UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE …€¦ · hexetidina frente a la prevotella melaninogenica. Estudio in Vitro”. Proyecto de investigación presentado como requisito

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

CARRERA DE ODONTOLOGÍA

“Efecto inhibitorio del arrayán (myrtus communis) en infusión y la

hexetidina frente a la prevotella melaninogenica. Estudio in Vitro”.

Proyecto de investigación presentado como requisito previo a la obtención del

título de Odontólogo

Autor: Christian Alejandro Díaz Pilaluisa

Tutora: Dra. Marina Antonia Dona Vidale

Quito, mayo 2019

ii

DERECHOS DE AUTOR

Yo, Christian Alejandro Díaz Pilaluisa en calidad de autor y titular de los derechos

morales y patrimoniales del trabajo “Efecto inhibitorio del arrayán

(myrtus communis) en infusión y la hexetidina frente a la prevotella

melaninogenica. Estudio in Vitro”, modalidad Proyecto de Investigación,

de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA

SOCIAL, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad

Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso

no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor

todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la

digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de

conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación

Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su

forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la

responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y

liberando a la Universidad de toda responsabilidad.

Firma: _________________________________________

Christian Alejandro Díaz Pilaluisa

CC 1719530808

Dirección electrónica:

iii

APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN

Yo, Marina Antonia Dona Vidale, en mi calidad de tutora del trabajo de titulación,

modalidad Proyecto de Investigación, elaborado por Christian Alejandro Díaz

Pilaluisa, cuyo título es: EFECTO INHIBITORIO DEL ARRAYAN

(MYRTUSCOMMUNIS) EN INFUSIÓN Y LA HEXETIDINA FRENTE A LA

PREVOTELLA MELANINOGENICA. ESTUDIO IN VITRO, de conformidad

con el Art. 144 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS

CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, previo a la obtención del

Grado de Odontólogo: considero que el mismo reúne los requisitos y méritos

necesarios en el campo metodológico y epistemológico, para ser sometido a la

evaluación por parte del tribunal examinador que se designe, por lo que lo

APRUEBO, a fin de que el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de

titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador.

En la ciudad de Quito, a los 15 del mes de marzo de 2019.

iv

APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL

El Tribunal constituido por: Dra. Mariela Balseca, Dr. Jorge Muñoz. Luego de

receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la obtención del título

de Odontólogo presentado por el señor Christian Alejandro Díaz Pilaluisa,

Con el título:

“Efecto inhibitorio del arrayán (myrtus communis) en infusión y la


Emite el siguiente veredicto:

Fecha:2019/05/31

Para constancia de lo actuado firman:

Nombre y Apellido Calificación Firma

Presidente Dra. Mariela Balseca __________________________________

Vocal 1 Dr. Jorge Muñoz __________________________________

v

DEDICATORIA

La presente investigación va dedicada a mis padres, Fernando y Lourdes, quienes

nunca perdieron las esperanzas y me dieron toda su confianza.

Para mi familia, pero en especial a mis abuelos, ya que fueron como mis segundos

padres y su cariño siempre estuvo presente. (+)

Para mi hermano Edison y su familia quienes me apoyaron todo este transcurso, en

la elaboración de la presente investigación.

A mis profesores quienes durante mi vida universitaria supieron brindarme su

conocimiento, siendo de gran ayuda en mi desarrollo profesional.

vi

AGRADECIMIENTOS

A Dios, a mis padres a mi familia y amigos por siempre estar cuando los necesite.

A la Universidad Central del Ecuador por haberme acogido en sus aulas y

desarrollar actitudes y aptitudes que me ayudaran en el desempeño profesional.

A la Dra. Marina Dona por su interés y dedicación a cada uno de sus alumnos, y

mas aún en la tutoría de la presente investigación.

A todas las personas que a lo largo de la carrera universitaria hicieron lo posible

por que no llegue este día, ya que lo único que lograron es darme fuerzas y asi poder

continuar.

vii

ÍNDICE DE CONTENIDOS

DERECHOS DE AUTOR ...................................................................................... ii

APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN ................... iii

APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL ......................... iv

DEDICATORIA ..................................................................................................... v

AGRADECIMIENTOS ......................................................................................... vi

ÍNDICE DE CONTENIDOS ................................................................................ vii

LISTA DE TABLAS .............................................................................................. x

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ xi

LISTA DE GRÁFICOS ........................................................................................ xii

LISTA DE ANEXOS ........................................................................................... xiii

RESUMEN ........................................................................................................... xiv

ABSTRACT .......................................................................................................... xv

INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1

CAPÍTULO I ........................................................................................................... 3

1. MARCO TEÓRICO ........................................................................................ 3

1.1. Prevotella melaninogenica........................................................................ 3

1.1.1. Definición .......................................................................................... 3

1.1.2. Estructura Prevotella melaninogenica ............................................... 3

1.1.3. Factores de virulencia ....................................................................... 4

1.2. Fisioterapia ............................................................................................... 4

1.3. Myrtus communis (Arrayán) .................................................................... 5

1.3.1. Descripción ....................................................................................... 5

1.3.2. Taxonomía......................................................................................... 6

viii

1.3.3. Composición química ....................................................................... 6

1.3.4. Propiedades medicinales ................................................................... 7

1.3.5. Aplicación del Myrtus communis en odontología ............................. 7

1.4. Antisépticos bucales ................................................................................. 8

1.4.1. Definición .......................................................................................... 8

1.4.2. Propiedades específicas del antiséptico ............................................ 9

1.4.3. Tipos de antisépticos ....................................................................... 10

1.4.3.1. Hexetidina ................................................................................ 10

CAPÍTULO II ....................................................................................................... 11

2. EL PROBLEMA ........................................................................................... 11

2.1. Planteamiento del problema ................................................................... 11

2.2. Formulación del problema ...................................................................... 12

2.3. Objetivos ................................................................................................ 12

2.3.1. Objetivo general .............................................................................. 12

2.3.2. Objetivos específicos ...................................................................... 12

2.4. Hipótesis ................................................................................................. 12

2.5. Conceptualización de variables .............................................................. 13

2.5.1. Variables independientes ................................................................ 13

2.5.2. Variables dependientes.................................................................... 14

2.6. Justificación ............................................................................................ 14

CAPÍTULO III ...................................................................................................... 16

3. METODOLOGÍA ......................................................................................... 16

3.1. Tipo de investigación ............................................................................. 16

3.2. Población de estudio y muestra .............................................................. 16

3.3. Criterios de inclusión y exclusión .......................................................... 17

3.4. Operacionalización de las variables ....................................................... 18

ix

3.5. Estandarización ...................................................................................... 19

3.6. Manejo y recolección de datos ............................................................... 20

3.7. Análisis estadístico ................................................................................. 32

3.8. Aspectos bioéticos .................................................................................. 32

CAPÍTULO IV ...................................................................................................... 34

4. ANÁLISIS DE RESULTADOS ................................................................... 34

4.1. Resultados .............................................................................................. 34

4.1.1. Información descriptiva .................................................................. 35

4.1.2. Estudio estadístico ........................................................................... 36

4.1.2.1. Prueba Wilcoxon para muestras relacionadas ......................... 39

4.1.2.2. Prueba Mann Whitney para muestras independientes ............. 40

4.2. Discusión ................................................................................................ 42

CAPÍTULO V ....................................................................................................... 46

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................ 46

5.1. Conclusiones .......................................................................................... 46

5.2. Recomendaciones ................................................................................... 47

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 48

ANEXOS .............................................................................................................. 52

x

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación taxonómica de Myrtus communis ....................................... 6

Tabla 2. Resultados de la infusión de arrayán, hexetidina y suero fisiológico ..... 34

Tabla 3. Resultados descriptivos ........................................................................... 35

Tabla 4Prueba de normalidad................................................................................ 36

Tabla 5Datos comparativos de la Prueba Krusk Wallis ........................................ 38

Tabla 6. Comparación de la infusión de 48 a 72 horas (Prueba de Wilcoxon) ..... 39

Tabla 7. Comparación infusión de arrayán al 50% de 48 y 72 horas con Hexetidina

al 0,12% (Prueba de Mannn Whitney) .................................................................. 40

Tabla 8. Comparación de la infusión de arrayán 50%-100% y hexetedina 0,12%de

48 y 72 horas con suero fisiológico....................................................................... 41

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Materiales utilizados ............................................................................... 19

Figura 2: Obtenciones de concentraciones de Planta de arrayan (myrtus communis)

50% y 100% a) Planta de arrayan b) material triturado, c) Maceracion por 24 horas,

d) Obtencion de concentraciones a travez de filtros ............................................. 21

Figura 3: Obtención de Prevotella Melaninogénica ATCC ®25845 .................... 22

Figura 4 : a) Activación de la cepa de Prevotella Melaninogénica ATCC ®25845,

caja petri con medio de cultivo agar sangre, b) Medio de cultivo liquido TBS, c)

Apertura de cepa de Prevotella Melaninogénica ATCC ®25845, d ) y e) Toma de

Prevotella por medio de isopo para su siembra, f) Siembra en caja petri. ............ 24

Figura 5: a) siembra en medio sólido y líquido, b) Colocacion en jarra de

anaerobios (Gaspack), c) colocación en medio aislado d) temperatura ambiente 25

Figura 6: Rotulación de las 20 cajas petri ............................................................. 26

Figura 7: Siembra de bacteria Prevotella melaninogenica .................................... 26

Figura 8: Fórmula Mac Farland ............................................................................ 27

Figura 9: Materiales a usar en procedimiento experimental ................................. 28

Figura 10: Separación de discos estériles con pinzas para colocar en cajas petri. 28

Figura 11. Discos impregnados:1) Infusión de arrayán 50%, 2) Infusión de arrayán

al 100%, 3) Hexetidina, 4) Suero fisiológico. ..................................................... 29

Figura 12. Incubación de bacteria Prevotella melaninogenica en jarra de anaerobios

y puesto a incubación. ........................................................................................... 30

Figura 13. Halos de inhibición a las 48 horas ....................................................... 31

Figura 14. Medición halos de inhibición a las 72 horas ........................................ 31

xii

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Medias de halo de inhibición ............................................................... 35

Gráfico 2: Efecto de los halos de inhibición ......................................................... 36

Gráfico 3: Prueba Krusk Wallis ............................................................................ 37

Gráfico 4: Comparación infusión de arrayán al 50% de 48 y 72 horas con Hexetidina

al 0,12% (Prueba de Mannn Whitney) .................................................................. 40

xiii

LISTA DE ANEXOS

Anexo A Solicitud de permisos para realizar la investigación ............................. 52

Anexo B Certificado autenticidad cepas de Prevotellamelaninogenica ............... 53

Anexo C Hoja de recolección de datos ................................................................. 54

Anexo D Declaración de confidencialidad ........................................................... 55

Anexo E Normas Generales de Bioseguridad de la Facultad de Odontología de la

Universidad Central de Ecuador ........................................................................... 56

Anexo F Protocolo de manejo de los desechos infecciosos .................................. 58

Anexo G Certificado de idoneidad ética y experticia del estudio del investigador

............................................................................................................................... 59

Anexo H Certificado de idoneidad ética y experticia del estudio del tutor .......... 60

Anexo I Certificado de conflicto de intereses del investigador ............................ 61

Anexo J Certificado de conflicto de intereses del tutor ........................................ 62

xiv

Tema: “Efecto inhibitorio del arrayán (myrtus communis) en infusión y la


Autor: Christian Alejandro Díaz Pilaluisa

Tutora: Dra. Marina Antonia Dona Vidale

RESUMEN

Las enfermedades periodontales son consecuencia del crecimiento sin control de la población de microorganismos alojados en la cavidad bucal, los cuales conforman el biofilm bucal. Entre la gran cantidad de microorganismos que lo componen se encuentra la Prevotella melaninogenica, bacteria causante de la gingivitis, periodontitis, infecciones de los conductos radiculares, abscesos de origen dentario y responsable de la halitosis. Objetivo: Establecer el efecto inhibitorio in vitro de la infusión del arrayán (Myrtus communis) en diferentes concentraciones y hexetidina sobre cepas de Prevotella melaninogenica. Metodología: Estudio de tipo experimental, in vitro, transversal y comparativo aplicado a una población de 20 caja Petri con cepas Prevotella melaninogénica a los cuales se les agregarán discos impregnados con infusión de arrayan (Myrtus communis) a concentraciones del 50% y 100%, así como de hexetidina como control positivo y suero fisiológico como control negativo, llevadas a incubación en campana de anaerobios a una temperatura de 37ºC por 48 horas. Para determinar el efecto antimicrobiano, se medirá con una regla milimetrada el halo que se formó alrededor del disco, utilizando la escala de referencias de la clasificación establecida por Duraffourd, finalmente los datos obtenidos se registrarán en una hoja de recolección de datos, utilizando el programa SPSS, verificando si los datos provienen de una población normal, para lo cual se realizará una prueba de Shapiro Will (<50 muestras), de proceder de datos normales se realizará una prueba ANOVA y Tukey, en caso de ser resultados de población de no normalidad se efectuará un test de Kruskall Wallis o Man Whitney con un nivel de confianza del 95% y 5% de error. Resultados:

Responder los objetivos planteados, esperando identificar que concentración de arrayán (Myrtus communis) es más efectiva como inhibidor del microorganismo Prevotella melaninogénica, además de compararlos entre sí y con la hexetidina como agente químico antimicrobiano.

Palabras claves: EFECTO INHIBITORIO / INFUSIÓN DE ARRAYÁN

(MYRTUS COMMUNIS) / HEXETIDINA /PREVOTELLA MELANINOGENICA

xv

Topic: “Inhibitory effect of arrayan (myrtus communis) in infusion and hexetidine

in front of the prevotella melaninogenica. In vitro studio”

Author: Christian Alejandro Diaz Pilaluisa

Tutor: Dra. Marina Antonia Dona Vidale

ABSTRACT

Periodontal diseases are the result of uncontrolled growth of the population of microorganisms housed in the oral cavity, which make up the buccal biofilm. Among the large number of microorganisms that compose it is the melaningenic

prevotella, bacterium that causes gingivitis, periodontitis, infections of the root canals, abscesses of dental origin and responsible for halitosis. Objective: To establish the inhibitory effect in vitro of the infusion of myrtle (Myrtus communis) in different concentrations and hexetidine on strains of melanothogenic prevotella. Methodology: Experimental, in vitro, cross-sectional and comparative study applied to a population of 20 box preti with melanotonogenic prevotella strains to which disks impregnated with arrayan infusion (Myrtus communis) at concentrations of 50% and 100% will be added, as well as hexetidine as a positive control and physiological saline as a negative control, taken to incubation in an anaerobic hood at a temperature of 37ºC for 48 hours. To determine the antimicrobial effect, the halo that formed around the disk will be measured with a millimeter rule, using the reference scale of the classification established by Duraffourd, finally the data obtained will be recorded in a data collection sheet, using the program SPSS, verifying if the data come from a normal population, for which a test of Shapiro Will will be carried out (<50 samples), of proceeding from normal data, an ANOVA and Tukey test will be performed, in case of results of non-population. Normally a Kruskall Wallis or Man Whitney test will be performed with a confidence level of 95% and 5% error. Expected results: Responding to the proposed objectives, hoping to identify which concentration of myrtle (Myrtus

communis) is more effective as an inhibitor of the melanothogenic prevotella microorganism, in addition to comparing them with each other and with hexetidine as an antimicrobial chemical agent.

Key Words: INHIBITORY EFFECT / MYRTLE ARRAY INFUSION

(MYRTUSCOMMUNIS) / HEXETIDINE / MELANINOGENIC PREVOTELLA

1

INTRODUCCIÓN

Entre la gran cantidad de microorganismos que componen el biofilm se encuentra

la Prevotella melaninogenica, la cual es una de las bacterias causantes de la

gingivitis, periodontitis, infecciones de los conductos radiculares, abscesos de

origen dentario y responsable de la halitosis, que por lo general son consecuencia

del crecimiento descontrolado de la población de microorganismos alojados en la

cavidad bucal(1).

La Prevotella melaninogenica es una bacteria perteneciente al género Prevotella,

parte de la familia Bacteroidaceae, caracterizada por ser un microorganismo

bacteriano con forma de bacilos anaerobios estrictos, inmóviles y no esporulados,

productores de pigmento negro o marrón, característica que sirve para clasificarlos

como pigmentadas o no pigmentadas. En el caso de la Prevotella melaninogenica

residente en la cavidad bucal es considerado un microorganismo patógeno del

periodonto(2).

Para eliminar o disminuir este tipo de bacterias patógenas es fundamental el

tratamiento periodontal, aplicando métodos mecánicos y químicos como requisito

para el control de la infección y la mejora clínica, tales como la hexetidina, que es

una sustancia a la que se le atribuyen propiedades antisépticas, así como la de

acelerar la cicatrización post-cirugía periodontal con acción inhibitoria limitada de

la placa(3).

No obstante, estos tratamientos no eliminan todas las bacterias periodonto-

patógenas, por lo que han surgido alternativas menos costosas a través de

compuestos naturales obtenidas de plantas que sirven de mecanismo preventivo por

el efecto desinfectante y antiséptico que poseen, entre las cuales se encuentra el

arrayán (Myrtus communis), planta muy utilizada en la medicina tradicional por la

comprobada acción antiséptica, astringente, hipoglucemiante, antioxidante y

antimicrobiana(4).

2

Es por ello que se planteó la presente investigación, con la finalidad de determinar

el efecto inhibitorio de la infusión de arrayán (Myrtus communis) en diferentes

concentraciones sobre cepas de Prevotella melaninogenica y compararlo con la

hexetidina, mediante un estudio in vitro a las 48 y 72 horas.

3

CAPÍTULO I

1. MARCO TEÓRICO

1.1. Prevotella melaninogenica

El género Prevotella es un componente principal de la microflora humana en una

variedad de sitios del cuerpo, incluyendo la boca, el tracto gastrointestinal y la

vagina. Además, varias especies de Prevotella han sido implicadas en las

infecciones purulentas. La infección dentoalveolar es quizás la infección purulenta

más común tratada en clínicas de cirugía oral y se ha evidenciado que este tipo de

infecciones están asociadas con una variedad de especies de Prevotella, que pueden

aislarse del sitio de infección(10).

1.1.1. Definición

La Prevotella melaninogenica es una bacteria perteneciente al género Prevotella,

que forma parte de la familia Bacteroidaceae, caracterizadas por ser

microorganismos bacterianos con forma de bacilos anaerobios estrictos, inmóviles

y no esporulados, productores de pigmento negro o marrón, característica que sirve

para clasificarlos como pigmentadas o no pigmentadas. Generalmente se encuentra

relacionada con el desarrollo de abscesos pulmonares y cerebrales, empiema

(infección diseminada desde el pulmón), patología inflamatoria pélvica y abscesos

tubo ovarios. En el caso de las especies residentes en la cavidad bucal mayormente

son considerados microorganismos patógenos del periodonto(2).

1.1.2. Estructura Prevotella melaninogenica

La Prevotella melaninogenica es una bacteria gramnegativa. Entre la pared celular

externa e interna, las proteínas de la membrana están presentes para descomponer

e hidrolizar los nutrientes. La bacteria Gram-negativa tiene un periplasma grande

en el que tiene lugar la degradación de las enzimas, la unión a las proteínas y la

4

impresión del entorno, estudios recientes han encontrado que la enzima que procede

de la actividad de precinasa se encuentra en la superficie y dentro de esta bacteria(11).

1.1.3. Factores de virulencia

La Prevotella melaninogenica juega un papel importante en las infecciones

subcutáneas transmisibles producidas por mezclas complejas de bacterias orales

nativas. Tiende a producir sulfuro de hidrógeno, amoníaco y sustancias citotóxicas,

inhibiendo la fagocitosis y la muerte de otras bacterias, también estimula el sistema

inmune del huésped para producir sustancias con potencial de eliminación de tejido

y se asocia con la capacidad para convertirse en hemolisina, por lo tanto, es capaz

de lisar los eritrocitos como los glóbulos rojos(12).

Se ha comprobado que la Prevotella melaninogenica actúa como factor de

virulencia en muchos microorganismos patógenos médicamente relevantes, junto

con la capacidad para lisar glóbulos rojos, también puede lisar otras células, como

células cebadas, neutrófilos y células polimorfonucleares. Esta bacteria daña

directamente los tejidos del huésped e induce una respuesta inflamatoria. Sin

embargo, la producción de hemolisina se produce sólo en condiciones limitantes de

hierro; se encontró que el magnesio y el calcio inhiben la reacción. Esta actividad

también se puede encontrar en fracciones subcelulares tales como citoplasma,

membrana externa y fracciones vesiculares (Prevotella melaninogenica), afectando

a la neuraminidasa, la colagenasa, las inmunoglobulinas G e IgA específicas(10).

1.2. Fisioterapia

La fitoterapia es un campo de la medicina que utiliza las plantas para tratar

enfermedades o como agentes promotores de la salud. El uso tradicional con

fitoterapias generalmente conserva la composición original y la integridad de la

planta de origen, de modo que la planta completa o un porcentaje representativo de

los componentes mínimamente adulterados son utilizados con fines medicinales.

5

Varias tradiciones médicas utilizan terapias basadas en plantas, que incluyen

medicina antroposófica, medicina naturista, medicina tradicional china, medicina

ayurvédica y medicina alopática(13).

Los médicos y proveedores pueden usar tratamientos de una sola hierba, hierbas

múltiples que se cree que tienen propiedades complementarias, o mezclas con

sustancias no herbarias, como minerales y vitaminas. El uso más tradicional de la

fitoterapia a menudo incluye toda la parte de la planta, tales como las infusiones o

té, mientras que la medicina natural occidental es más común el uso de hierbas

estandarizados individuales a un componente del extracto(14).

En contraste, las medicinas farmacéuticas derivadas de plantas son típicamente

compuestos aislados a través de la separación industrial y la extracción de

componentes identificados con propiedades terapéuticas(13).

1.3. Myrtus communis (Arrayán)

El arrayán (Myrtus communis), también conocido como mirto, es una conocida

planta medicinal que se ha utilizado en todo el mundo en la medicina tradicional.

La familia de las mirtáceas incluye 100 géneros y 3000 especies. El género Myrtus

pertenece a esta familia de arbustos perennes o árboles pequeños, que crecen

espontáneamente de hasta 5 m de alto. Es nativa del sur de Europa, el norte de

África y Asia occidental y también se distribuye en América del Sur, el noroeste

del Himalaya y Australia(15).

1.3.1. Descripción

La planta de arrayán tiene entre 2,4 y 3 m de altura y las ramas forman una cabeza

completa, cubierta densamente de hojas, las cuales son pequeñas y verdes y las

frutas son pequeñas y oscuras(16). Las hojas perennes tienen entre 2 y 5 cm de largo

y aromático después de la trituración, como en el caso de la mirra o el eucalipto. El

sabor es amargo e intenso, debido principalmente a la astringencia(17)

6

Las flores son como estrellas, blancas o rosadas y muy fragantes. La baya azul-

negra redonda contiene varias semillas. La polinización es hecha por insectos y las

semillas son dispersadas por aves que comen las bayas. (18)

1.3.2. Taxonomía

Tabla 1. Clasificación taxonómica de Myrtus communis

Reino Plantae División Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Subclase Rosidae Orden Myrtales Familia Myrtaceae Subfamilia Myrtoideae Tribu Myrteae Género Myrtus

Especie M. communis L. Fuente: Serce et al. 2010. (19)Actividades antioxidantes y composición de ácidos grasos de frutos de mirto silvestre (Myrtus communis L.)

1.3.3. Composición química

La planta contiene fibras, azúcares y antioxidantes y muchos compuestos

biológicamente activos. Los compuestos fenólicos, flavonoides y antocianinas son

los principales fitoquímicos en las bayas. Las semillas rinden 12-15% de un aceite

graso (aceite fijo) que consiste en glicéridos de ácido oleico, linoleico, mirístico,

palmítico, linolénico y ácido láurico. Los estudios sobre el análisis de ácidos grasos

de mirtos mostraron que contiene 14 ácidos grasos, siendo el ácido oleico el ácido

graso dominante (67.07%) seguido por ácido palmítico (10.24%) y ácido esteárico

(8.19%)(19).

El aceite de mirto es el aceite esencial de Myrtus communis, que se extrae de las

hojas, ramas, frutos y flores a través de la destilación al vapor. Es de color amarillo

o amarillo verdoso con un característico olor refrescante. El rendimiento y la

calidad del aceite dependen de la región de producción, la temporada de cosecha y

la duración de la destilación. Los rendimientos de aceite (p/p) de diferentes partes

de la planta son diferentes. Los rendimientos de los aceites hidrodestilados son:

7

hojas, 0.4-0.5; flor, 0.4; frutos verdes, 0.5; y frutas maduras, 0.02%. Los terpenos y

los alcoholes terpénicos constituyen casi la totalidad de los compuestos volátiles

del aceite esencial. Los cinco compuestos terpenoides (acetato de mirtenilo, 1, 8-

cineol, limoneno, linalool) están presentes en el aceite de la hoja (0.19-0.37%),

frutas (0.03-0.13%) y flores (0.21-0.26%) pero en diferentes proporciones(20).

1.3.4. Propiedades medicinales

Las bayas se usan como antiséptico, astringente, carminativo, emenagogo,

demulcente, desecante, analgésico, tónico capilar, hemostático, antiemético,

litotripsico, cardiotónico, diurético, antiinflamatorio, estomacal, tónico cerebral,

hemostático, nefroprotector, antídoto, antidiapofórico y antidiabético. Diversas

acciones farmacológicas de las hojas son astringentes, antisépticas,

hipoglucemiantes, laxantes, analgésicas, hemostáticas, tónicas capilares y

estimulantes. Se informa que la raíz tiene propiedades antibacterianas. En medicina

popular, se usa una decocción de hojas y frutas como enfermedades estomacales,

hipoglucemiantes, antimicrobianas, de la tos y bucales, para el estreñimiento,

apetitoso, antihemorrágico y externamente para la curación de heridas(16).

1.3.5. Aplicación del Myrtus communis en odontología

Mohammadreza et al. 2014 (21), en estudio realizado con la finalidad de evaluar la

actividad antimicrobiana de Myrtus communis, en pacientes con contaminación a

nivel de conductos radiculares y, Salvagnini et al. 2008 (22)que realizo su

investigación de reacción o inhibición en cultivos frente a otras bacterias utilizaron

aceite esencial crudo y el extracto de etanol crudo con las hojas de Myrtus

communis y verificaron que presentaban una actividad antimicrobiana discreta

contra bacterias patógenas, los halos de inhibición del crecimiento se evaluaron

mediante las técnicas de "molde" y de difusión en disco a las cepas Staphylococcus

aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichiacoli, Bacillus subtilis y Serratia

marcescens. Los resultados demostraron que el aceite de M. communis presentó una

actividad antibacteriana superior para todas las cepas.(21)(22)

8

Asimismo, Rasaide et al. 2017(23), desarrollaron una investigación con la finalidad

de evaluar los efectos antimicrobianos de aceites esenciales aislados de Myrtus

communis contra Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis y Streptococcus

salivarius a través de experimentos in vitro.

Utilizaron el método de difusión del disco para evaluar la zona de inhibición del

crecimiento microbiano por diferentes concentraciones, resultando que las hojas de

mirto tenían actividad antimicrobiana en las placas de difusión de disco contra todas

las cepas de Streptococcus, que se analizaron; sin embargo, S. mutants mostraron

una mayor susceptibilidad que otros. El aceite esencial de hojas de mirto podría ser

recomendado como un remedio potencial para la prevención de la colonización de

los dientes por Streptococcus mutants y obstaculizan el desarrollo de caries

dental.(23)

1.4. Antisépticos bucales

Los antisépticos son los fármacos más empleados para el control de placa

bacteriana, considerado el principal método en la prevención y tratamiento de las

enfermedades periodontales, estando cada vez está más extendido el denominado

control químico de la placa de manera complementaria a un control mecánico

ineficaz(3).

1.4.1. Definición

Los antisépticos bucales son sustancias empleadas para complementar la

eliminación mecánica de la placa produciendo un efecto antimicrobiano en toda la

boca. Los agentes químicos presentes en el enjuague bucal deben ser efectivos para

modificar la microbiota eliminando selectivamente los patógenos sin afectar

9

negativamente la flora normal que puede resultar en un sobrecrecimiento de

organismos patógenos(24).

1.4.2. Propiedades específicas del antiséptico

Los antisépticos bucales deben cumplir con requisitos básicos para lograr un

eficiente control de la placa dental, entre los cuales se puede mencionar(3):

i. Especificidad: El control de placa no debe fundamentarse en antibióticos,

estos deben ser reservados para uso sistémico en infecciones dentales o

enfermedades sistémicas específicas.

ii. Eficacia: Las dosis involucradas en la terapiase encuentra determinada por la

concentración mínima inhibitoria para las bacterias asociadas a patologías

dentales. Por tanto, debido a la naturaleza no específica de la placa dental, las

características antimicrobianas de los antisépticos bucales los convierten en

los fármacos de elección.

iii. Sustantividad: Para el tratamiento de infecciones dentales ésta es una

cualidad muy importante, ya que el agente antimicrobiano necesita cierto

tiempo de contacto con el microorganismo para inhibirlo o eliminarlo, a

diferencia de las infecciones sistémicas en las que el tiempo de contacto

deseado puede obtenerse mediante aplicaciones periódicas parenterales o

enterales del fármaco.

iv. Seguridad: Los agentes antimicrobianos se han ensayado extensamente con

lo que el uso está avalado científicamente. La seguridad de un fármaco viene

condicionada por su permeabilidad y el potencial de toxicidad.

v. Eficacia intrínseca: Porcentaje de efecto máximo que puede conseguirse con

las limitaciones de solubilidad del agente. No todos los agentes utilizados,

10

son capaces de conseguir por enjuagues una supresión completa del

crecimiento bacteriano.(3)

1.4.3. Tipos de antisépticos

De acuerdo a la estructura química los antisépticos se clasifican en: componentes

fenólicos, componentes de amonio cuaternario, agentes oxigenantes, extractos de

hierbas, biguanidas, bipiridinas, pirimidinas, halógenos y sales de metales

pesados(3).

1.4.3.1. Hexetidina

Roberts & Addy 1981, Ashley 1984, Wile et al. 1986 determinan que la hexetidina

es un antiséptico de amplio espectro, activo in vitro e in vivo contra de

las bacterias grampositivas y gramnegativas, así como las levaduras (Candida

albicans).

Presenta inhibición y reducción significativas al ser utilizadas en pacientes que

presentan placa supragingival, asi como la reducción en la inflamación que se

puede presentar en encías, teniendo sustantividad para gingivitis, placa y sangrado

gingival, respectivamente. (26)

Derivado de pirimidina al que se le atribuyen propiedades antisépticas así como la

de acelerar la cicatrización postcirugía periodontal, además, posee acción

inhibitoria limitada de la placa, acción que es reforzada con las sales de Zinc(25).

La sustantividad es de 1-3 horas, por tal motivo se lo clasifica como antiséptico de

primera generación, al estudiar la efectividad en la curación de úlceras aftosas,

encontraron beneficio sobre una higiene oral convencional concentración del 0,1% (26).

11

CAPÍTULO II

2. EL PROBLEMA

2.1. Planteamiento del problema

De acuerdo a la evidencia científica la Prevotella melaninogenica es una de las

bacterias causantes de la gingivitis, periodontitis, infecciones de los conductos

radiculares, abscesos de origen dentario y responsable de la halitosis(1). Para

disminuir estas bacterias patógenas han surgido alternativas menos costosas usando

diversas sustancias naturales obtenidas de plantas que sirven de mecanismos

preventivos por el efecto desinfectante y antiséptico que alcanzan, entre los cuales

se encuentra el arrayán (Myrtus communis), muy utilizada con la medicina

milenaria tradicional por la comprobada acción antiséptica, astringente,

hipoglucemiante, antioxidante y antimicrobiana(4).

Los investigadores Hashemipour et al.(5) realizaron un estudio donde evaluaron la

eficacia de varias plantas entre las cuales se encontraba el Myrtus communis en el

proceso de recuperación de la úlcera bucal, encontrando que la mayor reducción

registrada en el tamaño de la úlcera fue con esta planta, además de detectar un

mayor grosor del epitelio.

También en 2012,Messaoud et al. (4)desarrollaron un estudio con el objetivo de

investigar la actividad antibacteriana de la hoja de Myrtus communis en infusiones

preparadas durante tiempos diferentes, obteniendo como resultado que se evidenció

una actividad antimicrobiana sustancial contra E. coli, P. mirabalis, K. pneumoniae,

S. typhi y S. flexneri. Sn embargo, en el caso de patógenos bucales no hay evidencias

de haber sido probado la infusión de arrayán como factor antimicrobiano.

Por lo tanto, se planteó la presente investigación con el objetivo de establecer el

efecto inhibitorio de la infusión de arrayán (Myrtus communis) en diferentes

concentraciones y hexetidina sobre cepas de Prevotella melaninogenica, mediante

un estudio in vitro.

12

2.2. Formulación del problema

¿Cuál fue el efecto inhibitorio de la infusión natural de arrayán (Myrtus communis)

a las concentraciones de 50% y 100% con respecto al agente químico antiséptico

hexetidina sobre cepas de Prevotella melaninogenica?

2.3. Objetivos

2.3.1. Objetivo general

Establecer el efecto inhibitorio in vitro de la infusión de arrayán (Myrtus communis)

en diferentes concentraciones (50 y 100%) y hexetidina sobre cepas de Prevotella

melaninogenica.

2.3.2. Objetivos específicos

i. Identificar el efecto inhibitorio de la infusión de arrayán (Myrtus communis)

a la concentración de 50% sobre cepas de Prevotella melaninogenica a las

48 y 72 horas.

ii. Identificar el efecto inhibitorio de la infusión de arrayán (Myrtus communis)

a la concentración de 100% sobre cepas de Prevotella melaninogenica a las

48 y 72 horas.

iii. Determinar la acción inhibitoria de la hexetidina al 0,12% sobre cepas de

Prevotella melaninogenica a las 48 y 72 horas.

iv. Comparar el efecto inhibitorio de la infusión de arrayán (Myrtus communis)

a las concentraciones de 50 y 100%.

2.4. Hipótesis

Hipótesis de investigación (H1)

13

a. El efecto inhibitorio de la infusión de arrayán (Myrtus communis) a la

concentración del 100% fue mayor o igual que el efecto inhibitorio de la

infusión de arrayán (Myrtus communis) al 50%.

b. La infusión de arrayán (Myrtus communis) a las concentraciones de 50% y

100% tuvo mayor efecto inhibitorio que la hexetidina al 0,12%.

Hipótesis nula (H0)

a. El efecto inhibitorio de la infusión de arrayán (Myrtus communis) a la

concentración del 100% fue menor que el efecto inhibitorio de la infusión de

arrayán (Myrtus communis) al 50%.

b. La infusión de arrayán (Myrtus communis) a las concentraciones de 50% y

100% NO tuvo mayor efecto inhibitorio que la hexetidina al 0,12%.

2.5. Conceptualización de variables

2.5.1. Variables independientes

i Infusión de arrayán (Myrtus communis): Sustancia que se obtiene de

diversas partes del arrayán, a las cuales se les vierte o se los introduce en

agua a una temperatura mayor a la ambiental, pero sin llegar a hervir(28).

ii Hexetidina: Fármaco antiséptico con efecto bacteriostático y de uso tópico

sobre la mucosa oral(3).

iii Suero fisiológico: Solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% (p/v) en

agua(29).

14

2.5.2. Variables dependientes

i. Efecto inhibitorio sobre Prevotella melaninogenica: Capacidad que

poseen ciertas sustancias y elementos de inhibir el desarrollo y crecimiento

de Prevotella melaninogenica(2).

2.6. Justificación

Los microorganismos que forman parte del ecosistema de la cavidad bucal no

ocasionan ningún tipo de daño cuando mientras se mantengan en condiciones

normales, sin embargo, cuando se presentan desequilibrios comienzan a

desarrollarse diversas afecciones(6)

Entre las cuales se encuentra la enfermedad periodontal en las diversas etapas y

tipos de manifestaciones en el periodonto, que tienen un origen polimicrobiano(7)

Lográndose identificar los agentes patógenos que intervienen en enfermedades

como gingivitis y periodontitis, entre las cuales están las del género Prevotella,

implicadas y de alta relevancia en el desarrollo de las patologías periodontales(2).

El género Prevotella es fermentativo y sensible a la bilis, incluyendo especies

pigmentadas, es decir, que producen colonias negras en los cultivos, y no

pigmentadas; encontrando entre las pigmentadas la Prevotella melaninogenica con

gran interés clínico por predominar en la boca y ser causante de infecciones

periodontales, abscesos peribucales y afecciones respiratorias(8,9).

Como un método alternativo y de bajo costo con respecto a agentes antisépticos

químicos existentes en el mercado para aliviar este tipo de afecciones en el área

odontológica se aplica la fitoterapia, encontrando el arrayán (Myrtus communis), el

cual es conocido como una planta medicinal y aromática perteneciente a la familia

Myrtaceae, muy extendida en las regiones mediterráneas, utilizada desde la

15

antigüedad con fines alimenticios y medicinales, siendo frecuentemente consumido

como una infusión y decocción en la medicina tradicional, debido al efecto

estimulante, antiséptico, astringente, hipoglucemiante, antioxidante y

antimicrobiano(4).

En el Ecuador esta planta se cultiva como ornamental, usando las hojas, flores y

frutos para la obtención de aceites aromáticos, usándose también como antigripal y

antiséptico en forma de infusión, quedando evidenciado el efecto antimicrobiano

en investigaciones como las de Hashemipour et al.(5)y Messaoud et al.(4).

Por tanto, el presente estudio permitió establecer el efecto inhibitorio de la infusión

de arrayán (Myrtus communis) en diferentes concentraciones y compararlo con la

hexetidina, que es el agente antiséptico usado para el tratamiento de procesos

infecciosos orales y halitosis, sobre cepas de Prevotella melaninogenica.

La finalidad es el identificar cuál de los dos productos es más efectivo para controlar

la proliferación del microorganismo dentro de la cavidad bucal, planteando de

acuerdo a los resultados obtenidos una alternativa natural que minimice las

patologías orales infecciosas, permitiendo incorporar compuestos derivados de esta

planta como tratamientos alternativos de bajo costo dentro de los tratamientos

clínicos y políticas públicas de prevención y control de enfermedades bucales para

beneficio de la salud oral de la comunidad en general.

16

CAPÍTULO III

3. METODOLOGÍA

3.1. Tipo de investigación

El estudio planteado fue de tipo experimental, in vitro, transversal y comparativo.

i. Experimental: se usó este tipo de diseño, donde el investigador modificó

el factor de la concentración de la infusión de arrayán (Myrtus communis)

al 50% y 100%, para verificar el efecto inhibitorio sobre el microorganismo

Prevotella melaninogenica posterior a las 48 y 72 horas.

ii. In vitro: El procedimiento se desarrolló dentro de un ambiente controlado

de laboratorio, siguiendo de manera estricta las normas de bioseguridad

establecidas. Se recolectaron las muestras obtenidas de inocular infusión de

arrayán (Myrtus communis) a distintas concentraciones en cápsulas Petri

con cepas de Prevotella melaninogenica.

iii. Transversal: Los datos se obtuvieron una sola vez, durante el proceso

experimental.

iv. Comparativo: Se realizó un análisis de la diferencia en el efecto inhibitorio

sobre el microorganismo Prevotella melaninogenica que posee la infusión

de arrayán (Myrtus communis) a distintas concentraciones y la hexetidina

3.2. Población de estudio y muestra

La población estuvo constituida por un número infinito de cepas microbianas de

Prevotella melaninogenica que fueron adquiridas en MEDIBAC, proveedor

integral para laboratorios.

17

La muestra fue no probabilística, por tanto la selección se realizó a través de

muestreo por conveniencia, utilizando 20 cajas Petri con cepas Prevotella

melaninogenica necesarias para investigar la actividad de las distintas

concentraciones de la infusión de arrayán (Myrtus communis), así como de los

controles positivo y negativo, todo de acuerdo a los lineamientos de la investigación

que se realizó en el artículo base de Galarza et al.(27)

3.3. Criterios de inclusión y exclusión

Criterios de inclusión

i. Cajas Petri con cepas de Prevotella melaninogenica no contaminadas.

ii. Hojas de la planta arrayán (Myrtus communis) en buen estado.

iii. Infusión de arrayán (Myrtus communis) a concentraciones de 50% y 100%.

Criterios de exclusión

i. Cajas Petri con cepas de Prevotella melaninogenica que se contaminen

durante el procedimiento.

ii. Cajas Petri con cepas de Prevotella de especies diferentes a la

melaninogenica.

iii. Hojas de la planta arrayán (Myrtus communis) putrefactas o con presencia

de plagas.

iv. Infusión de arrayán (Myrtus communis) a concentraciones diferentes a las

preestablecidas para la investigación.

18

3.4. Operacionalización de las variables

Variable Definición Operacional Tipo Clasificación Indicador Categórico Escala de

Medición

Infusión de arrayán

(Myrtus communis)

Sustancia obtenida de diferentes partes del arrayán, a las cuales se les vierte o se les introduce en agua a una temperatura mayor a la ambiental, sin que llegue a hervir(28).

Independiente Cuantitativa Nominal

Concentración 50% 100%

1 2

Hexetidina

Antiséptico con efecto bacteriostático usado de manera tópica sobre la mucosa oral(3).

Independiente Cuantitativa Nominal

Concentración 0,12%

1

Suero fisiológico Solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% (p/v) en agua(29). Independiente Cuantitativa

Nominal Microlitros utilizados en la

prueba 1

Efecto inhibitorio sobre

Prevotella

melaninogenica

Capacidad de ciertas sustancias de inhibir el desarrollo y crecimiento de Prevotella melaninogenica(2).

Dependiente Cuantitativa Nominal

Diámetro de halo de inhibición en milímetros (mm), según Mariani

et al.(30):

Leve = ≤ 6 mm Moderada = Entre 7 mm y 8 mm

Alta = ˃ 8 mm

1 2 3

19

3.5. Estandarización

Antes de iniciar el procedimiento se solicitó los permisos correspondientes a la

Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador para

desarrollar la parte experimental del estudio en el Laboratorio de Análisis Clínico

de esta dependencia. (Anexo A).

Para el estudio planteado se empleó la planta de arrayán (Myrtus communis),

disponible comercialmente en la ciudad de Quito, para obtener infusión en las

concentraciones del 50% y 100%. Por otra parte, la cepa bacteriana de Prevotella

melaninogenica, fueron adquiridas en el laboratorio MEDIBAC, el cual entregó un

certificado de autenticidad de la misma (Anexo B), cultivadas en cápsulas Petri en

incubadora a 37ºC por 48 horas. La turbidez se ajustó al estándar Mc Farland 0,5

para hacer una dilución de 1,5 x 108 UFC/ml, siguiendo el procedimiento

establecido por el Manual de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana(31). En

cuanto a la medición del halo de inhibición se utilizó una regla milimetrada, la cual

estuvo calibrada por el fabricante.

Figura 1 Materiales utilizados

Fuente: Investigador

Elaboración: autor

20

3.6. Manejo y recolección de datos

El procedimiento experimental se dividió en los siguientes pasos:

1.- Elaboración de la infusión de arrayán (Myrtus communis)

Se realizó la recolección del fruto de arrayán (Myrtus communis) y se extrajo el

material seco y molido mediante el uso de agua destilada hervida, manteniendo el

proceso de maceración por 24 horas en sitio oscuro, para posteriormente ser filtrado

con el objetivo de eliminar sólidos remanentes. Este líquido filtrado fue sometido a

centrifugación a 1000 rpm por una hora (60 minutos) e inmediatamente cumplido

el tiempo fue esterilizado por medio de microfiltros de 0,45 µm. Finalmente el

producto obtenido fue conservado en refrigeración a 4º hasta la experimentación(32).

a b

21

Figura 2: Obtenciones de concentraciones de Planta de arrayan (myrtus communis) 50% y

100% a) Planta de arrayan b) material triturado, c) Maceracion por 24 horas, d) Obtencion

de concentraciones a travez de filtros


Elaboración: autor

2.- Obtención de la cepa de Prevotella melaninogenica

La cepa de Prevotella melaninogenica fue adquirida en la empresa MEDIBAC que

importa dichos microorganismos e insumos propios de estudio, localizado en la

ciudad de Quito.

c d

22

Figura 3: Obtención de Prevotella Melaninogénica ATCC ®25845


Elaboración: autor

3.- Activación y siembra de la cepa de Prevotella melaninogenica

Para la activación se siguió las instrucciones del fabricante apoyado con la asesoría

de personal encargado del laboratorio Microbiológico de la Facultad de Ingeniería

Ciencias Química de la Universidad Central del Ecuador. Se utilizó un aza

desechable para sembrar la cepa en el medio de cultivo, utilizamos TSB (Caldo de

Tripticasa Soya), este procedimiento se realizó en la cama de flujo laminar para

evitar la contaminación, después se colocó el medio con la cepa sembrada en la

jarra Gaspack y se llevó a incubadora por 24 horas a 36ºC.

23

a b

c d

24

Figura 4 : a) Activación de la cepa de Prevotella Melaninogénica ATCC ®25845, caja petri

con medio de cultivo agar sangre, b) Medio de cultivo liquido TBS, c) Apertura de cepa de

Prevotella Melaninogénica ATCC ®25845, d ) y e) Toma de Prevotella por medio de isopo

para su siembra, f) Siembra en caja petri.


Elaboración: autor

e f

6

a b

25

Figura 5: a) siembra en medio sólido y líquido, b) Colocacion en jarra de anaerobios

(Gaspack), c) colocación en medio aislado d) temperatura ambiente


Elaboración: autor

4.- Inoculación de Prevotella melaninogenica

Se prepararon 20 cajas Petri con Agar Muller Hinton suplementado con 5% de

sangre, donde se realizó la siembra de la cepa activada de Prevotella

melaninogenica, utilizando un hisopo estéril frotándolo sobre la superficie del agar

y rotando la posición de 60º de ida y vuelta, repitiendo este paso tres veces, con el

objetivo de garantizar la distribución del inóculo de manera homogénea.

c d

26

Figura 6: Rotulación de las 20 cajas petri


Elaboración: autor

Tomamos un hisopo estéril con la cantidad suficiente de bacterias y llevamos la muestra al medio de cultivo agar sangre y realizamos la siembra en las 20 cajas Petri.

Figura 7: Siembra de bacteria Prevotella melaninogenica


Elaboración: autor

27

5.- Fórmula Mac Farland y Siembra de discos en cápsulas Petri

Se trabajó dentro de la cámara de flujo laminar, utilizamos 10 ml de Cloruro de

sodio en un tubo de ensayo, se tomó una muestra del cultivo de Prevotella

melaninogenica con un asa estéril llevamos una cantidad de bacteria hacia el tubo

de ensayo, se mezcla bien y medimos la concentración del tubo con una turbidez a

la escala 0.5 Mc. Farland.

Figura 8: Fórmula Mac Farland


Elaboración: autor

Con la ayuda de una pinza estéril se colocó sobre cada placa de agar inoculado con

Prevotella melaninogenica cuatro discos de papel de aproximadamente 6 mm, a

una distancia no menor de 15 mm entre cada disco y 1,5 cm del borde de la caja.

28

Figura 9: Materiales a usar en procedimiento experimental


Elaboración: autor

Figura 10: Separación de discos estériles con pinzas para colocar en cajas petri.


Elaboración: autor

Cada uno de estos discos fueron impregnados con infusión de arrayán (Myrtus

communis) al 50%, infusión de arrayán (Myrtus communis) al 100%, hexetidina al

0,12% como control positivo y suero fisiológico como control negativo, llevándose

a incubación en campana de anaerobios a una temperatura de 37ºC por 48 horas y

72 horas para determinar su efecto.

29

Figura 11. Discos impregnados:1) Infusión de arrayán 50%, 2) Infusión de arrayán al

100%, 3) Hexetidina, 4) Suero fisiológico.


Elaboración: autor

1

3

2

4

30

Figura 12. Incubación de bacteria Prevotella melaninogenica en jarra de anaerobios y puesto

a incubación.


Elaboración: autor

6.- Evaluación del efecto inhibitorio

Para determinar el efecto antimicrobiano, se medió con una regla milimetrada el

halo que se formó alrededor del disco, utilizando la escala de referencias de la

clasificación establecida por Mariani et al(30):

31

i. Leve = ≤ 6 mm

ii. Moderada = Entre 7 mm y 8 mm

iii. Alta = ˃ 8 mm

Cabe recalcar que la medición se realizó a las 48 y 72 horas.

Figura 13. Halos de inhibición a las 48 horas


Elaboración: autor

Figura 14. Medición halos de inhibición a las 72 horas


Elaboración: autor

32

3.7. Análisis estadístico

Los datos obtenidos se registraron en una hoja de recolección de datos (Anexo C),

para posteriormente realizar tablas y gráficas de los valores descriptivos (media,

frecuencia, porcentaje) para la correcta interpretación, utilizando el programa

SPSS, verificando si los datos provienen de una población normal, para lo cual se

realizó un prueba de Shapiro Will (< 50 muestras), de proceder de datos normales

se realizó una prueba ANOVA y Tukey, en caso de ser resultados de población de

no normalidad se efectuó un Test de Kruskall Wallis o Mann Whitney, con un nivel

de confianza del 95% y 5% de error.

3.8. Aspectos bioéticos

Beneficencia

La información obtenida con la investigación aportó información actualizada que

puede ser utilizada como material de referencia, tanto para los profesionales en el

área odontológica como a los estudiantes de odontología; asimismo, estableció

bases para desarrollar futuros estudios con los resultados y recomendaciones que se

alcancen. También fue de gran utilidad para los profesionales de salud bucal por

cuanto obtuvieron nuevos conocimientos concernientes a la prevención de

patologías orales causadas por Prevotellamelaninogenica,

Riesgos potenciales del estudio

No existieron riesgos en la investigación, debido que la metodología empleada no

comprometió la salud o integridad física del investigador. Sin embargo, siempre

existen riesgos de contaminación durante el análisis microbiológico, consecuencia

del manejo de las muestras, lo cual se controló haciendo uso de las Normas

Generales de Bioseguridad de la Facultad de Odontología de la Universidad Central

de Ecuador (Anexo E), las cuales se basaron en los lineamientos sugeridos por el

33

Ministerio de Salud sobre el Manejo de desechos infeccioso, en el Art 9. Además,

se utilizó el equipo de protección personal (guantes, mascarillas, batas) adecuado

para el ensayo microbiológico y se realizó un correcto manejo de los desechos

infecciosos una vez finalizados los procedimientos, recolectándolos y rotulando en

una funda plástica infectocontagiosa que fueron almacenados en el contenedor de

desechos infecciosos del Laboratorio de la Facultad para finalmente ser enviados a

la empresa encargada. (Anexo F)

Beneficios potenciales del estudio

Beneficio directo: Fue de apoyo para el investigador por cuanto le permitió adquirir

nuevos conocimiento que pondrá en práctica durante la vida profesional.

Beneficio indirecto: Dirigido a los especialistas del área de odontología y los

pacientes, debido a que el resultado de la investigación fue fundamentado en un

producto natural que permita evitar infecciones y patologías orales como

consecuencia de Prevotella melaninogenica, optimizando de esta manera la

atención recibida.

Idoneidad ética y experticia del estudio - Conflicto de intereses

Establecido por un certificado reflejado en los Anexos G y H.

La declaración de conflicto de intereses se encuentra señalado en los Anexos I y J.

34

CAPÍTULO IV

4. ANÁLISIS DE RESULTADOS

4.1. Resultados

El estudio está compuesto por 20 muestras que contienen la infusión de arrayán de

50 y 100%, Hexetidina y suero fisiológico entre 48 y 72 horas.

Tabla 2. Resultados de la infusión de arrayán, hexetidina y suero fisiológico

MUESTRAS

INFUSIÓN DE ARRAYÁN HEXETIDINA

0,12% SUERO

FISIOLÓGICO 50% 100%

48H 72H 48H 72H 48H 72H

HALOS DE INHIBICIÓN (mm)*

1 8 8 12 12 17 17 6 2 7 7 11 11 15 15 6 3 8 8 13 13 15 15 6 4 9 9 12 12 15 15 6 5 7 7 13 13 16 16 6 6 8 8 13 13 16 16 6 7 9 9 11 11 15 15 6 8 8 8 13 13 14 14 6 9 9 9 12 12 15 15 6 10 8 8 13 13 16 16 6 11 8 8 11 11 15 15 6 12 8 8 12 12 16 16 6 13 9 9 13 13 14 14 6 14 9 9 13 13 16 16 6 15 8 8 12 12 14 14 6 16 8 8 12 12 16 16 6 17 9 9 12 12 16 16 6 18 7 7 11 11 16 16 6 19 8 8 13 13 17 17 6 20 7 7 12 12 15 15 6

Fuente y elaboración: Christian Alejandro Díaz Pilaluisa

En la tabla 2 se evidencian los resultados finales de la infusión de arrayán (50% y

100%), hexetidina y suero fisiológico.

35

4.1.1. Información descriptiva

En la tabla 3 se presentanlas 20 muestras dónde se describe las medias y desviación

estándar.

Tabla 3. Resultados descriptivos

Estadísticos descriptivos

N Mínimo Máximo Media Desv.

Desviación

Infusión de Arrayán 50% - 48 h 20 7,00 9,00 8,1000 ,71818 Infusión de Arrayán 50% - 72 h 20 7,00 9,00 8,1000 ,71818 Infusión de Arrayán 100% - 48 h 20 11,00 13,00 12,2000 ,76777 Infusión de Arrayán 100% - 72 h 20 11,00 13,00 12,2000 ,76777 Hexetidina 0,1 2% - 48 h 20 14,00 17,00 15,4500 ,88704 Hexetidina 0,1 2% - 72 h 20 14,00 17,00 15,4500 ,88704 Suero Fisiológco 20 6,00 6,00 6,0000 ,00000 N válido (por lista) 20


Gráfico 1. Medias de halo de inhibición


Se observa que la infusión de arrayán a 48 y 72 horas tiene una media de 8,1 mm

en concentración del 50% . Similares resultados se presentan con la concentración

al 100% que presentaron una media de 12,2 mm a las 48 y 72 horas, mismo caso

para la hexetidina al 0,12% que tiene una media de 17 mm y el suero fisiológico

tiene una media de 6 mm.

8 8

12 12

17 17

6

48H 72H 48H 72H 48H 72H H

Infusión de arrayán 50% Infusión de arrayán 100% Hexetidina 0,1 2% SueroFisiológico

Medias de halos de inhibición mm

36

Gráfico 2: Efecto de los halos de inhibición


De acuerdo a los resultados la infusión de arrayán al 50% tanto a 48 y 72 horas tiene

una situación moderada y alta; mientras la infusión al 100% y hexetidina 0,12%

tiene una situación alta y suero fisiológico es leve.

4.1.2. Estudio estadístico

Para aplicar las pruebas se basa en un nivel de confianza del 95% y 5%. Pero antes

se debe calcular la prueba de normalidad para determinar si los datos provienen de

una distribución normal o no. A continuación se aplica esta prueba.

H0: Los datos provienen de una distribución normal

H1: Los datos no provienen de una distribución normal

Tabla 4Prueba de normalidad

Estadístico gl Sig.

Infusión de Arrayán 50% - 48 h ,812 20 ,001 Infusión de Arrayán 50% - 72 h ,812 20 ,001 Infusión de Arrayán 100% - 48 h ,800 20 ,001 Infusión de Arrayán 100% - 72 h ,800 20 ,001 Hexetidina 0,1 2% - 48 h ,884 20 ,021 Hexetidina 0,1 2% - 72 h ,884 20 ,021 Suero Fisiológico . 20 .


Infusión dearrayán

50% 48H


50% 72H


100% 48H


100%72H

Hexetidina0,1 2% 48H

Hexetidina0,1 2% 72H

SueroFisiológico

Leve 0% 0% 0% 0% 0% 0% 100%Moderado 68,42% 68,42% 0% 0% 0% 0% 0%Alto 31,58% 31,58% 100% 100% 1005 100% 0%

0%20000%40000%60000%80000%

100000%120000%

Efecto de los halos de inhibición

37

De acuerdo a los resultados de la prueba de normalidad se observa que los datos no

provienen de una distribución normal al considerar que el valor de significancia o

valor p<0,05. Al rechazar la hipótesis nula y aceptar la alternativa.

Considerando esta prueba se debe utilizar las pruebas no paramétricas como el

Krusk Wallis, Mann Whitney y Wilcoxon.

Gráfico 31: Prueba Krusk Wallis

38


Al comparar entre grupos con esta prueba tanto a 48 y 72 horas entre la infusión de

arrayán, hexetidina 0,12% y suero fisiológico, se evidencia que existe una variación

al comparar en grupos.

Tabla 5Datos comparativos de la Prueba Krusk Wallis


Mientras la comparación entre variables identifica que existe un efecto inhibitorio

de la infusión de arrayán (Myrtus communis) a la concentración del 100% fue mayor

o igual que el efecto inhibitorio de la infusión de arrayán (Myrtus communis) al

50%. Pero la infusión de arrayán (Myrtus communis) a las concentraciones de 50%

y 100% no tuvo mayor efecto inhibitorio que la hexetidina al 0,12%.

39

4.1.2.1. Prueba Wilcoxon para muestras relacionadas

Después de comparar entre grupos se procede a la comparación entre cada una de

las variables tanto a 48 y 72 horas.

Tabla 6. Comparación de la infusión de 48 a 72 horas (Prueba de Wilcoxon)

Comparación de la infusión de 48 a 72 horas

Prueba

de

Wilcoxon

Z Sig. asintótica(bilateral)

Infusión de Arrayán 50% de 48 a 72 h ,000 1

Infusión de Arrayán 100% de 48 a 72 h ,000 1

Hexetidina 0,1 2% de 48 a 72 h ,000 1 Comparación de la infusión de arrayán de 50 al 100% de 48 a 72 horas

Prueba

de

Wilcoxon

Z Sig. Asintótica(bilateral)

Infusión de Arrayán 50% de 48 a 100% de 48 h -3,965 0,000

Infusión de Arrayán 50% de 72 a 100% de 48 h -3,965 0,000


Como se evidencia en la tabla 6 al comparar tanto la infusión de arrayán al 50% y

100% como la Hexetidina al 0,12% de 48 a 72 horas, se evidencia que no existe

variación porque son iguales a 1.

Al comparar entre concentraciones de la infusión de arrayan se evidencia que el

100% es mayor que el 50% tanto en 48 y 72 horas.

40

4.1.2.2. Prueba Mann Whitney para muestras independientes

Tabla 7. Comparación infusión de arrayán al 50% de 48 y 72 horas con Hexetidina al 0,12%

(Prueba de Mannn Whitney) Comparación de la infusión de arrayán al 50% de 48 y 72 horas con Hexetidina al 0,12%

U de Mann-Whitney

Concentraciones Z Sig. asintótica(bilateral)

Infusión de Arrayán 50% de 48 con Hexetidina 0,12% 48 horas 400,00 0,000


Comparación de la infusión de arrayán 100% de 48 y 72 horas con Hexetidina 0,12 48 y 72 horas

U de Mann-Whitney

Concentraciones Z Sig. asintótica(bilateral)




Gráfico 4: Comparación infusión de arrayán al 50% de 48 y 72 horas con Hexetidina al 0,12%

(Prueba de Mannn Whitney)


41

Al comparar la infusión de arrayán de 50% y 100% de concentración con la

hexetidina 0,12% a 48 y 72 horas se existe una diferencia, dónde el segundo grupo

es mayor que la primera.

Tabla 8. Comparación de la infusión de arrayán 50%-100% y hexetedina 0,12%de 48 y 72

horas con suero fisiológico

Comparación de la infusión de arrayán 50% de 48 y 72 horas con suero fisiológico

U de Mann-

Whitney

Concentraciones Z Sig. Asintótica(bilateral)

Infusión de Arrayán 50% de 48 horas con suero fisiológico 0,00 0,00


Comparación de la infusión de arrayán 100% de 48 y 72 horas con suero fisiológico

U de Mann-

Whitney




Comparación de la hexetidina 0,12% de 48 y 72 horas con suero fisiológico

U de Mann-

Whitney


Hexetedina 0,12% de 48 horas con suero fisiológico 0,00 0,00

Hexetedina 0,12% de 72 horas con suero fisiológico 0,00 0,00

No existe diferencia en la comparación de la infusión de arrayán al 50%-100% y hexetedina al 0,12% de 48 y 72 horas con el suero fisiológico.

42

4.2. Discusión

La Prevotella melaninogenica es de gran interés clínico por predominar en la boca

y ser causante de infecciones periodontales, abscesos peribucales y afecciones

respiratorias(8,9),

Carroll et al. (8) y Borsanelli et al.(9) han tratado de buscar alternativas naturales para

contrarrestar el efecto de proliferación a nivel de cavidad bucal que produce esta

bacteria gram negativa.

Existe similitud con el estudio de Al-Saimary y cols (33) ya que estudiaron la

actividad antibacterial de algunos extractos de plantas (extractos acuosos de hojas

de Myrtus communis y Eucaliptus) y la prueba en comparación con los antibióticos

estándar, a la concentración de 100% (1000mcg/ml) del extracto acuoso reporto un

promedio de halo de inhibición de 14 mm, mientras que en mi investigación

presento un efecto inhibitorio sobre Prevotella melaninogenica de 12,2 mm según

la clasificación de Mariani y cols.(30)

Los autores manifiestan que es un excelente efecto sobre el crecimiento de a

bacteria gran negativa, atribuyen este comportamiento a la combinación de los

compuestos fenolicos del extracto de la planta que causan un efecto negativo a las

membranas celulares de la bacteria, causando filtración de materiales celures y, en

ultima instancia, la erradicación del microorganismo (34).

De igual manera la investigación de Messaoud y cols. (4), coincide con mi

investigación, donde determinaron la actividad antibacteriana de la infusión de la

hoja de arrayán (Myrtus communis) y la composición fenólica, con respecto a cinco

bacterias (Salmonella typhi, Proteus mirabilis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, and

Shigella flexner), identificando que existe una inhibición de la infusiones

contrabacterias gram negativas, específicamente la Proteus mirabilisy Shigella

flexner(halos de inhibición mayores a 20 mm), aducen que este comportamiento

posiblemente se debe a las propiedades antimicrobianas de las infusiones deMyrtus

43

communis están asociadas con los altos contenidos de polifenoles y monoterpenos

oxigenados, de los cuales los terpenos oxigenados, como el 1,8-cineol, linalool y α-

terpineol, muestran una potente actividad antibacteriana contra bacterias gram

negativos.

Sin embargo, Mert y cols(35), difieren con respecto a mi investigación ya que ellos

investigaron sobre las actividades antimicrobianas y citotóxicas del extracto con n-

hexano, metanol, etanol, acetato de etilo y la infusión de hojas de Myrtus communis

sobre siete microorganismos, esto fue realizado en Turquía, manifestando que el

efecto antimicrobiano de la infusión con la bacteria Gram negativa Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853 fue de 8 mm.

Este mismo comportamiento se evidenció en los otro métodos de extracción,

demostrando mayor efecto en las bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureusy

Staphylococcus epidermidis), sobre esto Aleksic y cols. 2014,(36)expresan que

generalmente las bacterias Gram negativas son más resistentes a los extractos de

plantas y aceites esenciales que los Gram positivos.

Este diferimiento con los resultados de mi estudio se puede atribuir a las diferentes

condiciones de crecimiento ambiental de la planta utilizada, también el tiempo y

forma de elaboración de la infusión, estos factores pueden impactar los resultados

y dificultar las comparaciones entre las investigaciones(37).

Revisando los resultados obtenidos en mi investigación se puede constatar que con

una infusión de 50% de arrayan con un halo inhibitorio de 8,1 mm a las 48 y 72

horas (efecto moderado), lo cual coincide con el estudio realizado por Guasgua, J.

2017,(38) quien con un extracto etanólico de 50% obtuvo un halo promedio de 7,00

mm frente a la bacteria Porphyromonas gingivalis; aunque en la actual

investigación se estudió con respecto a la Prevotella melaninogenica, ambas son

bacteriasGram negativa, anaerobia facultativa y forman parte de la microbiota de la

cavidad oral.

44

Con respecto al acción de la hexetidina al 0,12% muestra concordancia con el

estudio de Parčina y cols. 2017 (39), la capacidad antimicrobiana de pastas dentales

con probióticos y enjuague dentales (uno a base de hexetidina), frente a las

microorganismos Candida albicans, Candida tropicalis, Enterococcus faecalis,

Streptococcus salivarius y Staphylococcus aureus, demostraron un halo de

inhibición entre 11 a 28 mm, dependiendo del microorganismo,mientras que mi

estudio determinó una media del halo de inhibición de 15,45 mm (efecto inhibitorio

alto)

Se evidenció en mi investigación que existió diferencia significativa entre el halo

de inhibición con la infusión de Myrtus communis a las concentraciones de 50% y

100% con respecto a la hexetidina al 0,12% (15,45 mm), sin embargo la hexetidina

presenta el mismo efecto inhibitorio que la concentración de la infusión de la planta

al 100% (alto efecto inhibitorio).

Existióconcordancia parcial con la investigación de Alvarado y Moromi. 2010(41),

y mi investigación, el halo de inhibición de los extractos hidroalcohólico de las tres

plantas estudiadas (Plantago major L. (llantén), Erythroxylum novograntense

vartruxillense (coca trujillo) y Camellia sinensis (té verde) frente a la Prevotella

melaninogenicaestuvo en el rango de 10,4 a 15,2 mm (efecto inhibitorio alto) y al

compararlo con la clorhexidina al 0,12% (17 mm), reportó una diferencia

significativa, no obstante el efecto inhibitorio de las plantas y de la clorhexidina es

alto en función de la escala de Mariani y cols. (30) (Alta = ˃ 8 mm), la cual fue la

utilizada en la actual investigación.

Los hallazgos de mi investigación difieren del estudio de Taheri y cols (41), el

extracto hidroalcohólico de las hojas de Myrtus communis se evaluó en 4

concentraciones, incluidas 10-80 m/ml en cuatro cepas de bacterias patógenas y

comparadas con cuatros antibióticos, evidenciando que el extracto en ninguna de

las concentraciones demostró efecto antibacteriano sobre la Pseudomonas

aeruginosa, solo con la gentamicina reportó un halo de inhibición de 11,29 mm,

45

con esto se evidencia que dependiendo del método de extracción y el

microorganismo, la Myrtus communis. pueden surtir efecto inhibitorio.

Mediante los resultados de mi investigación se determinó que no existió diferencia

significativa entre el halo de inhibición de la infusión de Myrtus communis al 50%

y 100%, lo mismo ocurrió con la hexetidina 0,12% a las 48 y 72 horas de tiempo

de inoculación sobre Prevotella melaninogenica. De acuerdo a Alcalá y cols. 2004,

(41) en el Manual de Procedimiento en Microbiología Clínica, que el crecimiento

visible de las bacterias en las placas Petri conjuntamente con la acción de un

producto antimicrobiano es de 24 a 48 horas (31), sin embargo existen algunas

especies como la Prevotella spp. yPorphyromonas spp, se necesitan de más tiempo

para crecer, con respecto a los datos del actual estudio con 48 horas fue suficiente

para identificar el efecto inhibitorio de los productos utilizados en la presente

investigación.

46

CAPÍTULO V

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1. Conclusiones

En este estudio se identificó el Efecto Inhibitorio de la infusión de arrayan

(myrtus communis) a la concentración de 50% sobre cepas de Prevotella

melaninogenica a las 48 y 72 horas obteniendo una media de 8.1 mm en la

concentración del 50%

Se logró identificar el Efecto Inhibitorio de la infusión de arrayan (Myrtus

communis) en una concentración de 100% sobre cepas de prevotella

melaninogenica a las 48 y 72 horas obteniendo una media de 12.2 mm.

Ante la acción inhibitoria de la hexetidina al 0.12% sobre cepas de

prevotella melaninogenica a las 48 y 72 horas se determinó una media de

17 mm.

Se concluyó, por lo tanto que el Efecto Inhibitorio de la infusión del arrayan

(myrtus communis) a las concentraciones de 50 y 100% se obtuvo: al 50%

en las 48 y 72 horas de la infusión de arrayan obtuvo una situación moderada

y alta; mientras que la infusión de arrayan al 100% tuvo una situación alta.

47

5.2. Recomendaciones

Se recomienda mejorar las características de la infusión, aumentar aditivos

y preservantes que permitan su comercialización.

Utilizar los resultados obtenidos en este estudio para la aplicación en

pacientes que presenten enfermedades periodontales como una terapia

alternativa y natural propuesta por el odontólogo.

Se recomienda realizar estudios in vivo verificando la acción del arrayan

como colutorio ante enfermedad periodontal.

Continuar con investigaciones permitiendo realizar ensayos donde

intervenga la infusión de arrayan sobre otras bacterias periodonto patógenas

demostrando su efecto inhibitorio.

48

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52

ANEXOS

Anexo A Solicitud de permisos para realizar la investigación

53

Anexo B Certificado autenticidad cepas de Prevotella melaninogenica

54

Anexo C Hoja de recolección de datos

Muestra

s

HALOS DE INHIBICIÓN EN mm

Infusión de arrayán

(Myrtuscommunis) Hexetidina al

0,12% Suero

fisiológico Al 50% Al 100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

55

Anexo D Declaración de confidencialidad

56

Anexo E Normas Generales de Bioseguridad de la Facultad de Odontología de la Universidad

Central de Ecuador

57

58

Anexo F Protocolo de manejo de los desechos infecciosos

59

Anexo G Certificado de idoneidad ética y experticia del estudio del investigador

60

Anexo H Certificado de idoneidad ética y experticia del estudio del tutor

61

Anexo I Certificado de conflicto de intereses del investigador

62

Anexo J Certificado de conflicto de intereses del tutor

63

FORMATO PARA EXPEDIENTE DEL ESTUDIANTE

AUTORIZACIÓN DE PUBLICACIÓN EN EL REPOSITORIO INSTITUCIONAL

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CODIGO: sib-uce.

Fecha de entrega: Día: 27 Mes: 05 Año: 2019

INFORMACIÓN DE AUTOR (ES)

Nombres y apellidos: Christian Alejandro Díaz Pilaluisa C.I. o pasaporte: 1719530808

Email: [email protected] Año Nacimiento: 12/03/1984

INFORMACIÓN INSTITUCIONAL

Nombre de la Facultad: Odontología

Carrera: Odontología

Título a optar: Odontólogo

Pregrado: x Especialización: Maestría: Doctorado: Institucional: Otro:

Tutor (es): Dra Marina Antonia Dona Vidale

INFORMACIÓN Y CATEGORÍA DEL DOCUMENTO. Marque con X (uno o varios) Artículo de Revista Revista Académica / Científica

Capítulo de Libro Tesis (Maestría y Doctorado)

Libro Trabajo de grado (Pregrado y Especialización) x

Memoria de Evento Otro

Ponencia Cual?

Producción Docente

Título y subtítulo del documento:

DINÁMICA DE INVESTIGACIÓN (Definida por cada Facultad. Consultar con su Tutor)

Grupo de Investigación:

Línea de Investigación: Biología Estomatológica

Área: Ciencias Odontológicas Básicas

Tema: “Efecto inhibitorio del arrayán (myrtus communis) en infusión y la hexetidina

frente a la prevotella melaninogenica. Estudio in Vitro”.

64

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académico e investigativo; utilicé mecanismos de detección antiplagio y/o buscadores comerciales en línea que permiten detectar indicios de

fraude académico; según los conocimientos adquiridos en mi área de especialidad profesional certifico un alto nivel de confiabilidad de

autoridad, que cumple con los requisitos de calidad exigidos por la Universidad Central del Ecuador para efectos de visibilidad y prestigio

nacional e internacional y por lo tanto avalo la calidad de este trabajo y su inclusión en texto completo y referencial en la Colección de Trabajos

de Titulación.

AVAL DE PUBLICACIÓN EN EL REPOSITORIO DIGITAL

Nombre tutor* Dra. Marina Antonia Dona Vidale Email [email protected]

*Se aceptan firmas originales y/o digitales, tanto para autor(es) como para tutor (es), las cuales son requisitos indispensables para la entrega en Biblioteca

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