SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE
Fakulta biotechnológie a potravinárstva
1126197
SPôsoB DETEKCIE LIESKOVÝCH ORECHOV AKO ALERGÉNNEJ ZLOŽKY
POTRAVÍN
2010Lucia Moskaľová
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE
Fakulta biotechnológie a potravinárstva
SPôsoB DETEKCIE LIESKOVÝCH ORECHOV AKO ALERGÉNNEJ ZLOŽKY
POTRAVÍN
(Bakalárska práca)
Štúdijný program: Agropotravinárstvo
Študijný odbor: 6.1.13 Spracovanie poľnohospodárskych
produktov
Školiace pracovisko: Katedra hygieny a bezpečnosti
potravín
Školiteľ: Ing. Radoslav Židek, PhD.
Nitra, 2010 Lucia MOSKAĽOVÁ
Čestné vyhlásenie
Podpísaná Lucia Moskaľová vyhlasujem, že som záverečnú prácu na
tému „Spôsoby detekcie lieskových orechov ako alergénnej zložky
potravín“ vypracovala samostatne s použitím uvedenej
literatúry.
Som si vedomá zákonných dôsledkov v prípade, ak uvedené
údaje nie sú pravdivé.
V Nitre 15. mája 2010
Lucia Moskaľová
Poďakovanie
Ďakujem vedúcemu bakalárskej práce, pánovi Ing. Radoslavovi
Židekovi, PhD. Za cenné rady, pripomienky a odborné vedenie,
ktoré mi pri spracovaní bakalárskej práce poskytol.
Abstrakt
Lieskové orechy sú široko používané v potravinárskom
priemysle vzhľadom na ich výživnú hodnotu a chuť. Prítomnosť
určitého množstva lieskových orechov v recepte je považovaná
za známku kvality. Na druhej strane kontaminácia potravín, ktoré
bežne neobsahujú orechy je hrozbou pre pacientov s alergiou na
orechy. Z tohto dôvodu je potrebná dostupnosť metód na
detekciu lieskových orechov v potravinách. Cieľom tejto práce
je predstaviť metódy na detekciu lieskových orechov
v potravinárskych výrobkoch, ktoré sú potenciálne uplatniteľné
pre potravinársky priemysel. V bežných potravinových analýzach
sa používajú enzyme-linked immunosorbent test (ELISA)
a polymerázová reťazová reakcia (PCR) v podobe real-time
PCR alebo v kombinácii s ELISA. Obe metódy boli vysoko
citlivé a umožňovali detekciu lieskových orechov dokonca menej
ako 10 ppm v komplexných potravinových maticiach. Proteín
ELISA bol vysoko špecifický pre lieskové orechy. Metódou Real -
Time sa pozitívne identifikovali lieskové orechy z 5
kultivarov registrovaných v SR. Detekčný limit metódy bol 13
pg DNA.
Kľúčové slová: lieskový orech, alergén, polymerázová reťazová
reakcia, ELISA
Abstract
Hazelnuts are widely used in the food industry owing to their
nutritive value and taste. The amount of hazelnut present in
a recipe is usually considered as a mark of quality. On
the other hand, contamination of foods that normally do not contain
hazelnuts is a threat for patients with a hazelnut
allergy. For this reason, the availability of a method for the
detection of hazelnuts in foods would be desirable. The objective
of this study was to explain the methods for the detection of
hazelnut in food products that are potentially applicable for the
food industry. In routine food analysis, the enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) and the polymerase chain reaction (PCR)
in the form of a real-time PCR or in combination with an ELISA
are used. Both methods were highly sensitive and allowed the
detection of even less than 10 ppm of hazelnut in complex food
matrixes. The protein ELISA was highly specific for hazelnut. The
Real – Time method was positive for five hazelnut varieties
registered in Slovakia. The intrinsic detection limit of the method
was 13 pg DNA.
Keywords: hazelnut, allergen, Polymerase Chain Reaction,
ELISA
Obsah
Obsah 2
Zoznam skratiek a značiek4
Úvod5
1 Cieľ práce6
2 Metodika práce7
3 Výsledky práce- štúdia o súčasnom stave riešenej
problematiky8
3.1 Alergia8
3.1.1 Potravinová alergia8
3.1.2 Potravinová intolerancia (pseudoalergia)10
3.1.3 Označovanie alergénov11
3.1.4 Najznámejšie alergény rastlinného pôvodu12
3.1.4.1 Sója12
3.1.4.2 Vlčí bôb12
3.1.4.3 Ovocie a zelenina13
3.1.5 Najznámejšie alergény živočíšneho pôvodu13
3.1.5.1 Mäso13
3.1.5.2 Vajce13
3.1.5.3 Ryby a mäkkýše14
3.1.6 Lieskové orechy14
3.2 Metódy na detekciu alergénov v potravinách15
3.2.1 PCR metóda15
3.2.1.1 História PCR16
3.2.1.2 Princíp PCR16
3.2.1.3 Reakčné zložky PCR19
3.2.1.4 Real- Time PCR20
3.2.1.5 Taqman metóda21
3.2.1.6 SYBR Green23
3.2.2 Imunochemické metódy24
3.2.2.1 ELISA metóda25
3.2.2.2 Priama ELISA27
3.2.2.3 Nepriama ELISA28
3.2.2.4 Sendvičová ELISA29
4 Návrh na využitie poznatkov32
5 Záver33
6 Zoznam použitej literatúry34
Zoznam skratiek a značiek
Ab – protilátka
Ag – antigén
DNA – deoxyribonukleová kyselina
dNTP - deoxynukleozidtrifosfát
EIA – (Enzyme Immunoassay) – enzýmová imunoanalýza
ELISA – (Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay) = enzýmová
imunoanalýza
HACCP – (Hazard Analysis and Critical Control Points) – analýza
nebezpečenstva
a kritických kontrolných bodov
Ig – imunoglobulín
IgE- imunoglobulín E
ng - nanogram
PCR – (Polymerase Chain Reaction) - polymerázová reťazová
reakcia
pg - pikogram
Real- Time PCR – polymerázová reťazová reakcia v reálnom
čase
SYBR Green - fluorescenčné farbivo
Taqman sonda- fluorescenčná sonda
u- (unid) - jednotka
Úvod
V súčasnosti sa stále častejšie stretávame s pojmami
nežiadúce potravinové reakcie, alergia, alergén.
Alergie sa zaraďujú medzi tri najvýznamnejšie ochorenia, ktoré
sa dostávajú do popredia už od 20. storočia. Okrem alergií ide
o srdcovo - cievne ochorenia a onkologické ochorenia.
Alergia na potraviny môže vzniknúť hocikedy počas života
a môže ju vyvolať ktorákoľvek súčasť potravy. Látka, ktorá
nežiadúcu imunitnú reakciu (alergiu) vyvolala, sa nazýva alergén.
Potenciálnym alergénom môže byť akákoľvek potravina obsahujúca
proteín. Zaujímavé je, že 90 % alergických reakcií zapríčiňuje len
pomerne úzky okruh potravín. K najvýznamnejším patria vajcia,
mlieko, ryby a kôrovce, arašidy, orechy, sója, sezam, ovocie
a zelenina.
Lieskové orechy patria k často konzumujúcim orechom. Sú
používané v mnohých cukrárskych výrobkoch, ako sú čokolády,
müsli, ďalej v pekárskych výrobkoch, v rôznych koláčoch
a v ostatných potravinárskych výrobkoch. Avšak semená
lieskových orechov môžu byť ohrozením pre niektorých spotrebiteľov,
pretože obsahujú alergény a konzumácia výrobkov, ktoré
obsahujú lieskové orechy, môže spôsobiť silnú alergiu. Preto je
potrebné, aby množstvo lieskových orechov prítomných v potravine
bolo označené na výrobku.
Lieskový orech spôsobuje 13 % akútnych alergických reakcii
u citlivých pacientov. Jediným účinným opatrením pre tieto
osoby sú analytické metódy potrebné na zisťovanie stopových
množstiev potenciálne alergénnych zložiek vo vzorkách potravín.
Všeobecne platí, že tieto metódy sú založené na detekcii
špecifických druhov proteínov – ELISA metóda, alternatívnou metódou
k nej je polymerázová reťazová reakcia založená ma detekcii
molekuly DNA.
1 Cieľ práce
Cieľom tejto bakalárskej práce bolo zhodnotiť a popísať súčasné
možnosti testovania prítomnosti lieskových orechov
v potravinách prostredníctvom dostupných analytických metód,
ktoré sú potenciálne uplatniteľné pre potravinársky priemysel
a navrhnúť najvhodnejší a najlacnejší systém takéhoto
testovania pre podmienky slovenského trhu.
2 Metodika práce
Predkladaná bakalárska práca má kompilačný charakter.
V súlade so stanoveným cieľom práce sme získali informácie
z odborných a vedeckých zdrojov a taktiež
internetových zdrojov, v ktorých sa publikujú práce
zaoberajúce sa riešenou problematikou. Zoštudované poznatky sme
spracovali do celkov podľa stanoveného cieľa a zo získaných
poznatkov sme vyvodili všeobecné platné závery.
3 Výsledky práce - súčasný stave riešenej problematiky
3.1 Alergia
Precitlivenosť, hypersenzitivita, alergia sú názvy, ktoré sa
používajú na označenie klinicky nežiadúcich reakcií imunitného
systému na vonkajšie podnety, obyčajne na faktory prostredia, ktoré
nazývame antigény (alergény). Následkom aktivity imunitného systému
býva väčšie či menšie poškodenie tkaniva alebo orgánu. Je
samozrejmosťou, že táto aktivita nie je žiadúca (Pružinec,
2002).
Pojem alergia zaviedol do medicíny v roku 1906 rakúsky
detský lekár Clemens Pirquet. Výraz je gréckeho pôvodu
a znamená „zmenený spôsob reakcie“. Pirquet pozoroval, že
u mnohých ľudí sa po druhom alebo treťom kontakte
s alergénom prejavovali intenzívne reakcie tkanív, ktoré
prebiehali ako lokálne kožné zmeny, polynózy a iné (Schott et
al., 1994).
Alergiou rozumieme odchýlnu reaktivitu organizmu na rozličné
podnety. Človek postihnutý alergickou chorobou reaguje na podnet,
s ktorým sa vo svojom živote bežne stretáva, úplne inak ako
ostatní ľudia. Iní ľudia, ktorí sa stretávajú s tým istým
podnetom, ale nie sú naň precitlivený, neochorejú vôbec. Práve
v tom sa alergické choroby odlišujú od ostatných chorôb, pri
ktorých rovnaký podnet vyvoláva u väčšiny ľudí približne
rovnakú reakciu (Doberský, 1987).
Pojem alergia (hypersenzitivita) je veľmi rozsiahly
a zahŕňa veľký počet rozmanitých chorobných stavov. Alergia je
výsledkom spolupôsobenia dedičnej dispozície a vplyvu
vonkajších faktorov. Pri zvýšenej náchylnosti na alergiu sa môže
stať spúšťačom alergickej reakcie (alergénom) celá škála látok.
Náchylnosť na alergické reakcie stúpa najmä medzi obyvateľstvom
priemyselných miest. Alergia sa stáva vážnou civilizačnou chorobou
(Schott et al., 1994).
3.1.1 Potravinová alergia
Podľa Kayserovej (2000) je potravinová alergia netoxická
potravinová nežiadúca reakcia, vznikajúca u osôb
s vrodenou podmienenou schopnosťou alergicky reagovať, tzv.
atopikov.
K potravinovým alergiám dochádza pri preniknutí
nestráviteľného jedla do krvného riečiska, kde vyvolávajú imunitnú
reakciu (Zachar, 2006).
Pravé potravinové alergie sú imunitným systémom sprostredkované
prejavy nadmernej citlivosti organizmu na určité potraviny.
Pozorujeme ich častejšie u detí a kojencov ako
u dospelých. Môžu sa časom zvýšiť alebo naopak znížiť,
a preto je nutné zisťovať vplyv zložiek potravy opakovane
(Keller, Meier, Bertoli, 1993).
Podľa Goliana (1998) je potravinová alergia osobitný typ
imunologicky podmienenej reakcie na potraviny, čo je tzv.
senzibilizácia na potraviny. Pri nej sa antigén z potraviny
dostáva cez slizničnú bariéru do organizmu, viaže sa na špecifické
protilátky a reakcia medzi antigénom a protilátkami
spôsobí uvoľňovanie určitých aktívnych látok, ktoré spôsobujú
alergie. Tieto látky sa uvoľňujú do čreva, do krvi alebo do
vzdialených orgánov, kde mžu vyvolať tiež určité prejavy (dýchanie
alebo kožné). Niekedy môže spôsobiť i ťažkú reakciu,
anafylaktický šok.
Alergické reakcie na potraviny vyplývajúce z nárastu
imunitných odpovedí na glykoproteínové zložky prítomné
v potravinách a predstavujú častý zdravotný problém
(Metcalfe, 1991; Shah a Walker, 2002).
Deti a dospelý, u ktorých sa prejavujú tieto reakcie
trpia tzv. potravinovou hypersenzitivitou, alebo potravinovou
alergiou. Ide o termíny definujúce reakciu vystavenia
potravine vyvolávajúcu objektívne reprodukovateľné symptómy, alebo
znaky v dávke tolerovanej bežnými konzumentmi (Crespo et al.,
2004).
Odhaduje sa, že približne 6 % detí a asi 2 % všeobecnej
populácie má potravinovú alergiu s prevahou
gastrointestinálnych symptómov (Sampson, 2003).
Skutočná alergická reakcia môže byť vyvolaná tromi primárnymi
príčinami: styk s potravinovým alergénom (látkou, ktorá vyvoláva
reakciu, obyčajne bielkovinou), zvýšená hladina imunoglobulínu E
(IgE je protilátka imunitného systému, ktorá reaguje
s alergénom), prítomnosť tkaninových buniek a bazofylov
(krvných buniek), ktoré v styku s protilátkami IgE uvoľňujú
histamín alebo iné látky vyvolávajúce alergické príznaky (URL,
2009a).
I keď niekoľko imunologických mechanizmov môže
spoluspôsobiť na alergickej reakcii na potravinu, IgE-
sprostredkovaná okamžitá reakcia hypersenzitivity je najviac
potvrdeným mechanizmom (Bischoff et al., 2000).
Určiť potravu alebo látku, ktorá alergiu vyvoláva, môže byť
veľmi problematické. Vlastnosti látok sa môžu meniť v dôsledku
tepelnej úpravy – alergiu napríklad vyvoláva potravina len v
surovom stave, po uvarení už nie (vzácne i naopak). Potraviny
obsahujú taktiež rôzne prísady (aditíva), farbivá a konzervačné
látky, alebo sú v nich stopy chemikálií. Napríklad reakcia po
zjedení mäsa nemusí byť alergiou na mäso, ale na antibiotiká,
ktorými bolo zviera liečené. Z chemického hľadiska sú potravinové
alergény väčšinou glykoproteíny s molekulovou hmotnosťou
10 000 – 40 000 a majú veľmi rozdielne fyzikálne vlastnosti.
Ak sa vyvinie alergia na určitú potravinu, nie je vzácnosťou, že
jedinec reaguje kvôli zkríženej reakcii i na podobné druhy
potravín, niekedy však i na celkom odlišné. Situácia je
komplikovaná taktiež tým, že prejavy potravinovej alergie sú
častejšie u človeka, ktorý zároveň trpí i inými formami alergií
(Bartůňková, 1998).
Potravinovým alergénom sa môže stať ľubovoľná potravina. V
Európe evidujeme 14 potravinových alergénov. Medzi najrizikovejšie,
ktoré sú predmetom legislatívy o označovaní patria: arašídy,
horčica, mlieko, obilniny obsahujúce glutén, orechy, ryby, sezamové
semená, sója a vajcia. Treba poznamenať, že z väčšiny alergií,
ktoré sa prejavujú v dojčenskom období, deti vyrastú (URL,
2009b).
3.1.2 Potravinová intolerancia (pseudoalergia)
Veľa nežiadúcich reakcií na potraviny sprostredkúvajú
mechanizmy, ktoré nezahŕňajú imunitný systém. Niektoré
z týchto reakcií je možné pomýliť si s alergiami.
Príčinou uvedených reakcií sú väčšinou nízkomolekulové látky
odlišné od proteínov, napríklad toxíny prirodzene sa vyskytujúce
v potravinách, mikrobiálne alebo chemické kontaminanty
potravín (Kvasničková, 1998).
Pojem potravinová intolerancia zahŕňa všetky abnormálne
fyziologické reakcie na niektorú zložku potravy alebo pridané
látky. Môže ísť o reakciu imunologickú, metabolickú,
farmakologickú, toxickú alebo o idiosynkraziu – jednoduchú
nadmernú citlivosť (Keller, Meier, Bertoli, 1993).
Podľa Pružinca (2002) je potravinová intolerancia fyziologickou
odpoveďou na skonzumovanú potravinu, ktorej podstatou nie je
imunitná reakcia.
Podľa Goliana (1998) je intolerancia potravín (neznášanlivosť
potravín) porucha, ktorá znamená neprimeranú reakciu na jedlo.
Niektoré potraviny alebo ich súčasti sú pritom príčinou ťažkostí
nasledujúcich po prijatí jedla.
Potravinová neznášanlivosť môže byť spôsobená podľa Kvasničkovej
et al. (2005) deficitom určitých enzýmov, farmakologickým účinkom
niektorých látok, poprípade toxickým efektom, ktoré môžu vyvolať
niektoré látky u precitlivených jedincov. Potravinovú
intoleranciu zaraďujeme medzi neimunologické reakcie.
Príčiny týchto ťažkosti delíme na tri základné skupiny (Golian,
1998):
1. intolerancia potravín imunologického pôvodu,
2. intolerancia potravín iného pôvodu,
3. intolerancia potravín psychického pôvodu
Podľa Magulu (2001) spôsobuje pseudoalergie potrava, ktorá
obsahuje histamín, alebo ktorá uvoľňuje histamín počas chemických
procesov trávenia pôsobením baktérií v tráviacej sústave.
Podľa Zachara (2006) tvorí významnú problematiku cereálna
intolerancia, ktorá sa prejavuje ako choroba zvaná celiakia
(celiakálna sprue).
3.1.3 Označovanie alergénov
Nomenklatúru alergénov určuje Výbor pre nomenklatúru alergénov
Medzinárodnej únie imunologických spoločností – IUIS. Alergén sa
označuje podľa názvu jeho pôvodcu takto: prvé tri písmená označujú
rod (genus), potom po medzere nasleduje písmeno zodpovedajúceho
druhu (species) a znovu po medzere arabská číslovka podľa
poradia jeho objavenia. To znamená, že číslo nemusí byť vždy
v súlade s významom pre vznik alergickej choroby
(Ferenčík, 2006).
Osoby alergické na niektoré potraviny, napr. pšenicu alebo
vajcia, sa môžu týmto potravinám v prírodnej forme ľahko vyhýbať.
Je však veľmi obtiažne zistiť, či sa dané alergény nenachádzajú v
niektorých hotových pokrmoch alebo polotovaroch, napr. v omáčkach.
Výroba hotových pokrmov a polotovarov je komplexný a náročný proces
a tieto výrobky tvoria významnú súčasť nášho každodenného života.
Len ťažko si vieme predstaviť, že by sme sa vzdali tohto pohodlia
iba preto, že nevieme, či bola potravina pripravená na tuku s
vysokým podielom nasýtených mastných kyselín alebo či môže
obsahovať glutén, prípadne kôrovce v nejakej forme.
Väčšina ľudí využíva bez akýchkoľvek problémov pestrú paletu
pohotových potravín. U malého percenta ľudí však môžu určité
potraviny alebo ich zložky vyvolávať nepriaznivé reakcie od ľahkých
vyrážok až po vážne alergické záchvaty. V záujme zabezpečenia
vyššej úrovne ochrany zdravia spotrebiteľov a zabezpečenia ich práv
na dostatočné informácie sa nedávno pozmenila legislatíva EÚ.
Označovanie potravín musí poskytovať zreteľné informácie o
prísadách a zložkách, ktoré patria medzi potenciálne alergény.
(URL, 2009b)
Lieskové oriešky sú jedným z hlavných potravinových
alergénov, ktoré môžu byť prítomné v potravine a
z uvedeného dôvodu musí byť ich prítomnosť označená
v súlade s Európskou Direktívou 2007/68/ES.
V súčasnosti jedinou účinnou starostlivosťou o pacientov
trpiacich potravinovou alergiou alebo intoleranciou je vyhnutie sa
príčinnej potravine prostredníctvom diéty. Bohužiaľ skryté
potravinové alergény v komplexných potravinách sú základným
problémom pre týchto pacientov kvôli nedôslednému označovaniu alebo
neumýselnej krížovej kontaminácií komerčných potravín
v priebehu spracovávania (Holzhauser a Vieths 1999).
3.1.4 Najznámejšie alergény rastlinného pôvodu
Potravinové alergény sa delia na alergény I. a II. triedy.
Potravinové alergény I. triedy sú tradičné alergény, ktoré
senzibilizujú prostredníctvom tráviaceho systému. Potravinové
alergény II. triedy senzibilizujú inhalačnou cestou. Typickým
zástupcom týchto alergénov sú alergény podobné peľovým alergénom.
Primárne dôjde k senziblizácii na peľové alergény inhalačnou
cestou a následne, na základe podobnosti peľového alergénu
s alergénom v potravinách, dôjde ku klinickej
manifestácii potravinovej alergie po požití potraviny. Hovoríme
o tzv. skríženej alergii s peľovými alergénmi (Drápal et
al., 2005).
3.1.4.1 Sója
Sója patrí medzi potraviny s významným alergizujúcim
účinkom. Obsahuje alergény stabilné voči tepelnému spracovaniu,
voči enzymatickej degradácii (alergény I. triedy) a alergény
II.triedy, ktoré skrížene reagujú s peľovými alergénmi
(Strážnická et al., 2000).
Hlavným alergénom je Gly m 1,ktorý je obsiahnutý v 7S
globulínovej frakcii (Renčová, 2006).
Priama alergia na sójovú bielkovinu je veľmi zriedkavá.
V drvivej väčšine prípadov sa alergia na sóju vyskytuje
u detí a sprevádza alergiu na proteíny kravského mlieka
alebo atopickú dermatitídu (Sabolová, 2004).
3.1.4.2 Vlčí bôb
Táto strukovina, ktorá má 450 druhov, sa ako taká konzumuje už
veľmi dlho, ale múka z vlčieho bôbu sa pridáva do pšeničnej
múky na výrobu pekárenských výrobkov iba niekoľko rokov.
Zaznamenali sa priame alergické reakcia, častokrát vážne,
a výskumy poukazujú na relatívne riziko skríženej alergie na
vlčí bôb u 30 až 60% osôb alergických na arašidy
(2006/142/ES).
3.1.4.3 Ovocie a zelenina
Niektoré alergény ovocia a zeleniny sú termolabilné, takže
po tepelnej úprave môžu byť ovocie a zelenina menej dráždivé.
Pri spracovaní ovocia a zeleniny prichádza do úvahy nielen
alergia po konzumácii, ale aj pri vdychovaní pár pri varení.
Niekoho môžu značne dráždiť aj aerosólové kvapôčky, ktoré vznikajú
pri krájaní, či strúhaní (URL, 2009j).
3.1.5 Najznámejšie alergény živočíšneho pôvodu
Hlavné alergény potravín živočíšneho pôvodu sú typickými
alergénmi I. triedy, ktoré senzibilizujú cez tráviaci systém
a všeobecne sa vyznačujú odolnosťou voči vonkajším vplyvom
(Drápal et al., 2005).
3.1.5.1 Mäso
Hovädzie mäso obsahuje skupinu alergénov s rôznymi
fyzikálno – chemickými vlastnosťami. U niektorých alergických
jedincov sa objavila anafylaktická reakcia na krátko a prudko
opečené mäso, ale tolerovali dobre prepečené mäso. Iní reagovali
alergickou reakciou aj na dobre prepečené mäso (Drápal et al.,
2005).
Alergie na mäso bravčove, hydinové, ale aj hovädzie sa vyskytujú
len ojedinele. Vplyvu spracovateľských postupov na alergenicitu
bravčového a hydinového mäsa nebola venovaná pozornosť. Možno
predpokladať podobné výsledky ako u mäsa hovädzieho (URL,
2009j).
3.1.5.2 Vajce
Vajce patrí k významným zdrojom alergénov. Vaječný bielok
má silnejší alergizujúci účinok ako vaječný žĺtok. Hlavnými
alergénmi vaječného bielka sú ovomukoid, ktorý je relatívne
rezistentný voči teplu a tráviacim enzýmom, a ovalbumín,
ovotransferín a lyzozým, ktoré sú relatívne citlivé voči týmto
vplyvom. Vzhľadom na to, že dominantným alergénom u jedincov
alergických na vajce je termostabilný ovomukoid, väčšina
alergických jedincov reaguje aj na tepelne upravené vajce.
Alergici, ktorí neznášajú vaječnú bielkovinu, nesmú byť očkovaní
proti chrípke, pretože sa očkovací vírus pestuje na kuracích
embryách (Leibold, 1993).
3.1.5.3 Ryby a mäkkýše
Ryby sa dávajú do súvislostí s prípadmi smrti
v dôsledku anafylaktických reakcií. Alergia na ryby sa
vyskytuje najčastejšie v krajinách, kde je vysoká
spotreba rýb, napr. alergia na tresku je najčastejší prípad
potravinovej alergie v škandinávskych krajinách (Kvasničková,
2005).
Podľa Kvasničkovej (2005) hlavným alergénom rýb (parvalbumín).
Kôrovcov a mäkkýšov (tropomyozín) sú prevažne termostabilné
a odolné voči enzymatickej degradácii. Pri tepelnej úprave
nedochádza k strate alergenicity. Minoritnými alergénmi je
transferová RNA. Ide o jediný prípad, kedy nukleová kyselina
z potraviny vedie k odozve IgE. Zistilo sa, že iba 1 – 2
g garnátov stačí na vyvolanie anafylaktickej reakcie.
3.1.6 Lieskové orechy
Lieskové orechy sú mimoriadne bohaté na vitamín E, ktorého je v
10 dkg až 13,5 mg. Môžu sa jesť v surovom stave alebo
opražené. V našej kuchyni ich najčastejšie využívame do rôznych
zákuskov. Pri jedení ich treba dobre rozhrýzť alebo postrúhať na
jemnom strúhadle, pretože sú ťažko stráviteľné. Postrúhané sú
vhodné pre ľudí s cukrovkou. Spolu s medom sa používajú aj
posilňujúci prostriedok pre rekonvalescentov, študentov a
športovcov (Demešová, 2009).
Podľa Kvasničkovej (2005) patria lieskové orechy
k najčastejším príčinám závažnej alergickej reakcie. Pritom sa
nachádzajú často v skrytej forme rôznych potravinárskych
výrobkoch. Otázka bezpečnosti pre alergického spotrebiteľa je tu
veľmi dôležitá.
Hlavný alergén lieskových orechov patrí do skupiny Bet v 1
homológnych alergénov. Okrem tohto hlavného, termolabilného
alergénu, obsahujú aj iné alergény, ktoré sú odolné voči tepelnému
pôsobeniu. Drápal et al. (2005) zistili, že alergenicita lieskových
orechov sa dá zredukovať pražením (140 ˚C po dobu 40 min.). Určitá
imunoreaktivita týchto alergénov však zostáva a je významné,
že asi u 30 % peľových alergikov alergických na lieskové
orechy pretrvávajú klinické prejavy alergie aj na pražené lieskové
orechy.
3.2 Metódy na detekciu alergénov v potravinách
Za účelom overenia alergénov označovaných potravín a odhalenia
skrytých alergénov v spracovaných potravinách, je potrebné použiť
analytické metódy, ktoré sú schopné detekovať veľmi nízke hodnoty
alergénnych rezíduí v spracovaných potravinách. Všeobecne platí, že
tieto metódy sú založené na detekcii špecifických druhov proteínov
- enzyme-linked immunoassay (ELISA) (Holzhauser et al., 1999). PCR
technológia bola stanovená ako DNA-metóda založená na označovanie
geneticky modifikovaných organizmov, patogénov rastlinných a
živočíšnych druhov. Okrem toho PCR bola široko používaná v oblasti
molekulárnej biológie a bežne uplatňovaná v klinickej chémii. Od
polovice 90-tych rokov tejto metodike prislúcha rastúca pozornosť
na detekciu alergénov v potravinárskych výrobkov, a to sa odráža v
rastúcom počte publikovaných a komerčne dostupných PCR testov (Poms
et al., 2003).
3.2.1 PCR metóda
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) založená na detekcii
špecifických DNA sekvencií bola navrhnutá ako alternatíva
k imunologickým metódam na detekciu skrytých alergénov
v komplexných potravinách (Poms et al., 2004).
Metóda polymerázovej reťazovej reakcie je dnes základným
nástrojom molekulárnej biológie, umožňuje v podstate
neobmedzené namnoženie vybraného úseku DNA v skúmavke
a následné zviditeľnenie vzniknutého produktu (Smýkal,
2006).
Hlavným nevyhnutným predpokladom pre PCR analýzu je DNA dobrej
kvality a kvantity (Gryson et al., 2008).
Stabilita DNA ju robí preferovaným analytom pre PCR analýzu.
Táto technika je tiež zahrnutá v analýze alergénov
v potravinárskych produktoch. Aj keď PCR nie je schopná
detegovať priamo alergickú zložku v produkte, môže byť použitá
na detekciu druhov, z ktorých alergická zložka pochádza. Preto
môže byť použitá ako dôležitý nástroj preverovania potravinárskych
produktov na prítomnosť alergénov. Okrem uvedeného PCR je známa ako
veľmi citlivá metóda, špeciálne v porovnaní so sandwich ELISA
technikou, najviac používanou na detekciu alergénov (Holst-Jensen
et al., 2003).
Z proteínového hľadiska, metódy založené na DNA sa ukázali
byť spoľahlivejšie kvôli stabilite DNA za podmienok použitia
vysokých teplôt, tlaku a chemického ošetrenia, ktoré sa
využívajú počas výroby niektorých potravín (Behrens et al.,
1999).
3.2.1.1 História PCR
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) byla vyvinutá vedeckými
pracovníkmi biotechnologickej firmy Cetus Corporation v USA
v polovici 80. rokov 20. storočia. Objaviteľom tejto metódy
bol v roku 1983 molekulárny genetik Kary B. Mullis, ktorý po
prvýkrát predviedol mnohonásobnu in vitro replikáciu v skúmavke. V
máji roku 1993 za objav PCR získal Nobelovu cenu za chémiu. Keďže
DNA polymeráza neznáša vysoké teploty, využil Mullis enzým
izolovaný z baktérie Thermus aquaticus žijúcu v horúcich prameňoch.
Výsledky testovania takto získaného enzýmu označovaného skratkou
Taq polymerasa, ktorú vyizoloval Mullisuv kolega D. Gelfland,
prevýšila očakávania. V roku 1989 poskytla Cetus Corporation
švajčiarskej firme Roche exkluzívne celosvetové právo k obchodnému
využitiu PCR pre diagnostiku ľudských ochorení. Neskôr práva
získala farmaceutická spoločnosť Hoffmann-La Roche. O rastúcom
význame PCR svedčí stúpajúci počet publikácií venovaných každoročne
tejto metóde (Schwagele, 1998).
3.2.1.2 Princíp PCR
Polymerázová reťazová reakcia - PCR (polymerase chain reaction)
- je spôsob amplifikácie (rozmnoženia) špecifických úsekov DNA in
vitro polymerizáciou za prítomnosti DNA - polymerázy (špecifický
katalytický enzým). Metóda je založená na cyklickom opakovaní
procesu replikácie DNA, ktorý je prirodzenou súčasťou každého
bunkového cyklu. Práve jej cyklické opakovanie , ako to naznačuje
aj komponent názvu - polymerázová reťazová reakcia , realizuje
jedno - až niekoľkomiliónové rozmnoženie DNA (ktorého dĺžka
nepresahuje 3 kb) v priebehu niekoľkých hodín. Dôležité je však
poznať sekvenciu príslušných báz alebo aspoň sekvenciu obidvoch
koncových častí DNA - na zhotovenie primerov (Szárazová, 2010).
Amplifikácia DNA metódou PCR sa uskutočňuje cyklickým procesom,
pričom každý cyklus pozostáva z troch základných krokov, čo je
vidieť na obrázku 1 (URL, 1999e).
1. Denaturácia: prvým krokom je tepelná denaturácia templátovej
DNA zohriatím reakčnej zmesi na teplotu > 90˚C,
2. Anelácia primerov na templátovú DNA: v druhom kroku sa
zníži teplota na 37 - 65˚C, čo umožní hybridizáciu dvoch
oligonukleotidových primerov s templátovou DNA na
komplementárnych miestach. K úspešnej amplifikácii DNA je
potrebné, aby vzdialenosť medzi priamym a reverzným primerom
(100 - 5000 nukleotidov) bola dostačujúca z hľadiska času
potrebného na polymerizáciu (príliš dlhé alebo naopak príliš krátke
fragmenty sa nedajú amplifikovať),
3. Polymerizácia: účinkom DNA polymerázy sa syntetizuje druhé
vlákno DNA pripájaním nukleotidov (substrátom sú deoxynukleozid
trifosfáty, dNTP) na 3´OH koniec primérov, optimálna teplota
reakcie je 72˚C.
Tieto tri kroky sa cyklicky opakujú 20 – 40 krát
a výsledkom je syntéza mnohých kópií fragmentu DNA
ohraničeného použitými primérmi (Pančík a Marcišová, 2003).
V prvom cykle sa nasyntetizuje komplementárna DNA, ktorá je
na 5´konci ohraničená primerom a na 3´ konci je neohraničená.
V druhom cykle je aj táto DNA použitá ako templát,
v tomto prípade je syntéza ohraničená na začiatku primerom
a na druhej strane molekuly koncom templátu, takže vzniká
produkt s presnou veľkosťou. Po každom cykle vzniká tak
dvojnásobné množstvo molekúl produktu, ktoré sú v nasledujúcom
cykle použité ako templát. Počet kópií rastie exponenciálne, po n
cykloch dosiahne hodnotu 2n , po 30 cykloch je to 230, tj. až 109
násobná amplifikácia. Množstvo PCR produktu v jednej reakcii
môže dosiahnuť hodnoty 0,2 – 1 μg DNA, čo postačuje na analýzu
štandardnými metódami molekulárnej biológie ako je elektroforéza
v agarózovom géli (URL, 2010i).
Obrázok 1: Princíp PCR ( URL, 1999e)
3.2.1.3 Reakčné zložky PCR
Polymerázová reťazová reakcia sa uskutočňuje vtedy, ak sú
v reakčnom prostredí prítomné nasledovné zložky: termostabilná
DNA polymeráza, tlmivý roztok, deoxyribonukleozidtrifosfáty,
priméry a templátová DNA (Bauerová et al., 2004).
Vzorka
Ako vzorka sa môže použiť napr. genómová DNA vyizolovaná
z buniek, alebo prípadne len hrubý bunkový extrakt (Viglaský
et al., 1998).
Primery
Primery sú syntetické jednovláknové oligonukleotidy
komplementárne k templátovému vláknu DNA. Počas hybridizácie
primery svojou polohou na templátovej DNA vymedzujú žiadanú
sekvenciu, ktorá bude amplifikovaná (Bauerová et al., 2004).
Ak sa amplifikuje gén alebo jeho časť (Obr. 2), tak primer,
ktorý nasadá na 5´koniec génu (kódujúci NH2 koniec proteínu)
a jeho extenzia pokračuje smerom k 3´koncu génu (t. j. v
smere transkripcie) sa nazýva: 5´primer. Tento primer nasadá na
antikodónové (-) vlákno (jeho sekvencia je teda komplementárna k
sekvencii antikodónového a identická so sekvenciou kodónového
vlákna DNA). Primer, ktorý nasadá na 3´ koniec génu (kódujúci COOH
koniec proteínu) a jeho extenzia pokračuje strom k 5´ koncu
génu (t. j. proti smeru transkripcie) sa nazýva: 3´ primer. Tento
primer nasadá na kodónové (+) vlákno (jeho sekvencia je teda
komplementárna k sekvencii kodónového a identická so sekvenciou
antikodónového vlákna) (Viglaský et al., 1998).
DNA polymeráza
Prvým enzýmom použitým v PCR bola DNA polymeráza I z E. coli.
Veľmi skoro bola nahradená Taq DNA polymerázou izolovanou z
baktérie Thermus aquaticus, ktorá žije v horúcich prameňoch
Yellowstonského národného parku. Optimálna teplota reakcie tohto
enzýmu je 74˚C a Taq polymeráza zostáva funkčná po inkubácii pri
teplote 95˚C po dobu viac ako 40 minút. Koncentrácia enzýmu je
spravidla 0,5 – 5 U v jednej reakcii, jeho nadbytok môže
zvýšiť tvorbu nešpecifických produktov (URL, 2010i).
Podľa Bauerovej et al. (2004) sa okrem Taq DNA polymerázy
v PCR používajú aj iné termostabilné polymerázy, ktoré sa
líšia najmä prítomnosťou 5´-3´ a 3´-5´ exonukleázovej
aktivity, schopnosťou reverznej transkripcie a tvorbou tupých
alebo 3´ prečnievajúcich koncov obsahujúcich jeden adenozínový
nukleotid.
Prvé kvalitatívne PCR metódy na detekciu lieskových orieškov ako
alergénu v spracovaných potravinách boli zverejnené v roku
2000 (Holzhauser et al., 2000). Priméry špecifické pre gén Cor
1,0401, hlavný alergén lieskových orechov a 182 bp PCR produkt boli
zistené v agarózovom géle elektroforézy. Detekčný limit bol
stanovený na 0.001% (10 mg / kg) vo vyšetrovaných matriciach
potravín (čokoláda, cookies, obilniny/müsli, zemiaky, kukurica).
Krížové reaktivity s 33 príslušnými potravinami neboli pozorované.
Špecifické lieskové oriešky PCR boli ďalej zlepšované a rozvíjali
sa pre aplikáciu PCR v kombinácii s ELISA metódou.(Holzhauser et
al., 2002).
Herman et al. (2003) uvádzajú, že bola použitá podstatne kratšia
extrakcia DNA a viedla k skráteniu celkovej doby trvania testu
približne o šesť hodín.
Holzhauser et al. (2000) vyvinuli ešte novú metódu na presnú
a citlivú detekciu alergénnych lieskových rezíduí
v komplexných potravinových matriciach s použitím PCR
s metódou „horúceho štartu“ a „ postupným uvoľňovaním“.
Zvýrazňovaním 182 bp fragmentov pri kódovaní DNA z Cor 1, čo
je hlavný alergén lieskového orecha, bola preukázaná prítomnosť
dokonca len 0,001 % lieskových orechov v potravinárskych
výrobkoch.
Nedávno bola uverejnená iná špecifická PCR metóda, ktorá je
založená na vložení priméru špecifického pre intróny kódované
v mitochondriálnom genóme nad 1. Špecifickosť tejto metódy
testoval Herman et al. (2003) s rôznymi úzko súvisiacimi
rastlinami. Citlivosť tejto metódy bola uvedená ako 10 mg.kg-1
lieskových orechov v potravinách.
3.2.1.4 Real-time PCR (q- PCR)
Real-time PCR (quantitative PCR, q-PCR) je metóda umožňujúca
presnú kvantifikáciu hľadanej DNA sekvencie vo vzorke. Využíva sa
tu niekoľko možností detekcie. Všetky sú založené na náraste
fluorescencie vplyvom zvyšujúceho sa počtu novo syntetizovaných
molekúl DNA. Principiálne najjednoduchšia je metóda využívajúca
fluorescenčne farbivá, ktorá se interkalujú medzi bázy DNA (napr.
Sybr Green), narastajúca fluorescencia potom odpovedá vzrastajúcemu
množstvu DNA vo vzorke. V súčasnosti je asi najviac rozšírená
metóda využívajúca 5-exonukleázové aktivity DNA polymerázy.
Kľúčovým je použitie oligonukleotidu – próby (najčastejšie TaqMan
sonda), ktorá sa špecificky viaže na sekvenciu medzi obidvoma
primermi. Sonda je na jednom svojom konci označená fluorescenčnou
látkou a na druhom konci zhášacim fluorochrómom. Pri syntéze
komplementárnych vláken hydrolyzuje DNA polymeráza TaqMan sondu,
dôjde k uvoľneniu fluorescenčnej látky a k nárastu fluorescencie,
ktorá je detekovaná a zaznamenaná v reálnom čase. Na základe
štandardizačných kriviek sa dá presne kvantifikovať množstvo
hľadanej DNA sekvencie vo vzorke (URL, 2007b).
Presnosť tejto metódy je založená na matematickom modely, na
ktorom sú založené kvantitatívne metódy. Real - Time PCR sa stala
štandardnou metódou pre mnohé aplikácie. Citlivosť tejto metódy
umožňuje detekciu aj malého počtu kópií, ba dokonca aj jedinej
kópie cieľovej DNA. Detekčné rozmedzie tejto metódy je približne od
30 pg do 30 ng jadrovej DNA. Výhodou tejto metódy je fakt, že PCR
produkt nemusí byť následne analyzovaný, čím sa predíde možnej
kontaminácií (Miragliaa et al., 2004).
3.2.1.5 Taqman sonda
TaqMan sondy závisí na aktivite 5'-nukleázy DNA polymerázy
používanej pri PCR hydrolyzovať oligonukleotid, ktorý je
hybridizovaný do cieľového amplikónu. TaqMan sondy sú
oligonukleotidy, ktoré majú fluorescenčné farbivo-reportér
pripojený k 5´ koncu a hasič viazaný na 3' koniec, čo je znázornené
na obrázku 2 (URL, 2003f). Tieto sondy sú navrhnuté tak, aby sa
krížili s vnútorným regiónom produktu PCR (Dharmaraj, 2010).
Obrázok 2. Taqman sonda. Červený kruh reprezentuje hasič, ktorý
narúša pozorovateľný signál od reportéra farbivá (Zelený kruh), ak
je v krátkej vzdialenosti (URL, 2003f).
V nehybridizovanom stave, ako znázorňuje obrázok 3 (URL, 2003f),
blízkosť molekúl fluóru a hasiča bránia detekcii fluorescenčného
signálu od sondy. Počas PCR, kedy polymeráza replikuje templát, na
ktorej je TaqMan sonda viazaná, aktivita 5- nukleázy DNA polymerázy
štiepi sondu. To oddeľuje fluorescenčné a uhasené farbivá a
k rezonančnému prenosu energie (Fret) už nedochádza. Tak sa
fluorescencia zvyšuje v každom cykle, v pomere k množstvu
štiepenia sondy (Dharmaraj, 2010).
Obrázok 3. TaqMan ® Sonda sa viaže na cieľovú DNA a primer sa
viaže rovnako.Vzhľadom k tomu, že je primer naviazaný, môže Taq
polymeráza teraz vytvárať doplňujúci sa prvok ( URL, 2003f).
Obrázok 4. Reportér farbivo je prepustený z rozšírenej
dvojzávitnice DNA vytvorenej Taq polymerázou, ktorá potom pridáva
aj nukleotidy. To oddeľuje hasič od reportéra a umožňuje
reportérovi vyžarovať svoju energiu (URL, 2003f).
3.2.1.6 SYBR Green
SYBR Green poskytuje najjednoduchší a najekonomickejší formát
pre detekciu a kvantifikáciu PCR produktov v real-time reakcii. Na
obrázku 5 (Rasmussen, 2003) je vidieť fluorescenčné farbivo SYBR
Green, ktoré viaže dvojzávitnicu DNA, a po excitácii vyžaruje
svetlo. Tak keď sa produkt PCR hromadí, fluorescencia sa zvyšuje.
Výhodou SYBR Green metódy je, že je lacná, ľahko ovládateľná a
citlivá. Nevýhodou je, že SYBR Green viaže na dvojzávitnicu DNA v
reakcii okrem primerov-dimerov aj iné nešpecifické reakčné
produkty, čo má za následok nadhodnotenie cieľovej koncentráte
(Dharmaraj, 2010).
Obrázok 5. Fluorescenčné farbivo SYBR Green sa viaže na menšie
drážky dvojzávitnice DNA. V roztoku, voľné farbivo vykazuje veľmi
málo fluorescencie, avšak fluorescencia je výrazne zvýšená na DNA
väzbe (Rasmussen, 2003).
Obrázok 6. Na začiatku amplifikácie (zosilnenia), reakčná zmes
obsahuje denaturovanú DNA, primery a farbivá. Farbivo molekuly
slabo svetielkuje, produkuje minimálnu fluorescenciu , signál,
ktorý je odpočítaný pri počítačovej analýze (Rasmussen, 2003).
Obrázok 7. Po žíhaní primérov, niekoľko molekúl farbív sa môže
viazať na dvojaký prameň. SYBR Green vyžaruje svetlo na excitáciu.
Počas predĺženia sa viac a viac molekúl viaže na novo syntetizované
vlákno DNA (Rasmussen, 2003).
Kuchta a Piknová (2007) vyvinuli RT - PCR na identifikáciu
lieskových orechov. Metóda pozostávala z izolácie DNA
chaotropickou extrakciou na tuhej fáze a z real-time PCR
s primermi a 5´- nukleázovou sondou špecifickými pre lieskové
orechy, orientovanými na gén hsp1. Metódou pozitívne identifikovali
lieskové orechy z 5 kultivarov registrovaných v SR a
negatívne výsledky získali so všetkými ostatnými potravinársky
významnými rastlinnými druhmi. Detekčný limit metódy bol 13 pg DNA,
čo zodpovedá 27 kópiam haploidného genómu. Citlivosť metódy
hodnotili analýzou modelového pečiva s definovaným obsahom
lieskových orechov a stanovili prakticky detekčný limit 0,01 %.
Praktická použiteľnosť metódy sa overila pri analýze 20 vzoriek
pečiva a cukroviek. Vypracovaná metóda real- time PCR sa ukázala
ako vhodná na rutinné použitie na základe vysokej selektivity,
dostatočnej citlivosti i z hľadiska rýchlosti, keďže výsledky
bolo možné získať v priebehu jedného pracovného dňa.
3.2.2 Imunochemické metódy
Hermanová (1994) vyjadrila podstatu imunochemických metód ako
precipitačnú reakciu medzi antigénom a protilátkou. Biosyntéza
protilátky prebieha v tele experimentálneho zvieraťa po jeho
imunizácií, čiže vniknutí antigénu do organizmu. Tým sa stimulujú
imunokompetentné lymfocyty, ktoré sa nakoniec diferencujú na bunky
produkujúce protilátky. Tie sa dostávajú do krvného obehu, odkiaľ
sa dajú izolovať.
Pomocou imunochemických metód sa dá stanoviť v pôvodnom
biologickom materiály celá rada cudzorodých látok (farmaka, toxické
látky), látky telu vlastné, látky infekčného pôvodu alebo
špecifické protilátky vzniknuté na nejaký imunologický podnet
(Zajoncová, 2003).
Zajoncová (2003) ďalej uvádza, že imunochemická metóda, ktorá
vyžaduje pre kvantifikáciu deja oddelenie voľného reaktantu od jeho
viazanej formy, sa označuje ako heterogénna, naproti tomu metódy,
ktoré tento krok nevyžadujú sa nazývajú homogénna. Imunochemické
metódy, ktoré využívajú ako značky enzýmy, patria do súboru metód
označovaných ako enzýmové imunoanalýzy EIA (Enzyme
Immunoassay).
3.2.2.1 ELISA metóda
ELISA (z angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), niekedy
taktiež označovaná ako EIA (Enzyme Immunoassay) je jednou z
najpoužívanějších imunologických metód slúžiacich k detekcii
protilátok. Metóda funguje na báze imunoenzymatickej reakcie a dá
sa s ňou rovnako detekovať i antigén. ELISA využíva dve základné
vlastnosti imunoglobulínov. Po prvé je to schopnosť proteínov (teda
imunoglobulínov) viazať sa na povrch umelých hmôt (napr.
polystyrénu) a v druhom rade potom schopnosť viazať enzýmy na Fc
fragmenty imunoglobulínových molekúl (URL, 2010g)
V potravinovej analýze je ELISA najpoužívanejšia forma
imunoanalýzy, pretože redukuje cenu vybavenia a je ľahko
použiteľná, rýchla, pohotová a automatizovaná
(Giovannacci et al., 2004).
Podľa Garcié et al. (1993) patrí ELISA medzi perspektívne
imunoprocedúry, pričom je spôsobilá pôsobiť v 2 rovinách: ako
lacná kvalitatívna metóda, či presná a spoľahlivá
kvantitatívna procedúra.
ELISA je široko používaná forma imunoskúšok. V počiatkoch
sa ELISA využívala v prepracovaných imunologických
laboratóriách, ktoré mali kvalitné prístrojové vybavenie.
Uplatňovala sa najmä v medicíne pri riešení lekárskych
problémov (Müller, 1997). V poslednom čase však ELISA metóda
nachádza široké uplatnenie aj v nemedicínskych oblastiach. Ako
príklad uvádzajú Lee a Morgan (1993) analýzu kvality
a bezpečnosti potravín. Jednoduchosť a citlivosť zaraďuje
ELISA do oblasti používania screeningov v laboratóriách:
epidemiológia a diagnostika infekčných ochorení, screening mAb, pre
detekciu a meranie hormónov a drog, ďalej napr. tehotenské testy
alebo pre protilátky HIV vírusov (Zajoncová, 2003).
Test ELISA bol vyvinutý v roku 1960 a 1970 ako náhrada za
imunologické vyšetrenia, ktoré zahnalo použitie rádioaktívnych
protilátok a antigénov. Riziká používania rádioaktívnych materiálov
v procese testovania boli nebezpečné a nástup metódy ELISA
vyriešil tieto problémy. Namiesto použitia rádioaktívnych
materiálov na určenie výsledkov testu, ELISA používa enzýmy, ktoré
reagujú s protilátkami vo forme farebných produktov. Vývoj
farby v teste ELISA naznačuje pozitívny výsledok. (URL,
2003h).
Kľúčom k metóde ELISA je, že sekundárna protilátka je
označená osobitným druhom enzýmu. Použitý enzým je schopný zmeniť
farbu skúšobnej vzorky pri reakcii s jeho substrátom. Preto ak
vzorka obsahuje niektorú z protilátok, ktoré sú testované, po
pridaní substrátu zmení farbu vďaka prítomnosti sekundárnej
protilátky a jeho pridruženého enzýmu (URL, 2003h).
Samotnému vytvoreniu komplexu antigén- protilátka predbieha
označovanie jedného z dvoch reakčných partnerov enzýmom.
Enzýmová imunoanalýza je preto kombináciou dvoch princípov. Jednak
reakcie antigénu s protilátkou a enzýmovej substrátovej
reakcie. Principiálne možno EIA rozdeliť na kompetitívne a
nekompetitívne. Pri nekompetitívnej EIA sa pracuje s prebytkom
imunoreaktantov, aby bolo zachytených čo najviac analytov a
dosiahnutie čo najväčšieho signálu pri meraní enzýmovej aktivity.
Oproti tomu kompetitívna EIA využíva skutočnosť, že znižovaním
koncentrácie imunoreaktantov sa zvyšuje citlivosť metódy. To platí
len po určitú hranicu. Podľa zákona o pôsobení aktívnej hmoty
nízkej koncentrácie Ab a Ag znižujú významne rýchlosť tvorby
imunokomplexov. Okrem toho sa toto znižovanie koncentrácie
prejavuje v zhoršovaní presnosti stanovenia (Märtlbauer,
1999).
Pri ELISA metodách sa používa k značeniu enzým peroxidáza a ich
substrát peroxid vodíka, ktorý v prítomnosti chromogénu
1,2-diaminobenzénu dáva merateľný žlto-oranžový produkt. Ďalším
enzýmom, ktorý sa využíva k značeniu je g-D-galaktozidáza a jej
substrát o-nitrofenyl-g-D-galaktopyranozid, ktorý je premenovaný na
merateľný žltý nitrofenolový produkt. K značeniu sa taktiež často
používa alkalická fosfatáza a jej substrát p-nitrofenylfosfát,
ktorý je premenovaný na nitrofenolát. Zastavujúcím činidlom
peroxidázovej reakcie je 1M kyselina sírová, ktorá zároveň
stabilizuje konečný farebný produkt enzýmovej reakcie. U súprav,
ktoré používajú alkalickú fosfatázu sa enzýmová reakcia zastavuje
roztokom hydroxidu sodného (Zajoncová, 2003).
Pri zhotovovaní imunoenzymatických metód, ako aj ich praktickom
využití má rozhodujúci význam kvalita použitého antiséra, resp.
použitých protilátok, či špecifita a senzitivita dôkazového systému
(Levieux a Venien, 1994). Aj podľa Baudnera a Drehera (1991) má
výber imunogénov, pokusných zvierat a spôsob imunizácie rozhodujúci
význam pre kvalitu a praktickú využiteľnosť vyvinutého EIA systému.
Zvieracie druhy, ktoré sa využívajú na produkciu antiséra
(imunizáciu) pre diagnostické účely sú králiky, myši, ovce a
kozy.
Podľa spôsobu prevedenia detekcie, kedy sú imobilizované buď
protilátky alebo antigény rozlišujeme tri typy ELISA metód:
1. priama
2. nepriama
3. sendvičová (inak tiež viacvrstvová).
3.2.2.2 Priama ELISA
Priama metóda sa v ELISE nevyužíva tak často a široko ako ďalšie
typy, ale je to veľmi jednoduchá metóda pre rýchle stanovenie. Je
to metóda na detekciu a meranie koncentrácie antigénu vo vzorke.
Pomocou pre zachytenie monoklonálnej protilátky, je prítomnosť
určitého antigénu vo vzorke. Mikroplatničkové dosky sú potiahnuté
vzorkou, ktorá obsahuje cieľový antigén, a označené protilátky sa
kvantitatívne stanovia podľa kolorimetrického, chemoluminiscenčného
alebo fluorescenčného koncového bodu. (URL, 2010d).
Priebeh stanovenia, ktorý je znázornený na obrázku 8
(Obrusníková, 2008), možno popísať takto: antigén je zriedený
mierne alkalickým pufrom (takými puframi sú karbonátový pufer nebo
PBS). Antigény sa imobilizujú adhezívne na pevnú fázu behom
inkubácie, ktorá prebieha buď 2 hodiny pri pokojovej teplote, alebo
pri 4 ºC cez noc. Po inkubácii je nenaviazaný antigén odstránený
jednoduchým premytím pomocou premývacieho pufra. Potom sa pridajú
protilátky konjugované s enzýmom tzv. konjugát, ktoré
špecificky rozpoznávajú antigénne miesta reagentov naviazané na
pevnú fázu. Konjugované protilátky sa riedia v pufroch obsahujúce
blokačné činidlo spôsobujúce inhibíciu pasívnej adsorpcie
proteínov, ale ktoré stále umožňujú imunologickú väzbu. Behom
inkubácie sa konjugát naviaže na imobilizovaný antigén. Odstránenie
nenaviazaných konjugátov je opäť prevedené premytím. Následne je
pridaný substrát, ktorý reaguje so špecifickým enzýmom viazaným na
protilátku. Pomocou enzymaticky katalyzovanej reakcie dochádza k
vývoju farvy, kedy sa reakcia nechá prebiehať nejakú dobu, po
ktorej je zastavená pridaním tzv. „stopping solution“, kedy
dochádza opäť ku zmene farby, ktorá je detekovaná
spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke odpovedajúcej vzniknutej
farbe (Crowther, 2008).
Obrázok 8: Priama ELISA (Obrusníková, 2008).
3.2.2.3 Nepriama ELISA
Nepriama ELISA, ilustrovaná na obrázku 9 (Obrusníková, 2008)
využíva neznačené primárne protilátky v spojení s označením
sekundárnej protilátky. Vzhľadom k tomu, označená sekundárna
protilátka je namierená proti všetkým protilátkam určitého druhu
(napr. anti-myšou), môže byť použitý so širokou škálou primárnych
protilátok (napr. všetky myšie monoklonálne protilátky). Použitie
sekundárnej protilátky tiež poskytuje ďalší krok k zosilneniu
signálu, čo zvyšuje celkovú citlivosť testu.
Obrázok 9: Nepriama ELISA. V tomto usporiadaní sa na naviazaný
antigén viaže v druhej jamke neznačená detekčná protilátka (Ab). V
ďalšom kroku je pridaný konjugát (Ab*), ktorý sa viaže na neznačené
protilátky. Nasledujúce kroky sú zhodné s predchádzajúcim systémom
(Obrusníková, 2008).
3.2.2.4 Sendvičová ELISA
Sendvičová ELISA, ktorá je znázornená na obrázku 10
(Obrusníková, 2008), je citlivá metóda pre kvantifikáciu substancií
(ako sú napr. hormóny, produkty „cell signaling“, antigénov
infekčných ochorení, cytokínov atď.) v množstvách od pikogramov po
mikrogramy. Použitie tohto typu metódy ELISA môže byť z viacerých
dôvodov výhodnejšie ako priama alebo nepriama ELISA. Riedenie
analyzovanej látky môže byť napr. príliš vysoké na väzbu na
polystyrénovú mikrotitračnú platničku (napr. bielkovina v
supernatante bunkovej kultúry) alebo sa dobre neviaže na plast
(napr. malé organické molekuly). Taktiež môže byť v zmesi s mnohými
inými látkami, ktoré sa dobre viažu na platničku (URL, 2010c).
Obr. 10: Sendvičová ELISA. Na povrchu prvej jamky sú naviazané
protilátky (Ab), na ktoré sa špecificky viaže antigén (Ag). Potom
je pridaný konjugát (Ab*), ktorý sa viaže na zachytený antigén.
Ďalšie kroky sú rovnaké ako u predchádzajúceho stanovenia.
(Obrusníková, 2008).
Podľa Holst - Jensena et al. (2003) je sendvičová ELISA
technikou najviac používanou na detekciu alergénov.
Tú istú metódu sendvič ELISA použil Holzhauser et al. (2002) na
detekciu lieskových orechov skonštruovanú
s imunopurifikovanými protilátkami od králikov obalenými
proteínmi lieskových orechov. Nespozoroval žiadne podstatné krížové
reakcie s inými orechmi, strukovinami alebo inými zložkami potravín
a boli zistené také nízke koncentrácie ako 5 mg . ml-1, čo
zodpovedá 1 ppm v potravinárskych výrobkoch. Táto sendvičová ELISA
metóda je citlivá a špecifická metóda detekcie a kvantifikácie
lieskových orechov, je užitočná pri odhaľovaní stopovej
kontaminácie lieskových orechov v rôznych spotrebiteľských
výrobkoch. Vzhľadom k tomu, že tento test nevyžaduje séra od
pacientov, je vhodný pre použitie v potravinárskom priemysle.
Podobné výsledky zaznamenal aj Koppelman (1999). Táto sendvičová
ELISA metóda je citlivou a špecifickou metódou detekcie a
kvantifikácie lieskových orechov, je užitočná pri odhaľovaní
stopovej kontaminácie lieskových orechov v rôznych spotrebiteľských
výrobkoch. Vzhľadom k tomu, že tento test nevyžaduje séra od
pacientov, je vhodný pre použitie v potravinárskom priemysle.
Na detekciu a kvantifikáciu lieskových orechov vo veľmi nízkých
koncentráciach sa používa BIOKITS Hazelnut Assay kit. Tento test
využíva polyklonálne protilátky proti proteínu lieskových orechov
v sendvičovej ELISE (URL, 2010a).
Niekoľko štúdií poukázalo na dobrú koreláciu medzi prítomnosťou
amplifikovateľnej DNA a proteínom stanoveným ELISA metódou (Allmann
et al., 1993).
Herman (2003) vo svojej porovnávacej štúdií PCR a ELISA použil
na analyzovanie 41 potravinárskych výrobkov na prítomnosť
nedeklarovaných stôp po lieskových orieškoch s medzou detekcie
<1 mg . kg-1 proteínnych orechov (zodpovedajúce až <10 mg .
kg-1 lieskových orieškov). Oba testy ukázali veľmi dobrú koreláciu
pre potraviny s 1 mg . kg-1 proteínov lieskových orechov.
Sporadické rozpory v odhaľovaní lieskových orechov boli nájdené len
u potravín, ktoré majú <1 mg . kg-1 proteínov lieskových
orechov.
Bola vykonaná aj porovnávacia štúdia PCR v kombinácii s
ELISOU a sendvičovej ELISA na detekciu lieskovoorechového
proteínu s cieľom zistiť do akej miery imunochemické metódy
a techniky založené na DNA sa môžu využiť pri detekcii stôp
alergénnych lieskovoorechových rezíduí. Obe metódy boli vysoko
citlivé a umožňovali detekciu lieskových orechov dokonca menej
ako 10 ppm v komplexných potravinových maticiach. Dobrá
korelácia výsledkov PCR v kombinácii s ELISOU a proteínu
ELISA naznačila, že obe PCR a imunochemické metódy sú vhodné
pre spoľahlivú detekciu potenciálne alergénnych rezíduí lieskových
orechov v potravinách v stopových množstvách (Holzhauser
et al., 2002).
4 Návrh na použitie výsledkov
Po preštudovaní dostupnej literatúry navrhujeme na detekciu
lieskových orechov v potravinách obidve detekčné metódy- ELISA
metódy a polymerázová reťazová reakcia v podobe Real-
Time PCR alebo v kombinácii s ELISA. Metódy sú založené
na rýchlej a citlivej detekcii potenciálne alergénnych zložiek
potravín alebo kontaminácii potravín.
PCR ponúka bezkonkurenčné špecifiká v identifikácii zložiek
a jednou z jej hlavných výhod je jej vysoká citlivosť,
krátke trvanie, potreba malého množstva DNA a pomerne
jednoduchá praktická realizovateľnosť.
Výhodou metód ELISA je dostatočná citlivosť, špecifickosť, je
časovo menej náročná a nie je potrebná separácia. Je vhodná
pre automatizáciu a vyhodnotenie cez počítač, je bezpečnejšia
a je lepšia kontrolovateľnosť reakcie. Vzhľadom k tomu,
že nevyžaduje séra od pacientov je vhodná pre použitie
v potravinárskom priemysle.
Pre zvyšovanie kvality potravín je potrebné zaviesť aj tzv.
správnu výrobnú prax a HACCP systém. Tento systém zahŕňa
starostlivý výber dodávateľov, skúmanie možnosti kontaminácie
výrobku v technologickom procese a analýzu výrobku.
Výsledkom by malo byť, že by potravinový produkt obsahoval len tie
ingrediencie, ktoré sa pri jeho výrobe použili. Systém varovného
označenia upozorňuje na možnú prítomnosť určitých alergénov
v potravine, čím sa alergikom zužuje sortiment použiteľných
produktov.
5 Záver
Alergických reakcií na potraviny pribúda a potravinová
alergia sa stáva celosvetovým problémom. Pritom môže ísť
o pravú alebo o nepravú alergiu, tzv. pseudoalergiu, pri
ktorej dochádza k prehnanej reakcii organizmu na látky, ktoré
sa v potravine nachádzajú.
V tejto práci sme sa venovali popisu spôsobov detekcie
lieskových orechov v potravinách, ktoré sú jedným
z najnebezpečnejším alergénom schopným vyvolať množstvo
symptómov, od kožných reakcií, cez dýchacie až tráviace ťažkosti,
až po anafylaktický šok.
Prvá časť našej práce popisuje jednak alergiu vo všeobecnosti,
ako aj jednotlivé najznámejšie druhy potravinových alergii
s rozdelením na alergie spôsobené potravinami živočíšneho
a potravinami rastlinného pôvodu.
V druhej časti sme sa venovali jednotlivým metódam na
detekciu alergénov v potravinách, s rozdelením na metódy
založené na detekcii DNA – PCR metódy a metódy založené na
detekcii protilátok - imunochemické metódy.
PCR metódy sú používané od 80. rokov 20. storočia a ich
význam neustále narastá. Prvé kvalitatívné PCR metódy na detekciu
lieskových orechov v spracovaných potravinách boli zverejnené
v roku 2000. Ako primer bol použitý hlavný alergén lieskových
orechov.
Metóda umožnujúca presnú kvantifikáciu hľadanej DNA sekvencie vo
vzorke je Real - Time PCR metóda, ktorá využíva fluorescenčné
farbivo SYBR Green a Taqman fluorescenčnú sondu. Citlivosť
tejto metódy umožňuje detekciu aj malého počtu kópií, ba dokonca aj
jedinej kópie cieľovej DNA. Metóda vykazovala pozitívne výsledky na
prítomnosť lieskových orechov v potravinách.
V súčasnosti najčastejšou metódou používanou na detekciu
alergénov je ELISA metóda, ktorá je citlivá a špecifická
a je schopná prinášať plné kvalitatívne výsledky. Najviac
používaným typom ELISA metódy pri detekcii stopových množstiev
lieskových orechov v rôznych potravinárskych výrobkoch je
sendvičová ELISA. Keďže tento test nevyžaduje séra od pacientov, je
vhodný pre použitie v potravinárskom priemysle.
6 Zoznam použitej literatúry
1. ALLMANN, M. - CANDRIAN, U. - HÖFELEIN, C. - LUTHY, J. 1993.
Polymerase chain reaction (PCR): a possible alternative to
immunochemical methods assuring safety and quality of food. In
Lebensm Unters Forsch, roč.196, 1993, s. 248 – 251.
2. BARTŮŇKOVÁ,J. 1998. Potravinové alergie. [online].
[01.11.1998]. [cit. 2009-02-02]. Dostupné na internete: <
http://www.vesmir.cz/clanek/potravinove-alergie>
3. BAUDNER, S. - DREHER, R. M. 1991. Immunochemische Methoden in
der lebensmittelanalytik- Prinzip und Anwendung. In
Lebensmittelchem., roč.45, 1991, s. 53- 69.
4. BAUEROVÁ, M. - TURČÁNI, M. - OMELKA, R. 2004. Polymerázová
reťazová reakcia. Vysokoškolský učebný text. [študijný materiál na
CD ROM]. Nitra: FPV UKF. 2004.
5. BISCHOFF, S. C. - MAYER, J. H. - MANNS, M. P. 2000. Allergy
and the gut. In Int. Arch. Allergy Immunol., roč. 121, 2000, s.
270-283.
6. BEHRENS, M. - UNTAN, M. - BRINKMANN, Y.- BULCHLOU,R.-
LATUS,N. 1999. Identification of animal species in heated and
komplex meat products using species- specific PCR reactions. In
Fleischwirtschaft, roč. 5, 1999, s. 97- 100.
7. CRESPO, J. F.- JAMES, J. M. - RODRIGUES, J. 2004. Diagnosis
and therapy of food aller-gy. In Mol. Nutr. Food Res., roč. 48,
2004, s. 347-355.
8. CROWTHER, R., J. 2008. Direct ELISA. In Biomedical and Life
Sciences., roč. 42, 2008, s. 119- 130.
9. DHARMARAJ, S. 2010. RT- PCR: The Basics. [online]. [cit.
2010-04-24]. Dostupné na internete: <
http://www.ambion.com/techlib/basics/rtpcr/index.html >
10. DEMEŠOVÁ, M. 2009. Orechy sú to pravé orechové. [online].
[12.5.2008]. [cit. 2009-02-04]. Dostupné na internete: <
http://koktail.pravda.sk/orechy-su-to-prave-orechove-df9-/sk_kzdravie.asp.htm>
11. DOBERSKÝ, P. 1987. Náuka o výžive a dietetike.
2.vyd. Martin: Osveta, 1987, s. 168.
12. DRÁPAL, J. – ETTLEROVÁ, K. – HAJŠALOVÁ, J. 2005. Vliv
zpracování potraviny na alergicitu [online]. 2005, [cit.
2007-02-10]. Dostupné na internete: <
http://www.cupr.szn.cz/vedvybor/vvp.htm >
13. FERENČÍK, M. - ROVENSKÝ, J. - MAŤHA, V. - JENSEN - JAROLIM,
E. 2006. munológia a alergológia. Bratislava: Slovak Academic
Press, 425 s., ISBN 80-89104-82-7.
14. GARCIÁ, T. - MARTÍN, R. - MORÁLES, P. 1993. Sandwich ELISA
for detection of caprine milk in bovine milk. In Milchwiss, roč.
48, 1993, s. 563- 566.
15.GIOVANNACCI, I. - GUIZARD,C. - CARLIER,M. - DUVAL,V. -
MARTON, J. 2004. Species identification of meat products by ELISA.
In International Journal of Food Science and Technology, roč. 39,
s. 863- 867.
16. GOLIAN, J. 1998. Ochorenia z potravín. Nitra: VES SPU,
1998, s. 128, ISBN 80-7137-519-5.
17. GRYSON, N. – MESSENS, K. – DEWETTINCK, K. 2008. PCR
detection of soy ingredients in bread. In Eur. Food Res. Technol.,
roč. 227, 2008, s. 345 – 351.
18. HERMAN, L. - BLOCK, J. - VIANE, R. 2003. Detection of
hazelnut DNA traces in chocolate by PCR. In J Food Sci Tech, roč.
38, 2003, s. 633 – 640.
19. HERMANOVÁ, V. 1994. Detekcia kravského mlieka v ovčom
a kozom mlieku a mliečnych výrobkov imunologickou
metódou. In Laboralim: zborník z vedeckej konferencie
s medzinárodnou účasťou. Banská Bystrica, 1994, s. 54- 57.
20. HOLST-JENSEN, A. - RONNING, S. B. - LOVSETH, A. - BERDAL, K.
G. 2003. PCR technology for screening and quantification of
genetically modified organisms (GMOs). In Anal. Bioanal. Chem.,
roč. 375, 2003, s. 985-993.
21. HOLZHAUSER, T. - STEPHAN, O. - VIETHS, S. 2002. Detection of
potentially allergenic hazelnut (Corylus avellana) residues in
food: a comparative study with DNA PCR-ELISA and protein sandwich –
ELISA. In J Agric Food Chem, roč. 50, 2002, s. 5808 - 5815.
22. HOLZHAUSER, T. - VIETHS, S. 1999. Quantitative sandwich
ELISA for determinative of traces of hazelnut (Corylus avellana)
protein in komplex food matrixes. In J Agric Food Chem, roč. 47,
1999, s. 4209 - 4218.
23. HOLZHAUSER, T. - WANGORSCH, A. - VIETHS, S. 2000. Polymerase
chain reaction (PCR) for detection of potentially allergenic
hazelnut residues in complex food matrixes. In Eur Food Res
Technol, roč. 211, 2000, s. 360 - 365.
24. KAYSEROVÁ, H. 2000. Potravinová alergia. In Dieťa nielen pre
rodičov, roč.4, 1998, č.3, s. 6 - 9.
25. KELLER, U. - MEIER, R. - BERTOLI, S. 1993. Klinická
výživa.1.vyd. Praha: Scientia medica, 1993, s. 230, ISBN
80-85526-08-5.
26. KOPPELMAN, J. et al.2000. Comparison of different
immunochemical methods for the detection and quantification of
hazelnut proteins in food products . [online]. [2000-01-06].
[cit.2009-03-30]. Dostupné na internete:
27. KOPPELMAN, J. - KNULST, C. - KOERS, J. - PENNINKS, H. -
PEPPELMAN, H. - VLOOSWIJK, R. - PIGMANS, I. - VAN DUIJN, G. -
HESSING, M. 1999. Comparison of differentimmunochemical methods for
the detection and quantification of hazelnut proteins in food
products. In Journal of Immunol Methods, roč. 229, 1999, s. 107 -
120.
28. KVASNIČKOVÁ, A. 1998. Alergie z potravín. Praha: ÚZPI,
1998, s. 60, ISBN 80-85120-93-3.
29. KVASNIČKOVÁ, A. et al. 2005. Alergény v potravinách. In
Kvalita potravín, roč.5, 2005, č. 3, s. 30 - 33, ISSN 1213 -
6859.
30. KUCHTA, T. – PIKNOVÁ, L. 2007. A novel real-time
polymerase chain reaction (PCR) method for the detection of
hazelnuts in food. In Eur Food Res Technol, roč. 226, 2008, s.
1155- 1158.
31. LEE, H. - MORGAN, M. R. A. 1993. Food immunoassays:
applications of polyclonal, monoclonal and recombinanat antibodies.
In Trend in Food Scienc of Technology, roč. 4, 1993, s. 129 -
134.
32. LEIBOLD, G. 1993. Alergie. Praha: Svoboda – Lebertas, 1993,
s. 113. ISBN 80-205-0315-3.
33. LEVIEUX, D. - VENIEN, A. 1994. Rapid, sensitive two- side
ELISA for detection of cows milk in goats or ewes milk using
monoclonal antibodies. In J. Dairy Res. roč. ,61, 1994, s. 91-
99.
34. MÄRTLBAUER, E. 1999. Comparison of ELISA and HPLC for the
Determination of Histamine in Cheese. In J. Agric. Food Chem. roč.
47, 1999, 1961 - 1964.
35. METCALFE, D. D. 1991. Food allergy. In Curr. Opin. Immunol.,
roč. 3, 1991, s. 881- 886.
36. MIRAGLIA, M. - BERDAL, G.K. - BRERA, C. - CORBISIER, P. -
HOLST-JENSEN, A. - KOK, E. J. - MARVIN, H. J. P. - SCHIMMEL, H. -
RENTSCH, J. - ZAGON, J. 2004. Detection and traceability of
genetically modified organisms in the food production chain. In
Food and Chemical Toxicology, roč. 42, 2004, s. 1157- 1180.
37. MÜLLER, R. 1997. Timed - ELISA: an alternative approect to
quantitative enzyme- linked immunosorbent assay. In Biotechnol.
App.Biochem., roč. 26, 1997, s. 73- 78.
38. OBRUSNÍKOVÁ, R. 2008. Vývoj a optimalizace ELISA metódy pro
stanovení obsahu glykovaného hemoglobinu ve vzorcích krve:
Bakalárska práca. Brno: Masarykova univerzita, 2008, 80 s.
39. PANČÍK, P. - MARCIŠOVÁ, D. 2003. Polymerázová reťazová
reakcia. [online]. [cit. 2010-02-12]. Dostupné na internete:
40. POMS, A. - HELM, M. - BANNON, A. - BURKS, W. - TSAY, A. –
CHAPMAN. 2003. Monitoring peanut allergen in food products by
measuring Ara h 1. In J Allergy Clin Immunol, roč. 111, 2003, s.
640 - 645.
41. POMS, R. E. - KLEIN, C. L. - ANKLAM, E. 2004. Methods for
allergen analysis in food: a review. In Food Addit Contam., roč.
21, 2004, s. 1-31.
42. PRUŽINEC, P. 2002. Moja alergia. Bratislava: Bonus, 2002,
148 s., ISBN 80-968491-3-1.
43. RASMUSSEN, R. 2003. Quantification on the LightCycler
Instrument. [online]. [cit. 2010-03-15]. Dostupné na internete:
<
http://www.idahotec.com/lightcycler_u/lectures/quantification-on-lc.htm
>
44. RENČOVÁ, E. 2006. Potravinové alergény a vhodné metódy
pro jejich stanovení. In XXXVI. LENFELDOVY A HÖKLOVY DNY.
Konference o hygiene a technológii potravin. Brno:
Veterinárni a farmaceutická univerzita, 2006. S. 32-35. ISBN
80-7305-570-8.
45. RT- PCR: The Basics. 2010. [online]. [cit. 2010-04-24].
Dostupné na internete:
< http://www.ambion.com/techlib/basics/rtpcr/index.html
>
46. SABOLOVÁ, G. 2004. Ochrana osôb trpících potravinovou
alergií v európskej potravinovej legislatíve. In Slovenský
veterinárny časopis, roč. 29, 2004, č. 4, s. 12-13.
.
47. SANDBER, M. - LUNGBERG, L. - FERM, M. - MALMEHEDEN YMAN, I.
(2003). Real time PCR for the detection and discrimination of
cereal contamination in gluten free foods. In Eur Food Res Technol,
roč. 217, 2003, s. 344–349.
48. SHAH, U. - WALKER, W. A. 2002. Pathophysiology of intestinal
food allergy. In Adv. Pediatr., roč. 49, 2002, s. 299- 316.
49. SCHOTT, H. 1994. Kronika medicíny. 1. vyd. Bratislava:
Fortuna Print, 1994, s. 647, ISBN 80-7153-081-6.
50. SMERNICA KOMISIE 2007/68/ES z 27. novembra 2007, ktorou sa
mení a dopĺňa príloha IIIa k smernici Európskeho parlamentu a Rady
2000/13/ES, pokiaľ ide o určité zložky potravín.
51. SMERNICA KOMISIE 2006/142/ES z 22. decembra. 2006,
ktorou sa mení a dopĺňa príloha III a k smernici
Európskeho parlamentu a Rady 2000/13/ES, ktorý obsahuje zoznam
zložiek, ktoré musia byť uvedené na označení potravín.
52. SCHWAGELE, F. 1998, Polymerase Chain Reaction – PCR –
Moglichkeiten und Grenzen der Anwendung in der
Lebensmittelanalytik. In Roche magazine, roč. 40, 1998.
53. SMÝKAL, P. 2006. Hrách v genomickém věku- 140 let od
Mendelova objevu. In Živa, časopis pro logickou práci, Praha:
Academia, roč. 54, 2006,s. 4, ISSN 0044- 4812.
54. STRÁŽNICKÁ, H. et al. 2000. Alergény v sóji
a v sójových výrobkoch ako ukazovatele použitej
technológie. In Agrochémia, roč. 4 (40), 2000, č. 2, s. 4-6.
55. SZÁRAZOVÁ, A. 2010. Polymerázová reťazová reakcia. [online].
[cit. 2010-04-12]. Dostupné na internete: <
www.lfuk.sk/files/ref/pcr.doc>
56. VIGLASKÝ, J. 1998. Polymerázová reťazová reakcia.
[online].[cit. 2010-04-05]. Dostupné na internete: <
www.uniba.sk/fileadmin/user_upload/editors/a.../UKOLF-04.rtf>
57. ZAJONCOVÁ, L. 2003. Imunochemické metódy [online]. [cit.
2010-14-03]. Dostupné na internete:
58. ZACHAR, D. 2006. Výživa človeka I., 1. vyd. Zvolen : TU,
2006. 266 s. ISBN 80-228-1580-2.
59. Alergia. 2009j. [online]. [cit. 2009-05-04]. Dostupné na
internete: .
60. DIRECT ELISA. 2010d. [online]. [cit. 2010-15-03]. Dostupné
na internete: <
http://www.genwaybio.com/gw_file.php?fid=3032>
61. ELISA. 2010g. [online]. [cit.2010-03-15]. Dostupné na
internete: < http://cs.wikipedia.org/wiki/ELISA >
62. NEPRIAMA ELISA. 2010c. [online].[cit. 2010-23-04]. Dostupné
na internete:
<
http://www.sigmaaldrich.com/slovakia/informcie-o-produktoch/nepriama-elisa.html>
63. Polymerázová reťazová reakcia. 2010i. [online]. [cit.
2010-03-14]. Dostupné na internete:
64. Principle of the PCR. 1999e. [online]. [cit. 2010-03-12 ].
Dostupné na internete:
65. REAL-TIME RT PCR (kvantitativní PCR v reálném čase). 2007b.
[online]. [cit. 2010-03-15]. Dostupné na internete: <
www.lem-olomouc.cz/real-time.htm>
66. Real- Time PCR: the TagMan Method. 2003f. [online]. [cit.
2010-04-24]. Dostupné na internete:
67. The Biokits Hazelnut Assay kit. 2010a. [online]. [cit.
2010-22-04]. Dostupné na internete:
<
http://www.neogen.com/foodsafety/pdf/ProdInfo/Page_902084L_1209.pdf>
68. What is the ELISA method?. 2003h. [online]. [cit.
2010-04-21]. Dostupné na internete: <
http://www.wisegeek.com/what-is-the-elisa-method.htm>
38
