UNE-EN_ISO_6887-5=2011[1]disolventes de alimentos_noPW

norma espaol

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Editada e impresa por AENOR Depsito legal: M 14598:2011

LAS OBSE

AENOR 2011 Reproduccin prohibida

Gnova, 628004 MADRID-Espa

la UNE-EN

obiologa de los alimentos para consal

aracin de las muestras de ensayo, susones decimales para examen microbiolg

5: Reglas especficas para la prepaructos lcteos

6887-5:2008)

logy of food and animal feeding stuffs. Preparation of test samples, ifor microbiological examination. Part 5: Specific rules for the p(ISO 6887-5:2010).

logie des aliments. Prparation des chantillons, de la suspension ml'examen microbiologique. Partie 5: Rgles spcifiques pour la prp

ISO 6887-5:2010).

rma es la versin oficial, en espaol, de la Norma Europeu vez adopta la Norma Internacional ISO 6887-5:2010.

rma anula y sustituye a la Norma UNE-EN ISO 8261:20

orma ha sido elaborada por el comit tcnico AEarios cuya Secretara desempea FIAB.

ERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A:

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N ISO 6887-5

Marzo 2011

sumo humano y

spensin inicial y gico

acin de leche y

initial suspension and decimal preparation of milk and milk

mre et des dilutions dcimales paration du lait et des produits

ea EN ISO 6887-5:2010,

002.

EN/CTN 34 Productos

19 Pginas

102 201 104 032

Grupo 14

AENOR AUTORIZA EL USO DE ESTE DOCUMENTO A INDECOPI PARA VENTA A CLIENTES

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NORMA EUROPEA EUROPEAN STANDARD NORME EUROPENNE EUROPISCHE NORM

EN ISO 6887-5 Agosto 2010

ICS 07.100.30 Sustituye a EN ISO 8261:2001

Versin en espaol

Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y

diluciones decimales para examen microbiolgico Parte 5: Reglas especficas para la preparacin de leche y productos lcteos

(ISO 6887-5:2008)

Microbiology of food and animal feeding stuffs. Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination. Part 5: Specific rules for the preparation of milk and milk products. (ISO 6887-5:2010).

Microbiologie des aliments. Prparation des chantillons, de la suspension mre et des dilutions dcimales en vue de l'examen microbiologique. Partie 5: Rgles spcifiques pour la prparation du lait et des produits laitiers. (ISO 6887-5:2010).

Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln. Vorbereitung von Untersuchungsproben und Herstellung von Erstverdnnungen und von Dezimalverdnnungen fr mikrobiologische Untersuchungen. Teil 5: Spezifische Regeln fr die Vorbereitung von Milch und Milcherzeugnissen. (ISO 6887-5:2010).

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2010-03-25. Los miembros de CEN estn sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificacin, la norma europea como norma nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliogrficas relativas a estas normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de Gestin de CEN, o a travs de sus miembros. Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemn, francs e ingls). Una versin en otra lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al Centro de Gestin, tiene el mismo rango que aqullas. Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalizacin de los pases siguientes: Alemania, Austria, Blgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, Espaa, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungra, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Pases Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, Repblica Checa, Rumana, Suecia y Suiza.

CEN COMIT EUROPEO DE NORMALIZACIN

European Committee for Standardization Comit Europen de Normalisation Europisches Komitee fr Normung

CENTRO DE GESTIN: Avenue Marnix, 17-1000 Bruxelles

2010 CEN. Derechos de reproduccin reservados a los Miembros de CEN.


EN ISO 6887-5:2010 - 4 -

PRLOGO

El texto de la Norma EN ISO 6887-5:2010 ha sido elaborado por el Comit Tcnico ISO/TC 34 Productos alimenticios en colaboracin con el Comit Tcnico CEN/TC 275 Anlisis de los productos alimenticios. Mtodos horizontales, cuya Secretara desempea DIN. Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicacin de un texto idntico a ella o mediante ratificacin antes de finales de febrero de 2011, y todas las normas nacionales tcnicamente divergentes deben anularse antes de finales de febrero de 2011. Se llama la atencin sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estn sujetos a derechos de patente. CEN y/o CENELEC no es(son) responsable(s) de la identificacin de dichos derechos de patente. Esta norma anula y sustituye a la Norma EN ISO 8261:2001. De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, estn obligados a adoptar esta norma europea los organismos de normalizacin de los siguientes pases: Alemania, Austria, Blgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, Espaa, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungra, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Pases Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, Repblica Checa, Rumana, Suecia y Suiza.

DECLARACIN El texto de la Norma ISO 6887-5:2010 ha sido aprobado por CEN como Norma EN ISO 6887-5:2010 sin ninguna modificacin.


- 5 - ISO 6887-5:2010

NDICE

Pgina

PRLOGO .............................................................................................................................................. 6 1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN ............................................................................. 7 2 NORMAS PARA CONSULTA ............................................................................................. 7 3 TRMINOS Y DEFINICIONES .......................................................................................... 7 4 PRINCIPIO............................................................................................................................. 8 5 DILUYENTES ........................................................................................................................ 8 5.1 Materiales bsicos .................................................................................................................. 8 5.2 Diluyentes de uso general ....................................................................................................... 8 5.3 Diluyentes para casos especiales .......................................................................................... 10 5.4 Distribucin y esterilizacin del diluyente .......................................................................... 12 5.5 Ensayo de rendimiento para el control de calidad ............................................................ 12 6 APARATOS .......................................................................................................................... 13 7 PREPARACIN DE LAS MUESTRAS ............................................................................ 13 7.1 Productos congelados ........................................................................................................... 13 7.2 Productos secos y duros ....................................................................................................... 13 7.3 Productos lquidos y no viscosos ......................................................................................... 14 7.4 Productos heterogneos ....................................................................................................... 14 8 PROCEDIMIENTOS GENERALES ................................................................................. 14 8.1 Generalidades ....................................................................................................................... 14 8.2 Toma de muestras ................................................................................................................ 14 8.3 Caso general para los productos cidos .............................................................................. 14 8.4 Alimentos de alto contenido en materia grasa (contenido en materia grasa > 20% en fraccin en masa) ............................................................................................................. 15 9 PROCEDIMIENTOS ESPECFICOS ............................................................................... 15 9.1 Leche y productos lcteos lquidos ...................................................................................... 15 9.2 Leche en polvo, suero de leche en polvo, suero cido de leche deshidratado, suero de mantequilla en polvo y lactosa ............................................................................. 15 9.3 Queso y productos elaborados a base de queso ................................................................. 16 9.4 Casena cida, casena lctica, casena al cuajo mediante hidrlisis enzimtica (casena rennet) y caseinatos................................................................................................ 16 9.5 Mantequilla ........................................................................................................................... 17 9.6 Helados .................................................................................................................................. 17 9.7 Natillas, postres y nata (pH > 5) .......................................................................................... 17 9.8 Leche fermentada y nata agria (pH < 5) ............................................................................ 18 9.9 Alimentos infantiles a base de leche .................................................................................... 18 10 DILUCIONES DECIMALES SUCESIVAS ...................................................................... 18 BIBLIOGRAFA ................................................................................................................................... 19


ISO 6887-5:2010 - 6 -

PRLOGO ISO (Organizacin Internacional de Normalizacin) es una federacin mundial de organismos nacionales de normalizacin (organismos miembros de ISO). El trabajo de preparacin de las normas internacionales normalmente se realiza a travs de los comits tcnicos de ISO. Cada organismo miembro interesado en una materia para la cual se haya establecido un comit tcnico, tiene el derecho de estar representado en dicho comit. Las organizaciones internacionales, pblicas y privadas, en coordinacin con ISO, tambin participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la Comisin Electrotcnica Internacional (IEC) en todas las materias de normalizacin electrotcnica. Las normas internacionales se redactan de acuerdo con las reglas establecidas en la Parte 2 de las Directivas ISO/IEC. La tarea principal de los comits tcnicos es preparar normas internacionales. Los proyectos de normas internacionales adoptados por los comits tcnicos se envan a los organismos miembros para votacin. La publicacin como norma internacional requiere la aprobacin por al menos el 75% de los organismos miembros que emiten voto. Se llama la atencin sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan estar sujetos a derechos de patente. ISO no asume la responsabilidad por la identificacin de cualquiera o todos los derechos de patente. La Norma ISO 6887-5 fue preparada por el Comit Tcnico ISO/TC 34, Productos alimenticios, Subcomit SC 9, Microbiologa. Esta primera edicin anula y sustituye a la Norma ISO 8261|IDF 122:2001, que ha sido revisada tcnicamente. La Norma ISO 8261|IDF 122:2001 fue elaborada por el ISO/TC 34/SC 5 Leche y productos lcteos, y con su visto bueno, ha sido renumerada como ISO 6887-5 y revisada tcnicamente por el ISO/TC 34/SC 9 con las siguientes modificaciones: a) la introduccin de agua de peptona tamponada como un disolvente de uso general; b) el precalentamiento sistemtico del disolvente se mantiene slo para aquellos casos en los que

resuelve problemas de homogeneidad de la suspensin; c) la eliminacin de la etapa de reactivacin. La Norma ISO 6887, consiste en las siguientes partes, bajo el ttulo general Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para examen microbiolgico:

Parte 1: Reglas generales para la preparacin de la suspensin inicial y las diluciones decimales.

Parte 2: Reglas especficas para la preparacin de carne y productos crnicos.

Parte 3: Reglas especficas para la preparacin de pescados y productos de la pesca.

Parte 4: Reglas especficas para la preparacin de productos distintos a leche y productos lcteos, carne y productos crnicos y, pescados y productos de la pesca.

Parte 5: Reglas especficas para la preparacin de leche y productos lcteos. La siguiente parte est en elaboracin:

Parte 6: Reglas especficas para la preparacin de muestras tomadas en la etapa de produccin primaria.


- 7 - ISO 6887-5:2010

AVISO La utilizacin de esta norma internacional puede suponer el uso de equipamiento, procedimientos y materiales peligrosos. Es responsabilidad del usuario establecer las prcticas de seguridad e higiene adecuadas y determinar las limitaciones reglamentarias de aplicacin con anterioridad a su puesta en prctica. 1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN

Esta parte de la Norma ISO 6887 define las reglas para la preparacin de las muestras de leche y productos lcteos y de sus suspensiones para el examen microbiolgico cuando las muestras necesitan una preparacin diferente de los mtodos generales descritos en la Norma ISO 6887-1. La Norma ISO 6887-1 define las reglas generales para la prepara-cin de la suspensin inicial y de las diluciones decimales para el examen microbiolgico. Esta parte de la Norma ISO 6887 excluye la preparacin de muestras en mtodos de anlisis de deteccin y recuento para los que los detalles de la preparacin se describen en las correspondientes normas internacionales. Esta parte de la Norma ISO 6887 resulta aplicable para:

a) leche y productos lcteos lquidos;

b) productos lcteos en polvo;

c) queso;

d) casena y caseinatos;

e) mantequilla;

f) helados;

g) natillas, postres y nata;

h) leche fermentada y nata agria;

i) alimentos infantiles a base de leche. 2 NORMAS PARA CONSULTA

Las normas que a continuacin se indican son indispensables para la aplicacin de esta norma. Para las referencias con fecha, slo se aplica la edicin citada. Para las referencias sin fecha se aplica la ltima edicin de la norma (incluyendo cualquier modificacin de sta). ISO 707|IDF 50 Leche y productos lcteos. Directrices para la toma de muestras. ISO 6887-1 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para examen microbiolgico. Parte 1: Reglas generales para la preparacin de la suspensin inicial y las diluciones decimales. EN ISO 7218 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y alimentacin animal. Requisitos generales y gua para el examen microbiolgico. ISO/TS 11133-2 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Gua para la preparacin y produccin de medios de cultivo. Parte 2: Gua prctica para las pruebas de rendimiento de medios de cultivo. 3 TRMINOS Y DEFINICIONES

Para los fines de este documento, se aplican los trminos y definiciones siguientes:

3.1 muestra de laboratorio: Muestra preparada para su envo al laboratorio y destinada a su inspeccin o anlisis. NOTA Adaptado del captulo A.19 de la Norma ISO 7002:1986[1].


ISO 6887-5:2010 - 8 -

3.2 porcin para anlisis: Volumen medido o masa medida de una muestra representativa, recogida de la muestra de laboratorio y destinada a la preparacin de la suspensin inicial.

3.3 suspensin inicial; dilucin inicial: Suspensin, disolucin o emulsin obtenida cuando se ha mezclado una cierta cantidad medida o pesada del producto examinado (o de una muestra para anlisis preparada a partir del producto), utilizando en caso necesario un mezclador y observando las precauciones necesarias, con una cantidad nueve veces superior del medio de dilucin (diluyente), dejando que las partculas grandes, si existen, queden sedimentadas. NOTA 1 Vanse las precauciones necesarias en el apartado 8.1. NOTA 2 Vanse los detalles sobre los diluyentes en el captulo 5.

3.4 diluciones decimales sucesivas Suspensiones, disoluciones o emulsiones obtenidas al mezclar un volumen determinado de la dilucin inicial (3.3) con un volumen nueve veces superior de diluyente, y repitiendo esta operacin con todas las dems diluciones preparadas de la misma manera, hasta conseguir una serie de diluciones decimales adecuada para la inoculacin de los medios de cultivo. 4 PRINCIPIO

Se prepara una suspensin inicial (3.3) con una distribucin tan homognea como sea posible de los microorganismos presentes en la muestra para anlisis. En caso necesario, se preparan diluciones decimales sucesivas (3.4) destinadas a reducir el nmero de microorganismos por unidad de volumen, que permita, tras la incubacin, la observacin de todo tipo de crecimiento (en el caso de los medios lquidos) o de colonias (en el caso de las placas de agar), segn se establece en cada norma internacional correspondiente. Para restringir, en caso necesario, el rango del recuento dentro de un intervalo definido, o si se prev la presencia de un gran nmero de microorganismos, es posible inocular solamente las diluciones decimales adecuadas (al menos dos diluciones consecutivas) para conseguir un recuento conforme a los clculos descritos en la Norma ISO 7218. 5 DILUYENTES

Durante los anlisis, y salvo indicacin en sentido contrario, se utilizan exclusivamente reactivos de calidad analtica reconocida y solamente agua estril destilada o desionizada.

5.1 Materiales bsicos

Vase la Norma ISO 6887-1.

5.2 Diluyentes de uso general 5.2.1 Disolucin salina de peptona 5.2.1.1 Composicin

Digerido enzimtico de casena 1,0 g

Cloruro sdico (NaCl) 8,5 g

Agua 1 000 ml


- 9 - ISO 6887-5:2010

5.2.1.2 Preparacin

Se disuelven los componentes en el agua, calentando suavemente en una placa calefactora (6.6) en caso necesario. Se ajusta el pH si es necesario, de forma que tras la esterilizacin sea de 7,0 0,2 unidades a 25 C. 5.2.2 Disolucin de Ringer de potencia 1/4x 5.2.2.1 Composicin


Cloruro potsico (KCl) 0,105 g

Cloruro clcico (CaCl2), anhidro 0,06 ga

Hidrgeno carbonato sdico (NaHCO3) 0,05 g

Agua 1 000 ml a Alternativamente, se utilizan 0,12 g de CaCl26H2O.

5.2.2.2 Preparacin

Se disuelven las sales en el agua. Se ajusta el pH si es necesario, de forma que tras la esterilizacin sea de 6,9 0,2 unidades a 25 C. 5.2.3 Disolucin de peptona 5.2.3.1 Composicin

Digerido enzimtico de casena 1,0 g

Agua 1 000 ml

5.2.3.2 Preparacin

Se disuelve la peptona en el agua. Se ajusta el pH si es necesario, de forma que tras la esterilizacin sea de 7,0 0,2 unidades a 25 C. 5.2.4 Disolucin tamponada de fosfato 5.2.4.1 Composicin

Dihidrgeno fosfato potsico (KH2PO4) 42,5 g

Agua 1 000 ml

5.2.4.2 Preparacin

Se disuelve la sal en 500 ml de agua. Se ajusta el pH si es necesario, de forma que tras la esterilizacin sea de 7,2 0,2 unidades a 25 C. Se diluye hasta 1 000 ml con el resto del agua. La disolucin concentrada se almacena refrigerada. Se aade 1 ml de esta disolucin concentrada sobre 1 000 ml de agua para su uso como diluyente.


ISO 6887-5:2010 - 10 -

5.2.5 Disolucin de peptona tamponada 5.2.5.1 Composicin

Digerido enzimtico de tejidos animales 10,0 g


Hidrgeno fosfato disdico dodecahidratado (Na2HPO412H2O) 9,0 ga

Dihidrgeno fosfato potsico (KH2PO4) 1,5 g

Agua 1 000 ml a Alternativamente, se utilizan 3,56 g de hidrgeno fosfato disdico anhidro (Na2HPO4).

5.2.5.2 Preparacin

Se disuelven los componentes en el agua, calentando suavemente en una placa calefactora (6.6) en caso necesario. Se ajusta el pH si es necesario, de forma que tras la esterilizacin sea de 7,0 0,2 unidades a 25 C. 5.2.5.3 Aplicacin

Se recomienda en especial este diluyente para la deteccin de Salmonella spp. o para el recuento de Listeria monocytogenes, pero tambin se puede utilizar para la preparacin de las suspensiones iniciales en otras determinaciones.

5.3 Diluyentes para casos especiales

Estos diluyentes solamente deben utilizarse para la preparacin de las suspensiones iniciales. 5.3.1 Disolucin de citrato sdico 5.3.1.1 Composicin

Citrato trisdico dihidratado (Na3C6H5O72H2O) 20,0 g

Agua 1 000 ml

5.3.1.2 Preparacin

Se disuelve la sal en el agua, calentando en caso necesario en una placa calefactora (6.6) a una temperatura de 45 C a 50 C. Se ajusta el pH si es necesario, de forma que tras la esterilizacin sea de 7,5 0,2 unidades a 25 C. 5.3.1.3 Aplicacin

Esta disolucin se utiliza para queso y leche en polvo obtenida mediante rodillos (Hatmaker), y para algunos caseinatos. 5.3.2 Disolucin de hidrgeno fosfato dipotsico 5.3.2.1 Composicin

Hidrgeno fosfato dipotsico (K2HPO4) 20,0 g

Agua 1 000 ml


- 11 - ISO 6887-5:2010

5.3.2.2 Preparacin

Se disuelve la sal en el agua, calentando en caso necesario en una placa calefactora (6.6) a una temperatura de 45 C a 50 C. Para el suero agrio en polvo, se ajusta el pH de forma que para la dilucin inicial, tras la esterilizacin, sea de 8,4 0,2 unidades a 25 C. Para el queso, la leche en polvo obtenida mediante rodillos (Hatmaker), la leche fermentada, los caseinatos y la nata agria, se ajusta el pH de forma que tras la esterilizacin sea de 7,5 0,2 unidades a 25 C. 5.3.2.3 Aplicacin

Esta disolucin se utiliza para el queso, la leche en polvo obtenida mediante rodillos (Hatmaker), la leche fermentada, algunos caseinatos, el suero agrio en polvo y la nata agria. 5.3.3 Disolucin de hidrgeno fosfato dipotsico con agente antiespumante 5.3.3.1 Disolucin de hidrgeno fosfato dipotsico 5.3.3.1.1 Composicin

Hidrgeno fosfato dipotsico (K2HPO4) 20,0 g

Agua 1 000 ml

5.3.3.1.2 Preparacin

Se disuelve el hidrgeno fosfato dipotsico en el agua, calentando en caso necesario en una placa calefactora (6.6) a una temperatura de 45 C a 50 C. 5.3.3.2 Disolucin concentrada de antiespumante 5.3.3.2.1 Composicin

Polietilnglicol 2 000 1 g

Agua 100 ml

5.3.3.2.2 Preparacin

Se disuelve el polietilnglicol 2 000 en el agua mezclando. 5.3.3.3 Preparacin

Se aade 1 ml de la disolucin concentrada del agente antiespumante (5.3.3.2) a 1 l de la disolucin de K2HPO4 (5.3.3.1). Se ajusta el pH de forma que la dilucin inicial tanto para la casena lctica como cida, tras la esterilizacin, sea de 8,4 0,2 unidades a 25 C, y para la casena al cuajo mediante hidrlisis enzimtica (casena rennet), tras la esterilizacin, sea de 7,5 0,2 unidades a 25 C. 5.3.3.4 Aplicacin

Esta disolucin se utiliza para casena cida, casena lctica y casenas al cuajo mediante hidrlisis enzimtica (casenas rennet). 5.3.4 Disolucin de tripolifosfato 5.3.4.1 Composicin

Tripolifosfato sdico (Na5O10P3) 20,0 g

Agua 1 000 ml


ISO 6887-5:2010 - 12 -

5.3.4.2 Preparacin

Se disuelve la sal en el agua, calentando suavemente en caso necesario en una placa calefactora (6.6). La disolucin de tripolifosfato se reparte en botellas en porciones de 90 ml y se esterilizan. El medio se puede almacenar a una temperatura de 5 C 3 C durante un mximo de un mes. 5.3.4.3 Aplicacin

Esta disolucin se utiliza como diluyente alternativo para las casenas al cuajo mediante hidrlisis enzimtica (casenas rennet) difciles de disolver. 5.3.5 Diluyente de uso general con disolucin de -amilasa 5.3.5.1 Composicin

Se aaden 12,5 mg de -amilasa (EC 3.2.1.1, vase la referencia [3] de la bibliografa), de una actividad especfica de aproximadamente 400 unidades1) por miligramo sobre 225 ml del diluyente de uso general (vase el apartado 5.2). Este diluyente se utiliza para una porcin para anlisis de 25 g. Se utilizan cantidades proporcionales para la preparacin de porciones de ensayo diferentes (por ejemplo, para una porcin para anlisis de 10 g, se aaden 5 mg de -amilasa sobre 90 ml de diluyente de uso general). 5.3.5.2 Aplicacin

Esta disolucin se utiliza para alimentos que contienen almidn. 5.3.6 Agua de peptona tamponada con prpura de bromocresol 5.3.6.1 Composicin

Agua de peptona tamponada (vase el apartado 5.2.5) 1 000 ml

Prpura de bromocresol (disolucin en alcohol al 4%, por ejemplo disolucin etanlica) 0,1 ml

5.3.6.2 Preparacin

Se aade 0,1 ml de disolucin de prpura de bromocresol a 1 000 ml de agua de peptona tamponada (5.2.5). 5.3.6.3 Aplicacin

Esta disolucin se puede utilizar con ciertos productos cidos de forma que el ajuste del pH se puede realizar sin el uso de una sonda de pH estril (vase 8.3). El prpura de bromocresol es amarillo a pH cido, virando a prpura a un pH superior a 6,8.

5.4 Distribucin y esterilizacin del diluyente

Vase la Norma ISO 6887-1.

5.5 Ensayo de rendimiento para el control de calidad

Se realiza un control de calidad para todos los diluyentes incluidos en esta parte de la Norma ISO 6887, segn se describe para la disolucin salina de peptona en la Especificacin Tcnica ISO/TS 11133-2.

1) Esta unidad (frecuentemente denominada Unidad Internacional o Unidad Estndar) se define como la cantidad de enzima que cataliza la

transformacin de 1 mol de sustrato por minuto en condiciones normales.


- 13 - ISO 6887-5:2010

Incubacin: 45 min a una temperatura de 20 C a 25 C.

Cepa: Escherichia coli WDCM 00013a,2) o WDCM 00012a,2)

Staphylococcus aureus WDCM 000342)

Medio de control: TSA a 37 C 1 C durante 24 h 2 h

Mtodo de control: Cuantitativo

Criterios: 50% del recuento a t0 a Cepas para ser utilizadas por el laboratorio del usuario (como mnimo).

6 APARATOS

El equipamiento habitual de un laboratorio microbiolgico (vanse las Normas ISO 7218 e ISO 6887-1) y, en particular, lo siguiente.

6.1 Mezclador peristltico o giratorio

6.2 Mezclador de vrtex

6.3 Cuentas de vidrio, de un dimetro de aproximadamente 6 mm.

6.4 Baos de agua, capaces de mantener respectivamente unas temperaturas de 37 C 1 C y 45 C 1 C.

6.5 Esptulas o varillas de vidrio

6.6 Placa calefactora u otro aparato capaz de un calentamiento suave (no un mechero de gas), y capaz de funcionar a la temperatura requerida. 7 PREPARACIN DE LAS MUESTRAS 7.1 Productos congelados

Los productos almacenados congelados deberan calentarse hasta alcanzar una consistencia que permita su toma de muestras, por ejemplo mantenindolos a una temperatura de 18 C a 27 C (temperatura del laboratorio) durante un tiempo mximo de 3 h o a una temperatura de 3 C 2 C durante un tiempo mximo de 24 h. Las muestras deberan ensayarse lo ms rpidamente posible despus de esto. Vase la Norma ISO 6887-1. Si el producto se mantiene an congelado mientras se divide, pueden utilizarse algn diluyente (captulo 5) a la temperatura del laboratorio para facilitar su descongelacin.

7.2 Productos secos y duros

Para mezclar productos duros en un mezclador peristltico (6.1), la muestra y el diluyente se colocan en dos o ms bolsas estriles para evitar que se agujeree y la posible prdida de muestra. Los productos secos o duros no se deben homogeneizar en el homogeneizador giratorio durante ms de 2,5 min cada vez.

2) Para ms informacin acerca de los nmeros de las cepas de la coleccin de cultivos y los detalles de contacto, consltese el catlogo de cepas de

referencia disponibles (consultado el 19-07-2010) en http://www.wfcc.nig.ac.jp/WDCM_Reference_Strain_Catalogue.


ISO 6887-5:2010 - 14 -

En el caso de los productos secos y duros o heterogneos, puede ser necesario deshacer o triturar la muestra de laboratorio. En este caso, para evitar un aumento excesivo de la temperatura, no se deben deshacer o triturar durante ms de 1 min.

7.3 Productos lquidos y no viscosos

La muestra para anlisis se agita manualmente (vase 9.1) o mecnicamente para asegurar una distribucin uniforme de los microorganismos antes del anlisis.

7.4 Productos heterogneos

La toma de muestras de los productos heterogneos (que contienen porciones de distintos alimentos) debera realizarse recogiendo alcuotas de cada componente, representativas de sus proporciones en el producto original. Tambin se puede homogeneizar toda la muestra de laboratorio para conseguir que la toma de muestras se realice sobre una muestra para anlisis ms homognea. Puede resultar necesario deshacer o triturar la muestra de laboratorio. En este caso, para evitar un aumento excesivo de temperatura, no se deben deshacer o triturar durante ms de 1 min. 8 PROCEDIMIENTOS GENERALES 8.1 Generalidades

Todas las preparaciones y las manipulaciones deberan realizarse utilizando buenas prcticas aspticas y utilizando un equipamiento estril para evitar la contaminacin microbiolgica de las muestras por fuentes externas. Consltese la Norma ISO 7218. Se indica en el informe qu procedimiento se utiliza para el anlisis si es distinto del procedimiento descrito en esta parte de la Norma ISO 6887.

8.2 Toma de muestras

Debera haberse enviado al laboratorio una muestra representativa que no debera haber sufrido dao o transformacin durante el transporte o el almacenamiento. La toma de muestras no es parte del mtodo descrito en esta parte de la Norma ISO 6887. En la Norma ISO 707|IDF 50 se expone un mtodo de toma de muestras recomendado. Si no hay una norma internacional especfica relacionada con el producto considerado, se recomienda que las partes interesadas alcancen un acuerdo sobre el particular.

8.3 Caso general para los productos cidos

Cuando se utiliza una disolucin en suspensin de productos cidos, se verifica que el pH se revierte a un valor neutro. El uso de un diluyente con indicador de pH aadido (5.3.6) puede evitar la necesidad de utilizar y esterilizar sondas de pH; se aade hidrxido sdico (NaOH) hasta que el indicador comience a cambiar de color. En los diluyentes tamponados, suele ser necesaria la adicin de NaOH, para aumentar la capacidad tamponante del componente alcalino. La concentracin de NaOH aadido depende de la acidez del producto. La concentracin ms adecuada (por ejemplo 0,1 mol/l o 1 mol/l) es la concentracin que todava mantiene una proporcin cercana a 1 a 9 con el diluyente.


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8.4 Alimentos de alto contenido en materia grasa (contenido en materia grasa > 20% en fraccin en masa)

El uso de un diluyente con una cantidad aadida de monooleato de sorbitn [polisorbato 803)] entre 1 g/l y 10 g/l, en relacin aproximada a los niveles de materia grasa (por ejemplo se aaden 4 g/l para un contenido de materia grasa del 40%) puede mejorar la emulsificacin durante la suspensin. 9 PROCEDIMIENTOS ESPECFICOS 9.1 Leche y productos lcteos lquidos

La muestra para anlisis se mezcla exhaustivamente de forma que los microorganismos se distribuyan lo ms homog-neamente posible invirtiendo el recipiente de la muestra 25 veces. Se evita la formacin de espuma o bien se deja que se deshaga la espuma formada. El tiempo transcurrido entre la mezcla y la recogida de la porcin para anlisis no debe ser mayor de 3 min. Se retira como mnimo 1 ml de la muestra para anlisis con una pipeta estril y se aade un volumen nueve veces superior del diluyente de uso general (5.2). Se agita esta disolucin inicial [por ejemplo 25 veces con un movimiento de aproximadamente 300 mm durante 7 s de forma manual, o utilizando un mezclador de vrtex (6.2) durante un tiempo de 5 s a 10 s] para obtener una dilucin de orden 10-1. Se preparan diluciones sucesivas conforme al captulo 10.

9.2 Leche en polvo, suero de leche en polvo, suero cido de leche deshidratado, suero de mantequilla en polvo y lactosa

Se mezcla exhaustivamente el contenido del recipiente cerrado por agitacin repetida e inversin. Si la muestra para anlisis se presenta en su recipiente original sin abrir y ste est demasiado lleno como para permitir una agitacin suficiente, se transfiere a un recipiente de mayor tamao y se mezcla. Se abre el recipiente, se retira la porcin para anlisis necesaria con una esptula y se procede segn se indica a continuacin. El recipiente se vuelve a cerrar inmediatamente. Se pesan 10 g de la muestra para anlisis y se introducen en un recipiente de vidrio estril (por ejemplo un vaso de precipitados) y se aade el material en polvo a la botella de dilucin que contiene diluyente de uso general (5.2). Para el suero de leche agrio se utiliza disolucin de hidrgeno fosfato dipotsico (5.3.2) a un pH de 8,4 0,2 o, en caso necesario, para leche en polvo obtenida mediante rodillos (Hatmaker), se utiliza disolucin de citrato sdico (5.3.1) o disolucin de hidrgeno fosfato dipotsico (5.3.2) a un pH de 7,5 0,2. Alternativamente, se pesan 10 g de la muestra para anlisis directamente en la botella que contiene el diluyente necesario. NOTA Para conseguir una mejor reconstitucin, y en particular para leche en polvo obtenida mediante rodillos (Hatmaker), pueden resultar

convenientes las cuentas de vidrio (6.3). Si se utilizan, deberan aadirse a la botella antes de su esterilizacin. Para disolver la muestra para anlisis, se remueve suavemente para humedecer el producto en polvo y a continuacin se agita la botella por ejemplo 25 veces, con un movimiento de aproximadamente 300 mm, durante un tiempo de unos 7 s. Puede utilizarse un agitador peristltico (6.1) como alternativa a la agitacin. Se deja en reposo durante 5 min, agitando ocasionalmente. El diluyente puede precalentarse a 45 C si no puede conseguirse una suspensin homognea incluso despus de mezclar. Dicho procedimiento adicional se menciona en el informe del anlisis. Se preparan diluciones sucesivas conforme al captulo 10.

3) Tween 80 es un ejemplo de un producto comercial adecuado disponible en el mercado. Esta informacin se facilita por su utilidad para los

usuarios de este documento sin que ello constituya una recomendacin por parte de ISO hacia el producto mencionado.


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9.3 Queso y productos elaborados a base de queso

Se pesan 10 g de la muestra para anlisis en una placa y se transfieren al recipiente de un mezclador giratorio o de un mezclador peristltico (6.1). Alternativamente, se pesan 10 g de la muestra para anlisis directamente en el recipiente. Se aaden 90 ml del diluyente de uso general (5.2) o, como diluyente para el queso, 90 ml de disolucin de citrato sdico (5.3.1) o de disolucin de hidrgeno fosfato dipotsico (5.3.2) a un pH de 7,5 0,2. Se mezcla hasta que todo el queso quede bien dispersado. Se deja que se deshaga toda la espuma. El diluyente puede precalentarse a 45 C si no se puede obtener una suspensin homognea incluso despus de mezclar. Dicho procedimiento adicional se menciona en el informe del anlisis. Se preparan diluciones sucesivas conforme al captulo 10.

9.4 Casena cida, casena lctica, casena al cuajo mediante hidrlisis enzimtica (casena rennet) y caseinatos 9.4.1 Caso general

Se mezcla exhaustivamente el contenido del recipiente cerrado por agitacin repetida e inversin. Se pesan 10 g de la muestra para anlisis y se introducen en la bolsa de plstico estril de un mezclador peristltico (6.1). Se aaden 90 ml del diluyente adecuado a temperatura ambiente, de la siguiente manera: a) para casena cida y lctica, se diluye con disolucin de hidrgeno fosfato dipotsico con agente antiespumante

(5.3.3) a un pH de 8,4 0,2 unidades; b) para caseinato, se diluye con disolucin de citrato (5.3.1) o con disolucin de hidrgeno fosfato dipotsico (5.3.2) a

un pH de 7,5 0,2 o disolucin salina de peptona (5.2.1); c) para casena al cuajo mediante hidrlisis enzimtica (casena rennet), se diluye con disolucin de hidrgeno fosfato

dipotsico con agente antiespumante (5.3.3) a un pH de 7,5 0,2 unidades. Se mezcla bien manualmente y se deja en reposo a temperatura ambiente durante 15 min. En caso necesario se mezcla durante 2 min en el mezclador peristltico (6.1) utilizando dos bolsas estriles para los productos granulados. Se deja en reposo durante 5 min. Se preparan diluciones sucesivas conforme al captulo 10. 9.4.2 Caso especial: casena al cuajo mediante hidrlisis enzimtica (casena rennet)

La casena al cuajo mediante hidrlisis enzimtica (casena rennet) puede resultar difcil de disolver. Puede utilizarse un protocolo alternativo al descrito en el apartado 9.4.1. El uso de disolucin de hidrgeno fosfato dipotsico con agente antiespumante (5.3.3) como diluyente para las casenas de rennet puede no ser eficaz en la disolucin de los granos. Dichos granos de casena dificultan el recuento de microorganismos a 30 C. Por consiguiente, se recomienda el siguiente procedimiento alternativo. En caso necesario, se tritura la casena seca antes de recoger la porcin para anlisis. Se transfieren aproximadamente 20 g de la porcin para anlisis a un recipiente adecuado. Se trituran utilizando un aparato con cuchillas capaz de girar a una frecuencia de aproximadamente 20 000 r/min, equipado con un sistema que prevenga que la muestra se caliente durante la trituracin4).

4) El aparato VirTis es un ejemplo de un producto comercial adecuado disponible en el mercado. Esta informacin se facilita por su utilidad para los

usuarios de este documento sin que ello constituya una recomendacin por parte de ISO hacia el producto mencionado.


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Se pesan 5 g de la muestra para anlisis preparada de esta forma en una botella estril de 250 ml. Se aaden cuentas de vidrio (6.3) para mezclar y 95 ml de la disolucin de tripolifosfato sdico (5.3.4) precalentada a 37 C. Se mezcla dejando la botella en el sistema de mezclado durante 15 min. A continuacin se introduce en el bao de agua (6.4) calentado a 37 C durante 15 min mezclando de vez en cuando. Se preparan diluciones sucesivas conforme al captulo 10.

9.5 Mantequilla

Vase la Norma ISO 707|IDF 50 si se considera necesario excluir de la investigacin la superficie de una muestra de mantequilla. Se pesan 10 g de la muestra para anlisis y se llevan al recipiente para muestras. El recipiente se introduce en el bao de agua (6.4) calentado a 45 C. Se mantiene dentro del bao de agua hasta que toda la porcin para anlisis se acabe de fundir. Se aaden 90 ml del diluyente de uso general (5.2) calentado a 45 C y se mezcla. Esta operacin se realiza ms fcilmente en un mezclador peristltico (6.1). Alternativamente, se utiliza solamente la fase acuosa para la dilucin, de la siguiente manera. Se recoge una porcin para anlisis de 50 g que contenga una proporcin volumen:masa de agua del W %. Se aaden (50 [50 W/100]) ml del diluyente de uso general (5.2) precalentado en el bao de agua (6.4) a 45 C. En estas condiciones, 1 ml de fase acuosa corresponde a 1 g de mantequilla. EJEMPLO Para 50 g de mantequilla con una proporcin volumen:masa de agua de aproximadamente el 16%, la fase acuosa representa 8 ml de

lquido. Se aaden (50 [50 x 16/100]) = 42 ml del diluyente de uso general (5.2) precalentado en el bao de agua (6.4) a 45 C.

El recipiente se introduce en el bao de agua (6.4) calentado a 45 C hasta que se funda la mantequilla. Se retira del bao de agua, se agita bien y se deja que las fases se separen durante un tiempo no superior a 15 min. En caso necesario, la fase de materia grasa se retira con una esptula o con una varilla de vidrio (6.5). En caso necesario, para separar las fases, se transfiere la porcin para anlisis fundida a un tubo de centrfuga estril (o bien se funde la porcin para anlisis directamente en el tubo) y se centrifuga a una frecuencia de rotacin que permita la separacin de fases. Puede ser necesario retirar aspticamente la fase de materia grasa (superior) utilizando un tubo estril conectado a una bomba de vaco. Se pipetea de la fase inferior. Se preparan diluciones sucesivas conforme al captulo 10.

9.6 Helados

Se pesan 10 g de la muestra para anlisis y se introducen en un matraz o en la bolsa de plstico estril de un mezclador peristltico (6.1). Se aaden 90 ml de diluyente a temperatura ambiente y se mezcla. El producto se funde a la vez que se mezcla. Se preparan diluciones sucesivas conforme al captulo 10.

9.7 Natillas, postres y nata (pH > 5)

Se pesan 10 g de la muestra para anlisis y se introducen en un matraz que contenga cuentas de vidrio (6.3). Se aaden 90 ml del diluyente de uso general (5.2) a temperatura ambiente y se agita para disgregar. Alternativamente, puede utilizarse un mezclador peristltico (6.1) siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso, la bolsa no debera contener cuentas de vidrio. Se preparan diluciones sucesivas conforme al captulo 10.


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9.8 Leche fermentada y nata agria (pH < 5)

Se pesan 10 g de la muestra para anlisis y se introducen en un matraz que contenga cuentas de vidrio (6.3). Se aaden como diluyente 90 ml de agua de peptona tamponada (5.2.5) o de disolucin de hidrgeno fosfato dipotsico (5.3.2) a un pH de 7,5 0,2 unidades a temperatura ambiente y se agita de forma manual. Alternativamente, puede utilizarse un mezclador peristltico (6.1) siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso, la bolsa no debera contener cuentas de vidrio. Se preparan diluciones sucesivas conforme al captulo 10.

9.9 Alimentos infantiles a base de leche

Se mezcla exhaustivamente el contenido del recipiente cerrado por agitacin repetida e inversin. Si la muestra para anlisis se encuentra en su recipiente original sin abrir y ste est demasiado lleno como para permitir que se mezcle lo suficiente, se transfiere a un recipiente de mayor tamao y se mezcla. Se abre el recipiente, se retira la porcin para anlisis necesaria con una esptula (6.5) y se contina segn se indica a continuacin. El recipiente se vuelve a cerrar inmediatamente. Se pesan 10 g de la muestra para anlisis y se introducen en un recipiente de vidrio estril adecuado (por ejemplo en un vaso de precipitados). Se aade el material en polvo a la botella de dilucin que contiene un diluyente de uso general (5.2), o, para muestras con un alto contenido en almidn, un diluyente para casos especiales (5.3.5). Alternativamente, se pesan 10 g de la muestra para anlisis directamente en la botella con el diluyente necesario. El diluyente puede precalentarse a 45 C si no puede conseguirse una suspensin homognea incluso despus de mezclar. Dicho procedimiento adicional se menciona en el informe de ensayo. Para conseguir una mejor reconstitucin, podra resultar conveniente el uso de cuentas de vidrio (6.3). Si se utilizan, se aaden a la botella antes de su esterilizacin. Para disolver la muestra, se remueve suavemente para humedecer el producto en polvo y a continuacin se agita la botella de forma manual, por ejemplo 25 veces, con un movimiento de aproximadamente 300 mm, durante un tiempo de unos 7 s. Alternativamente, puede utilizarse un agitador peristltico (6.1). Se deja en reposo durante 5 min, agitando de vez en cuando. Se preparan diluciones sucesivas conforme al captulo 10. Las muestras con un alto contenido de almidn pueden ocasionar problemas debidos a la elevada viscosidad de la disolucin base. Se utiliza el diluyente de uso general (5.2) con disolucin de -amilasa (5.3.5) para reducir la viscosidad de la disolucin inicial, o bien se utiliza una cantidad doble de diluyente. Esta dilucin adicional se toma en consideracin en los exmenes posteriores. 10 DILUCIONES DECIMALES SUCESIVAS

Vase la Norma ISO 6887-1. Cuando se transfieren volmenes de una dilucin inicial viscosa, como las de la casena cida o de rennet (9.4), la pipeta se enjuaga con diluyente aspirando varias veces, utilizando el diluyente del tubo utilizado para preparar la dilucin decimal. IMPORTANTE Si el proceso mencionado se realiza sin enjuagar la pipeta cuando se transfiere una dilucin inicial viscosa, se transfiere un volumen incorrecto de dilucin inicial. Cuando se han recogido 10 ml ms 90 ml, u 11 ml ms 99 ml, se agita de forma manual como se describe en el aparta-do 9.1.


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BIBLIOGRAFA [1] ISO 7002:1986, Agricultural food products. Layout for a standard method of sampling from a lot [2] ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs. Guidelines on preparation and production of

culture media. Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory

[3] Webb, E. C. Enzyme nomenclature 1992: Recommendations of the Nomenclature Committee of the

International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. Academic Press, London, 1992, 862p. Update available (2009-09-30) at: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html


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