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UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE MEDICINA
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
Sensibilidad de las neuronas secretoras del acocil a laD-glucosa
Tesis para obtener el grado deMAESTRO EN CIENCIAS
en la especialidad deFISIOLOGIA
PRESENTA
Armando Benítez Hernández
Asesor: Carlos G. Onetti Percello
Colima, Col., Ju io de 1993
Los resultados del presente manuscrito fueron presentados en
el XXXV Congreso Nacional de Ciencias Fisiológicas con el
Título: sensibilidad de las neuronas del órgano X a la D-
glucosa.
Aceptados en el J. Neurophysiol. con el Título:
Responsiveness to D-Glucose in neurosecretory cells of
crustaceans.
AGRADECIMIENTOS
A mis profesores.
A la Universidad de Colima y al Centro Universitario de
Investigaciones Biomédicas.
Al Dr. Carlos Onetti, por sus enseñanzas y su paciencia para
la culminación del presente manuscrito.
A la Dra. Esperanza García, por todo su apoyo y confianza.
A mis compañeros, Ana Lilia Peraza, J. Jesús Lara, Ricardo
A. Navarro y Sergio A. Montero, por su ayuda incondicional.
A Saúl Hernhdez, por su colaboración en los programas de
cómputo.
A Juan Carlos Muñoz, por el trabajo de dibujo y fotografia.
A todas aquellas personas que de manera valiosa colaboraron
en la revisión y complemento del trabajo.
INDICE
INTRODUCCION ............................................... 1
Importancia del metabolismo de la glucosa .......... ...4
La hormona hiperglucemiante de los crustáceos ...... ...6
Sistema órgano X-glándula sinusal.....................g
En los sistemas neurosecretores la...................1 0
actividad eléctrica influye sobre la secreción.
Las neuronas del órgano X presentan distintos........1 3
patrones de descarga.
Las conductancias iónicas en estado estado...........1 6
estable subyacen en el patrón de descargas
en ráfagas.
Corrientes iónicas en el órgano X....................lg
OBJETIVOS ................................................. 24
METODOS ................................................... 25
Preparación biológica................................2 5
Dispositivos experimentales..........................2 6
Pipetas..............................................3 1
Soluciones...........................................3 1
Tabla 1 .............................................. 32
Tabla 2..............................................3 3
RESULTADOS................................................3 5
Efecto de la D-glucosa sobre la actividad............3 5
eléctrica de las neuronas del OX.
Relación entre el potencial de reposo y la...........4 2
concentración extracelular de la D-glucosa.
Efecto de la D-glucosa sobre la actividad............46
eléctrica al modificar la concentración
extracelular de sodio.
Efecto del manito1 sobre la actividad................50
eléctrica de las neuronas del OX.
Registro de corrientes iónicas con la técnica........53
de control de voltaje.
Registro de corrientes de canales unitarios..........58
en la configuración C/A.
DISCUSION...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 0
CONCLUSIONES..............................................76
BIBLIOGRAFIA..............................................77
1
INTRODUCCION
Diversas funciones de los seres vivos son moduladas por
sustancias hormonales. Una hormona es un producto quimico
que 'funciona como mensajero intercelular, participando en la
integración funcional necesaria para mantener el equilibrio
interno (Bolander, 1989). Esto ocurre incluso en
invertebrados, en los que se han identificado gran cantidad
de sustancias hormonales.
En 1944, Abramowitz y colaboradores describieron por
primera vez una hormona que elevaba los niveles de glucosa
circulante en la hemolinfa de los crustáceos y la denominó
"factor diabetogénico". Este autor observó que el efecto
hiperglucémico podía ser inducido con la inyección de
estractos del tallo ocular, estructura en la que se localiza
un 'órgano neurohemal conocido como glándula sinusal
(Kleinholz, 1976).
La hiperglucemia producida por la inyección de dichos
extractos ha sido reportada en todas las especies de
decápodos estudiadas excepto en el anomuro Munida rugosa
(Keller y col., 1985); esta respuesta aparece después de 5-
10 minutos de la inyección y puede durar hasta 2 horas
(Gorgels-Kallen y Van Herp, 1981; Gorgels-Kallen y Voorter,
1985; Keller y Andrew, 1973).
La inyección de hormona purificada extraida de
Urconectes e inyectada en acociles de la misma especie
aumenta la concentración de glucosa de 16.3k3.4 a 135.8k13.0
mg de glucosa/100 ml (Keller y col., 1985).
Actualmente se sabe que la actividad biológica de los
extractos del tallo ocular se debe a la hormona
hiperglucemiante de los crustáceos (HHC), producida por
células neuroendócrinas que constituyen el complejo
denominado órgano X-glándula sinusal (OX-GS), ubicado en el
tallo ,ocular de los crustáceos decápodos (figura 1A).
En los somas que componen el OX (localizado en la
médula terminalis; figura 1B) se elaboran y sintetizan
diferentes hormonas que se empaquetan en pequeños gránulos;
éstos se desplazan a través de proyecciones axonales hasta
almacenarse en las terminales nerviosas que constituyen la
glándula sinusal, localizada entre la médula externa e
interna (figura lA), desde donde se liberan las hormonas a
la hemolinfa por exocitosis (Gorgels-Kallen, 1985).
3
x0
200pFIGURA 1.
A: Esquema del tallo ocular del acocil mostrando la
localización del órgano X (Xo) y la glándula sinusal (sg), y
las principales estructuras anatómicas: retina (r), lámina
ganglionaris (lg), médula externa (me), médula interna (mi),
médula terminalis (mt). B: Reconstrucción fotográfica de una
neurona del OX de acocil teñida con amarillo lucifer. Las
flechas indican el sitio donde se realizó la axotomia
(modificada de García y col., 1993).
4
Importancia del metabolismo de la glucosa en los crustáceos.
Una de las principales caracteristicas de los seres vivos es
la capacidad de producir energía metabólica, en forma de
ATP, la cual es requerida en el crecimiento y desarrollo de
las múltiples funciones celulares (Erecinska y Wilson,
1982') . Las principales vias de producción de la energia de
los organismos eucariontes son la glucólisis y la
fosforilación oxidativa; estos procesos son los responsables
de la combustión de la glucosa dando como productos bióxido
de carbono y agua (Erecinska y Wilson, 1982). Los cambios en
el flujo de los metabolitos a través de estas vías inducen
variaciones en la concentración de glucosa circulante.
En crustáceos se ha demostrado que una movilización
rápida de la reserva de carbohidratos produce hiperglucemia
y ésta coincide con la etapa de mayor actividad de los
animales (Keller y col., 1985).
La regulación hormonal de los niveles de glucosa en
hemolinfa permite satisfacer la demanda energética,
dependiendo de las necesidades fisiológicas (Kallen y col.,
1990).
Dean y Vernberg (1965) encontraron que los niveles de
glucosa en la hemolinfa de los crustáceos presenta
variaciones de acuerdo al estado fisiológico de los
animales; es decir, depende de la dieta, de las etapas del
ciclo reproductivo (en las hembras), de la época de muda, de
la estación del año y de la hora del día. Con esto se esta
afirmando que hay un cambio significativo del nivel de
5
glucosa en la hemolinfa que depende de las condiciones
fisiológicas y ambientales durante la vida de estos animales
(Schirf y col., 1987).
En Astacus leptodactylus la glucemia presenta cambios
periódicos con un patrón circádico caracterizado por niveles
bajos durante el período de luz y por un aumento en la
concentración de glucosa unas horas antes del inicio de la
fase de oscuridad (Gorgels-Kallen y Voorter, 1985). En el
cangrejo azul (Callinectes sapidus) se demostró que después
de 30 minutos de ejercicio exhaustivo los niveles de glucosa
se elevan hasta 5 veces el valor basal (de 1 hasta 5 mM;
Lallier y Walsh, 1992).
Kallen, Abrahamse y Van Herp (1990) estudiaron si
existía una relación entre la concentración de glucosa y los
niveles de HHC, y observaron que en Orconectes limosus el
nivel máximo de glucosa se presenta una hora después de un
pico de hormona hiperglucemiante. En esta especie los
niveles de HHC alcanzados durante el día son aproximadamente
1 ng/lOO ~1, mientras que el promedio nocturno fluctúa
alrededor de los 10 ng de hormona por 100 ~1 de hemolinfa
(Kallen y col., 1990).
Además de esta relación entre las variaciones cíclicas
de HHC y glucosa, la HHC parece estar relacionada no sólo
con el mantenimiento de los niveles de azúcar en condiciones
basales, sino también con aumentos temporales asociados a
necesidades fisiológicas como la hiperglucemia por estrés.
Por otra parte, Strolenberg y colaboradores (1977)
6
reportaron que en Orconectes limosus una extirpación de la
GS no sólo causa una disminución de los niveles de glucosa
circulante sino también desaparece la ritmicidad (Keller y
col., 1985).
La hormona hiperglucemiante de los crustáceos.
La HHC es un neuropéptido cuyo peso molecular varía de
acuerdo a la especie. Por ejemplo, su peso molecular
determinado por filtración (en shefadex G-100) en Cancer
magister, Pandalus jordani y Orconectes limosus fué de
6,700, 6,400 y 7,400 daltons respectivamente (Keller y col.,
1985; Kegel y col., 1991; Kleinholz, 1976); en el crustáceo
no decápodo Porcellio dilatatus el peso molecular varía de
5,76.9 a 6,092 daltons (Keller y col., 1985).
Esta hormona se ha purificado y consta de
aproximadamente 58 residuos de aminoácidos (Keller, 1981).
Sin embargo, la actividad biológica parece estar asociada
con más de un polipéptido. Aunque no haY diferencia
significativa en la composición de sus aminoácidos aún se
desconocen las implicaciones de este polimorfismo (Kegel y
col., 1991).
Utilizando técnicas de inmunocitoquímica se han
identificado en el tallo ocular del acocil Astacus
leptodactilus un grupo de aproximadamente 35 células que
sintetizan la HHC (figura 2). Este grupo de neuronas, cuyo
diámetro varía entre 28 y 56 Pm, está localizado en la
región rostral del órgano X (Gorgels-Kallen y col., 1982;
7
Gorgels-Kallen, 1985; Gorgels-Kallen y Van Herp, 1981; Van
Herp y Van Beggenun, 1979).
;E.
-
FIGURA 2.
A) Fotografía que muestra la sección longitudinal del
tallo ocular de Orconectes limosus, donde se localizan las
neuronas productoras de hormona hiperglucemiante (flechas)
teñidas inmunocitoquímicamente, así como las ramificaciones
del sistema órgano X (X)-glándula sinusal (SG). B) Neuronas
del OX que contienen hormona hiperglucemiante. D)
Identificación de las células productoras de HHC por
hibridación in situ del mRNA; las reacciones positivas sólo
se encuentran en los sitios de transcripción en el soma
celular. E) Sección que muestra la no hibridación usada como
testigo. Las barras representan para A, 135 Pm; B, D y E, 45
Pm (modificada de Tensen y col., 1990).
Sistema órgano X-glándula sinusal.
Desde el punto de vista funcional, es posible considerar que
el sistema órgano X-glándula sinusal de los crustáceos está
dividido en tres compartimientos: los cuerpos neuronales 0
somas, los axones y las terminales nerviosas. La síntesis y
empaquetamiento de neuropéptidos ocurre únicamente en los
somas, el transporte de los gránulos es a través de los
axones, y el almacenamiento y liberación se lleva a cabo en
las terminales nerviosas.
El OX consta de 150 (Andrew y col., 1978; Jaros, 1978)
a 200 somas (Newcomb y col., 1985) que forman dos racimos de
células con actividad biosintética.
Según Stuenkel (1985), algunas de las características
morfológicas que posee este sistema son las siguientes:
a) Es un sistema heterogéneo en el que pueden distinguirse 6
diferentes tipos de células.
b) Más del 90% de los somas que componen el OX poseen axones
cuyas terminaciones están en la GS.
cl Del segmento proximal de los axones surgen pequeñas
arborizaciones colaterales que forman la neuropila; se ha
sugerido que éste podría ser el sitio de regulación por
medio de sinapsis química.
d) La neuropila es una estructura compuesta por
ensanchamientos de la parte proximal del axón, estas
dilataciones se encuentran en la periferia con la cara
exterior hacia la hemolinfa (Stuenkel, 1985).
10
Además de su capacidad de sintetizar polipéptidos con
actividad hormonal, las neuronas del OX son células
excitables capaces de generar potenciales de acción atín en
ausencia sináptica. Esta actividad eléctrica endógena, se
propaga por el axón hacia las terminaciones nerviosas
constituyendo el estímulo para la liberación de diversas
sustancias hormonales (Nordmann y Raji, 1990). Entonces,
dado que la liberación hormonal está relacionada con los
potenciales de acción, a continuación se describir& en que
consiste esta relación y posteriormente se analizará el
patrón de actividad eléctrica, particularmente en el OX.
En los sistemas neurosecretores la actividad eléctrica
influye sobre la secreción.
Uno de los procesos fundamentales en la liberación hormonal
es el acople estimulación-secreción, que es la secuencia de
eventos que median entre la propagación de la actividad
eléctrica en las neuronas y la liberación de cantidades
precisas de productos neurosecretados (Ganten y Pfaff,
1988).
Los potenciales de acción propagados desde el cono
axónico causan la liberación de hormonas almacenadas en la
glándula sinusal del cangrejo (Cooke y col., 1977).
En los vertebrados, la estimulación eléctrica de las
células de la neurohipófisis in vitro evoca la liberación de
las hormonas oxitocina y vasopresina (Douglas y Poisner,
1964; Haller y col., 1965; Nordmann y Dreifuss, 1972). Este
ll
efecto depende de la generación de potenciales (Dreifuss y
col., 1971; Ishida, 1970) que despolarizan las terminales
neurosecretoras y activan los procesos dependientes de
calcio (Dune y Petersen, 1991; Mikiten y Douglas, 1965). Mas
aún, se ha demostrado que la estimulación eléctrica a altas
frecuencias puede ser más efectiva que estimulaciones a
bajas frecuencias para obtener la secreción de hormonas
(Cazalis y col., 1985; Dreifus y col., 1971; Haller y col.,
1965).
Las neuronas magnocelulares del hipotálamo de los
mamiferos, cuya función es la secreción de vasopresina por
estimulos fisiológicos como la hemorragia o la
deshidratación, presentan un aumento en su actividad
eléctrica después de la presencia de estos estímulos. Cuando
hay demanda de vasopresina las células descargan en ráfagas,
separadas por períodos silentes de 10 a 30 segundos; parece
ser que la duración de estos períodos es también un factor
importante en la cantidad de hormona liberada (Nordmann y
Raji, 1990).
De igual manera, en las neuronas liberadoras de
oxitocina del hipotálamo de ratas lactantes se ha observado
que las células descargan potenciales de acción
periódicamente (cada 5 a 15 min, durante 0.5 a 4 s, con una
frecuencia hasta de 80 espigas/s) cuando son estimuladas por
cambios en la presión intramamaria por succión (Douglas y
Sorimachi, 1971; Ganten y Pfaff, 1988).
12
Con estos ejemplos se muestra que hay una relación
estrecha entre la actividad eléctrica de las células
neurosecretoras y la cantidad de hormona secretada.
Es de gran importancia la participación del calcio en
la neurosecreción; la estimulación eléctrica prolongada del
lóbulo neural de rata in vitro produce liberación hormonal
sostenida en presencia de calcio en el medio extracelular
(Douglas y Sorimachi, 1971; Summerlee y Parry, 1988).
Las despolarizaciones producidas por potenciales de
acción en ráfagas aumentan la concentración intracelular de
calcio (Gorman y col., 1982), otros patrones de descargas no
producen aumentos significativos en el calcio intracelular.
En neurohipófisis de rata, las ráfagas que inducen dicho
aumento en la concentración intracelular de calcio producen
la liberación hormonal (Dreifuss y col., 1971; Nordmann y
Raji, 1990). Vemos que el patrón de actividad eléctrica es
importante para la secreción hormonal en sistemas
neurosecretores y por lo tanto uno de los agentes que
modulan dicha secreción.
En situaciones fisiológicas diferentes hay demanda de
distintos péptidos, por lo que se puede suponer que existe
un control especifico a nivel central sobre las neuronas que
liberan estos distintos tipos de péptidos; incluso es
posible que en crustáceos, diferentes neurotransmisores
estén involucrados en las sinapsis cuyas terminales se
localizan en la neuropila del sistema neurosecretor. Existen
evidencias que sugieren la posibilidad de que la secreción
13
del sistema OX-GS es controlada, o por lo menos modulada,
por entradas del sistema nervioso central por medio de las
sinapsis en las colaterales de las células neurosecretoras
(Newcomb y col., 1985).
Las neuronas del órgano X presentan distintos patrones de
descarga.
La actividad rítmica es caracteristica inherente de algunas
neuronas. Por ejemplo, en neuronas ganglionares aisladas de
Aplysia se ha reportado actividad ritmica en los somas
neuronales (Alving, 1968); también se presentan actividades
rítmicas en neuronas de caracol Helix aspersa (Connor y
Stevens, 1971), en el acocil Procambarus clarkii cierto
número de neuronas del OX no presentan actividad espontánea;
estas células generan potenciales de acción al ser
estimuladas. Otras neuronas presentan actividad espontánea
ritmica y un tercer grupo de ellas producen potenciales de
acción espontáneos agrupados en ráfagas (Onetti y col.,
1990). Cada actividad espontánea se relaciona con un tipo de
curva voltaje-corriente (V-1, figura 3). Las células
sile,ntes tienen bajas resistencias de entrada y presentan
potenciales de reposo de aproximadamente -70 mV; mientras
que las neuronas con actividad rítmica tienen resistencias
de membrana mayores y potenciales de reposo más positivos
(alrededor de -60 mV). Las células que descargan en ráfagas
poseen una alta resistencia de entrada y una región con
pendiente negativa (NSR) en la curva V-I, ocasionando que la
14
neurona presente un potencial de membrana inestable, que
oscila entre -45 y -30 mV (valores que caen dentro de la
NSR)..
15
b
2-4h
E,(W
FIGURA 3.
Registros del potencial de membrana de 3 neuronas que
presentan diferentes patrones d e actividad
electrofisiológica: silente (sin potenciales de acción
espontáneos; a), rítmica (b) y en ráfagas (cl lLas curvas
voltaje-corriente señaladas, con las letras a, b Y c,
corresponden a las células silentes, rítmicas y en ráfagas,
respectivamente.
16
Las conductancias iónicas en estado estable que subyacen en
el patrón de descargas en ráfagas.
Un patrón de descarga en ráfaga de las neuronas consiste en
potenciales de acción agrupados y seguidas de un periodo
silente, de tal forma que la frecuencia de descarga durante
la ráfaga aumenta inicialmente para luego disminuir hasta el
final de la misma. Al terminar la ráfaga se produce una
repolarización rápida seguida por una despolarización lenta
que genera una nueva ráfaga (Adams y Benson, 1985).
Los principales mecanismos iónicos subyacentes a los
distintos tipos de actividad eléctrica registrada en el
cuerpo neurona1 de las células del sistema OX-GS fueron
estudiados por Onetti y col. en 1990, utilizando la técnica
de fijación de voltaje en la configuración de célula
completa ("whole-cell patch clamp"). En este estudio se
registraron las corrientes iónicas en estado estable y la
actividad eléctrica espontánea en condiciones de fijación de
corriente y encontraron que en las neuronas del OX que
presentan un patrón de disparo en ráfagas, la curva I-V en
estado estable tiene una NSR (veáse Onetti y col., 1990;
figura 3). Esta región se atribuye a la activación de una
corriente iónica denominada INSR.
Estas características de la curva I-V también se han
correlacionado con la actividad eléctrica en ráfagas en
neuronas R15 de Apysia (Adams y Benson, 1985). La
disminución observada en la conductancia de pendiente
durante las interráfagas da como resultado una reactivación
17
de la INSR. La INSR es una corriente entrante despolarizante
que puede ser activada por sodio, por calcio o por ambos
iones (figura 4), que se contrapone a la corriente saliente
de potasio que hiperpolariza y estabiliza la célula (Onetti
y col., 1990).
En neuronas del OX de acocil, esta región desaparece de
la curva I-V cuando se elimina el sodio del medio
extracelular, es insensible a la tetrodotoxina (TTX) y es
independiente de la concentración extracelular de calcio
(Onetti y col., 1990). En la figura 4 se muestra un esquema
que incluye algunos de los eventos que generan una ráfaga de
potenciales de acción: un aumento en la resistencia de
membrana (Rm) induce una predominancia de la corriente INSR
(es decir, la corriente neta de membrana es entrante) por lo
que se produce una despolarización (Vm+) hasta alcanzar el
umbral del potencial de acción y se inicia una ráfaga, la
cual a su vez produce un aumento en la concentración
intacelular de calcio (Cai); al terminar la ráfaga sigue una
disminución en la 1NSR que produce una repolarización (Vm-)
que constituye el intervalo entre ráfagas.
R A F A G A 1,
INTERVALOE N T R E RAFAGAS r
FIGURA 4.
Modelo cualitativo de las bases iónicas de una neurona
del órgano X de acocil cuyo patrón de descarga es en rdfagas
(modificada de Kramer y Zucker, 1985).
19
Corr.ientes iónicas en el órgano X.
Las células del OX poseen dos tipos de corrientes entrantes,
acarreadas por iones de sodio y calcio, que han sido
estudiadas en neuronas intactas y en neuronas axotomizadas.
Onetti y col. (1990) reportaron que en neuronas axotomizadas
existen dos tipos de corrientes salientes de potasio, cuya
dependencia al voltaje y sensibilidad a bloqueadores de
canales de K+ son semejantes a las que se han descrito en
otras preparaciones para el rectificador tardío y para la
corriente transitoria de salida (IX e IA, respectivamente).
La cinética de las corrientes de potasio participan en la
duración y frecuencia de los potenciales de acción de las
células que descargan en ráfagas (Martínez y col., 1991).
Se han descrito otras corrientes de potasio en
preparaciones diferentes: la corriente activada por un
aumento en la concentración intracelular de calcio, la
corriente del rectificador anómalo, la corriente modulada
por agonistas muscarínicos, la corriente modulada por
serotonina, la corriente activada por sodio y las corrientes
sensibles al trifosfato de adenosina (Rudy, 1988). A estas
corrientes se les han atribuido cierta relación con la
actividad espontánea modulando la frecuencia y duración de
los potenciales de acción (Martínez y col., 1991), de tal
manera que una disminución en la conductancia de dichas
corrientes implicaría una despolarización de la célula y
viceversa, un aumento de la conductancia produciría una
hiperpolarización.
20
Originalmente se describieron en miocitos los canales
de potasio que relacionan el estado metabólico con la
actividad eléctrica de las células y posteriormente se han
encontrado en células f3 del páncreas, células de músculo
esquelético, de músculo liso y neuronas centrales. A estos
canales se les llamó canales de potasio sensibles a ATP
(Noma y Takano, 1991; Tromba y col., 1992), debido a que son
bloqueados por un aumento en la concentración intracelular
de ATP como resultado del metabolismo de la glucosa
(Ashcroft, 1988).
La familia de canales de potasio sensibles a ATP (K-
ATP) han despertado gran interés debido a que proveen una
relación directa entre el estado metabólico de las células y
su excitabilidad (Ashford y col., 1990). Estos canales
desempeñan diversas funciones; por ejemplo, en células B del
páncreas, determinan el potencial de la membrana en reposo y
participan en la iniciación de la secreción de insulina,
estimulada por glucosa (Ashcroft, 1988; Dune y Petersen,
1991; Quast y Cook, 1989; Ree y col., 1990).
Un incremento en la concentración intracelular de ATP
bloquea estos canales en células B y produce la
despolarización de la célula; esto permite la apertura de
canales de calcio dependientes de voltaje que provocan un
aumento en la concentración interna de calcio y en
consecuencia la liberación de insulina (Petersen, 1990).
Por otra parte, en músculo cardíaco y esquelético, el
aumento de la permeabilidad por la apertura de los canales
21
K-ATP produce una relajación de los vasos en tejidos
isquémicos preferentemente por enfermedades arteriales,
angina de pecho, isquemia cerebral o hipoxia; con este
aumento de la permeabilidad se produce una hiperpolarización
que evita la aparición de potenciales de acción dando como
resultado una relajación muscular (Ashcroft, 1988; Ashford y
col., 1990; Petersen, 1990; Spruce y col., 1985).
Los canales K-ATP son altamente selectivos a potasio
(Ashcroft, 1988); sin embargo, algunas de sus propiedades
varian en los diversos tejidos. Por ejemplo, la conductancia
unitaria (extrapolada a una concentración extracelular de
potasio de 140 mM) varía alrededor de 50 pS en células B,
músculo cardiaco y músculo esquelético y de aproximadamente
150 pS en cerebro y músculo liso (Ashcroft, 1988; Quast y
Cook, 1989).
La cinética de los canales K-ATP es compleja, consiste
en ráfagas de aperturas separadas por períodos de cierre
relativamente largos (Ashford y col., 1990; Petersen, 1990).
El principal efecto del ATP sobre la cinética de los
canales K-ATP es reducir tanto el tiempo medio de apertura
como el número de aperturas por ráfaga (Kakei y col., 1985).
Este efecto es similar al que produce la glucosa en células
B registradas en la configuración de w'cell-attachedwl, esto
sugiere que el ATP actúa como un regulador intracelular de
la actividad de los canales.
La glucosa reduce la permeabilidad de la membrana al
potasio y despolariza las neuronas glucorreceptoras del
22
núcleo del tracto solitario y las neuronas hipotalámicas
ventromediales del tipo C (Ashcroft, 1988; Ree y col.,
1989). Ashford y col. (1990) en estudios realizados, con
rebanadas de hipotálamo, en neuronas hipotalámicas
ventromediales en ratas encontraron que al retirar la
glucosa (10 mM) de la solución normal, la membrana se
hiperpolariza y en registros de canales unitarios con la
técnica de lwpatch-clampll en la configuración "inside-out"
bajo condiciones simétricas (140 mM de K+) la curva I-V
muestra una relación lineal, con un valor para la
conductancia del canal unitario de 146.Ok1.8 PS. S i n
embargo, en registros con la misma técnica, pero con 140 mM
de KCl en el baño y en la pipeta 145 mM de NaCl y 5 mM de
KCl (gradiente iónico similar al fisiológico) el resultado
de la relación I-V es una curva que muestra una
rectificación saliente a potenciales despolarizados. La
aplicación de ATP (l-5 mM) en la cara citoplasmática da como
resultado la inhibición reversible de los canales K-ATP
(Ashford y col., 1990).
Se han descrito varias drogas cve bloquean
selectivamente estos canales, entre las que destacan las
sulfonilureas (Dunne y Petersen, 1991); existen también
drogas cuyo efecto es la apertura de estos canales como son
la cromakalim y la diazoxida (Tromba y col., 1992).
En el área hipotalámica lateral del mono resus (Macaca
mulatta) existen dos tipos de neuronas llamadas
glucosensibles que responden a la presencia de glucosa, de
23
hormonas relacionadas a la alimentación o de otros
metabolitos; y otro grupo llamadas insensibles que no
muestran cambios en su actividad por la presencia de dichos
compuestos (Karadi y col., 1992).
En el núcleo del tracto solitario de rata se estudiaron
neuronas llamadas glucosensibles (GS) y glucoreceptoras
(GR) lCuando se aplica glucosa las células GS disminuyen su
actividad debido a una hiperpolarización; mientras que las
GR muestran una despolarización que aumenta su actividad
(Mizuno y Oomura, 1984).
En relación a la enorme importancia que tiene la
glucosa sobre los canales K-ATP de neuronas hipotalámicas y
de células B del páncreas se puede decir que juegan un papel
muY importante en el mecanismo de control de
retroalimentación del apetito y de la homeostasis de
nutrientes (Karadi y col., 1992).
Hasta la fecha no se habia explorado la posibilidad de
que las neuronas de invertebrados tuviesen la capacidad de
responder a estímulos químicos extracelulares relacionados
con el: metabolismo celular.
Dado que el sistema neurosecretor OX-GS participa en la
regulación de la glucemia, resulta interesante iniciar la
caracterización de la respuesta de estas células ante el
estimulo con glucosa y explorar si ésta puede regular la
actividad eléctrica de las neuronas del Órgano-X.
24
OBJETIVOS
1) Estudiar la sensibilidad a la D-glucosa de células
neurosecretoras del acocil con distintos patrones de
actividad eléctrica.
2) Estudiar la relación entre concentración extracelular de
D-glucosa y caracteristicas electrofisiológicas de las
neuronas del OX.
3) Analizar posibles mecanismos de efectos de D-glucosa en
relación con los canales iónicos de la membrana.
2 5
L o s experimentos se realizaron en acociles (Procambarus
clarkii) adultos hembras y machos, con longitud corporal
entre 8.5 y 10.5 cm. Los acociles se mantuvieron en charolas
con agua, a una profundidad de 4 cm., alimentándose con
zanahoria y pescado, este último una vez por semana. Se
conservaron con el período de luz-oscuridad natural, a una
temperatura ambiental entre 22 y 25OC. Los experimentos
fueron realizados durante los meses de octubre a marzo.
Preparación biológica.
Para obtener la preparación se practicó la ablación del
tallo ocular del acocil que se colocó en una caja de Petri
con una solución salina para crustáceos modificada de Van
Harreveld (1936; W-IN), cuya composición se muestra en la
tabla '1. Se eliminó el exoesqueleto, el músculo y el tejido
conectivo, y se colocó la preparación en la parte central de
una cámara de lucita de tres compartimientos interconectados
entre sí con una capacidad total de 1 ml de volumen. Se
utilizó un sistema de perfusión que permitió recambiar
continuamente las soluciones control (W-IN) y de prueba, a un
flujo constante de 700 pl/min.
L a región donde se localiza el OX se identificó
visualmente, utilizando un microscopio de luz Leitz Laborlux
II y para colocar los microelectrodos en la superficie de
las células se usó un micromanipulador Narishigue MK2.
2 6
Tanto la disección como los registros se llevaron a
cabo a temperaturas entre 20 y 22OC; las preparaciones se
lavaron con la solución VI-IN durante 20 minutos antes de
iniciar los registros.
Dispositivos experimentales.
Se utilizaron dos sistemas de registro:
1) Registro intracelular del potencial de membrana
microelectrodos.
2) Registro de las corrientes transmembranales con
técnica de control de voltaje.
Para los registros intracelulares se utilizó
con
la
u n
amplificador de alta impedancia de entrada (Dagan 8100).
Este amplificador contiene un sistema que permite aplicar
pulsos de corriente y compensar las caídas de voltaje
ocasionadas por el paso de la corriente a través del
microelectrodo.
Se utilizó como electrodo de referencia un alambre de
plata clorurado, colocado en un compartimiento de la cámara
de lucita y conectado a la tierra del amplificador.
Para la inyección de pulsos de corriente se utilizó un
estimulador (Grass S48) que permitió variar tanto la
intensidad, la duración, así como la frecuencia de los
pulsos.
Los registros de corriente en células intactas se
hicieron utilizando la técnica de fijación de voltaje en las
configuraciones d e células completas ("perforated
27
patch-clamplw, P/P) y microáreas de membrana ("cell-attached
patch-clampll, C/A) (Hamill y col., 1981; Horn y Marty,
1988):
En la técnica P/P se agregó nistatina (200 pl/ml) en la
solución de llenado de las pipetas para obtener la
comunicación con el interior celular a través de los canales
que forma la nistatina y que no permite la salida de
moléculas de gran tamaño como la glucosa, el ADP y ATP entre
otras (Kleinberg y Finkelstein, 1984).
Se midió la corriente de membrana a través de un
convertidor corriente a voltaje (I/V) construido en la
Universidad de Colima, cuyo diseño es similar al descrito
por Sigworth (1983).
Las curvas I-V en estado estable fueron obtenidas en
control de voltaje por medio de la aplicación de rampas de
voltaje proporcionadas por un generador de rampas con el
programa pClamp. La rampa se aplicó de -100 a 0 mV en un
tiempo de 20 segundos, es decir, con una pendiente de 5
mV/s.
Las señales de voltaje y corriente se filtraron con un
filtro pasa bajas tipo Bessel de cuarto orden (Frecuency
Devices) a diferentes frecuencias que se mencionarán en los
resultados.
En ambos sistemas de registro las señales filtradas y
amplificadas fueron visualizadas durante todo el experimento
en un osciloscopio (Hitachi VC-6025) y se registraron en un
graficador de plumillas de dos canales (Gould 220). Los
28
registros se almacenaron con un sistema de videocasetera
(Sony SL-2700B) a través de un procesador digital de audio
(Sony, PCM 501-ES) modificado para capturar este tipo de
señales; los registros almacenados en este sistema fueron
seleccionados y adquiridos en una microcomputadora (IBM AT)
usando un convertidor analógico a digital de 12 bits (Tecfen
isc-16). Los dispositivos experimentales están
esquematizados en las figuras 5 y 6. Los resultados fueron
analizados y medidos mediante programas en lenguaje Pascal
diseñados para tal efecto, y posteriormente fueron dibujados
con un graficador X-Y (plotter, Hewlett Packard Colorpro).
El ajuste de las curvas fué realizado mediante el método de
minimos cuadrados para funciones no lineales (Colquhoun,
1971).
29
/\ EAR -
El-G P
El--V G
FIGURA 5.
Esquema del dispositivo experiental utilizado en el
registro intracelular. El inserto ilustra la posición del
electrodo a través de la membrana. C, célula; ME,
microelectrodo; SV, seguidor de voltaje; F-A, filtro y
amplificador; AR, amplificador de retroalimentación; E,
estimulador; Vm, medición del potencial de membrana en el
osciloscopio; PC, computadora; AD, convertidor analógico-
digital; GP, graficador en papel; VG, videograbadora.
30
P/
P NOOOO
OO0&. <.. .,<.<,,:.:~::::.::::.::,.:.::,.,..,<. <....<. ., :..<.. . . . .,.<<,. ,.:”..:::.::::,:<:.:::.:::”. . . . :,,. .,. ,,’.:-;i;::.:‘:::.,:::::,..,. ..<....,. c:
,
<4m-+- EAR
cl-G P
P C2AD
FIGURA 6.
Esquema que muestra el arreglo experimental para el
registro de las corrientes de membrana. P, pipeta; C,
célula; N, nistatina; Rf, resistencia de retroalimentración;
I/Q, convertidor corriente-voltaje; AR, amplificador de
retroalimentación; E, estimulador; Vm potencial de
mantenimiento; F-A, filtro y amplificador; Im medición de la
corriente transmembranal en el osciloscopio; para el caso de
PC, AD, GP y VG ver figura 5. Se utilizó el mismo sistema
cuando la pipeta contenía nistatina (inserto inferior
izquierdo) o cuando se registraron canales unitarios
(inserto inferior derecho).
31
Pipetas.
En los registros obtenidos con microelectrodos se utilizaron
capilares de vidrio de 1.2 mm de diámetro externo y 0.68 mm
de diámetro interno, con fibra de vidrio y llenos con
solución de KCl-3M. Se utilizaron microelectrodos con
resistencia entre 20 y 30 MegaOhms.
Las pipetas para registros en control de voltaje fueron
hechas con capilares de borosilicato de pared gruesa de 1.5
y 0.86 mm de diámetro externo e interno respectivamente;
dependiendo del experimento, las pipetas se llenaron con
distintas soluciones (vease la tabla 2). La resistencia de
las pipetas fué de 4 a 7 MegaOhms.
Soluciones.
L a composición de la solución VHN con la cual se
perfundieron todos las preparaciones se muestra en la tabla
1 .
En la tabla 2 se muestran las composiciones de las
soluciones utilizadas para llenar las pipetas utilizadas en
la técnica en control de voltaje, que fueron filtradas
utilizando membranas con poros de 0.22 Pm (Millipore GS-
Wpe) .
32
Composición
intracelular
NaCl
KCl
CaCl
MgCl
(en mM):
VHN
200
5.4
13.5
2
SOLUCIONES CON BAJO SODIO
1 2 3
2 0 5 0 100
5.4 5.4 5.4
13.5 13.5 13.5
2 2 2
HEPES-NaOH 10 m-w -Sm B-m
TRIS-HCl -ev 188 158 109
TABLA 1
de las soluciones utilizadas para registro
33
Para las técnicas de fijación de voltaje se usaron tres
soluciones diferentes, cuya composición se muestran en la
tabla 2. La solución 1 se usó para llenar las pipetas
utiliz'adas en la técnica P/P para simular la composición
celular interna. Las soluciones II y III se usaron para
llenar las pipetas durante la técnica C/A a dos
concentraciones de K+ diferentes (5.4 y 205 mM), dos
potenciales de equilibrio de potasio.
TABLA 2
Composición de las soluciones usadas en los experimentos de
control de voltaje (en mM):
1 I I I I I
NaCl . 40 --- w-w
KCl --- 205 5.4
CaCl --- 13.5 13.5
MgCl 2 2 2
HEPES-KOH 10 10 s-w
185 - - - - - -
--- -mm 207.5
K-Aspartato
TRIS-Cl
Nistatina 200 (w/ml)
34
Las soluciones con D-glucosa, 2-desoxiglucosa (4.6 y
6.1 mM), L-glucosa (5.5 mM), manoheptulosa (10 mM) y manito1
(5.5 mM) fueron preparadas al momento de ser utilizadas; la
D-glucosa fué usada a concentraciones de 0.55, 1.1, 2.8,
4.2, y 5.5 mM.
A las soluciones con diferentes concentraciones de
sodio extracelular (tabla 1) se les agregó D-glucosa a una
concentración de 5.5 mM. Las soluciones fueron ajustadas a
un pH-de 7.4.
35
Efecto de la D-glucosa sobre la actividad eléctrica de las
neuronas del OX.
Antes de iniciar la disección se tomó una muestra de
hemolinfa en los animales de experimentación, obtenida de la
base de la quela, y se midió la concentración de D-glucosa
por el método de glucosa-oxidasa. El valor obtenido en
condiciones basales fue de 0.9kO.2 mM (n=38); por esta razón
las concentraciones de glucosa que se probaron in vitre
oscilaron entre 0.55 y 5.5 mM, ya que en la literatura se
reporta como hiperglucemia un valor de 5 mM.
La glucosa, a una concentración de 5.5 mM, provoca en
las neuronas del órgano X una despolarización de 14.2k7.2 mV
(n=24). El potencial de reposo regresa a valores cercanos al
control en un tiempo de 20 a 30 minutos al lavar la
preparación con la solución VHN (figura 7).
En neuronas con potenciales de acción espontáneos en
ráfagas (figura 7.1) la despolarización provocada por la
glucosa indujo un aumento en la frecuencia de descarga
acompañada de una disminución en la amplitud de los
potenciales de acción. Además del aumento en la frecuencia,
se observó un cambio en el patrón de descarga de potenciales
de acción; durante la despolarización las células
descargaron en forma tónica (figura 7.2). Al lavar la
glucosa los potenciales de acción se fueron agrupando
nuevamente, hasta formar ráfagas similares al control, sin
36
embargo el número de potenciales de acción en cada ráfaga
aumentó (figura 7.3).
37
1 G L U C O S A 2 3
I I I
-LL 11.J-l--
5 mln
n
FIGURA 7.
3
160 m V
1 2 t3ec
El trazo superior muestra el registro intracelular del
potencial de membrana en una neurona del órgano X, antes,
durante y después de la perfusión con D-glucosa 5.5 mM,
durante el tiempo indicado por la barra. Los trazos
inferiores corresponden a los registros señalados como 1,2 y
3 en el registro superior, a dos escalas de tiempo
diferente. La aplicación de glucosa produjo una
despolarización (trazo superior) modificando el patrón de
descarga (trazos inferiores a la izquierda) y la
configuración de los potenciales de acción (abajo a la
derecha). Los trazos inferiores de la derecha corresponden a
3 potenciales de acción consecutivos, superpuestos.
Solución de perfusión: VHN.
38
GLUCOSA
z.------------------- ---- 5:
FIGURA 8.
Registros que muestran los efectos de la aplicación de
5.5 mM de D-glucosa en una neurona con actividad espontánea
tónica (los puntos suspensivos que inician el trazo inferior
indican la continuación después de 5 min). La despolariza-
ción inducida por la glucosa produjo una desaparición de los
potenciales de acción y su efecto fue reversible. La barra
superior indica el tiempo de aplicación de la D-glucosa.
Solución de perfusión: VHN.
G L U C O S A
39
11.z
------------ z 545 min-..
FIGURA 9.
¿os trazos corresponden a un registro continuo del
potencial de membrana de una neurona silente que muestra los
efectos producidos por la aplicación de D-glucosa (5.5 mM)
durante el tiempo señalado por la barra. Se observa que la
glucosa produce una despolarización y la aparición de
potenciales de acción espontáneos. Aún después de la
recuperación del potencial de reposo se mantienen las
descargas tónicas. Solución de perfusión: VHN.
4 0
En neuronas tónicas las descargas espontáneas cesan
durante la despolarización, como se muestra en la figura 8;
este efecto es reversible ya que al lavar la preparación
durante 25 minutos con solución VHN las descargas reaparecen
de manera similar al control.
En neuronas silentes la despolarización inducida por la
glucosa provocó la aparición de potenciales de acción
espontáneos. Dichos potenciales se mantuvieron después de
lavar con solución VHN por tiempos de 30 minutos, aun cuando
las células se repolarizaron a un valor de potencial de
reposo cercano al control (figura 9).
La figura 10 muestra el curso temporal del cambio en el
potencial de reposo en una neurona con respuesta espontánea
e n u n experimento representativo que demuestra la
despolarización y la repolarización durante y después de la
aplicación de D-glucosa (5.5 mM).
41
16
.
2020 3030
TIEMPO (min)TIEMPO (min)
FIGURA 10.
Gráfica que muestra el curso temporal del cambio en el
potencial de reposo en una neurona con descargas espontáneas
expuesta a D-glucosa (durante el tiempo que indica la barra)
y después de perfundir la preparación con solución VHN. En
este caso la despolarización es evidente desde los 5 minutos
de haberse iniciado la perfusión con D-glucosa y aumenta
progresivamente aún después de haber iniciado el lavado, el
potencial de reposo regresa al control a los 25 minutos de
lavar con W-IN.
42
Relación entre el potencial de reposo y la Concentración
extracelular de la D-glucosa
Se cuantificaron los cambios en el potencial de membrana y
la variación en la frecuencia de descarga en células con
actividad espontánea al agregar glucosa a la solución
extracelular, a concentraciones de 0.55, 1.1, 2.8, 4.2 y 5.5
mM.
La magnitud de la despolarización producida por glucosa
fué dependiente de la concentración (figuras 11 y 13). La
figúra 13 muestra la relación entre la concentración de
glucosa y la despolarización; se puede observar que la
despolarización máxima se obtuvo a una concentración de 5.5
mM. Además, al aumentar la concentración de glucosa en el
baño aumentó la frecuencia de descarga de los potenciales de
acción acompañada de una disminución en la amplitud (figuras
11 y 12).
43
GLUCOSA
2.8
FIGURA ll.
Registros obtenidos en una neurona representativa al
ser perfundida con 1.1, 2.8 y 5.5 mM de D-glucosa durante el
tiempo señalado por la barra; se observa que la glucosa
despolariza y cambia la frecuencia de descarga dependiendo
de la concentración. Solución de perfusión: VHN.
44
2.8
5.5
---Ll-b
ll l.LL50m”l1
12 sec
FIGURA 12.
Registros de una neurona representativa con descargas
en ráfagas, a la cual se le aplicó glucosa a las distintas
concentraciones (en n-W señaladas junto a cada trazo; se
observa que la glucosa modifica la frecuencia y el patrón de
descarga. Solución del baño: VHN.
4 5
ZO-
18 --
1 6 --
14--
12--
lO--
8 --
6--
4 --
2 --
0 I 1 t 1 4 4 I0 1 2 3 4 5 6
[D-glucosa] mM
FIGURA 13.
Gráfica que muestra la relación entre la magnitud de la
despolarización y la concentración extracelular de glucosa.
Los números junto a cada símbolo indican el número de
neuronas exploradas para cada concentración. Las barras
representan las desviaciones estándar. Solución de
perfusión: VHN.
4 6
Efecto de la D-glucosa sobre la actividad eléctrica al
modificar la concentración extracelular de sodio.
Se registró el potencial de membrana mientras la preparación
se perfundió con soluciones externas a diferente
concentración de sodio (ver tabla 1) con la finalidad de
observar si el cambio en el potencial de membrana en
presencia de D-glucosa es dependiente de la concentración
extracelular de sodio.
Con los resultados obtenidos se puede decir que la
despolarización por D-glucosa en neuronas del órgano X no es
dependiente de la concentración extracelular de sodio. En la
figura 14 se muestran los registros obtenidos en una neurona
representativa expuesta a diferentes concentraciones de
sodio. En esta preparación, dada la participación del sodio
en el potencial de reposo, el solo hecho de disminuír su
concentración en la solución externa se produce una
hiperpolarización. Si se agrega glucosa en las soluciones
con bajo sodio, la magnitud de la hiperpolarización es menor
(figura 14).
El cambio en el potencial de reposo provocado por la
glucosa se mantiene constante a diferentes concentraciones
de sodio extracelular, y ese efecto es reversible al lavar
con solución VHN (figura 14).
47
(Na)
6 0
(Na)+GLUCOSA
6 mln
FIGURA 14.
Registros del potencial de membrana en una neurona
representativa a diferente concentración extracelular de
sodio, en ausencia (izquierda) y en presencia (derecha) de
D-glucosa (5.5 mM). Los números junto a los trazos
corresponden a la concentración extracelular de sodio (en
mw ' El sodio fue sustituido equimolarmente por TRIS-HCl. La
glucosa se lavó con solución VHN. Las barras indican el
tiempo de perfusión con las soluciones experimentales.
48
La gráfica de la figura 15 muestra la relación entre el
cambio en el potencial de reposo, y la concentración externa
de sodio en condiciones control (círculos blancos), y al
aplicar glucosa en la solución de perfusión (círculos
negros). El comportamiento paralelo de ambas rectas indica
que la despolarización producida por glucosa no depende de
la concentración externa de sodio.
49
c.
c
9E
P- 5
>”
- 1 0
- 1 50 4 0 8 0 1 2 0 1 6 0 2 0 0
PJ 1a o mM
FIGURA 15.
La figura muestra la relación entre el potencial de
reposo (Vr-Vp) y la concentración extracelular de sodio en
ausencia (círculos blancos) y en presencia (círculos negros)
de 5.5 mM de glucosa, en una célula representativa del
órgano X. Las líneas corresponden a los ajustes de los
puntos por el método de mínimos cuadrados; dichas rectas
tienen la misma pendiente.
50
Efecto del manito1 sobre la actividad eléctrica de las
neuronas del OX.
Para comprobar si la despolarización observada en las
neuronas del órgano X en presencia de D-glucosa se debe a un
efecto osmótico, se aplicó manito1 a una concentración de
5.5 .mM (n=8) en el baño durante 12 minutos; posteriormente
se lavó con solución control. Las neuronas fueron
previamente expuestas a la D-glucosa a una concentración de
5.5 mM para comprobar la sensibilidad a éstas y comparar los
efectos producidos en ambos casos. En la figura 16 se
muestra un ejemplo de dichos experimentos; se puede observar
que el manito1 no ocasionó un efecto comparable al efecto
típico producido por la D-glucosa. Con estos experimentos se
descartó la posibilidad de que la despolarización observada
en presencia de glucosa sea resultado de un cambio en la
osmolaridad de la solución externa.
La L-glucosa un estereoisómero de la D-glucosa que es
reconocido por el transportador de glucosa pero no es
introducido a la célula (Wheeler y Hinkle, 1985) fué probada
a la concentración de 5.5 mM. La L-glucosa no produjo
cambios en el potencial de reposo ni en el patrón de
descarga de potenciales de acción.
En estudios realizados en eritrocitos de mamíferos e
islotes pancreáticos con 2-desoxiglucosa (un análogo de la
D-glucosa) se reportó que éste es interiorizado y
fosforilado por la célula; sin embargo, no es metabolizado
(Ohta y col., 1991; Wheeler y Hinkle, 1985). En las neuronas
51
del OX, la 2-desoxiglucosa 5.5 mM no alteró el potencial de
reposo; sin embargo, se observó una tendencia a disminuir la
frecuencia de potenciales de acción.
Se estudió el efecto de la D-glucosa en presencia de
manoheptulosa, un inhibidor del metabolismo (Ashford y col.,
1990). La glucosa a una concentración de 3 mM no produce los
efectos tipicos observados cuando es agregada a la
preparación en presencia de manoheptulosa (10 mM).
52
$lUCOSA
5 min
FIGURA 16.
Registros del potencial de membrana obtenidos en una
neurona representativa aplicando glucosa y manito1 a la
misma concentración (5.5 mM) y durante el mismo tiempo
(mostTado por las barras). Como se muestra, el manito1 no
produce un cambio apreciable en el potencial de membrana de
las células del OX. Solución de perfusión: VHN.
53
Registro de corrientes iónicas con la técnica de control de
voltaje.
Con el propósito de estudiar el mecanismo por el cual las
neuronas del OX se despolarizan agregando D-glucosa al medio
extracelular, se realizaron registros de corrientes iónicas,
con la técnica de fijación de voltaje, en condiciones
contról (utilizando VHN) y agregando D-glucosa a la solución
de perfusión.
La figura 17 muestra un registro del potencial de
membrana (trazo superior) en una neurona axotomizada
mantenida a -50 mV y la corriente transmembranal (trazo
inferior) registrados con un microelectrodo. Después de
perfundir la glucosa durante 10 minutos (señalado con la
barra) se observó un cambio que puede interpretarse como una
disminución transitoria en la corriente saliente 0 un
aumento en la corriente entrante. El control de voltaje con
la técnica de microelectrodos permitió observar un cambio en
la corriente total con el mismo curso temporal que el cambio
del potencial de reposo producido por la D-glucosa (figura
17). Sin embargo, es necesario aplicar la D-glucosa a
diferentes valores de potencial de membrana para obtener
curvas corriente voltaje (I-V) en condiciones control y en
presencia de glucosa. El método utilizado para obtener las
curvas I-V en estado estable consistió en la aplicación de
rampas de voltaje con una pendiente pequeña.
Para evitar que se dialice el medio intracelular y
lograr mantener la maquinaria metabólica de las células del
54
OX, se utilizó la técnica P/P para registrar las corrientes
iónicas en estado estable durante la aplicación de rampas de
voltaje de -100 a 0 mV con una duración de 20 s, es decir
con una pendiente de 5 mV/s, en solución VHN y en presencia
de glucosa.
55
G L U C O S A
I 2 0 m V
----\_f--[
0 . 5nA
0
5 mm
FIGURA 17.
Registro intracelular de la corriente total con un
microelectrodo en una neurona axotomizada bajo control de
voltaje. El potencial de mantenimiento fué de -50 mV (trazo
superior); la corriente transmembranal (trazo inferior)
mostró un cambio transitorio al aplicar glucosa (5.5 mM)
durante 10 minutos. Solución de perfusión: VHN.
56
En la figura 18 se muestran las curvas I-V obtenidas en
una neurona antes, y durante la aplicación de glucosa. En
este experimento se muestra que la glucosa produce un
corrimiento del potencial de inversión de la corriente de
aproximadamente 7 mV. Para potenciales m6s positivos que -50
mV se observa una disminución de las corrientes salientes y,
consecuentemente, una disminución en la conductancia de la
membrana de 17.8 a 15.7 nS. Esta disminución en las
corrientes salientes observada al perfundir glucosa en la
preparación nos sugirió que probablemente se estuvieran
cerrando o bloqueando canales de potasio o de cloro. Para
tratar de aclarar cual puede ser la participación de alguno
uno de estos canales iónicos, se realizaron los experimentos
que se muestran más adelante.
57
IllV- 5 0 0
0
-100
FIGURA 18.
Curvas I-V obtenidas con la técnica P/P aplicando una
rampa de voltaje (trazo inferior). Las curvas I-V fueron
obtenidas con la solución de perfusión VHN (marcada con una
l1C II) y después de aplicar glucosa a una concentración de
5.5 mM durante 10 minutos (trazo señalado con lwglucosall).
Solución de la pipeta: 1 (vease tabla 2).
58
Registro de corrientes de canales unitarios en la
configuración C/A.
Se realizaron experimentos de canales unitarios en la
configuración C/A utilizando pipetas llenas con la solución
II y perfundiendo la preparación con VBN. En esas
condiciones, al potencial de reposo de las neuronas se
registraron corrientes entrantes a través de canales
unitarios (figuras 19 y 20A).
La figura 19 muestra un registro de la actividad de
dichos canales en una neurona representativa perfundiendo la
preparación con solución de VHN a la cual se le agregó
glucosa (5.5 mM) durante 10 minutos. Como se observa en el
registro, al finalizar la aplicación de glucosa hay una
disminución de la activad de los canales la cual se recupera
parc,ialmente después de lavar la preparación con VBN; es
evidente que la glucosa produce el cierre de los canales
registrados en dichas condiciones. En la figura 20 se
muestra que al perfundir la preparación con glucosa (5.5 mM)
durante 3 minutos fué suficiente para que los canales se
inactivaran (figura 20B), y a los 3 minutos de lavar la
preparación con solución VHN la actividad aparece nuevamente
como se muestra en la figura 20C. Se observa que la
aplicación de glucosa cierra los canales por períodos
largos.
La figura 21 muestra los histogramas de la amplitud (A)
y del' tiempo medio de apertura (B) de las corrientes a
través de los canales unitarios registrados en solución de
59
VHN mostrados en la figura 20. De 562 eventos analizados, la
amplitud unitaria fué de 2.2kl.l pA y la constante de tiempo
medio de apertura fue de 9.2+3 ms. Al lavar la preparación
con VHN, la recuperación de la amplitud fué practicamente
total ya que se obtuvo un valor medido de 2.1kO.8 pA; sin
embargo, el tiempo medio de apertura medido fué de 6.4k2.5
ms, es decir que la recuperación no fué completa a los 3
minutos de lavado.
Para estudiar cual de los iones (Cl- o K+) son los
responsables de la actividad de los canales unitarios
registrados al potencial de reposo, se realizaron
experimentos bañando la preparación con KCl isotónico
(solución II) para llevar el potencial de reposo a un valor
cercano a 0 mV, y de esta manera controlar el potencial de
membrana en la punta de la pipeta modificando el potencial
aplicado al interior de la pipeta; es decir, Vp= Vm.
6 0
I
4 mln
GLUCOSA-
FIGti 19.
Registro de la actividad de los canales en una neurona
del OX en ausencia y presencia de glucosa (5.5 mM) durante
10 minutos. Potencial fijado al potencial de reposo de la
célula. Solución de la pipeta: II. Solución de perfusión:
VI-IN.
61
C
o= 10 pAFIGURA 20. 5 0 0 m s
Actividad de los canales unitarios obtenida con la
técnica de fijación de voltaje en microáreas de membrana al
potencial de reposo de la célula. Bañando la preparación con
solución VHN (A), a los 3 minutos de la exposición a
D-glucosa a una concentración de 5.5 mM (B) y después de
lavar con solución VHN durante 3 minutos (C). La pipeta fué
llenada con la solución II.
62
A10 -
0.8 <’
izI- 0.6 1
-0 2 4 6 8 1 0
AMPLITUD (X 1.0 PA)
FO
0 . 8
0.6
B
0 2. 4 6 8 1 0TIEMPO DE APERTURA 6(25.0ms)
l
FIGURA 21.
Histogramas que muestran la amplitud de las corrientes
unitarias (A) de las que se obtuvo un valor de 2.2kl.l pA y
el tiempo medio de apertura (9.2_+3 ms) (B) de 562 eventos
muestreados en la misma neurona mostrada en la figura 20.
La figura 22 muestra la actividad de los canales
unitarios registrados en la configuración C/A a un potencial
de mantenimiento de -40 mV, llenando las pipetas y bañando
la preparación con la solución II.
En la figura 22A se muestra la actividad al perfundir
la preparación con solución II, en la figura 22B se muestra
que la actividad disminuye después de 10 minutos de aplicar
glucosa (2.8 mM) y al lavar la preparación con solución II
durante 20 minutos la actividad de los canales aparece
recuperada parcialmente (figura 22C).
A Cb
0,
B Cbb
C.‘r.
C Cb
0,-ir
,i
acl
0t-l
20 msFIGURA 22.
A: actividad de los canales unitarios a un potencial de -40
mV en la configuración C/A.
64
B: Registros obtenidos después de 10 minutos de aplicar D-
glucosa (2.8 mM).
c: Registros obtenidos después de lavar la preparación con
la solución II.
Solución de la pipeta: II.
65
L a figura 23 muestra los registros obtenidos al
perfundir la preparación con solución II y llenando las
pipetas con solución II (figura 23A) y con la solución III
(figura 23B), cuyas concentraciones de K+ es diferente (205
y 5.4 mM). Con los registros mostrados en la figura 23 se
construyeron las curvas I-V de los canales unitarios en
ambas condiciones (figura 24). En el primer caso cuando la
concentración de potasio era simétrica (205 mM), la relación
fué lineal con una conductancia unitaria de 135 pS (figura
24, círculos negros), el potencial de inversión de la
corriente unitaria fué de aproximadamente 0 mV. Cuando la
concentración de potasio en las pipetas fué de 5.4 mM, la
curva I-V de las corrientes unitarias mostró una
rectificación hacia afuera. Dichas corrientes para
potenciales de membrana entre -60 y 60 mV fueron salientes
(figura 24, circulos blancos). Ambas relaciones I-V muestran
que los potenciales de inversión fueron cercanos al
potencial de equilibrio para el K+ (EK) estimado por la
ecuación de Nernst.
La cinética de los canales de potasio se modificó al
cambiar el potencial de mantenimiento como se observa en la
figura 23A, donde a potenciales positivos el tiempo de
apertura es mayor que el tiempo de cierre; mientras que a
potenciales negativos la actividad se presenta en forma de
ráfagas, con estados de cierres prolongados entre las
ráfagas y cierres breves durante éstas.
![Gaceta de la Propiedad Industrial · 29 acocil no vivo [crustáceo de agua dulce] 08 acocote ... 10 bastones de uso médico 09 bastones para celulares y cámaras fotográficas](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/5bb1ea8809d3f2e82b8b9a8b/gaceta-de-la-propiedad-industrial-29-acocil-no-vivo-crustaceo-de-agua-dulce.jpg)
