UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD …...DMQ, 11 de abril de 2017 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS CARACTERIZACIÓN

DMQ, 11 de abril de 2017

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS

CARACTERIZACIÓN BROMATOLÓGICA DE LA CÁSCARA DE

BANANO (Musa paradisiaca) Y POSTERIOR EXTRACCIÓN E

IDENTIFICACIÓN DE LA FRACCIÓN CON MAYOR ACTIVIDAD

ANTIMICROBIANA.

Trabajo de investigación presentado como requisito previo a la obtención

del título de QUÍMICA DE ALIMENTOS

Autor: Gabriela Tatiana Pilco Romero

e-mail: [email protected]

Tutor: MSc. María Lorena Goetschel Gómez


Co-tutor: Ph.D. Luis Ramos Guerrero


ii

DEDICATORIA

A mi padre Jorge, por ser mi ejemplo de responsabilidad, trabajo duro, constancia y

superación.

A mi madre Carmita, por ser mi apoyo incondicional, mi mejor amiga y mi sabia

consejera.

A mi hermano mayor Jorgito, por cuidar siempre de mí, por alentarme y confiar en mis

capacidades.

A mi hermano menor Alex, por todas sus travesuras, ocurrencias y alegrías.

iii

AGRADECIMIENTO

A Dios por todas las bendiciones que me ha otorgado a lo largo de mi vida

especialmente por mi familia, que ha sido, es y será mi mayor inspiración, mi apoyo, mi

fortaleza y mi alegría.

Al Dr. Luis Ramos, Director de los Laboratorios de AGROCALIDAD, por brindarme

todas las facilidades necesarias para el desarrollo del presente trabajo de investigación y

por su calidad humana, que lo hacen merecedor de mi estima y admiración.

Al personal técnico de AGROCALIDAD, especialmente a Paulette Andrade, Patricia

Obando y Jorge Irazábal, por su valioso aporte en la consecución de los objetivos de

esta investigación.

Al personal administrativo y docente de la Facultad de Ciencias Químicas, en especial a

mi tutora MSc. Lorena Goetschel y Dra. Dayana Borja así como a los miembros de mi

tribunal MSc. Anita Hidalgo y Dr. Iván Tapia, por toda su ayuda, confianza, apoyo y

amistad.

A mis queridos amigos de universidad Estefanía, Anita, Ingrid, Cristian, Alex, Jenny,

Germania, Richy, José Luis, Sofía y Carolina, por todos los momentos compartidos, por

las travesuras realizadas, por su ayuda, protección y cariño que los convirtió en mi

familia lejos de casa; a mis amigas de colegio Lorena, Nicole, Daniela y Sandy, por

enseñarme que la amistad perdura a pesar del tiempo y la distancia y a mis mejores

amigos Fernando, Antonio y Gregorio, por estar presentes en los buenos y malos

momentos, por sus consejos y todo el cariño que siempre me brindan.

De corazón, muchas gracias.

iv

v

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vii

ÍNDICE DE CONTENIDOS

INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1

CAPITULO 1

EL PROBLEMA .......................................................................................................... 2

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .............................................................................................. 2

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ................................................................................................ 4

1.2.1 Preguntas directrices. ............................................................................................... 4

1.3 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 4

1.3.1 General. .................................................................................................................. 4

1.3.2 Específicos. .............................................................................................................. 4

1.4 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA ................................................................................................ 5

CAPITULO 2

MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 7

2.1 ANTECEDENTES ................................................................................................................... 7

2.2 MARCO TEÓRICO ................................................................................................................. 8

2.2.1 Banano. ................................................................................................................... 8 2.2.1.1 Taxonomía del banano. ......................................................................................................... 8 2.2.1.2 Banano en el Ecuador. ........................................................................................................... 8 2.2.1.3 Composición del banano. ...................................................................................................... 9

2.2.2 Metabolismo de las frutas despues de la recolección. ............................................... 9

2.2.3 Análisis de los alimentos. ....................................................................................... 10 2.2.3.1 Determinación de humedad y sólidos totales. ................................................................... 10 2.2.3.2 Determinación de ceniza. .................................................................................................... 11 2.2.3.3 Determinación de grasa bruta............................................................................................. 11 2.2.3.4 Determinación de proteína. ................................................................................................ 12 2.2.3.5 Determinación de carbohidratos. ....................................................................................... 13 2.2.3.6 Determinación de fibra cruda. ............................................................................................ 13

2.2.4 Componentes químicos vegetales. .......................................................................... 14 2.2.4.1 Metabolitos secundarios. .................................................................................................... 14

2.2.5 Estudio de los constituyentes químicos de las plantas............................................. 20

2.2.6 Antibióticos. ........................................................................................................... 21 2.2.6.1 Valoraciones de antibióticos por medios microbiológicos. ............................................... 21 2.2.6.2 Resistencia a antibióticos. ................................................................................................... 23 2.2.6.3 Salud pública y la resistencia a antibióticos........................................................................ 23 2.2.6.4 Prevención y control de la resistencia a antibióticos. ........................................................ 24

2.2.8 Técnicas cromatográficas. ...................................................................................... 24 2.2.8.1 Criterios de clasificación de las técnicas cromatográficas. ................................................ 25 2.2.8.2 Cromatografía líquida. ......................................................................................................... 25 2.2.8.3 Cromatografía de gases. ...................................................................................................... 26 2.2.8.4 Cromatografía de fluidos supercríticos. .............................................................................. 29

2.3 MARCO LEGAL ................................................................................................................... 30

2.4 HIPÓTESIS ......................................................................................................................... 30

viii

2.5 CONCEPTUALIZACIÓN DE VARIABLES ........................................................................................ 31

2.5.1 Variables independientes. ...................................................................................... 31

2.5.2 Variables dependientes. ......................................................................................... 31

2.5.3 Variable de interés. ................................................................................................ 31

CAPITULO III

MARCO METODOLÓGICO ................................................................................... 32

3.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ................................................................................................ 32

3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA........................................................................................................ 32

3.3 MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................................... 32

3.3.1 Materiales. ............................................................................................................. 33 3.3.1.1 Equipos. ............................................................................................................................... 34 3.3.1.2 Reactivos. ............................................................................................................................ 34

3.3.2 Métodos. ................................................................................................................ 36 3.3.2.1 Muestreo. ............................................................................................................................. 36 3.3.2.2 Análisis bromatológico. ....................................................................................................... 36 3.3.2.3 Extracción. ............................................................................................................................ 36 3.3.2.4 Ensayo de actividad antimicrobiana. .................................................................................. 37 3.3.2.5 Fraccionamiento. ................................................................................................................. 38 3.3.2.6 Tamizaje Fitoquímico. .......................................................................................................... 39

3.4 DISEÑO EXPERIMENTAL ........................................................................................................ 43

3.5 MATRIZ DE OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES ........................................................................ 43

3.6 TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS .............................................................. 44

3.7 TÉCNICAS DE PROCESAMIENTO DE INFORMACIÓN Y ANÁLISIS DE DATOS ............................................ 45

CAPITULO IV

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ...................................................... 49

4.1 MUESTREO .................................................................................................................... 49

4.2. ANÁLISIS BROMATOLÓGICO ................................................................................................. 49

4.3. EXTRACCIÓN ..................................................................................................................... 53

4.4. ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA................................................................................. 54

4.5. FRACCIONAMIENTO ............................................................................................................ 57

4.6. TAMIZAJE FITOQUÍMICO ...................................................................................................... 60

CAPITULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES........................................................ 66

5.1. CONCLUSIONES ................................................................................................................. 66

5.2. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 67

BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................ 68

ANEXOS ..................................................................................................................... 72

ANEXO 1. DIAGRAMA DE ISHIKAWA (ESPINA DE PEZ) ................................................................... 72

ANEXO 2. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO EXPERIMENTAL ........................................................ 73

ANEXO 3. VALORES CRÍTICOS DE F PARA UN CONTRASTE DE UNA COLA (P=0,05) ............................... 74

ANEXO 4. TABLA DE RANGOS ESTUDENTIZADOS SIGNIFICATIVOS PARA UN NIVEL DEL 0,05% ................ 75

ANEXO 5. FOTOGRAFÍAS DEL PROCESO DE RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PREVIO AL

ANÁLISIS BROMATOLÓGICO ...................................................................................... 76

ANEXO 6. FOTOGRAFÍAS DEL PROCESO DE PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Y OBTENCIÓN DE EXTRACTOS .... 77

ix

ANEXO 7. FOTOGRAFÍAS OBTENIDAS DURANTE LOS ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO

CRUDO ................................................................................................................ 78

ANEXO 8. IMÁGENES OBTENIDAS DURANTE EL TAMIZAJE FITOQUÍMICO Y CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA 80

ANEXO 9. PATRONES ESTÁNDAR DEL HALO DE INHIBICIÓN PARA ESTAFILOCOCOS, PUNTOS DE CORTE

EQUIVALENTE A LA CMI Y DIÁMETRO DEL HALO DE INHIBICIÓN PARA LA CEPA STAPHYLOCOCCUS

AUREUS ATCC 25923 EMPLEADO COMO CONTROL DE CALIDAD. ...................................... 81

ANEXO 10. PATRONES ESTÁNDAR DEL HALO DE INHIBICIÓN, PUNTOS DE CORTE EQUIVALENTE A LA CMI PARA

ENTEROBACTERIAS Y DIÁMETRO DEL HALO DE INHIBICIÓN PARA LA CEPA ESCHERICHIA COLI ATCC

25922 EMPLEADO COMO CONTROL DE CALIDAD. .......................................................... 82

ANEXO 11. IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LA ESPECIE DE BANANO ESTUDIADA ................................ 83

ANEXO 12. TABLAS DE IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS FLAVONOIDES ............................................ 84

ANEXO 13. INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS PARA EL ANÁLISIS BROMATOLÓGICO. .................. 86

ANEXO 14. INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD

ANTIMICROBIANA. ................................................................................................. 88

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Clasificación de las especies de banano y plátano. ................................................................... 8

Figura 2. Unidades estructurales de los metabolitos secundarios. ......................................................... 15

Figura 3. Origen de metabolitos secundarios a partir del metabolismo primario ................................... 15

Figura 4. Monoterpenos de diferente estructura. ................................................................................... 16

Figura 5. Ejemplo de sesquiterpenos más comunes. ............................................................................... 16

Figura 6. Estructura química del diterpeno Fitol. .................................................................................. 16

Figura 7. Estructura de los triterpenos y esteroides. .............................................................................. 17

Figura 8. Estructura química de carotenoides comunes. ........................................................................ 17

Figura 9. Estructura química del resveratrol. ........................................................................................ 18

Figura 10. Ejemplo de la estructura del ácido tánico. ............................................................................ 18

Figura 11. Producción de hormonas a partir de sapogeninas esteroidales............................................. 19

Figura 12. Estructura de glicósidos cardiotónicos en función de sus agliconas. .................................... 19

Figura 13. Estructura de protoalcaloides. ............................................................................................. 19

Figura 14. Estructura de alcaloides verdaderos. ................................................................................... 20

Figura 15. Estructura del pseudoalcaloide aconitina. ............................................................................ 20

Figura 16. Técnicas de validación de antibióticos por medios microbiológicos. .................................... 22

Figura 17. Mecanismo de interacción presentes en cromatografía líquida. ............................................ 26

Figura 18. Diagrama de bloques de un cromatógrafo de gases típico. ................................................... 27

Figura 19. Proceso de ionización y fragmentación por impacto electrónico. ......................................... 28

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Composición proximal del banano en base húmeda ................................................................... 9

Tabla 2. Aparición de resistencia luego de la introducción del antimicrobiano para uso clínico ............ 23

Tabla 3. Tipos de detectores para cromatografía de gases y sus aplicaciones ........................................ 28

Tabla 4. Ensayos específicos para la detección de grupos fitoquímicos en las fracciones generadas a

través del primer método de extracción ................................................................................................. 39

x

Tabla 5. Ensayos específicos para la detección de grupos fitoquímicos en las fracciones generadas a

partir del extracto crudo ........................................................................................................................ 40

Tabla 6. Criterios de interpretación de pruebas cualitativas .................................................................. 42

Tabla 7. Fases móviles y reveladores a utilizar en la cromatografía de capa fina. ................................. 42

Tabla 8. Factores de estudio y niveles ................................................................................................... 43

Tabla 9. Matriz de operacionalización de variables ............................................................................... 44

Tabla 10. Resultados obtenidos de la determinación de humedad y sólidos totales ................................ 49

Tabla 11. Resultados obtenidos de la determinación de grasa ............................................................... 50

Tabla 12. Resultados obtenidos de la determinación de proteína ........................................................... 50

Tabla 13. Resultados obtenidos de la determinación de cenizas ............................................................. 51

Tabla 14. Resultados obtenidos de la determinación de fibra cruda. ...................................................... 51

Tabla 15. Resultados obtenidos de la determinación de carbohidratos totales ....................................... 52

Tabla 16. Resultados generales del análisis bromatológico de la cáscara de banano ............................ 52

Tabla 17. Composición porcentual de los sólidos totales presentes en la cáscara de banano ................. 53

Tabla 18. Datos generados durante el primer método de extracción ...................................................... 53

Tabla 19. Datos generados durante el proceso de extracción según el segundo método ......................... 53

Tabla 20. Datos correspondientes a las concentraciones del extracto madre usado ............................... 54

Tabla 21. Hipótesis propuestas para la evaluación del efecto de las concentraciones del extracto crudo

sobre la inhibición del crecimiento de las bacterias de interés. .............................................................. 54

Tabla 22. ANOVA de los datos obtenidos del ensayo de actividad antimicrobiana de las diferentes

concentraciones del extracto madre ....................................................................................................... 55

Tabla 23. Pruebas de Múltiple Rangos para Diámetro de inhibición por Concentraciones .................... 56

Tabla 24. Datos correspondientes al fraccionamiento del extracto madre ............................................. 57

Tabla 25. Hipótesis propuestas para la evaluación del efecto de las diferentes fracciones sobre la

inhibición del crecimiento de las bacterias de interés. ........................................................................... 58

Tabla 26. ANOVA de los datos obtenidos del ensayo de actividad antimicrobiana de las diferentes

fracciones .............................................................................................................................................. 58

Tabla 27. Pruebas de Múltiple Rangos para Diámetro de inhibición por Fracciones ............................. 59

Tabla 28. Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico de las fracciones obtenidas por el primer

método de extracción ............................................................................................................................. 61

Tabla 29. Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico de las fracciones obtenidas por el segundo

método de extracción ............................................................................................................................. 62

Tabla 30. Resultados obtenidos de la cromatografía de capa fina .......................................................... 64

Tabla 31. Rf obtenidos de la cromatografía de capa fina ....................................................................... 64

ÍNDICE DE GRÁFICAS

Gráfica 1. Distribución de las medias de las mediciones de los halos de inhibición en función de la

concentración del extracto etanolico crudo….…………………………………………………………………..57

Gráfica 2. Distribución de las medias de las mediciones de los halos de inhibición en función de las

fracciones obtenidas del extracto crudo…. …………………………………………………………….………..60

ÍNDICE DE ECUACIONES

Ecuación 1. Determinación del porcentaje de humedad ......................................................................... 11

xi

Ecuación 2. Determinación del porcentaje de humedad ......................................................................... 11

Ecuación 3. Determinación del porcentaje de sólidos totales ................................................................. 11

Ecuación 4. Determinación del porcentaje de ceniza ............................................................................. 11

Ecuación 5. Determinación del porcentaje de grasa .............................................................................. 12

Ecuación 6. Determinación del porcentaje de proteína .......................................................................... 12

Ecuación 7. Determinación del porcentaje de carbohidratos por diferencia .......................................... 13

Ecuación 8. Determinación del porcentaje de fibra ............................................................................... 14

Ecuación 9. Ecuación para el cálculo de la media aritmética ................................................................ 45

Ecuación 10. Ecuación para el cálculo de la varianza ........................................................................... 45

Ecuación 11. Ecuación para el cálculo de la desviación estándar ......................................................... 45

Ecuación 12. Ecuación para el cálculo del coeficiente de variación ...................................................... 46

Ecuación 13. Ecuación para el cálculo de la razón F ............................................................................ 46

Ecuación 14. Hipótesis nula correspondiente al factor de estudio A . .................................................... 46

Ecuación 15. Hipótesis alternativa correspondiente al factor de estudio A ............................................ 46

Ecuación 16. Hipótesis nula correspondiente al factor de estudio B ...................................................... 47

Ecuación 17. Hipótesis alternativa correspondiente al factor de estudio B ............................................ 47

Ecuación 18. Hipótesis nula correspondiente al efecto de la interacción entre factores ......................... 47

Ecuación 19. Hipótesis alternativa correspondiente al efecto de la interacción entre factores ............... 47

Ecuación 20. Determinación del número de comparaciones necesarias para la prueba Tukey............... 47

Ecuación 21. Determinación del error estándar. ................................................................................... 47

Ecuación 22. Cálculo de la diferencia mínima significativa (DMS)........................................................ 48

xii

Tema: “Caracterización bromatológica de la cáscara de banano (Musa paradisiaca) y

posterior extracción e identificación de la fracción con mayor actividad antimicrobiana”,

Autor: Gabriela Pilco Romero

Tutor: MSc. Lorena Goetschel

RESUMEN

El presente trabajo de investigación tuvo como finalidad caracterizar la cáscara de banano

Musa paradisiaca mediante el análisis de su composición bromatológica así como

identificar las fracciones responsables de su actividad antimicrobiana. El análisis

bromatológico se realizó en base húmeda y se determinó un porcentaje de humedad del

88.94% y un 11,06% correspondiente a sólidos totales (1,55% ceniza, 0,47% grasa,

0,74% proteína, 0,87% fibra y 8,3% carbohidratos totales). Dos métodos de extracción

por maceración se llevaron a cabo sobre la cáscara seca. En el primero se usaron cuatro

solventes de polaridad creciente, éter de petróleo, cloroformo, acetato de etilo y agua, los

extractos obtenidos fueron sometidos a pruebas de tamizaje fitoquímico identificándose

la presencia de: compuestos grasos, esteroles, triterpenos, saponinas, taninos y

compuestos fenólicos. Para el segundo método se usó como solvente de extracción

alcohol etílico al 70% y el extracto obtenido se fraccionó en cinco. Ensayos de actividad

antimicrobiana por el método de difusión en agar se realizaron en Staphylococcus aureus

y Escherichia coli usando el extracto crudo y las fracciones, evidenciando una mayor

actividad en el extracto crudo con factor de concentración de 10 y en las fracciones B y

C. Ensayos cualitativos de tamizaje fitoquímico y técnicas de cromatografía en capa fina

se realizaron sobre cada fracción identificando a: esteroles, triterpenos, flavonoides,

taninos, saponinas y compuestos fenólicos como los grupos de compuestos responsables

de la actividad antimicrobiana.

Palabras claves: BANANO, EXTRACCIÓN, TAMIZAJE FITOQUÍMICO,

FRACCIONAMIENTO, ANÁLISIS BROMATOLÓGICO.

xiii

ABSTRACT

The present study aimed to characterize Musa paradisiaca banana peel by analyzing its

proximal composition as well as to identify the fractions responsible for its antimicrobial

activity. The bromatological analysis was performed on a wet basis, and a moisture

content of 88.94% and 11.06% for total solids (1,55% ash, 0,47% fat, 0,74% protein,

0,87% fiber, 8,30% total carbohydrates) were determined. Two methods of extraction by

maceration were carried out on the dried peel. In the first one, four solvents of increasing

polarity, petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and water were used, the obtained

extracts were subjected to tests of phytochemical screening identifying the presence of:

fatty compounds, sterols, triterpenes, saponins, tannins and phenolic compounds. For the

second method 70% ethyl alcohol was used as extraction solvent, the obtained extract

was fractionated in five. Tests of antimicrobial activity by diffusion agar method upon

Staphylococcus aureus and Escherichia coli were used on the crude extract and fractions,

showing a higher activity in the crude extract with a concentration factor of 10 and the

fractions B and C. Qualitative tests of phytochemical screening and thin layer

chromatography techniques were performed on each fraction identifying: sterols,

triterpenes, flavonoids, tannins, saponins and phenolic compounds as the compound

groups responsible for the antimicrobial activity.

Key words: BANANA, EXTRACTION, PHYTOCHEMICAL SCREENING,

FRACTIONATION, BROMATOLOGICAL ANALYSIS.

1

INTRODUCCIÓN

El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo realizar la caracterización

bromatológica de la cáscara de banano y posteriormente extraer e identificar la fracción

con mayor actividad antimicrobiana.

En el capítulo 1 “El Problema”, se detalla el planteamiento y se explica la

problemática que conllevó a realizar esta investigación; la formulación del problema y

por último la justificación, misma que expone la importancia que tiene este trabajo para

el bien común.

En el capítulo 2 “Marco teórico”, se exponen como antecedentes varias

investigaciones realizadas en todo el mundo sobre la cáscara de banano, su composición,

principios activos y propiedades. Adicionalmente, mediante información bibliográfica,

se profundiza el conocimiento referente al banano, análisis proximal de alimentos,

metabolitos secundarios, métodos de extracción, fraccionamiento e identificación de

principios activos, etc. También se definen las variables y se exponen las políticas y

reglamentos que rigen el desarrollo del trabajo.

En el capítulo 3 “Marco Metodológico”, se definen el tipo, nivel y paradigma de

investigación al que pertenece el presente trabajo, se describen: población muestra,

métodos y materiales que se utilizarán en la experimentación. En este capítulo también

se mencionan las variables con sus dimensiones e indicadores mediante la matriz de

operacionalización de variables.

En el capítulo 4 “Análisis y discusión de resultados”, se exponen en detalle todos

los resultados obtenidos correspondientes al análisis proximal, extracción,

fraccionamiento, tamizaje fitoquímico y ensayo de actividad antimicrobiana.

En el capítulo 5 “Conclusiones y Recomendaciones”, se resumen los resultados

obtenidos y aportes del trabajo en concordancia con los objetivos propuestos.

2

CAPITULO 1

EL PROBLEMA

1.1 Planteamiento del problema

La agricultura es un proceso mediante el cual se extraen bienes y recursos del

medio natural, constituyendo además una de las actividades primarias más importantes

del mundo, que junto con la explotación forestal, minería, caza y pesca, comprenden las

principales labores económicas de países en vías de desarrollo, en contraste con los países

desarrollados que se basan en actividades secundarias, que producen manufacturas y

demás bienes procesados, así como en las actividades terciarias que producen servicios.

(Montoya, 2012)

Tanto la producción como el consumo agrícola varían dependiendo de las zonas

geográficas, viéndose influenciadas directamente por factores como el clima,

características del suelo, disponibilidad de agua, tamaño y grado de desarrollo de una

población específica e incluso los conflictos políticos y bélicos. (Montoya, 2013)

Debido a la trascendencia de esta actividad, el hombre ha enfocado su

conocimiento de ciencia y tecnología sobre el desarrollo de técnicas y procedimientos

que permitan optimizar al máximo los cultivos realizados. La Organización de las

Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura FAO en el año 2000, a través de

su documento titulado “El Estado Actual de la Agricultura y la Alimentación” reconoce

los profundos cambios llevados a cabo en la agricultura durante los últimos cincuenta

años debido a la industrialización. El uso de maquinaria agraria de origen industrial,

fertilizantes químicos, pesticidas, insecticidas, etc. integrado con el desarrollo de nuevas

variedades de semillas de alto rendimiento han conllevado a un incremento en la tasa de

crecimiento de la producción agrícola mundial, permitiendo suplir las necesidades

emergentes durante aquellos años y convertir a países densamente poblados con graves

déficit de alimentos en productores autosuficientes. (Organización de las Naciones

Unidas para la Alimentación y la Agricultura, 2000)

De acuerdo con la información publicada por la Organización de las Naciones

Unidas para la Alimentación y la Agricultura FAO en su documento “Agricultura

mundial: hacia los años 2015/2030”, con respecto a las perspectivas futuras, la demanda

de productos agrícolas durante los próximos años a nivel mundial presentará un

crecimiento continuo, sin embargo a una velocidad menor que la observada en los últimos

decenios, lo cual se relaciona directamente con la menor tasa de crecimiento de la

población. Sin embargo, análisis detallados indican que, a escala mundial, la tierra, el

suelo y el agua existentes son suficientes y que existe igualmente suficiente potencial

para hacer crecer los rendimientos, de manera que sea factible la producción necesaria.

(Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, 2002)

3

Por lo tanto, se puede afirmar que la agricultura ha sido, es y será un pilar

importante en la historia y desarrollo del hombre, permitiéndole mejorar su calidad de

vida al constituir la principal arma mediante el cual puede hacer frente a la pobreza y al

hambre.

Miles de millones de toneladas de alimentos de origen agrícola se producen en

todo el mundo diariamente, implicando la utilización y explotación de recursos hídricos,

terrestres, energéticos y humanos, así como la generación de cantidades excesivas de

residuos de cosecha y de subproductos de procesamiento de alimentos que no son

tratados de una forma adecuada. (FAO, 2000)

Por lo tanto, el desarrollo e industrialización de la agricultura ha traído como

consecuencia el grave deterioro del medio ambiente a escala mundial (erosión del suelo,

destrucción de bosques, contaminación del agua y de la vida marina, contaminación del

aire y destrucción progresiva de la capa de ozono, etc.), cuyos efectos en la actualidad

aunque son notables y persistentes pueden ser aún reducidos y en cierta medida

controlados, pero que si no se toman las medidas necesarias para frenarlos, la perspectiva

para el hombre en años futuros será desafiante y muy poco prometedora. (Collantes,

2008)

Los subproductos agrícolas (raíces, tubérculos, hojas, cáscaras, pseudo-troncos,

productos de rechazado por maduración incompleta, etc.) como ya se mencionó se

generan constantemente en grandes cantidades. De todos los desechos solamente pocos

son los que tienen un uso definido, por ejemplo: las pastas de cártamo, soya, ajonjolí,

algodón, coco, sorgo y girasol, el pulido de arroz y los salvados de trigo y de cebada son

utilizados en la fabricación de balanceados; se pueden usar también como abono natural

o como alimento directo para el ganado. (Organización de las Naciones Unidas para la

Alimentación y la Agricultura, 2001)

Es importante notar que desafortunadamente no todas las industrias cuentan con

procedimientos e infraestructura que permitan la reutilización de estos residuos o al

menos de un tratamiento de eliminación adecuado, razón por la cual estos materiales se

convierten en focos de contaminación, ya que al ser almacenados y debido a su

composición, inician rápidamente un proceso de fermentación, permitiendo el desarrollo

de todo tipo de microorganismos y plagas, contaminando el agua e inclusive el aire

mediante los gases emitidos durante la descomposición o debido a la combustión a la

cual por lo general también pueden ser cometidos. (Organización de las Naciones Unidas

para la Alimentación y la Agricultura, 1993)

Empíricamente se conoce que muchos de los subproductos agrícolas,

considerados por la industria únicamente como desechos, tienen diferentes propiedades

que permiten su utilización en la fabricación de diferentes productos, sin embargo no

existen estudios científicos que identifiquen y respalden la presencia de estos principios

activos, por lo que su posible utilización y aprovechamiento se ve estancado.

Con los datos analizados se puede concluir que las actividades agrícolas van de

la mano del desarrollo del hombre, evolucionando con él, razón por la cual en los

4

próximos años se continuarán realizando a pesar de los posibles factores que puedan

influenciarla. La generación de subproductos crecerá a la par con la demanda de

alimentos mundial remarcando la necesidad del desarrollo de nuevos formas de

utilización que aprovechen sus propiedades funcionales, reduciendo de esa forma el

impacto ambiental que durante siglos ésta actividad ha generado.

1.2 Formulación del problema

¿Qué características bromatológicas presenta la cáscara de banano Musa

paradisiaca y cuáles son los grupos de compuestos responsables de su efecto

antimicrobiano?

1.2.1 Preguntas directrices.

¿Qué porcentaje de humedad, ceniza, grasa, fibra, sólidos totales y carbohidratos

por diferencia presenta la cáscara de banano?

¿Cómo preparar la muestra para el proceso de extracción?

¿Cómo extraer los principios activos presentes en la cáscara de banano?

¿Cómo identificar los grupos de compuestos extraídos de la cáscara de banano?

¿Cómo fraccionar el extracto crudo obtenido?

¿Cómo evaluar la actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas?

¿Cómo identificar los grupos de compuestos químicos responsables de la

actividad antimicrobiana presentes en el extracto?

1.3 Objetivos

1.3.1 General.

Realizar la caracterización bromatológica de la cáscara de banano y

posteriormente fraccionar e identificar los grupos de compuestos responsables de la

actividad antibiótica presente en el extracto.

1.3.2 Específicos.

• Determinar la composición proximal de las cáscaras de banano mediante el

cálculo del porcentaje de: sólidos totales, humedad, ceniza, grasa, fibra, proteína

y carbohidratos.

• Identificar los grupos o familias de compuestos fitoquímicos presentes en las

fracciones obtenidas por dos métodos de extracción mediante pruebas cualitativas

de tamizaje fitoquímico.

• Determinar estadísticamente la concentración del extracto etanólico crudo que

presenta un mayor efecto en la inhibición del crecimiento de los microorganismos

Staphylococcus aureus y Escherichia coli.

5

• Determinar estadísticamente las fracciones que tienen una mayor actividad

antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus y Escherichia coli.

• Identificar los grupos de compuestos fitoquímicos responsables de la actividad

antimicrobiana de las cáscaras de banano.

1.4 Justificación e importancia

La gestión de residuos inadecuada presenta consecuencias negativas sobre la

salud humana y el medio ambiente, tales como la generación de gases de efecto

invernadero; la contaminación del suelo, agua, aire; la pérdida de biodiversidad, entre

muchos otros. También conlleva importantes implicaciones sociales y económicas.

Durante la Conferencia de las Naciones Unidas sobre el Desarrollo Sostenible llevada a

cabo en 2012, en relación con el Marco decenal de programas sobre modalidades de

consumo y producción sostenibles, se estableció que:

Para lograr el desarrollo sostenible mundial deben producirse cambios fundamentales en

la manera en que las sociedades producen y consumen. Todos los países deben fomentar

modalidades de consumo y producción sostenibles (…) El apoyo a las iniciativas

regionales y nacionales es necesario para acelerar el cambio hacia un consumo y una

producción sostenibles con el fin de promover el desarrollo social y económico dentro

de la capacidad máxima de los ecosistemas; ello se logrará abordando el problema del

crecimiento económico que produce la degradación del medio ambiente y desvinculando

a uno del otro, aumentando la eficiencia y la sostenibilidad en el uso de los recursos y los

procesos de producción, y reduciendo la degradación de los recursos, la contaminación

y la generación de desechos. (Naciones Unidas, 2012)

La resistencia a los antimicrobianos (RAM) constituye una amenaza creciente

para la salud pública mundial, ésta se produce cuando un microorganismo (bacteria,

hongo, virus o parásito) muta en respuesta al uso de estos fármacos, razón por lo que las

infecciones que genera son mucho más difíciles o incluso imposibles de tratar. La

Organización Mundial de la Salud (2014) en su informe titulado “Resistencia a los

antimicrobianos: informe mundial sobre la vigilancia” establece que esta amenaza ha

dejado de ser una previsión para el futuro y es una realidad palpable que puede afectar a

cualquier persona, de cualquier edad en cualquier lugar.

Los datos del informe también revelaron que en América existe ya una elevada

resistencia de Escherichia coli a fluoroquinolonas y cefalosporinas de tercera generación,

dos tipos muy importantes y utilizados de antimicrobianos. Para el caso de K.

pneumoniae la resistencia a cefalosporinas de tercera generación también es elevada y

generalizada. En ciertas zonas, hasta un 90% de las infecciones por Staphylococcus

aureus son resistentes a la meticilina por lo que el tratamiento con los antibióticos

habituales no funciona.

Ecuador es el primer país exportador de banano de calidad a nivel mundial,

constituyendo aproximadamente el 30% de la oferta mundial y representando el 10 % de

las exportaciones totales y el segundo rubro de mayor exportación del país. (Ministerio

6

de Comercio Exterior, s.f.) Factores climáticos y geográficos propician la producción de

esta fruta en el país durante todo el año. Durante el 2013 se produjeron aproximadamente

5.995.527 toneladas métricas, mientras que en el 2014 la cifra ascendió a 6.907.376

toneladas, revelando la tendencia de crecimiento de producción de esta fruta para los

próximos años. (Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca, 2014)

Los subproductos obtenidos de la producción de banano constituyen una fuente

de biomasa fácilmente disponible para su utilización como materia prima en el desarrollo

de nuevos productos, otorgando así valor añadido a materiales tradicionalmente

considerados como desechos. Pectinas, celulosa, minerales, carbohidratos, colorantes

naturales, compuestos antioxidantes, aromas, etc. son varios de los muchos compuestos

que han sido identificados en las cáscaras del banano y han sido además utilizados en la

industria. Sin embargo en los últimos años, el interés en este subproducto ha crecido,

debido a que varios estudios, como los realizados por Mordi et al. (2016), Niamah (2014)

y Ravinder, Kathiresan, Sithranga, Anandhan, & Govindan (2013), han reportado la

presencia de compuestos bioactivos con actividad antimicrobiana y antifúngica.

Con los antecedentes mencionados, la importancia de este trabajo es evidente, la

producción de banano en Ecuador es continua y presenta un patrón de crecimiento en

función de los requerimientos internos y extremos, implicando de esa forma la

generación de grandes cantidades de subproductos, siendo la cáscara uno de los más

importantes y menos valorados en la industria. Un estudio a profundidad de su

composición bromatológica, actividad antimicrobiana y presencia de grupos

fitoquímicos permitirá identificar las aplicaciones potenciales y nuevas opciones de

utilización de la cáscara de banano que es tradicionalmente considerada como desecho.

Adicionalmente se reducirá la generación de residuos y se promoverá una producción de

la industria enmarcada en lo propuesto por las Naciones Unidas en relación al Desarrollo

sostenible; y, se vislumbrará una posible alternativa en lo referente al uso de antibióticos

de origen natural en respuesta a la resistencia bacteriana, conllevando impactos sobre el

aspecto social y económico del país.

7

CAPITULO 2

MARCO TEÓRICO

2.1 Antecedentes

Alrededor de todo el mundo existe un interés creciente en los subproductos de

cosecha y su posible utilización en diferentes campos de la industria. Scott, Hoe, Fook,

& Mohd, (2012) establecieron que los subproductos del banano (rizomas, pseudo-tallos,

hojas, cáscaras, etc) constituyen fuentes de biomasa renovable, con un gran potencial de

aplicación, resaltando además su contenido de compuestos naturales bioactivos.

Niamah (2014) extrajo los compuestos bioactivos presentes en la cáscara de

banano (Musa accuminata) mediante el uso de 6 solventes diferentes (acetona, metanol,

etanol, etil acetato, benceno y agua), identificando la presencia de compuestos fenólicos,

flavonoides, saponinas y glicósidos en los diferentes extractos; sin embargo, el metanol

y el etanol presentaron el mejor rendimiento de extracción. El extracto metanólico fue

sometido a pruebas de actividad antimicrobiana demostando su poder de inhibición frente

a levaduras, bacterias gram negativas y gram positivas. Este extracto fue analizado

mediante GC-MS, identificandose los compuestos bioactivos como pirogalol, ácido

pentadecanóico, ácido benzóico, ácido octadecanóico, cis-9-hexadecenal y cis-9-ácido

hexadecenóico.

Waghmare y Kurhade (2014) identificaron los posibles compuestos bioactivos

presentes en la cáscara de banano (Musa sapientum), obtenidos del extracto etanólico,

mediante el uso de GC-MS. fueron identificados 8 compuestos entre los cuales se

encuentran: estragol, ester etílico del ácido hexadecanóico, epicatequina, galocatequina,

éster etílico del ácido p-cumárico, éster (2-etilhexil) 1,2 ácido benzendicarboxílico, β-

tocoferol y vitamina E.

Mordi et al. (2016) centraron su investigación en 2 variedades de banano Nigeria

(Musa paradisiaca colla y Musa sapientum), a los cuales sometieron a un proceso de

extracción con metanol y a un posterior análisis fitoquímico, el cual reveló la presncia de

esteroides, saponinas, terpenoides, antraquinonas y taninos. Estudios de actividad

antimicrobiana fueron realizados demostrando la efectividad de los extractos frente a

varias bacterias. Mediante GC-SM se identificaron 14 compuestos en cada extracto, sin

embargo los compuestos ciclododecano, dibutilphtalato y β-sitosterol estuvieron

presentes en Musa sapientum,y, los compuestos 2-metil-5-(1-metiletil) fenol, 3,5-

dihidro-2-metil-4H-piron-4-ona, sesamina y su isómero solo se presentaron en Musa

paradisiaca colla.

En conclusión, existen muchas investigaciones realizadas en base a la cáscara de

banano, sin embargo no se dispone de datos correspondientes a la composición proximal

8

de este subproducto, adicionalmente los grupos de compuestos químicos bioactivos que

le otrogan su característica antimicrobiana no han sido especificados claramente.

2.2 Marco Teórico

2.2.1 Banano.

El banano constituye el fruto de la planta herbácea perenne gigante conocida

comúnmente como platanero, el cual puede crecer en diferentes tipos de suelos y climas,

siendo el clima húmedo tropical el mas apropiado para su producción, la cual se lleva a

cabo durante todo el año. Esta fruta tropical es de origen asiático y aunque no se conoce

exactamente se estima que existen alrededor de 1000 especies diferentes. El banano

constituye además la fruta mas popular en el mundo, siendo producida en mas de 150

países, adicionalmente, según la FAO, el banano es el cuarto cultivo alimenticio mas

importante del planeta, despues del trigo, arroz y maiz.

2.2.1.1 Taxonomía del banano.

Existen muchos sistemas de clasificación del banano, sin embargo el más usado

en la actualidad es el propuesto por Simmonds y Shepherd en 1955, el cual divide el

banano en grupos genómicos en función de la contribución de las especies ancestrales,

Musa paradisiaca y Musa balbisiana, y en subgrupos de cultivares que están

relacionados entre sí a través de mutaciones somáticas. (ProMusa, 2016).

Figura 1. Clasificación de las especies de banano y plátano.

Fuente: Instituto de Promoción de Exportaciones e Inversiones (2013)

2.2.1.2 Banano en el Ecuador.

El cultivo de banano en Ecuador se ve favorecido por las condiciones geográficas

y climáticas, que junto con las tecnologías de producción empleadas, han convertido a

este país en el principal exportador de banano de calidad a nivel mundial.

9

De acuerdo con el Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuicultura y Pesca, la

producción de banano ocupa aproximadamente el 10% de la superficie total agrícola en

el país, actividad que se concentra principalmente en las provincias de Los Ríos, El Oro

y Guayas.

Con respecto a la estructura productiva hasta el 2014, el 95% de los productores

son pequeños y medianos (menor a 30 y 100 hectáreas respectivamente), mientras que el

5% corresponde a grandes productores (mayor de 100 hectáreas). Casi la totalidad de los

productores son nacionales, mientras que solo un pequeño porcentaje corresponde a

empresas transnacionales. (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la

Alimentación, 2004).

2.2.1.3 Composición del banano.

El banano, debido a su facilidad de consumo, aroma, sabor y textura, se encuentra

entre las frutas más consumidas en todo el mundo. Desde el punto de vista nutricional,

esta fruta ofrece gran variedad de beneficios para la salud y por ende su consumo es

ampliamente recomendado. La Tabla 1 expone la composición proximal del banano. Su

contenido de fibra ayuda a mantener una correcta digestión y la cantidad de minerales

presentes, especialmente potasio y magnesio, protege el sistema cardiovascular. También

es importante su aporte de aminoácidos especialmente el triptófano, de vitaminas como

la A y B6 y de compuestos fenólicos que actúan como antioxidantes.

Tabla 1

Composición proximal del banano en base húmeda

Nutriente Unidad Valor por 100 g

Agua g 74,91

Energía kcal 89

Energía J 371

Proteína g 1,09

Lípidos totales (grasas) g 0,33

Ceniza g 0,82

Carbohidratos por diferencia g 22,84

Fibra dietética total g 2,6

Azúcares totales g 12,23

Tomado de United States Department of Agriculture (2016)

2.2.2 Metabolismo de las frutas despues de la recolección.

Las frutas aún después de ser recolectadas continúan respirando y desarrollando

actividades metabólicas, obteniendo la energía necesaria a partir de la oxidación de los

azúcares y otros sustratos como los ácidos orgánicos. El conocimiento de estos procesos

permite predecir los cambios que ocurrirán durante los procesos de almacenaje,

transporte y comercialización de las frutas, otrogando además una guía para el desarrollo

de técnicas para una adecuada conservación.

10

La intensidad de la respiración se mide a través de la producción de dióxido de

carbono por kilogramo de fruta y por hora y constituye además un buen índice del tiempo

que dicha fruta puede ser conservada después de ser recolectada. En función del patrón

de respiración y la producción de etileno las frutas pueden clasificarse en: climatéricas y

no climatéricas. Las frutas climatéricas sufren una maduración poscocecha caracterizada

por un aumento mas o menos rápido de la intensidad respiratoria y de la producción de

etileno, conocido como el pico climatérico, después del cual éstos niveles disminuyen,

ejemplos de estas frutas son: banano, manzana, aguacate, chirimoya, mango, papaya. En

cambio las frutas no climatéricas presentan un descenso contínuo de la intensidad

respiratoria, como: uvas, piña, fresa, naranja.

Muchos cambios metabólicos se llevan acabo durante el proceso de maduración,

varios de los cuales son perceptibles mediante los sentidos como el color, textura, aroma,

sabor, astringencia, dulzor, etc. Por ejemplo, durante la maduración los niveles de

azúcares reductores aumentan debido a la hidrólisis del almidón, el contenido de pectina

soluble aumenta lo que conlleva a una reducción de la consistencia, el contenido de

ácidos orgánicos alifáticos y fenólicos así como el de taninos disminuye al igual que la

astringencia, el contenido de compuestos volátiles aumenta al igual que el aroma

característico de las frutas y existe además una reducción del contenido de clorofila y el

desarrollo de pigmentos carotenoides o antocianos (dependiendo de la fruta). (Yúfera,

1998)

2.2.3 Análisis de los alimentos.

El análisis de la composición química y propiedades físicas de los alimentos

permite identificar su valor nutricional, sus características funcionales y su aceptabilidad.

El análisis químico constituye además una herramienta importante en los programas de

garantía de calidad en el procesamiento de los alimentos, desde el control de las materias

primas hasta el producto terminado. Es igualmente necesario en la formulación de nuevos

productos, en la evaluación de nuevos procesos de producción e inclusive en la

identificación del origen de problemas en el caso de productos inaceptables.

Los ensayos convencionales generalmente realizados permiten identificar grupos

de componentes afines (grasas, proteínas, fibra, cenizas, sólidos totales, etc.), es

importante notar que en función de la naturaleza de la muestra así como el objetivo con

el cual la información será utilizada los procedimientos pueden ser adecuados o

modificados.

2.2.3.1 Determinación de humedad y sólidos totales.

La determinación de la cantidad de agua presente en un alimento constituye uno

de los ensayos más importantes a ser realizados, ya que se relaciona con la actividad de

agua, la cual a su vez determina la estabilidad y calidad del alimento.

El agua en los alimentos puede presentarse en diversas formas: agua libre, agua

absorbida o agua de hidratación, cada una de las cuales presenta un diferente nivel de

11

dificultad para ser eliminada, razón por la cual los métodos a usar deben ser oficiales con

procedimientos establecidos y validados.

El método de desecación por estufa es el más comúnmente utilizado, en éste la

muestra es calentada bajo condiciones especificadas y se utiliza la pérdida de peso para

determinar el contenido de humedad, mientras que la materia remanente es considerada

como sólidos totales, las Ecuaciones 1, 2 y 3 resumen este proceso. (Nielsen, 2009)

%𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 =𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝐻2𝑂 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑎𝑥100 (Ecuación 1)

%𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 =(𝐴+𝑀)−𝐵

𝑀𝑥100 (Ecuación 2)

%𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 = 100 − %𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 (Ecuación 3)

Dónde: A= peso en gramos de cápsula vacía

M= peso en gramos de muestra

B= peso en gramos de la cápsula más la muestra seca

2.2.3.2 Determinación de ceniza.

El método se fundamenta en la eliminación de la materia orgánica presente en

una muestra mediante calcinación u oxidación completa, permitiendo de esta forma la

obtención de un residuo inorgánico o ceniza. Dependiendo de los objetivos del análisis,

se pueden llevar a cabo dos tipos de calcinaciones: por vía seca (para determinar la

composición inmediata y para análisis de elementos inorgánicos específicos) y por vía

húmeda (oxida la materia orgánica mediante el uso de ácidos y evita la volatilización de

elementos como Fe, Se, Pb y Hg).

La calcinación por vía seca permite alcanzar temperaturas de 500-600°C

mediante el uso de una mufla, de esta manera el agua y las sustancias volátiles se

vaporizan mientras que los componentes orgánicos son incinerados generando dióxido

de carbono y óxidos de nitrógeno. Los elementos minerales son convertidos en óxidos,

sulfatos, fosfatos, cloruros y silicatos. (Nielsen, 2009)

La Ecuación 4 expresa la forma de calcular el contenido de ceniza.

%𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 =𝐵−𝐴


Dónde: A= peso en gramos del crisol vacía


B= peso en gramos del crisol con la muestra calcinada

2.2.3.3 Determinación de grasa bruta.

Los lípidos constituyen un amplio grupo de compuestos químicos que presentan

propiedades comunes y similitudes en su estructura. Existen lípidos simples (grasas,

ceras), lípidos complejos (fosfolípidos, cerebrósidos y esfingolípidos) y lípidos derivados

(ácidos grasos, alcoholes de cadena larga, esteroles, hidrocarburos, vitaminas

12

liposolubles, etc.) los cuales pueden o no presentarse en diferentes proporciones en un

mismo alimento.

La cantidad de lípidos en un alimento es determinado mediante procesos de

extracción con solventes, cuya exactitud depende de la solubilidad que presenten los

lípidos en el disolvente elegido y de la capacidad de separar y extraer los líquidos

presentes en complejos macromoleculares. Previo a la extracción, es importante eliminar

el agua presente en la muestra, ya que puede reducir la eficiencia del proceso.

El método de extracción en continuo con solventes es el más ampliamente

utilizado debido a que presenta ventajas como mayor rapidez y eficiencia en comparación

con los métodos de extracción semicontinuos. Mediante este método el solvente,

proveniente de un matraz de ebullición, fluye sobre la muestra contenida en un cartucho

de extracción. El contenido de grasas del alimento se calcula mediante la pérdida de peso

de la muestra o mediante el peso de las grasas extraídas. (Nielsen, 2009)

Mediante el uso de la Ecuación 5 es posible relacionar la cantidad de grasa

extraída con el peso total del alimento, expresando el resultado como porcentaje:

%𝐺𝑟𝑎𝑠𝑎 =𝐵−𝐴


Dónde: A= peso en gramos del vaso vacío.

M= peso en gramos de muestra.

B= peso en gramos del vaso con el residuo de grasa.

2.2.3.4 Determinación de proteína.

Las proteínas son compuestos químicos de estructura compleja y peso molecular

por lo general alto, siendo los aminoácidos sus unidades estructurales. En estas

biomoléculas el nitrógeno constituye el componente más representativo, lo cual ha

permitido el desarrollo de métodos que estiman la cantidad de proteína de un alimento

específico al relacionarlo con el contenido de nitrógeno total mediante un factor

dependiente de la naturaleza del mismo.

El método oficial Kjeldahl se fundamenta en la conversación de todo el nitrógeno

orgánico presente en un alimento en sulfato de amonio, mediante un proceso de digestión

con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. Posteriormente el digerido es

neutralizado con álcali y destilado sobre una solución de ácido bórico. Los iones borato

resultantes son titulados usando ácido valorado y cada mili equivalente (mEq) de titulante

equivale a 14 mg de nitrógeno presentes, como se observa en la Ecuación 6.

En término general, las proteínas contienen un 16% de nitrógeno en su estructura,

por lo tanto se utiliza 6,25 (100/16) como factor de conversión a proteínas, sin embargo

para ciertos alimentos (trigo, arroz, productos lácteos, semillas oleaginosas, etc.) dicha

proporción es mejor conocida, generando factores específicos. (Yúfera, 1998)

%𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 =𝑁𝐻𝐶𝑙∗(𝑉𝑚−𝑉𝑏)∗0,014∗ƒ


13

Dónde: 𝑁𝐻𝐶𝑙= normalidad del ácido clorhídrico valorado (aprox. 0,1N)

𝑉𝑚= volumen de HCl valorado consumido por la muestra

𝑉𝑏= volumen de HCl valorado consumido por el blanco


ƒ= factor de conversión de porcentaje de nitrógeno a porcentaje de

proteína, dependiente del tipo de alimento.

Pese a que este método tiene la desventaja de medir el nitrógeno total, no solo el

proveniente de las proteínas, presenta ventajas como: aplicabilidad a todo tipo de

alimentos, exactitud, precisión y sensibilidad. (Nielsen, 2009)

2.2.3.5 Determinación de carbohidratos.

Los carbohidratos son compuestos ampliamente distribuidos en plantas y

animales, se caracterizan por: presentar funciones estructurales así como metabólicas y

constituir la principal fuente de energía de los alimentos. En función de su estructura

pueden ser clasificados como: monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y

polisacáridos. Los monosacáridos son los únicos carbohidratos que pueden ser

absorbidos directamente en el intestino delgado ya que los sacáridos superiores necesitan

ser hidrolizados a monosacáridos previo a su absorción.

Existen diferentes métodos utilizados para la determinación de hidratos de

carbono, muchos de los cuales son específicos para un alimento en particular debido a su

naturaleza o su composición, entre los más usados se encuentran: ensayos cualitativos y

cuantitativos de color para la identificación de azúcares reductores, métodos enzimáticos,

cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía de gases de los azúcares

derivatizados, entre otros.

Sin embargo, la United States Food and Drug Administration en su reglamento

para el etiquetado nutricional de los alimentos establece que el contenido total de

carbohidratos debe ser calculado por diferencia, es decir que constituye el resultado de

la sustracción de las sumas de los pesos de la humedad, ceniza, proteína y grasa del peso

total del alimento. Mediante la Ecuación 7 se puede determinar el contenido de

carbohidratos en forma de porcentaje.

%𝐶𝑎𝑟𝑏𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠 = 100 − (𝐴 + 𝐵 + 𝐶 + 𝐷) (Ecuación 7)

Dónde: A= porcentaje de humedad

B= porcentaje de cenizas

C= porcentaje de proteína

D= porcentaje de grasa

2.2.3.6 Determinación de fibra cruda.

El término fibra abarca un grupo amplio de carbohidratos que se caracteriza por

ser no digerible. Esos carbohidratos por lo general son de tipo estructural, entre los que

se encuentran: celulosa, hemicelulosa y lignina. (Nielsen, 2009)

14

El método se fundamenta en la eliminación progresiva de los carbohidratos

solubles mediante un tratamiento continuo con ácido y álcali a una muestra a la que

previamente se debió eliminar su contenido de agua y de grasa para evitar interferencias.

Como resultado se obtiene únicamente la fibra cruda o insoluble, así como también

componentes minerales, razón por lo cual, para corregir los resultados es necesario

incinerar la muestra y descontar el aporte de las cenizas, dicho procedimiento puede ser

expresado mediante la Ecuación 8:

%𝐹𝑖𝑏𝑟𝑎 =(𝐷−𝐶)−(𝐹−𝐸)


Dónde: C= peso en gramos del filtro

D= peso en gramos del filtro más fibra

E= peso en gramos del crisol

F= peso en gramos del crisol más ceniza


2.2.4 Componentes químicos vegetales.

Las plantas, como todo organismo vivo, llevan a cabo de forma constante

procesos de síntesis y degradación de biomoléculas o metabolitos que les permiten

mantener un estado de equilibrio u homeostasis. Estos componentes químicos vegetales

pueden ser clasificados en primarios o secundarios.

Los metabolitos primarios son esenciales para el funcionamiento de la materia

viva, se encuentran directamente relacionados con el crecimiento, desarrollo y

reproducción normal y son: hidratos de carbono, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos.

Los metabolitos secundarios, llamados también productos naturales, no se

encuentran relacionados en ninguno de los procesos vitales, de hecho muchos de ellos

constituyen desechos del metabolismo. Sin embargo, las plantas los utilizan por lo

general para interactuar con el medio, ya sea para atraer polinizadores, alejar

depredadores, adaptarse a condiciones adversas de clima o suelo, etc. ejemplo de estos

compuestos son los pigmentos carotenoides. Los caminos de síntesis y utilización de

estos compuestos constituyen el metabolismo secundario.

2.2.4.1 Metabolitos secundarios.

Existen 4 compuestos fundamentales de partida, precursores o “building blocks”,

los cuales se exponen en la Figura 2, que al intervenir en diferentes rutas metabólicas

secundarias originadas del metabolismo primario del carbono, expuesto en la Figura 3,

generan los denominados productos naturales, diferenciables entre sí principalmente por

su estructura y propiedades. La acetilcoenzima A constituye el precursor de los ácidos

grasos, eicosanoides, poliacetilenos, policétidos macrocíclicos y aromáticos. A partir del

mevalonato se forman los terpenos (carotenoides, esteroides, etc), mientras que a partir

del anión shikamato se forman los compuestos aromáticos (polifenoles, ácidos

cinámicos, aminoácidos aromáticos, etc.). En cambio los compuestos alcaloides se

15

generan a partir de diferentes aminoácidos. (Claramunt, Farrán, López, Pérez, & Santa

María, 2013).

Figura 2. Unidades estructurales de los metabolitos secundarios.

Fuente: Claramunt, Farrán, López, Pérez, & Santa María (2013)

Figura 3. Origen de metabolitos secundarios a partir del metabolismo primario.

Fuente: Claramunt, Farrán, López, Pérez, & Santa María (2013)

Los metabolitos secundarios pueden ser agrupados de la siguiente manera:

a) Terpenos: constituyen la más larga y diversa clase de productos naturales que

se encuentran en plantas así como en ciertos animales. Se forman a partir de

unidades de isopreno (cadena de 5 carbonos), razón por la cual se los puede

clasificar dependiendo del número presente en la estructura.

16

- Monoterpenos: formado por el acoplamiento de dos unidades de isopreno,

pueden presentar: estructura regular (constituyen generalmente los aceites

esenciales), estructura irregular (forman piretrinas y ciertos aceites esenciales)

y estructura ciclada en metilciclopentano (forman iridoides). La Figura 4

muestra tres monoterpenos de diferente estructura.

Figura 4. Monoterpenos de diferente estructura.

Fuente: Bruneton (2001)

- Sesquiterpenos: son compuestos formados por 15 átomos de carbono que

presentan una gran diversidad estructural debido a la facilidad que tienen de

sufrir reacciones de oxidación, reagrupamiento, ciclaciones intermoleculares,

entre otras. Estos compuestos pueden encontrarse en los aceites esenciales y

desempeñan diferentes funciones, atraen o alejan insectos, interfieren en la

regulación del crecimiento, etc. La Figura 5 muestra la estructura de los

sesquiterpenos poligodial y warburganal que son conocidos por ser

antifúngicos naturales.

Figura 5. Ejemplo de sesquiterpenos más comunes.


- Diterpenos: presentan 20 átomos de carbono en su estructura y se encuentran

en insectos, animales marinos pero principalmente en plantas. La variabilidad

de las estructuras se debe a los diversos procesos de biogénesis, los cuales se

utilizan como criterios de clasificación. Pueden ser acíclicos (lineales o

presentar grupos éter o ciclo lactónico) o cíclicos (bi, tri o tetra cíclicos). La

Figura 6 muestra la estructura del fitol, diterpeno de importancia biológica

que forma parte de la clorofila e interviene en la síntesis de vitaminas.

Figura 6. Estructura química del diterpeno Fitol.

Fuente: Sarker & Nahat (2007)

17

- Triterpenos y esteroides: son compuestos químicos ciclados de 30 átomos de

carbono, generalmente hidroxilados que presentan una gran unidad

estructural diferenciable por conformaciones y configuraciones, tal como se

puede apreciar en la Figura 7. Los esteroides pueden ser considerados como

triterpenos tetracíclicos carentes de por lo menos tres grupos metilo. Son

metabolitos secundarios de gran interés a nivel industrial por sus particulares

propiedades terapéuticas.

Figura 7. Estructura de los triterpenos y esteroides.


- Carotenoides: moléculas tetraterpénicas generadas por el acoplamiento de 8

unidades isoprénicas permitiendo a su vez la formación de un grupo

cromóforo de al menos 10 enlaces dobles conjugados, lo cual explica su

sensibilidad a la oxidación y sus coloraciones características. Si en la

molécula existen grupos hidroxilo se le denomina xantofila, si en cambio la

molécula es completamente hidrocarburo se le denomina caroteno. La Figura

8 muestra la estructura del licopeno, carotenoide característico de los tomates,

y del β-caroteno, abundante en la zanahoria.

Figura 8. Estructura química de carotenoides comunes.


b) Compuestos fenólicos: son un grupo muy amplio que abarca desde moléculas

sencillas como los ácidos fenólicos hasta polímeros complejos como los

taninos, se caracterizan por poseer en su estructura un anillo aromático así

como uno o más grupos hidroxilo de reacción ácida. Estos compuestos son

sintetizados mediante la ruta metabólica del ácido shikímico, en la cual se

forman los aminoácidos aromáticos que constituyen sus precursores. Los

compuestos fenólicos se agrupan dependiendo su abundancia en:

- Compuestos fenólicos simples: abarcan a su vez a 3 grupos específicos que

son fenilpropanoides simples (anillo fenilo unido a una cadena lateral de 3

átomos de carbono), cumarinas (anillo fenilo unido a una cadena lateral que

forma un anillo o lactona) y derivados del ácido benzoico.

18

- Flavonoides: estructuralmente están formados por 2 anillos aromáticos unidos

por una cadena de 3 átomos de carbono, la cual presenta diferentes niveles de

oxidación, criterio que ha permitido clasificar a los flavonoides en diferentes

grupos como antocianinas, flavonas, chalconas, flavanonas, flavonoides e

isoflavonas. La Figura 9 muestra la estructura del flavonoide resveratrol, cuya

presencia es característica en el vino tinto.

Figura 9. Estructura química del resveratrol.

Fuente: Cooper & Nicola (2015)

- Lignina: segunda sustancia, después de la celulosa, más abundante en las

plantas. Estructuralmente la lignina constituye un polímero heterogéneo

formado principalmente por 3 derivados fenilpropanoides que son los

alcoholes coniferílico, p-cumárico y sinapílico. No se conoce su estructura

química precisa debido a la dificultad de extracción y a que se encuentra

enlazada a moléculas como la celulosa. (Taiz & Zeiger, 2006)

- Taninos: son compuestos químicos poliméricos que se caracterizan por

formar complejos con alcaloides, iones metálicos y macromoléculas como las

proteínas. Los taninos pueden ser agrupados en 2 grandes grupos:

hidrolizables, formados por ácidos fenólicos y azúcar; y, los condensados que

son formados por varias unidades de flavonoides, no pueden ser hidrolizados

pero si oxidados. La Figura 10 muestra la estructura química del ácido tánico,

compuesto que se encuentra en varias frutas y es responsable de la sensación

de astringencia.

Figura 10. Ejemplo de la estructura del ácido tánico.

Fuente: Cooper & Nicola (2015)

c) Glucósidos: son compuestos derivados de los carbohidratos que se

caracterizan por tener un enlace glicosídico en su estructura, el cual se forma

por la condensación del grupo hidroxilo del carbono anomérico de un

monosacárido con un compuesto de diversa naturaleza llamado aglicona.

(Murray, y otros, 2010)

- Saponinas: glucósidos cuyas agliconas, llamadas también sapogeninas, se

derivan de unidades de isopreno. Existen dos tipos de sapogeninas:

esteroidales (diosgenina y hecogenina) y triterpenoidales, sin embargo las

19

primeras presentan un mayor interés en la industria debido a su uso en la

producción de hormonas sexuales como la progesterona y la cortisona, tal

como se muestra en la Figura 11.

Figura 11. Producción de hormonas a partir de sapogeninas esteroidales.

Fuente: Sarker & Nahat(2007)

- Glicósidos cardiotónicos: pueden ser clasificados en función de sus agliconas,

tal como se muestra en la Figura 12. Éstas se caracterizan por ser esteroides

con cadenas laterales que contienen un anillo lactona insaturado, ya sea una

γ-lactona (cardenolidos) o δ-lactona (bufadienolidos). Están presentes en

familias de plantas específicas, su importancia radica en el efecto que

presentan sobre la conducción atrioventricular y en la contracción miocardial.

Figura 12. Estructura de glicósidos cardiotónicos en función de sus agliconas.


d) Alcaloides: constituyen un amplio grupo de metabolitos secundarios con

actividad farmacológica que se caracterizan por contener al menos un átomo

de nitrógeno en su estructura, la cual es principalmente cíclica aunque

también alifática. Estos metabolitos son de naturaleza básica y forman sales

con ácidos minerales que son solubles en agua. Puede ser clasificados en

función de su estructura y su ruta metabólica en 3 tipos:

- Protoalcaloides: son considerados aminas simples, al igual que los alcaloides

verdaderos se forman a partir de aminoácidos, pero se diferencian en que el

átomo de nitrógeno es extracíclico (N en cadena lateral), como se muestra en

la Figura 13.

Figura 13. Estructura de protoalcaloides.

Fuente: Ringuelet (2013)

20

- Alcaloides verdaderos: se derivan de aminoácidos, presentan un nitrógeno

intracíclico y forman sales por lo general con los ácidos: acético, láctico,

tartárico, málico, oxálico, etc. La Figura 14 muestra la estructura de los

alcaloides estricnina y ajmalina, que se encuentran en la nuez vómica y en la

raíz de la Rauwolfia serpentina.

Figura 14. Estructura de alcaloides verdaderos.


- Pseudoalcaloides: Se caracterizan porque no se forman a partir de

aminoácidos, de hecho la mayoría de los pseudoalcaloides conocidos son

isoprenoides, llamados también alcaloides terpénicos. La Figura 15 muestra

la estructura de la aconitina, alcaloide proveniente del acónito, que presenta

uso terapéutico en el tratamiento de arritmias y neuralgias.

Figura 15. Estructura del pseudoalcaloide aconitina.


2.2.5 Estudio de los constituyentes químicos de las plantas.

La naturaleza ha sido la principal fuente de agentes terapéuticos desde hace miles

de años y un gran número de medicamentos actuales se han derivado de sustancias de

origen natural. Factores como el número creciente de patologías y el notable aumento de

la resistencia microbiana a los antibióticos han incrementado el interés sobre el estudio

de los productos naturales como fuentes potenciales de nuevos medicamentos a través de

tres vías:

a) Presentando actividad en un estado natural (no modificado)

b) Proporcionando compuestos promotores o ‘‘building blocks’’ para la síntesis

de compuestos mucho más complejos.

c) Indicando nuevos modos de acción farmacológica que permitan la síntesis

completa de nuevos compuestos análogos.

Solo una pequeña fracción de la biodiversidad del mundo ha sido explorada hasta

la fecha, además el desarrollo de nuevas estrategias de investigación, como los

bioensayos guiados in vitro acoplados a las técnicas básicas de extracción,

21

fraccionamiento y aislamiento, constituye una perspectiva favorable en el campo de

estudio de los productos naturales. Todos los protocolos de investigación se proponen en

función del material de estudio, no existe una técnica global, pero si procedimientos

comunes.

El método de extracción debe ser elegido en función del compuesto que se desea

obtener, es decir, si es un metabolito primario o secundario, un compuesto activo definido

o una familia de compuestos o un compuesto bioactivo totalmente desconocido. La

muestra de estudio puede ser secada o no previamente a la extracción, la cual puede

realizarse mediante: maceración, lixiviación, infusión, método Soxhlet, extracción con

fluidos supercríticos, destilación por arrastre de vapor, etc.

Un extracto crudo es literalmente una mezcla compleja de compuestos por lo que

se requieren varias técnicas de separación para aislar los compuestos de interés. Por lo

tanto un extracto crudo inicialmente debe ser separado en varias fracciones discretas de

compuestos con polaridades o tamaños moleculares semejantes. Técnicas como

separación líquido-líquido, extracción en fase sólida, o cromatografía en columna o de

exclusión, entre otras, son las más recomendadas.

El conocimiento de las características generales de la molécula a aislar, como:

solubilidad, carga, propiedades ácido-base, tamaño molecular, etc. permiten una elección

rápida y acertada del método de aislamiento. Sin embargo, cuando el compuesto

bioactivo de estudio no está identificado, es necesario realizar pruebas cualitativas

indicadoras de la presencia de familias de compuestos (alcaloides, saponinas, taninos,

ácidos fenólicos, etc.) así como pruebas analíticas cromatográficas como cromatografía

en capa fina.

2.2.6 Antibióticos.

Los antibióticos se definen como sustancias químicas de origen natural o sintético

que tienen acción inhibitoria o destructiva sobre los microorganismos y que se

caracterizan por su toxicidad selectiva, elevada potencia biológica y especificidad. Estos

compuestos presentan diferentes mecanismos de acción como: inhibir la síntesis de la

pared celular, alterar la membrana citoplasmática, interferir en la síntesis proteica,

bloquear la síntesis de ácidos nucleicos, entre otras. (Granados & Villaverde, 2003)

2.2.6.1 Valoraciones de antibióticos por medios microbiológicos.

Las valoraciones microbiológicas tienen como objetivo evaluar in vitro la

potencia o actividad de un antibiótico o sustancia activa frente uno o varios

microorganismos determinados, comparando cuantitativamente la inhibición producida

por dicha sustancia frente a un patrón o referencia, obteniendo así un valor de potencia

relativa.

Estas pruebas presentan la ventaja de ser altamente sensibles y específicas,

además permiten analizar muestras de diferente naturaleza (sustancias activas puras,

materias compuestas, extractos naturales, etc.). Adicionalmente constituyen herramientas

22

importantes en los laboratorios de microbiología clínica ya que sus resultados permiten

una correcta elección de los antibióticos a usar en el tratamiento de enfermedades

infecciosas.

Existen diferentes tipos de pruebas para valorar antibióticos, las cuales se

encuentran estandarizadas para asegurar la reproducibilidad de sus resultados, sin

embargo son dos las más utilizadas: difusión en medios gelificados o técnica en placas;

y, técnica en tubos o turbidimétrica, como se aprecia en la Figura 16. Estas pruebas se

fundamentan en: la comparación del efecto de la muestra de estudio con un patrón, la

medición del efecto inhibidor sobre el crecimiento de un microorganismo y la existencia

de una relación entre las concentraciones de la sustancia activa con las respuestas. (Cerra,

Fernández, Lagomarsino, Torno, & Zarankin)

Figura 16. Técnicas de validación de antibióticos por medios microbiológicos.

Fuente: Cerra, Fernández, Lagomarsino, Torno, & Zarankin (s.f.)

2.2.6.1.1 Métodos de difusión en medios gelificados.

Constituyen pruebas de rutina en muchos laboratorios clínicos, permiten

determinar la sensibilidad a los antibióticos en bacterias comunes de desarrollo rápido y

ciertas bacterias de requerimientos nutricionales especiales. Este método consiste en

depositar, sobre la superficie de un agar inoculado previamente, los reservorios con las

soluciones de patrón y de muestra, los cuales pueden ser: cilindros de acero inoxidable,

aisladores de porcelana, papeles de filtro o incluso perforaciones circulares realizadas en

el medio de cultivo. Una vez que entran en contacto con la superficie húmeda del agar,

las sustancias de estudio difunden radialmente formando un gradiente de concentración.

Después de 18-24 horas de incubación se miden los diámetros las zonas de inhibición

existentes alrededor de los reservorios, interpretando los resultados como sensible,

intermedio o resistente.

2.2.6.1.2 Técnica en tubos.

Permite la cuantificación de la actividad antimicrobiana in vitro, mediante la

determinación de la concentración mínima inhibitoria CMI y la concentración mínima

bactericida CMB. Este método consiste en preparar soluciones de diferente

concentración del antimicrobiano usando un medio de cultivo adecuado, las cuales, al

igual que un blanco, son inoculados con una suspensión estandarizada del

microorganismo de estudio. Los resultados son revelados después de 24 horas de

incubación, al medir la transmitancia o absorbancia de los tubos que corresponde a una

estimación del crecimiento del microorganismo.

23

2.2.6.2 Resistencia a antibióticos.

Una cepa bacteriana se define como resistente a un determinado antibiótico

cuando la concentración necesaria de dicho fármaco para lograr la inhibición es superior

a la concentración que éste puede alcanzar en el lugar de la infección. Existen dos tipos

de resistencia bacteriana, la intrínseca y la adquirida.

Resistencia intrínseca. Es inherente a especies bacterianas específicas, estos

microorganismos carecen de los sitios de acción o poseen barreras naturales que evitan

la acción de los antibióticos. Un ejemplo es la resistencia de las enterobacterias a la

penicilina G.

Resistencia adquirida. Se deben a cambios ocurridos en el material genético del

microorganismo, pueden ser modificaciones cromosómicas o extracromosómicas. De

esta forma, si un antibiótico alguna vez tuvo actividad sobre una determinada bacteria, al

adquirir resistencia, éste ya no es efectivo. (Samaniego, 2010)

2.2.6.3 Salud pública y la resistencia a antibióticos.

La resistencia bacteriana no es un problema nuevo, ha existido desde los inicios

mismos del desarrollo de antibióticos, la Tabla 2 recoge varios datos referentes a este

problema a través de los años. Factores como el mal uso y abuso de antibióticos así como

una dosificación incorrecta favorecen la aparición de resistencia, misma que en la

actualidad es considerada como un problema sumamente serio de salud pública que

amenaza también la seguridad alimentaria y el desarrollo.

Tabla 2

Aparición de resistencia luego de la introducción del antimicrobiano para uso clínico

Antibacteriano Bacteria Introducción clínica,

año

Reporte de

resistencia, año

Penicilina Staphylococcus 1943 1947

Str. pneumoniae 1943 1976

Oxacilina Staphylococcus 1960 1961

Vancomicina Enterococcus 1956 1986

Staphylococcus 1980 2002

Adaptado de Samaniego (2010)

En los años recientes, el uso de antimicrobianos en productos de limpieza en los

hogares también ha sido considerado como contribuyente al desarrollo de resistencia;

varios estudios han demostrado que aquellas bacterias que son resistentes a los químicos

usados en estos productos muestran una disminución en la sensibilidad a los

antibacterianos. (Samaniego, 2010)

Todos los países alrededor del mundo se encuentran involucrados en este

problema de resistencia. Las bacterias farmacorresistentes causan infecciones en el ser

humano y en los animales, mismas que son mucho más difíciles y varias veces imposibles

de tratar, por lo que se precisan estancias hospitalarias más prolongadas e inclusive el

índice de mortalidad aumenta. Ejemplos de estas infecciones son la neumonía, la

tuberculosis, la septicemia y la gonorrea.

24

El impacto generado por el desarrollo de resistencia a antibióticos en nuestra

sociedad es muy profundo, de seguir igual las perspectivas para un futuro son

desalentadoras. El efecto sobre el sector económico es significativo, como los

antibióticos de primera línea ya no son efectivos, se requieren fármacos más costosos, la

mayor duración de la enfermedad y su correspondiente tratamiento incrementan los

costos de la atención sanitaria así como la carga económica de las familias y la sociedad.

En los países en vías desarrollo, los costos elevados de estos nuevos antibióticos limitan

su accesibilidad y utilización. Adicionalmente, los logros en lo referente a la medicina

moderna se encuentran en riesgo ya que al carecer de antibióticos efectivos para tratar y

prevenir infecciones, cualquier intervención quirúrgica, trasplante de órganos,

quimioterapia, etc. constituirá un grave riesgo para la salud.

2.2.6.4 Prevención y control de la resistencia a antibióticos.

Para afrontar el problema de la resistencia se precisa adoptar medidas en todos

los niveles de la sociedad con el fin de reducir su impacto y limitar su propagación. Cada

país debe establecer planes nacionales de acción para hacer frente a la resistencia a

antibióticos; reforzar políticas, crear programas y monitorear la aplicación de medidas de

prevención y control de infecciones; y, reglamentar y fomentar la apropiada utilización

y eliminación de medicamentos antibióticos.

En el sector agrícola las medidas a tomarse deben ser rápidas y precisas ya que

afectan directamente la salud de las personas. Se deben establecer, fomentar y aplicar

buenas prácticas en todos los eslabones de la cadena de producción de alimentos de

origen animal y vegetal, es necesario además fomentar la seguridad biológica en granjas,

mediante mejoras en higiene y bienestar, para prevenir infecciones. Los antibióticos

deben ser administrados únicamente bajo supervisión veterinaria y no como promotores

de crecimiento. Los animales de granja deben ser vacunados periódicamente para evitar

el uso de antibióticos y, si es posible, usar alternativas a éstos.

Adicionalmente, el estado debe dar prioridad, fomentar e invertir en la realización

de investigaciones enfocadas al desarrollo y descubrimiento de nuevos antibióticos,

vacunas, productos diagnósticos u otros instrumentos.

Por último, la mejor forma de prevención es la educación, todas las personas

deben ser informadas sobre el correcto uso de antibióticos (bajo prescripción médica), la

prevención de infecciones (higiene adecuada, vacunas, relaciones sexuales seguras, etc.)

y las consecuencias del desarrollo de la resistencia antimicrobiana. (Organización

Mundial de la Salud, 2016)

2.2.8 Técnicas cromatográficas.

La cromatografía constituye un método para la separación de componentes

estrechamente relacionados presentes en mezclas complejas, que debido a su

especificidad presenta aplicaciones en todas las ramas de la ciencia.

25

Este método se fundamenta en el desplazamiento de una muestra con una fase

móvil (líquido, gas o fluido supercrítico) a través de una fase estacionaria inmiscible

fijada a una columna o a una superficie sólida. Los componentes de la muestra se

distribuyen, dependiendo de sus propiedades, entre la fase móvil y la estacionaria. Por lo

tanto aquellos compuestos que presentan una mayor afinidad con la fase estacionaria son

fuertemente retenidos por lo que presentarán un desplazamiento lento con el flujo de la

fase móvil. En contraste, aquellos componentes que no son fines con la fase estacionaria

y por ende se unen de forma débil presentarán un movimiento mucho más rápido. Como

resultado los diferentes componentes de la muestra se separan formando bandas o zonas

discretas que pueden analizarse de forma cualitativa o cuantitativa. (Skoog, Holler, &

Crouch, 2008)

2.2.8.1 Criterios de clasificación de las técnicas cromatográficas.

Existen diferentes criterios de clasificación de las técnicas cromatográficas, sin

embargo dos de ellos son los más comunes. El primer criterio se basa en la forma en la

cual las fases se ponen en contacto, dividiendo las técnicas en cromatografía en columna

y cromatografía en plano, mientras que el segundo criterio se fundamenta en la naturaleza

de la fase móvil, clasificando las técnicas en cromatografía de líquidos, cromatografía de

gases y cromatografía de fluidos supercríticos.

2.2.8.2 Cromatografía líquida.

Se caracteriza porque la fase móvil es líquida. En esta técnica se pueden usar una

amplia variedad de solventes como fase móvil en diferentes combinaciones así como

numerosos tipos de fases estacionarias, permitiendo el análisis de una gran variedad de

muestras. En la cromatografía líquida, la separación se produce mediante 4 tipos

principales de interacciones entre los analitos y la fase estacionaria que sirven como base

para su clasificación. (Rubinson & Rubinson, 2001)

- Fase normal: se caracteriza porque los momentos dipolares de la fase

estacionaria son muchos mayores que los correspondientes a la fase móvil.

Óxidos de silicio o de aluminio hidratados (sílice o alúmina) constituyen las

fases estacionarias más comúnmente utilizadas. La polaridad del disolvente

afecta directamente la velocidad de elución, razón por la cual su correcta

elección es un factor crítico.

- Fase reversa: la polaridad de la fase estacionaria es mucho menor que la de la

fase móvil. Pueden usarse partículas esféricas de polímero orgánico o sílice

con cadenas no polares de diferente longitud unidas a su superficie. Esta

técnica permite obtener picos agudos y simétricos, además el equilibrio de las

reacciones de adsorción y desorción tienden a alcanzarse más rápidamente.

- Intercambio iónico: se fundamenta en los equilibrios de intercambio entre los

iones de una muestra problema o solución y los iones del mismo signo

presentes en la superficie de un sólido insoluble de elevada masa molecular.

(Skoog, Holler, & Crouch, 2008)

26

- Exclusión o permeabilidad en gel: se diferencia de las demás técnicas debido

a que la separación se produce en función del tamaño efectivo de las

moléculas de analito, mas no por interacciones químicas. La fase estacionaria

se caracteriza por tener poros de un tamaño establecido, dentro de los cuales

ingresan aquellos analitos pequeños, mientras que los de mayor tamaño fluyen

con la fase móvil, permitiendo de esta forma la separación.

Figura 17. Mecanismo de interacción presentes en cromatografía líquida.

Fuente: Rubinson & Rubinson (2001)

2.2.8.3 Cromatografía de gases.

Técnica ampliamente utilizada para el análisis cualitativo y cuantitativo de una

gran variedad de muestras. La separación se lleva a cabo cuando los componentes de la

muestra vaporizada se reparten entre la fase móvil, que es un gas inerte, y la fase

estacionaria, que puede ser un sólido o líquido retenido en una columna. Una

característica especial en esta técnica es que la fase móvil no interacciona con el analito,

su única función es transportarlos a lo largo de la columna.

Existen dos tipos de cromatografía de gases: la cromatografía de gas-líquido y la

cromatografía de gas-sólido. En el primero la fase estacionaria es un líquido retenido

mediante adsorción o enlaces químicos sobre la superficie de un sólido inerte, presenta

aplicaciones en todos los campos de la ciencia, por lo que se la conoce únicamente como

cromatografía de gases. En cambio, en la cromatografía de gas-sólido, la fase estacionaria

constituye un sólido que mediante adsorción física retiene a los analitos, sin embargo las

moléculas activas o polares tienden a retenerse de manera semipermanente, generando

27

picos de elución con colas demasiado grandes, por lo que esta técnica presenta usos muy

limitados.

2.2.8.3.1 Instrumentación en cromatografía de gases.

Los componentes básicos de un equipo de cromatografía de gases se pueden

apreciar en la Figura 18:

Figura 18. Diagrama de bloques de un cromatógrafo de gases típico.

Fuente: Skoog, Holler, & Crouch (2008)

- Sistema de gas portador: permite controlar la velocidad de flujo de la fase

móvil, la cual es un gas inerte como nitrógeno, helio, argón o hidrógeno.

Reguladores de presión, medidores de presión y calibradores son

necesarios para establecer y controlar dicha velocidad.

- Sistema de inyección de muestras: las muestras líquidas son inyectadas a

través de un septum de caucho o silicona en un puerto de muestras

calentado, ubicado en la cabeza de la columna, mediante micro jeringas

calibradas. La temperatura del puerto de muestras se mantiene a unos

50°C superior al punto de ebullición del componente menos volátil, de

esta forma se asegura que toda la muestra se vaporice.

- Columnas y hornos de columnas: existen dos tipos de columnas utilizadas

en la cromatografía de gases, las columnas empaquetadas y las columnas

capilares o tubulares abiertas. En los últimos años las columnas tubulares

han sido más ampliamente utilizadas debido a su rapidez y eficacia. Las

columnas cromatográficas presentan una longitud variable que puede ir

de 2 hasta 50 metros y son fabricadas con diferentes materiales como

acero inoxidable, vidrio, teflón o sílice fundida. Para trabajar con

precisión es importante que la temperatura de la columna permanezca

constante, por lo tanto ésta es enrollada en forma de serpentín y colocada

dentro del horno con termostato. Factores como la naturaleza de la

muestra o el grado de separación requerido determinan la temperatura

óptima de la columna a usar.

- Sistema de detectores: un detector debe presentar propiedades como:

sensibilidad, estabilidad y reproducibilidad adecuada, facilidad de uso,

28

alta fiabilidad, breve tiempo de respuesta e independencia de la velocidad

de flujo, amplio rango de temperatura de trabajo, respuesta lineal y

selectiva. Sin embargo, no existe un detector que cumpla con todas estas

características por lo que se debe elegir un sistema de detección

dependiendo del tipo de muestra y análisis a realizar. La Tabla 3 recoge

varios tipos de detectores y las muestras que pueden ser analizadas.

Tabla 3

Tipos de detectores para cromatografía de gases y sus aplicaciones

Detectores de cromatografía de gases

Tipo Muestras aplicables

Ionización de llama Hidrocarburos

Conductividad térmica Detector universal

Captura electrónica Compuestos halogenados

Espectrómetro de masas Ajustable a cualquier especie

Termoiónico Compuestos con nitrógeno y fósforo

Conductividad eléctrica Compuestos que contienen halógenos, azufre o

nitrógeno

Fotoionización Compuestos ionizables por radiación ultravioleta

Transformada de Fourier Compuestos orgánicos

2.2.8.3.2 Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas.

En la cromatografía de gases acoplada a un detector de masas (GC/MS), los

componentes de la muestra son separados y transportados por el gas portador al salir de

la columna hacia el espectrómetro, el cual los analiza. La GC/MS se caracteriza por ser

muy eficaz y sensible, ya que requiere cantidades de muestra en el orden de 10-9g para

ser analizadas.

La Figura 19 resume el proceso de ionización y fragmentación ocurrido durante

la espectrometría de masas, misma que se fundamenta en el bombardeo de la molécula

de estudio con electrones de alta energía, los cuales debido a la colisión transfieren dicha

energía para desplazar un electrón de la molécula. Como resultado se obtiene un catión

radical, una especie con carga positiva y número impar de electrones, llamado también

ion molecular, que se caracteriza por tener la misma masa de la molécula de la cual se

formó (menos el peso insignificante del electrón desplazado). (Carey, 2006).

Figura 19. Proceso de ionización y fragmentación por impacto electrónico.

Fuente: Carey (2006)

29

La energía transferida en los impactos electrónicos permite, a más de la

ionización, la ruptura de los enlaces químicos, por lo tanto el ion molecular es capaz de

disociarse en fragmentos más pequeños. Es importante notar que al disociarse un catión

radical se generan dos fragmentos, uno con carga neutra y otro con carga positiva.

Únicamente los iones con carga positiva son separados y detectados en función a

su razón carga-masa (m/z). Cada compuesto presenta una particular distribución de iones

positivos o espectro de masas, herramienta que permite deducir su estructura.

2.2.8.3.3 Aplicaciones de la cromatografía de gases.

Los compuestos que pueden ser analizados mediante cromatografía de gases

deben ser volátiles y térmicamente estable, las aplicaciones pueden ser cualitativas y

cuantitativas. Entre las aplicaciones cualitativas constan la determinación de la pureza de

compuestos orgánicos, evaluación de la efectividad de procedimientos de purificación,

confirmación de presencia o ausencia de posibles compuestos en una mezcla, entre otros.

Las aplicaciones cuantitativas se basan en la comparación entre la altura o el área

del pico obtenido del analito frente a uno o varios patrones, ya que estos parámetros, bajo

ciertas condiciones, son proporcionales a la concentración. Una aplicación muy conocida

de esta técnica se la determinación de esteroides, estimulantes y fármacos que aumentan

el rendimiento en muestras de orina obtenidas de atletas. (Carey, 2006)

En lo referente al análisis de alimentos, mediante esta técnica es posible

identificar y medir la concentración de ácidos grasos, triglicéridos, colesterol y otros

esteroles, alcoholes, pesticidas, herbicidas, aditivos alimentarios, antioxidantes,

nitrosaminas, etc. presentes en matrices alimenticias de gran diversidad. Sin embargo,

como no es posible inyectar directamente en el equipo un producto alimenticio, procesos

de preparación de la muestra, extracción, purificación y concentración son necesarios.

2.2.8.4 Cromatografía de fluidos supercríticos.

Un fluido supercrítico se forma cuando una sustancia es calentada por encima de

su temperatura crítica (temperatura sobre la cual una sustancia no puede ser licuada), por

lo que ésta no puede ser condensada por la aplicación de presión como normalmente

ocurre. En este tipo de cromatografía la fase móvil constituye en fluido supercrítico,

razón por la cual constituye un híbrido entre la cromatografía líquida y la de gases,

combinando las mejores características de cada una de ellas.

Mediante esta técnica se pueden analizar muestras de difícil manejo en

cromatografía de gases o cromatografía líquida como aquellas que son térmicamente

inestables, no volátiles y que adicionalmente carecen de compuestos cromóforos para

una posible detección fotométrica. Ejemplos de sustancias que pueden ser analizadas

mediante esta técnica son: ciertos tipos de drogas, combustibles fósiles, tensoactivos,

explosivos, etc. (Skoog, West, & Holler, 2005)

30

2.3 Marco Legal

El presente trabajo de investigación se encuentra en concordancia con las políticas

y lineamientos estratégicos establecidos para el cumplimiento del Plan Nacional del Buen

Vivir, específicamente con los relacionados a: el auspicio de la igualdad, cohesión,

inclusión y equidad social y territorial; la garantía de los derechos de la naturaleza; la

promoción de la sostenibilidad ambiental territorial y global; y, el impulso a la

transformación de la matriz productiva.

Política 2.1. “Generar condiciones y capacidades para la inclusión económica, la

promoción social y la erradicación progresiva de la pobreza”

Política 7.2. “Conocer, valorar, conservar y manejar sustentablemente el

patrimonio natural y su biodiversidad terrestre, acuática continental, marina y costera,

con el acceso justo y equitativo a sus beneficios”

Política 7.4. “Impulsar la generación de bioconocimiento como alternativa a la

producción primario-exportadora”

Política 7.8. “Prevenir, controlar y mitigar la contaminación ambiental en los

procesos de extracción, producción, consumo y posconsumo”

Política 10.1. “Diversificar y generar mayor valor agregado en la producción

nacional”.

Política 10.2. “Promover la intensidad tecnológica en la producción primaria, de

bienes intermedios y finales”

Política 10.4. “Impulsar la producción y la productividad de forma sostenible y

sustentable, fomentar la inclusión y redistribuir los factores y recursos de la producción

en el sector agropecuario, acuícola y pesquero”.

La Constitución de la República del Ecuador señala en el Artículo 15 que “el Estado

promoverá, en el sector público y privado, el uso de tecnologías ambientalmente limpias

y de energías alternativas no contaminantes y de bajo impacto”.

2.4 Hipótesis

Hipótesis de trabajo (Hi): Es posible comprobar e identificar los grupos de

compuestos fitoquímicos responsables de la actividad antimicrobiana de la cáscara de

banano Musa paradisiaca.

Hipótesis nula (Ho): No es posible comprobar e identificar los grupos de

compuestos fitoquímicos responsables de la actividad antimicrobiana de la cáscara de

banano Musa paradisiaca.

31

2.5 Conceptualización de variables

2.5.1 Variables independientes.

V1: Tipo de fracción. Fracciones obtenidas por los dos métodos de extracción

(FEP, FCF, FAE, FAC, FA, FB, FC, FD, FE)

V2: Tipo de microorganismo. Se usaron dos tipos de bacterias en los ensayos

de actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos, Staphylococcus aureus y

Escherichia coli.

V3: Concentraciones del extracto. Para la realización de los ensayos de

actividad antimicrobiana la bibliografía recomienda el uso de diferentes concentraciones,

en la presente investigación se usaron 5 concentraciones del extracto etanolico crudo

(blanco, 1, 2, 5,10).

2.5.2 Variables dependientes.

V4: Actividad antimicrobiana de los extractos. Expresado como el diámetro

del halo de inhibición del crecimiento de los diferentes microorganismos frente a las

diferentes concentraciones del extracto etanolico crudo y fracciones.

V5: Composición proximal de la cáscara de banano. Se determinó mediante el

análisis bromatológico de las cáscaras de banano (porcentaje de: humedad, sólidos

totales, ceniza, grasa, proteína, fibra, carbohidratos por diferencia).

2.5.3 Variable de interés.

V5: Composición proximal de la cáscara de banano. Se determinó mediante el

análisis bromatológico de las cáscaras de banano (porcentaje de: humedad, sólidos

totales, ceniza, grasa, proteína, fibra, carbohidratos por diferencia).

V6: Composición cualitativa de los extractos. Mediante las pruebas de tamizaje

fitoquímico se podrán identificar las familias de compuestos extraídas y presentes en las

fracciones.

32

CAPITULO III

MARCO METODOLÓGICO

3.1 Diseño de la investigación

El presente trabajo de investigación presenta un enfoque cuantitativo, el cual se

caracteriza por utilizar la recolección de datos y el análisis de los mismos para contestar

preguntas de investigación y por ende probar hipótesis previamente establecidas. Este

enfoque confía en la medición numérica, el conteo y el uso de la estadística para

establecer, con la mayor exactitud posible, los patrones existentes en una población.

(Gómez, 2006)

De acuerdo a la naturaleza de la investigación, este trabajo presenta varios niveles

como: descriptivo, ya que a través del análisis bromatológico se analizó y estableció la

composición del objeto de estudio; exploratorio, ya que a través de pruebas cualitativas

se obtuvo información preliminar sobre el tópico poco conocido; y, explicativo, ya que

permitió conocer la relación existente entre las variables.

Con respecto a la obtención de datos, el presente trabajo se fundamentó en una

revisión bibliográfica y experimental. La primera se apoyó en fuentes escritas como:

libros, revistas científicas, documentos legales, etc. La segunda se caracterizó porque la

información obtenida fue resultado de la actividad intencional llevada a cabo por el

investigador.

3.2 Población y muestra

La población para este estudio corresponde al banano Cavendrish (Musa

paradisiaca) en estado de completa maduración de nombre comercial “PINKA

BANANA” proveniente de la Hacienda “Llano Chico”, que se encontraba disponible en

un mercado de la ciudad de Quito. Se tomaron cuatro muestras de 2kg cada una para el

correspondiente análisis bromatológico, mientras que para el fraccionamiento e

identificación de los grupos de compuestos bioactivos se partió de una sola muestra de

20kg.

3.3 Materiales y métodos

El presente trabajo de investigación se llevó a cabo en los Laboratorios de

Bromatología, Microbiología y Contaminantes de los Productos Agrícolas de la Agencia

Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del Agro (Agrocalidad), ubicada en la vía

Interoceánica km 14 ½ y Eloy Alfaro, parroquia Tumbaco, cantón Quito, Ecuador.

33

Las pruebas de tamizaje fitoquímico se realizaron en el Laboratorio de Productos

Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador,

ubicada en la Ciudadela Universitaria, cantón Quito, Ecuador.

3.3.1 Materiales.

a) Análisis bromatológico

- Pinzas para manipulación de cápsulas

- Desecador con sustancia desecante activa

- Espátula

- Cápsulas de aluminio

- Tubos Kjeldahl de 300ml

- Matraces de erlenmeyer

- Papel celofán incoloro

- Núcleos de ebullición

- Vasos de vidrio

- Crisoles de porcelana

- Embudos de vidrio

b) Extracción

- Frascos ámbar de 1 litro con tapa

- Papel filtro cualitativo

- Matraces de erlenmeyer

- Embudo butchner

- Manguera

- Papel aluminio

d) Fraccionamiento

- Vasos de precipitación

- Embudos de separación

- Soporte universal

- Aros de hierro

- Probetas

- Papel indicador

- Frascos de vidrio

e) Tamizaje fitoquímico

- Pipetas volumétricas

- Pera de succión

- Tubos de ensayo

- Gradilla

- Placas de porcelana

- Placas de silica gel

d) Ensayo de actividad antimicrobiana

- Cultivo Escherichia coli ATCC

- Cultivo Staphylococcus aureus ATCC

- Caldo nutritivo

34

- Agar Muller-Hilton

- Tubos de ensayo

- Pipetas automáticas

- Mechero Bunsen

- Cajas petri de vidrio

- Hisopos

- Asa de inoculación

- Aguja de inoculación

3.3.1.1 Equipos.


- Balanza analítica Scientech con resolución de 0,0001g

- Estufa Precisión, 135±2°C

- Equipo de determinación de proteína (Digestor y Scrubber marca Selecta,

destilador marca Velp)

- Bureta digital de 50ml marca Brand

- Sorbona

- Equipo extractor de grasa marca Velp

- Mufla, 600±20°C

- Plancha de calentamiento

b) Extracción

- Bomba de vacío

- Rotavapor

c) Fraccionamiento

- Campana extractora de gases

- Rotavapor

d) Tamizaje fitoquímico

- Cámara cromatográfica

- Lámpara de luz UV 254 y 396 nm

e) Ensayo de actividad antimicrobiana

- Equipo de protección personal

- Incubadora

- Cabina de seguridad biológica tipo II

- Autoclave

- Espectrofotómetro UV-VIS

3.3.1.2 Reactivos.


- Ácido sulfúrico concentrado

- Catalizador Kjeldahl

- Solución de ácido bórico al 4%

- Solución de hidróxido de sodio al 40%

- Solución valorada de ácido clorhídrico 0,1N

35

- Éter de petróleo

- Agua destilada

- Solución de ácido sulfúrico al 1,25%

- Solución de hidróxido de sodio al 1,25%

b) Extracción

- Alcohol etílico 70%


- Cloroformo

- Acetato de etilo

- Agua

c) Fraccionamiento

- Ácido clorhídrico al 5%

- Hidróxido de sodio al 20%

- Cloroformo


- Metanol

- Agua estéril

- Acetato de plomo

- Sulfato de sodio anhidro

d) Tamizaje fitoquímico

- Reactivo de Mayer

- Reactivo de Wagner

- Reactivo de Dragendorff

- Anhídrido acético

- Ácido sulfúrico concentrado

- Ácido clorhídrico concentrado

- Cinta de magnesio metálico

- Hidróxido de potasio en etanol al 5 y 10%

- Hidróxido de amonio

- Alcohol amílico

- Solución de cloruro férrico al 5% y al 2%

- Benceno

- Solución de gelatina salada (1% gelatina – 10%sal)

- Reactivo de Stiansy

- Reactivo de Baljet

- Reactivo de Kedde

- Cloroformo

- Metanol

- Etanol al 96%


- Acetona

- Butanol

- Ácido acético

36

- Acetato de etilo

- Diclorometano

3.3.2 Métodos.

3.3.2.1 Muestreo.

Una vez identificada la población de estudio, así como el lugar de toma de

muestra, el proceso se llevó a cabo según los parámetros establecidos en la Norma INEN

1750 correspondiente a “Hortalizas y frutas frescas. Muestreo”. El muestro se realizó de

forma aleatoria.

3.3.2.2 Análisis bromatológico.

Previo al análisis bromatológico todas las muestras fueron sometidas al proceso

de preparación que consistió en la limpieza de los bananos, separación de la pulpa y en

la reducción de tamaño de las cáscaras.

a) Determinación de humedad: El ensayo se llevó a cabo según los lineamientos

establecido en el Procedimiento Específico de Ensayo PEE/B/01 del Laboratorio

de Bromatología y Microbiología de la Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento

de la Calidad del Agro.

b) Determinación de proteína: El ensayo se llevó a cabo según los lineamientos




c) Determinación de grasa: El ensayo se llevó a cabo según los lineamientos




d) Determinación de cenizas: El ensayo se llevó a cabo según los lineamientos




e) Determinación de fibra cruda: El ensayo se llevó a cabo según los lineamientos




3.3.2.3 Extracción.

En el presente trabajo de investigación se realizaron dos tipos de

extracción. El primer método consistió en una maceración sucesiva con cuatro

solventes de polaridad creciente: éter de petróleo, cloroformo, acetato de etilo y

agua, los cuales permitieron extraer los grupos fitoquímicos pero de forma

selectiva. El segundo método consistió en la obtención, por maceración, de un

extracto etanolico crudo, que posteriormente fue sometido a un proceso de

fraccionamiento.

37

El proceso de extracción sucesiva con solventes de polaridad creciente que

se utilizó corresponde a una adaptación del método propuesto por Miranda (s.f.),

el cual establece:

1. Acondicionar la muestra mediante procesos de lavado y reducción de tamaño

de partícula.

2. Pesar 200 gr de la materia vegetal y someter a un proceso de secado por 24

horas a 35°C.

3. Adicionar 400 ml del primer solvente de extracción (éter de petróleo).

4. Macerar durante 48 horas a temperatura ambiente y protegido de la luz.

5. Filtrar al vacío.

6. Concentrar usando rotavapor el extracto obtenido hasta un volumen de 200ml.

7. Secar al ambiente el residuo sólido.

8. Repetir los numerales 3 al 6 utilizando un solvente de extracción diferente

cada vez (cloroformo, acetato de etilo y agua).

9. Una vez obtenidos todos los extractos, almacenarlos en refrigeración.

El segundo método de extracción usado corresponde a una adaptación del método

propuesto por Cooper & Nicola (2015), cuyos pasos a seguir son:

1. Limpiar los bananos y enjuagarlos con agua destilada.

2. Separar la cáscara de la pulpa del banano.

3. Colocar las cáscaras en bandejas de aluminio y secarlas en estufa a 40°C por

24 horas.

4. Reducir el tamaño de las cáscaras secas mediante el uso de una licuadora

5. Pesar 200g de muestra seca y colocarlo en un vaso de precipitación adecuado.

6. Adicionar 400ml de etanol al 70%.

7. Permitir maceración durante 48 horas a temperatura ambiente y en sombra.

8. Filtrar al vacío.

9. Concentrar a presión reducida el líquido extraído hasta un volumen final de

200ml (extracto crudo).

10. Tomar alícuotas del extracto crudo y concentrar nuevamente hasta obtener 4

diferentes concentraciones (1, 2, 5, 10), guardarlas en refrigeración hasta su

posterior utilización en los ensayos de actividad antimicrobiana.

11. Repetir el procedimiento detallado en los numerales 1-9 hasta obtener un

extracto crudo y almacenarlo en refrigeración hasta llevar a cabo el proceso

de fraccionamiento.

3.3.2.4 Ensayo de actividad antimicrobiana.

El ensayo de actividad antimicrobiana usado fue una adaptación del método de

difusión en discos o antibiograma propuesto por Clinical and Laboratory Standars

Institute (2012), que establece:

Preparación del inóculo por método directo de inoculación a partir de colonia

aislada: Suspender colonias seleccionadas de una placa de cultivo no selectivo de 18-24

38

horas de incubación en caldo nutritivo o solución salina. La densidad de la suspensión se

debe ajustar a la escala 0,5 McFarland.

Inoculación en placas: Sembrar las placas de agar Muller Hilton por hisopado

usando el inóculo previamente preparado. Presionar el hisopo contra las paredes del tubo

a fin de escurrir un posible exceso. La inoculación en la superficie del medio de cultivo

debe realizarse en tres direcciones, rotando la placa 60° cada vez, al finalizar se debe

hisopar la circunferencia de la placa para asegurar una completa distribución del inóculo.

Dejar la tapa de la placa abierta de 3-5 minutos, de esta forma el exceso de humedad

superficial es absorbido. La siembra debe realizarse dentro de los 15 minutos posteriores

al ajuste de densidad del inóculo.

Aplicación de los discos con antimicrobianos en las placas inoculadas: Realizar

discos, usando papel filtro, de un diámetro de 6mm. Esterilizar los discos por autoclave.

Impregnar los discos con las diferentes concentraciones de los extractos y las fracciones.

Colocar los discos con antimicrobiano sobre la superficie inoculada de la placa con la

ayuda de una pinza estéril aplicando ligera presión y a una distancia adecuada que evite

una posible superposición de halos.

Incubación de las placas y lectura de resultados: Incubar las placas invertidas

por 16-18 horas a 35°C. Cumplido el tiempo de incubación, examinar cada placa y medir

los halos de inhibición generados. Se debe medir el diámetro de la zona de inhibición a

ojo desnudo incluyendo el diámetro del disco. Las zonas de inhibición se deben medir en

la base de las placas de Petri usando calibre o regla. La lectura se debe aproximar al valor

entero en milímetros más cercano.

3.3.2.5 Fraccionamiento.

En el primer método todos los compuestos presentes en la cáscara de banano

fueron extraídos en función de la polaridad del solvente usado (éter de petróleo,

cloroformo, acetato de etilo y agua), por lo que a cada uno de los extractos obtenidos se

le considera también como fracción: el extracto o fracción etérea, extracto o fracción

clorofórmica, extracto o fracción de acetato de etilo y el extracto o fracción acuosa.

El extracto crudo obtenido por el segundo método se dividió en cuatro partes

iguales, cada una de las cuales fue fraccionada usando solventes de diferente polaridad.

a) Fraccionamiento con cloroformo: Llevar una porción del extracto a un pH de

2-3 usando una solución de HCl al 5% (verificar con papel indicador).

Adicionar NaOH al 20% gota a gota hasta alcanzar un pH de 10-12 (verificar

con papel indicador). Transferir el extracto alcalinizado a un embudo de

separación. Extraer con cloroformo, realizando 3 lavados con el solvente y

separando la fase orgánica cada vez. Usando un rotavapor, concentrar la fase

orgánica hasta sequedad y posteriormente reconstruirla usando agua estéril,

de esta forma se obtiene la fracción A, a partir de la cual se realizan las pruebas

de identificación de grupos fitoquímicos y el ensayo de actividad

antimicrobiana.

39

b) Fraccionamiento con éter de petróleo: Transferir una porción del extracto a

un embudo de separación y extraer con éter de petróleo, realizando 3 lavados

con el solvente, separando la fase orgánica cada vez y guardando la fase

acuosa para posterior extracción. Usando un rotavapor, concentrar la fase

orgánica hasta sequedad y posteriormente reconstruirla usando agua estéril,

de esta forma se obtiene la fracción B, a partir de la cual se realizan las pruebas

de identificación de grupos fitoquímicos y el ensayo de actividad

antimicrobiana.

c) Fraccionamiento con metanol/agua (50/50): Macerar la fase acuosa

previamente obtenida durante 24 horas usando una mezcla de metanol/agua

(50/50). Filtrar al vacío y al residuo sólido obtenido redisolverlo en

cloroformo, concentrarlo a sequedad y reconstruirlo con agua estéril, de esta

forma se obtiene la fracción C. El líquido filtrado obtenido se concentra a

sequedad y se reconstituye usando agua estéril, obteniendo de esta forma la

fracción D. A partir de estas dos fracciones se realizan las pruebas de

identificación de grupos fitoquímicos y el ensayo de actividad antimicrobiana.

d) Fraccionamiento con acetato de plomo y cloroformo: Añadir gota a gota una

solución de acetato de plomo al 20% sobre una porción del extracto hasta que

no se aprecie la formación de precipitado. Filtrar por gravedad, desechar el

precipitado y al filtrado extraer con cloroformo, realizando 3 lavados con el

solvente y separando la fase orgánica cada vez. Filtrar el extracto

clorofórmico usando sulfato de sodio anhidro, concentrar el filtrado obtenido

a sequedad y reconstruirlo con agua estéril, de esta forma se obtiene la

fracción E, a partir de la cual se realizan las pruebas de identificación de

grupos fitoquímicos y el ensayo de actividad antimicrobiana.

3.3.2.6 Tamizaje Fitoquímico.

Las fracciones obtenidas por el primer método fueron analizadas para la

identificación de los grupos fitoquímicos presentes (alcaloides, terpenos, esteroides,

antocianos, flavonoides, taninos, saponinas, etc.) mediante ensayos cualitativos

específicos, como se puede ver en la Tabla 4.

Tabla 4

Ensayos específicos para la detección de grupos fitoquímicos en las fracciones generadas a

través del primer método de extracción

Solvente usado

en la extracción Fracción Ensayo

Grupo fitoquímico a

detectar

Éter de petróleo FEP

Ensayo de Libermand-

Burchard Triterpenos y/o esteroides

Ensayo de Sudan Aceites y grasas

Ensayo de Baljet Lactonas y curaminas

Ensayo de Dragendorff Alcaloides

Cloroformo FCF


Burchard Triterpenos y/o esteroides

Ensayo de Baljet Lactonas

40

Tabla 4 (Continuación)

Acetato de etilo FAE

Ensayo de Shhinoda Flavonoides

Ensayo de cloruro férrico Taninos


Burchard

Triterpenos y/o

esteroides

Agua FAC

Ensayo de Shinoda Flavonoides

Ensayo de cloruro férrico Taninos

Ensayo de espuma Saponinas

Ensayo de Dragendorff Alcaloides

Cada una de las fracciones obtenidas a partir del extracto crudo fue analizada

según los ensayos propuestos en la Tabla 5.

Tabla 5

Ensayos específicos para la detección de grupos fitoquímicos en las fracciones generadas a

partir del extracto crudo

Fracción Ensayo Grupo fitoquímico a detectar

Fracción A

Ensayo de Mayer

Alcaloides Ensayo de Wagner

Ensayo de Dragendorff

Fracción B Ensayo de Libermand-Burchard Triterpenos y esteroides

Fracción C y

fracción D

Ensayo de Shinoda Flavonoides

Reacción en medio alcalino

Ensayo de antocianos Antocianos

Ensayo de Bontrager Antraquinonas

Ensayo de cloruro férrico Taninos (hidrolizables y no

hidrolizables) Ensayo de gelatina salada

Reacción de Stiasny

Ensayo de espuma Saponinas

Fracción E Ensayo de Baljet Lactonas y couraminas

Reacción de Kedde Glucósidos cardiotónicos

a) Ensayo de Mayer: A una alícuota de la fracción acuosa añadir 1 gota de ácido

clorhídrico concentrado (calentar suavemente y dejar enfriar). Adicionar una

pizca de cloruro de sodio en polvo, agitar y filtrar. Colocar 2-3 gotas de la

solución reactiva de Mayer. El ensayo se considera positivo si se desarrolla

opalescencia, turbidez definida y/o precipitado coposo.

b) Ensayo de Wagner: A una alícuota de la fracción acuosa añadir 1 gota de

ácido clorhídrico concentrado (calentar suavemente y dejar enfriar).

Adicionar 2-3 gotas de reactivo de Wagner. La aparición de opalescencia,

turbidez y/o precipitado indica un ensayo positivo.

c) Ensayo de Dragendorff: A una alícuota de la fracción acuosa añadir 1 gota

de ácido clorhídrico concentrado (calentar suavemente y dejar enfriar),

41

posteriormente se adicionan 3 gotas de reactivo de Dragendorff. Se considera

positivo el ensayo cuando existe opalescencia, turbidez y/o formación de

precipitado.

d) Ensayo de Libermand-Burchard: Tomar una alícuota de la fracción y

colocarla en un tubo de ensayo (si ésta no se encuentra en cloroformo, debe

evaporarse el solvente y el residuo redisolverse en 1 mL de cloroformo).

Adiciona 1 mL de anhídrido acético y homogeneizar. Seguidamente añadir

por las paredes del tubo 3-4 gotas de ácido sulfúrico concentrado, sin agitar.

Un ensayo positivo se tiene por un cambio rápido de coloración: rosa-azul

muy rápido, verde intenso-visible aunque rápido, verde oscuro-negro final de

la reacción.

e) Ensayo de Shinoda: Permite identificar la presencia de flavonoides. A una

alícuota del extracto disuelto en alcohol se añade 1ml de ácido clorhídrico

concentrado y un pedazo de cinta de magnesio metálico. Se espera 5 minutos

y se adicionan 1ml de alcohol amílico, se mezclan las fases y se deja reposar

hasta que se separen. El resultado se considera positivo si la fase

correspondiente al alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita

o rojo intensos.

f) Reacción en medio alcalino: Tomar una alícuota de la fracción en estudio y

añadir 3-4 gotas de una solución de hidróxido de potasio al 5% en etanol. Si

existe un cambio de coloración a amarillo naranja añadir 3-4 gotas de cloruro

férrico al 2%. Si se desarrolla una coloración final azul verdosa la reacción se

considera positiva.

g) Ensayo de antocianos: Tomar una alícuota de la fracción de interés y adicionar

2 gotas de ácido clorhídrico concentrado, agitar y dejar en reposo. Si el color

cambia a rojo adicionar un exceso de amoníaco, si la coloración se torna azul

el ensayo se considera positivo.

h) Ensayo de Bontrager: Tomar una alícuota de la fracción, adicionar 5mL de

ácido sulfúrico 1N y llevar a ebullición por 10 minutos. Filtrar por gravedad

y adicionar, sobre el líquido filtrado, un volumen igual de benceno. Colocar

en un embudo de separación, agitar y dejar en reposo. Separar la fase orgánica

y adicionar 1 mL de hidróxido de amonio, Observar la coloración rosa en la

capa acuosa.

i) Ensayo de cloruro férrico: Permite reconocer la presencia de compuestos

fenólicos y/o taninos. A una alícuota del extracto acuoso se añade acetato de

sodio para neutralizar y tres gotas de una solución de cloruro férrico al 5% en

solución salina fisiológica. El desarrollo de una coloración rojo-vino indica la

presencia de compuestos fenólicos en general, una coloración verde intensa

es indicativo de la presencia de taninos del tipo pirocatecólicos, mientras que

una coloración azul corresponde a taninos del tipo pirogalotánicos.

j) Ensayo de gelatina salada: Adicionar el reactivo de gelatina-sal a una alícuota

de la fracción de estudio en una cantidad igual a la mitad de la misma. El

ensayo se considera positivo si aparece un precipitado blanco floculento.

42

k) Reacción de Stiasny: A una alícuota de la fracción de estudio adicionar 3-4

gotas de formol clorhídrico. Si existen taninos condensados, estos precipitarán

en forma de grandes copos rojos.

l) Ensayo de espuma: Permite identificar la presencia de saponinas, tanto en tipo

esteroidal como triterpénica. Diluir una alícuota de la fracción, disuelta en

alcohol, con 5 veces su volumen de agua y agitar fuertemente durante 5-10

minutos. El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie

del líquido, de más de 2 mm de altura que persista por más de 2 minutos.

m) Ensayo de Baljet: Permite reconocer la presencia de compuestos con

agrupamiento lactónico como las curaminas. El desarrollo de una coloración

y precipitado rojo al agregar 1mL del reactivo de Baljet sobre 1mL de la

muestra, indica la presencia de estos compuestos.

n) Reacción de Kedde: A una alícuota de la fracción en estudio adicionar 0,5mL

del reactivo de Kedde y 3-4 gotas de hidróxido de potasio al 10% en etanol.

La reacción se considera positiva si existe el desarrollo de una coloración

púrpura muy estable.

o) Ensayo de Sudan: Permite reconocer la presencia de compuestos grasos, para

lo cual, a una alícuota de la fracción en el solvente de extracción se añade 1

ml de una solución diluida en agua de colorante Sudan III. Se calienta en baño

de agua hasta evaporación completa del solvente. La presencia de compuestos

grasos se considera positiva si aparecen gotas o una película coloreada de rojo

en el seno del líquido o en las paredes del tubo de ensayo.

Los resultados de las pruebas cualitativas realizadas fueron expresados según los

criterios expuestos en la Tabla 6.

Tabla 6

Criterios de interpretación de pruebas cualitativas

+++ Abundante

++ Moderado

+ Medianamente escaso

+/- Escaso

- Nada

Mediante cromatografía en capa fina se identificó la presencia de familias de

compuestos fitoquímicos específicos en las fracciones obtenidas a partir del extracto

etanolico crudo, según lo establecido en la Tabla 7.

Tabla 7

Fases móviles y reveladores a utilizar en la cromatografía de capa fina.

Fracción Grupo

fitoquímico Fase móvil Revelador

Fracción A Alcaloides Cloroformo-metanol

(19-1)

Reactivo de

Dragendorff

43


Fracción B Esteroles Éter de petróleo-acetona

(80:20)

Anhídrido acético +

ácido sulfúrico + etanol

Fracción C y D Flavonoides Butanol-ácido acético-

agua (4:1:5) UV florescencia

Fracción C y D Antraquinonas Benceno-acetato de etilo-

ácido acético (75:24:1)

Hidróxido de potasio al

10%

Fracción E Sesquiterpenos Diclorometano-acetona

(60:40) Hidróxido de potasio

Fracción E Glucósidos

cardiotónicos

Dicloro metano-acetato

de etilo (60:40) Reactivo de Kedde

3.4 Diseño Experimental

El análisis de la actividad antimicrobiana del extracto crudo y de sus fracciones

se fundamentó en un diseño experimental completamente al azar. En la Tabla 8 se

detallan los factores y niveles de estudio propuestos en este trabajo de investigación.

Tabla 8

Factores de estudio y niveles

Factores Niveles Codificación

Tipo de microorganismo Staphylococcus aureus SA

Escherichia coli EC

Concentración del extracto

crudo

Blanco C0

Concentración 1 C1

Concentración 2 C2

Concentración 3 C3

Concentración 4 C4

Tipo de fracción

Fracción etérea FEP

Fracción clorofórmica FCF

Fracción de acetato de etilo FAE

Fracción acuosa FAC

Fracción A FA

Fracción B FB

Fracción C FC

Fracción D FD

Fracción E FE

3.5 Matriz de operacionalización de variables

La Tabla 9 resume las variables de estudio propuestas para este trabajo, sus

dimensiones, indicadores e ítems.

44

Tabla 9

Matriz de operacionalización de variables

Variable Dimensiones Indicadores Items

Composición

química

proximal

Cantidad de agua Porcentaje de

humedad

Cantidad de grasa Porcentaje de grasa

Cantidad de ceniza Porcentaje de ceniza

Cantidad de proteína Porcentaje de proteína

Cantidad de fibra Porcentaje de fibra

Cantidad de

carbohidratos

Porcentaje de

carbohidratos

Tipos de

fracciones

Fracciones obtenidas

a partir de la

extracción sucesiva

con solventes de

polaridad creciente

Fracción etérea

Fracción clorofórmica

Fracción de acetato de

etilo

Fracción acuosa

Fracciones obtenidas

a partir del extracto

crudo

Fracción A

Fracción B

Fracción C

Fracción D

Fracción E

Actividad

antimicrobiana

Inhibición de

crecimiento

Diámetro de halos de

inhibición generados

Concentración

de los

extractos

Concentraciones

obtenidas a partir del

extracto crudo

Blanco

Concentración 1

Concentración 2

Concentración 3

Concentración 4

Composición

cualitativa de

las fracciones

Técnicas de tamizaje

fitoquímico Familias de

compuestos químicos

Presencia/ausencia de

grupos o familias de

compuestos fitoquímicos Técnicas de CCF

3.6 Técnicas e Instrumentos de recolección de datos

Debido a que el presente trabajo de investigación se fundamenta en la

experimentación, la observación constituyó la técnica principal para abstraer la

información del fenómeno en estudio correspondiente a la determinación de la actividad

antimicrobiana y la composición proximal de las cáscaras, usando como instrumento la

guía de observación. Con respecto a la identificación cualitativa de los grupos de

compuestos fitoquímicos presentes en las fracciones se usaron listas de cotejo.

45

3.7 Técnicas de procesamiento de información y análisis de datos

Las mediciones correspondientes a la determinación de la composición

bromatológica de la cáscara del banano se realizaron por duplicado, por lo que se utilizó

la media aritmética de los datos obtenidos para expresar el resultado. Para evaluar el

grado de dispersión de los datos generados se usaron la desviación estándar y el

coeficiente de variación.

Los halos de inhibición obtenidos mediante el ensayo de actividad

antimicrobiana, realizado en el extracto crudo, sus diferentes concentraciones y las

fracciones, fueron medidos y expresados en milímetros. Se calculó su media aritmética

y su dispersión se expresó como varianza.

Media aritmética (�̅�). Medida de posición conocida también como media o

promedio, se define como la suma de todos los datos de un conjunto dividido para el

número de los mismos, se expresa mediante la Ecuación 9.

�̅� = 1

𝑛∑ 𝑥𝑖

𝑛𝑖=1 (Ecuación 9)

Dónde: n= número de datos presentes en un conjunto

𝑥𝑖= datos presentes en un conjunto

Varianza (𝑠2). Medida de dispersión de los datos con respecto al valor medio. La

varianza de una población se representa por σ2, mientras que la varianza de una muestra

se representa por 𝑠2 y es mejor conocida como cuasivarianza. La Ecuación 10 expresa la

definición de la varianza de una muestra. Si los datos que se disponen corresponden a los

de la población total, en la ecuación debe usarse N en lugar de N-1.

𝑠2 = ∑ (𝑥1−�̅�)2𝑁

𝑖=1

𝑛−1 (Ecuación 10)



�̅�= media aritmética de los datos analizados

Desviación estándar (s). Conocida también como desviación típica, es una

medida de dispersión que se expresa en las mismas unidades que la media, se calcula

simplemente como la raíz cuadrada de la varianza. Si se parte de la desviación de una

muestra se obtiene la cuasidesviación típica cuya forma de cálculo se expone en la

Ecuación 11.

𝑠 = √∑ (𝑥1−�̅�)2𝑛

𝑖=1

𝑛−1 (Ecuación 11)



�̅�= media aritmética de los datos analizados

46

Coeficiente de variación (CV). Representa la desviación típica con respecto a la

media del conjunto de datos en estudio pero en forma de porcentaje por lo que su

interpretación es más sencilla, la Ecuación 12 expresa lo anteriormente expuesto.

𝐶𝑉 = 𝑠

�̅�× 100 (Ecuación 12)

Dónde: �̅�= media aritmética de los datos analizados

s= desviación estándar

Para procesar los datos obtenidos de los ensayos de actividad antimicrobiana y

evaluar el efecto de las diferentes concentraciones del extracto crudo así como de las

distintas fracciones sobre la inhibición del crecimiento de las bacterias Escherichia coli

y Staphylococcus aureus se utilizó el análisis de varianza ANOVA de dos factores con

varias muestras por grupo. Una vez que se determinó la existencia de diferencia

significativa entre los tratamientos, se realizó la prueba de comparaciones múltiples de

Tukey para identificar cuáles son diferentes entre sí.

Análisis de varianza (ANOVA). Herramienta estadística usada para comparar las

medias entre tres o más grupos de datos simultáneamente, es una prueba paramétrica que

requiere grupos de datos continuos de poblaciones normalmente distribuidas. Una

característica importante del ANOVA es que separa y estima las diversas fuentes de

variación, es decir, varianza intergrupos (error generado por las diferentes variables o

manipulación experimental) y varianza intragrupos (error aleatorio). De esta forma es

posible calcular la razón F, mediante la Ecuación 13, que al contrastarse con valores

tabulados a una significancia (ver Anexo 3) específica indican si existe o no diferencia

significativa entre los valores medios.

𝐹 = 𝑉𝑎𝑟𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑑𝑒𝑏𝑖𝑑𝑎 𝑎 𝑓𝑢𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜𝑠)

𝑉𝑎𝑟𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑑𝑒𝑏𝑖𝑑𝑎 𝑎𝑙 𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 (𝑖𝑛𝑡𝑟𝑎𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜𝑠) (Ecuación 13)

El ANOVA de dos factores permite analizar el efecto que tienen dos variables

independientes sobre la variable respuesta. Como ya fue mencionado, dependiendo de su

origen existen dos tipos de variaciones, la intergrupo y la intragrupo, pero en este tipo de

ANOVA, la variación intergrupo se debe a los diferentes factores así como a la

interacción existente entre ellos. Por lo tanto existen cuatro fuentes de variación: a)

debida a la primera variable independiente, b) debida a la segunda variable

independiente, c) interacción entre ellas y d) error.

Para los factores o variables independientes (A y B), la hipótesis nula propone

que la varianza debida a cada uno de ellos es igual a la varianza del error y por lo tanto

su efecto individual sobre la variable respuesta no es significativo, mientras que la

hipótesis alternativa propone que la varianza generada por cada factor es mayor que la

del error y por ende su efecto sí es significativo, lo cual se expresa mediante las

Ecuaciones 14, 15, 16 y 17.

𝐻0𝐴 𝑠𝐴

2 = 𝑠𝐸2 (Ecuación 14)

𝐻1𝐴 𝑠𝐴

2 ≠ 𝑠𝐸2 (Ecuación 15)

47

𝐻0𝐵 𝑠𝐵


𝐻1𝐵 𝑠𝐵


Dónde: 𝐻0𝐴= hipótesis nula para el factor A

𝐻1𝐴= hipótesis alternativa para el factor A

𝑠𝐴2= varianza del factor A

𝐻0𝐵= hipótesis nula para el factor B

𝐻1𝐵= hipótesis alternativa para el factor B

𝑠𝐵2= varianza del factor B

𝑠𝐸2= varianza del error

Para el efecto de la interacción entre los factores de estudio, la hipótesis nula

propone que la varianza debida a ésta es igual a la varianza del error y por lo tanto su

efecto sobre la variable respuesta no es significativo, mientras que la hipótesis alternativa

propone que la varianza generada por esta interacción es mayor que la del error y por

ende su efecto sí es significativo, lo cual se expresa mediante las Ecuaciones 18 y 19.

𝐻0𝐴𝐵 𝑠𝐴𝐵


𝐻1𝐴𝐵 𝑠𝐴𝐵


Dónde: 𝐻0𝐴𝐵= hipótesis nula para el efecto de la interacción

𝐻1𝐴𝐵= hipótesis alternativa para el efecto de la interacción

𝑠𝐴𝐵2 = varianza de la interacción

𝑠𝐸2 = varianza del error

Prueba de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey. Prueba de

comparaciones múltiples que utiliza el estadístico de rango estudentizado para hacer

todas las comparaciones por parejas entre los grupos y de esta forma calcular y comparar

los porcentajes de error del experimento y de todas las comparaciones.

Para llevar a cabo la prueba de Tukey primeramente se calcula la media de cada

tratamiento y se las ordena de mayor a menor. La Ecuación 20 se utiliza para determinar

el número de comparaciones (N) que deben ser realizadas.

𝑁 =𝑛(𝑛−1)

2 (Ecuación 20)

Dónde: 𝑛= número de medias existentes

A continuación se calcula el error estándar (ε), mediante la Ecuación 21; se

consulta la tabla de rangos estudentizados significativos (ver Anexo 4) con el número de

tratamientos y los grados de libertad del error y el valor obtenido (RES) se multiplica por

ε para obtener la diferencia mínima significativa (DMS), como expresa la Ecuación 22.

ε = √𝐶𝑀𝐸

𝑗 (Ecuación 21)

48

𝐷𝑀𝑆 = ε(RES) (Ecuación 22)

Dónde: 𝐶𝑀𝐸= Cuadrado medio del error

j= Número de réplicas

ε= Error estándar

DMS= Diferencia mínima significativa

RES= valor de rango estudentizado significativo

Finalmente se realiza la diferencia entre las medias y los resultados obtenidos se

comparan con el valor de DMS, aquellos que sean mayores indican una diferencia

significativa.

49

CAPITULO IV

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

4.1 Muestreo

Para iniciar la investigación se realizó la toma de muestra en el supermercado

“SUPERMAXI”, ubicado en la Avenida 12 de Octubre s/n. El banano Cavendish en

completo estado de maduración de nombre comercial “Pinka Banana”, proveniente de la

Hacienda Llano Chico, fue seleccionado al azar, almacenado en fundas de polietileno y

transportadas inmediatamente al laboratorio para evitar cualquier tipo de cambio en el

producto. Cuatro muestras, de 2Kg cada una, fueron tomadas para el correspondiente

análisis bromatológico, mientras que una sola muestra de 20Kg fue recolectada para los

posteriores procesos de extracción y fraccionamiento. Debido a que fueron frutas a

granel, no se pudo obtener datos correspondientes a la trazabilidad de la muestra, sin

embargo, la identificación taxonómica de la especie vegetal estudiada se expone en el

Anexo 11.

4.2. Análisis Bromatológico

Una vez realizado el acondicionamiento de las muestras, éstas fueron ingresadas

al Laboratorio de Bromatología y Microbiología de la Agencia Ecuatoriana de

Aseguramiento de la Calidad del Agro para llevar a cabo el análisis bromatológico. Todos

los análisis fueron realizados por duplicado y en función de lo establecido en los

procedimientos específicos de ensayo.

La determinación de humedad se llevó a cabo mediante el método de desecación

en estufa que utiliza la pérdida de peso de la muestra para calcular el contenido de agua,

mientras que para la determinación de los sólidos totales se utiliza el peso de la muestra

seca. Los resultados obtenidos se expresan a continuación en la Tabla 10.

Tabla 1

Resultados obtenidos de la determinación de humedad y sólidos totales

Identificación

de la muestra %Humedad

Promedio

%Humedad

%Sólidos

totales

Promedio

%Sólidos

totales

M1 89,65

89,21 10,35

10,79 88,78 11,22

M2 88,94

88,85 11,06

11,15 88,76 11,24

M3 88,60

88,81 11,40

11,19 89,01 10,99

M4 88,67

88,88 11,33

11,12 89,09 10,91

50

Para la determinación de grasa cruda se realizó un proceso de hidrólisis ácida que

permitió romper las uniones de los lípidos enlazados tanto iónica como covalentemente

en la muestra, generando formas fácilmente extraíbles y por ende aumentando la

eficiencia del proceso. El porcentaje de grasa se determinó gravimétricamente usando el

peso de las grasas extraídas y relacionándolo con el peso de la muestra inicial, los

resultados obtenidos se expresan en la Tabla 11.

Tabla 11

Resultados obtenidos de la determinación de grasa

Identificación

de la muestra %Grasa

Promedio

%Grasa

M1 0,46

0,48 0,49

M2 0,40

0,39 0,37

M3 0,50

0,50 0,49

M4 0,53

0,53 0,53

Para la determinación de proteínas se usó el método Kjeldahl, mismo que analiza

el nitrógeno orgánico y, mediante el uso de un factor de conversión, lo transforma en

porcentaje de proteína.

El factor utilizado corresponde al valor estándar de 6,25 ya que no existe una

relación específica entre contenido de nitrógeno-porcentaje de proteínas como en el caso

de otros alimentos como: lácteos, cereales o leguminosas. Los resultados obtenidos se

expresan a continuación en la Tabla 12.

Tabla 12

Resultados obtenidos de la determinación de proteína

Identificación

de la muestra %Proteína

Promedio

%Proteína

M1 0,75

0,77 0,79

M2 0,70

0,74 0,77

M3 0,73

0,70 0,67

M4 0,74

0,75 0,76

La determinación de cenizas se realizó mediante calcinación por vía seca, de esta

forma el agua y los elementos volátiles se vaporizaron, los compuestos orgánicos se

incineraron mientras que la mayoría de los elementos inorgánicos se convirtieron en

51

óxidos, sulfatos, fosfatos, cloruros, etc. Usando el peso de las cenizas obtenidas después

de la calcinación se calculó gravimétricamente su porcentaje, los resultados obtenidos

son expresados en la Tabla 13.

Tabla 13

Resultados obtenidos de la determinación de cenizas

Identificación

de la muestra %Cenizas

Promedio

%Ceniza

M1 1,58

1,58 1,59

M2 1,53

1,53 1,53

M3 1,57

1,55 1,52

M4 1,53

1,53 1,52

El porcentaje de fibra cruda se calculó mediante gravimetría, para lo cual se

eliminaron todas las posibles interferencias (lípidos, proteínas e hidratos de carbono

digeribles) mediante procesos de hidrólisis ácida y alcalina continuos. Los residuos no

solubilizados y no digeridos se recogieron por filtración, se secaron y se pesaron. Para

eliminar el error generado por la presencia de compuestos inorgánicos, los residuos

obtenidos fueron sometidos a calcinación. El valor obtenido se restó del correspondiente

a la fibra. Los resultados obtenidos se expresan en la Tabla 14.

Tabla 14

Resultados obtenidos de la determinación de fibra cruda.

Identificación de

la muestra %Fibra

Promedio

%Fibra

M1 0,94

0,92 0,90

M2 0,78

0,87 0,96

M3 0,82

0,82 0,82

M4 0,84

0,89 0,94

Los carbohidratos totales fueron calculados teóricamente por diferencia, de esta

manera la resta entre el peso total de la muestra y los valores obtenidos de grasa, proteína,

ceniza y humedad corresponden al contenido de hidratos de carbono totales. Los

resultados obtenidos se expresan a continuación mediante la Tabla 15.

52

Tabla 15

Resultados obtenidos de la determinación de carbohidratos totales

Identificación

de la muestra

% Carbohidratos

(por diferencia)

M1 7,96

M2 8,50

M3 8,45

M4 8,31

Los resultados generales del análisis bromatológico de las cuatro muestras se

expresan en la Tabla 16. De acuerdo con ellos, el agua constituye el principal

componente, mientras que los sólidos totales, que incluyen grasa, proteína, ceniza y

carbohidratos, conforman una décima del peso total de las cáscaras de banano analizadas.

En función de los coeficientes de variación se puede afirmar que la desviación en

las mediciones de grasa es significativamente mayor por lo que la precisión obtenida es

aceptable, mientas que en los otros parámetros es buena.

Tabla 16

Resultados generales del análisis bromatológico de la cáscara de banano

Identificación

de la muestra %Humedad

%Sólidos

totales %Grasa %Proteína %Ceniza %Fibra

%

Carbohidratos

M1 89,21 10,79 0,48 0,77 1,58 0,92 7,96

M2 88,85 11,15 0,39 0,74 1,53 0,87 8,50

M3 88,81 11,19 0,50 0,70 1,55 0,82 8,45

M4 88,88 11,12 0,53 0,75 1,53 0,89 8,31

Media total 88,94 % 11,06 % 0,47 % 0,74 % 1,55 % 0,87 % 8,30 %

Desviación

estándar 0,19 % 0,19 % 0,06 % 0,03 % 0,03 % 0,04 % 0,24 %

Coeficiente

de variación 0,21 1,68 12,81 3,88 1,64 4,78 2,93

La composición porcentual de los sólidos totales de la cáscara de banano se

expresa en la Tabla 17. El contenido de grasa, proteína y fibra existente es bajo en

contraste con la cantidad de cenizas que es significativa, ya que es mayor al valor

correspondiente a la pulpa de la misma fruta expuesto por USDA, 2016. Los

carbohidratos constituyen aproximadamente tres cuartas partes de los sólidos totales.

53

Tabla 17

Composición porcentual de los sólidos totales presentes en la cáscara de banano

Porcentaje (%)

Grasa 4,28

Proteína 6,67

Ceniza 13,99

Fibra 7,90

Carbohidratos 75,06

4.3. Extracción

Previo a la extracción, las cáscaras de banano fueron limpiadas, separadas de la

pulpa, secadas y su tamaño reducido. Para el primer método de extracción, una cantidad

específica de muestra fue sometida a maceración, por 24 horas a temperatura ambiente,

usando éter de petróleo como solvente. Posteriormente el extracto obtenido fue filtrado

y concentrado al vacío, mientras que la materia vegetal fue secada al ambiente y sometida

nuevamente a maceración, en las mismas condiciones, pero usando como solvente

cloroformo. El proceso de maceración continua se repitió dos veces más usando acetato

de etilo y agua. La Tabla 18 resume el proceso llevado a cabo para el primer método de

extracción.

Tabla 18

Datos generados durante el primer método de extracción

Muestra Peso (g) Solvente de

extracción

Volumen del

solvente usado (mL)

Volumen final

del extracto (mL)

E0 200,58

Éter de petróleo 400 200

Cloroformo 400 200

Acetato de etilo 400 200

Agua 400 200

Para el segundo método, el extracto se obtuvo mediante un proceso de maceración

por 24 horas a temperatura ambiente, usando como solvente de extracción alcohol etílico

al 70%. Una vez terminado este proceso, se filtró el extracto y se concentró al vacío,

hasta obtener un volumen final establecido, tal y como se puede apreciar en la Tabla 19.

El proceso de maceración se realizó por duplicado, el primer extracto, E1, se

utilizó para los ensayos de actividad antimicrobiana, mientras que el segundo, E2, se usó

tanto para las pruebas de tamizaje fitoquímico como para el fraccionamiento.

Tabla 19

Datos generados durante el proceso de extracción según el segundo método

Muestra Peso (g) Volumen de etanol

al 70% (ml)

Volumen final del

extracto (ml)

E1 200,47 400 200

E2 209,81 400 200

54

4.4. Ensayo de actividad antimicrobiana

Los extractos obtenidos por el primer método se caracterizaron por presentar una

coloración amarilla intensa, apariencia opaca y una consistencia muy poco fluida que

dificultó su manipulación, impidiendo la correcta preparación de las diferentes

concentraciones necesarias para el ensayo de actividad antimicrobiana. Por lo tanto, las

fracciones obtenidas por el primer método fueron analizadas únicamente mediante las

pruebas cualitativas de tamizaje fitoquímico.

El extracto crudo E1 obtenido mediante el segundo método presentó una

coloración naranja intensa y, a diferencia de los extractos anteriormente mencionados,

una consistencia fluida y manejable. Para realizar el ensayo de actividad antimicrobiana

se obtuvieron diferentes concentraciones a partir de este extracto, los datos generados se

exponen en la Tabla 20.

Tabla 20

Datos correspondientes a las concentraciones del extracto madre usado

Volumen del extracto

madre usado (mL)

Volumen final después

de concentración (mL)

Factor de

concentración

Blanco (etanol al 70%) - - -

Concentración 1 5 5 1




Una vez obtenido el extracto madre y las diferentes concentraciones se procedió

a impregnar los discos de papel filtro previamente esterilizados, para lo cual éstos se

introdujeron y permanecieron sumergidos en los extractos por 24 horas, protegidos de la

luz y en refrigeración. Transcurrido el tiempo necesario, fueron removidos y secados al

ambiente, dentro de la cabina de bioseguridad para evitar cualquier posible

contaminación, para posteriormente ser usados en el ensayo de actividad antimicrobiana.

Las determinaciones se realizaron por triplicado y los resultados obtenidos se

expresan en la Tabla 22. Durante el procesamiento de los datos mediante el análisis de

varianza ANOVA de dos factores para evaluar el efecto de las diferentes concentraciones

del extracto crudo sobre la inhibición del crecimiento de las bacterias Escherichia coli y

Staphylococcus aureus se propusieron seis hipótesis, mismas que se exponen en la Tabla

21.

Tabla 21

Hipótesis propuestas para la evaluación del efecto de las concentraciones del extracto crudo

sobre la inhibición del crecimiento de las bacterias de interés.

Fuente de variación Hipótesis propuestas

Tipos de bacterias

𝐻0𝑋 𝑠𝑋

2 = 𝑠𝐸2

La varianza debida al tipo de bacteria es

igual a la varianza del error

𝐻1𝑋 𝑠𝑋

2 ≠ 𝑠𝐸2

La varianza debida al tipo de bacteria es

mayor a la varianza del error

55


Concentraciones del

extracto crudo

𝑯𝟎𝒀 𝒔𝒀

𝟐 = 𝒔𝑬𝟐

La varianza debida a las concentraciones del

extracto crudo es igual a la varianza del error

𝐻1𝑌 𝑠𝑌

2 ≠ 𝑠𝐸2

La varianza debida a las concentraciones del

extracto crudo es mayor a la varianza del

error

Interacción entre

factores

𝐻0𝑋𝑌 𝑠𝑋𝑌

2 = 𝑠𝐸2

La varianza debida a la interacción entre

factores es igual a la varianza del error


2 ≠ 𝑠𝐸2


factores es mayor a la varianza del error

De acuerdo a las resultados obtenidos en la ANOVA realizada, para el factor tipo

de bacterias se acepta la hipótesis nula (Ho), es decir, no existe diferencia significativa

entre las medias de las mediciones de los halos de inhibición debidas al tipo de

microorganismo analizado (Staphylococcus aureus y Escherichia coli). Sin embargo,

para el factor concentraciones del extracto crudo, ya que el Fcalculado es mayor que los F5%

y F1% tabulados, se rechaza la hipótesis nula, aceptando la hipótesis alternativa (H1), lo

que indica que sí existe una diferencia altamente significativa entre las medias de las

mediciones de los halos de inhibición debidas a las concentraciones estudiadas y que por

lo tanto al menos una de ellas es diferente. Del análisis de varianza también se desprende

que no existe interacción entre tipo de bacterias y concentraciones analizadas, ya que el

Fcalculado es menor que los valores tabulados.

Tabla 22

ANOVA de los datos obtenidos del ensayo de actividad antimicrobiana de las diferentes

concentraciones del extracto madre

Resumen Concentraciones del extracto crudo

Staphylococcus aureus CO C1 C2 C3 C4 Total

Cuenta 3 3 3 3 3 15

Suma (mm) 18 18 21 23 47 127

Promedio (mm) 6 6 7 7,67 15,67 8,47

Varianza (mm2) 0 0 1 0,33 0,33 14,55

Escherichia coli

Cuenta 3 3 3 3 3 15

Suma (mm) 18 18 20 26 50 132

Promedio (mm) 6 6 6,67 8,67 16,67 8,8

Varianza (mm2) 0 0 0,33 0,33 0,33 17,74

Total

Cuenta 6 6 6 6 6

Suma (mm) 36 36 41 49 97

Promedio (mm) 6 6 6,83 8,17 16,17

Varianza (mm2) 0 0 0,57 0,57 0,57

56

Debido a que se rechazó la hipótesis nula propuesta para el factor concentraciones

del extracto crudo, se llevó a cabo la prueba de rangos múltiples correspondiente al

procedimiento de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey para identificar

cuales medias son significativamente diferentes de otras. Los resultados obtenidos se

expresan en la Tabla 23, según esta prueba, existen 3 grupos homogéneos de medias,

identificados según la alineación de las X´s en columnas, el primer grupo se encuentra

formado por el blanco y las dos concentraciones más bajas analizadas C1 y C2, el

segundo grupo se encuentra formado por la concentración C3 y el último lo constituye la

concentración C4, siendo ésta la que presenta una mayor inhibición en el crecimiento de

los microorganismos analizados.

Tabla 23

Pruebas de Múltiple Rangos para Diámetro de inhibición por Concentraciones

Concentración de

extracto Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

BLANCO 6 6,00 0,210819 X

C1 6 6,00 0,210819 X

C2 6 6,83 0,210819 X

C3 6 8,16 0,210819 X

C4 6 16,1667 0,210819 X

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

BLANCO - C1 0 0,892426

BLANCO - C2 -0,833333 0,892426

BLANCO - C3 * -2,16667 0,892426

BLANCO - C4 * -10,1667 0,892426

C1 - C2 -0,833333 0,892426

C1 - C3 * -2,16667 0,892426

C1 - C4 * -10,1667 0,892426

C2 - C3 * -1,33333 0,892426

C2 - C4 * -9,33333 0,892426

C3 - C4 * -8,0 0,892426

* indica una diferencia significativa.

ANÁLISIS DE VARIANZA

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados

de

libertad

Promedio

de los

cuadrados

F Probabilidad

Valor

crítico

F5%

Valor

crítico

F1%

Tipo de Bacterias 0,83 1 0,83 3,12 0,09 4,35 8,10

Concentraciones

del extracto crudo 444,47 4 111,12 416,69** 5,98E-19 2,87 4,43

Interacción 2,33 4 0,58 2,19 0,11 2,87 4,43

Error 5,33 20 0,27

Total 452,96 29

57

Gráfica 1. Distribución de las medias de las mediciones de los halos de inhibición en función de

la concentración del extracto etanolico crudo. Tres grupos homogéneos son identificados, grupo

1: blanco-C1-C2; grupo 2: C3 y grupo 3: C4, mismo que genera un mayor efecto de inhibición

en el crecimiento de las bacterias estudiadas.

4.5. Fraccionamiento

Debido a que la concentración 4, según los resultados del Test de Tukey, generó

una mayor inhibición en el crecimiento de las bacterias, el extracto etanolico crudo E2 se

fraccionó, concentró y reconstituyó de tal forma que se mantuvo el factor de

concentración de 10, los datos generados se exponen en la Tabla 24.

Tabla 24

Datos correspondientes al fraccionamiento del extracto madre

Volumen del extracto

madre usado (mL)

Volumen después de

reconstitución (mL)

Factor de

concentración

Fracción A 50 5 10

Fracción B 50

5 10

Fracción C 5 10

Fracción D 50 5 10

Fracción E 50 5 10

Una vez obtenidas las fracciones, para llevar a cabo el ensayo de actividad

antimicrobiana se impregnaron los discos de papel de la misma forma que para el extracto

crudo y sus diferentes concentraciones.

Las determinaciones se realizaron por triplicado y los resultados obtenidos se

expresan en la Tabla 26. Durante el procesamiento de datos, mediante el análisis de

varianza ANOVA de dos factores, para evaluar el efecto de las diferentes fracciones

obtenidas a partir del extracto crudo sobre la inhibición del crecimiento de las bacterias

Escherichia coli y Staphylococcus aureus se propusieron seis hipótesis, mismas que se

exponen en la Tabla 25.

58

Tabla 25

Hipótesis propuestas para la evaluación del efecto de las diferentes fracciones sobre la

inhibición del crecimiento de las bacterias de interés.

Fuente de variación Hipótesis propuestas

Tipos de bacterias

𝐻0𝑋 𝑠𝑋

2 = 𝑠𝐸2

La varianza debida al tipo de bacteria es igual

a la varianza del error

𝐻1𝑋 𝑠𝑋

2 ≠ 𝑠𝐸2

La varianza debida al tipo de bacteria es mayor


Tipo de fracción

𝐻0𝑌 𝑠𝑌

2 = 𝑠𝐸2

La varianza debida al tipo de fracción es igual


𝐻1𝑌 𝑠𝑌

2 ≠ 𝑠𝐸2

La varianza debida al tipo de fracción es

mayor a la varianza del error

Interacción entre

factores


2 = 𝑠𝐸2


factores es igual a la varianza del error


2 ≠ 𝑠𝐸2


factores es mayor a la varianza del error

Al contrastar los valores de Fcalculados con los F5% y F1% tabulados, para el factor

tipo de bacterias se aceptó la hipótesis nula (H0), mientras que para el factor tipo de

fracción se rechazó la misma aceptando en su lugar la hipótesis alternativa (H1), es decir,

existe diferencia altamente significativa entre las medias de las mediciones de los halos

de inhibición debida a las fracciones utilizadas mas no debida al microorganismo

analizado. Con respecto a la interacción entre los factores, se acepta la hipótesis nula

(H0), no existe ningún efecto significativo producido por ella.

Tabla 26

ANOVA de los datos obtenidos del ensayo de actividad antimicrobiana de las diferentes

fracciones

Resumen Fracciones obtenidas a partir del extracto crudo C4

Staphylococcus aureus FA FB FC FD FE Total

Cuenta 3 3 3 3 3 15

Suma (mm) 18 22 22 19 18 99

Promedio (mm) 6 7,33 7,33 6,33 6 6,6

Varianza (mm2) 0 0,33 0,33 0,33 0 0,54

Escherichia coli

Cuenta 3 3 3 3 3 15

Suma (mm) 18 23 19 18 19 97

Promedio (mm) 6 7,67 6,33 6 6,33 6,47

Varianza (mm2) 0 0,33 0,33 0 0,33 0,55

Total

Cuenta 6 6 6 6 6

Suma (mm) 36 45 41 37 37

Promedio (mm) 6 7,5 6,83 6,17 6,17

Varianza (mm2) 0 0,3 0,57 0,17 0,17

59

ANÁLISIS DE VARIANZA

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio

de los

cuadrados

F Probabilidad

Valor

crítico

F5%

Valor

crítico

F1%

Tipo de

bacterias 0,13 1 0,13 0,67 0,42 4,35 8,10

Tipo de

fracción 9,47 4 2,37 11,83** 0,00 2,87 4,43

Interacción 1,87 4 0,47 2,33 0,09 2,87 4,43

Error 4 20 0,2

Total 15,47 29

Debido a que se aceptó la hipótesis alternativa para el factor tipo de fracción, se

procedió a realizar la prueba de Tukey o Diferencia Mínima Significativa, los resultados

obtenidos se expresan a continuación en la Tabla 27. Según esta prueba, existen 3 grupos

homogéneos de medias, identificados según la alineación de las X´s en columnas, El

primer grupo está formado por las fracciones A, D y E; el segundo grupo por las

fracciones D, E y C; y, el último grupo lo constituyen las fracciones C y D, que presentan

una mayor inhibición en el crecimiento de las bacterias.

Tabla 27

Pruebas de Múltiple Rangos para Diámetro de inhibición por Fracciones

Fracciones Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

FA 6 6,0 0,182574 X

FD 6 6,16667 0,182574 XX

FE 6 6,16667 0,182574 XX

FC 6 6,83333 0,182574 XX

FB 6 7,5 0,182574 X

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

FA - FB * -1,5 0,772864

FA - FC * -0,833333 0,772864

FA - FD -0,166667 0,772864

FA - FE -0,166667 0,772864

FB - FC 0,666667 0,772864

FB - FD * 1,33333 0,772864

FB - FE * 1,33333 0,772864

FC - FD 0,666667 0,772864

FC - FE 0,666667 0,772864

FD - FE 0 0,772864

* indica una diferencia significativa.

60

Gráfica 2. Distribución de las medias de las mediciones de los halos de inhibición en función de

las fracciones obtenidas del extracto etanolico crudo. Tres grupos homogéneos son identificados,

grupo 1: A-D-E; grupo 2: D-E-C y grupo 3: C-B, mismos que generan un mayor efecto de

inhibición en el crecimiento de las bacterias estudiadas.

En función de la respuesta in vitro de un microorganismo frente a un determinado

antibiótico, expresado como el halo de inhibición, su nivel de susceptibilidad puede ser

categorizado como: sensible, intermedio o resistente. Para la mayoría de bacterias de

interés clínico existen criterios de interpretación tabulados en función de los antibióticos

de estudio. (Ver Anexo 9 y 10)

Las medias de los halos de inhibición generados por la concentración del extracto

etanolico crudo correspondiente a un factor de 10, así como las medias de las fracciones

B y C, que generaron una inhibición significativamente mayor, fueron comparadas con

los valores tabulados de varios antibióticos de uso común tanto para Staphylococcus

aureus como para Escherichia coli.

En el caso de Staphylococcus aureus, las medias obtenidas del extracto crudo y

de las fracciones B y C fueron: 16mm, 7mm y 7mm respectivamente, que al contrastarlas

con los valores correspondientes a penicilina G, norfloxacina, eritromicina, clindamicina

y tetraciclina, permitieron categorizar a la bacteria como intermedia para el caso del

extracto crudo y resistente para las fracciones. Para el caso de Escherichia coli, las

medias fueron 16mm, 8mm y 6mm para el extracto crudo y las dos fracciones, que al

compararlas con los valores de ampicilina, tetraciclina, norfloxacina, cloranfenicol y

amoxicilina la clasificaron como intermedia frente al extracto crudo y resistente frente a

las fracciones.

4.6. Tamizaje Fitoquímico

Pese a que no fue posible realizar el ensayo de actividad antimicrobiana en las

cuatro fracciones obtenidas mediante el primer método de extracción sí se llevaron a cabo

las pruebas cualitativas de identificación de grupos fitoquímicos, la Tabla 28 recoge los

resultados obtenidos.

61

Se identificó, en la fracción obtenida con éter de petróleo, la presencia de

compuestos grasos (aceites) y esteroles así como la ausencia de alcaloides. En la fracción

clorofórmica, al igual que en la fracción etérea, se identificaron compuestos grasos y

esteroles pero en una cantidad menor, mientras que los compuestos fenólicos y taninos

se encontraron ausentes. Se identificó la presencia de esteroles y la ausencia de

flavonoides, compuestos fenólicos y taninos en la fracción obtenida usando acetato de

etilo como solvente de extracción. En la fracción acuosa no se identificaron flavonoides

ni alcaloides, sin embargo se reconoció la presencia de compuestos fenólicos, taninos y

saponinas.

La cantidad de compuestos grasos y esteroles presentes en la cáscara de banano

puede asumirse como elevada, ya que su presencia se identificó en varios de los extractos

obtenidos. Para el caso de los compuestos grasos, el solvente usado en la primera

extracción (éter de petróleo) se saturó y por ende el proceso realizado no fue completo,

consecuentemente, en la posterior extracción sucesiva que utilizó cloroformo como

solvente también fueron identificados estos compuestos. Lo mismo ocurrió en el caso de

los esteroles, aunque éstos fueron reconocidos también en el extracto obtenido con

acetato de etilo.

Tabla 28

Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico de las fracciones obtenidas por el primer método

de extracción

Solvente usado en

la extracción Ensayo Resultado Observaciones

Éter de petróleo


Burchard +++

Cambio de coloración a verde

intenso

Ensayo de Sudan +++ Aparición de gotas de color rojo

intenso

Ensayo de Baljet - No hay cambio de coloración o

aparición de precipitado rojo

Ensayo de Dragendorff - No formación de opalescencia,

turbidez ni precipitado

Cloroformo


Burchard ++


intenso

Ensayo de Sudan ++ Aparición de gotas de color rojo

intenso

Ensayo de cloruro

férrico -

No cambio apreciable de

coloración

Acetato de etilo


Burchard +


intenso

Ensayo de Shinoda - No formación de espuma ni

cambio evidente de color

Ensayo de cloruro

férrico -

No cambio apreciable de

coloración

62


Agua

Ensayo de Shinoda - No formación de espuma ni

cambio evidente de color

Ensayo de cloruro

férrico ++


intenso

Ensayo de espuma + Formación de espuma

Ensayo de Dragendorff - No formación de opalescencia,

turbidez ni precipitado

Se realizaron pruebas cualitativas para la identificación de grupos fitoquímicos

en las fracciones obtenidas a partir del extracto crudo generado mediante el segundo

método de extracción y los resultados se resumen en la Tabla 29. Adicionalmente a estas

fracciones se las analizó mediante cromatografía en capa fina, los resultados se exponen

en la Tabla 30.

Las pruebas realizadas sobre la fracción A indicaron la ausencia de alcaloides;

mientras que los resultados obtenidos de la fracción B confirmaron la presencia de

esteroles y triterpenos. En la fracción C se identificaron varios grupos fitoquímicos:

flavonoides, compuestos fenólicos, saponinas y taninos no hidrolizables y condensados,

sin embargo en la fracción D, que fue analizada por las mismas pruebas cualitativas, no

se identificó ninguna familia de compuestos fitoquímicos. Se descartó la presencia en la

fracción E de glicósidos cardiotónicos y compuestos con agrupamiento lactónico como

las curaminas.

Es importante recalcar que debido a la coloración intensa del extracto y sus

fracciones, en la prueba de gelatina salada, reacción de Stiasny y medio alcalino, pese a

que se formó precipitado no se pudo discernir claramente el color del mismo, razón por

la cual su resultado se expresó como escaso (+/-).

Tabla 29

Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico de las fracciones obtenidas por el segundo método

de extracción

Reacción Resultado Observaciones

Fracción A

Mayer - No formación de opalescencia,

turbidez ni precipitado Wagner -

Draggendorff -

Fracción B Ensayo de Libermand-

Burchard +++ Cambio de coloración a verde intenso

Fracción C

Ensayo de Shinoda +++ Desarrollo de abundante espuma sin

cambio observable de coloración

Reacción en medio

alcalino +/-

Cambio de coloración a rojo intenso al

añadir gotas de KOH etanólico, no

cambio apreciable de color al añadir

FeCl3 al 2%

Ensayo de antocianos - No cambio apreciable de coloración

63


Fracción C

Ensayo de Bontrager - No cambio de coloración apreciable

Ensayo de cloruro

férrico +++ Cambio de coloración a verde intenso

Ensayo de gelatina

salada +/-

Formación de precipitado floculento,

no identificación de color

Reacción de Stiasny +/- Formación de precipitado en forma de

copos, no identificación de color

Ensayo de espuma ++ Formación de espuma

Fracción D

Ensayo de Shinoda - No desarrollo de espuma ni cambio

observable de coloración

Reacción en medio

alcalino - No cambio apreciable de coloración

Ensayo de antocianos - No cambio apreciable de coloración

Ensayo de Bontrager - No cambio apreciable de coloración

Ensayo de cloruro

férrico - No cambio apreciable de coloración

Ensayo de gelatina

salada - No formación de precipitado floculento

Reacción de Stiasny - No formación de precipitado en forma

de copos rojos

Ensayo de espuma - No formación de espuma

Fracción E Reacción de Kedde - No cambio apreciable de coloración

Ensayo de Baljet - No cambio apreciable de coloración

Al comparar los resultados de las pruebas cualitativas realizadas en los dos grupos

de fracciones obtenidos por diferentes métodos de extracción, se evidenció que el

reconocimiento de los grupos de compuestos fitoquímicos fue casi el mismo, sin embargo

en lo referente a flavonoides los resultados difirieron, siendo ausencia para los extractos

acuoso y de acetato de etilo del primer método y presencia para la fracción B del segundo.

Posiblemente el solvente usado no permitió una correcta estabilización de los compuestos

extraídos, impidiendo su adecuada identificación.

Los resultados obtenidos de la técnica cromatográfica de capa fina llevada a cabo

en las fracciones concuerdan con los correspondientes a las pruebas cualitativas para la

identificación de las familias de compuestos fitoquímicos. En las fracciones B y C se

reconoció la presencia de esteroles y flavonoides respectivamente, los resultados totales

son expuestos en la Tabla 30. Al revelar las placas obtenidas para esteroles y flavonoides

se observaron 4 manchas en cada una de ellas, para la identificación de flavonoides

también fueron leídas las placas en UV y fluorescencia identificando los colores

desarrollados. Se calcularon los factores de retención o Rf, mediante el cociente entre la

64

distancia recorrida por la muestra sobre la distancia recorrida por la fase móvil, los

resultados se exponen en la Tabla 31.

Tabla 30

Resultados obtenidos de la cromatografía de capa fina

Fracción Grupo fitoquímico Observaciones

Fracción A Alcaloides -

Fracción B Esteroles

Aparición de manchas de diferente

color. Manchas fluorescentes en UV

onda larga

Fracción C Flavonoides

Manchas fluorescentes en UV

Fracción D -

Fracción C Antraquinonas

-

Fracción D -

Fracción E Sesquiterpenos -

Fracción E Glucósidos

cardiotónicos -

Las técnicas de separación cromatográfica han sido ampliamente utilizadas

durante el estudio de los compuestos flavonoides debido a sus características de

solubilidad y a los colores característicos que presentan en luz visible y ultravioleta. Los

resultados obtenidos fueron comparados con datos de referencia de diferentes tipos de

flavonoides (ver Anexo 12) identificando la presencia de flavonoles, flavanonas e

isoflavonas.

Tabla 31

Rf obtenidos de la cromatografía de capa fina

Grupo fitoquímico 𝑹𝒇 Color en UV Color en fluorescencia

Flavonoides

0,21 Azul Si

0,31 Azul Si

0,57 Amarillo No

0,90 Amarillo Si

Esteroles

0,24 - -

0,33 - -

0,40 - -

0,47 - -

Los resultados obtenidos durante la realización de este trabajo de investigación

fueron comparados con datos previos e información disponible. En Ecuador no existe

registro de otras investigaciones realizadas sobre la composición bromatológica de la

cáscara de banano Musa paradisiaca, razón por la cual los resultados obtenidos destacan

por su trascendencia. Adicionalmente, el conocimiento del contenido general de los

diferentes nutrientes presentes en la cáscara constituye la base para el planteamiento de

posibles aplicaciones que, con futuras investigaciones, permitirá finalmente otorgarle

usos innovadores a este subproducto.

65

Los grupos de compuestos fitoquímicos identificados en los extractos se

caracterizan por sus propiedades bioactivas y su potencial utilidad en la industria, no

obstante los resultados obtenidos difieren de los generados en otras investigaciones.

Niamah (2014) identificó, en el extracto metanólico crudo obtenido por

maceración, la presencia de compuestos fenólicos, flavonoides, saponinas, glicósidos y

la ausencia de taninos. Mordi et al. (2016), obtuvieron un extracto metanólico a través

del método Soxhlet en el que identificaron terpenos, taninos, esteroles y compuestos

fenólicos en trazas, reconociendo además la ausencia de flavonoides. Ahmed (2015)

identificó la presencia de saponinas, carotenoides, compuestos fenólicos, taninos y

ausencia de alcaloides en el extracto etanolico crudo. Los diferentes métodos de

preparación de muestra, extracción y los solventes usados son los posibles responsables

de la discrepancia en los resultados.

Varias investigaciones con respecto a la actividad antimicrobiana de la cáscara de

banano han sido realizadas en todo el mundo, no obstante, existe una notable diferencia

entre los datos generados en esta investigación y los existentes. Ravinder et al. (2013),

concluyó que la cáscara de banano posee actividad antimicrobiana significantiva sobre

Aeromona hydrophyla, Staphylococcus aureus y Pseudomona citrii, pero actividad nula

frente a enterobacterias como Escherichia coli, Shigela sp., Klebsiella pneumoniae y

Salmonella thyphi y thypinurium. Niamah (2014), evidenció una elevada actividad

antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus, Lactobacillus casei, Bacillus sp., y una

actividad menor sobre Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa. Ahmed (2015),

reportó una elevada actividad sobre Staphylococcus aureus, P. aeruginosa así como en

los hongos Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillium digitatum y Fusarium

oxysporum; mientras que la actividad antimicrobiana sobre Escherichia coli fue menor.

Mordi et al. (2016), identificó una elevada actividad antimicrobiana sobre Escherichia

coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Klebsiella spp., y Pseudomona spp.

Es importante recalcar que, pese a que las investigaciones mencionadas se

realizaron en banano maduro de la misma especie, la fisiología de las plantas durante su

desarrollo se ve afectada directamente por factores como el tipo de suelo, clima, cantidad

de lluvias, época del año en la cual se produce, etc. Por lo tanto, existirán diferencias en

la composición de los compuestos fitoquímicos presentes lo cual se traduce en

variaciones en sus propiedades bioactivas, lo cual explicaría la discrepancia de los datos

de actividad antimicrobiana.

La existencia de actividad antimicrobiana y la presencia de grupos fitoquímicos

específicos en el extracto de la cáscara de banano Musa paradisiaca sustentan y justifican

una posible utilización en la industria. Como ya se ha demostrado, el desarrollo de

aplicaciones a base de este subproducto constituiría una alternativa sostenible, ecológica

e innovadora, que orientándolo adecuadamente permitiría inclusive enfrentar de alguna

forma el cada vez más preocupante problema de resistencia a los antibióticos. Por lo

tanto, más investigaciones en este aspecto deben ser realizadas.

66

CAPITULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1. Conclusiones

- Se determinó la composición proximal de la cáscara de banano (Musa

paradisiaca) en completo estado de maduración como: 88,94% humedad y

11,06% sólidos totales, mismos que se descomponen en 0,47% grasa, 0,74%

proteína, 1,55%ceniza; 0,87% fibra y 8,30% carbohidratos.

- Se realizaron dos métodos de extracción en las cáscaras de banano, mediante el

primero, que consistió en una maceración sucesiva con cuatro solventes de

polaridad creciente (éter de petróleo, cloroformo, acetato de etilo y agua), se

identificó la presencia de las familias de grupos fitoquímicos correspondientes a:

compuestos grasos, esteroles, triterpenos, compuestos fenólicos, taninos y

saponinas; mientras que en el segundo método de extracción, que consistió en

una maceración con etanol al 70% y posterior fraccionamiento, se identificaron:

esteroles, triterpenos, flavonoides, taninos no hidrolizables y condensados y

saponinas.

- Se realizó el ensayo de actividad antimicrobiana mediante el método de difusión

en discos sobre las bacterias Staphylococcus aureus y Escherichia coli usando un

blanco y cuatro diferentes concentraciones del extracto etanólico crudo y se

determinó que la concentración 4, la más alta estudiada y correspondiente a un

factor de concentración de 10, genera una mayor inhibición en el crecimiento de

los microorganismos ensayados.

- Se determinó estadísticamente que las fracciones B y C, obtenidas a partir del

extracto etanólico crudo, generan una mayor inhibición en el crecimiento de los

microorganismos Staphylococcus aureus y Escherichia coli.

- En base a los resultados de las pruebas de actividad antimicrobiana y de tamizaje

fitoquímico, se identificaron como familias de compuestos fitoquímicos

responsables de la actividad antimicrobiana de las cáscaras de banano a: esteroles,

triterpenos, flavonoides, taninos no hidrolizables y condensados, saponinas y

compuestos fenólicos.

- Se evidenció que existe un mayor efecto de inhibición en el crecimiento de los

microorganismos Staphylococcus aureus y Escherichia coli al usar el extracto

crudo que al usar las fracciones.

67

5.2. Recomendaciones

- Se recomienda realizar más estudios sobre la actividad antimicrobiana del

banano en diferentes estados de maduración, de diferentes especies, así como

sobre otros microorganismos, tanto bacterias como hongos.

- Realizar un análisis del contenido de minerales y del tipo de carbohidratos

presentes en la cáscara de banano.

- Realizar el análisis del tipo de ácidos grasos del aceite presente en la cáscara

de banano.

- Debido a que se evidenció la presencia de flavonoides, se recomienda evaluar

la capacidad antioxidante de los extractos de la cáscara de banano.

- Se recomienda realizar un estudio más a profundidad de las fracciones B y C

mediante cromatografía de capa fina, usando otras fases móviles y estándares

de flavonoides y esteroles, para poder comparar los resultados con mayor

precisión.

- Realizar extracciones enfocadas en el aislamiento de los grupos fitoquímicos

responsables de la actividad antimicrobiana de la cáscara del banano, para

posteriormente someter los extractos a técnicas de cromatografía de gases

acoplada a un detector de masas para así estimar de forma más precisa la

identidad de los compuestos individuales.

- Se recomienda realizar un análisis cuantitativo de los metabolitos secundarios

mediante la determinación de compuestos fenólicos, flavonoides, saponinas

y taninos totales mediante técnicas colorimétricas y espectrofotométricas.

- Desarrollar nuevas formas de utilización de la cáscara de banano y

aprovechamiento de sus propiedades bioactivas, como por ejemplo la

elaboración de piensos o inclusive alimentos de consumo humano.

- Ya que se demostró in vitro, se recomienda evaluar la actividad

antimicrobiana de la cáscara de banano in vivo.

68

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72

ANEXOS

Anexo 1. Diagrama de Ishikawa (espina de pez)

73

Anexo 2. Diagrama de flujo del proceso experimental

74

Anexo 3. Valores críticos de F para un contraste de una cola (P=0,05)

𝑉1= número de grados de libertad del numerados

𝑉2= número de grados de libertad del denominador

Tomado de Miller & Miller (2002)

75

Anexo 4. Tabla de Rangos Estudentizados significativos para un nivel del

0,05%

Tomado de Universidad de Valencia (s.f.)

76

Anexo 5. Fotografías del proceso de recolección y preparación de la muestra

previo al análisis bromatológico

Fotografía 1. Banano disponible en el lugar de muestreo Fotografía 2. Muestra de banano limpias

Fotografía 3. Reducción manual de tamaño de muestra Fotografía 4. Molino usado para reducir tamaño de la muestra

Fotografías 5 y 6. Reducción de tamaño de las cáscaras de banano frescas para su ingreso en el Laboratorio de

Bromatología

5 6

1 2

3 4

77

Anexo 6. Fotografías del proceso de preparación de la muestra y obtención de

extractos

Fotografía 7. Muestra de banano lavado Fotografía 8. Cáscaras cortadas antes de secarlas

Fotografías 9. Cáscaras de banano secas Fotografía 10. Banano seco molido

Fotografías 11 y 12. Extractos obtenidos por maceración sucesiva con solventes de polaridad creciente (éter de petróleo, cloroformo, acetato de etilo, agua). Extractos crudos obtenidos por maceración con etanol al 70%.

7 8

9 10

11 12

78

Anexo 7. Fotografías obtenidas durante los ensayos de actividad

antimicrobiana del extracto crudo

Fotografías 13 y 14. Crecimiento de Staphylococcus aureus y Escherichia coli en agar sangre y EMB

respectivamente.

Fotografías 15. Ensayo de actividad antimicrobiana usando la concentración 4 del extracto madre.

Fotografías 16. Ensayo de actividad antimicrobiana usando la fracción A.

13 14

15

16

79

Fotografías 17. Ensayo de actividad antimicrobiana usando la fracción B.

Fotografías 18. Ensayo de actividad antimicrobiana usando la fracción C.

Fotografías 19. Ensayo de actividad antimicrobiana usando la fracción D.

Fotografías 20. Ensayo de actividad antimicrobiana usando la fracción E.

17

18

19

20

80

Anexo 8. Imágenes obtenidas durante el tamizaje fitoquímico y cromatografía

en capa fina

Fotografías 21-27. Resultados de pruebas cualitativas de identificación de grupos funcionales,

Fotografías 28-31. Placas obtenidas de la cromatografía en capa fina.

28 29 31 30

27

26 25 24

23 22 21

81

Anexo 9. Patrones estándar del halo de inhibición para estafilococos, puntos de

corte equivalente a la CMI y diámetro del halo de inhibición para la cepa

Staphylococcus aureus ATCC 25923 empleado como control de calidad.

Tomado de Sacsaquispe & Velásquez (2012)

82

Anexo 10. Patrones estándar del halo de inhibición, puntos de corte equivalente

a la CMI para enterobacterias y diámetro del halo de inhibición para la cepa

Escherichia coli ATCC 25922 empleado como control de calidad.

Tomado de Sacsaquispe & Velásquez (2012)

83

Anexo 11. Identificación taxonómica de la especie de banano estudiada

84

Anexo 12. Tablas de identificación de compuestos flavonoides

Tomado de Harborne (1959)


85


86

Anexo 13. Instrumento de recolección de datos para el análisis bromatológico.

ANÁLISIS BROMATOLÓGICO

%HUMEDAD-SÓLIDOS TOTALES

Peso cápsula

vacía (g)

Peso

muestra (g)

Peso cápsula+

muestra seca (g) %Humedad

Promedio

%Humedad

%Sólidos

totales

Promedio

%Sólidos

totales

M1 26,2102 2,0030 26,4176 89,65

89,21 10,35

10,79 25,3897 2,0053 25,6147 88,78 11,22

M2 25,047 2,0108 25,2694 88,94

88,85 11,06

11,15 25,2636 2,0030 25,4887 88,76 11,24

M3 26,6908 2,0075 26,9196 88,60

88,81 11,40

11,19 27,226 2,0052 27,4464 89,01 10,99

M4 21,4994 2,0089 21,727 88,67

88,88 11,33

11,12 24,7218 2,0080 24,9408 89,09 10,91

%GRASA

Peso vaso

vacío (g)

Peso

muestra (g)

Peso vaso+

grasa (g) %Grasa

Promedio

%Grasa

M1 73,7141 2,0042 73,7234 0,46

0,48 76,7832 2,004 76,7931 0,49

M2 73,8483 2,001 73,8563 0,40

0,39 72,5476 2,0271 72,5552 0,37

M3 71,3234 2,0035 71,3335 0,50

0,50 74,8999 2,0296 74,9099 0,49

M4 73,8498 2,0199 73,8605 0,53

0,53 74,8984 2,0351 74,9091 0,53

%PROTEINA

Peso

muestra

(g)

Volumen del

titulante (ml)

Concentración

titulante (N)

Volumen del

blanco (ml) Factor %Proteína

Promedio

%Proteína

M1 1,0302 0,97 0,101 0,1 6,25 0,75

0,77 1,0228 1,01 0,101 0,1 6,25 0,79

M2 1,0202 0,91 0,101 0,1 6,25 0,70

0,74 1,0478 1,01 0,101 0,1 6,25 0,77

M3 1,0721 0,98 0,101 0,1 6,25 0,73

0,70 1,0107 0,87 0,101 0,1 6,25 0,67

M4 1,0513 0,98 0,101 0,1 6,25 0,74

0,75 1,0344 0,99 0,101 0,1 6,25 0,76

87

%CENIZAS

Peso crisol

vacío (g)

Peso muestra

(g)

Peso crisol+

ceniza (g) %Cenizas

Promedio

%Ceniza

M1 18,5064 2,0108 18,5382 1,58

1,58 19,1543 2,0048 19,1861 1,59

M2 19,6001 2,0051 19,6307 1,53

1,53 19,7354 2,0073 19,7662 1,53

M3 21,3557 2,0144 21,3874 1,57

1,55 17,7027 2,0143 17,7334 1,52

M4 18,3246 2,0136 18,3555 1,53

1,53 19,8401 2,007 19,8707 1,52

FIBRA CRUDA

Peso

muestra

(g)

Peso filtro

(g)

Peso filtro+

fibra (g)

Peso del

crisol (g)

Peso crisol

+cenizas

(g)

%Fibra %Fibra Promedio

%Fibra

M1 0,5047 35,7473 35,7977 35,7473 35,7516 9,13 0,94

0,92 0,5053 35,6212 35,665 35,6212 35,6211 8,69 0,90

M2 0,5047 35,6327 35,6687 35,6327 35,6322 7,23 0,78

0,87 0,5064 34,9645 35,0439 34,9645 34,9988 8,91 0,96

M3 0,5024 36,8652 36,9088 36,8652 36,8703 7,66 0,82

0,82 0,5014 36,8646 36,908 36,8652 36,8700 7,70 0,82

M4 0,5065 36,6385 36,6789 36,6385 36,6387 7,94 0,84

0,89 0,509 23,7169 23,762 23,7169 23,7168 8,88 0,94

88

Anexo 14. Instrumento de recolección de datos para la determinación de la

actividad antimicrobiana.

PRUEBAS DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

Prueba de actividad antimicrobiana

Identificación

Diámetro de halo de inhibición

(mm)

Staphylococcus

aureus

Escherichia

coli

Blanco (etanol

70%)

6 6

6 6

6 6

C1

6 6

6 6

6 6

C2

7 7

6 7

8 6

C3

8 8

8 9

7 9

C4

16 17

15 17

16 16

Prueba de actividad antimicrobiana

Identificación

Diámetro de halo de inhibición

(mm) Staphylococcus

aureus Escherichia

coli

FA

6 6

6 6

6 6

FB

7 8

8 8

7 7

FC

7 6

7 7

8 6

FD

7 6

6 6

6 6

FE

6 7

6 6

6 6

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD …...DMQ, 11 de abril de 2017 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS CARACTERIZACIÓN