibe olmuştur. Bu sonuç enzimin alkaline, halofil ve metalloenzim özellikte

olduğunun bir göstergesidir. Horikoshi ile Hutscheon ve ark. amilaz enziminin 8M

üre ile tamamen inhibe olmasının alkalofil ve halofil özelliğin göstergesi olduğunu

70


belirtmektedir (Horikoshi, 1999; Hutscheon ve ark. 2005). SB-28 amilaz enzimi

Horikoshi’nin bulgularıyla çok büyük benzerlik göstermektedir.

SDS ve Triton X-100 gibi ajanlarla kısmi inhibisyon gerçekleşmiştir. Bu

özellik deterjanlara karşı dirençliliği göstermektedir. Lo ve ark. (2001), Bacillus sp.

TS-23 amilaz enziminin %6’lık SDS bulunan ortamda 30ºC de 1 saat inkübe

edildiği zaman stabil olduğunu, 60ºC ise inaktivasyon gerçekleştiğini belirtmişlerdir.

Elde edilen bu sonuç enzimin okside edici ajanlarla etkilenmediğini ısıyla birlikte

amino asitlerin değişikliğe uğradığı ve dirençliliğe yol açtığını düşündürmektedir.

Literatürde Enzimde disülfid bağlarının bulunması ve oksidasyona dayanıksız

aminoasitlerin okside olarak değişikliğe uğramasının enzimde termostabiliteyi

arttırdığı, ve enzimin okside edici ajanlardan etkilenmediği belirtilmektedir (Barnet

ve ark., 1998; Redy ve ark., 2003).

Sb-28 amilaz enzimi 5 mM ZnCL2 ile 55 de 15 dakikalık ön inkübasyondan

sonra yaklaşık %68 orijinal aktivitesini devam ettirmiştir. Burhan ve ark., (2003)

Bacillus sp. ANT-6 amilaz enziminin ZnCL2 ile yapılan inaktivasyon çalışması

sonucunda orijinal aktivitenin %63 oranında korunduğunu belirtmişler ve bunun

termostabilitenin göstergesi olduğunu bildirmişlerdir.

SB-28 amilaz enziminin PMSF ile kısmen denatüre olup, yaklaşık %75

dirençlilik görülmesi, enzimin serin protein özellikte olmadığının bir göstergesi olup

literatür bulguları ile büyük ölçüde uyumluluk göstermektedir. Termofilik

proteinlerde serin amino asitlerinin düşük düzeyde olduğu, ektrem termofillerde ise

mezofilik organizmalara göre çok düşük düzeyde bulunduğu veya hiç saptanamadığı

ve bunun termostabilitenin en önemli nedenlerinden birisini oluşturduğu

belirtilmektedir (Szilagyi ve Zavodszky, 2000).

71


0

20

40

60

80

100

120

Kont Edta Ca Pms Mer Sds Trit N-sü Nacl Zncl Phan Üre

İnhibitörler

Kala

n re

latif

enz

im a

ktiv

itesi

(%)

Şekil 4.7.21: SB-28 amilaz enzimi üzerine şelatör, inhibitör, metal iyonları,

ve deterjanların etkisi

4.8. SDS-PAGE Analiz Sonuçları

SB-28 amilaz enziminin %10’luk homojen SDS-PAGE jelinde yapılan analizi

sonucu elde edilen protein bandları şekil 22 de gösterilmiştir. Marker proteinden 20,

örnek proteinden ise 40µl kullanılmıştır. Moleküler ağırlık marker’ı olarak (Sigma

SDS 6H, 205000, 116000, 97400, 66000, 45000 ve 36000 Da) örneği kullanılmıştır.

72


205000

f

B

p

e

s

5

t

1

O

e

d

d

Ç

p

116000
97400 66000 45000
Şekil 4.7.22: SB-28amilaz enziminin SDS-PAGE sonuçla

analizlerinde %10’luk homojen jel kullanılmıştır.

Yapılan analizler sonucunda moleküler ağırlıkları 116000 ve 97

arklı protein bandı elde edilmiştir. Bernhardsdotter ve ark. (200

acillus sp. L1711 suşundan moleküler ağırlıkları 30-100 kDa arası

rotein bandı elde ettiklerini belirtmişlerdir.

Sookheo ve ark. (2000), Bacillus strearothermophilus TLS33

dilen proteaz enziminin S, N ve B olmak üzere üç ünitesin

aptamışlardır. Bu enzimlerin SDS-PAGE zimogram analizlerinde s

3000 ve 71000 daltonluk ağırlığa sahip oldukları saptanmıştır.

Ito (1997), Alkaline Bacillus KSM-635 suşundan izole edilen e

ayinlerinde iki farklı pik oluşturduğu belirtilmiştir. Bunların molek

30.000 ve 103.000 Da ağırlığa sahip iki proteinden meydana geldi

kamato ve ark. (2001), Termofil Bacillus sp. MO-1 suşundan kolleje

nzimini saflaştırarak analiz etmişlerdir. Enzimin moleküler ağ

altondur. Bununla birlikte doğal konumda enzimin moleküler a

altondur. Araştırmacılar enzimin iki büyük alt birimden oluştuğunu

alışmamızda izole ettiğimiz enzim 116000 ve 97400 Da ağırlığa sah

rotein fragmentinden oluşmaktadır.

73

116000

97400

rı. SDS-PAGE

400 Da olan iki

5). Alkalofilik

nda değişen üç

suşundan izole

in ulunduğunu

ırasıyla 36000,

nzimin aktivite

üler ağırlıkları

ği saptanmıştır.

nolitik proteaz

ırlığı 105.000

ğırlığı 210.000

belirtmişlerdir.

ip iki bağımsız


Nötrofilik özelliğe sahip amilaz enzimleri genel olarak pH 5-7.5 aralığında

aktivite gösterirken, özellikle deterjan sanayisinde kullanılan amilaz enzimleri pH 8-

11 aralığında aktivite göstermekte olup, alkalifilik Bacillus türlerinden izole

edilmektedirler. Alkalifilik Bacillus suşları daha çok pH’sı yüksek ve sodalı

göllerden izole edilmektedirler (Igarashi ve ark., 1998).

Sıradışı bakteriyel amilazlar asidofilik, alkalifilik ve termoasidofilik

bakterilerde bulunmuştur. Termoasidofilik ve alkalifilik bakterilerden elde edilen

enzimler ekstrem pH ve sıcaklık koşullarında kullanıma uygundur. Çok yüksek

sıcaklıklarda (80-90°C) optimal aktiviteye sahip olan α-amilaz enzimi termofil

ortamda üreyen B. licheniformis tarafından üretilmektedir (John, 1987).

Ito ve arkadaşlarının (1997), Igarashi ve ark. 1998) ve John (1987)’un

bulgularıyla büyük benzerlik gösteren enzimimiz literatürde de vurgulandığı gibi

alkaline ve termofil özelliktedir.

74

5. SONUÇ VE ÖNERİLER Seçil TATAR

5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER

Biyoteknoloji, çok çeşitli alanlarda gelişme gösteren ve günümüzde moleküler

biyolojik yöntemlerinde yaygın şekilde kullanımıyla birlikte, giderek moleküler

biyoteknoloji şeklinde transformasyona uğrayan, çok yeni ve geleceğe damgasını

vuracak bir alandır. Ticari alanda kullanılan ürünlerin üretilmesi ile ilgili

çalışmaların giderek hız kazanması sonucu, önemi her geçen gün daha da

artmaktadır. Dünyada,1980-1983 yılları arasında sadece 300 küçük biyoteknoloji

şirketi çalışma yaparken, bu sayı 1985 yılında sadece Amerika Birleşik Devletlerinde

(A.B.D) 400 düzeyine ulaşmıştır.

Günümüzde A.B.D de 900, bütün dünyada ise yaklaşık 1200 biyoteknoloji

şirketi çalışmalarını çeşitli alanlarda sürdürmektedirler. Örneğin sadece farmasötik

alanında 2000’li yıllarda kullanılacak biyoteknolojik ürünlerin toplam değerinin

yaklaşık 60 milyar dolar/yıl düzeyinde olacağı düşünülmektedir. Biyoteknoloji

kaynaklı çalışmalar A.B.D. de odaklanmış olmakla birlikte, günümüzde, Japonya ve

Kanada, biyoteknolojiyi (özellikle moleküler biyoteknolojiyi) stratejik alan

kategorisinde değerlendirerek, özel şirketlerin yanısıra, hükümetler düzeyinde

destekleme ve geliştirme kararı almışlardır (Glick ve Pasternak, 1994; Kirk ve ark.,

2002).

Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının

çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle, biyoteknolojinin

endüstriyel enzimlerle ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar, daha da önem

kazanmaktadır. Özellikle birkaç ülke dışındaki diğer ülkeler bu konuda tamamen

dışa bağımlı durumdadırlar.

Alkalifilik özellikteki organizmalar, prokaryot, eukaryot ve archea grubu

içerisinde yer almaktadırlar. Alkalifiller arasında çok değişik taksonomik gruplar

olmakla birlikte, bunların bazıları taksonomiye yeni girmişlerdir. Alkalifiller, bahçe

toprağı gibi normal çevresel ortamlardan izole edilebileceği gibi, yüksek alkalik

özellik gösteren topraklardan da izole edilebilirler. Alkalofilik enzimler endüstriyel

uygulamalarda büyük öneme sahiptirler.

75


Alkaline sellülase, alkaline protease ve alkaline amilaz gibi alkalofilik

organizmalardan izole edilen enzimler, çeşitli deterjanların içerisine karıştırılmışlar

ve biyolojik deterjanlar şeklinde tanımlanmışlardır. Dünyada üretilen toplam

alkalifilik enzimlerin %30 dan büyük kısmı çamaşır deterjanları içerisine

karıştırılarak değerlendirilmektedir. (Horikoshi, 1996). Alkalifilik amilaz, selülaz ve

proteazlar aynı zamanda endüstrinin diğer bir çok alanında da yoğun şekilde

değerlendirilmektedirler.

Bunlar arasında dericilik, tekstil, gıda endüstrisi, içecek endüstrisi, ekmek ve

pasta ürünleri, çeşitli soya ürünlerinin üretimi, protein hidrolizatlarının

tatlandırılması, farmasötik endüstrisi ve tıbbi uygulamalar, kimya endüstrisi,

atıkların temizlenmesi, nişastadan etanol üretimi gibi kendi içlerinde birer endüstri

olan çok değişik alanlar vardır (Rao ve ark., 1998; Igarashi ve ark., 1998; Kumar ve

Takagi, 1999).

Mikrobiyal enzimlerin dünya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığı

zaman, alkaline proteaz %25, diğer proteazlar %21, Amilaz %18, Renin %10,

Trypsin %3, Lipaz %3, diğer karbonhidrat parçalayan enzimler (selülaz ve xylanaz

gibi) %10, analitik ve farmasötik enzimler %10 şeklinde bir dağılımla

karşılaşılmaktadır (Rao ve ark. 1998).

Endüstride faydalı olan ve ticari olarak kullanılan enzimlerin bazı avantajlara

sahip olması gerekmektedir. Buna göre bir enzimin herhangi bir endüstri alanında

kullanılabilmesi için, işlem maliyeti bakımından ucuz olması, fiziksel ve kimyasal

koşullara bağlı olmadan aktivitesini en yüksek düzeyde koruması ve mümkün olan

en uzun süreyle sürdürmesi, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması,

allerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir olması gerekir (Sarıkaya,

1995).

Endüstriyel alanda kullanılan enzimler bitkisel, hayvansal ve

mikroorganizma kökenli olmakla birlikte ağırlıklı olarak mikroorganizmalardan

izole edilmektedirler. Bunun nedeni, mikroorganizma kaynaklı enzimlerin katalitik

aktivitelerinin yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve

daha ucuz olmaları, büyük boyutlarda ve yüksek saflıkta elde edilmesi gibi

avantajlara sahip olmasıdır. Örneğin mikrobiyal enzimler ekstrem sıcaklık ve pH

76


değerlerinde çok yüksek düzeyde aktivite gösterirler. (Wiseman, 1987; Horikoshi,

1999).

Endüstride yaygın şekilde kullanılan enzimler arasında Bacillus cinsine ait tür

ve alttürleri tarafından sentezlenen ondan fazla enzim vardır. Örneğin ticari olarak

üretilen ve kullanılan termostabil amilaz enzimlerinin üretilmelerinde B.

amyloliquefaciens ve B. licheniformis en çok kullanılan iki Bacillus türüdür (Lin ve

ark., 1998).

Alkaline protease üretiminde Halobacterium sp., B. licheniformis, B.

megatherium, Aspergillus, sp., Micrococcus, Pseudomonas ve Streptomyces türleri,

Clostridium paradoxum gibi anaerob bakteriler vardır. (Horikoshi, 1996; Horikoshi,

1999; Kumar ve Takagi, 1999). Enzim üretimi çalışmalarında kullanılan bu

bakterilerin birçok üstün tarafı olup, büyük bir bölümü kemoorganotrof olduğu için

besin istekleri azdır, kolayca kültüre alınabilirler ve yapılarında heterojenlik yoktur

(Priest, 1977).

Bacillus sp. suşları, proteolitik enzimler ve karbohidratazların önemli bir

kaynağını oluşturmaktadırlar. Örneğin α-amilaz enzimi Bacillus sp. grubunda

oldukça yaygın şekilde bulunur ve başlıca, gıda endüstrisinde nişastanın maltoza

hidrolize edilmesi, maltoz şuruplarının hazırlanması ile ekmek ve bira üretiminde

kullanılmaktadır.

Diğer taraftan, gıdalarda tatlandırıcı ve kaliteyi arttırıcı olarak (Anonymous,

1988a), tekstil endüstrisinde haşıl alma işlemlerinde (Tarakçıoğlu, 1979) ve alkol

fermantasyonunda yaygın bir kullanım alanı vardır (Bailey ve Ollis., 1977).

Özellikle termofilik alkali amilazlar, pH 9’un üzerinde yüksek düzeyde aktif olup,

deterjan endüstrisinin en önemli katkı maddesini oluşturmaktadır. Bunların dışında

kağıt ve tekstil endüstrisi, çeşitli içeceklerin saflaştırılması ve berraklaştırılması, gibi

geniş bir kullanım alanına sahiptirler.

Halofil organizmalar halofil, moderately halofil ve ekstrem halofil olmak üzere

genelde üç grup içerisinde toplanmaktadırlar. Bu gruptaki mikroorganizmalar archea

adı verilen grup içerisinde değerlendirilirler ve yüksek tuz içeren çevre koşullarında

yaşamaya uyum sağlamışlardır. Orta düzeyde halofil organizmaların optimum

üreyebildikleri tuz konsantrasyonu %3 ile %15 aralığında değişiklik gösterir

77


(Ventosa ve ark., 1998). Halofil organizmalar özellikle soda gölleri, çöller ve tuzlu

yiyecekler gibi tuz içeren çok değişik habitatlarda bulunmaktadırlar (Ventosa ve ark.

1998). Alkaline, halofil ve termofil özellik gösteren extremopHile

mikroorganizmaların enzim üretim alanında mikrobiyal fabrikalar şeklinde

kullanılacakları ve bu şekilde adlandırılacakları belirtilmektedir (Aguilar ve ark.,

1998).

Halofilik mikroorganizmalar arasında özellikle gram negatif özellik

taşıyanlarla çalışılmıştır. Gram pozitif özelik gösterenler ise bu alanda henüz yeni

araştırılmaya başlanmış organizmalardır. Ekstrem olarak adlandırılan bir çok

mikroorganizma adaptasyon gösterdikleri ortam koşullarına bağlı olarak çeşitli

özelliklere sahiptirler. Bu nedenle bu organizmaların biyoteknolojik ve ticari

önemleri oldukça yüksektir.

Halofil mikroorganizmalar arasında Halobacillus halopHilus (Spring, ve ark.

1996), Marinococcus halopHilus (Marquez ve ark. 1992), ve Bacillus halopHilus

(Ventosa ve ark. 1998) en fazla bilinen organizmalardır. Halofil organizmaların

sentezlediği ürünler arasında bakteriorodopsin, Ectoin, amylase, lipase, cellulase,

protease, biyosürfaktanlar, lectinler ve biyoplastikler en önemlileridir (Banat ve ark.

2000; Adams ve Kelly, 1995).

Halotolerant veya halofilik mikroorganizmalar tuz içeren çevresel ortamlarda

üreyebildikleri için biyoteknolojinin değişik alanlarında ve güncel uygulamalar için

potansiyel oluşturmaktadırlar. Halofillerden elde edilen bakteriyel rodopsin uzaysal

ışık modülatörleri, optik hafızalar, optik bilgisayarlar ve optik holograf teknoloji

alanlarında kullanılmaktadır. Halotolerant mikroorganizmalar fermente gıda ve gıda

katkı maddelerinin üretimi için gıda biyoteknolojisinde temel bir rol oynamaktadır.

Değişik organik kirleticilerin transformasyonu veya parçalanmasında ve alternatif

enerji üretim alanlarında halofil mikroorganizmalar kilit bir öneme sahiptirler

(Margesin ve Schinner, 2005).

Çalışmalar sırasında tanımlanmaları yapılarak morfolojik, boyanma davranışı

ve biyokimyasal testler sonucunda Bacillus sp. şeklinde adlandırılan toplam 68

bakteri suşu öncelikli olarak üreme ve enzim sentezleme özelliklerinin saptanması

amacı ile 20-60°C ortam sıcaklığı ve 7-12.5 aralığındaki pH değerlerinde analiz

78


edilmişlerdir. Analizler içerisinde uygun konsantrasyonda nişasta bulunan katı

besiyerinde gerçekleştirilmiştir.

Analizler sonucunda bütün sıcaklık değerlerinde farklı oranlarda üreme

gerçekleşirken, özellikle 25-55°C aralığında ortalama %84 düzeyinde 10 mm’den

daha fazla koloni çapı oluşturacak şekilde üreme gerçekleşmiştir. PH değerleri

açısından bakıldığında 7.0-12.0 aralığında ortalama %75 üreme gerçekleşmiştir.

Enzim sentezi bakterilerin üreme sıcaklıkları ile aynı paralelde gerçekleşmiştir.

Bununla birlikte pH değerleri dikkate alındığı zaman enzim sentezinin 8.0-11.0

aralığının ortalama %72 düzeyinde gerçekleştiği gözlenmektedir.

Çalışmamızda kullandığımız SB-28 suşu bütün pH ve sıcaklık değerlerinde yi

üreme gösterirken özellikle 55°C ve pH 9.5 de 10 mm bakteri, 30 mm aktivite zon

çapı oluşturarak üreme göstermiştir. Enzim sentezi açısından 55°C de pH 9.0-10.0

aralığında en yüksek aktivite zonu elde edilirken, optimum pH değerinin 9.5 olduğu

bulunmuştur. Enzim üretiminde kullandığımız bakteri suşunun, katı besiyerinde

yaptığımız analizler sonunda alkalofilik ve termofil özellikte olduğu saptanmıştır.

Alkol presipitasyon yöntemi uygulanarak kısmi saflaştırma tekniğine göre

izolasyonu yapılan SB-28 amilaz enziminin karakterizasyon analizleri sonunda

şaşırtıcı özellikte ve literatür verilerine göre bu güne kadar rastlanmamış bir enzim

karakteri gösterdiği bulunmuştur.

Enzimimiz optimum aktivitesini pH 12.5 de gösterirken son derece geniş bir

pH aralığında da yüksek aktivite göstermiştir. pH stabilitesi ile ilgili çalışmalarda 72

saatlik inkübasyon sonunda orijinal aktivitenin yaklaşık %54 oranında korunduğu

saptanmıştır. Enzim yüksek düzeyde alkalofil ve pH stabil özelliktedir.

SB-28 amilaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değeri 140°C

olup, 30-100°C ‘ler arasında yaklaşık %50 stabil bir aktivite söz konusudur. Enzim

optimum aktivitesini 140˚C de gösterirken 150˚C de %92.61 ve160˚C de %86.50

aktivite elde edilmiştir.

Enzimin 120-160˚C arasındaki rölatif aktivitesi yaklaşık %89 düzeyindedir.

Termal stabilite çalışmalarında alışılmışın dışında bir davranış gözlenmiştir. Enzim

sıcaklık ve inkübasyon süresinin artışıyla birlikte inaktive olma yerine aktivitesi

giderek artmıştır. Aktivite artışı 130˚C de hızlı bir yükselişe geçerek ve 140˚C de en

79


yüksek değere ulaşırken sıcaklık 150˚C’ye yükseltildiğinde aktivitede önemli bir

düşme geçekleşmiştir. Yapılan analizler sonunda 140˚C de en yüksek olmak üzere

ön inkübasyon süresi 15 dakikada %147, 30 dakikada %222, 60 dakikada %314 ve

120 dakikada %408 kalan aktivite değeri elde edilmiştir. Gerçekleştirilen testlerde

40-100˚C aralığında, kalan enzim aktivitesi ortalama %95 düzeyinde

gerçekleşmiştir.

Literatürde bu güne kadar en yüksek optimum aktivite sıcaklığının 135˚C

olduğu ve 160˚C de yaklaşık %70 aktivite elde edildiği belirtilmektedir (Konsoula ve

Kyriakides., 2004). Bir başka literatürde ise gelecek on yılda 150˚C civarında

aktivite gösteren enzimin bulunamayacağı iddia edilmektedir (Daniel ve ark.,1996).

Bu alışılmadık davranışa göre izole ettiğimiz enzim, ultratermofil ve indüklenebilir

termostabil şeklinde tanımlanmıştır.

SB-28 amilaz enzimi değişik tuz konsantrasyonları içeren çözeltilerde 60

dakika süreyle 55 bekletildikten sonra optimum aktivitenin yaklaşık %89 ile 2M

NaCL (%10) konsantrasyonunda elde edilmiştir. Literatürde Halofil amilaz

enziminin en yüksek aktiviteyi 2-4M tuz konsantrasyonunda gösterdiği

belirtilmektedir (Pomares ve ark., 2003). Bu verilere göre enzimimiz halofil

özelliktedir.

SB-28 amilaz enzimi inhibitör, şelatör, metal iyonları ve deterjanlarla analiz

edilmiş ve 8M Üre ile tamamen inhibe olurken EDTA, PMSF, β-merkaptoetanol,

Triton X-100, ZnCL2, 1,10-pHenantroline, CaCL2 ve SDS ile ortalama %20-30

arasında inhibe olmuştur. Bu verilere göre enzim alkaline, termostable ve

deterjanlara direçli özelliktedir.

SDS-PAGE analizinde enzimin, moleküler ağırlıkları 116000 ve 97400 Da

olan iki alt birimden oluştuğu saptanmıştır. Özellikle alkaline ve termstabil

enzimlerin moleküler ağırlıklarının 100000 Da’dan büyük olduğu bildirilmektedir

(Okamato ve ark.,2001; ve Ito, 1997). SDS-PAGE sonuçları enzimimizin alkaline ve

termostabil ozellikte olduğunu desteklemektedir.

Horikoshi, Bacillus AB-42 suşundan izole ettiği alkalifilik amilaz enziminin

pH 9-12 aralığında sıcaklık optimumunun 60°C olduğunu belirtmiştir (Horikoshi,

1996). B. acidocaldarius α-amilazı için 30-60°C (Koivula ve ark., 1993), B. subtilis

80


α-amilazı için 40-65°C, B. licheniformis α-amilazı için ise 90°C (Fogarty, 1983)

optimum sıcaklık dereceleri saptanmıştır. B. licheniformis α-amilazın 100°C’nin

üstündeki sıcaklıkta bile aktivite gösterdiği ve bu nedenle endüstride kullanımının

arttığı belirtilmektedir (Wiseman, 1987).

EkstemopHilic organizmalar yüksek sıcaklık, ekstrem pH, yüksek tuz

konsantrasyonu ve yüksek basınç gibi ekolojik koşullara uyum sağlamış

organizmalardır. Bu mikroorganizmalar, ekstrem koşullar altında fonksiyonel olan

biyokatalistik ürünler sentezlemektedirler. Sentezledikleri ürünler arasında amilaz,

pullulanaz, selülaz, xylanaz, chitinaz, proteazlar, esterazlar, glikoizomerazlar,

alkoldehidrojenazlar ve DNA modifiye eden enzimler ilk sayılabileceklerdir. Bu

enzimler gıdadan tekstile, ekmekten deterjana, içecek üretiminden saflaştırmasına,

yenilenebilir enerji kaynaklarından alkol üretimine ve kimya endüstrisinden

farmasötik alanına kadar çok yaygın bir yelpazede, belki de en önemlisi bir çok

farklı uygulamalarla tedavide kullanım alanı bulmuşlardır (Niehaus ve ark., 1999).

Nişasta amiloz ve amilopektin adı verilen yüksek büyük moleküler ağırlıklı iki

alt birimin birleşmesi sonucu oluşmuş heterojen bir polysakkarittir. Nişasta bazı

durumlarda, yaş bitkisel materyallerin toplam ağırlığının %70’inden fazlasını

meydana getirebilir. Yüksek bitkilerdeki en önemli depo karbonhidratıdır. Nişasta

sulu ortamda ısıtıldığı zaman, granülleri bir arada tutan hidrojen bağlarının

zayıflaması sonucu şişer ve jelatinleşir (Aiyer, 2005). Endüstriyel uygulamalarda

nişastanın sıvılaştırılması aşamasında genellikle %35 nişasta süspansiyonu kullanılır.

Sıvılaştırma işlemi iki yöntemle yapılabilir.

Tek aşamada sıvılaştırma olarak ta adlandırılan teknikte %30-40 nişasta

konsantrasyonu olacak şekilde tank içinde süspansiyon hazırlanır ve ortama

sıvılaştırıcı enzim ilave edilir. Tankın içerisine taze buhar verilerek, sıcaklık 105°C

ye yükseltilir. Nişasta çözeltisi bu sıcaklıkta yaklaşık 5 dakika inkübasyona bırakılır.

Enzimin etki göstermesi için 95°C de 2 saat inkübasyon gerçekleştirilir. Bu

uygulamanın sonunda, kullanılan enzim miktarına bağlı olarak nişasta dextrose’a

dönüşmüş olur (Aiyer, 2005).

Normalde tam bir sıvılaşmanın gerçekleşmesi için 140-150°C de uygulama

yapılması gereklidir, fakat temostabil enzimler genellikle 100°C de aktivite

81


gösterdikleri için 105°C’lik uygulama koşulları tercih edilmektedir. Bu açıdan

bakıldığında eğer yüksek sıcaklıkta aktivite gösteren ve uzun süre yüksek sıcaklıkta

stabil olan br enzim yoksa, ortam sıcaklığını 105°C’ye düşürmek gerekmektedir. Bu

ise, hem soğutma için aşırı enerji tüketimine neden olmakta hem de çözünürlüğü

azalttığı için verimi düşürmektedir. Yüksek sıcaklıkta sıvılaştırma uygulamaları

yerine 105°C sıvılaştırma gerçekleştirilmesi soğutma için fazladan enerji

kullanılmasına ihtiyaç göstermediği için maliyetin düşmesi sağlamaktadır (Aiyer,

2005). Hattori (1984) uygun α-amylase enzimi kullanıldığında nişasta işleme

uygulamalarındaki en önemli aşama olan sıvılaştırma basamağı için gerekli ortam

sıcaklığının, 105-107°C arasında olması gerektiğini belirtmiştir.

İkinci yöntem asit ve enzim kullanılarak sıvılaştırmanın gerçekleştirilmesidir.

Bu işlemde de %30-40 nişasta içeren karışım yüksek sıcaklıkta 5 dakika muamele

edildikten sonra 95-100°C ye soğutma işlemi uygulanır ve pH 6-6.5’e ayarlandıktan

sona ortama uygun enzim ilave edilir.

Sindhu ve ark. (1997), jelatinleşmenin 100-110°C, sıvılaştırmanın ise 80-

90°C’de optimum gerçekleştiğini bu nedenle yüksek düzeyde verim alınabilmesi için

yüksek sıcaklıklarda aktivite gösteren termofilik ve termostabil amilaz enzimine

gereksinim olduğunu belirtmişlerdir.

Yukarıda bütün karakterizasyonu ayrıntılı olarak verilen, SB-28 amilaz enzimi,

değişik uygulama alanları için ideal özellikler taşımaktadır. Sonuç olarak;

Enzimin, sıcaklığın yükselmesiyle birlikte aktif merkeze hidrojen bağları ile

bağlanmış çeşitli radikal gruplar kopmaktadır. 140ºC de aktif merkezin tamamen

çıplak kalmasıyla, aktivite maksimuma ulaşmakta, ısının 150 ºC yükseltilmesiyle

kısmi denatürasyonun gerçekleştiği düşünülmektedir.

Yüksek sıcaklıkta aktivite ve termal stabilitenin daha iyi açıklanabilmesi için

bundan sonraki adım, enzimin amino asit bileşimi ve molekülün konfügürasyonunun

saptanması yönünde olmalıdır.

1.Nişasta işletmelerinde birinci aşama olan jelatinleştirmenin 140-150°C de 5

dakika süreyle gerçekleştirilip, 100-105°C’ye soğutulduktan sonra ikinci ve en

82


önemli aşama olan sıvılaştırmanın 2 saat süreyle yapılması düşünüldüğünde,

soğutma işlemleri için çok önemli bir enerji kullanılması söz konusudur.

Oysa, 140-150°C-140°C de uzun süre aktif ve stabil bir enzim kullanılsa

soğutmaya gerek kalmayacaktır. Dolayısı ile, soğutma için ekstra enerji

kullanılmaması ve moleküller arası bağların kopması sonucu enzimin daha yüksek

düzeyde aktivite göstermesine bağlı olarak, çok yüksek verim alınması söz

konusudur. Optimum aktivitesini 140°C de gösteren, 120 dakika süreyle 140°C

bekletildiği halde inaktive olma yerine, aktivitesi inkübasyon süresi arttıkça artarak,

%408 düzeyine ulaşan SB-28 amilaz enzimi, her alanda maliyetleri çok düşürecek ve

ürün verimini üst düzeylere taşıyacaktır.

2.Tekstil endüstrisinde haşıllama işlemlerinde yoğun nişasta kullanımı söz

konusudur. Tekstil endüstrisi pH’nın yaklaşık 12, sıcaklığın en az 80°C olduğu

işletmelerdir. Nişastanın ortamdan uzaklaştırılmasında son yıllarda enzim kullanımı

önemli bir yer tutmaktadır. SB-28 amilaz enziminin alkaline, termofil ve termostabil

özelliği dikkate alındığında bu işletmeler için ideal bir enzim olduğu görülmektedir.

3.Amilaz enzimlerinin en fazla kullanıldığı alanlardan bir diğeri deterjan

endüstrisidir. Özellikle alkaline, termostabil ve SDS gibi ajanlara dirençli enzimler,

deterjan formülasyonunda öncelikli bir yere sahiptir. Bu açıdan da SB-28 enzimi,

sahip olduğu özellikler dikkate alınırsa, ideal endüstriyel enzim özelliğindedir.

83

KAYNAKLAR

ADAMS,M.W.W., AND KELLY,R.M. 1995. Enzymes in extreme environments.

Chem. Eng. News. 73:32-42.

AGUILAR, A., INGEMANSSON, T., and MAGNIEN, E. 1998. Extremophile

microorganisms as cell factories: supprt frm the Eropian Union.

Extremophiles. 2:367-373.

AIRA, S., KILAL, K., and IMANAKA, A., 1983. Cloning and Expression of

Thermostable a- Amylase Gene from Bacillus stear other mophilus in

Bacillus stear other mophilus and Bacillus subtilis. Applied and

Environmental Microbiology, 32:3059-1065.

AIYER, P.V.2005. Amylases and their applications. African Journal of

Biotechnology. 4 (13):1525-1529.

ANONYMOUS, 1917. Buffer solutions. Handbook of Biochemistry and Molecular

Biology, s. 370-382.

ANONYMOUS, 1978. Microbiologisches Handbuch, E.Merck, Darmstad.

ANONYMOUS., 1988a., Handbook of amylases and related enzymes. Edited by the

amylase research society of japan. Pergamon press, Oxford.

AOKİ, K., MİYAMOTO, K., MURAKAMİ, S., SHİNKE, R., 1995. Anaerobic

Synthesis of Extracellular Proteases by The Soil Bacterium Bacillus sp.

AM-23: Putrification and Characterization of The Enzymes. Soil Biol.

Biochem. 27(11):1377-1382.

AUNSTRUP, K., 1981. Industrial Aspects of Biochemistry (B. Spencer editör),

pp:23-29. FEES, Dublin.

AYHAN, K. 2000. Gıdalarda Bulunan Mikroorganizmalar, Gıda Mikrobiyolojisi ve

Uygulamaları Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği

Bölüm Yayını, 43-44. Sim Matbaacılık Ltd. Ankara.

BAILEY,J.E., and OLLIS,D.F., 1977. Biochemical engineering fundamentals:

International student Edition, Chapter 1-7, p:39-50.

84

BAJPAI, P., and BAJPAI, K.P., 1987. High- Temperature Alkaline a-Amylase from

Bacillus licheniformis TCRDC-B13. Biotechmlogy and Bioengineeria.

33:72-78.

BANAT,I.M., MAKKAR,R.S., AND CAMEOTRA,S.S., 2000. Potential

commercial applications of microbial surfactans. Appl microbiol

Biotechnol. 53:495-508.

BANWART, G.J., 1983. Basic Food Microbiology. Avi. Publishing Company Inch.Wesport - Connecticut p:72-74.

BARNETT, C.C., MİTSHİNSON, C., POWER, S.D., AND ROQUADT, C.A.

1998). Oxidatively stable alpha-amylase. Patent Aplication US. 5:824-

832.

BATAILLON,M., CARDINALE,A.P.N., CASTILLON,N., and DUCHIRON,F.

2000. purification and characterization of a moderately thermostable

xylanase from Bacillus sp. strain SPS-0. Enzyme and Microbial

technology, 26:187-192.

BERNHARDSDOTTER, E.C.M.J., NG, J.D., GARRİOTT, O.K., AND PUSEY,

M.L. 2005. Enzymatic properties of an alkaline chelator-resistant α-

amylase from an alkaliphilic Bacillus sp. isolate L1711. Process

Biochemistry. 40:2401-2408.

BHAT,M.K., 2000. Cellulase and related enzymes in biotechnology. Biotechnology

Advences. 18 (5): 355-458.

BİLGEHAN, H., 1995. Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Şafak Matbaacılık. İzmir. 768p.

BLEISMER,B.O., and HARTMAN,P.A., 1973. Diferential heat stabilities of

Bacillus subtilis amilases. J.Bacteriol. 113:526-528.

BOLLAG, D.M. and EDELSTEIR S.J., 1991. Proteins Metods. Villey-Liss

Press.,USA, 180p.

BORGİA, P.T. and CAMPBELL. L.L., 1978. a-Amylases from Five Strains of

Bacillus amyioiiquefaciem : Evidence for Identical Primary Structures.

J.Bacteriol. 134(2):389-393.

85

BOYER, F.W., INGLE, M.B., and MERCER, G.D. 1972. Starch. 31:66-71

BURHAN, A., ÜNALDI, N., CORAL, G., COLAK, O., AYGAN, A., VE

GÜLNAZ, O. 2003. Enzymatic properties of a novel thermostable,

thermophilic, alkaline and chelator resistant amylase from an alkaliphilic

Bacillus sp. İsolate ANT-6. Process Biochemistry. 38:1397-1403

CHRİSTOV, L.P., AKHTAR, M., PRİOR, B.A., 1996. Impact of Xylanase and

Fungal Pretreatment on Alkali Solubility and Brightness of Dissolving

Pulp. Biobleaching of Sulphite Pulp. 50: 579-582.

COLEMAN, G., and ELLIOTT, W.H., 1962. Studies on a-Amylase formation by

Bacillus subtilis, Biochcm. J. 83:256-263

CORAL, G., ARIKAN, B., ÜNALDI, M.N., VE GÜVENMEZ KORKMAZ, H.

2002. Some properties of thermostable xylanase from an Aspergillus

niger strain. Ann. Microbiol. 52:299-306.

ÇETÎN, E.T., 1968. Pratik Mikrobiyoloji, Istanbul Üniversitesi, 2. Baskı, Menteş

Matb. İstanbul 645p.

DANİEL, R.M., DİNES,M.,AND PETACH, HH. 1996. The denaturation and

degradation of stable enzymes at high temperatures. Biochem.J. 317:1-

11.

DEMAİN, A.L., and SOLOMON, N.a., 1981. In Industrial Microbiology.

EKŞİ, A., 1988. Meyve Suyu Durultma Tekniği. Gıda Teknolojisi Derneği, yaym No

: 9, 127p, Ankara.

FOGARTY, W.M., and KELLY, C.T., 1979. Developments in microbial

extracellular enzymes. In: Wiseman A, editor. Topics in enzyme and

fermentaion biotechnology. 3:45-108.

FOGARTY,W.M., 1983. Microbiol enzymes and biotechnolgy. Chapter 1. Microbial

amylases. Applied Science Publisher, p. 1-92.

FUJIWARA, N., and MASUI, A., 1993. Purification and Properties of the Highly

Thermostable Alkaline Protease from an Alkaliphilic and Thermophilic

Bacillus sp. Journal of Biotechnology, 30, 245-246.

86

GAMERİTH, G., GROİCHER, R., ZEİLİNGER, S., HERZOG, P., KUBİCEK, C.P.,

1992. Cellulase-Poor Xylanases Produced by Trichoderma reesei RUTC-

30 on Hemicellulase Substrates. Appl Microbiol Biotechnol. 38: 315-

322.

GESSESSE, A., 1998. Purification and Properties of Two Thermostable Alkaline

Xylanases from an Alkaliphilic Bacillus sp. Applied and Environmental

Microbiology., 3533-3535.

GESSESSE, A., and GASHE. B:A., 1997. Production of Alkaline Xylanase by

anBacillus sp. Isolated from an Alkaline Soda Lake. Journal of

Applied Microbiology., 83. 402-406.

GLICK,B.R., and PASTERNAK,S.S., 1994. Molecular biotechnology: Principles

and Applications of Recombinant DNA. Cold Spring Harbor Laboratory,

New York.

GOODFREY, T., and REICHET,J. 1985. Industrial enzymology: The application of

enzymes in ındustry. The Nature Press, London.

GOYAL, N., GUPTA, J.K., AND SONİ, S.K. 2005. A novel raw starch digesting

thermostable α-amylase from Bacillus sp. I-3 and its use in the direct

hydrolysis of raw starch. Enzyme and Microbial Technology. 37:723-

734.

GRANT, W. D. And HORJKOSHİ, K., 1992. Alkliphiles : Ecology and

Biotechnologicaî Application. In Molucular Biology and Biotechnology

of Extremophiles ed. Herbert, R.A and Sharp, R.J. pp. 143-162 New

York :

HAMILTON, LM., KELLY,C.T., and FOGARTY, W.M. 1999. Purification and

properties of the raw starch degrading α-amylase of Bacillus sp. IMD434.

Biotechnol. Lett. 2:111-115.

HATTORİ, F.1984. Japan Patent No 1203977, Japan Kokai Tokyo, Koh. 51-44652.

87

HOLS, P., FERAIN, T., GARMYN, D., BERNARD, N., DELCOUR, J., 1994. Use

of Expression Secretion Signals and Vector Free Stable Chromosomal

Integration In Engineering of Laclobacillus planetarium for Alfa Amylase

and Levanase Expression. App. And Environ. Microbiai. 60 (5):1401-

1413.

HORIKOSHI,K., 1996. Alkaliphiles-from an industrial point of view. FEMS

Microbiology Reviews, 18:259-270.

HORİKOSHİ, K. 1999. Alkaliphiles: Some apllications of their products for

biotechnology. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63

(4):735-750.

HUTSCHEON, G.W., VASİSHT, V., AND BOLHUİS, A. 2005. Characterisation of

a high stable α-amylase from the halophilic archen Haloarcula hispanica.

Extremophiles. 9:487-495.

IGARASHI, K., HATADA, Y., IIAGIHARA, H., SAEKI, K., TAKAIWA, S.,

KOBAYASHI, T, and İTO. S.. 1998. Enzymatic Properties of a Novel

Liquefying a-Amylase from an Alkaliphilic Bacillus Isolate and Entire

Nucleotidc and Amino Acid Sequences. Applied and

Environmental Microbiology.64 (9): 3282-3289.

IKEDA, T., YAMAZAKI, H., YAMAShıta, K. And SHINKE, R. 1992. The

Tetracycline Inducible Expression of a-Aınylase İb Bacillus subtilis. J.

Ferment. Bioeng. 74: 58-60.

ITO,S., 1997. Alkaline cellulases from alkaliphilic Bacillus: Enzymatic properties,

genetics and application to detergents. Extremophiles. 1:61-66.

JIN, F., CHENG, X., SHI, Y., and ZHANG, C., 1990. Isolation of New

Thermophilic Aerobic Bacteria Which Produce Thermostable a-Amylase.

J. Gen. Appl. Microbiol. 36:415-424.

JOHN, F.K.,1987. Enzyme TechnoIogy(HJ.REHM.5 G.REED editor).Biotechnology

Vol. 7A. New York s 37-62.

JOHN, W., and SONS, I., 1998. Industrial Enzymes and Their Applications. United

States of Amerika. 454p.

88

KANNO, M. 1986. Bacillus acidocaldorius α-amylase that is highly stable to heat

under acidic conditions. Agric. Biol. Chem. 50 (1): 23-31.

KELLY, C.T. and FOGARTY, W. M., 1976. Microbial Alkaline Proteinases.

Proc.Biochem., 11:3-9.

KESKİN, H., 1982. Besin Kimyası. Cilt II. S : 558. Fatih Yayınevi, İstanbul.

KHOO, S.L., AMIRUL, A.A., KAMARUZAMAN, M., NAZALAN, N., and

AZIZAN, M.N. 1994. Purification ad characterization of α-amylase from

Aspergillus flavus. Folio. Microbiol. 39:392-398.

KINDLE,K.L., 1983. Characterization and production of thermostable α-amilase.

Appl. Biochem. Biotechnol. 8:153-158.

KIRK, O., BORCHERT, T.V., and FUGLSANG, C.C. 2002. Indusrialenzyme

applications. Current opinion in biotechnology. 13:345-351

KOCH, R., ZOBLOVSKİ, P., SPREİNAT, A., AND ATRANİKİAN, G. 1990.

FEMS Microbiol. Lett. 71:21-26.

KOIVULA,T.T., HEMILA,H., PAKKANEN,R., SIBAKOV,M., and PALVA,I.,

1993. Cloning and sequencing of a gene encoding acidophilic amylase

from Bacillus acidocaldorius. Biotech. Letters. 12 (5): 393-396.

KOLAYLI, E. ve BEYATLI ,Y. 2003. Bacillus Cinsi Bakterilerin Antimikrobiyal

Aktiviteleri, PHB Üretimleri ve Plazmid DNA'ları Orlab On-Line

Mikrobiyoloji Dergisi. 01(12):24-35.

KONSULA, Z., AND KYRİAKİDES, M.L. 2004. Hydrolysis of starches by the

action of an α-amylase from Bacillus subtilis. Process Biochemistry,

39:1745-1749.

KULKARNI, N., SHENDYE, A., RAO,M., 1999., Moleculer and Biotechnological

Aspects of Xylanases. FEMS Microbiology Reviews 23: 411-456.

KUMAR,G.C., and TAKAGI,H., 1999. Microbial alkaline proteases from a

bioindustrial viewpoint. Biotechnology Advances. 17:561-594.

KUMAR,S.,TSAİ, C.J., AND NUSSİNOV, R. 2000. Factors enhancing protein

thermostability. Protein Engineering. 13 (3):179-191.

89

KUSCHNER.D.J.,and KAMEKURA,M. 1988. Physiology of halophilic eubacteria.

In:Rodriques-Valera F (ed) Halophilic bacteria, vol I. CRC Pres, Boca

Raton, pp:109-140.

LANE, A.G. and PIRT, S.J., 1973. Production of Cyclodextrin Glycoyltransferase by

Batch and Chemostat Cultures of Bacillus macerans in Chemically

Defined Mediom. J. Appi. C hem. Biotech., 23:309-321.

LEE, S., MORIKAVA, M., TAKAGI, M., and IMANAKA, T. 1994. Cloning aapt

Gene and Characterization its Pruduct, a-Amylase, Pullulunase (aapt),

From thermophilic and Alkalphilic Bacillus sp. Strain XAL60L Appl.

Environ. Microbiol. 60:3761-3773.

LENNETE, E.H., BALOWS, A., HAUSLER, J.WJR, SHADOMY, J.H., 1985.

Manual of Clinical Microbiology. Vol. 4 Amerika. 1149p.

LİN, L.L., CHYAU, C.C., HSU, W.H. 1998. Production ad properties of a raw

starch-degrading amylase from the thermophilic and alkalophilic Bacillus

sp. TS-23. Biotechno. Appl. Biohem. 28:61-68.

LO, H.F., LİN, L.L., CHEN, H.H., HSU, W.H., AND CHANG, C.T. 2001.

Enzymatic properties of a SDS-resistant Bacillus sp. TS-23 α-amylase

produced by recombinant Escherichia coli. Process Biochemistry.

36:743-750.

MACFADDIN, J.F., 2000.Biochemical Tests for Identificatıon of Medical Bacteria.

Third Edition, USA, pg:506-509.

MADSEN, G.B., NORMAN, B.E.. and SLOTT, S., 1973. A New Heat-Stable

Bacterial Amylase and its Use İn High-Temperature Liquefaction .Starke

25, 304.

MAMO, G., AND GESSESSE, A. 1999. Purification and characterisation of two

raw starch-digesting thermostable α-amylase from a thermophilic

Bacillus. Enzyme and Microbial Technology. 25:433-438.

MANNING, G.B. and CAMPBELL, L.L., 1961. Thermostable a-Amylase of

Bacillus stearothermophilus. J. Biol. Chem. 236 (11):2952-2957.

90

MARGESİN, R., AND SCHİNNER, F. 2005. Potential of halotolerant and

halophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles. 5:73-83.

MARQUEZ,M.C., VENTOSA,A., AND CORMENZANA,R. 1992. Phenotypic and

chemotaxonomic characterization of Marinococcus halophilus. Syst Appl

Microbiol, 15:63-69.

MATSUZAKI, H., YAMANE, K., YAMAGUCHI, K, NAGATA, K., and

MAROU, B., 1974. Hybrid a-Amylases Produced by Transformants

of Bacillus subtilis. I Purification and Characterization of Extracellular

ct-Amylases Produced by the Parental Strains and Transformants :

Biochim. Biophy. Acta., 365, 235-247.

MCTİGUE, M.A., KELLY,C.T., DOYLE, E.M. AND FOGARTY, W.M. 1995. The

alkaine amylase of the alkalophilic Bacillus sp IMD370.Enzyme Microb.

Biotechnol. 17:570-573.

MEER, J.L., 1972. The Regulation Of _ a-Amylase Production in Bacillus

licheniformis. Antonievon Leuvenhoek : J. Microb. Serol., 38:570-585.

MEHROTRA,S., PANDEY,P.K., GAUR,R., and DARMWAL,N.S., 1999. The

prufication of alkaline protease by a Bacillus species isolated.

Bioresource Technology. 67:201-203.

MORGAN, F..]., PRIEST, F.G.; 1981. Characterization of Thermostable a-Amylase

from Bacillus lichemformh NCTB 6346. J. Appl. Bacteriol 50: 107-114.

NAKAMURA, S.s ISHIGURO, Y., NAKAl, R.s WAKABAYASHI, K., AONO,

R.,and HORlKOSHİ, K., 1995. Pınfıcation and Characterization

of a Thermophilic Alkaline Xylanase From Thermoalkaliphilic Bacillus

sp, strain TAR-1. J. Mol. Çatal. B Biocatal. l: 7-15.

NELSON, D.L., COX., M.M., 2000. Lehninger Principles of Biochemistry 257 p.

NIEHAUS,F., BERTOLDO,C., KAHLER,M., AND ANTRANIKIAN,G.1999.

Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application.

App Microbiol Biotechnol, 51:711-729.

91

OGASAHARA, K.IMAN1SHI, A., and 1SEMURA, T., 1970. Studies on

Thermophilic a- Amylase from Bacillus stearolhermophilus. I some

General and Physiochemical Properties of Thermophilic a-Amylase. J.

Biochem., 67:65-75.

OKAMATO,M., YONEJIMA,Y., TSUJIMOTA,Y., SUZUKI,Y., and

WATANABE,K. 2001. A thermosatble collagenolytic protease with a

very large molecular mass produced by thermophilic Bacillus sp. strain

MO-1. Sipringer Verlag.

OUTRUP, H.s ANDRESEN, 0., and AUNSTRUP, K., 1972. Improvoments in or

Relating To The Preparation of Microbial Enzyme s. U.K. Patentl296839.

ÖZÇELİK, S.,1995. Genel Mikrobiyoloji, Isparta, 1-33s.

PAZUR, H.H., 1965. Starch Chemistry and Technology, p: 133 Academic Press,

New York.

POMARES, F.P., BAUTİSTA, V., FERER, J., PİRE, C., MARHUENDA-EGEA,

F.C., AND BONETE, M.J. 2003. α-Amylase activity frm the halophiic

archeon Haloferax mediterranei. Extremophiles. 7:299-306

PRIEST,F.G., 1977. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. Bacteriol

Rev. 41 (3):711-753.

RADLEY, J.A., 1976. Production of Microbial Amylolytic Enzymes : Starch

Production Technology (L.A. Underkofler Editör). Chapter 16., Applied

Science Publisher Ld., England, p : 295-309.

RAO,B.M., TANKSALE.M.A., GHATHE.S.M., and DESHPANDE.V.V., 1998.

Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases.

Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3):597-635

REDY, N.S., NİMMAGADDA, A., AND RAO, K.R.S.S. 2003. Anoverview of the

microbial α-amylase family. African Journal of Biotechnology. 2

(12):645-648.

SAITO,N., 1973. Thermophilic extracellular α-amilase from Bacillus licheniformis.

Arc. Biochem. Biophy. 155:290-298.

92

SARIKAYA, E., 1995. a-Amilaz Üreten Bazı Bacillus Suşlarmın Gelişme

Parametreleri, Enzim Özellik Ve Üretim Koşullarının Optımizasyonu,

Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Doktora tezi 2s..

SARIKAYA,E., 1995. α-amilase üreten bazı Bacillus suşlarının gelişme

parametreleri, enzim özellik ve üretim koşullarının optimizasyonu.

Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Doktora Tezi.

SAXENA, R.K., DUTT, K., AGARWAL, L., AND NAYYAR, P. 2007. A highly

thermostableand alkaline amylase from a Bacillus sp. PN5. Bioresourch

technology.98:260-265

SHARP, R.J., SCAWEN, M.D. ATKINSON, T., 1989. Fermentation And Down

Stream Processing Of Bacillus. In : Harwood CR (&d)

Bacillus.Biotechnology Handbooks, Vol 2. Plenum Press, New York, pp

255-292.

SİMPSON, H.D., HAULLER, U.R., AND DANİEL, R. 1991. Biochem. J., 227:413-

417.

SİNDHU, G.S., SHAMA, P., CHAKRABARTİ, T., AND GUPTA, J.K. 1997. Strain

improvement for the production of a themostable α-amylase. Enzyme

Microbil. Technol. 24:584-59.

SPRING,S., LUDWIG,W., MARQUEZ,M.C., VENTOSA,A., AND

SCHLEIFER,K.H., 1996. Halobacillus gen. Nov. , with descriptions of

Halobacillus litoralis sp. nov. And Halobacillus trueperi sp. nov., and

transfer of Sporosarcina halophila to Halobacillus halophilus comb. nov.

Int. J Syst Bacteriol. 46:492-496.

SRIVASTAVA, R.A.K., 1987. Purification and Chemical Characterization

of Thermostable Amylases Produuced by Bacillus

stearothermophilus. Biochemistry Laboratory, Botany Department,

University of Gorakhpur, Gorakhpur 273001, India.

SZİLAGYİ, A., AD ZAVODSZKY, P. 2000. Structural differences between

mesophilic, moderately thermophilic and extremely thermophilic protein

subunits: results on a comprehensive survey. Structure. 8:493-504.

93

TAKASAKI, Y., FRUTANL S.. I-IAYASHI. S., and İMADA, K., 1994. Acid-Stable

and Thermostable a-Amyiase from Bacillus licheniformis. Journal

of Fermentation and Bioengineering, 77 (1): 94-96.

TARAKÇIOĞLU , Y., 1979. An Amylase Producing Maltotiose from Bacillus

subtilis . Agric. Biol. Chem.49 (4):1901-1097.

TARAKÇIOĞLU,Y., 1979. An amylase producing maltotriose from Bacillus

subtilis. Agric. Biol. Chem. 49 (4):1091-1097.

TEMÎZKAN, G., ve ARDA. N.. 1999. Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler.

İstanbul Üniversitesi, Biyoicknoloji ve Genetik Mühendisliği Araştırma

ve Uygulama Merkezi (BİYOGEM) No ; l,236s.

TOMME, P., WARREN, R.A., GİLKES,N.R., 1995. Cellulose hydrolisis this

bacteria and fungi. Adv. Microbiology Physiol, 37: 1-81.

UHLIG, H. 1998.Industrial enzymes and their applications. John Wiley&Sons, Inc.

VENTOSA, A., MARQUEZ.M.C., GARABITO.M.J., AND ARAHAL,D.R. 1998.

Moderately halophilic gram-positive bacterial diversity in hyper saline

environments. Extremophiles. 2:297-304.

WAINQ, M.,and INGWORSEN,K. 2003. Roduction of β-xylnase and β-xylosidase

by the extremelyhalophilic arceon Halorhabdus utahensis. Extremophiles,

7:87-93.

WHINEN, M., and MANTSALA, P. 1989. Microbial amylolytic enzymes. Crt. Rev.

Biochem. Mol. Bio. 24:329-418.

WIND, R.D., BUITELAAR, R.nu EGG1NK, G., HUIZING, H.J., DIJKHUIZEN,L.,

1994. Characterization of a New Bacillus stearothermophilus Isolate : A

Highly Thermostable a-Amylase-P reducing Strain. Appl.

Microbiol. Biotechnol 41 : 155-162.

WISEMAN,A., 1987. Handbook of enzyme biotechnology. Second Edition. Chapter

3. The application of enzymes in industry, p.274-373.

ZEIKUS, J.G., 1979. Enzyme Microb. Technol. 3,243.

ZEMAN, N.W. and McCREA, J.M., 1985. Alpha-amylase Production Using a

Recombinant DNA Organism. Cereal Foods World. 30 (1): 777-780.

94

95

ÖZGEÇMİŞ

1981 yılında Gaziantep'te doğdum.İlk, orta ve lise öğrenimimi Gaziantep'te

tamamladım. 1999 yılında Çukurova Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji

Bölümünü kazandım. 2003 yılında mezun oldum. 2004 yılında Çukurova

Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı' da Yüksek Lisans

Eğitimime başladım.2006 yılında Gaziantep Final Dergisi Dershanesi'ne Biyoloji

Öğretmeni olarak göreve başladım ve hala görevimi sürdürmekteyim.

Documents

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİİzole edilen verilere göre enzim deterjanlara dirençli, halofil, ekstrem alkalofil, pH stabil, ultratermofil, indüklenebilir termostabil özellik göstermektedir