Unidad 4 Mutagénesis

Unidad 4. Mutagnesis, carcinognesis y teratognesis

Francisco Hernndez-Luis, Mara Elena Bravo-Gmez, Perla

Castaeda-Lpez, Circe Mouret-Hernndez

Facultad de Qumica, Departamento de Farmacia, UNAM

Contenido 4.1 Mutagnesis ................................................................................................ 1

4.1. Niveles de accin de mutgenos .............................................................. 3

4.2. Interaccin de xenobiticos con el ADN .................................................. 3

4.2.1. Agentes desaminantes ........................................................................... 3

4.2.2. Agentes alquilantes ................................................................................ 4

4.2.2.1. Agentes alquilantes que necesitan bioactivarse ............................... 7

4.2.3. Agentes intercalantes ............................................................................. 9

4.3 Evaluacin de la actividad mutagnica de xenobiticos ....................... 10

Bibliografa ...................................................................................................... 17

4.1 Mutagnesis

Mutacin es todo cambio transmisible en el material gentico de un

organismo. Algunos de los agentes fsicos y qumicos que producen dichos

cambios son: la radiacin ionizante, mostazas nitrogenadas, epxidos,

sulfonatos de metilo.1

Es importante sealar la diferencia entre dos trminos que con

frecuencia suelen utilizarse como sinnimos: mutagnesis y genotoxicidad.

La mutagnesis es la capacidad de un xenobitico para causar alteraciones

en el material gentico que lleguen a ser transmisible a la progenie celular.

La genotoxicidad esun trmino que incluye alteraciones al material gentico,

tales como intercambio de cromtidas hermanas o rupturas de hebras de

ADN, que no necesariamente son transmitidas a la decendencia.1

Los tipos de efectos genotxicos que se pueden presentar

dependern si la interaccin se llev a cabo sobre el ADN o sobre los

cromosomas. En el primer caso, se denomina microlesin; si la alteracin se

manifiesta en la progenie se denotar como una mutacin puntual. En el

segundo caso, la alteracin se denomina macrolesin.2

Unidad 4. Mutagnesis, carcinognesis y teratognesis Departamento de Farmacia, Facultad de Qumica, UNAM.

2 Profesores: Francisco Hernndez Luis, Mara Elena Bravo Gmez, Perla Castaeda Lpez, Servicio Social (2014-12/16280): Circe Mouret-Hernndez

De las alteraciones que se producen en el cido desoxiribonuclico (ADN),

no todas son necesariamente dainas, ya que muchas mutaciones han

ocasionado mejores adaptaciones de los individuos en los procesos

evolutivos. El peligro se presenta con aquellas mutaciones cuyos efectos

provocan reacciones adversas para el organismo. Las consecuencias

nocivas de las mutaciones incluyen desordenes en la fertilidad, muerte

embrionaria y perinatal, malformaciones, enfermedades hereditarias, y

cncer. Los propsitos de la toxicologa en este campo son:

a) Identificar aquellas sustancias que presenten potencialidad

genotxica (mutagnica).

b) Tratar de establecer el mecanismo de accin y las consecuencias

fenotpicas de los agentes que provocan mutaciones.

c) Establecer los parmetros o condiciones necesarias para minimizar

la exposicin humana a los genotxicos, con el propsito de evitar

alteraciones en la informacin hereditaria que ya posee el individuo.

La probabilidad de que un xenobitico pueda causar dao gentico

depende de los siguientes factores:

a) Concentracin del xenobitico en el medio ambiente.

b) Ingreso del xenobitico y su distribucin corporal.

c) Biotransformacin por el tejido en el cual el compuesto es

distribuido.

d) Reactividad del xenobitico, o sus metabolitos, con las

macromolculas, especialmente con el ADN.

e) Capacidad de la clula para rectificar o amplificar el dao y que ste

se exprese.

f) Competencia del tejido para reconocer y suprimir la multiplicacin de

las clulas con propiedades aberrantes

Por todos estos factores, es importante tener en cuenta que para que un

compuesto presente en el medio ambiente, afecte al material gentico no es

un evento simple y fcil de llevarse a cabo.

Figura 4-1. Paradigma toxicolgico

excrecin

aproximacin al ADNtraslado por la membrana

del ncleo

riesgo de exposicin

ruta de ingreso y

distribucin fisiolgica

biotransformacin

reaccin con el ADN

(mutacin)

procesos de

reparacin

expresin

trastorno biolgico

(reaccin adversa)

traslado por membranas

celulares

etapa

toxocinticaetapa

toxodinmica



4.1. Niveles de accin de mutgenos

Las consecuencias de la mutagnesis se pueden esquematizar en

la siguiente forma segn sea afectada una clula somtica o una clula

germinal.

Figura 4-2. Consecuencias de mutaciones en clulas somticas y germinales

4.2. Interaccin de xenobiticos con el ADN De manera general se pueden agrupar a los xenobiticos que actan

sobre el material gentico en cuatro grandes grupos.

Tabla 4-1. Genotxicos puntuales y sus mecanismos de accin

Tipo de compuesto

Mecanismo Ejemplo Alteracin gentica

Agentes alquilantes

Forman enlaces covalentes con las purinas y pirimidinas provocando los sitios alquilados

Sulfato de alquilo, mostazas nitrogenadas, nitrosourea

Transicin, Transversin

Agentes desaminantes

Desaminan adenina y la transforman en hipoxantina; y a la citosina en uracilo

cido nitroso Transicin

Anlogos de base

Sustituyen a las bases pricas y pirimidnicas normales durante la replicacin del ADN

2-aminopurina Transicin

Agentes intercalantes

Se intercalan en las hebras de ADN.

Acridinas, antraciclinas

Alargamiento que altera la lectura en el ADN

Transicin: cambio de una purina por otra purina (o pirimidina por otra pirimidina) en la replicacin del ADN; Transversin: cambio de una purina por una pirimidina en el mismo proceso.

4.2.1. Agentes desaminantes

Un ejemplo de transformacin qumica de bases es provocada por

el cido nitroso, HNO2, el cual provoca la transformacin de citosina a uracilo

o de la adenina a hipoxantina. El cido nitroso puede ser formado, en el

cuerpo humano, por la reaccin de nitritos con compuestos orgnicos

(aminas secundarias) en las condiciones cidas del estmago.

Figura 4-3. La transicin y tranversin en las bases nitrogenadas del ADN

transmisible a

la progenie

recesivodominante viablemuerte fetal

cncer

cambio recesivo

muerte celular

clula germinalclula somtica

evento mutagnico

odominante

mutgeno



Figura 4-4. Desaminacin de bases nitrogenadas por accin del HNO2

4.2.2. Agentes alquilantes

Los agentes alquilantes pueden adicionar un grupo alquilo (metilo,

etilo, propilo, etc) al ADN, o a cualquier otra molcula de carcter nucleoflica.

En el ADN provocan alteraciones estructurales en los cidos nucleicos

(microlesiones). El mecanismo de la reaccin involucra la adicin de una

porcin nucleoflica del ADN a la parte electroflica (alquilo) del agente

alquilante.

Caractersticas de los agentes alquilantes Naturaleza electroflica Altamente reactivos Forman enlaces covalentes Alteran la funcin del ADN y muerte celular Manifiestan escasa selectividad hacia los tipos de clulas (antineoplsicos (antiproloferativos) y carcingenos) Deprimen la mdula sea

Agentes alquilantes monofuncionales y bifuncionales Entre los agentes alquilantes se encuentran varios compuestos de

importancia industrial y frmacos anticancergenos. Su toxicidad radica en

que pueden introducir un grupo alquilo en las macromolculas biolgicas,

particularmente el ADN. La mayora de ellos son genotxicos directos y se

clasifican en dos grupos: aquellos que van a provocar una sola alquilacin

(monofuncionales), y aquellos que logran provocar dos alquilaciones

(bifuncionales). Ejemplos del primer grupo lo constituyen el sulfato de dimetilo

(DMS), -propiolactona (BPL). Este ltimo ha sido utilizado en medicina como

agente esterilizante y para inactivar al virus del SIDA presente en las

muestras biolgicas.

Los agentes alquilantes bifuncionales se caracterizan porque pueden

alquilar dos sitios nucleoflicos en el ADN. Tales sustancias pueden provocar

enlaces cruzados entre una base nitrogenada y una protena o con otra base

nitrogenada, la cual puede estar en la misma hebra o en la hebra alterna del ADN.

El compuesto prototipo para los agentes bifuncionales es el gas mostaza, el cual

pertenece a su vez al grupo de los compuestos referidos como mostazas, que

pueden presentar al tomo de azufre o al tomo de nitrgeno como elemento

para la cooperacin de grupo vecino (cooperacin ananquimrica).

Alquilacin intracatenaria Alquilacin intercatenaria

Figura 4-5. Tipos de alquilaciones en las hebras de ADN



Figura 4-6. Modos de alquilacion del ADN

Figura 4-7. Forma de accin de un agente alquilante bifuncional

Estos compuestos inicialmente no fueron identificados, en pruebas

con animales de laboratorio, como agentes carcinognicos. Posteriormente,

fueron implicados como tales, al estudiarse los casos de trabajadores

japoneses quienes laboraban en la fabricacin de gas mostaza con fines

blicos. Estos trabajadores presentaron alta incidencia de cncer en el tracto

respiratorio.

Tabla 4-2. Ejemplos del algunos alquilantes mono y bifuncionales

Xenobitico Estructura

Alquilantes monofuncionales

Alquiliminas

Etilenimina

steres de sulfato

Sulfato de dimetilo (CH3)2SO4

Lactonas pequeas

-propiolactona (BPL)

Compuestos con halgeno activo

Cloruro de bencilo

Yoduro de metilo CH3I

Alquilantes bifuncionales

Alquilenepxidos

1,2,3,4-butadienepxido

Mostazas

Sulfuro de bis(2-cloroetilo), (gas mostaza,

yperita)

S

CH2CH2Cl

CH2CH2Cl

agente alquilante bifuncional

+

ADN

protena

OH

alquilantehidrolizado

alquilacindos hebras

alquilacinuna hebra

alquilacinADN-protena

alquilacindos ADN

H2C CHR

N

H

O

O

CH2Cl

H2C CH CH CH2O O



Bis(2-cloroetil)amina NH

CH2CH2Cl

CH2CH2Cl

Ciclofosfamida (cytoxan)

(necesita bioactivarse)

Los ejemplos de lo sitios mono-alquilados que se han encontrado se muestran a

continuacin.

Figura 4-8 La alquilacin de la guanina (G) en el oxgeno exocclico en posicin 6 (O6MeG)

es la primera lesin que ocasionan los agentes alquilantes y su presencia ha correlacionado

con la aparicin de tumores en ratas. La O6MeG provoca la transicin GA (adenosina) en

el proceso de replicacin de ADN. Sin embargo, existe en las clulas de los mamferos una

enzima no inducible llamada la AGT que se encarga de reparar el dao ocasionado al

revertir el proceso de alquilacin y recuperar a la G para que siga realizando su funcin en

el ADN.

AGT: O6-alquilguanina ADN alquiltransferasa

Figura 4-9. Reparacin de una monoalquilacin3

ClCH2CH2N P

O

ClCH2CH2 O

N

H



4.2.2.1. Agentes alquilantes que necesitan bioactivarse

Las nitrosaminas

La mayora de los carcingenos N-alquilados requieren de

activacin enzimtica para transformarse en compuestos activos contra el

ADN. Estas biotransformaciones involucran generalmente reacciones de

oxidacin mediadas por el citocromo P 450. Como ejemplo presentamos a

continuacin, la bioactivacin de la N,N-dimetilnitrosamina (NDMA).

Figura 4-10. Activacin y alquilacin por una nitrosamina

El diazometano parece ser el intermediario en la accin de estos

compuestos sobre el ADN al transferir directamente el grupo metilo a esta

macromolcula.

Las nitrosoureas y nitrosoguanidinas

Algunos agentes alquilantes, necesitan hidrolizarse para liberar a la

especie reactiva, tal es el caso de las nitroureas, nitrosoguanidinas y

nitrosouretanos. La N-metil-N-nitrosourea (MNU) se hidroliza rpidamente a

pH 7 y 37 C, para dar hidroxildiazometano, mientras que la N-metil-N-nitro-

N-nitrosoguanidina (MNNG), lo hace lentamente. Como resultado de esto,

se ha postulado que una forma acelerada de alquilacin por MNNG,

implicara una catlisis de un grupo tiol de las clulas.

Este tipo de compuestos se utilizan en los laboratorios de sntesis,

como precursores de diazometano.

Figura 4-11. Generacin de hidroxildiazometano por MNU y MNNG

Los hidrocarburos aromticos policclicos (HAP)

Este grupo de compuestos se presentan en forma de mezclas

complejas en una variedad de productos ambientales tales como el holln,

alquitrn, humo de tabaco, combustin incompleta del petrleo. Dos

ejemplos de este tipo de compuestos lo constituyen el benzo[a]pireno (BP) y

el dibenzo[a,h]antraceno cuyas estructuras se han presentado

anteriormente. En 1964, se demostr que el benzo[a]pireno se una

covalentemente al ADN de la piel del ratn in vivo y este fenmeno se

reprodujo in vitro utilizando microsomas de ratas como fuente de citocromo

P 450.

diazometano

(especie

alquilante)

P 450

NDMA

N

CH3

CH3

N O N

CH3

N O

CH2

OH

C

H

H

O

N=N

CH3

OH

N=N

CH3 OH

CH3 N=N+

hidroxildiazometano

cis

trans

C

NH

NHNO2

SR

MNNG

+CH3 N=N OH

(NC NH NO2)+CH3 N=N OHa

b

b

a

OH-

R SH

C

N NH NO2

N

N OCH3

H

NCH3 N=O

CNH2O

MNU

CH3 N=N OH + O=C=NH

hidroxildiazometano



Se ha propuesto una teora denominada regin baha. En esta, se

considera que aquellos HAP que presente esta regin estructural sern de

riesgo carcinognico ya que al metabolizarse producirn dos epxidos, uno

de los cuales ser el responsable de interaccionar con el ADN.

Figura 4-12. Propuestas de biotransformacin de la teora baha

Esta biotransformacin implica algunas consideraciones

estereoqumicas que a continuacin se presentan:

Figura 4-13. Aspectos estereoqumicos en la biotransformacin del benzo[a]pireno

El BP 7,8-diol-9,10-epxido de conformacin (+)anti (dado por la

relacin entre el epxido y el hidroxilo en posicin 7) es el que va a

interaccionar con las bases nitrogenadas.

Figura 4-14. Interaccin del BP-7,8-dihidrodiol-9,10-epoxido con la guanina

Es importante puntualizar, que la biotransformacin de estos

compuestos primeramente conducir a la destoxificacin mediante la

reaccin de glucuronidacin. Slo por la saturacin de este proceso se

presentarn aquellos cambios estructurales que provoquen la produccin de

sustancias con riesgo carcinognico.

BP: benzo[a]pireno; Ah: aromatic receptor

Figura 4-15. Alternativas de biotransformacin para los HAP

(segundo epxido)( primer epxido)

regin baha 1

3

4

67

8

9

10

12

benzo[a]pireno (BP)

O

BP 7,8-epxido

HO

OH

BP 7,8-diol

HO

HO

O

BP 7,8-diol-9,10-epxido

109

7

epxido

hidrolasa

epxido

hidrolasa

epxido

hidrolasa

CYP 1

CYP 1CYP 2

CYP 2

109

7

(+) anti

O

OH

HO HO

OH

(+) syn

O

HO

HO

HO

HOO

Obenzo[a]pireno

BP 7,8-diol-

9,10-epxido

BP 7,8-diol-

9,10-epxido

78

78

HO

HO

O

N

N N

N

O

H2N

H

azucar

N N

N

O

azucar

HN

N

H

HO

HO OH

Aducto del hidrocarburo policclico y la guanina

CYP 2

ACTIVACION TOXICA

DESTOXIFICACION

BP 7,8-glucurnidoglucuronidacin

mutacinADN

mitsis

promocin

receptores

regulatorios

CYP 1

receptor Ah

BP 7,8-diol-

9,10- epxido

CYP 1

BP

7,8-diol

BP

transcripcin del ADN



4.2.3. Agentes intercalantes

A continuacin se ilustra el fenmeno de la intercalacin en el ADN.

Figura 4-16. Intercalacin del ADN

Figura 4-17. Diagrama que muestra dos molculas de doxorrubicina intercalndose en el ADN

Los agentes intercalantes son un importante grupo de mutgenos

utilizados en los laboratorios de investigacin. La intercalacin fu primero

descrita por Lerman en 1961 como una interaccin no covalente en la cual el

agente intercalante se coloca de forma perpendicular al eje de la doble hlice.

Algunos ejemplos de agentes intercalantes se presentan en la Figura 4-14.

Los compuestos intercalantes se caracterizan por su dimensin, que

corresponde a 3 anillos aromticos condensados (o heterocclicos), la cual

es semejante al dimetro de la doble hlice del ADN. La intercalacin provoca

una separacin vertical de los pares de bases, distorsionando la

conformacin del enlace azucar-fosfato y una distorsin de la hlice tal que

la longitud de la misma se incrementar. La intercalacin ocurre

preferentemente en la secuencia pirimidina-3-5-purina que dentro de la

secuencia purina-3-5-pirimidina.

Figura 4-18. Agentes intercalantes del DNA

Las investigaciones sealan que los agentes intercalantes interfieren

con la topoisomerasa II. Esta enzima cataliza la ruptura pasajera de la doble

hlice de ADN para propsitos tales como replicacin o transcripcin. Aunque

la separacin ocurre en presencia de los intercaladores, la topoisomerasa II

quinacrina

N

OCH3

Cl

NHN

C2H5

C2H5

P = pptido

actinomicina

PP

O

N

O

CH3 CH3

C CO O

bromuro de etidium

+ -Br N

NH2H2N

C2H5acriflavina

NH2N NH2



permanece firmemente unida en el punto daado y entonces previene el

acoplamiento de las hebras nuevamente. Actualmente, se piensa que la

intercalacin es la primera etapa en una serie de eventos que provocarn

dao al ADN por otros mecanismos.

Figura 4-19. Afectacin de la topoisomerasa

4.3. Evaluacin de la actividad mutagnica de xenobiticos

Muchas sustancias qumicas y agentes fsicos pueden provocar

citotoxicidad por diferentes mecanismos, uno de los cuales involucra la

interaccin con los cidos nuclicos provocando alteraciones de la

informacin gentica, con la consecuente produccin, ya sea, de un efecto

letal para la clula o daos dbiles o severos a una o ms de las funciones

celulares a nivel de ARN, membranas, protenas y enzimas. Los

experimentos para poder evaluar estos efectos llegan a ser complejos y

prolongados ya que implican animales completos, y estudios a travs de

varias generaciones. Ante tal situacin, se han desarrollado una serie de

pruebas in vitro de corta duracin (short-term) utilizando microorganismos,

plantas, insectos y cultivos celulares de mamferos. Estas pruebas sirven

para monitorear (screening) posibles agentes con actividad mutagnica,

teratognica y/o carcinognica.

Pruebas para la evaluacin de actividad mutagnica en procariotes

Basados en la hiptesis de que los carcingenos son inicialmente

mutgenos, Ames y colaboradores en la dcada de los 70s, realizaron

experimentos con varios microorganismos para encontrar sustancias con

actividad mutagnica. La cepa bacteriana que mejores resultados

proporcion fu la Salmonella typhimurium. (En la actualidad tambin se

utiliza Escherichia coli WP2 uvr A-). Las cepas originales fueron

genticamente incapaces de sintetizar histidina (his-). En este ensayo, se

incuban cepas de esta bacteria con algn xenobitico y en medio de cultivo

sin histidina. En estas circunstancias, un crecimiento de colonias es indicativo

de accin mutagnica del compuesto estudiado, al convertir un organismo

auxotrfico que requiere de un nutriente especfico para subsistir (histidina)

hacia un organismo prototrfico, que puede sintetizar el nutriente requerido

desde un precursor ms simple presente el medio de cultivo.

Figura 4-20. Prueba de Ames www.bioreliance.com/AMES_assay.html



Dos variantes de esta tcnica, se utilizan al verter las mezclas de

microorganismos y xenobiticos, a las cajas de petri para posterior

incubacin. Estas variantes son: la incorporacin inmediata y la

preincubacin.

En la incorporacin inmediata, el control, el microorganismo y el

xenobitico, una vez que han sido mezclados, se vierten inmediatamente a

las cajas de Petri, para enseguida incubarlas a 37 C durante 48 h. sta

variante se presenta esquemticamente en la figura 4-11.

Figura 4-21. Pruebas para la actividad mutagnica en bacterias

Un aspecto adicional a considerar es la adicin de la fraccin S9.

Esta fraccin se obtiene del hgado de mamferos (usualmente ratas), a las

cuales se les administra previamente Aroclor 1254 (en la actualidad se

prefiere una mezcla de fenobarbital y 5,6-benzoflavona) para inducir las

enzimas que metabolizan xenobiticos.

Figura 4-22. Obtencin de la fraccin S9

Para mejores resultados, se prepara la mezcla S9 que consiste en

fraccin S9 (0.1-0.3 mL), MgCl2 (0.4 M, 0.02 mL), KCl (1.65 M, 0.02 mL),

glucosa 6-fosfato(1M, 0.005 mL), NADPH (0.1 M, 0.04 mL), NADH (0.1M,

0.04 mL), amortiguador de fosfato de sodio (0.2M, 0.5 mL). Todo esto se

afora a 1 mL.

La variante de preincubacin se describe a continuacin. Cantidades

disponibles (108 microorganismos/ mL) de microorganismo mutante, son

incubados en tubos de ensayo por 30 o 60 min, con medios pocos nutritivos,

una capa de agar y en presencia o ausencia del xenobitico a evaluar.

Transcurrido el tiempo, el contenido de los tubos se vierte sobre cajas de

petri que contiene una cantidad mnima de medio de cultivo y son incubadas

a 37 C por 48 h.

rataadministracin

del inductor

sacrificar y

extraer el

hgado

homogeneizar

en fro con

solucin salina

centrifugar

a 10, 000 g

el sobrenanante

se centrifuga a

102 000 g

al precipitado

se le denomina

fraccin micro-

somal S9

al sobrenadante

se le llama fracin

citoslica S100



Los tubos de ensayo deben presentar 108 organismos por mL. En el tubo (A) se presenta medio de cultivo ms agar, en el tubo (B) se presenta el medio de cultivo ms la fraccin S-9 del hgado de rata inducido por Aroclor 1254; el tubo (C) presenta el medio de cultivo, la fraccin S-9 y el compuesto qumico que se va a evaluar. Los tubos se incuban a 37 C por 48 Hr. Sobre un rango de concentraciones del compuesto de prueba, el nmero de colonias debe incrementarse al aumentar la cantidad de sustancia.

Figura 4-23. Pasos generales de la prueba de Ames

Un aspecto importante a considerar es la concentracin del

xenobitico que se va a estudiar. Por esta razn, primero se lleva a cabo un

estudio de sensibilidad de la cepa a diferentes concentraciones del

xenobitico. Las concentraciones txicas (pendientes negativas, Figura

siguiente) de entrada se rechazan.

Para cada estudio se recomienda de 5 a 6 concentraciones diluidas

a una relacin del doble o triple. Cada estudio por duplicado. En la grfica

siguiente, la recta de pendiente positiva es la de utilidad. De esta parte se

determina el valor de dicha pendiente (m) que se interpreta como la actividad

mutagnica especfica, parmetro que nos sirve para evaluar la actividad

mutagnica del xenobitico estudiado.

m = actividad mutagnica especfica (n.c./mg) n.c. : nmero de colonias

Figura 4-24. Consideraciones para la prueba de Ames

En la actualidad se disponen de varias cepas de Salmonella

typhimurium para realizar las evaluaciones de actividad mutagnica. Algunas

de ellas se presentan en la siguiente tabla.

Tabla 4-3. Algunas cepas de salmonella utilizadas para la prueba de Ames

Cepas de Salmonella typhimurium

Tipos de mutaciones detectadas

TA 1535 Detecta mutaciones por sustitucin de pares de bases

TA 100 Es derivada de la TA 1535, pero contiene el plsmido pKM101, el cual incrementa la sensibilidad al provocar fallas en los procesos de reparacin del ADN.

TA 102, TA 104 Detectan mutaciones por sustitucin de pares de bases que no detectan las cepas TA 1535 y TA 100.

TA 1537 Detecta mutaciones por adicin de bases. Presenta una mutacin en el gen hisC3076

n.c./caja

mg/caja

0

0 | | | |

efecto txico

sobre el

microorganismom

10 20 30 40

_

_

_

_

_

100

200

300

400

500



TA 1538 Detecta mutaciones por adicin de bases. Presenta la mutacin en el gen hisD3052

TA 98 Es derivada de la TA 1538, presenta el plsmido pKM101

TA 1535 Detecta mutaciones por delecin de bases

YG 1024 Cepa sensible a aminas aromticas heterocclicas Claxton, L.D.; Allen, J.; Autetta, A.; Mortelmans, K.; Nestmann, E.; Zeiger, E. Guide for the Salmonella thyphimurium/mammalian microsome tests for bacterial mutagenicity. Muatation Research 1987, 189, 83-91.

Para ilustrar la aplicacin de la prueba de Ames, se presenta a

continuacin los resultados obtenidos al evaluar al caf soluble (Nescaf) con

este procedimiento.

Tabla 4-4. Actividad mutagnica especfica (n.c./mg) del caf soluble

Incorporacin inmediata Preincubacin

Cepa Sin S9 Con S9 Sin S9 Con S9

TA 98 1.92 0.91 negativo 9.15 0.90 2.43 0.24 TA 100 5.02 0.70 negativo 28.11 2.85 6.66 0.94 TA 102 15.05 0.61 9.83 0.57 30.38 2.87 26.70 2.87 TA 104 negativo negativo 34.10 2.28 negativo YG 1024

negativo negativo 14.47 3.77 negativo

Duarte, M.P.; Laires, A.; Gaspar, J.; Le o, D.; Oliveira, J.S.; Rueff, J. Genotoxicity of instand cofee: possible involvement og phenolic compounds. Mutation Research 1999, 442, 43-51

Los resultados obtenidos con cepas de distintas sensibilidades a

compuestos genotxicos, sugieren que los componentes del caf soluble

lesionaron al ADN por mecanismos diferentes. En este estudio, el procedimiento

de preincubacin previa fue ms eficiente en detectar la actividad mutagnica

que el de incorporacin inmediata. En ambos casos, la adicin de la fraccin S9,

disminuy la actividad mutagnica del caf, lo que indica que los compuestos

responsables, al metabolizarse perdieron sus caractersticas genotxicas.

Prueba SOS en bacterias (Escherichia coli) (Chromotest)

http://www.ebpi-kits.com/SOS-ChromoTest.pdf

Figura 4-25. El ensayo de SOS chemotest

Pruebas de mutagenicidad con clulas eucariotas in vitro

Intercambio de cromtides hermanas (SCE)

Esta prueba ha sido utilizada para detectar rupturas cromosmicas

por xenobiticos



ClulaXenobitico

Fraccin S-9

.

lavar BrdU Colchicina

Replicaciones

No 1 No 2

ausencia de luz

Cromosomas en metafase

Preparacin de cortes

Teir

Observacin de

cromosomas

"arlequines" BrdU: bromodesoxiuridina

Figura 4-26. Pasos generales para la prueba de intercambio de cromtidas

Del cultivo celular de ovario de hamster (CHO) o pulmonares (V79)

se toman muestras que se incuban con el xenobitico en presencia y en

ausencia de alcuotas de la fraccin S-9 durante 2 h. En seguida, se lava

para remover el compuesto que no haya sido absorbido; las clulas son

transferidas a un medio que contiene 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU) y se

permite que ocurran dos replicaciones de ADN (24 o 30 Hr). Transcurrido el

tiempo, se adiciona colchicina para detener el proceso de reproduccin en la

etapa de metafase. Cortes son preparados y teidos con colorantes

fluorescentes, expuestos a la luz ultravioleta, y fijados con Giemsa. Los

daos causados por la exposicin al xenobitico (rupturas, fragmentaciones,

etc.) se vern reflejados en el intercambio de piezas entre cromosomas. Este

efecto se observar en el microscopio por la presencia de una variedad de

patrones luminosos y obscuros en los cromosomas, quienes reciben el

nombre de arlequines.

Pruebas de mutagenicidad con clulas eucariotas in vivo

Pruebas con Drosophila melanogaster

La mayor ventaja de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster)

como un organismo de prueba en estudios toxicolgicos se enlistan a

continuacin:

- Una especie eucariota de reproduccin sexual

- Paralelismo entre sus clulas germinales con las del ser humano

- Genticamente bien conocido

- Presenta tres cromosomas grandes

- Muchas mutaciones con efectos visibles son marcadores tiles

- Presenta cromosomas especiales combinados con marcadores y

rearreglos

- Tiempo de generacin corto y gran nmero de progenie

- Es capaz de metabolizar una gran cantidad de xenobiticos, lo que

resulta conveniente en la transformacin de promutgenos a

mutgenos.

Uno de los sistemas de prueba se basa en que los machos de una

especie tienen un gen ligado al cromosoma X, que le da un color amarillo a

su cuerpo. Los machos de 2 das de edad son expuestos al xenobitico a

probar, disuelto a diferentes concentraciones en agua con azcar. Los

machos sobrevivientes son apareados con hembras. Si no hay machos de

cuerpo amarillo en la progenie, se asume que ha ocurrido una mutacin letal.

Con cantidades menores a la concentracin letal, se podrn observar

algunos machos de cuerpo amarillo, cuyo nmero guardar una relacin



inversa con la concentracin de xenobitico a la que los progenitores han

sido expuestos.

Cuando se quiere monitorear un gran nmero de sustancias, para

evaluar los daos letales recesivos ligados al sexo (SLRL), la Drosophila

melanogaster es la mejor eleccin. En este ensayo se detectan efectos

letales asociados con mutaciones como microlesiones, deleciones, o

rearreglos cromosmicos. Los parmetros estudiados en clulas germinales

de las Drosophila son:

- Induccin de mutaciones relativas a citotoxicidad

- La proporcin de aberraciones cromosmicas para las mutaciones

letales recesivas

- El papel de los procesos de reparacin

- La influencia del tiempo de expresin en la formacin de

aberraciones cromosmicas

- La induccin de mutaciones relativas a uniones cuantitativas al ADN

Prueba de microncleos

Un microncleo (MN) se forma durante la transicin

metafase/anafase del proceso mittico. Surge de: a) un cromosoma entero o

b) de un pedazo del mismo. stos no se incorporan al ncleo de las clulas

hijas por carecer de un centrmero. El primer caso es ocasionado por una

sustancia aneugnica y el segundo, por una sustancia clastognica.

Figura 4-27. Microncleos ocasionados por a) dao aneugnico y por b) dao clastognico

Figura 4-28. Microncleo

Los microncleos se pueden presentar en cualquier tipo de clulas

de tejidos proliferativos (tejido heptico, eritrocitos en mdula sea,

linfocitos). Estas clulas, recolectadas de animales expuestos a xenobiticos,

pueden ser utilizadas para este ensayo. El ratn es la especie preferida para

inicial

Macho: cuerpo amarillo

(ligado al cromosoma X)

progenie

Macho: cuerpo amarillo

(ligado al cromosoma X)

Si no hay machos de

cuerpo amarillo, entonces

ha ocurrido una mutacin

Exposicin al xenobiotico



este tipo de estudios. Recientes reportes han sealado el uso de peces, los

cuales tienen eritrocitos nucleados, como especies disponibles para el

monitoreo de dao mutagnico por contaminantes de cuerpos de aguas. As

mismo, se han utilizado algunas especies vegetales como Tradescantia spp

y Vicia faba, para evaluar la actividad mutagnica de algunos contaminantes

y frmacos.

El ensayo permite la deteccin de:

- Clastgenos (sustancia que rompe los cromosomas)

- Aneugenos (sustancias que afectan el huso mittico)

- Apoptosis

- Retraso mittico

- Ruptura de cromosomas

- Prdida de cromosomas

- No disyuncin de cromosomas

Ventajas del ensayo de microncleos

- El ensayo de MN es una alternativa al test de aberraciones

cromosmicas convencional.

- Se analizan las alteraciones presentes en metafases mitticas

- Permite detectar aberraciones cromosmicas que responden a

alteraciones de tipo estructural (efecto clastognico) o alteraciones

numricas (efecto aneugnico) del agente en estudio.

El ensayo Cometa

Utilizado para evaluar el potencial genotxico de diversas sustancias

qumicas.

Figura 4-29. Representacin de ensayo cometa

Est basado en la migracin de fragmentos rotos de ADN durante

un proceso electrofortico, el cual es una tcnica sensible que detecta:

- Rompimiento de cadenas sencillas

- Sitios lcali-lbiles

- Sitios de reparacin por escisin de bases nitrogenadas

Las principales ventajas del ensayo cometa incluyen:

- La obtencin de datos genticos a nivel de clulas individuales, lo

que permite que el estudio estadstico sea robusto

- La necesidad de un pequeo nmero de clulas (



b) Se realiza un corrido electrofortico despus de lisar las clulas en el

microgel de agarosa.

c) Se colorea el ADN con Bromuro de etidio y se estima el dao mediante

la visualizacin de la fluorescencia del ADN que migra.

Figura 4-30. Referencia para las mediciones en el ensayo cometa

La cola del cometa representa la migracin del ADN. La longitud se

mide en micras desde el centro del ncleo hasta el ltimo punto de

fluorescencia.

Figura 4-31

Bibliografa

1. Klaassen, C. D., Casarett and Doulls Toxicology. The Basic Science of Poisons. Eighth ed.; 2013; p 1375-1390.

2. Hodgson, E., A Textbook of Modern Toxicology. John Wiley and Sons, Inc: U.S.A., 2010.

3 Stanton L. Gerson. MGMT: its role in cancer a etiology and cancer therapeutics

Nature Reviews Cancer (2004)4,296-307.

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Unidad 4 Mutagénesis