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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL
ECUADOR FACULTAD DE
ODONTOLOGÍA CARRERA DE
ODONTOLOGÍA
EFECTO ANTIBACTERIANO DEL EXTRACTO ACUOSO
DE Acmella repens BOTONCILLO SOBRE Streptococcus
mutans
Proyecto de investigación presentado como requisito previo a la
obtención del título de Odontóloga
Autora: Mejía Caguasango Amparo Viviana
Tutora: Dra. Anita del Carmen Armas Vargas Ph.D
Quito, Septiembre de 2017
ii
DERECHO DE AUTORA
Yo, Amparo Viviana Mejía Caguasango, en calidad de autora del trabajo de
Investigación: “EFECTO ANTIBACTERIANO DEL EXTRACTO
ACUOSO DE Acmella repens BOTONCILLO SOBRE Streptococcus
mutans”, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL
ECUADOR, hacer uso del contenido total o parcial que me pertenecen, con fines
estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autora me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en
los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y
su Reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a realizar la digitalización
y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación
Superior.
-------------------------------------------
Amparo Viviana Mejía Caguasango
C.C: 0401626411
iii
APROBACIÓN DE LA TUTORA DEL TRABAJO DE
TITULACIÓN
Yo, Dra. Ana del Carmen Armas Vargas Ph.D., en mi calidad de tutora del trabajo
de titulación, modalidad Proyecto de Investigación, elaborado por AMPARO
VIVIANA MEJÍA CAGUASANGO, cuyo título es: EFECTO
ANTIBACTERIANO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Acmella repens
BOTONCILLO SOBRE Streptococcus mutans, previo a la obtención del Grado
de Odontóloga: considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios
en el campo metodológico y epistemológico, para ser sometido a la evaluación por
parte del tribunal examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de
que el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación
determinado por la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito a los 5 días del mes de septiembre del año 2017.
-------------------------------------------------
Dra. Ana del Carmen Armas Ph.D.
DOCENTE-TUTORA
C.C: 1710508571
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El Tribunal constituido por: Dr. Luna Herrera Jaime Humberto, Dra. Freire
Andrade Alicia del Carmen. Luego de receptar la presentación oral del trabajo de
titulación previo a la obtención del título (o grado académico) de Odontóloga
presentado por la señorita Amparo Viviana Mejía Caguasango. Con el título
EFECTO ANTIBACTERIANO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Acmella
repens BOTONCILLO SOBRE Streptococcus mutans.
Emite el siguiente veredicto APROBADO
Fecha: 05 de Septiembre de 2017
Para constancia de lo actuado firman:
Presidente
Nombre y Apellido
Dr. Luna Herrera Jaime
Calificación
Firma
......................... Vocal 1 Dra. Freire Andrade
Alicia del Carmen
..........................
v
DEDICATORIA
La presente tesis le dedico con todo mi amor y cariño a Dios por su infinito amor,
ya que gracias a él he logrado culminar mi carrera.
A mis padres y hermanos por su apoyo y confianza en todo lo necesario para
cumplir mis objetivos como persona y estudiante; a mis amigos que de una u otra
manera me han llenado de sabiduría para terminar la tesis.
A todos en general por darme tiempo para realizarme profesionalmente.
Amparo Viviana Mejía Caguasango
vi
AGRADECIMIENTO
A la gloriosa, alma máter, “Universidad Central del Ecuador” y a mi querida
Facultad de Odontología, que me abrió sus puertas y me brindó la oportunidad para
formarme como profesional; a mis maestros quienes inculcaron en mí sus sabios
conocimientos académicos y el amor infinito a esta noble profesión.
A mi tutora, Dra. Anita Armas Ph.D, por su esfuerzo y dedicación, sus
conocimientos, su persistencia, su paciencia, su motivación fueron fundamentales
para mi formación como investigadora, quién a su manera fue capaz de ganarse mi
lealtad, admiración y eterna gratitud.
A la Dra. Rachide Acosta, especialista en Microbiología y Bacteriología del
Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de Química de la
U.C.E, al Dr. Darwin Roldán especialista Bioquímico-Farmacéutico del
Laboratorio del Departamento de Ofertas Servicios y Productos (OSP) de la
Facultad de Química de la U.C.E, por los conocimientos y guía que me brindaron
en la ejecución de la parte experimental de mi proyecto.
Finalmente agradezco a mi familia, amigos y compañeros por su amistad y apoyo
incondicional.
Amparo Viviana Mejía Caguasango
vii
ÍNDICE DE CONTENIDO
DERECHO DE AUTORA ................................................................................................................ ii
APROBACIÓN DE LA TUTORA DEL TRABAJO DE TITULACIÓN ....................................... iii
C.C: 1710508571 ............................................................................................................................. iii
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL ................................................... iv
DEDICATORIA ............................................................................................................................... v
AGRADECIMIENTO ...................................................................................................................... vi
ÍNDICE DE CONTENIDO ............................................................................................................. vii
ÍNDICE DE TABLAS ...................................................................................................................... x
ÍNDICE DE GRÁFICOS .................................................................................................................. x
ÍNDICE DE ILUSTRACIONES ....................................................................................................... x
ÍNDICE DE ANEXOS ..................................................................................................................... xi
RESUMEN ...................................................................................................................................... xii
ABSTRACT ................................................................................................................................... xiii
Introducción ...................................................................................................................................... 1
CAPÍTULO I ..................................................................................................................................... 2
1.1 Planteamiento del problema ..................................................................................................... 2
1.1.1 Formulación de la pregunta de investigación: .................................................................. 2
1.2 Justificación .............................................................................................................................. 3
1.3 Objetivos .................................................................................................................................. 4
1.3.1 Objetivo General .............................................................................................................. 4
1.3.2 Objetivos Específicos ....................................................................................................... 4
1.4 Hipótesis ................................................................................................................................... 5
1.4.1 Hipótesis de investigación [H1] ....................................................................................... 5
1.4.2 Hipótesis Nula ⦋H01] ....................................................................................................... 5
viii
CAPÍTULO II ................................................................................................................................... 6
MARCO TEÓRICO .......................................................................................................................... 6
2 CARIES DENTAL ........................................................................................................................ 6
2.1 Placa dental .............................................................................................................................. 6
2.2 Flora microbiana oral ............................................................................................................... 7
2.3 Microorganismos cariogénicos ................................................................................................. 7
2.4 Proceso evolutivo de la caries dental ........................................................................................ 8
2.5 Uso de antisépticos bucales en Odontología ............................................................................ 9
2.6 FITOTERAPIA ...................................................................................................................... 10
2.7 Extracto acuoso de Botoncillo ................................................................................................ 10
CAPÍTULO III ................................................................................................................................ 14
3 Materiales y Métodos ................................................................................................................... 14
3.1 Tipo de Diseño de la Investigación ........................................................................................ 14
3.2 Población de estudio ............................................................................................................... 14
3.3 Selección y tamaño de la muestra........................................................................................... 14
3.4 Formulación: .......................................................................................................................... 15
3.5 Criterios de inclusión y exclusión .......................................................................................... 17
3.6 Variables ................................................................................................................................. 18
3.7 Métodos de recolección de información ................................................................................ 19
3.8 Procedimiento ......................................................................................................................... 19
3.8.1 Obtención del extracto acuoso de (Acmella repens) Botoncillo .................................... 19
3.8.2 Cultivo de la cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175 ............................................. 21
3.9 Forma y análisis para obtención de resultados ...................................................................... 22
3.10 Aspectos bioéticos ................................................................................................................ 22
3.10.1 Autonomía .................................................................................................................... 22
ix
3.10.2 Riesgo potencial del estudio ......................................................................................... 22
3.10.3 Beneficios potenciales de estudio ................................................................................. 23
3.10.4 Idoneidad ética y experiencia del investigador ............................................................. 23
3.10.5 Declaración de conflicto de intereses ........................................................................... 24
3.11 Resultados y productos esperados ........................................................................................ 24
CAPÍTULO IV ................................................................................................................................ 25
4. ANALISIS E INTERPRETACION DE RESULTADOS ........................................................... 25
4.1 Medición de los halos ............................................................................................................. 25
4.2 Recolección de datos .............................................................................................................. 27
CAPÍTULO V ................................................................................................................................. 31
5. DISCUCIÓN ............................................................................................................................... 31
CAPITULO VI ................................................................................................................................ 33
CONCLUSIONES .......................................................................................................................... 33
RECOMENDACIONES ................................................................................................................. 34
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................ 35
Bibliografía ..................................................................................................................................... 35
ANEXOS ........................................................................................................................................ 42
x
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Cálculo de las concentraciones a emplear en el estudio .......................... 20
Tabla 2 Halo de inhibición (mm) por grupo de estudio ......................................... 26
Tabla 3 gl: Resultados del test de normalidad ....................................................... 27
Tabla 4 Estadísticos descriptivos para el halo de inhibición.................................. 28
Tabla 5 Prueba pareada. ......................................................................................... 30
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Selección y tamaño de la muestra ........................................................ 15
Gráfico 2: Colocación y distribución de discos blanco en cada una de las cajas
Petri ..................................................................................................... 16
Gráfico 3: Extracto acuoso de Botoncillo obtenido mediante percolación química.
............................................................................................................. 20
Gráfico 4: Siembra y medición de los halos de inhibición bacteriana .................. 21
Gráfico 5: Nivel de inhibición de los extractos de Botoncillo y las sustancias de
control.................................................................................................. 25
ÍNDICE DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1 Diagrama de caja y bigotes para el halo de inhibición por grupo ..... 28
Ilustración 2 Media del halo de inhibición por grupo ............................................ 29
xi
ÍNDICE DE ANEXOS
1 Certificado laboratorio microbiologics Medibac-INC S.A, con el registro de la
cepa bacteriana de Streptococcus mutans ATCC 25175........................................ 42
2 Ficha de lectura de inhibición bacteriana, del extracto acuoso de Botoncillo
(Acmella repens) sobre la cepa de Streptococcus mutans, test de difusión en
agar sangre de cordero. .......................................................................................... 43
3 Protocolo de manejo de desechos infecciosos del laboratorio de Análisis Clínico
y Bacteriológico de la Facultad de Ciencias Químicas de la U.C.E. ..................... 44
4 Certificado de realización de pruebas diagnósticas bacteriológicas en el
laboratorio de análisis Clínico y Bacteriológico de la Facultad de Ciencias Químicas
de la U.C.E. ............................................................................................................ 45
5 Autorización para el manejo de desechos infecciosos en el Laboratorio de Análisis
clínico y bacteriológico de la Facultad de Ciencias Químicas de la U.C.E ........... 46
6 Carta de idoneidad ética y experiencia de la autora. ........................................... 47
7 Carta de idoneidad ética y experiencia de la tutora............................................. 48
8 Declaración de conflicto de intereses de la autora. ............................................. 49
9 Declaración de conflicto de intereses de la tutora. .............................................. 50
10 Declaración de la autora de no tener ningún tipo de relación con la empresa
MEDIBAC-INC S.A. ............................................................................................. 51
11 Declaración de la tutora de no tener ningún tipo de relación con la empresa
MEDIBAC-INC S.A. ............................................................................................. 52
12 Declaración de experiencia de la tutora. ........................................................... 53
xii
Tema: “Efecto antibacteriano del extracto acuoso de Acmella repens Botoncillo
sobre Streptococcus mutans”
Autora: Amparo Viviana Mejía Caguasango
Tutora: Dra. Anita del Carmen Armas Vargas Ph.D.
RESUMEN
El objetivo de este estudio fue determinar el efecto antibacteriano del extracto
acuoso de Acmella repens (Botoncillo), en diferentes concentraciones sobre la cepa
de Streptococcus mutans. Se planteó así un estudio de tipo experimental; donde los
extractos de Botoncillo obtenidos mediante el método de percolación química, en
concentraciones al 15%, 25%, 50%, fueron comparadas con Clorhexidina al 0.12%
y suero fisiológico, realizándose 15 repeticiones para cada extracto. Para la
evaluación antibacteriana de los extractos se utilizó una cepa estandarizada del
Streptococcus mutans ATCC 25175, empleándose un técnica de difusión en agar
sangre, en la cual discos blanco estériles se embebieron e n 20µL de cada
sustancia, incubándose a 35°C por 120 horas, tras lo cual se procedió a la medición
de los halos. Los resultados obtenidos fueron analizados con las pruebas estadísticas
de normalidad mediante el test de Kolmogorov - Smirnov con corrección de
Lilliefors, con las pruebas de Shapiro – Wilk y Kruskal-Wallis, cuyo valor de
significación fue p < 0,001, confirmando que existió un leve poder de inhibición
del extracto acuoso de Botoncillo al 25%, observándose un mayor poder de
inhibición para el extracto al 50%, pero no alcanzó los valores conseguidos por la
Clorhexidina al 0,12%. En conclusión podemos decir que el extracto acuoso de
Botoncillo presentó un efecto antibacteriano sobre S. mutans interesante pero
menor que la sustancia empleada como control.
Palabras claves: Efecto antibacteriano, Streptococcus mutans, extracto acuoso,
Acmella repens.
xiii
TITLE: “Antibacterial effect of the aqueous extract of Acmella Repens
Botoncillo over Streptococcus mutans”
Author: Amparo Viviana Mejía Caguasango
Tutora: Dra. Anita del Carmen Armas Vargas Ph.D
ABSTRACT
The objective of this study was to determine the antibacterial effect of the aqueous
extract of Acmella repens (Botoncillo), in different concentrations, over the
Streptococcus mutans strain. Thus, an experimental study was undertaken, where
the extracts of Botoncillo obtained through a chemical percolation method, in
concentrations of 15%, 25%, 50%, were compared with 0.12% Chlorhexidine and
physiological saline solution. The process was repeated 15 times for each extract.
For the antibacterial evaluation of the extracts, a standard Streptococcus mutans
ATCC 25175, strain was used, employing blood agar diffusion tests, where white
sterile discs were embedded in each substance and incubated to 35ºC during 120
hours. Later, the halos were measured. The results obtained were analyzed with the
statistic tests of normality through a Kolmogorov- Smirnov test with Lilliefors
correction, with Shapiro-Wilk and Kruskal Wallis tests, whose value of significance
was p< 0,001. This confirmed the existence of a mild inhibition power in the 25%
aqueous extract of Botoncillo, observing a higher power of inhibition for the 50%
extract, but yet not reaching the values obtained with 0.12% Chlorhexidine. In
conclusion, it can be stated that the aqueous extract of Botoncillo presented an
interesting antibacterial effect on S. mutans, but was lower than the substance
employed as control.
Key words: Antibacterial effect, Streptococcus mutans, aqueous extract, Acmella
repens
1
Introducción
La historia del hombre está estrechamente ligada con el reino vegetal, antes
de emplear el fuego y domesticar a los animales, su subsistencia dependía
en gran parte de la miel, las hierbas, los frutos y los jugos que se extraía de
las plantas, algunos de ellos empleados para combatir enfermedades del hombre
y de sus animales, desde tiempos inmemoriales, los hombres trataron de
combatir a las enfermedades como mejor sabían o podían; la naturaleza
fue sin duda su primer médico y la farmacia inicial a la que él recurrió, el
hombre dotado de inteligencia constató que las plantas tenían un poder curativo y
numerosas culturas fueron dejado testimonio de ello (1). Uno de sus usos ha sido
sobre la caries dental, su utilización se fortalece ya que cada vez aparecen nuevos
y novedosos principios activos. (2)
La caries es una enfermedad ampliamente extendida en el mundo, considerada la
enfermedad más frecuente del hombre moderno, dentro de los factores principales
que influyen en su prevalencia se encuentra la presencia de microorganismos y entre
ellos estreptococos del grupo mutans (3). Observándose un importante papel
predominante en su proceso, especialmente en las fases iniciales del desarrollo de
la caries. (4)
En la Sierra Norte ecuatoriana, específicamente en las provincias de Carchi e
Imbabura existen reportes de empleo de Botoncillo, principalmente en comunidades
indígenas, es así que con la finalidad de recuperar el conocimiento ancestral sobre
el uso de plantas medicinales, se pretende mediante un estudio in vitro, evaluar el
efecto antibacteriano que poseen las sustancias activas del extracto acuoso de
Acmella repens (Botoncillo) sobre cepas de Streptococcus mutans.
2
CAPÍTULO I
1.1 Planteamiento del problema
La Odontología a más de ser una disciplina científica, es una disciplina práctica
relacionada con la comprensión de las interacciones entre los seres humanos y los
elementos de la naturaleza entre ella las plantas de uso medicinal, la profesión
aplica teorías, principios y métodos de diseño para optimizar el bienestar humano
y todo el desempeño del sistema de salud bucodental. La caries dental es uno de
los problemas de salud oral más comunes en el mundo, que afectan indistintamente
al individuo sin límite de edad, muchas propiedades de plantas medicinales de
forma ancestral se han convertido en un medio natural para controlar, prevenir y
frenar la enfermedad.
El Acmella repens conocido como Botoncillo a nivel de comunidades indígenas de
Carchi e Imbabura constituye una planta empleada en el control de lesiones
cariosas, de ahí que se pretende establecer su relación respecto al efecto inhibitorio
frente al Streptococcus mutans, como principal causante de la caries dental, a
través de ensayos microbiológicos que determinen la efectividad antibacteriana de
la planta en estudio.
1.1.1 Formulación de la pregunta de investigación:
¿Cuál es el efecto antibacteriano del extracto acuoso de Acmella repens
(Botoncillo), empleado en concentraciones de 15%, 25% y 50% sobre la cepa de
Streptococcus mutans?
3
1.2 Justificación
Las plantas medicinales poseen efectos fisiológicos múltiples relacionados a sus
principios activos, éstos conciernen a compuestos químicos propios de las plantas,
de ahí el interés por parte de los investigadores en estudiar los métodos y las
sustancias naturales que posean propiedades antibacterianas contra
microorganismos cariogénicos.
El Streptococcus mutans ha sido identificado como el principal agente patógeno
de la caries y es por esto que se han desarrollado numerosas investigaciones
destinadas al estudio de sustancias fitoquímicas que impidan que el agente
etiológico de la caries dental prolifere en el ecosistema bucal o controlen su
proliferación.
La mayor parte de los trabajos científicos sobre plantas medicinales se han
desarrollado en Asia, Europa y Norteamérica, los países que poseen el número de
trabajos de investigación en plantas medicinales más alto son India, Estados
Unidos, Japón y Brasil, a nivel de los países suramericanos, Brasil presenta la
mayor cantidad de registros, Colombia, aparece con 17 artículos sobre este tema,
en el último lugar se encuentra Ecuador, con 7 publicaciones sobre plantas
medicinales registradas (5). Debido a la biodiversidad botánica existente en nuestro
país, muchas plantas medicinales han sido empleadas con éxito de forma
tradicional por comunidades indígenas.
Esto nos llevó a plantearnos la necesidad de ejecutar ensayos microbiológicos, que
comprueben la actividad antibacteriana de extractos naturales de Acmella repens
(Botoncillo), como alternativa natural y segura en la inhibición de Streptococcus
mutans.
4
1.3 Objetivos
1.3.1 Objetivo General
Determinar el efecto antibacteriano del extracto acuoso de Acmella repens
(Botoncillo) en concentraciones del 15%, 25% y 50% sobre el Streptococcus
mutans ATCC 25175, mediante conteo de halos de inhibición.
1.3.2 Objetivos Específicos
i. Establecer las características fitoquímicas del extracto
acuoso de Botoncillo elaborado a base un proceso de percolación
química.
ii. Evaluar los halos de inhibición para el extracto acuoso,
obtenido de Acmella repens (Botoncillo) frente a Streptococcus mutans
ATCC 25175, en cada una de las diferentes concentraciones.
iii. Comparar con cuál de las tres concentraciones al 15%, 25%
y 50%, se obtiene el mejor efecto antibacteriano del extracto acuoso de
Acmella repens (Botoncillo).
5
1.4 Hipótesis
1.4.1 Hipótesis de investigación [H1]
El extracto acuoso de Acmella repens (Botoncillo), independiente de la
concentración evaluada tiene un efecto evidentemente inhibitorio en el
crecimiento de colonias de Streptococcus mutans ATCC 25175.
1.4.2 Hipótesis Nula ⦋H01]
El extracto acuoso de Acmella repens (Botoncillo), independiente de la
concentración evaluada no tiene ningún efecto inhibitorio en el crecimiento de
colonias de Streptococcus mutans ATCC 25175.
6
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2 CARIES DENTAL
La caries es considerada como una enfermedad infecciosa de origen microbiano,
localizado en los tejidos duros (6), que se inicia como una desmineralización del
esmalte resultante de ácidos orgánicos producidas por bacterias orales específicas
que metabolizan a los carbohidratos de la dieta (7), al ser una enfermedad
multifactorial en la que interaccionan diferentes factores dependientes del huésped,
la dieta, la placa dental y el tiempo su tratamiento requiere de una interacción
integral (8). La alta prevalencia de la enfermedad es de 80-90% de la población
mundial (9), esto lleva a pensar en la necesidad de identificar los indicadores de
riesgo implicados en el desarrollo de la enfermedad. (10)
2.1 Placa dental
La gran cantidad de bacterias presentes en boca constituyen una comunidad
microbiológica desencadenante de la patogénesis de la caries y enfermedad
periodontal así como de otros órganos del cuerpo (11), métodos moleculares
recientes han revelado que casi todas las enfermedades dentales son causadas por
biofilm dental asociado a comunidades microbianas multiespecíficas (12),
estructuradas tridimensionalmente y embebidas en una matriz de exopolisacáridos
que se unen a superficies sólidas como el esmalte de los dientes, la superficie de la
raíz o implantes dentales dentro de un tiempo determinado. (13)
El Streptococcus mutans es el microorganismo predominantemente encontrado en
la placa dental asociada a una lesión de caries, por lo tanto, la prevención de la
caries dental debe ser dirigida a la reducción de S. mutans (14), el proceso se inicia
7
desde cambios dentro de la placa dental supragingival que desencadena en la
formación de una biopelícula compleja formada en la superficie del diente, por la
agregación de un grupo de bacterias de una manera bien organizada (9), considerada
necesaria para que el proceso carioso se desarrolle. (15)
2.2 Flora microbiana oral
El microbioma humano oral se compone de cientos de microorganismos que
colonizan una variedad de superficies, muchas de las superficies dentales crecen
como un biofilm conocido como placa dental que consta de al menos 800 especies
bacterianas (16). Todas las superficies en la cavidad bucal están cubiertas por una
película de las glicoproteínas de la saliva, en donde existen microorganismos son
capaces de adherirse a esta capa y forma un consorcio organizado de bacterias, virus
y hongos. (17)
La microflora oral es un complejo ecosistema que contiene una amplia variedad de
especies microbianas, que es colonizada por varios microorganismos antes de la
erupción de los dientes, sin embargo los recién nacidos son esencialmente libre de
microorganismos, con la erupción de los dientes la placa dental se desarrolla en
superficies dentales expuestas, de no tomarse medidas de higiene oral, las
superficies de los dientes acumulan grandes masas microbianas, mientras que la
descamación de células epiteliales no permiten la acumulación en las superficies de
la mucosa oral. (18)
2.3 Microorganismos cariogénicos
Dentro de los factores principales que influyen en la prevalencia de la caries dental
los microorganismos como estreptococos del grupo mutans, pueden ser aislados a
partir de placa dental supra y subgingival y en saliva (3). Constituyéndose son los
8
principales colonizadores de las superficies orales y el 70% de las bacterias
cultivables existentes en la placa dental humana. (19)
El género Streptococcus es un grupo formado por diversos cocos grampositivos que
normalmente se disponen en parejas o cadenas, forma el grupo de anaerobios
facultativos que crecen únicamente en una atmósfera enriquecida con dióxido de
carbono, sus exigencias nutricionales son complejas y su aislamiento requiere el
uso de medios enriquecidos con sangre o suero, son capaces de fermentar
carbohidratos, proceso que produce ácido láctico, y son catalasa negativos. (20)
El S. mutans, considerado como el más cariogénico de la microflora oral, coloniza
las superficies del diente y produce cantidades significativas de extra y
polisacáridos intracelulares siendo el responsable de la etapa inicial de formación
de biopelículas orales y lesiones cariosas, los agentes quimioterapéuticos pueden
utilizarse como coadyuvante en la reducción del recuento de S. mutans. (14), siendo
la superficie dental un hábitat natural indispensable para Streptococcus mutans. (18)
Los Streptococcus mutans se recuperan casi exclusivamente de superficies duras, y
superficies no diseminadas de la boca, como dientes o prótesis, y que pueden actuar
como patógenos oportunistas, siendo aislados de casos de endocarditis contagiosa,
los Streptococcus mutans son regularmente aislados de la placa dental en los sitios
cariados, pero su prevalencia es baja en esmalte sano, pudiendo crecer a u n a
temperatura de 36+/- 1 grados centígrados y ser cultivados en agar Mueller Hilton
adicionado sangre de cordero o en medios enriquecidos con NaCl 6,5 %, o medio
selectivo Mitis salivarius. (21)
2.4 Proceso evolutivo de la caries dental
La caries dental, ha sido definida como un proceso patológico y dinámico, que se
inicia desde los niveles subclínicos hasta los macroscópicos en esmalte y dentina,
por lo que afecta los tejidos duros del diente (22), los factores de riesgo están
asociados con una mala higiene bucal e hipofunción de las glándulas salivales (23).
9
Las manchas blancas son las precursoras de la caries, están producidas por ácidos
segregados por bacterias que atacan el esmalte y producen una desmineralización
en la superficie (24), observándose cristales de esmalte no están organizados y
pocos iones de calcio y fosfato (23). Criterios clínicos para clasificar una caries
dentaria constituyen la clave para efectuar un tratamiento adecuado, uno de los
puntos determinantes constituye el análisis de las superficies limpias y húmedas
(25), sin embargo nuevas tendencias mencionan el análisis de la superficie seca
como método adecuado de diagnóstico. (26)
2.5 Uso de antisépticos bucales en Odontología
La experiencia clínica, muestra la eficacia que los métodos de higiene bucal en el
control de la caries por medio del cepillado como medio mecánico de remoción o
con el empleo de colutorios como método químico de control de la placa y
prevención de enfermedades orales (27). La Clorhexidina desde su descubrimiento
en los años cincuenta y especialmente desde su comercialización en los años
ochenta, constituye el principal antiséptico empleado en el control químico del
biofilm oral, por su naturaleza catiónica altamente reactiva tiene un efecto
bactericida en altas concentraciones y bacteriostático en bajas (28), al ser activa
contra bacterias Gram positivas, Gram negativas, anaerobias facultativas, aerobias
y en menor medida contra hongos y levaduras. (29)
El enjuague bucal constituye uno de los sistemas de administración seguro, eficaz
como agente antimicrobiano y antiplaca, capaz de inhibir la adhesión bacteriana, la
colonización y la actividad metabólica que en última instancia afecta el crecimiento
bacteriano, entre los agentes terapéuticos utilizados en enjuagues bucales, la
Clorhexidina es el "patrón oro" o control positivo para la comparación con otras
sustancias debido a su eficacia probada (30), estos demuestran utilidad en el
tratamiento de la infección oral o tópica. (31)
10
2.6 FITOTERAPIA
Se define a la Fitoterapia como la ciencia que se encarga del estudio de la utilización
de los productos de origen vegetal con una finalidad terapéutica (32), limitando el
uso de productos vegetales a la administración por vía oral o tópica (33). La cavidad
oral, puerta de entrada al resto del cuerpo tanto de manera metafórica como
anatómica, puede verse afectada por sus propias enfermedades los individuos aún
recurren a las plantas medicinales para aliviar diferentes dolencias. (34)
Los principios activos son sustancias que se encuentran en las distintas partes u
órganos de las plantas medicinales y que alteran o modifican el funcionamiento de
órganos y sistemas del cuerpo humano o animal, la investigación científica ha
permitido descubrir una variada gama de principios activos, de los cuales los más
importantes desde el punto de vista de la salud son los aceites esenciales, los
alcaloides, los glucósidos o heterócidos, los mucílagos, gomas y los taninos. (35)
La OMS define a las plantas medicinales como cualquier especie vegetal que
contiene sustancias que pueden ser empleadas para propósitos terapéuticos (36),
cuyos principios activos pueden servir de precursores para la síntesis de nuevos
fármacos, muchos de los remedios tradicionales son fabricados a partir de
poblaciones silvestres cuyo contenido químico puede variar debido a razones
ambientales (37), o de la tradición según su uso medicinal (38). Las plantas gracias
a su maravilloso y complejo metabolismo, constituyen un verdadero arsenal
químico del cual sólo se conoce con éxito un tercio, considerando la variedad de
especies existentes a nivel mundial y aquellas inexploradas hasta la actualidad. (39)
2.7 Extracto acuoso de Botoncillo
Un extracto acuoso es una preparación líquida obtenida de la planta que en forma
concentrada que posee características de la misma, siendo el volumen líquido
del extracto igual al volumen de la planta usada (40), su obtención se produce
11
mediante la extracción de una parte de una materia prima, frecuentemente usando
como solvente agua destilada, con la técnica la percolación química se logra la
extracción de los componentes activos de la planta los mismos que se encuentran
en solución y /o suspensión en el producto final. (41)
El método oficial de extracción mediante percolación química, descrito en la
Farmacopea Americana, se realiza en recipientes (percoladores) cilíndricos o
cónicos que poseen dispositivos de carga y descarga, lográndose una extracción
total de los principios activos (prácticamente se obtiene hasta el 95% de sustancias
extraíbles); siendo necesario previo a la extracción humectar la droga con el
disolvente, permitiendo su esponjamiento con el fin de facilitar la entrada del
menstruo en las membranas celulares durante la percolación. (42)
La creciente demanda de medicamentos a base de hierbas y su aceptación en el
mercado internacional está estrechamente relacionado a su potente potencial
farmacológico, el Acmella repens encontrada en los países tropicales y
subtropicales, principalmente la India y América del Sur popularmente se conoce
como planta de “dolor de muelas” ya que reduce el dolor asociado con los dolores
dentales y puede inducir la secreción de la saliva, varios extractos y metabolitos
activos de diversas partes de esta planta poseen actividades farmacológicas útiles
(43). Recientemente empleada por pobladores nativos de zonas rurales para el
tratamiento de la malaria, heridas infectadas, parásitos de la sangre, ampollas de
la boca y tratamientos de enfermedades respiratorias. (44)
El Botoncillo es una planta suberecta o decumbente que mide hasta 50 cm de altura,
tallitos con entrenudos entre 1 a 4 cm de largo de color verde, hojas con peciolos
subsésiles de ovaladas a óvalo-lanceoladas, basas obtusas o redondas, margen
entero o corto dentado, acuminado o agudas en el ápice; de color verde obscuro con
flores de color amarillo que se asemejan a un botón de hojas, flores y ramas picantes
al masticar, que adormecen las mucosas de la boca y los labios, lo cual se debe al
alcohol aromático spilantol, la spilantina y otras sustancias similares. (45)
12
Dentro de los usos etnomedicinales del Botoncillo, las hojas y las flores es
empleado para limpiar, blanquear y endurecer los dientes, para mantener sanas las
encías, se usa como analgésico estomacal, al masticar las hojas sirven para prevenir
la gingivitis, periodontitis y caries, la infusión prolongada es empleada para
combatir o curar la diabetes, cuando es machacada y cocida sirve para curar
enfermedades del hígado y manchas de la piel (45), beneficios asociados a su
composición química confirmándose que la planta tiene principios activos
importantes dentro del campo de la medicina como alcaloides (spilanthol), glúcidos
o heterócidos, taninos, terpenoides, derivado de fenol (thymol), sesquiterpenos
(germacrene) y otros flavonoides. (44)
Los alcaloides constituyen una gran familia de más de 15.000 metabolitos
secundarios son solubles en agua, contienen al menos un átomo de nitrógeno en la
molécula y exhiben actividad biológica, a dosis altas resultan muy tóxicos, sin
embargo, a dosis bajas tienen un alto valor terapéutico como relajante muscular,
tranquilizante, antitusivos y analgésicos (46). De ahí que el Botoncillo es utilizado
en las poblaciones aborígenes como anestésico local. (47). Los flavonoides son
compuestos fenólicos constituyentes de la parte no energética de la dieta humana,
se encuentran en vegetales, semillas, frutas y en bebidas como vino y cerveza,
existen más de 5.000 flavonoides diferentes (48), encontrados en las hojas de las
plantas, que presentan acción antitrombótica, analgésica, antimicrobiana, además
de proteger la mucosa gástrica y el hígado. (49)
Los glúcidos son muy variables en cuanto a su composición, destacándose la
glucosa, la arabinosa, la xilosa y el ácido galacturónico, su acción
farmacológica se efectúa sobre los tejidos y las mucosas, revistiéndolos de una
capa protectora eficaz frente a agentes irritantes tanto químicos como mecánicos,
con gran capacidad para retener grandes cantidades de agua, actúa como laxante
mecánico, por otro lado los Taninos son sustancias de origen vegetal carentes de
nitrógeno en su molécula y solubles parcialmente en agua y en alcohol, cuya
propiedad farmacológica se traduce en un efecto astringente, antiinflamatorio y
hemostático, los taninos están ampliamente repartidos entre las plantas, y
13
parece ser que juegan un papel disuasorio para insectos y herbívoros, ya que
dotan de sabor desagradable a las partes de la planta que los contienen, también
son muy frecuentes en los frutos inmaduros, siendo los responsables del sabor
astringente y desagradable de estos. (50)
Los terpenos o terpenoides, constituyen el grupo más numeroso de metabolitos
secundarios de gran importancia para el crecimiento y supervivencia de las
plantas, el grupo de los terpenos incluye hormonas, pigmentos carotenoides
(carotenos y xantofilas), esteroles, látex y aceites esenciales (proporcionan el olor
y el sabor característico de las plantas), siendo comercialmente interesantes por
su uso como aromas y fragancias en alimentación y cosmética, o por su
importancia en la calidad de productos agrícolas, otros compuestos terpenoides
tienen importancia medicinal por sus propiedades anticarcinogénicas,
antiulcerosas, antimalariales, antimicrobianas, etc. (46). Los esteroides
constituyen una de las principales familias del mundo biomolecular, presentes en
animales, plantas y hongos, algunos de ellos tienen función hormonal otros actúan
como agentes antivirales, frente a virus que infectan a hombres y animales. (51)
14
CAPÍTULO III
3 Materiales y Métodos
3.1 Tipo de Diseño de la Investigación
Se diseñó un estudio de tipo experimental in vitro: Para evaluar el efecto inhibitorio
antibacteriano, del extracto acuoso de Acmella repens (Botoncillo) sobre la cepa
de Streptococcus mutans ATCC 25175, misma que se manipuló en el laboratorio
las variables para el presente estudio.
3.2 Población de estudio
La población de estudio fue de 15 cajas Petri inoculadas de Streptococcus mutans
ATCC 25175, identificadas previamente por laboratorios Microbiologics e
importadas por Medibac-Inc S.A. Quito- Ecuador (Anexo 1).
3.3 Selección y tamaño de la muestra
La selección y tamaño de la muestra fue de quince unidades (cajas Petri),
inoculadas con cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175, deduciéndose
que se efectuaron repeticiones para el extracto acuoso de Acmella repens
(Botoncillo), con las diferentes concentraciones, es así que se establecieron 45
diluciones, entendiéndose que se efectuaron 15 diluciones por cada concentración
al 15 %, 25 % y 50% respectivamente, empleando como control positivo
Clorhexidina al 0.12% y suero fisiológico como control negativo; tal como se
muestra en el gráfico 1.
15
Gráfico 1: Selección y tamaño de la muestra
Fuente: Autora
3.4 Formulación:
Dónde:
n = tamaño de la muestra
Z: valores correspondientes al riesgo deseado
S2: varianza de la variable cuantitativa (grupo de control observado)
s = 1.75
d: valor mínimo de la diferencia que se deseó detectar
d = 2.3
n = 15,0 datos de cada muestra (15 cajas Petri)
Ejemplo de cómo se fueron colocando las muestras en cada caja Petri. Se ubicaron
discos embebidos en el extracto acuoso de Acmella repens (Botoncillo) en
16
concentraciones al 15%, 25% y 50%, más dos sustancias de control positivo
(Clorhexidina al 0.12) y otra negativo (Suero fisiológico), tal como se muestra en
el gráfico 2.
Gráfico 2: Colocación y distribución de discos blanco en cada una de las cajas Petri
Fuente: Autora
17
3.5 Criterios de inclusión y exclusión
Criterios de Inclusión
Hojas y flores de la planta de Acmella repens (Botoncillo) que se
encuentren en buen estado natural y libre de impurezas.
Extracto acuoso de Acmella repens (Botoncillo) al 15%, 25 %, 50% de
concentración.
Cajas Petri con agar sangre de cordero inoculadas con Streptococcus
mutans ATCC 25175 y almacenadas bajo refrigeración.
Cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175 estandarizadas.
Criterios de Exclusión
Cantidad inadecuada de hojas y flores de Botoncillo (menos de 100 g) para
aislar el extracto acuoso.
Tiempo transcurrido desde la obtención del extracto acuoso de Acmella
repens (Botoncillo), supere 60 días hasta su uso.
Extracto acuoso de Botoncillo almacenado en condiciones ambientales
inadecuadas y sin refrigeración.
Cajas Petri con agar sangre de cordero inoculadas con Streptococcus
mutans ATCC 25175, que estén expuestas a contaminación.
18
3.6 Variables
VARIABLES CONCEPTO DETERMINANTES INDICADORES ESCALA
DEPENDIENTE
Efecto inhibitorio
Las plantas, por su
biodiversidad y
riqueza en
metabolitos
secundarios,
proporcionan una
interesante fuente de
posibles sustancias
activas contra
muchas bacterias.
Por esto, en los
últimos años se ha
ido desarrollando un
creciente interés en
varios centros de
investigación de todo
el mundo en
búsqueda de efectos
antibacterianos de
extractos de
múltiples especies
vegetales.
(52).
Cepas de:
Streptococcus
mutans
Temperatura:
Tiempo:
Microscopio
digital
Calibrador
Numérica
(mm)
INDEPENDIENTE
Extracto químico de
Botoncillo
Son mezclas
complejas de
metabolitos
secundarios, aislados
de las plantas por
diversos métodos
como la destilación
por arrastre de vapor,
por expresión de los
frutos o por medio de
soxtlet. Los
principales
componentes
químicos de estas
mezclas son: mono y
sesquiterpenos
incluyendo
carbohidratos,
alcoholes, éter,
aldehídos y cetonas,
los cuales son
responsables de las
fragancias y de las
propiedades
biológicas de las
plantas aromáticas y
medicinales (53).
Acmella repens
(Botoncillo)
Temperatura:
Tiempo:
Procesos de
Percolación
Ordinal
(concentraciones)
1: 15%
2: 25%
3: 50%
19
3.7 Métodos de recolección de información
El presente estudio de investigación se llevó a cabo en las instalaciones de la
Universidad Central del Ecuador con el apoyo del Laboratorio del Departamento
de Ofertas Servicios y Productos (OSP) de la Facultad de Química de la U.C.E,
para la obtención del extracto acuoso de Botoncillo; así como también se contó
con el apoyo del Laboratorio de Análisis Clínico y Bacteriológico, situado en la
misma facultad para la activación de la cepa de Streptococcus mutans ATCC
25175, mismos que fueron sometidos a experimentación; donde se ejecutó la fase
de experimentación científica. (Anexo 2).
3.8 Procedimiento
Los procedimientos para el presente estudio le hemos dividido en dos etapas una
química y otra microbiológica, siguiendo un estricto protocolo de bioseguridad para
el manejo de desechos infecciosos, establecido en dicha institución (Anexo 3),
misma que contó con la colaboración de especialistas en laboratorios clínico
microbiológico, bacteriológico, bioquímico y farmacéutico para la realización de
este trabajo de investigación científica, los cuales trabajan para el Laboratorio del
Departamento de Ofertas Servicios y Productos (OSP) de la Facultad de Química
de la U.C.E contando con el apoyo de Laboratorio de Análisis Clínico y
Bacteriológico, situado en la misma facultad y siguiendo las normas de calidad
establecidas, (Anexo 4), seguido de la ejecución bioestadística de un especialista
en el tema. Las etapas de este proceso se describen a continuación:
3.8.1 Obtención del extracto acuoso de (Acmella repens) Botoncillo
Se recolectó 100 gramos de hojas y flores de Botoncillo. Las plantas debían
encontrarse en excelente estado, frescas, limpias, libres de contaminación, mismas
que fueron enviadas y refrigeradas en recipientes adecuados, en el departamento
de Ofertas Servicios y Productos (OSP) de la Facultad de Química de la
20
Universidad Central del Ecuador para la obtención del extracto acuoso de Acmella
repens, a concentraciones de 15%, 25% y 50%, mediante procesos de percolación
química, como se observa en el gráfico 3, manipulando adecuadamente los desechos
que se generaron en dicha actividad (Anexo 5).
Gráfico 3: Extracto acuoso de Botoncillo obtenido mediante percolación química.
Fuente: Autora
Para calcular el porcentaje en cada concentración se empleó la siguiente fórmula:
Fórmula
V%=
V%=
V%=
V%=
V1=Extracto químico
V2= Agua destilada
= 50% = 25% = 15%
Tabla 1 Cálculo de las concentraciones a emplear en el estudio
Fuente: Dr. Darwin Roldán Q.F
V1 (soluto en ml) x 100 (constante)
V2 (solución en ml)
V1 (50 ml) x 100
V2 (100 ml)V1 (25 ml) x 100
V2 (100 ml)
V1 (15 ml) x 100
V2 (100 ml)
21
3.8.2 Cultivo de la cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175
Se procedió de manera uniforme a sembrar las cepas bacterianas de Streptococcus
mutans ATCC 25175, en las placas con agar sangre de cordero mediante la
utilización de un hisopo estéril, a través de la técnica de diseminación, luego se
ubicaron los discos embebidos de los extractos acuosos en los discos blanco
estériles a 1,5 cm del borde en las placas de agar sangre de cordero y a una distancia
no menor de 15 mm entre sí, con diferentes concentraciones (15%, 25% y 50%),
como sustancia control positivo empleamos Clorhexidina al 0.12% y suero
fisiológico como control negativo, frente a la cepa de Streptococcus mutans ATCC
25175, dentro de una cámara de flujo laminar e inmediatamente fueron colocadas
las placas en una jarra hermética de anaerobiosis, para ser incubadas durante 5 días
a 35°. Transcurrido este tiempo, utilizamos una regla milimetrada, la cual se
empleó para medir los halos de inhibición bacteriana, llevando fichas con las
lecturas y registros de inhibición durante 5 días, para determinar su nivel de
sensibilidad de acuerdo al método de Kirby Bauer tal como se exhibe en el gráfico
4.
Gráfico 4: Siembra y medición de los halos de inhibición bacteriana
Fuente: Autora
22
Los residuos infecciosos que se generaron durante la fase experimental se
sometieron a un proceso de esterilización y almacenamiento en el cuarto de depósito
final de desechos de la Facultad de Química de la U.C.E, hasta su recolección por
el personal de la Empresa Pública Metropolitana Integral de Residuos Sólidos
“EMGIRS-EP”.
3.9 Forma y análisis para obtención de resultados
Para el análisis y obtención de resultados, utilizamos hojas electrónicas de Excel
para la realización de cuadros y gráficos estadísticos, y con la ayuda del paquete
SPSS 23 se realizaron las pruebas estadísticas de normalidad mediante el test de
Kolmogorov - Smirnov con corrección de Lilliefors y con la prueba de Shapiro -
Wilk (n< 20), se contó con el apoyo de la prueba no paramétrica en escala ordinal
Kruskall Wallis.
3.10 Aspectos bioéticos
3.10.1 Autonomía
El presente estudio de investigación se realizó en el Laboratorio de Análisis Clínico
y Bacteriológico, de la Facultad de Química de la Universidad Central del Ecuador
con ambientes adecuados, donde no existió compromiso con seres vivos,
únicamente con cepas biológicas de Streptococcus mutans ATCC 25175, las cuales
crecieron en un ambiente de anaerobiosis estricta y fueron manipulados con
materiales e instrumental de laboratorio adecuados, por lo cual no fue necesario
establecer un consentimiento informado. El estudio experimental estuvo dirigido
por la Dra. Rachide Acosta y Dr. Darwin Roldán.
3.10.2 Riesgo potencial del estudio
El estudio fue de tipo experimental in vitro, siguiendo estrictas normas de
bioseguridad para el manejo de desechos infecciosos producidos durante la fase
23
experimental, no obstante el anteproyecto que cumplió con todos los aspectos éticos
se presentó al comité de investigación de la Facultad de Odontología de la U.C.E
para su aprobación, mismo que cumplió con todas las normas bioéticas tanto
nacionales como internacionales.
3.10.3 Beneficios potenciales de estudio
Directo: Con la investigación experimental in vitro, mediante la utilización del
extracto acuoso de Acmella repens (Botoncillo), como recurso terapéutico alterno
en Odontología convencional, logramos demostrar los efectos de esta planta
medicinal, como un remedio totalmente casero, de origen natural que puede brindar
muchos beneficios y propiedades medicinales en los organismos tanto de animales
como humanos, de esta manera podremos aliviar síntomas pasajeros o para tratar
enfermedades importantes. Dentro del campo de la Odontología se podrían tratar
alteraciones bucodentales como gingivitis, aftas y en la prevención de la caries
dental, en un futuro no muy lejano poder elaborar productos de uso odontológico
como enjuagues bucales, colutorios, pastas dentales, geles, barnices en base de
principios activos presentes en Acmella repens (Botoncillo), de esta manera el
profesional odontólogo podrá evaluar la efectividad de estos productos en la
prevención de caries dental.
Indirecto: Los pacientes también serán beneficiados con el uso de ciertos
productos odontológicos y a la vez en las industrias de nuestro país podrían elaborar
productos odontológicos de buena calidad, por ejemplo se conseguiría añadir a las
pastas dentales sustancias de origen natural como es Acmella repens, el cual podrá
sustituir a algunos productos que tienen efectos colaterales adversos tales como
pigmentación de dientes y restauraciones, alteración en el sentido del gusto, ciertas
reacciones alérgicas.
3.10.4 Idoneidad ética y experiencia del investigador
24
Este trabajo de investigación fue ejecutado por mi persona en calidad de autora
(Anexo 6) y como tutora a la Dra. Anita Armas Ph.D (Anexo 7).
3.10.5 Declaración de conflicto de intereses
Al efectuar esta investigación no se obtuvo ningún tipo de beneficio personal ni
económico, para mi persona como autora (Anexo 8), ni a la tutora de esta
investigación (Anexo 9) por lo cual se anexó la carta de declaración de conflicto de
interés, como también no existió ningún vínculo comercial, laboral o económico de
mi persona como autora (Anexo 10), ni de la tutora de este proyecto de
investigación con la empresa Medibac-Inc S.A. Quito-Ecuador (Anexo 11).
3.11 Resultados y productos esperados
Se obtuvo información que nos propició conocer con claridad y profundidad los
últimos estudios realizados con plantas medicinales, técnicas microbiológicas y
fitoquímicas que nos puedan posibilitar en un futuro no muy lejano elaborar un
agente antibacteriano que se pueda incorporar en pastas dentales, pastas tópicas,
enjuagues bucales, colutorios, hilos interdentales, etc, para el tratamiento y
prevención de diferentes alteraciones bucodentales tales como caries, gingivitis,
aftas y procesos inflamatorios.
25
CAPÍTULO IV
4. ANALISIS E INTERPRETACION DE RESULTADOS
4.1 Medición de los halos
Al cabo de 5 días, se registraron los datos de los halos de forma manual, en fichas
de lectura, mediante la ayuda de una regla milimetrada, se midieron los halos
formados alrededor del disco, siendo esta zona directamente proporcional a las
concentraciones del extracto acuoso de Botoncillo. Para el análisis y obtención de
resultados, se utilizó hojas electrónicas de Excel para la elaboración de cuadros y
gráficos estadísticos y con la ayuda del paquete SPSS 23. Los datos obtenidos de
la medición de los halos de inhibición se ejemplifican en el gráfico 5 y se han
organizado en la tabla 1.
Fuente: Autora
Extracto al
25%
Extracto al
50%
Extracto al
15%
Suero
Fisiológico
Clorhexidina
0.12%
Gráfico 5: Nivel de inhibición de los extractos de
Botoncillo y las sustancias de control.
26
Es importante señalar que los valores fueron medidos incluyendo el diámetro
estándar del disco (6mm), por lo que en el caso del suero fisiológico empleado como
control negativo no observó halo y solo se registró el diámetro del disco, al igual
que lo ocurrió con el extracto acuoso de Botoncillo al 15%.
EXTRACTO DE Acmella
repens (BOTONCILLO)
N
15%
25%
50%
CLORHEXIDINA
0,12%
SUERO
FISIOLOGICO
1 6 7 14 14 6
2 6 6 10 10 6
3 6 6 14 10 6
4 6 7 12 14 6
5 6 6 11 11 6
6 6 6 9 12 6
7 6 8 8 14 6
8 6 6 10 12 6
9 6 6 12 14 6
10 6 6 9 12 6
11 6 6 14 11 6
12 6 6 7 12 6
13 6 8 8 14 6
14 6 6 9 14 6
15 6 6 14 12 6
Tabla 2 Halo de inhibición (mm) por grupo de estudio
Fuente: Autora
27
4.2 Recolección de datos
Los valores referidos al halo de inhibición se sometieron a la prueba de normalidad
mediante el test de Kolmogorov - Smirnov con corrección de Lilliefors y con la
prueba de Shapiro - Wilk (n< 20).
Observándose claramente dos de los grupos (suero fisiológico y extracto al 15%)
presentaron una distribución constante, por lo que fueron excluidos del análisis.
La prueba de Normalidad, reveló que la mayoría de valores de significación son
inferiores a 0,05 (95% de confiabilidad), por lo que se infiere que las muestras NO
provienen de poblaciones con distribución Normal, por lo que para las
comparaciones de los valores medios del halo formado por los grupos
experimentales se utilizaron pruebas no paramétricas tal como se muestra en la tabla
2.
Pruebas de normalidad
Kolmogorov-Smirnovb
Shapiro-Wilk
Estadístico Gl Sig. Estadístico Gl Sig.
EXTRACTO 25% 0,440 15 0,000 0,596 15 0,000
EXTRACTO 50% 0,174 15 0,200 0,899 15 0,092
CLORHEXIDINA
0,12%
0,257 15 0,009 0,837 15 0,011
Tabla 3 gl: Resultados del test de normalidad
Fuente: Ing. Juan Carlos Túquerres
A partir de la información obtenida se procedió a estimar los estadísticos
descriptivos del halo formado como indicador del efecto inhibitorio tal como se
muestra en la tabla 3.
28
Tabla 4 Estadísticos descriptivos para el halo de inhibición
Fuente: Ing. Juan Carlos Túquerres
Observando que los grupos de extracto al 15% y el control negativo no presentan
halo sobre los 6mm, en el caso del extracto de botoncillo al 25% hay un solo dato
extremo, además para el extracto al 50% y para la Clorhexidina se advierten
desviaciones estándar importantes, es decir existió una importante variabilidad de
los valores medidos tal como se observa en la ilustración 1.
Ilustración 1 Diagrama de caja y bigotes para el halo de inhibición por grupo
Fuente: Ing. Juan Carlos Túquerres
GRUPO N Media Desviación
estándar
Mínimo Máximo
EXTRACTO DE BOTONCILLO
(Acmella repens) 15%
15 6,00 0,000 6 6
EXTRACTO DE BOTONCILLO
(Acmella repens) 25%
15 6,40 0,737 6 8
EXTRACTO DE BOTONCILLO
(Acmella repens) 50%
15 10,73 2,463 7 14
CLORHEXIDINA 0,12% 15 12,40 1,502 10 14
SUERO FISIOLÓGICO 15 6,00 0,000 6 6
Total 75 8,31 3,027 6 14
29
Por lo que se realizó la gráfica de las medias, en la que se observó que el extracto
de Botoncillo al 15% igual que el suero fisiológico no desarrolló inhibición, en tanto
que se determinó que existe una leve capacidad de inhibición del extracto de
Botoncillo al 25% con un halo medio de 6,4 mm. Al 50% se observa una mayor
inhibición con una media de 10,7 mm, la Clorhexidina 0,12% (control positivo) está
muy por encima de los otros grupos, con una media de 12, 4 mm, tal como se
demuestra en la ilustración 2.
Ilustración 2 Media del halo de inhibición por grupo
Fuente: Ing. Juan Carlos Túquerres.
La prueba de Kruskal-Wallis, reveló un valor de significancia de p <0,001 que al
ser menor que 0,05 (95% de confiabilidad) permitió inferir que si existieron
diferencias respecto a la tendencia central de las poblaciones. Por lo cual se decidió
realizar pruebas dos a dos.
Con lo que se determinó que son diferentes entre las sustancias con significación
menor a 0,05: como es el caso del halo formado por el grupo al 25% con extracto
de Botoncillo (Acmella repens) y el del 50%, así como con el de la Clorhexidina,
en tanto que el extracto de Botoncillo al 50% no presentó diferencia significativa
con la Clorhexidina al 0,12%, tal como se exhibe en la tabla 4.
6,06,4
10,7
12,4
6,0
EXTRACTO DE
BOTONCILLO
15%
EXTRACTO DE
BOTONCILLO
25%
EXTRACTO DE
BOTONCILLO
50%
CLORHEXIDINA
0,12%
SUERO
FISIOLÓGICO
30
Sustancia (I)
Diferencia
de medias
Error
estándar Sig.
Extracto
de
Botoncillo
al 25%
Extracto de
Botoncillo al
50%
-4,33333* ,48626 ,000
Clorhexidina
0,12% -6,00000* ,48626 ,000
Extracto
de
Botoncillo
al 50%
Clorhexidina
0,12% -1,66667* ,48626 ,088
Tabla 5 Prueba pareada.
Fuente: Ing. Juan Carlos Túquerres
31
CAPÍTULO V
5. DISCUCIÓN
La Fitoterapia busca a través del empleo de diferentes plantas medicinales,
encontrar alternativas para aquellas enfermedades que frecuentemente afectan al
ser humano, este es el caso específico de nuestro estudio donde se empleó el
Acmella repens (Botoncillo), esta planta comúnmente empleada por comunidades
indígenas del Norte la serranía ecuatoriana, específicamente de las provincias del
Carchi e Imbabura “contra el dolor de muelas” decidimos evaluar su poder
inhibitorio frente al Streptococcus mutans, considerando a este como el principal
causante de lesiones cariosas, entendemos que la remoción de placa es el método
adecuado para el control de la caries sin embargo la literatura refiere el empleo de
métodos químicos (54), así basándonos en esta premisa consideramos que el
empleo de sustancias de tipo enjuague bucal elaborados a base de este elemento
como el Botoncillo podrían mejorar y efectivizar el control de esta patología.
Los resultados de este estudio permitieron determinar que el extracto acuoso de
Botoncillo al 50% de concentración, posee actividad antibacteriana sobre la cepa
de Streptococcus mutans y empleado como control positivo Clorhexidina al 0.12%.
Estudios previos refieren que existieron diferencias significativas entre el extracto
etanólico de Botoncillo al 100% y Clorhexidina al 0,12% sobre la cepa de
Porphyromona gingivalis. (55)
En nuestro estudio el extracto acuoso de Botoncillo al 15%, no produjo inhibición
bacteriana, mientras que el extracto al 25% de concentración produjo una leve
inhibición bacteriana para la cepa de Streptococcus mutans, mientras que para el
50% de concentración del extracto acuoso, presentó inhibición bacteriana cercano
a los niveles alcanzados con la Clorhexidina al 0.12 %, que difiere a los resultados
32
antes reportados donde emplearon el extracto etanólico de Botoncillo al 50% en el
que se presentó una leve inhibición, registrándose una mayor inhibición al 100%
de concentración sobre la cepa de Porphyromona gingivalis.
La acción antibacteriana del Botoncillo a nivel de patógenos comunes, como
Escherichia coli, Klebsiella pnumoniae, Proteus vulgaris, fue evidenciada en
otros estudios (44), existiendo buenos resultados, a pesar de ser estos
microorganismos Gram negativos y anaerobios facultativos. Estudios realizados
en la India donde emplearon como medicación intraconducto, concentraciones
de 2%, 5% y 10% de Botoncillo con éter de petróleo como solvente, mostraron
mejor actividad antibacteriana frente a Enterococcus faecalis comparada con
Hidróxido de Calcio (CaOH)2. (56)
La finalidad de este trabajo de investigación fue encontrar principios activos que
representen nuevas alternativas frente a microorganismos desencadenantes de
enfermedades frecuentes a nivel bucal y rescatar el conocimiento ancestral del
habitante nativo sobre el uso de Botoncillo, si bien no fue posible encontrar
literatura al respecto de esta planta, logramos rectificar el conocimiento que tienen
los ciudadanos de zonas rurales sobre el uso de Botoncillo empleado para aliviar
“el dolor dental”, demostrando así que la planta como tal posee una acción
beneficiaria que nuestros indígenas conocían pero que aún falta ser probada
científicamente, la idea en un futuro cercano será emplear sustancias encontradas
en el extracto acuoso de Botoncillo, como enjuagues bucales que al ser
aprovechadas como coadyuvantes químicos en el proceso de salud bucal y así
plantearnos mantener dientes y tejidos bucales sanos.
33
CAPITULO VI
CONCLUSIONES
De los resultados obtenidos en la presente investigación concluimos:
1. Que no existió inhibición bacteriana del extracto acuoso de Botoncillo al
15% sobre Streptococcus mutans.
2. Se registró un leve poder de inhibición del extracto acuoso al 25%, el
extracto de Botoncillo al 50%, mostró un mayor poder de inhibición entre
las concentraciones pareadas con un p< 0,001.
3. El poder inhibitorio del extracto acuoso de Botoncillo al 15 % y el suero
fisiológico son similares, en tanto el extracto de Botoncillo al 50% presentó
un nivel de inhibición bacteriana similar a la Clorhexidina al 0.12%.
4. Los principios activos aislados en Acmella repens (Botoncillo), contienen
compuestos químicos que pueden servir de precursores para la síntesis de
nuevos fármacos.
34
RECOMENDACIONES
Con la metodología empleada en el estudio podemos recomendar:
1. Efectuar estudios posteriores empleando el extracto acuoso de Botoncillo,
sobre otras bacterias orales y/o periodontales.
2. Probar diferentes y nuevas concentraciones del extracto acuoso de
Botoncillo sobre Streptococcus mutans.
3. Se recomienda que el uso del extracto acuoso de Botoncillo al 50 % se utilice
de manera similar a la Clorhexidina al 0.12%.
4. Considerar el empleo de sustancias activas presentes en el Botoncillo para
elaborar productos de uso odontológico de tipo enjuague bucal, mismos
que contribuirán en la prevención de la caries dental.
35
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42
ANEXOS
1 CERTIFICADO LABORATORIO MICROBIOLOGICS MEDIBAC-INC S.A,
CON EL REGISTRO DE LA CEPA BACTERIANA DE Streptococcus mutans
ATCC 25175.
43
Extracto acuoso de Botoncillo
ORD Extracto al
15%
Extracto al
25%
Extracto al
50%
CLORHEXIDINA
0,12%
SUERO
FISIOLOGICO
1 6 7 14 14 6
2 6 6 10 10 6
3 6 6 14 10 6
4 6 7 12 14 6
5 6 6 11 11 6
6 6 6 9 12 6
7 6 8 8 14 6
8 6 6 10 12 6
9 6 6 12 14 6
10 6 6 9 12 6
11 6 6 14 11 6
12 6 6 7 12 6
13 6 8 8 14 6
14 6 6 9 14 6
15 6 6 14 12 6
2 FICHA DE LECTURA DE INHIBICIÓN BACTERIANA, DEL
EXTRACTO ACUOSO DE BOTONCILLO (ACMELLA REPENS) SOBRE
LA CEPA DE Streptococcus mutans, TEST DE DIFUSIÓN EN AGAR
SANGRE DE CORDERO.
44
3 PROTOCOLO DE MANEJO DE DESECHOS INFECCIOSOS DEL
LABORATORIO DE ANÁLISIS CLÍNICO Y BACTERIOLÓGICO DE LA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS DE LA U.C.E.
45
4 CERTIFICADO DE REALIZACIÓN DE PRUEBAS DIAGNÓSTICAS
BACTERIOLÓGICAS EN EL LABORATORIO DE ANÁLISIS CLÍNICO Y
BACTERIOLÓGICO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS DE LA
U.C.E.
46
5 AUTORIZACIÓN PARA EL MANEJO DE DESECHOS INFECCIOSOS EN
EL LABORATORIO DE ANÁLISIS CLÍNICO Y BACTERIOLÓGICO DE LA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS DE LA U.C.E
47
6 CARTA DE IDONEIDAD ÉTICA Y EXPERIENCIA DE LA AUTORA.
48
7 CARTA DE IDONEIDAD ÉTICA Y EXPERIENCIA DE LA TUTORA.
49
8 DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES DE LA AUTORA.
50
9 DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES DE LA TUTORA.
51
10 DECLARACIÓN DE LA AUTORA DE NO TENER NINGÚN TIPO DE
RELACIÓN CON LA EMPRESA MEDIBAC-INC S.A.
52
11 DECLARACIÓN DE LA TUTORA DE NO TENER NINGÚN TIPO DE
RELACIÓN CON LA EMPRESA MEDIBAC-INC S.A.
53
12 DECLARACIÓN DE EXPERIENCIA DE LA TUTORA.
54
55
56
57
