UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA FACULTAD DE MEDICINA

1

UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA

FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE TERAPÉUTICA MÉDICO-QUIRÚRGICA.

ÁREA DE FARMACOLOGÍA

TESIS DOCTORAL

REEVALUACIÓN DE FACTORES GENÉTICOS QUE CONDICIONAN

LA ACETILACIÓN DE FÁRMACOS Y XENOBIÓTICOS.

Jhon Didier Ruiz Buitrago

Badajoz, 2011

2

UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA

FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE TERAPÉUTICA MÉDICO-QUIRÚRGICA.

ÁREA DE FARMACOLOGÍA

REEVALUACIÓN DE FACTORES GENÉTICOS QUE CONDICIONAN

LA ACETILACIÓN DE FÁRMACOS Y XENOBIÓTICOS.

Memoria presentada por

Jhon Didier Ruiz Buitrago

Para optar al grado de Doctor

3

D. JOSÉ AUGUSTO GARCÍA-AGÚNDEZ PÉREZ-COCA, Catedrático de Farmacología del

Departamento de Terapéutica Médico-Quirúrgica de la Universidad de Extremadura, Da

CARMEN MARTÍNEZ OLIVA, Profesora Titular de Farmacología del Departamento de

Terapéutica Médico-Quirúrgica de la Universidad de Extremadura y Da MARÍA ELENA

GARCÍA MARTÍN, Profesora Titular de Bioquímica y Biología Molecular del Departamento

de Bioquímica, Biología Molecular y Genética de la Universidad de Extremadura,

CERTIFICAN:

Que D. JHON DIDIER RUIZ BUITRAGO Licenciado en Medicina Veterinaria, ha

realizado bajo su dirección el presente trabajo titulado “REEVALUACIÓN DE FACTORES

GENÉTICOS QUE CONDICIONAN LA ACETILACIÓN DE FÁRMACOS Y

XENOBIÓTICOS”

Como directores hacemos constar que este ha sido realizado con todas las garantías

ténicas y metodológicas, y que las conclusiones obtenidas son plenamente válidas, además

consideramos que reúne las condiciones necesarias para ser presentado como Tesis

Doctoral.

Para que conste y surta los efectos oportunos, firmamos el presente certificado en Badajoz,

a 22 de noviembre de 2011.

Fdo. Dr. José A.García-Agúndez. Fdo. Dra. María Elena García Martín.

Fdo. Dra. Carmen Martínez Oliva.

4

AGRADECIMIENTOS:

A mis amigas y compañeras permanentes de laboratorio Gara, Mercedes y Julia, quienes

me hicieron sentir como en casa.

A mis compañeros de estudio Blanca, Mariola, Silvia, Juan Gonzalo, Pedro y Segismundo,

con quienes compartí penas, sueños y alegrías.

A mis profesores José A. García Agundez, Elena García, Carmen Martinez, por su

orientación en este duro camino de la academia.

A los profesores Guillermo Gervasiny y Juan Antonio Carrillo, que con su amistad hicieron

que esta empresa fuera más llevadera.

A todos gracias pues en ellos encontré más que valores académicos, valores humanos que

hacen que esta lucha haya sido digna de realizar.

5

DEDICATORIA

A mi esposa Margarita, que me ha apoyado y me ha dado aliento cuando queria

desfallecer.

A mis hijos Felipe y David de quienes tome parte del tiempo que les debí dedicar y que

espero algún día poder compensar.

6

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN 15

1.1 METABOLISMO ACETILADOR 16 1.1.1 ENZIMAS INVOLUCRADAS EN EL METABOLISMO ACETILADOR DE

FÁRMACOS 17

1.1.2 ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS NAT 17 1.1.3 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LAS ARILAMINA N-ACETILTRANSFERASAS 23 1.1.4 ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO 26 1.2 VARIACIONES INTERINDIVIDUALES EN EL METABOLISMO ACETILADOR 28 1.3 GENES IMPLICADOS EN LA ACETILACIÓN DE FARMACOS Y

XENOBIÓTICOS 29

1.4 POLIMORFISMOS EN LOS GENES NAT 35 1.4.1 NAT1 35 1.4.2 NAT2 41 1.5 POLIMORFISMO ACETILADOR Y RIESGO DE CÁNCER 48 1.5.1 CÁNCER DE CABEZA Y CUELLO 51 1.5.2 CÁNCER DE MAMA 51 1.5.3 CÁNCER DE PULMÓN 52 1.5.4 CÁNCER COLORRECTAL 53 1.5.5 CÁNCER DE VEJIGA 54 1.6 RELACIÓN ENTRE FENOTIPO ACETILADOR Y GENOTIPO ACETILADOR

55

2 OBJETIVOS

60

3 MATERIALES Y MÉTODOS 62 3.1 PARTICIPANTES 63 3.2 MATERIALES 63 3.3 REACTIVOS 63 3.4 EQUIPOS 65 3.5 TÉCNICAS ANALÍTICAS 66 3.5.1 Determinación del fenotipo acetilador. 66 3.5.2 Extracción ADN genómico 67 3.5.3 Reacción en cadena de polimerasa a tiempo real (PCR-TR) para genotipación 68 3.5.4 Determinación de la variación en el número de copias (Copy Number Variation:

CNV) de los genes NAT. 74

3.5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

78

4 RESULTADOS. 81 4.1 ANÁLISIS DEL FENOTIPO ACETILADOR DETERMINADO POR LA

RELACIÓN DE METABOLITOS DE CAFEÍNA Log AFMU/1X EN ORINA 82

4.2 DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO ACETILADOR 85 4.2.1 Genotipo NAT2 85 4.2.2 Genotipo NAT1. 102 4.3 Integración de los genotipos NAT1 y NAT2 sobre el metabolismo acetilador 113 4.4 Genotipo Xantina oxidasa (Xantina deshidrogenasa). 118 4.4.1 Efecto de los diplotipos XO, y su combinación con el diplotipo NAT2, sobre el

metabolismo de cafeína in vivo.

121

5 DISCUSIÓN

124

6 CONCLUSIONES.

131

7 BIBLIOGRAFÍA 133

7

ABREVIATURAS

ADN: Ácido desoxirribonucleico

AFMU 5-acetilamino-6-formilamino-3-metiluracilo

ANL: Anilina

ANS: 4-metoxianilina

APY: Aminopiridina

BOA: 4-butoxianilina

BRA: 4-bromoanilina

5AS: ácido 5-aminosalicíco

CBZ: 4-clorobenozóico hidrazida

CLA: 4-cloroanilina

CNV: Variación en el número de copias de un gen (Copy Number Variation)

CoA: Coenzima A

CT: Ciclo umbral (Cycle Threshold)

4AV: 4-aminoveratrol

4AS: ácido 4-aminosalicílico

CYP: Citocromo P450 (Cytochrome P450)

dNTP: Desoxirribonucleótido trifosfato

2AF: 2-aminofluorano

24DCA: 2,4-dicloroanilina

EDTA: Etilendiaminotetracético

EOA: 4-etoxianilina

HDZ: Hidralazina

HOA: 4-hexiloxianilina

8

HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución (High Pressure Liquid

Chromatography)

IC: Intervalo de confianza

INH: Isoniazida

IOA: 4-iodoanilina

Kb: Kilobases

MGB: Unidor a la ranura menor (Minor Groove Binder)

NAT: N-acetiltransferasa

NFQ: Inhibidor de fluorescencia (No Fluorecent Quencer)

ORF: Marco de lectura abierto (Open Reading Frame)

pABGlu: 4-aminobenzoil-l-glutamato

PABA: Ácido 4-aminobenzóico

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Polimerase chain reaction)

PHZ: Fenilhidrazina

POA: 4-fenoxianilina

PRO: Procainamida

RNAm: Ácido ribonucléico mensajero

SD: Desviación estándar o desviación típica

SE: Error estándar o error típico

SMZ: Sulfametazina

SNP: Polimorfismo de único nucleótido (Single Nucleotide Polymorphism)

TE: Tris-EDTA

TR: Tiempo real

34DCA: 3,4-dicloroanilina

UV: Ultravioleta

UTR: Región no traducida (Unstranslated region)

9

17U: 1,7-dimetilúrico ácido

1X: 1,7-dimetilxanthina

v/v: volumen/volumen

WT: Wild type (tipo silvestre)

XDH: Xantina deshidrogenasa

XO: Xantina oxidasa

10

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas NAT1 y NAT2

18

Tabla 2. Secuencia comparativa de nucleótidos en la región codificadora de los genes NAT1 y NAT2.

34

Tabla 3. Alelos NAT1 en humanos (Haplotipos).

36

Tabla 4. Frecuencias de haplotipos NAT1 en diferentes poblaciones humanas.

41

Tabla 5. Alelos NAT2 en humanos (Haplotipos).

42


48

Tabla 7. Frecuencias de SNPs no sinónimos del gen de xantina oxidasa en caucásicos

58

Tabla 8. Sondas Taqman utilizadas en la genotipación de NAT2

70


70

Tabla 10. Sondas Taqman para la genotipación de XO

71

Tabla 11. Frecuencia de SNPs del gen NAT2 en la población de estudio

85

Tabla 12. Frecuencias genotípicas de los SNPs en la región codificadora del gen NAT2 en la población de estudio

86

Tabla 13. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs1801280 (114 Ile/Thr) del gen NAT2 según la relación con el valor de (log AFMU/1X).

87

Tabla 14. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs1799930 (197 Arg/Gln) del gen NAT2 según la relación con el valor de (log AFMU/1X)

89

Tabla 15. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para el SNP rs1799931 (286 Gly/Glu) del gen NAT2 según la relación con el valor de (log AFMU/1X)

90

Tabla 16. Frecuencia de haplotipos y su denominación (nomenclatura) para el gen NAT2

92

Tabla 17. Frecuencias de los diplotipos NAT2 y su distribución según el fenotipo acetilado

94

Tabla 18. Estadística descriptiva del log AFMU/1X según los diplotipos NAT2.

96

11

Tabla 19. Comparación T-test entre los diplotipos del gen NAT2 según los valores de log AFMU/1X en orina.

97

Tabla 20. Frecuencias de CNV del gen NAT2 según el genotipo

100

Tabla 21. Valores de estadística descriptiva del log AFMU/1X según el número de copias del gen (CNV) en grupos con distintos genotipos NAT2.

101

Tabla 22. Frecuencia de SNP del gen NAT1 en la población de estudio.

102

Tabla 23. Frecuencias genotípicas de los SNPs en la región codificadora del gen NAT1 en la población de estudio.

103

Tabla 24. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs4986782 (187 Arg/Gln) del gen NAT1 según la relación con el Log AFMU/1X

105

Tabla 25. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs4986783 (Ser/Ala) del gen NAT1 según la relación con el Log AFMU/1X.

106

Tabla 26. Frecuencia de haplotipos del gen NAT1 determinados en la población de estudio.

108

Tabla 27. Frecuencias de los diplotipos NAT1 y su distribución según el fenotipo acetilador.

109

Tabla 28. Promedios ± SD, min, max e I.C. 95% del log AFMU según los diplotipos NAT1

110

Tabla 29. Comparación T-test entre los diplotipos del gen NAT1 según los valores de log AFMU/1X

111

Tabla 30. Frecuencias de CNV del gen NAT1 según el genotipo

112

Tabla 31. Valores de estadística descriptiva del log AFMU/1X según el número de copias del gen (CNV) en grupos con distintos genotipos NAT1.

112

Tabla 32. Valores de estadística descriptiva del log AFMU/1X para la relación de diplotipos NAT2 y SNPs del gen NAT1.

114

Tabla 33. Frecuencia de SNP del gen XO en la población de estudio

118

Tabla 34 Frecuencias genotípicas de los SNPs del gen XO en la población de estudio.

119

Tabla 35. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs17323225 (Ile/Val) del gen XO según la relación con el Log AFMU/1X

120

Tabla 36. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs17011368 (Ile/Val) del gen XO según la relación con el Log AFMU/1X

120

Tabla 37. Frecuencia de haplotipos para el gen XO (n=912 alelos) 121

12

Tabla 38. Valores de estadística descriptiva del log AFMU/1X para la relación de diplotipos NAT2 y algunos SNPs del gen XO.

122

13

INDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura tridimensional de la proteína NAT1 19

Figura 2. Modelo estructural del sitio activo de la proteína NAT1 humana.

20

Figura 3. Estructura de la proteína NAT1 humana.

21

Figura 4. Estructura tridimensional de la proteína NAT2.

22

Figura 5. Disposición de los residuos Cys68, His107, y Asp122 de NAT2 humana

22

Figura 6. Representación NAT1 y NAT2 humanas

23

Figura 7. Esquema de la reacción de acetilación N-acetiltransferasa por la traída catalítica de NAT1.

25

Figura 8. Reacción N,O-transacetilación o AHAT

26

Figura 9. Comparación de la especificidad de sustrato de las enzimas NAT1 y NAT2

27

Figura 10. Esquema del locus NAT en el cromosoma 8 humano

30

Figura 11. Esquema de la regulación de la expresión en los genes NAT1 y NAT2

31

Figura 12. Transcripción del gen NAT1 humano. Se observan varias variantes de splicing del gen NAT1 que son expresadas desde los diferentes promotores

32

Figura 13. Localización de polimorfismos en el gen NAT1 humano.

36

Figura 14. Localización de polimorfismos en el gen NAT2 humano.

42

Figura 15. Mecanismo propuesto para la asociación entre el cáncer hepático y polimorfismos de enzimas metabolizadoras de fármacos

49

Figura 16. Posibles mecanismos que relacionan las actividades NAT con la carcinogénesis.

50

Figura 17. Mapa del metabolismo de cafeína

56

Figura 18. Representación esquemática del proceso de genotipación por PCR-TR con sondas TaqMan® MGB

69

Figura 19. Amplificación de un blanco (sin ADN).

72

Figura 20. Amplificación de una muestra de ADN genómico. Genotipo silvestre

73

Figura 21. Amplificación de una muestra de ADN genómico.Genotipo mutado

73

14

Figura 22. Amplificación de una muestra de ADN genómico. Genotipo herocigoto

74

Figura 23. Representación esquemática del proceso de determinación del número de copias de un gen por PCR-TR

75

Figura 24. Amplificación de una muestra de ADN genómico por cuadruplicado, para la determinación de CNV.

77

Figura 25. Resultados de un experimento de estudio de CNV

78

Figura 26. Histograma de frecuencias de la relación log AFMU/1X en la población de estudio.

82

Figura 27. Cálculos de densidad de Kernel

83

Figura 28. Distribución de fenotipo acetilador según el sexo

84

Figura 29. Medias e IC del 95% de log AFMU/1X según el genotipo del SNP rs1801280 (114Ile/Thr) del gen NAT2.

87

Figura 30. Medias e IC del 95% de Log AFMU/1X según el genotipo del SNP rs1799930 NAT2 (Modelo codominante).

89

Figura 31. Medias e IC del 95% de Log AFMU/1X según el genotipo del SNP rs1799931 NAT2.

91

Figura 32. Diagrama de dispersión de valores de log AFMU/1X en orina según el diplotipo del gen NAT2.

95

Figura 33. Comparación de los promedios e I.C. 95% del log AFMU/1X entre los diplotipos NAT2 clasificados como rápidos e intermedios.

98

Figura 34. Comparación de los promedios e I.C. 95% del log AFMU/1X entre los diplotipos NAT2 clasificados como lentos.

99

Figura 35. Análisis de desequilibrio de ligamiento SNPs de NAT1.

107

Figura 36. Valores de media e I.C. 95% del log AFMU/1X según las comparaciones de diplotipos NAT2 y su combinación con el SNP rs4986782

116

Figura 37. Valores promedio e I.C. 95% del log AFMU/1X según el diplotipo de NAT2 combinados con los diplotipos NAT1.

117

Figura 38. Valores promedio e I.C. 95% del log AFMU/1X según el diplotipo de NAT2 combinados con los diplotipos XO

123

15

1. INTRODUCCIÓN

16

1.1 METABOLISMO ACETILADOR.

En los últimos años la investigación acerca de las Arilamina N-acetiltransferasas (CoASAc;

NAT, EC 2.3.1.5), ha permitido realizar importantes avances para comprender las bases de

las alteraciones en el metabolismo de fármacos y xenobióticos (Agundez, 2008). El proceso

de acetilación in vivo de estas sustancias fue descrito por primera vez por Jaffe y Cohn en

1887, cuando observaron en la orina de conejos una cantidad inusual de un producto

acetilado después de la administración de furfural (Jaffe and Cohn, 1887). La variabilidad en

el proceso de acetilación en seres humanos se describió inicialmente en el metabolismo de

isoniazida en pacientes tuberculosos (Bonicke and Reif, 1953; Evans et al., 1960a; Evans et

al., 1960b; Hughes et al., 1954). La observación de que la N-acetilación de isoniazida y de

otros fármacos como la sulfametazina se producía con diferentes fenotipos acetiladores

(rápidos, intermedios y lentos), y que la N-acetilación de otras sustancias como el ácido p-

aminosalicílico tenía una distribución aparentemente monomórfica permitió a Jenne, sugerir

la existencia al menos dos N-acetiltransferasas distintas (Jennne, 1965), denominadas

posteriormente NAT1 y NAT2 (Grant et al., 1989).

Más recientemente se demostró que la presencia de polimorfismos comunes en la enzima

N-acetiltransferasa 2 se relacionaban con una disminución de los niveles de proteína en el

hígado (Blum et al., 1991), lo que dio un impulso al desarrollo del conocimiento de las

enzimas N-acetiltransferasas (Agundez, 2008), llevó a la purificación de las NATs

(Bergstrom et al., 1995; Wagner et al., 1996), la clonación (Blum et al., 1989; Ohsako et al.,

1988), y el análisis funcional de los productos de la proteína recombinante (Blum et al.,

1991), permitiendo así un conocimiento más detallado de los mecanismos moleculares de

estas actividades enzimáticas y de cómo las alteraciones en los genes que las codifican

afectan la capacidad metabólica.

17

1.1.1. ENZIMAS IMPLICADAS EN EL METABOLISMO ACETILADOR DE FÁRMACOS.

Las enzimas implicadas en el metabolismo acetilador de fármacos y xenobióticos se

denominan Arilamina N-acetiltransferasas (NAT; EC 2.3.1.5). Se han identificado en

numerosos vertebrados y microorganismos (Upton et al., 2001; Vagena et al., 2008). Puede

encontrarse una base de datos actualizada de NATs no humanas, incluyendo procariotas y

eucariotas, creada por el comité internacional de nomenclatura de arilaminas N-

acetiltransferasas http://www.mbg.duth.gr/non-humannatnomenclature/background.html, donde pueden

consultarse los genes NAT conocidos. Las enzimas NATs han sido reportadas en muchas

especies de mamíferos (Sinclair et al., 2000), y el número de genes NAT, y por ende, de

enzimas, varía entre diferentes especies. Por ejemplo en ratas, se han identificado tres

genes NAT (Walraven et al., 2006), en conejos y hámsters, existen dos genes que codifican

NAT (Blum et al., 1989); lo mismo que en humanos (Upton et al., 2001); mientras que los

gatos domésticos y otros félidos tienen un único gen NAT (Trepanier et al., 1998); y los

perros domésticos y otros cánidos no tienen genes NAT (Trepanier et al., 1997). Información

mucho más detallada de las dos NATs humanas se puede encontrar en el enlace

http://louisville.edu/medschool/pharmacology/consensus-human-arylamine-n-acetyltransferase-gene-

nomenclature/

1.1.2. ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS NAT

Las dos enzimas arilamina N-acetiltransferasas humanas, NAT1 y NAT2, tienen un peso

molecular de 33 y 31 KDa, respectivamente (Levy and Weber., 2002) y 290 aminoácidos. La

comparación de las secuencias de las proteínas no mutadas se muestra en la tabla 1.

18

NAT1 1-10 M D I E A Y L E R I NAT2 1-10 F NAT1 11-20 G Y K K S R N K L D NAT2 11-20 M NAT1 21-30 L E T L T D I L Q H NAT2 21-30 E NAT1 31-40 Q I R A V P F E N L NAT2 31-40 NAT1 41-50 N I H C G D A M D L NAT2 41-50 M Q E NAT1 51-60 G L E A I F D Q V V NAT2 51-60 H I NAT1 61-70 R R N R G G W C L Q NAT2 61-70 NAT1 71-80 V N H L L Y W A L T NAT2 71-80 Q NAT1 81-90 T I G F E T T M L G NAT2 81-90 Q

NAT1 91-100 G Y V Y S T P A K K NAT2 91-100 F I P V N NAT1 101-110 Y S T G M I H L L L NAT2 101-110 V NAT1 111-120 Q V T I D G R N Y I NAT2 111-120 NAT1 121-130 V D A G F G R S Y Q NAT2 121-130 S S S NAT1 131-140 M W Q P L E L I S G NAT2 131-140 NAT1 141-150 K D Q P Q V P C V F NAT2 141-150 I NAT1 151-160 R L T E E N G F W Y NAT2 151-160 C R I NAT1 161-170 L D Q I R R E Q Y I NAT2 161-170 NAT1 171-180 P N E E F L H S D L NAT2 171-180 T K N H NAT1 181-190 L E D S K Y R K I Y NAT2 181-190 P K K H Q NAT1 191-200 S F T L K P R T I E NAT2 191-200 L E NAT1 201-210 D F E S M N T Y L Q NAT2 201-210 NAT1 211-220 T S P S S V F T S K NAT2 211-220 T S I T T NAT1 221-230 S F C S L Q T P D G NAT2 221-230 E NAT1 231-240 V H C L V G F T L T NAT2 231-240 Y I NAT1 241-250 H R R F N Y K D N T NAT2 241-250 Y K NAT1 251-260 D L I E F K T L S E NAT2 251-260 V T NAT1 261-270 E E I E K V L K N I NAT2 261-270 V E NAT1 271-280 F N I S L Q R K L V NAT2 271-280 K G N NAT1 281-290 P K H G D R F F T I NAT2 281-290 P G S L

Tabla 1. Comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas NAT1 y NAT2. Adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/34993. En rojo aparecen los aminoácidos en que difiere NAT2 respecto a NAT1.

19

Las proteínas NAT1 y NAT2 tienen una similitud del 81.4% en la secuencia de aminoácidos

(Blum et al., 1990; Rodrigues-Lima et al., 2001). De los 55 aminoácidos en que difieren las

dos proteínas, sólo 28 son no conservativos (Grant, 2008).

El dominio amino terminal (residuos 1-83) de NAT1, está formado por cinco α hélices (1 a 5)

y una lámina β corta entre las α hélices dos y tres. El segundo dominio comprende los

residuos 85 a 192 y consiste en nueve láminas β (2 a11), con dos α hélices cortas (6 y 7).

Estos dos dominios conectan a través de un interdominio de α hélices (hélices de 8 a 10)

con el tercer dominio, el cual tiene cuatro láminas β en sentido antiparalelo (12 a 15) y la

hélice 11. (Wu et al., 2007), como se muestra en la figura 1.

Figura 1. Estructura tridimensional de la proteína NAT1. La estructura secundaria tiene 11

α hélices y 15 láminas β. Tomado de (Wu et al., 2007).

20

Al comparar la secuencia de aminoácidos de las N-acetiltransferasas de muchas especies,

se observa la conservación de cisteínas en las posiciones 44, 68, y 223, y en particular la

secuencia circundante a C68 (C69 en Salmonella) (Watanabe et al., 1992). Todas las

proteínas arilamina N-acetiltransferasa de mamíferos incluyendo la N-acetiltransferasa 1

humana, contienen tres residuos estrictamente conservados (Cys68, His107, y Asp122), que

forman una tríada catalítica que se muestra en la figura 2 (Rodrigues-Lima et al., 2001;

Sinclair et al., 2000; Wu et al., 2007).

Figura 2. Modelo estructural del sitio activo de la proteína NAT1 humana. Se observa la

ubicación espacial de los residuos de la triada catalítica (Cys68, His107, y Asp122), con los

átomos de carbono en gris. Los residuos que interactúan con la acetanilida se muestran con

los átomos de carbono coloreados en verde. Nótese la posición de Phe217 (Wu et al., 2007)

A través de estudios de mutagénesis dirigida se ha establecido que el aminoácido Cys68 es

crítico en el sitio catalítico y participa directamente de la transferencia del grupo acetilo

desde el cofactor acetil-CoA al sustrato aceptor (Dupret and Grant, 1992). Se ha sugerido

21

que el sitio activo de la enzima NAT1 está oculto en un bolsillo de la proteína para excluir el

agua de la proximidad de Cys68, reduciendo la hidrólisis del producto intermedio sulfidril

acetilado (Wang et al., 2004), como se muestra en siguiente figura.

Figura 3. Estructura de la proteína NAT1 humana. Se muestra el bolsillo central donde se

encuentra el aminoácido Cys68. Tomado de Michin RF, y cols. 2007 (Minchin et al., 2007).

Además de la triada catalítica, existe un bucle o asa flexible que formada por los residuos

122 a 131 y que parece ser crítica para determinar la especificidad de sustrato. En particular

el residuo Phe125 que está alineado aproximadamente a 3.4 Å de la triada catalítica, como

se muestra en la figura 2. El gran volumen de la cadena lateral probablemente restringe el

acceso de sustratos grandes al sitio activo de la proteína NAT1 (Rodrigues-Lima et al.,

2001).

La estructura de la proteína NAT2, es similar a la N-acetiltransferasa 1. NAT2 contiene tres

residuos estrictamente conservados (Cys68, His107, y Asp 122) (Rodrigues-Lima et al.,

2001; Sinclair et al., 2000; Wu et al., 2007), como se muestran en las figuras 4 y 5.

22

Figura 4. Estructura tridimensional de la proteína NAT2. La estructura secundaria tiene 11 α

hélices y 15 láminas β. Tomado de (Wu et al., 2007).

Figura 5. Disposición de los residuos Cys68, His107, y Asp122 de NAT2 humana (Wu et al.,

2007).

23

Una diferencia de la proteína NAT2, comparada con la proteína NAT1, es el aminoácido en

la posición 125. Mientras que NAT1 tiene una fenilalanina, NAT2 tiene una serina. Ello le

permite acetilar arilaminas mucho más grandes que las que puede acetilar NAT1, ya que la

cadena lateral de la serina ocupa la mitad del volumen que ocupa la de la fenilalanina

(Rodrigues-Lima et al., 2001), como se puede ver en la figura 6.

Figura 6. Representación de NAT1 y NAT2 humanas, mostradas en ángulos similares. Los

residuos de la posición 125 (Phe125 en NAT1 y Ser125 en NAT2), se muestran en rojo. El

residuo Cys68 se muestra en verde. El bucle comprendido entre los residuos Val93 a Ile106

en NAT1 y Phe93 a Val106 en NAT2 se muestran en azul turquesa. Tomado de (Rodrigues-

Lima and Dupret, 2002).

1.1.3 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LAS ARILAMINA N-ACETILTRANSFERASAS.

Las arilamina N-acetiltransferasas 1 y 2, son enzimas citosólicas de fase II (Liu et al., 2007).

La actividad NAT2 es alta en el hígado (Fretland et al., 2003) y en el intestino (Kashuba et

al., 1998), por lo que esta enzima juega un papel relevante en el metabolismo presistémico

24

de fármacos. Aunque el catabolito del ácido fólico, p-aminobenzoilglutamato es N-acetilado

por NAT1 (Minchin, 1995; Ward et al., 1995), se desconocen sustratos endógenos de las

enzimas NAT1 y NAT2 humanas. La amplia distribución en tejidos de la actividad acetiladora

p-aba en hamsters, ratas, ratones, gatos y humanos, sugieren que NAT1 está implicada en

el metabolismo endógeno además de en el metabolismo de xenobióticos (Butcher et al.,

2000); sin embargo, además del aparente papel en el catabolismo del folato, todavía no se

ha identificado ninguna otra función endógena (Cornish et al., 2003). En el caso de NAT2, se

ha sugerido que es posible que participe en el mantenimiento de la homeostasis del acetil

CoA (Butcher et al., 2000).

Las enzimas arilamina N-acetiltransferasas catalizan las transferencia de un grupo acetilo

desde Ac-CoA a un átomo de nitrógeno o de oxígeno de arilaminas primarias, hidrazinas, y

sus metabolitos N-hidroxilados (Blum et al., 1990; Upton et al., 2001), de acuerdo al

esquema mostrado en la Figura 7.

La reacción de acetilación ocurre en dos pasos: primero el grupo acetilo es transferido

desde AcetilCoenzima A al residuo cisteína (Cys68) de la proteína NAT, formando un

intermediario catalítico acetil-cisteinil-NAT (Andres et al., 1988), y en el segundo paso el

grupo acetil es transferido al nitrógeno amino exocíclico o al oxígeno de sustratos amino

hidroxilados. El primer producto (CoA) es liberado antes de que el segundo reactante

(arilamina) se una; este mecanismo de reacción es clasificado como ping-pong Bi Bi (Wang

et al., 2004).

25

Figura 7. Esquema de la reacción de acetilación N-acetiltransferasa por la traída catalítica

de NAT1. Tomado de (Minchin et al., 2007).

Otra reacción catalizada por NAT es independiente del Acetil-CoA e implica la transferencia

de un grupo acetilo desde el nitrógeno de un ácido arilhidroxámico al oxígeno produciendo

un acetoxiarilamina. Esta reacción es referida como N,O-transacetilación o AHAT por sus

siglas en inglés (arylhydroxamic acid acetyl transfer) y produce una acetil-enzima intermedia.

La transferencia de N a O del grupo acetilo puede ser intramolecular o intermolecular

dependiendo de si el donante y el aceptor es la misma o diferente molécula. (Levy and

Weber., 2002).

26

Figura 8. Reacción N,O-transacetilación o AHAT (Arylhydroxamic acid acetyltransfer

reaction) (Levy and Weber., 2002)

1.1.4 ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO

Aunque las enzimas NAT1 y NAT2 humanas tienen diferencias en su especificidad de

sustrato, también presentan cierto grado de solapamiento (Dupret and Grant, 1992). En la

figura 9 se presenta el porcentaje de actividad específica de las enzimas NAT1 y NAT2

hacia diferentes sustratos.

Como se puede observar en la figura 9, NAT1 tiene mayor especificidad sobre algunos

sustratos como el ácido 4-aminobenzóico (PABA), ácido 4-aminosalicílico (4AS), 4-

metoxianilina (ANS), 2-aminofluorano (2AF) y 4-aminobenzoil-l-glutamato (pABGlu);

mientras que NAT2 tiene mayor especificidad sobre otros sustratos como anilina (ANL), 2,4-

dicloroanilina (24DCA), 3,4-dicloroanilina (34DCA), 4-butoxianilina (BOA), 4-hexiloxianilina

(HOA), 4-fenoxianilina (POA), 4-aminoveratrol (4AV), procainamida (PRO), sulfametazina

(SMZ), isoniazida (INH), hidralazina (HDZ), 4-clorobenozóico hidrazida (CBZ), fenilhidrazina

(PHZ). Sin embargo en la misma figura también se observan sustratos sobre los que ambas

enzimas tienen actividades similares como ácido 5-aminosalicílico (5AS), 4-cloroanilina

(CLA), 4-bromoanilina (BRA), 4-iodoanilina (IOA), 4-etoxianilina, (EOA), (Kawamura et al.,

2005). Las diferencias de selectividad por el sustrato están relacionadas con la presencia de

tres residuos de serina en las posiciones 125, 127 y 129 de NAT2, mientras que en NAT1

Ar-NOH -COCH3 Ar-NHO- COCH3

Ácido hidroxámico acetoxiamina

27

estas posiciones están ocupadas por los aminoácidos fenilalanina, arginina y tirosina,

respectivamente (Goodfellow et al., 2000).

Figura 9. Comparación de la especificidad de sustrato de las enzimas NAT1 y NAT2

ANL: anilina, PABA: ácido 4-aminobenzóico, 4AS: ácido 4-aminosalicílico, 5AS: ácido 5-

aminosalicílico, CLA: 4-cloroanilina, BRA: 4-bromoanilina, IOA: 4-iodoanilina, 24DCA: 2,4-

dicloroanilina, 34DCA: 3,4-dicloroanilina, ANS: 4-metoxianilina, EOA: 4-etoxianilina, BOA: 4-

butoxianilina, HOA: 4-hexiloxianilina, POA: 4-fenoxianilina, 4AV: 4-aminoveratrol, 2AF: 2-

aminofluorano, pABGlu: 4-aminobenzoil-l-glutamato, APY: aminopiridina, PRO: procainamida, SMZ:

sulfametazina, INH: isoniazida, HDZ: hidralazina, CBZ: 4-clorobenozóico hidrazida, PHZ:

fenilhidrazina. Adaptado de (Kawamura et al., 2005)

28

1.2 VARIACIONES INTERINDIVIDUALES EN EL METABOLISMO ACETILADOR.

Los genes NAT1 and NAT2 tienen polimorfismos con efectos funcionales sobre la actividad

enzimática. Utilizando aloenzimas N-acetiltransferasa recombinantes, se han identificado los

efectos de las sustituciones de nucleótidos de NAT1 y NAT2 sobre la afinidad del sustrato, la

actividad catalítica y/o la estabilidad de la proteína (Hein et al., 2000a). Sin embargo se debe

considerar que la actividad enzimática NAT está modulada por diferentes factores, además

del genotipo, entre los que se incluyen la dieta, algunas patologías y los tratamientos

farmacológicos. Por este motivo no existe una correlación absoluta entre el genotipo

acetilador (es decir, la presencia de polimorfismos en los genes que codifican NAT1 y NAT2)

y el fenotipo acetilador (es decir, la capacidad de acetilar sustratos de las enzimas NAT in

vivo). Incluso, dependiendo del sustrato que se use para determinar el fenotipo, y del

método analítico empleado, frecuentemente los fenotipos acetiladores no son discriminados

claramente, existiendo un cierto solapamiento entre ellos (Hein et al., 2000a).

El fenotipo NAT1 ha sido determinado in vivo usando ácido p-aminosalicílico como sustrato

(Hughes et al., 1998). La determinación de la proporción de metabolitos en orina o plasma

después de la administración de bajas dosis del ácido p-aminosalicílico, permite la

identificación de diferentes capacidades metabólicas de NAT1 (Hughes et al., 1998). Este

fenotipo tiene una utilidad limitada actualmente ya que, al contrario de lo que ocurre con

NAT2, el número de fármacos utilizados en clínica que son sustratos de NAT1 es muy

escaso.

29

La variabilidad en el fenotipo de NAT2 se identificó por primera vez en relación con los

efectos colaterales y tóxicos en pacientes tratados con isoniazida, un fármaco utilizado en el

tratamiento de la tuberculosis (Bonicke and Reif, 1953; Huang et al., 2002; Hughes et al.,

1954; Weber and Hein, 1979). Existe un consenso general en que hay dos fenotipos

principales denominados acetilador rápido, en portadores homocigotos o heterocigotos de

genes NAT2 funcionales y acetilador lento (el más frecuente en nuestra población) en

portadores homocigotos de genes NAT2 que codifican proteínas con una actividad reducida

(Hein, 2002). La mayoría de las mutaciones que causan fenotipo lento aparecen con una

alta frecuencia en la población mundial (ver más adelante), por lo que se ha sigerido que el

déficit en la capacidad acetiladora podría constituir algún tipo de adaptación humana a

factores dietéticos o ambientales (Patin et al., 2006a). Por ejemplo, los modelos de variación

de secuencia de NAT2 son consistentes con una neutralidad selectiva en todas las

poblaciones sub-Saharianas investigadas, mientras el alto nivel de diferenciación de

poblaciones entre Europeos y Asiáticos Orientales inferida desde los polimorfismos, sugiere

una presión selectiva, específica de algunas poblaciones, actuando sobre este locus,

probablemente causada por diferencias en la dieta o exposición a otros factores ambientales

(Sabbagh et al., 2008). Es obvio que dicha adaptación debe estar relacionada con la

exposición durante largos períodos de tiempo a químicos ambientales y componentes

dietéticos, más que a los fármacos, ya que el uso de éstos es demasiado reciente para

producir algún efecto selectivo apreciable (Luca et al., 2008).

1.3. GENES IMPLICADOS EN LA ACETILACIÓN DE FÁRMACOS Y XENOBIÓTICOS.

En humanos las dos enzimas N-acetiltransferasas, NAT1 y NAT2, son codificadas por

sendos genes ubicados en el cromosoma 8 (Dupret and Grant, 1992). Estos dos genes

30

homólogos, están situados dentro de una región de 200 kb, la región 8p22, junto con el

pseudogen NATP (Blum et al., 1990). NAT1 y NAT2 son multialélicos (Hein et al., 2000a), y

la frecuencia de los alelos depende del origen étnico de cada población (Garcia-Martin,

2008; Upton et al., 2001).

Figura 10. Esquema del locus NAT en el cromosoma 8 humano: NAT1 y NAT2 son genes

funcionales y están separados por aproximadamente 160 kb. El pseudogen NATP no se

muestra. Tomado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer/?id=NC_000008.9&v=18100000..18350000

La estructura y la regulación de la expresión es diferente en los dos genes NAT como se

muestra en la siguiente Figura:

31

Figura 11. Esquema de la regulación de la expresión en los genes NAT1 y NAT2. Tomado

de (Sim et al., 2008).

El gen NAT1 humano tiene nueve exones que se distribuyen en un área de

aproximadamente 53 kb (Butcher et al., 2005). Ver figura 12. Se han descrito varios

transcritos de NAT1, en los que se presentan varias combinaciones de exones (Butcher et

al., 2005; Husain et al., 2004).

32

Figura 12. Transcripción del gen NAT1 humano. Se observan diversas variantes de splicing

del gen NAT1 que son expresadas desde los diferentes promotores. El exón 9 es el que

codifica la proteína NAT1, y 1 a 8 son exones no codificantes. El primer promotor (NAT1a)

está localizado en la región 5’ del exón 1 y produce dos transcritos mayores a1 y a2, y

varios transcritos menores (no mostrados). El segundo promotor (NATb), está localizado en

la regíon 5’ del exón 4, b1 a b5 son cinco transcritos que se producen desde el promotor

NATb. Adaptado de (Minchin et al., 2007).

Los diferentes transcritos codifican proteínas con diferencias funcionales, pero el significado

biológico de esta variabilidad en la transcripción es todavía desconocido (Butcher et al.,

2005).

33

La transcripción de NAT2 parece ser mucho más simple. El gen NAT2 tiene dos exones: el

exón 2 que codifica la totalidad de la proteína arilamina N-acetiltransferasa 2 (Patin et al.,

2006a), y otro exón de 100 pb, localizado aproximadamente 8 kb en dirección 5’ (Ebisawa

and Deguchi, 1991; Sim et al., 2008), cuya función es desconocida. La expresión heteróloga

del exón 2 (codificante) del gen NAT2 produce proteína completamente funcional sin

necesidad de que en los clones esté presente el exón 1 ni el intrón que los separa, por lo

que se asume que el exón 1 tiene una escasa relevancia funcional en la actividad NAT2

(Olivera et al., 2007).

A pesar de la diferente regulación de la expresión en estos genes, las regiónes codificadoras

de los genes tienen una alta similitud (86,55%), como se muestra en la siguiente Tabla.

34

Nucleótido 1 NAT1 ATG GAC ATT GAA GCA TAT CTT GAA AGA ATT Nucleótido 1 NAT2 TTT Nucleótido 31 NAT1 GGC TAT AAG AAG TCT AGG AAC AAA TTG GAC Nucleótido 31 NAT2 AAC Nucleótido 61 NAT1 TTG GAA ACA TTA ACT GAC ATT CTT CAA CAC Nucleótido 61 NAT2 GAG Nucleótido 91 NAT1 CAG ATC CGA GCT GTT CCC TTT GAG AAC CTT Nucleótido 91 NAT2 CGG

Nucleótido 121 NAT1 AAC ATC CAT TGT GGG GAT GCC ATG GAC TTA Nucleótido 121 NAT2 ATG CAA TTG Nucleótido 151 NAT1 GGC TTA GAG GCC ATT TTT GAT CAA GTT GTG Nucleótido 151 NAT2 GCT CAC ATT GTA Nucleótido 181 NAT1 AGA AGA AAT CGG GGT GGA TGG TGT CTC CAG Nucleótido 181 NAT2 AAC GGG Nucleótido 211 NAT1 GTC AAT CAT CTT CTG TAC TGG GCT CTG ACC Nucleótido 211 NAT2 CAA Nucleótido 241 NAT1 ACT ATT GGT TTT GAG ACC ACG ATG TTG GGA Nucleótido 241 NAT2 ACA ATC CAG ACA TTA Nucleótido 271 NAT1 GGG TAT GTT TAC AGC ACT CCA GCC AAA AAA Nucleótido 271 NAT2 TTT ATC CCT GTT AAC Nucleótido 301 NAT1 TAC AGC ACT GGC ATG ATT CAC CTT CTC CTG Nucleótido 301 NAT2 GTT Nucleótido 331 NAT1 CAG GTG ACC ATT GAT GGC AGG AAC TAC ATT Nucleótido 331 NAT2 GAC AAT Nucleótido 361 NAT1 GTC GAT GCT GGG TTT GGA CGC TCA TAC CAG Nucleótido 361 NAT2 TCT AGC TCC TCC Nucleótido 391 NAT1 ATG TGG CAG CCT CTG GAG TTA ATT TCT GGG Nucleótido 391 NAT2 CTA GAA Nucleótido 421 NAT1 AAG GAT CAG CCT CAG GTG CCT TGT GTC TTC Nucleótido 421 NAT2 TGC ATT TTC Nucleótido 451 NAT1 CGT TTG ACG GAA GAG AAT GGA TTC TGG TAT Nucleótido 451 NAT2 TGC ACA AGA ATC TAC Nucleótido 481 NAT1 CTA GAC CAA ATC AGA AGG GAA CAG TAC ATT Nucleótido 481 NAT2 CTG AGG AGA GAG TAT Nucleótido 511 NAT1 CCA AAT GAA GAA TTT CTT CAT TCT GAT CTC Nucleótido 511 NAT2 ACA AAC AAA AAT CAT Nucleótido 541 NAT1 CTA GAA GAC AGC AAA TAC CGA AAA ATC TAC Nucleótido 541 NAT2 CTG CCA AAG AAG CAC CAA ATA Nucleótido 571 NAT1 TCC TTT ACT CTT AAG CCT CGA ACA ATT GAA Nucleótido 571 NAT2 TTA ACG GAA Nucleótido 601 NAT1 GAT TTT GAG TCT ATG AAT ACA TAC CTG CAG Nucleótido 601 NAT2 Nucleótido 631 NAT1 ACA TCT CCA TCA TCT GTG TTT ACT AGT AAA Nucleótido 631 NAT2 ACG ACA TCA ATA ACC ACA Nucleótido 661 NAT1 TCA TTT TGT TCC TTG CAG ACC CCA GAT GGG Nucleótido 661 NAT2 GAA Nucleótido 691 NAT1 GTT CAC TGT TTG GTG GGC TTC ACC CTC ACC Nucleótido 691 NAT2 TAC ATC Nucleótido 721 NAT1 CAT AGG AGA TTC AAT TAT AAG GAC AAT ACA Nucleótido 721 NAT2 TAT AGA AAA AAA Nucleótido 751 NAT1 GAT CTA ATA GAG TTC AAG ACT CTG AGT GAG Nucleótido 751 NAT2 CTG GTC TTT AAA CTC ACT Nucleótido 781 NAT1 GAA GAA ATA GAA AAA GTG CTG AAA AAT ATA Nucleótido 781 NAT2 GAG GTT GAA Nucleótido 811 NAT1 TTT AAT ATT TCC TTG CAG AGA AAG CTT GTG Nucleótido 811 NAT2 AAG GGG AAT CTC Nucleótido 841 NAT1 CCC AAA CAT GGT GAT AGA TTT TTT ACT ATT Nucleótido 841 NAT2 CCT GGA TCC CTT

Tabla 2. Secuencia comparativa de nucleótidos en la región codificadora de los genes NAT1

y NAT2. Las secuencias corresponden a los genes no mutados. En rojo aparecen marcados

los nucleótidos en que difiere NAT2 respecto a NAT1.

35

1.4 POLIMORFISMOS EN LOS GENES NAT.

En el primer simposio internacional sobre las arilamina N-acetiltransferasas en 1998, se creó

el comité internacional sobre nomenclatura NAT (Hein et al., 2000b; Ilett et al., 1999), para

actualizar, revisar y publicar una página web que mantenga al día, la nomenclatura NAT.

Esta página se publica desde 1995 (http://louisville.edu/medschool/pharmacology/consensus-

human-arylamine-n-acetyltransferase-gene-nomenclature/)(Hein et al., 2000b; Vatsis et al.,

1995). En el simposio de septiembre de 2010 se amplió el comité internacional y se decidió

reformular las páginas web de NATs. Actualmente estas páginas se encuentran en proceso

de revisión y actualización aunque las antiguas siguen siendo accesibles.

1.4.1 NAT1

Desde el punto de vista funcional, la enzima NAT1 fue inicialmente descrita como

monomórfica, debido a la distribución de frecuencias de su actividad in vivo sobre el ácido p-

aminosalicílico y otros sustratos que se distribuían como una única campana de Gauss en

poblaciones humanas (Weber and Hein, 1985). Sin embargo, estudios posteriores mostraron

que la actividad NAT1 no tiene una distribución completamente monomórfica (Grant et al.,

1991; Ozawa et al., 1990). Actualmente se sabe que el gen NAT1 es altamente polimórfico y

presenta mutaciones tanto en la región codificadora como en las UTR. Se han descrito

numerosas sustituciones de nucleótidos (Figura 13) que aparecen en alelos de NAT1 con

frecuencias entre 0.0003 y 0.005. En la base de datos de NAT (actualizada en 24 mayo de

2011), existen 28 haplotipos diferentes de NAT1, que consisten en diversas combinaciones

de mutaciones: http://www.louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.html.

36

Figura 13. Localización de polimorfismos en el gen NAT1 humano. Los polimorfismos no

sinónimos aparecen en rojo. Tomado de (Ruiz JD, 2009a).

De estos, el haplotipo NAT1*4 que es el que corresponde a la ausencia de mutaciones, es el

más frecuente en todas las poblaciones (Hein et al., 2000a) y al que se le atribuye la

activada enzimática rápida, y como se puede observar en la Tabla 3, a muchos de los

demás haplotipos no se les ha determinado la actividad enzimática y aparece como fenotipo

desconocido.

Tabla 3. Alelos NAT1 en humanos (Haplotipos). Actualizado 24 mayo de 2011. Alelo NAT1 Haplotipo

Nucleótidos cambiados e

identificador (rs)

Alteración de aminoácido(s) Fenotipo1 Referencias

NAT1*4 Referencia Referencia Referencia

(Vatsis and Weber, 1993) (Badawi et al., 1995) (Bell et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)

NAT1*3 1095 A>C (rs15561) Fuera de la región codificadora Desconocida

(Blum et al., 1990). (de Leon et al., 2000) (Zhu et al., 2011)

NAT1*5

350,351G>C (rs72554606) 497-499G>C (rs72554608) 884A>G (rs55793712)

∆ 976 (rs72554612)

∆

1105 (rs72554613)

R117T R166T-E167Q Fuera de la región codificadora

Desconocida (Ohsako and Deguchi, 1990)

37

NAT1*10

1088T>A (rs1057126) 1095A>C (rs15561)

Fuera de la región codificadora. Fuera de la región codificadora

Desconocida

(Vatsis and Weber, 1993) (Hughes et al., 1998) (Payton and Sim, 1998) (de Leon et al., 2000) (Butcher et al., 1998) (Yang et al., 2000) (Badawi et al., 1995) (Bell et al., 1995) (Hein et al., 2000c) (Vaziri et al., 2001)

NAT1*11A

-344C>T (rs4986988) -40A>T (rs4986989) 445G>A (rs4987076) 459G>A (rs4986990) 640T>G (rs4986783) ∆9 between 1065-1090 1095A>C (rs15561)

Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora V149I T153T (sinónimo) S214A Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora

Desconocida

(Doll et al., 1997) (de Leon et al., 2000) (Zhu and Hein, 2008) (Vaziri et al., 2001)

NAT1*11B

-344C>T (rs4986988) -40A>T (rs4986989) 445G>A (rs4987076) 459G>A (rs4986990) 640T>G (rs4986783) ∆9 between 1065-1090

Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora V149I T153T (sinónimo) S214A Fuera de la región codificadora

Desconocida (Johnson et al., 2004) (Zhu and Hein, 2008) (Vaziri et al., 2001)

NAT1*11C

-344C>T (rs4986988) -40A>T (rs4986989) 459G>A (rs4986990) 640T>G (rs4986783) ∆ 9 between 1065-1090 1095A>C (rs15561)

Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora T153T (sinónimo) S214A Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora

Desconocida (Cascorbi I et al., 2000)

NAT1*14A

560G>A (rs4986782) 1088T>A (rs1057126) 1095A>C (rs15561)

R187Q Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora

Menor que NAT1*4 “lento”

(Hughes et al., 1998) (Payton and Sim, 1998) (Vaziri et al., 2001)

NAT1*14B 560G>A (rs4986782) R187Q Menor que NAT1*4 “lento”

(Payton and Sim, 1998) (Hubbard et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)

NAT1*15 559C>T (rs5030839) R187Stop Menor que NAT1*4 “lento”

(Hughes et al., 1998) (Hubbard et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)

38

NAT1*16 [AAA] inmediatamente después de 1091 1095A>C (rs15561)

Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora

Desconocida (de Leon et al., 2000)

NAT1*17 190C>T (rs56379106) R64W Menor que NAT1*4 “lento”

(Butcher et al., 1998) (Lin et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)

NAT1*18A

∆3 between 1065-1087 (rs4646271) 1088T>A (rs1057126) 1095A>C (rs15561)

Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora Fuera de la región codificadora

Desconocida (Deitz AC et al., 1997a) (Yang et al., 2000) (Sekine et al., 2001)

NAT1*18B ∆3 between 1065-1090 (rs4646271)

Fuera de la región codificadora

Desconocida (Deitz AC et al., 1997b) (Yang et al., 2000) (Sekine et al., 2001)

NAT1*19A 97C>T (rs56318881) R33Stop

Proteína truncada/ sin actividad enzimática

(Lin et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)

NAT1*19B 97C>T (rs56318881) 190C>T (rs56379106)

R33Stop R64W

Proteína truncada/ sin actividad enzimática

Agundez J et al.; datos sin publicar

NAT1*20 402T>C P134P (sinónimo) Equivalente a NAT1*4


NAT1*21 613A>G (rs72554609) M205V Equivalente a NAT1*4


NAT1*22 752A>T (rs56172717) D251V Menor que NAT1*4 “lento”

(Lin et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008) (Vaziri et al., 2001)

NAT1*23 777T>C(rs4986991) S259S (sinónimo) Equivalente a NAT1*4

(Lin et al., 1998) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997). (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002)

39

(Zhu and Hein, 2008)

NAT1*24 781G>A (rs72554610) E261K Equivalente a NAT1*4


NAT1*25 787A>G (rs72554611) I263V Equivalente a NAT1*4


NAT1*26A [TAA] inserción entre 1065 - 1090 1095C>A (rs15561)


Desconocida (Deitz AC et al., 1998b)

NAT1*26B

[TAA] inserción entre 1065 -1090

Fuera de la región codificadora

Desconocida (Deitz AC et al., 1998a)

NAT1*27 21T>G (rs4986992) 777T>C (rs4986991)

L7L (sinónimo) S259S (sinónimo)

Equivalente a NAT1*4

(Smelt et al., 2000) (Badawi et al., 1995) (Grant et al., 1997) (Hein et al., 2000c) (Fretland et al., 2001a) (Butcher et al., 2002) (Hein, 2002) (Zhu and Hein, 2008)

NAT1*28 [TAATAA] delección entre 1065 - 1090

Fuera de la región codificadora Desconocida (Lo-Guidice J-M et al., 1999)

(Lo-Guidice et al., 2000) NAT1*29 1088T>A (rs1057126)

1095A>C (rs15561)

∆

1025


Desconocida (Lo-Guidice J-M et al., 1999) (Lo-Guidice et al., 2000)

NAT1*30 445G>>>>A (rs4987076) V149I Desconocida Agundez J et al. datos sin publicar

1El fenotipo asignado refleja la más reciente investigación, pero no necesariamente

es consistente en todos los estudios.

Adaptado de: (Hein David W et al., 2000) Consensus Human Arylamine N-Acetyltransferase Gene Nomenclature.

Determinadas variantes alélicas de NAT1 producen proteínas inestables con vidas medias

menores de cuatro horas (Butcher et al., 2004). Varios alelos de NAT1 han sido asociados

con una actividad reducida por estudios de expresión en bacterias (Butcher et al., 2000;

Hughes et al., 1998; Lin et al., 1998). La expresión de las variantes NAT1*21, NAT1*24, y

NAT1*25 produce aloenzimas N-acetyltransferasas con actividades de 2 a 3 veces más

40

altas que NAT1*4 (Lin et al., 1998). Algunos estudios también sugieren que NAT1*10 puede

ser un alelo acetilador más rápido que NAT1*4, debido a que NAT1*10 se ha asociado con

altas actividades N-acetiltransferasa en mucosa de vejiga y colon (Bell et al., 1995).

NAT1*10 no produce sustituciones de nucleótidos en la región codificadora, pero se ha

sugerido que la sustitución (T1088A), en la región 3’ altera la señal de poliadenilación

(TAATAA →TAAAAA), lo que puede aumentar la estabilidad del mRNA (Bell et al., 1995).

Sin embargo, estudios posteriores no han confirmado que NAT1*10 confiera una alta

actividad (Butcher et al., 1998; Hughes et al., 1998). A pesar del gran número de

polimorfismos identificados (Figura 13), la interrelación entre el genotipo y fenotipo NAT1

permanece sin aclarar, probablemente debido a la compleja regulación y transcripción de

este gen, esquematizadas en las Figuras 11 y 12, y al efecto de otros factores no genéticos

en la actividad NAT1 in vivo (Hein et al., 2000a).

El haplotipo más frecuente de NAT1 en poblaciones humanas caucásicas es el NAT1*4 (ver

tabla 4), que aparece con una frecuencia del 70 al 76%; mientras que en poblaciones negras

éste haplotipo está presente en el 45 al 54% de los genes. El segundo haplotipo más

frecuente en poblaciones humanas caucásicas es el NAT1*10 que aparece con una

frecuencia del 17,4 a 21%, mientras que en poblaciones negras este mismo haplotipo

representa del 42 al 50,5% de la población, como se resume en la Tabla 4.

41


Alelo

Cau

cási

cos

Eu

rop

eosa

Cau

cási

cos

Am

eric

ano

sb

Neg

ros

Afr

ican

osc

Neg

ros

Am

eric

ano

sd

Ch

ino

se

Jap

on

eses

f

Hin

dú

esg

Mal

ayo

sg

Tah

ilan

des

esh

Tai

wan

eses

i

Núm 224-628 382-1056 24-202 390-598 280-362 220-316 280 244 466 342 NAT1*4 70,9-74,4 74-76 48,5-54 45-46 35-49,6 46,7-56 51 29 50,4 54

NAT1*3 2,8-3,6 3-4 1,0-4,0 4,0-7,0 8,2-33 0,0-2,5 30 30 3,4 3,2

NAT1*10 17,8-20,1 17,4-21,0 42,0-50,5 48-50 30-40 40,6-53,3 17 39 43,8 42

NAT1*11A 0,0-3,4 1,2-3,0 0,0

- 2,0-2,2 0,0 2,0 2,0 2,4

NAT1*11B 0,0 0,06

NAT1*11C -

NAT1*14 0,9-3,7 0,0-2,0 - - - 0,0 - - 0,0 -

NAT1*15 0,0-0,5 0,0-0,3 - - - 0,0 - - - - NAT1*17 - 0,0-1,1 - - - 0,0 - - - -

NAT1*18A - - - - - 0,0-2,6 - - - -

NAT1*18B - - - - - 0,0-3,1 - - - -

NAT1*22 - - - - - - - - - - a (Bruhn et al., 1999; Lo-Guidice et al., 2000; Loktionov et al., 2002) b (Butler et al., 2008; Millikan et al., 1998; Taylor et al., 1998; Zheng et al., 1999) c (Loktionov et al., 2002; Taylor et al., 1998) d (Butler et al., 2008; Millikan et al., 1998) e (Zhangwei et al., 2006; Zhao et al., 1998) f (Katoh et al., 1998; Sekine et al., 2001; Yang et al., 2000) g (Zhao et al., 1998) h (Kukongviriyapan et al., 2003b). i (Hsieh et al., 1999)

1.4.2 NAT2

En cuanto al gen NAT2 humano, existe un gran número de polimorfismos, la mayoría de los

cuales producen cambios de aminoácidos, afectando la actividad de la enzima. En la base

de datos NAT (actualizada el 22 de julio de 2011), existen 66 diferentes haplotipos de NAT2

(ver figura 14 y tabla 5), identificados en poblaciones humanas y descritos en la base de

datos http://www.louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.html,

42

Figura 14. Localización de polimorfismos en el gen NAT2 humano. Los polimorfismos no

sinónimos aparecen en rojo. Tomado de (Ruiz JD, 2009b)

Tabla 5. Alelos NAT2 en humanos (Haplotipos). Actualizado 22 de julio de 2011.

Alelo NAT2 Haplotipo

Nucleótidos cambiados e

identificador (rs)

Alteración de aminoácido(s)

Fenotipo1 Referencias

NAT2*4 Referencia Referencia Rápido

(Deguchi, 1992). (Blum et al., 1991). (Ebisawa and Deguchi, 1991). (Vatsis et al., 1991). (Blum et al., 1990). (Ohsako and Deguchi, 1990). (Grant et al., 1989). (Hickman and Sim, 1991). (Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Hickman et al., 1995). (Fretland et al., 2001b). (Svensson and Hein, 2005). (Hein, 2006). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007b). (Zang et al., 2007a).

NAT2*5A 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929)

I114T L161L (sinónimo) Lento

(Blum et al., 1991). (Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Hickman et al., 1992). (Lin et al., 1993).

NAT2*5B 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208)

I114T L161L (sinónimo) K268R

Lento

(Vatsis et al., 1991). (Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Hickman et al., 1995) (Fretland et al., 2001b). (Svensson and Hein, 2005). (Hein, 2006). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007b). (Zang et al., 2007a). (Lin et al., 1993). (Abe et al., 1993)

43

NAT2*5C 341T>C (rs1801280) 803A>G (rs1208)

I114T K268R Lento

(Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Hickman et al., 1992). (Lin et al., 1993). (Ferguson et al., 1994). (Cascorbi et al., 1995).

NAT2*5D 341T>C (rs1801280) I114T Lento

(Fretland et al., 2001b). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007a). (Martinez et al., 1995). (Agundez et al., 1996a). (Agundez et al., 1996b). (Leff et al., 1999).

NAT2*5E 341T>C (rs1801280) 590G>A (rs1799930)

I114T R197Q Lento (Martinez et al., 1995)

NAT2*5F

341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 759C>T 803A>G (rs1208)

I114T L161L (sinónimo) V253V (sinónimo) K268R

Lento (Woolhouse et al., 1997).

NAT2*5G

282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208)

Y94Y (sinónimo) I114T L161L (sinónimo) K268R

Lento (Anitha and Banerjee, 2003)

NAT2*5H

341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 859Del

I114T L161L (sinónimo) K268R S287 Frameshift

Lento (Anitha and Banerjee, 2003)

NAT2*5I

341T>C (rs1801280) 411A>T (rs4986997) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208)

I114T L137F L161L (sinónimo) K268R

Lento (Zang et al., 2007b).

NAT2*5J 282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 590G>A (rs1799930)

Y94Y (sinónimo) I114T R197Q

Lento (Tanira MOM et al., 2003)

NAT2*5K 282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280)

Y94Y (sinónimo) I114T

Desconocida (Patin et al., 2006a)

NAT2*5L

70T>A 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208)

L24I I114T L161L (sinónimo) K268R

Desconocida (Patin et al., 2006a). (Patin et al., 2006b).

NAT2*5M

341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 838G>A

I114T L161L (sinónimo) K268R V289M

Desconocida (Sabbagh et al., 2008)

NAT2*5N

341T>C (rs1801280) 472A>C 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208)

I114T I158L L161L (sinónimo) K268R

Desconocida (Teixeira et al., 2010)

NAT2*50

203G>A (rs72466458) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208)

C68Y I114T L161L (sinónimo) K268R

Desconocida (Teixeira et al., 2010)

NAT2*5P

282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 578C>T 590G>A (rs1799930) 803A>G (rs1208)

Y94Y (sinónimo) I114T L161L (sinónimo) T193M R197Q K268R

Desconocida (Chauhan, 2010)

44

NAT2*6A 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930)

Y94Y (sinónimo) R197Q Lento

(Deguchi, 1992). (Blum et al., 1991). (Ebisawa and Deguchi, 1991). (Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Hickman et al., 1995). (Fretland et al., 2001b). (Svensson and Hein, 2005). (Hein, 2006). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007b). (Zang et al., 2007a). (Lin et al., 1993). (Cascorbi et al., 1995).

NAT2*6B 590G>A (rs1799930) R197Q Lento

(Fretland et al., 2001b). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007a). (Lin et al., 1993). (Agundez et al., 1996a). (Agundez et al., 1996b).

NAT2*6C 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 803A>G (rs1208)

Y94Y (sinónimo) R197Q K268R

Lento

(Agundez et al., 1996a). (Agundez et al., 1996b). (Patin et al., 2006a). (Hein and Doll, 2007).

NAT2*6D 111T>C 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930)

F37F (sinónimo) Y94Y (sinónimo) R197Q

Lento (Leff et al., 1999)

NAT2*6E 481C>T (rs1799929) 590G>A (rs1799930)

L161L (sinónimo) R197Q Lento (Dandara et al., 2003)

NAT2*6F 590G>A (rs1799930) 803A>G (rs1208)

R197Q K268R Desconocido (Patin et al., 2006b)

NAT2*6G 282C>T (rs1041983) 518A>G 590G>A (rs1799930)

Y94Y (sinónimo) K173R R197Q

Desconocido (Patin et al., 2006b)

NAT2*6H 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 766A>G

Y94Y (sinónimo) R197Q K256E

Desconocido (Patin et al., 2006b) . (Teixeira et al., 2010).

NAT2*6I

282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 838G>A 857G>A (rs1799931)

Y94Y (sinónimo) R197Q V280M G286E

(Patin et al., 2006b).

NAT2*6J 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 857G>A (rs1799931)

Y94Y (sinónimo) R197Q G286E

(Sabbagh et al., 2008).

NAT2*6K 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 638C>T

Y94Y (sinónimo) R197Q P213L

(Sabbagh et al., 2008).

NAT2*6L 282C>T (rs1041983) 345C>T 590G>A (rs1799930)

Y94Y (sinónimo) D115D (sinónimo) R197Q

(Sabbagh et al., 2008)

NAT2*6M 152G>T (rs72466457) 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930)

Gly51Val Y94Y (sinónimo) R197Q

(Teixeira et al., 2010)

NAT2*6N 282C>T (rs1041983) 481C>T (rs1799929) 590G>A (rs1799930)

Y94Y (sinónimo) L115L (sinónimo) R197Q

(Matimba et al., 2009)

45

NAT2*6O 282C>T (rs1041983) 481C>T (rs1799929) 838G>A

Y94Y (sinónimo) L115L (sinónimo) V280M

Teixeira et al. 2010 datos no publicado

NAT2*7A 857G>A (rs1799931) G286E Lento

Dependiente de sustrato?

(Blum et al., 1991). (Hickman et al., 1995). (Fretland et al., 2001b). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007a). (Lin et al., 1993). (Hein and Doll, 2007).

NAT2*7B 282C>T (rs1041983) 857G>A (rs1799931)

Y94Y (sinónimo) G286E

Lento Dependiente de sustrato?

(Deguchi, 1992). (Hein et al., 1994) (Hein et al., 1995). (Hickman et al., 1995). (Fretland et al., 2001b) (Svensson and Hein, 2005). (Hein, 2006). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007b). (Zang et al., 2007a). (Hickman et al., 1992). (Hein and Doll, 2007)

NAT2*7C 282C>T (rs1041983) 803A>G (rs1208) 857G>A (rs1799931)

Y94Y (sinónimo) K268R G286E

(Chauhan, 2010)

NAT2*7D 191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983) 857G>A (rs1799931)

R64Q Y94Y (sinónimo) G286E


NAT2*7E 282C>T (rs1041983) 481C>T (rs1799929) 857G>A (rs1799931)

Y94Y (sinónimo) L161L(sinónimo) G286E

Teixeira el al 2010. Datos no publicados

NAT2*10 499G>A E167K Lento

Dependiente de sustrato?

(Hickman et al., 1995). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007b). (Zang et al., 2007a).

NAT2*11A 481C>T (rs1799929) L161L (sinónimo) Rápido

(Fretland et al., 2001b). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007a). (Sekine et al., 2001)

NAT2*11B 481C>T (rs1799929) 859Del

L161L (sinónimo) S287 Frameshift Desconocido (Anitha and Banerjee, 2003).

NAT2*12A 803A>G (rs1208) K268R Rápido

(Fretland et al., 2001b). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007a). (Lin et al., 1993). (Cascorbi et al., 1996). (Bolt et al., 2005).

NAT2*12B 282C>T (rs1041983) 803A>G (rs1208)

Y94Y (sinónimo) K268R Rápido

(Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Lin et al., 1993). (Agundez et al., 1996b).

NAT2*12C 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208)

L161L (sinónimo) K268R Rápido

(Hein et al., 1994) (Hein et al., 1995). (Ferguson et al., 1994). (Agundez et al., 1996a). (Agundez et al., 1996b). (Bolt et al., 2005).

NAT2*12D 364G>A (rs4986996) 803A>G (rs1208)

D122N K268R

Lento (Zang et al., 2007b).

NAT2*12E 282C>T (rs1041983) 578C>T 803A>G (rs1208)

Y94Y (sinónimo) T193M K268R

(Patin et al., 2006a). (Patin et al., 2006b) (Teixeira et al.).

46

NAT2*12F 622T>C 803A>G (rs1208)

Y208H K268R (Patin et al., 2006a).


NAT2*12G 609G>T 803A>G (rs1208)

E203D K268R (Patin et al., 2006b).

NAT2*12H 403C>G 803A>G (rs1208)

L135V K268R (Sabbagh et al., 2008).

NAT2*12I 228C>T(rs72466459) 803A>G (rs1208)

T76T(sinónimo) K268R (Teixeira et al., 2010)

NAT2*12J 29C>T(rs72466456) 803A>G (rs1208)

I10T K268R (Teixeira et al., 2010)

NAT2*13A 282C>T (rs1041983) Y94Y (sinónimo) Rápido

(Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Fretland et al., 2001b). (Svensson and Hein, 2005). (Hein, 2006). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007a). (Lin et al., 1993). (Cascorbi et al., 1995). (Martinez et al., 1995). (Bolt et al., 2005). (Agundez et al., 1994).

NAT2*13B 282C>T (rs1041983) 578C>T

Y94Y (sinónimo) T193M


NAT2*14A 191G>A (rs1801279) R64Q Lento

(Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Fretland et al., 2001b). (Svensson and Hein, 2005). (Hein, 2006). (Hein et al., 2006). (Zang et al., 2007a). (Ferguson et al., 1994). (Bell et al., 1993).

NAT2*14B 191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983)

R64Q Y94Y (sinónimo) Lento (Bell et al., 1993).

(Delomenie et al., 1996))

NAT2*14C

191G>A (rs1801279) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208)

R64Q I114T L161L (sinónimo) K268R

Lento

(Martinez et al., 1995). (Agundez et al., 1996a). (Agundez et al., 1996b). (Hein and Doll, 2007).

NAT2*14D 191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930)

R64Q Y94Y (sinónimo) R197Q

Lento (Martinez et al., 1995). (Agundez et al., 1996b). (Hein and Doll, 2007)

NAT2*14E 191G>A (rs1801279) 803A>G (rs1208)

R64Q K268R Lento

(Martinez et al., 1995). (Patin et al., 2006b). (Hein and Doll, 2007)

NAT2*14F 191G>A (rs1801279) 341T>C (rs1801280) 803A>G (rs1208)

R64Q I114T K268R

Lento (Agundez et al., 1996b)

NAT2*14G 191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983) 803A>G (rs1208)

R64Q Y94Y (sinónimo) K268R

Lento (Leff et al., 1999)

NAT2*14H 191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983) 683C>T

R64Q Y94Y (sinónimo) P228L


NAT2*14I 191G>A (rs1801279) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208)

R64Q L161L (sinónimo) K268R

(Agundez et al., 2008).

47

NAT2*17 434A>C Q145P Lento

(Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Fretland et al., 2001b). (Hein et al., 2006). (Lin et al., 1994)

NAT2*18 845A>C K282T Rápido

(Hein et al., 1994). (Hein et al., 1995). (Fretland et al., 2001b). (Hein et al., 2006). (Lin et al., 1994).

NAT2*19 190C>T (rs1805158) R64W Lento (Shishikura et al., 2000). (Lee et al., 2002). (Zhu et al., 2002).

NAT2*20 600A>G (rs72466461) E200E(sinónimo) (Teixeira et al., 2010)

NAT2*21 458C>T(rs72466460) T153I (Teixeira et al., 2010)

1 El fenotipo asignado es el resultado de los estudios más recientes, pero no es necesariamente consistente en todos los estudios.

Adaptado desde:(Hein David W et al., 2000) Consensus Human Arylamine N-Acetyltransferase Gene Nomenclature

De entre las variantes alélicas de NAT2, se consideran variantes funcionales (que conducen

a un fenotipo rápido en homo y heterocigosidad) las variantes NAT2*4 (no mutada), que

aparece en nuestra población con una frecuencia de aproximadamente 0,22; así como las

variantes que solamente contienen mutaciones que no causan sustituciones de

aminoácidos. Entre ellas las más frecuentes son NAT2*11, *12 y *13 (con una frecuencia

conjunta en nuestra población de aproximadamente 0,03)(Selinkski S et al., 2011). El

haplotipo del gen NAT2 denominado NAT2*4 es considerado el alelo tipo silvestre (wild type

allele) (Blum et al., 1990; Deguchi, 1992; Hein et al., 2000a), sin embargo, NAT2*4 no es el

alelo más común en la mayoría de los grupos étnicos, incluido los Caucásicos y Africanos

(Cascorbi et al., 1996; Gross et al., 1999; Hein et al., 2000a) y algunas poblaciones asíaticas

(Kukongviriyapan et al., 2003a; Yuliwulandari et al., 2008). En caucásicos el haplotipo más

frecuente es el NAT2*5B (34,3-43,1%), seguido por los haplotipos NAT2*6A (24,4-28,6%) y

NAT2*4 (22 al 29%). Algunas de las frecuencias de haplotipos NAT2 en poblaciones

humanas aparecen en la Tabla 6.

48


Alelos

Cau

cási

cos

Eu

rop

eos

a

Cau

cási

cos

Am

eric

ano

sb

Afr

ican

os

sub

sah

aria

no

sc

Afr

o

amer

ican

osd

Ch

ino

se

Jap

on

eses

f

Ind

on

eses

g

Tai

lan

des

esh

Tai

wan

eses

i

Kyr

gis

tan

eses

j

Num 280-2068 382-444 1140 24-256 120 290 424 470 366 580

NAT2*4 22-29 23,2-25 5,3 36-42 58,3 68,6 37,3 38,1 52,6 40,1 NAT2*5A 1,2-4,2 6,8

29-30

3,8 6,0

0,1 NAT2*5B 34,3-43,1 37,2-42 23,3 1,7 2,4 9,0 17,4

NAT2*5C 0,7-4,1 0,9 NAT2*5D 0,3 NAT2*5E 0,05 NAT2*6A 24,4-28,6 25-31 18,6

17-22 15 19,3 36,8 27,9

27 25,7

NAT2*6B 0,1-1,8 1,8 0 4,2 4,7 0,6 NAT2*7A 0,0 0,9

2,0-4,0 0,8 6,0

13,9 0,16

NAT2*7B 1,2-1,4 2-2,5 0,4 12,5 9,7 15,3 14,5 11,6 NAT2*11A 0,7 1,7 NAT2*11B NAT2*12A 0,1-1,8 2,3 22,6 0,9 0,51 NAT2*12B 0,1 0,2 5,1 NAT2*12C 0,7 NAT2*13 0,0-1,5 0,4 11,4 7,5 0,7

NAT2*14A 0,4

0

1,4

0-8,0

0,5

NAT2*14B 0,0-0,12 5,1 8,0 NAT2*14C 0,5 NAT2*14D 0,1 NAT2*14E 0,0 1,1 NAT2*14F 0,05

Otros 9,7 0-9,0 a (Agundez et al., 1996b; Bell et al., 1993; Cascorbi et al., 1996; Rabstein et al., 2006). . b (Gross et al., 1999; Taylor et al., 1998) c (Patin et al., 2006b) h (Kukongviriyapan et al., 2003a) d (Bell et al., 1993; Taylor et al., 1998) i (Hsieh et al., 1999) e (Straka et al., 2006) j (Rabstein et al., 2006) f (Okumura et al., 1997) g (Yuliwulandari et al., 2008).

1.5 POLIMORFISMO ACETILADOR Y RIESGO DE CÁNCER

Además de los efectos de los SNPs descritos anteriormente en los genes NATs sobre el

metabolismo de fármacos y xenobióticos, en décadas recientes las enzimas NATs han sido

consideradas como factores potencialmente relevantes en el riesgo y desarrollo de cáncer,

49

especialmente en aquellos relacionados con factores ambientales (Agúndez, 2008). Tras la

activación de muchos carcinógenos a través de encimas de fase I (principalmente

citocromos P450) (Autrup, 2000; Daly et al., 1994), existe una segunda fase metabólica que

generalmente lleva a la detoxificación a través de procesos de conjugación de los

compuestos reactivos con moléculas endógenas y que se realiza por las enzimas de fase II

(entre ellas NATs y GSTs), esta fase del metabolismo en general convierte los carcinógenos

activados en compuestos inactivos antes de la eliminación (Autrup, 2000). Un esquema

general de este mecanismo ya fue propuesto con relación al cáncer hepático en 1996, como

se muestra en la Figura 15.

Figura 15. Mecanismo propuesto para la asociación entre el cáncer hepático y

polimorfismos de enzimas metabolizadoras de fármacos. Tomado de (Agúndez, 2008),

modificado de (Agundez et al., 1996a).

50

Numerosos estudios han investigado las interrelaciones entre el fenotipo acetilador (NAT2) y

el riesgo de desarrollar cáncer, aunque más recientemente se están llevando a cabo

estudios en los que se combinan análisis de los genes NAT1 y NAT2, combinaciones de los

polimorfismos de estos genes con otros que codifican enzimas de fase II (como las GSTs) y

combinaciones de genes codificadores de enzimas de fase II con las de fase I. La Figura 16

muestra un esquema de los posibles efectos de la actividad enzimática.

Figura 16. Posibles mecanismos que relacionan las actividades NAT con la carcinogénesis.

Tomado de (Rodrigues-Lima et al., 2008).

Los estudios que integran varios genes son más prometedores que aquellos en los que sólo

se investigaban polimorfismos en el gen NAT2, porque permiten tener una visión mucho

más completa del estado de las vías de activación y desactivación de carcinógenos. Por

51

este motivo solamente mencionaremos de forma sucinta algunos de estos estudios para

ilustrar los mecanismos que se han propuesto para explicar las posibles asociaciones.

1.5.1 CÁNCER DE CABEZA Y CUELLO.

Los compuestos químicos presentes en el tabaco son inactivados por enzimas de fase II, y

se ha propuesto que el riesgo de cáncer de cabeza y cuello puede ser modificado por los

genotipos NAT. Los cánceres de cabeza y cuello están fuertemente asociados con el hábito

de fumar, y unos pocos estudios han explorado el papel de los polimorfismos NAT1 en el

riesgo del desarrollo de cáncer de cabeza y cuello en fumadores; sin embargo los hallazgos

son inconsistentes y, cuando se presentan asociaciones, éstas son débiles y pueden indicar

cualquier opción entre una disminución del riesgo en portadores de la variante NAT1*10

(McKay et al., 2008), un incremento del riesgo (Katoh et al., 1998) o de débil a ninguna

asociación (Fronhoffs et al., 2001; Henning et al., 1999). De manera similar al genotipo

NAT1, en los estudios que exploran la participación de NAT2 en los cánceres de cabeza y

cuello, existen estudios que indican que los acetiladores rápidos tienen mayor riesgo

(Chatzimichalis et al., 2010); o los que concluyen que la acetilación lenta aumenta el riesgo

(Gonzalez et al., 1998) mientras que otros indican que no existe una asociación entre los

genotipos acetiladores NAT1 y NAT2 y el cancer de cabeza y cuello (McKay et al., 2008).

Sin embargo un reciente estudio ha establecido que determinados diplotipos NAT1/NAT2

pueden modificar el riesgo al cáncer de cabeza y cuello (Demokan et al., 2010).

1.5.2 CÁNCER DE MAMA

El alelo NAT1*10 ha sido asociado con el incremento del riesgo de cáncer de mama entre

mujeres fumadoras o que consumen carne muy hecha, que por lo tanto están expuestas a

52

aminas heterocíclicas (Krajinovic et al., 2001; Zheng et al., 1999), aunque estos resultados

requieren replicación. En cuanto a NAT2, después de decenas de estudios que implican

varios miles de pacientes con cáncer de mama (Agundez et al., 1995a; Gertig et al., 1999;

Kocabas et al., 2004; Millikan et al., 1998), así como varios metanálisis (Ochs-Balcom et al.,

2007; Terry and Goodman, 2006); no se ha encontrado una asociación relevante de los

polimorfismos NAT2 y el riesgo de cáncer de mama en la población general (Agúndez,

2008). No obstante, en estudios recientes se sugiere que cuando existe exposición a aminas

heterociclícas como las del tabaco o la carne muy asada, los genotipos NAT pueden

modificar el riesgo al desarrollo de cáncer de mama (Ambrosone et al., 2008; Conlon et al.,

2010; Deitz et al., 2000; Zhang et al., 2010).

1.5.3 CÁNCER DE PULMÓN

Se han realizado numerosos estudios basados sobre la hipótesis inicial que la acetilación

lenta puede incrementar el riesgo a desarrollar cáncer de pulmón (Agúndez, 2008), esta

hipótesis ha sido reforzada por otros estudios que indican que la acetilación lenta,

especialmente si está asociada a defectos genéticos de otras enzimas de fase II, puede

conferir un incremento en la susceptibilidad de formación de aductos (Hou et al., 2001; Hou

et al., 2000; Lee et al., 2010; Zupa et al., 2009) y concuerda con los hallazgos de varias

investigaciones en las que los genotipos NAT2 acetiladores lentos o genotipos lentos NAT1

y NAT2 causan incrementos, de marginales a significativos, en el desarrollo de cáncer de

pulmón (Gemignani et al., 2007; Habalova et al., 2005; Hou et al., 2000; Martinez et al.,

1995); sin embargo algunos estudios sugieren un papel diferencial de la acetilación en

según la enzima que se analiza. Así, un estudio no encontró asociación entre genotipos

NAT2 y el riesgo a cáncer de pulmón, mientras que si observó una asociación significativa

de los haplotipos NAT1 lentos con el riesgo de cáncer de pulmón (Bouchardy et al., 1998);

53

De forma similar, otro estudio indicó que los polimorfismos de NAT2 no se asocian al riesgo

de cáncer de pulmón; pero cuando se analizan los haplotipos NAT1 y NAT2 juntos se

encontró que la combinación de NAT1 rápidos con NAT2 lentos aumentaba el riesgo de

cáncer de pulmón (Wikman et al., 2001), En un metanálisis se encontró una asociación

relevante entre el genotipo NAT1 acetilador rápido y el cáncer (Zienolddiny et al., 2008), en

pacientes no fumadores que sufrieron cáncer pulmonar de células no pequeñas. No

obstante estos datos deben ser interpretados con cautela, pues contradicen la base teórica

del riesgo de la acetilación y el cáncer de pulmón. A pesar de estos resultados, la evidencia

actual sugiere que los polimorfismos NAT2 por sí solos no constituyen un factor de riesgo

relevante en el cáncer de pulmón (Agúndez, 2008). En este contexto NAT1 está emergiendo

como el gen NAT más probablemente relacionado con cáncer de pulmón (McKay et al.,

2008).

1.5.4 CÁNCER COLORRECTAL

En estudios iniciales se propuso que el genotipo acetilador rápido predisponía al cáncer

colorrectal (Borlak and Reamon-Buettner, 2006; Gil and Lechner, 1998; Hein, 2002; Huang

et al., 2007; Huang et al., 2009; Ilett et al., 1987; Minchin et al., 1993; Nothlings et al., 2009;

Osian et al., 2006; Tamer et al., 2006; Yoshida et al., 2007). La hipótesis de trabajo en estos

estudios sugería que la combinación de genotipos NAT1 y/o NAT2 acetiladores rápidos

deberían activar más los carcinógenos (aminas heterocíclicas) dentro del colon,

predisponiendo de ese modo a cáncer colorrectal (Agúndez, 2008). Algunos metaanálisis

posteriores a estos estudios mostraron de forma consistente una débil o ausente asociación

de los genotipos NAT acetiladores rápidos y el riesgo de cáncer colorrectal (Butler et al.,

2008; Chen K et al., 2005; Houlston and Tomlinson, 2001; Ye and Parry, 2002). En cambio

otros estudios han sugerido que el genotipo acetilador lento está asociado a cáncer de colon

54

(Frazier et al., 2001; Zupa et al., 2009). Globalmente estos resultados permiten descartar

una asociación relevante de los genotipos NAT2 por sí solos, con el riesgo de cáncer

colorrectal; sin embargo la interacción entre el consumo de carne (exposición a aminas

heterocíclicas) y los genotipos NAT2, merecen particular atención y deben ser objeto de

estudios adicionales (Agúndez, 2008; da Silva et al.).

1.5.5 CÁNCER DE VEJIGA

A pesar de que este es el tipo de cáncer más frecuentemente estudiado en relación al

estatus acetilador, y a pesar de los prometedores hallazgos iniciales, la asociación general

del estatus acetilador lento con el riesgo de cáncer de vejiga no ha sido completamente

confirmada. Los metaanálisis han obtenido resultados positivos que reflejan una modesta

asociación del genotipo acetilador NAT2 lento con el riesgo de cáncer de vejiga con un odds

ratio entre 1,3 y 1,5 (Dong et al., 2008; Garcia-Closas et al., 2005; Johns and Houlston,

2000; Marcus et al., 2000a; Marcus et al., 2000b; Rothman et al., 2007; Sanderson et al.,

2007; Song et al., 2009; Vineis et al., 2000) y esta asociación es particularmente significativa

en pacientes fumadores (Fontana et al., 2009; Gu et al., 2005; Klimcakova et al., 2011;

Sanderson et al., 2007; Vineis et al., 2001). Sin embargo también existen estudios en los

que se estableció un efecto protector del estatus acetilador lento NAT2 y para el desarrollo

de cáncer de vejiga y para la formación de aductos de ADN en trabajadores expuestos a

benzidinas (Carreon et al., 2006; Rothman et al., 1996). En otros estudios no se estableció

asociación positiva entre acetiladores lentos riesgo de cáncer de vejiga en pacientes con

riesgo ocupacional o en fumadores (Hayes et al., 1993; Kontani et al., 2001; Ma et al., 2004;

Mittal et al., 2004; Zupa et al., 2009). Cuando se estudian conjuntamente los genotipos

NAT1 y NAT2, varios estudios hallaron un efecto conjunto de genotipos NAT1 rápidos y

genotipos NAT2 lentos sumados al hábito de fumar o a la exposición ocupacional como

55

factores que incrementan el riesgo de cáncer de vejiga (Cascorbi et al., 2001; Hsieh et al.,

1999; Jaskula-Sztul et al., 2001; Sanderson et al., 2007; Taylor et al., 1998); mientras que

otros estudios no observaron ninguna asociación significativa de los genotipos NAT1 con el

riesgo de cáncer de vejiga (Covolo et al., 2008; Okkels et al., 1997; Sanderson et al., 2007).

1.6 RELACIÓN ENTRE FENOTIPO ACETILADOR Y GENOTIPO ACETILADOR.

Como se muestra en la Figura 9, la especificidad de sustrato de las enzimas NAT1 y NAT2

dista de ser absoluta. Ambas enzimas, aunque con diferente grado de participación,

intervienen en la acetilación de fármacos y xenobióticos. No obstante lo anterior, y debido a

que el genotipo NAT1 no muestra una clara asociación con la actividad de la enzima in vivo,

por los motivos comentados en apartados anteriores de esta introducción, cuando se

menciona el término fenotipo acetilador se está haciendo referencia de forma implícita al

fenotipo de la enzima NAT2. No debe olvidarse, sin embargo, que una parte de la actividad

enzimática se debe a NAT1.

Se han utilizado numerosos sustratos para analizar el estatus acetilador in vivo. Entre ellas

la cafeína es, con mucha diferencia, la más utilizada. El metabolismo de cafeína es muy

complejo, como se muestra en la siguiente Figura:

56

Figura 17. Mapa del metabolismo de cafeína. Aparece marcada en rojo la actividad NAT y

en azul la xantina oxidasa.

Para la determinación del fenotipo acetilador uno de los métodos más utilizados es el

recomendado por Grant y colaboradores en 1984, en el cual la determinación por HPLC de

la relación de AFMU/1-MX, en la orina recolectada por 24 horas de personas que

consumieron 300 mg de cafeína, permite diferenciar los distintos fenotipos acetiladores

(Grant et al., 1984, 2004). El ratio entre los metabolitos de cafeína AFMU/1-MX es un

indicador fiable y bien documentado del fenotipo acetilador (Miners and Birkett, 1996). Sin

embargo hay que tener en cuenta que hay otra enzima, la xantina oxidasa, que condiciona

AFMU

1-MU

1-MX

57

la transformación del metabolito 1-MX en 1-MU. Aunque se ha argumentado que los

resultados más fiables se obtienen con el ratio AFMU/1-MX, se ha propuesto el uso del ratio

AFMU / (AFMU + 1MX + 1MU) para obviar el efecto de la actividad xantina oxidasa (Miners

and Birkett, 1996). Utilizando la fenotipación con cafeína en algunos estudios como el de

Cascorbi y colaboradores en 1995, se encontró que el 7,2% de los individuos genotipados

como acetiladores lentos, presentaban actividades de acetilación altas y el 6,1% de los

individuos genotipados como acetiladores rápidos tuvieron actividades de acetilación lentas

(Cascorbi et al., 1995). Estas discrepancias entre el fenotipo y también han sido publicadas

por otros autores con un rango del 2 al 7% de los individuos (Blum et al., 1991; Gross et al.,

1999; Hickman et al., 1992). En otras poblaciones estas discrepancias son incluso más altas

(O'Neil et al., 2002; Straka et al., 2006).

Dado que se ha postulado que parte de las discordancias entre fenotipo y genotipo cuando

se utiliza cafeína como sustrato puedan ser debidas a la xantina oxidasa, se ha planteado

que alteraciones en el gen que codifica esta enzima, puedan producir alteraciones que

modifiquen la relación de los metabolitos de cafeína en orina. A continuación se presenta la

tabla 7 con los SNPs no sinónimos del gen que codifica la xantina oxidasa publicados en la

página www.ncbi.nml.nih.gov

En la tabla 7 se observa que son muy pocos los SNPs presentes en poblaciones caucásicas

y que aparecen con frecuencias muy bajas, siendo rs17323225 y rs17011368, los más

frecuentes. Dado que uno de los objetivos de esta Tesis es comparar los fenotipos y los

genotipos acetiladores de los participantes, se estudiarán como posibles factores que

modifiquen el fenotipo la presencia de estos dos SNPs del gen que codifica la xantina

oxidasa. No obstante lo anterior, algunas discordancias importantes entre el fenotipo

acetilador y genotipo NAT2 se han observado con el uso de otros sustratos como la

sulfametazina, en cuyo metabolismo no interviene la xantina oxidasa, por lo que es probable

58

que, además de la actividad xantino oxidasa, existan otros factores que puedan modificar el

metabolismo acetilador in vivo.

Identificación Variante Cambio de aminoácido

Frecuencia

rs113323020 97 G>T Leu 6 Phe 0 rs45447191 476 G>A Glu 133 Lys 0 rs45462996 579Del Gly 167 Frameshift 0 rs45523133 593 G>A Gly 172 Arg 0 rs1126469 651 T>C Leu 191 His ND rs112466737 750 G>A Arg 224 Gln ND rs45469499 783 C>T Thr 235 Met 0 rs34929837 1263 A>T Lys 395 Met 0 rs74874345 1614 C>G Thr 512 Ser ND rs45577338 1742 C>T Pro 555 Ser 0 rs45491693 1830 A>C Asp 584 Ala 0 rs61731081 1880 G>A Glu 601 Lys ND rs45442092 1889 G>A Arg 607 Gln ND rs45442398 1930 G>T Lys 617 Asn 0 rs45448694 1947 C>T Thr 623 Ile 0 rs17323225 2015 A>G Ile 646 Val 0,043 rs17011368 2185 A>G Ile 703 Val 0,042 rs72552333 2238 T>C Leu 720 Pro ND rs72549367 2243 A>T Lys 722 Stop ND rs61731083 2255 G>A Glu 726 Lys ND rs72549366 2289 T>C Ile 737 Thr ND rs76810353 2660 G>T Gli 861 Stop ND rs566362 2806 C>A Asn 909 Lys 0 rs669884 2808 C>A Thr 910 Lys 0 rs45619033 3350 G>C Val 1091 Leu 0 rs45547640 3405 A>C Asn 1109 Thr 0 rs1042036 3529 C>G Pro 1150 Arg ND rs45624433 3605 C>T Arg 1176 Cys 0 rs116290580 3746 C>T Arg 1223 Cys ND rs73922346 3954 A>G Lys 1292 Arg ND rs45564939 3965 C>T Arg 1296 Trp 0 rs2295474 4032 G>A Cys 1318 Tyr 0,004

Tabla 7. Frecuencias de SNPs no sinónimos del gen de xantina oxidasa en caucásicos.

Adaptado de http://http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Como se mencionaba anteriormente, otra enzima que se ha propuesto que puede influir en

el metabolismo acetilador de la cafeína es NAT1, por ejemplo, un estudio sugiere que el

50% o más de la variación en proporción de metabolitos de cafeína (AFMU/1X) en

59

acetiladores lentos, puede ser el resultado de la variación en la actividad de NAT1 (Cribb et

al., 1994).

Un factor adicional que aún no ha sido estudiado en estas enzimas es la variación en el

número de copias de los genes que las codifican. Este es un fenómeno común en otras

enzimas metabolizadoras de fármacos como CYP2D6 o glutation S-transferasas. Es posible

que parte de las discrepancias observadas entre fenotipo y genotipo se deban a estas

variaciones.

60

2. OBJETIVOS

61

2.1. Objetivo general.

Aunque se conoce el efecto de las mutaciones más frecuentes del gen NAT2 sobre la

capacidad acetiladora de fármacos y xenobióticos, numerosos estudios han detectado

discordancias entre fenotipo y genotipo acetilador que requieren un análisis más

detallado. Por otra parte, la clasificación fenotípica entre acetiladores lentos y rápidos es

una clasificación que solamente discrimina la población en dos subgrupos, mientras que

sería deseable una clasificación más selectiva que permitiese afinar más la asignación

fenotípica. En esta Tesis se propone un estudio exhaustivo del efecto de distintas

mutaciones en los genes NAT1 y NAT2 sobre el fenotipo acetilador in vivo, incluyendo

polimorfismos no sinónimos y variaciones en el número de copias de estos genes, así

como el análisis de otros factores que puedan modificar el fenotipo. El objetivo último es

refinar los algoritmos predictivos de los test genéticos para inferir el fenotipo acetilador

de un individuo.

2.2. Los objetivos específicos son:

1.- Analizar el efecto de polimorfismos no sinónimos en el gen NAT2, de forma aislada y

en combinación, sobre el fenotipo acetilador in vivo.

2.- Analizar la posible influencia de polimorfismos no sinónimos en el gen NAT1, de

forma aislada y en combinación, sobre el fenotipo acetilador in vivo.

3.- Analizar la interacción de los polimorfismos en los genes NAT1 y NAT2 sobre el

fenotipo acetilador in vivo, así como el desequilibrio de ligamiento de polimorfismos en

estos genes.

4.- Analizar la existencia y, en su caso, el efecto funcional de variaciones en el número

de copias (ausencias, duplicaciones o amplificaciones) de los genes NAT1 y NAT2.

5.- Estudiar factores adicionales, genéticos y no genéticos, que puedan modular la

asociación fenotipo-genotipo acetilador.

62

3. MATERIALES Y MÉTODOS

63

3.1 PARTICIPANTES

Los participantes en este estudio fueron individuos sanos que participaron en un estudio de

casos y controles de cáncer pancreático. Estos pacientes fueron reclutados por los Dres

Fred F. Kadlubar († 2010; University of Arkansas for Medical Sciences, Little Rock, USA) y

Kristin Andersson (University of Minnesota, Minneapolis, USA). Se incluyeron 504 individuos

(266 hombres y 238 mujeres), con una edad promedio 66,5 años. Todos los individuos

incluidos en este estudio se clasificaron como de etnia caucásica. El protocolo del estudio

desarrollado en esta Tesis fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de

Extremadura, España.

3.2 MATERIALES

• Gradilla para tubos eppendorf.

• Guantes de látex.

• Insertos o frascos para el HPLC (VWR international).

• Micropipetas de volumen variable (20, 200 y 1000 ul) eppendorf.

• Puntas para micropipeta.

• Tubos Eppendorf, Daslab.

3.3 REACTIVOS

• Agarosa, BIO-RAD.

• Agua purificada a través del sistema Milli Q de Millipore.

• Bromuro de etidio, Bio-Rad.

• Cloroformo, Merck.

• Cloruro de potasio, Merck.

• Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) de Invitrogen Life Technologies.

• EDTA, Sigma.

64

• Endonucleasas de restricción de Fermentas.

• Etanol, Merck.

• Fenol, Merck.

• Guantes de nitrilo y libres de polvo, DELTALBA®, (España)

• Hojas adhesivas transparentes, Thermo Scientific, ABsolute QPCR Seal, (USA).

• Isoamilalcohol, Merck.

• Isopropanol, Merck.

• Máscaras desechables, Dust & Filter®, CE (China)

• Metanol, Merck.

• Mezcla matriz de reacción 2X (TaqMan® Genotyping Master Mix): dNTPs, buffer

TRIS-EDTA (TE) pH 8.0, DNA polimerasa (AmpliTaq Gold®). Applied Biosystems

(USA).

• Mezcla preformulada de genotipación 20X (TaqMan® Drug Metabolism SNP

Genotyping Assays®) con: Cebadores alelo específicos, sonda marcada con

cromóforo fluorescente VIC® MGB para secuencia del alelo 1, sonda marcada con 6-

carboxyfluoresceina FAM® MGB para secuencia del alelo 2 (Applied Biosystems,

USA).

• Mezcla performulada para Copy Number Variation 20X (TaqMan® Copy Number

Assays). Consiste de dos cebadores para el gen específico de interés y sonda

TaqMan® marcada con cromóforo fluorescente FAM® MGB para el gen de interés

(USA).

• Mezcla performulada para Copy Number Reference 20X (TaqMan® Copy Number

Reference Assays). Consiste de dos cebadores para el gen de referencia RNasa P y

sonda TaqMan® marcada con cromóforo fluorescente VIC® TAMRA® para el gen

RNasa PH1 (USA).

• NaCl saturado, Merck.

65

• Oligonucleotidos, Sigma.

• Placas para PCR-TR blancas, 96 pozos de 200 µl, FLAT WHITE FOR TIME REAL

PCR, VWR, (USA).

• Propanol, Merck.

• Proteinasa K de Roche Diagnósticos.

• Puntas de 0-10 µl QSP® (USA), 0-100 µl TreffLab® (Suiza), de 100-1000 µl

TreffLab® (Suiza).

• Sacarosa de Merck.

• SDS Merck al 10% y 20%.

• Taq Polimerasa de Boehringer Mannheim (Madrid, España).

• Tris, Merck.

• Tubos para microcentrífuga libres de RNasa y DNasa de 0,6 ml y 1,5 ml QSP®

(USA).

3.4 EQUIPOS

• Agitador de volteo modelo REAX-2, Heidolph.

• Autoclave JP-SELECTA® SA (España).

• Balanza modelo 1000C-3000D, PRECISA.

• Balanza modelo H31AR, Mettler.

• Baño termostatizado modelo 3000543, Tectron.

• Baño termostatizado modelo 3473100, Tectron.

• Campana de vacío DINKO, modelo D-95.

• Centrífuga Heraeus Sepatech Megafuge1.OR.

• Centrífuga Heraeus Sepatech Biofuge 13.

• Congelador a -80oC, Forma.

• Equipo de electroforesis submarina Pharmacia, modelo GNA200.

66

• Espectofotómetro UV/Visible de laboratorio Nanodrop® 2000c Thermo Scientific

(USA)

• Fuente de alimentación multidrive XL, Pharmacia.

• Fuente de alimentación EPS 301, Amersham Biosciencies.

• pH metro Basic 20, Crison.

• Programa informático Molecular Analyst. Bio-Rad.

• Refrigerador de 0 a -5°C, LIEBHERR® Premium Frost Free (Suiza).

• Congelador de -15 a -32 °C LIEBHERR® Comfort (Suiza).

• Secuenciador AbiPrism 310 de Applied Biosystems.

• Termociclador de tiempo real Realplex, Eppendorf.

• Termociclador de tiempo real 7500 Real-Time PCR System, Applied.

• Transiluminador macrovue 2011. LKB.

• Transiluminador F-ChemiBIS 0,5 M Pro.

3.5 TÉCNICAS ANALÍTICAS

3.5.1 Determinación del fenotipo acetilador.

Todos los participantes fueron fenotipados para determinar su metabolismo acetilador en la

Universidad de Minnesota (USA). El proceso de fenotipación se hizo según metodología

propuesta por Butler y col 1992 (Butler et al., 1992) y con modificaciones menores

realizadas por Gross y col 1999 (Gross et al., 1999). Y se describe brevemente a

continuación: Los participantes en el estudio se abstuvieron de consumir cafeína y alimentos

o bebidas que contuvieran metilxantinas desde la media noche hasta 5 horas antes del

consumo de cafeína, al inicio del estudio se les administraron dos tabletas de 100 mg de

cafeína. Cuatro o cinco horas después de la ingestión de cafeína, los individuos vaciaron

sus vejigas urinarias y las muestras de orina fueron colectadas hasta este punto de las 5

horas. Inmediatamente después de la colección las muestras de orina fueron congeladas.

67

Las muestras fueron descongeladas en el plazo de una semana desde su obtención, se

ajustó el pH a 3,5 y se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -70°C hasta el análisis.

Antes del análisis por HPLC, las muestras de orina se descongelaron, se tomaron 200 µl de

orina y se le añadieron 125 mg sulfato de amonio, se agregaron 6,0 ml de

cloroformo:isopropanol (95:5 v/v). Cada muestra se mezcló vigorosamente durante 30

segundos, y se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos. Se transfirió la fase orgánica a

otro tubo y se evaporó por flujo de nitrógeno. El residuo resultante fue resuspendido en 250

µl de ácido acético al 0,05%, filtrado y se congeló hasta su análisis por HPLC.

Para el análisis por HPLC, 50 µl del extracto fueron inyectados en una columna de HPLC de

fase reversa Ultrasphere (ODS), de 25 cm de longitud y 4,6-mm de diámetro, tamaño de

partícula 5-µm (Beckman instrument Inc.), y se eluyó con una fase móvil compuesta por

ácido acético: metanol (88:12, v/v), al 0,05% a un flujo de 1,2 ml/min, monitorizando la

absorbancia a 280 nm. En el análisis detectaron los metabolitos de cafeína AFMU y 1X. El

fenotipo acetilador se asignó basado en la relación de áreas bajo la curva del cromatograma

de AFMU/1X, de tal manera que cuanto mayor era el valor de la relación, se interpretó como

mayor actividad metabólica de NAT (acetilador rápido).

3.5.2 Extracción ADN genómico:

Se tomaron 30 ml de sangre venosa de cada paciente en tubos con EDTA. Se centrifugó y

se almacenó el precipitado de leucocitos. Se almacenó a -70°C y se usó para la extracción

de ADN. El ADN fue obtenido por el método de extracción fenol-cloroformo y precipitado con

etanol usando el método de extracción automatizado Applied Biosystems DNA extractor®.

La extracción se hizo siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN se disolvió en buffer

Tris-EDTA (pH 7,4) (Gross et al., 1999), y cuantificó por espectrofotometría por medición de

la absorbancia a 260 nm. Las muestras así procesadas fueron enviadas al laboratorio de

68

Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Extremadura donde se

llevaron a cabo los estudios genéticos.

3.5.3 Reacción en cadena de polimerasa a tiempo real (PCR-TR) para genotipación.

Se realizó la amplificación de todas las muestras para determinar los SNPs de los genes

NAT1, NAT2 y del gen xantina oxidasa (XO). El proceso cuenta con una mezcla que

contiene (ver figura 18).

• Dos cebadores (primers) con una secuencia-específica para la amplificación del

fragmento de interés.

• Dos sondas TaqMan® MGB alelo específico para detectar el polimorfismo específico

de interés.

La selección de SNPs de los genes NAT de estudio se basó en datos de desequilibrio de

ligamiento en población caucásica (CEU) de la base de datos de HapMap como se muestra

en las Tablas 8 y 9. El SNP rs1801280 (341 T>C) tiene alta capacidad de predicción de

defectos genéticos de NAT2 en poblaciones caucásicas, identificando aproximadamente el

60,9% de los defectos alélicos, el SNP rs1799930 (590 G>A) predice el 35,4% de los

defectos genéticos de NAT2, mientras que en caucásicos los SNPs rs1801279 (191 G>A) y

rs1799931 (857 G>A) tienen baja capacidad predicitiva 1,4 y 1,5 % respectivamente, pero

aumenta notablemente la capacidad de predicción del fenotipo acetilador (Agundez, 2003).

69

Figura 18. Representación esquemática del proceso de genotipación por PCR-TR con

sondas TaqMan® MGB.

70


SNPs gen NAT2 Oligonucleótidos TaqMan® FNQ-MGB rs1801279 (191G>A)

Sonda: TTTGATCACATTGTAAGAAGAAACC[A/G] GGGTGGGTGGTGTCTCCAGGTCAAT

rs1801280 (341T>C)

Sonda: GTTCACCTTCTCCTGCAGGTGACCA[C/T] TGACGGCAGGAATTACATTGTCGAT

rs1799930 (590G>A)

Sonda: ATATACTTATTTACGCTTGAACCTC[A/G] AACAATTGAAGATTTTGAGTCTATG

rs1799931 (857G>A)

Sonda: AATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATG[A/G] ATCCCTTACTATTTAGAATAAGGAA


SNPs gen NAT1 Oligonucleótidos TaqMan® FNQ-MGB

rs56318881 (97C>T)

Sonda: AACTGACATTCTTCAACACCAGATC[C/T] GAGCTGTTCCCTTTGAGAACCTTAA

rs56379106 (190C>T)

Sonda: TTTTGATCAAGTTGTGAGAAGAAAT[C/T] GGGGTGGATGGTGTCTCCAGGTCAA

rs4987076 (445G>A )

Sonda: GAAGGATCAGCCTCAGGTGCCTTGT[A/G] TCTTCCGTTTGACGGAAGAGAATGG

rs5030839 (559C>T)

Sonda: TGATCTCCTAGAAGACAGCAAATAC[C/T] GAAAAATCTACTCCTTTACTCTTAA

rs4986782 (560G>A)

Sonda: GATCTCCTAGAAGACAGCAAATACC[A/G] AAAAATCTACTCCTTTACTCTTAAG

rs4986783 (640T>G)

Sonda: GAATACATACCTGCAGACATCTCCA[G/T] CATCTGTGTTTACTAGTAAATCATT

La selección de SNPs del gen XO (XDH) se basó en datos de frecuencias en población

caucásica (CEU) de la base de datos de HapMap como se muestra en la Tabla 10.

71

Tabla 10. Sondas Taqman para la genotipación de XO

SNPs gen XO Oligonucleótidos TaqMan® FNQ-MGB rs17323225 (1936A>G)

Sonda: GTCTCATCATTACAAATTCCAGTTA[C/T] GTTACTCCCAGGAACATCATCAGCG

s17011368 (2107A>G)

Sonda: GGTCCATAAAAGGAGTTGTTCTTTA[C/T] AGCATCCTGAGGATCACAAAGAAGT

Para la reacción de PCR-TR, se utilizaron para cada muestra:

1. 5 µl de TaqMan® Genotyping Master Mix® (Applied Biosystems PN AM9849)

2. 3,5 µl de agua MilliQ.

3. 0,5 µl del oligonucleótidos alelo específicos a 900 µM de concentración final, sonda

marcada con cromóforo fluorescente VIC® MGB para secuencia del alelo 1 a una

concentración de 200 µM, sonda marcada con FAM® MGB para secuencia del alelo

2 a una concentración de 200 µM.

4. 1,0 µl de ADN genómico (5-10 ng/µl).

La mezcla de reacción para 94 muestras y 2 controles negativos, fue pipeteada en un tubo

para microcentrífuga de 1,5 ml (QSP®), se mezcló en el agitador (Heidolph®), durante 5 s y

luego se centrifugó durante 5 s, en una centrífuga Eppendorf® 5417R. Posteriormente se

pipetearon 9 µl de la mezcla de reacción en cada pozo de las placas PCR-TR blancas (FLAT

WHITE VWR®), donde previamente se había pipeteado 1 µl de cada muestra de DNA

genómico. Seguidamente las placas se cubrieron con la hoja adhesiva transparente (Thermo

Scientific, ABsolute QPCR Seal). Se mezclaron durante 10 s en agitador de volteo

(Heidolph®) y luego se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 segundos, en centrífuga

Eppendorf® 5404R.

72

Las placas se amplificaron en el equipo de PCR-TR Mastercycler® ep realplex (Eppendorf®)

como se indica a continuación: La reacción se inicia con una preincubación a una

temperatura 95 °C durante 10:00 min este paso es necesario para la activación de la DNA

polimerasa (AmpliTaq Gold®), lo que le da una gran especificidad al proceso, pues se evitan

amplificaciones a temperaturas ambiente. A este paso le sigue una etapa de 92 °C durante

15 segundos y 60 °C durante 01:30 min. Estos pasos se repiten entre 40 y 60 ciclos. Al final

se hace una última etapa a 60 °C durante 02:00 min. En general, si la señal generada por la

amplificación de PCR-TR, muestra solo amplificación de la señal FAM® se asigna el

genotipo no mutado (Wild Type), ver figura 20. Si amplifica la señal VIC® se asigna genotipo

mutado homocigoto, ver figura 21 y si amplifican ambas señales se asigna genotipo

heterocigoto, ver figura 22.

Figura 19. Amplificación de un blanco (sin ADN), en el que ninguna de las señales

fluorescentes amplificó.

73

Figura 20. Amplificación de una muestra de ADN genómico para el SNP rs1799931

(857G>A) del gen NAT2, con amplificación de la señal fluorescente FAM®, asignando

genotipo silvestre o wild type (wt).


(857G>A) del gen NAT2, con amplificación de la señal fluorescente VIC®, asignando

genotipo mutado homocigoto.

74


(559C>T) del gen NAT1, con amplificación de las señales fluorescentes FAM® y VIC®,

asignando genotipo heterocigoto.

3.5.4 Determinación de la variación en el número de copias (Copy Number Variation:

CNV) de los genes NAT.

La determinación de CNV por PCR-TR con sondas TaqMan® MGB requiere una mezcla que

contiene:

• Cebadores específicos del gen de interés (NAT1 o NAT2).

• Sondas marcadas con cromóforo fluorescente FAM® en el extremo 5´, y un inhibidor

de fluorescencia (NFQ por sus siglas en inglés) y un Minor Groove Binder (MGB) en

el extremo 3´ para gen de interés (NAT1 o NAT2).

• Cebadores específicos para el gen de referencia RNasa P.

• Sondas marcadas con cromóforo fluorescente VIC® TAMRA® para el gen de

referencia RNasa P. En estas sondas el inhibidor de fluorescencia TAMRA®,

cumplen la misma función que NFQ-MGB®, descrito anteriormente.

75

La reacción se inicia con una preincubación a una temperatura 95 °C durante 10 min

seguido por un breve período de 95 °C durante 15 segundos. Luego la temperatura se baja

a 60 °C durante 1 min. Este proceso se repite durante 40 ciclos. Cuando las sondas están

intactas, la proximidad de inhibidor de fluorescencia (FNQ-MGB, TAMRA), impide que los

cromóforos emitan la fluorescencia (ver figura 23).

Figura 23. Representación esquemática del proceso de determinación del número de copias

de un gen por PCR-TR con sondas TaqMan®.

76

Para la reacción de PCR-TR, se utilizaron por cada muestra:

1. 5 µl de TaqMan® (Genotyping Master Mix® Applied Biosystems).

2. 2, µl de agua desionizada, filtrada MiliQ.

3. 0,5 µl del oligonucleótidos y sonda específica del gen de referencia (RNAasa PH1).

marcadas con cromóforo fluorescente VIC® TAMRA®

4. 0,5 µl del oligonucleótidos y sonda específica de gen NAT1 o NAT2 según

corresponda, marcadas con cromóforo fluorescente FAM® NFQ-MGB.

5. 2,0 µl de ADN genómico (5 ng/µl).

La mezcla de reacción para 31 muestras por triplicado y 3 controles negativos se preparó en

un tubo para microcentrífuga de 1,5 ml (QSP®), se mezcló en el agitador durante 5

segundos y luego se centrifugó durante 5 segundos, en microcentrífuga Spectrafuge®

5417R. De esta mezcla de reacción se pipetearon 8 µl en cada pozo de las placas para

PCR-TR transparentes, 96 pozos MicroAmp®, donde previamente se habían pipeteado 2 µl

de DNA genómico (a una concentración de 5 ng/µl), luego se cubrieron con la hoja adhesiva

transparente (Thermo Scientific, ABsolute QPCR Seal). Se mezclaron durante 10 segundos,

en un agitador de volteo (Heidolph®) y luego se centrifugaron a 2000 rpm durante 5

segundos, en la centrifuga Eppendorf® 5810R.

Una vez preparada la placa se colocaron en el equipo PCR-TR 7500® Biosystem Applied,

para la amplificación de las muestras en el programa de Cuantificación Relativa de usando

comparaciones de CT (∆∆CT). Los datos de CT desde PCR-TR son después utilizados por el

Software CopyCaller® de Applied Biosystems para calcular el valor de número de copias por

muestra por cuantificación relativa. El CT (Cycle Threshold o Ciclo Umbral), está asociado

con el ciclo de la PCR en el cual la emisión de fluorescencia puede ser detectada por el

instrumento de PCR-TR.

77

El sistema PCR-TR, muestra las señales de amplificación asociando la señal del

fluorescencia FAM® con el gen de interés (NAT1 o NAT2) y la señal de fluorescencia VIC®

con el gen de referencia RNasa P, ver figura 24.

Figura 24. Amplificación de una muestra de ADN genómico por cuadruplicado, para la

determinación de CNV. En rojo aparece la señal fluorescente FAM® para el gen de interés

NAT1 y en azul la señal VIC® para gen de referencia RNAasa HP1.

Los resultados de la amplificación se analizaron por el software 7500 v2.0.1 Applied

Biosystem PCR Time Real System®, que determina la cuantificación del amplificado. Este

método mide la diferencia de CT (∆CT) entre el gen de interés (NAT1 o NAT2) y el gen de

referencia (RNasa P) que se encuentran 2 copias en el genoma humano. Después de la

amplificación se exportó la tabla de los resultados del experimento que contenía los valores

de CT (Cycle Threshold o Ciclo Umbral), para la amplificación de los genes NAT1 o NAT2 y

del gen de referencia (RNAasa HP1), al software CopyCaller®, para el análisis de datos

post-PCR, que determinó el número de copias de los genes de interés.

78

De acuerdo con lo anterior, el software presentó un reporte de resultados con el número de

copias determinado para cada muestra y el valor de confianza para dicho cálculo. Ver figura

25.

Figura 25. Resultados de un experimento de estudio de CNV, una vez analizado por el

software CopyCaller®,

3.5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Estadística descriptiva.

Se realizó análisis de estadística descriptiva con el software de análisis estadístico SPSS

para Windows (SPSS 19.0.1. Inc. LEAD, Technologies, Chicago, Illinois). Se calcularon los

parámetros básicos descriptivos como las medidas de posición (media) medidas de

79

dispersión (varianza, desviación típica), histogramas y cálculo de intervalos de confianza y

se realizaron comparación de medias entre grupos por análisis de varianza y prueba de t.

Tests no paramétricos.

El fenotipo acetilador determinado como el logaritmo de la relación AFMU/1X, se analizó con

la estimación de Densidad de Kernel utilizando software libre (Wessa, 2008). Debido a que

los datos presentaron una distribución bimodal (no paramétrica), se realizaron tests no

paramétricos.

Análisis del equilibrio Hardy-Weinberg.

El equilibrio Hardy-Weinberg fue evaluado mediante la comparación de las frecuencias

genotípicas esperadas y observadas utilizando la distribución chi-cuadrado (χ2) (Rodriguez

et al., 2009).

Análisis de haplotipos y diplotipos.

El cálculo de haplotipos, sus frecuencias y, los estudios de asociación mediante el software

Arlequin 3.5.1.2 (Excoffier and Lischer, 2010). Se hicieron las inferencias de haplotipos a

partir de los genotipos obtenidos. Mediante el software SNPstats

(http://bioinfo.iconcologia.net/index.php?module=Snpstats), (SolÃ© et al., 2006) se

compararon la distribución de genotipos en la población analizada asumiendo un diseño

caso-control. Además mediante SNPstats se realizó un test de asociación entre los

genotipos y la respuesta a una variable asumiendo cuatro modelos genéticos: 1) modelo

codominante, que compara todos los pares de genotipos, 2) el modelo dominante, que

compara los homocigotos del alelo común con los heterocigotos más los homocigotos del

alelo poco frecuente, 3) el modelo recesivo que compara los alelos poco frecuentes con los

heterocigotos más los homocigotos del alelo frecuente y 4) el modelo aditivo.

80

.

En los estudios que se llevaron a cabo se aplicó un modelo de regresión logística ya que la

regresión lineal no era aplicable debido a que la variable respuesta es de tipo dicotómica. La

determinación de diplotipos para cada individuo se realizó a partir de los haplotipos inferidos

mediante el uso del software PHASEv2.1.1 (Stephens et al., 2001), utilizando siete análisis

independientes con 1000 iteraciones cada una (para más detalles ver (Agundez et al.,

2008)).

81

4. RESULTADOS.

82

4.1 ANÁLISIS DEL FENOTIPO ACETILADOR DETERMINADO POR LA RELACIÓN DE

METABOLITOS DE CAFEÍNA Log AFMU/1X EN ORINA.

La distribución de los fenotipos acetiladores in vivo en los 504 participantes, medidos como

el logaritmo de la relación de metabolitos de cafeína, 5-acetilamino-6-formilamino-3-

metiluracilo (AFMU) y 1-metilxanthina (1X) en orina (log AFMU/1X), mostró una distribución

aparentemente bimodal, según se puede observar en el histograma de frecuencias de la

figura 26.

Figura 26. Histograma de frecuencias de la relación log AFMU/1X en la población de

estudio.

Para este tipo de distribuciones se realizaron análisis de distribución de densidades de

Kernel, lo que permitió precisar que los datos presentaban una distribución bimodal (ver

figura 27).

83

Figura 27. Gráficas de diferentes cálculos de densidad de Kernel. En todos los gráficos se

observa que la distribución de frecuencias es bimodal.

Según el análisis de la función de densidad de Kernel, se calculó que el valor de log

AFMU/1X = -0,18, era el punto de corte del modelo de distribución bimodal (Silverman,

1986). De esta manera los individuos con valores <-0,18 log AFMU/1X, fueron clasificados

como acetiladores lentos y aquellos individuos con valores ≥-0,18 log AFMU/1X, fueron

clasificados como acetiladores rápidos. Según este criterio de clasificación 280 individuos

(147 hombres, 133 mujeres) de 504 de este estudio fueron acetiladores lentos (55,6%) y 224

individuos (119 hombres y 105 mujeres), fueron clasificados como acetiladores rápidos

(44,4%).

84

El valor promedio ± SD del log AFMU/1X para los individuos con fenotipo acetilador lento fue

de -0,548 ± 0,16063 (95% I.C. -0,5669 a -0,5291) y para los que presentaron fenotipo

acetilador rápido de 0,1940 ± 0,16274 (95% I.C. 0,1725 a 0,2174) y la comparación entre

ambos grupos fue estadísticamente significativa (p=0.0001).

En este estudio no se observaron diferencias estadísticas significativas en la proporción de

individuos clasificados como acetiladores rápidos o lentos según el sexo (p=0,895), como se

observa en la siguiente figura.

Figura 28. Distribución de fenotipo acetilador medido como log AFMU/1X según sexo.

P=0,771

P=0,671

85

4.2 DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO ACETILADOR

4.2.1 Genotipo NAT2.

Como se ha comentado en el capítulo de introducción, las mutaciones en el gen NAT2, y

particularmente aquellas que causan cambios de aminoácidos, son las que mejor

discriminan entre acetiladores lentos y rápidos. En una primera aproximación a la predicción

de fenotipo basada en el genotipo, se procedió a analizar los cuatro polimorfismos más

predictivos (Agundez et al., 2008). Los resultados de la frecuencia de los polimorfismos

analizados del gen NAT2 en la población de estudio se presentan en la tabla 11.

Tabla 11. Frecuencia de SNPs del gen NAT2 en la población de estudio.

Num rs Nombre trivial Alelo Num Porcentaje

rs1801279 191G>>>>A

G A

1008 0

100 0

rs1801280 341T>>>>C

T C

567 441

56 44

rs1799930 590G>>>>A

G A

733 275

73 27

rs1799931 857G>>>>A

G A

966 42

96 4

El SNP más frecuente en la población de estudio fue rs1801280, seguido del rs1799930. El

SNP rs1799931 tiene una muy baja frecuencia en la población de estudio, mientras el

rs1801279 presentó una distribución monomórfica. Estos resultados son consistentes con

los observados en poblaciones de origen caucásico (Garcia-Martin, 2008). En la tabla 12 se

observa que todos los SNP del gen NAT2 analizados se encuentran en equilibrio de Hardy-

Weinberg en la población de estudio y que no existe una diferencia estadísticamente

significativa con el modelo teórico.

86


SNP (Num rs) Aminoácido Frecuencia observada

% Frecuencia observada

% Frecuencia esperada

Valor de P

191G>>>>A (rs1801279) G/G G/A A/A

64 Arg/Arg 64 Arg/Glu 64 Glu/Glu

504

0 0

100,0 000,0 000,0

100,0 00,0 00,0

(--,--)

341T>>>>C (rs1801280) T/T T/C C/C

114 Ile/Ile 114 Ile/Thr 114 Thr/Thr

162 243 99

32,14 48,22 19,64

31,64 49,22 19,14

0,647

590G>>>>A (rs1799930) G/G G/A A/A

197 Arg/Arg 197 Arg/Gln 197 Gln/Gln

263 207 34

52,18 41,07 6,75

52,88 39,68 7,44

0,430

857G>>>>A (rs1799931) G/G G/A A/A

286 Gly/Gly 286 Gly/Glu 286 Glu/Glu

464 38 2

92,06 7,54 0,40

91,84 7,99 0,17

0,209

4.2.1.1. Relación entre SNPs de NAT2 y los metabolitos de cafeína en orina (log

AFMU/1X).

Para evaluar la relación entre los diferentes SNPs del gen NAT2, se revisó el modelo de

dominancia con respecto a la relación de metabolitos de cafeína en orina (log AFMU/1X). El

SNP rs1801279 no fue analizado ya que fue monomórfico en la población de estudio. En la

siguiente tabla se observa la probabilidad de ajuste al modelo de dominancia del SNP

rs1801280.

87

Tabla 13. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs1801280 (114 Ile/Thr)

del gen NAT2 según la relación con el valor de (log AFMU/1X).

SNP rs1801280

(341T>>>>C)

Genotipo n Log AFMU/1X ± SE P AIC BIC

Codominante

T/T 162 -0,05 ± 0,03

<0,0001 455,1 472 T/C 243 -0,24 ± 0,03

C/C 99 -0,44 ± 0,02

Dominante T/T 162 -0,05 ± 0,03

<0,0001 472,8 485,5 T/C C/C 342 -0,3 ± 0,02

Recesivo T/T T/C 405 -0,16 ± 0,02

<0,0001 478,7 491,4 C/C 99 -0,44 ± 0,02

Sobredominancia T/T C/C 261 -0,2 ± 0,03

0,21 517,1 529,8 T/C 243 -0,24 ± 0,03

Aditivo 0, T, C <0,0001 453,1 465,8

SE: Error estándar. AIC: Criterio de Información de Akaike's. BIC: Criterio de información

Bayesiano.

La siguiente Figura muestra los valores medios e I.C. del 95% de (log AFMU/1X):

Figura 29. Medias e IC del 95% de log AFMU/1X según el genotipo del SNP rs1801280 (114Ile/Thr) del gen NAT2. La línea marca el punto de corte entre acetiladores rápidos (por encima de la línea) y acetiladores lentos (por debajo de la línea).

88

Globalmente se observa que el modelo codominante es el que más se ajusta para la

influencia del SNP rs1801280 (114 Ile/Thr) de NAT2 sobre el fenotipo acetilador. Los

resultados indican que existe un efecto de dosis génica (confirmado por el modelo aditivo en

la Tabla 13), que determina en la población de estudio su capacidad acetiladora.

Este efecto de dosis génica va en contra de la clasificación tradicional de individuos

acetiladores lentos y rápidos, ya que el genotipo del SNP rs1801280 permite una

discriminación más fina entre los acetiladores rápidos heterocigotos y homocigotos. No

obstante, se observa que entre los portadores del genotipo T/C hay individuos con fenotipos

lentos debido al efecto de otras mutaciones en el gen NAT2 como se describe a

continuación. Por ese motivo el análisis aislado de SNPs en el gen NAT2 no aporta

información suficientemente predictiva y debe hacerse un análisis combinado como se

describe más adelante.

En la siguiente tabla se observa la probabilidad de ajuste al modelo de dominancia del SNP

rs1799930.

89

Tabla 14. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs1799930 (197 Arg/Gln)

del gen NAT2 según la relación con el valor de (log AFMU/1X).

SNP rs1799930

590G>>>>A Genotipo n Log AFMU/1X ± SE P AIC BIC

Codominante

G/G 263 -0,11 ± 0,02

<0,0001 459,5 476,4 G/A 207 -0,28 ± 0,03

A/A 34 -0,63 ± 0,03

Dominante G/G 263 -0,11 ± 0,02

<0,0001 481,1 493,7 G/A A/A 241 -0,33 ± 0,02

Recesivo G/G G/A 470 -0,19 ± 0,02

<0,0001 479,7 492,3 A/A 34 -0,63 ± 0,03

Sobredominancia G/G A/A 297 -0,17 ± 0,02

0,0027 509,7 522,3 G/A 207 -0,28 ± 0,03

Aditivo 0, G, A <0,0001 461,6 474,3


Bayesiano.


Figura 30. Medias e IC del 95% de Log AFMU/1X según el genotipo del SNP rs1799930 NAT2 (Modelo codominante). La línea marca el punto de corte entre acetiladores rápidos (por encima de la línea) y acetiladores lentos (por debajo de la línea).

90

De nuevo se observa que el modelo codominante es el que más se ajusta para describir la

influencia SNP rs1799930 (197 Arg/Gln) de NAT2 sobre el fenotipo acetilador, indicando

que también existe un efecto de dosis génica en este polimorfismo.

En la tabla 15 se observa la probabilidad de ajuste a modelos de dominancia del SNP

rs1799931 (286 Gly/Glu) del gen NAT2.

Tabla 15. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para el SNP rs1799931 (286 Gly/Glu)

del gen NAT2 según la relación con el valor de (log AFMU/1X)

SNP rs1799931

857G>>>>A

Genotipo n Log AFMU/1X ± SE P value AIC BIC

Codominante

G/G 464 -0,2 ± 0,02

0,0003 504,6 521,5 G/A 38 -0,44 ± 0,07

A/A 2 -0,74 ± 0,22

Dominante G/G 464 -0,2 ± 0,02

0,0001 503,6 516,3 G/A A/A 40 -0,45 ± 0,07

Recesivo G/G G/A 502 -0,22 ± 0,02

0,069 515,4 528 A/A 2 -0,74 ± 0,02

Sobredominancia G/G A/A 466 -0,2 ± 0,02

0,0004 506,2 518,9 G/A 38 -0,44 ± 0,07

Aditivo 0, G, A 0,0001 502,6 515,3


Bayesiano.


91

Figura 31. Medias e IC del 95% de Log AFMU/1X según el genotipo del SNP rs1799931 NAT2. La línea marca el punto de corte entre acetiladores rápidos (por encima de la línea) y acetiladores lentos (por debajo de la línea).

El modelo más probable para SNP rs1799931 (286 Gly/Glu) es el dominante. El modelo

codominante, que es el que tienen los otros SNPs, muestra para este SNP una validez

ligeramente inferior al dominante (Tabla 15). Esta aparente discordancia puede ser debida a

la baja frecuencia de la mutación en la población de estudio, que no permite determinar con

precisión el modelo de dominancia en esta población.

92

4.2.1.2. Análisis de haplotipos y diplotipos del gen NAT2.

Del análisis de haplotipos de los SNPs de la región codificadora del gen NAT2 se deduce que

la población presenta 5 variantes alélicas que combinan los cuatro SNPs analizados, en la

tabla 16 se muestra los haplotipos y las frecuencias inferidas, así como la nomenclatura de

los haplotipos de NAT2.

Tabla 16. Frecuencia de haplotipos y su denominación (nomenclatura) para el gen NAT2 (n=1008).

Alelos rs1801279

64 Arg/Gln

rs1801280

114 Ile/Thr

rs1799930

197 Arg/Gln

rs1799931

286 Gly/Glu Frecuencia

NAT2*4 G T G G 0,2564

NAT2*5 C 0,4324

NAT2*6 A 0,2654

NAT2*7 A 0,0374

NAT2*6I ó *6J

A A 0,0084

Total 1.0

Hay que resaltar que el análisis de SNPs realizado en este estudio sobre el gen NAT2 ha

sido simplificado, limitándose a los SNPs no sinónimos. Por ese motivo la asignación de

haplotipos debe considerarse como genérica. Así, los haplotipos clasificados como NAT2*4

podrían incluir también los haplotipos sumamente infrecuentes clasificados como NAT2*10,

NAT2*11A, NAT2*11B, NAT2*12A, NAT2*12B, NAT2*12C, NAT2*12D, NAT2*12E,

NAT2*12F, NAT2*12G, NAT2*12H, NAT2*12I, NAT2*12J, NAT2*13A, NAT2*13B, NAT2*17,

NAT2*18, NAT2*19, NAT2*20 y NAT2*21, que no se determinaron en este estudio.

93

Asímismo, los haplotipos clasificados como NAT2*5 incluyen los haplotipos NAT2*5A,

NAT2*5B, NAT2*5C, NAT2*5D, NAT2*5E, NAT2*5F, NAT2*5G, NAT2*5H, NAT2*5I,

NAT2*5K, NAT2*5L, NAT2*5M, NAT2*5N, NAT2*5O, NAT2*5P.

El haplotipo clasificado como NAT2*6 incluye los haplotipos NAT2*6A, NAT2*6B, NAT2*6C,

NAT2*6D, NAT2*6E, NAT2*6F, NAT2*6G, NAT2*6H, NAT2*6K, NAT2*6L, NAT2*6M,

NAT2*6N.

El haplotipo clasificado como NAT2*7 incluye los haplotipos NAT2*7A, NAT2*7B, NAT2*7C,

NAT2*7D. La simplificación en la determinación de haplotipos que se ha hecho en esta

Tesis tiene escasa repercusión funcional y se utiliza de forma rutinaria en estudios que

implican al gen NAT2 (Agundez et al., 2008).

Las frecuencias de diplotipos de SNP NAT2 analizados según el fenotipo acetilador se

muestran en la tabla 17. Se puede observar que los diplotipos que poseen al menos un alelo

del haplotipo NAT2*4 (*4*/*4, *4/*5, *4/*6, *4/*7), se observan predominantemente, pero no

exclusivamente, en individuos con fenotipos acetiladores rápidos. Los números que

aparecen en rojo en la tabla 16 corresponden a discordancias entre el genotipo y el fenotipo.

El 3.9% de los participantes con fenotipos lentos tienen genotipos correspondientes a

acetiladores rápidos. Por otra parte el 9.4% de los participantes con fenotipos rápidos tienen

genotipos que corresponderían a acetiladores lentos. Estas discordancias ya se han

observados en estudios de nuestro grupo y de otros autores (véase el capítulo de

introducción).

94


Diplotipo n

Fenotipo Acetilador

rápido (n=224)

Frec.

Fenotipo Acetilador

lento (n=280)

Frec.

*4/*4 38 36 16,07 2 0,71

*4/*5 99 95 42,41 4 1,42

*4/*6 71 66 29,45 5 1,79

*4/*7 6 6 2,68 0 0

*5/*5 99 8 3,57 91 32,50

*5/*6 124 9 4,02 115 41,07

*5/*7 20 1 0,45 19 6,79

*6/*6 33 1 0,45 32 11,43

*6/*7 12 2 0,90 10 3,57

*7/*7 1 0 0 1 0,36

*6I/*6I ó *6J/*6J

1 0 0 1 0,36

504 224 100 280 100

En la siguiente figura se observa con más detalle la dispersión de valores de log AFMU/1X

en orina según el diplotipo de gen NAT2.

95

Figura 32. Diagrama de dispersión de valores de log AFMU/1X en orina según el diplotipo

del gen NAT2.

La concordancia entre el genotipo y el fenotipo acetilador es del 94,8% entre acetiladores

rápidos y del 92,8% entre acetiladores lentos, mediante el análisis de sólo tres SNPs

rs1801280 (114 Ile/Thr), rs1799930 (197 Arg/Gln), rs1799931 (286 Gly/Glu). De entre los

casos discordantes, la explicación más probable de los individuos con genotipos rápidos y

fenotipos lentos es la presencia de otras mutaciones poco frecuentes que no se han

analizado en este estudio. Pero lo que llama poderosamente la atención es la existencia de

individuos con los dos genes NAT2 mutados y que sin embargo presentan actividades

metabólicas rápidas in vivo (Figura 32). Otro aspecto que llama la atención en la Figura 32

es que las medias de valores de log AFMU/1X en orina parecen ser diferentes en función del

Ace

tila

do

res

ráp

ido

s A

ceti

lad

ore

s l

en

tos

96

diplotipo, incluso entre subgrupos de metabolizadores lentos. Este aspecto se analiza a

continuación.

La siguiente tabla muestra los valores de estadística descriptiva de la relación de los valores

(log AFMU/1X) en relación a los diferentes diplotipos.

Tabla 18. Estadística descriptiva del log AFMU/1X según los diplotipos NAT2.

Genotipo n Media SD min max 95% CI min

95% CI max

*4/*4 38 0,2745 0,28138 -0,70 0,57 0,1820 0,3670

*4/*5 99 0,1445 0,18661 -0,54 0,76 0,1073 0,1818

*4/*6 71 0,1394 0,21794 -0,60 0,69 0,0879 0,1910

*4/*7 6 0,1717 0,12319 0,05 0,32 0,0424 0,3010

*5/*5 99 -0,4429 0,18425 -0,82 0,09 -0,4797 -0,4062

*5/*6 123 -0,4988 0,23803 -1,15 0,57 -0,5411 -0,4565

*5/*7 20 -0,5590 0,33425 -1,52 0,36 -0,7154 -0,4026

*6/*6 33 -0,6265 0,18396 -0,89 0,00 -0,6907 -0,5623

*6/*7 12 -0,5425 0,37183 -0,96 0,37 -0,7787 -0,3063

*6i/*6i 1 -0,5100 - - - - -

7/7 1 -0,9600 - - - - -

Total 504

Además de las evidentes diferencias entre acetiladores lentos y rápidos, se observan

diferencias en los valores medios entre las diferentes categorías de acetiladores lentos, en

función del diplotipo que posean. En la Tabla 19 se muestran los valores de la comparación

entre los diferentes diplotipos NAT2.

97

Tabla 19. Comparación T-test entre los diplotipos del gen NAT2 según los valores de log AFMU/1X en orina.

Genotipo *4/*5 *4/*6 *4/*7 *5/*5 *5/*6 *5/*7 *6/*6 *6/*7

*4/*4 0,002 0,006 0,387 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

*4/*5 0,870 0,727 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

*4/*6 0,723 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

*4/*7 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

*5/*5 0,056 0,030 0,000 0,125

*5/*6 0,325 0,004 0,567

*5/*7 0,324 0,898

*6/*6 0,449

Valores inferiores a 0,05 indican una diferencia estadística significativa.

Nota: Se excluyeron del análisis los diplotipos con frecuencias inferiores a 2.

En las tablas anteriores se puede apreciar que los diplotipos considerados rápidos

(NAT2*4/*4), e intermedios (NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7), se diferencian

significativamente de los diplotipos considerados lentos (NAT2*5/*5, NAT2*5/6*, NAT2*5/*7,

NAT2*6/*6, NAT2*6/*7), cuando se comparan los valores de log AFMU/1X (p=0,0001).

Como se puede observar en la tabla 18 y la figura 33, los diplotipos NAT2*4/*5 y NAT2*4/*6

(intermedios) presentan menores valores promedios de log AFMU/1X y con diferencia

estadística significativa cuando se le compara con el diplotipo NAT2*4/*4. Estos datos

permiten observar en esta población de estudio un grupo de acetiladores intermedios con

características genotípicas y fenotípicas propias. Los resultados son compatibles con los

obtenidos en el análisis de haplotipos en donde se encontró que los SNPs rs1801280 (114

Ile/Thr) y rs1799930 (197 Arg/Gln), tenían un modelo de codominancia, que daban un efecto

98

de dosis génica cuando el fenotipo se medía como la relación de metabolitos de cafeína en

orina log AFMU/1X y son precisamente estos mismos SNPs los que identifican a los alelos

NAT2*5 y NAT2*6 respectivamente. El diplotipo NAT2*4/*7 no presentó diferencias con

ninguno de las diplotipos NAT2*4/*4, NAT2*4/*5 y NAT2*4/*6 (p>0,05), esto se debe

principalmente al bajo número de individuos con este genotipo (n=6).

Figura 33. Comparación de los promedios e I.C. 95% del log AFMU/1X entre los diplotipos

NAT2 clasificados como rápidos (NAT2*4/*4), e intermedios (NAT2*4/*5, NAT2*4/*6,

NAT2*4/*7),

P=0,002

P=0,006

P=0,387

99

Cuando se comparan los promedios e I.C. 95% del log AFMU/1X entre los diplotipos

clasificados como lentos (*5/*5, *5/6*, *6/*6, *5/*7, *6/*7), se observa que existen diferencias

significativas intergrupos, como se observa en la tabla 18 y en la siguiente figura.

Figura 34. Comparación de los promedios e I.C. 95% del log AFMU/1X entre los diplotipos

NAT2 clasificados como lentos.

En esta figura se observa que el diplotipo NAT2*6/*6, causa una mayor disminución de la

actividad acetiladora de NAT2, que NAT2*5/*5, con diferencias estadísticamente significativas

(p=0,001). La actividad observada entre portadores del diplotipo NAT2*5/*6 fue intermedia

entre NAT2*5/*5 y NAT2*6/*6. No se observaron diferencias significativas entre portadores de

combinaciones del alelo NAT2*7 con ningún otro grupo, debido al bajo número de portadores

de este alelo en la población de estudio.

P=0,056

P=0,03

P=0,379

P=0,001

P=0,004

100

4.2.1.3. Variación en el número de copias del gen NAT2 (CNV; copy number variation)

En el grupo de estudio se analizaron la existencia y la frecuencia de variaciones en el número

de copias del gen NAT2, como se describe en el capítulo de métodos. Debido a limitaciones

en la cantidad de DNA disponible, este estudio solamente pudo hacerse en 383 participantes.

Diecinueve participantes (5% de la población de estudio) mostraron variaciones en el número

de copias. Entre ellos 6 solamente tenían una copia del gen, y 13 tenían tres o más copias

del gen. En el siguiente cuadro se observa el número de copias del gen NAT2 según el

diplotipo determinado en la población de estudio.

Tabla 20. Frecuencias de CNV del gen NAT2 según el genotipo.

NAT2

Diplotipo

Número de copias gen

n 1 2 ≥3

*4/*4 27 3 23 1

*4/*5 76 0 74 2

*4/*6 54 0 52 2

*4/*7 5 0 5 0

*5/*5 73 1 70 2

*5/*6 98 0 94 4

*5/*7 16 0 15 1

*6/*6 26 2 23 1

*6/*7 8 0 8 0

Total 383 6 364 13

Para determinar si el número de copias del gen NAT2 tiene una influencia sobre la actividad

acetiladora se realizaron análisis de estadísticos clasificando a los individuos como

acetiladores rápidos (NAT2*4/*4), intermedios (NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7), y lentos

101

(NAT2*5/*5, NAT2*5/*6, NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7) y a su vez se clasificaron según

el número de copias.

Tabla 21. Valores de estadística descriptiva del log AFMU/1X según el número de copias del

gen (CNV) en grupos con distintos genotipos NAT2.

Genotipo NAT2

CNV n Media SD min max 95% CI min

95% CI max

Rápidos

1 3 0,3967 0,08737 0,30 0,47 0,1796 0,6137

2 23 0,2896 0,26896 -0,66 0,56 0,1733 0,4059

≥3 1 0,1506 - - - - -

Intermedios

1 0 - - - - - -

2 131 0,1489 0,19155 -0,54 0,76 0,1158 0,1820

≥3 4 0,1525 0,12945 0,02 0,32 -0,0535 0,3585

Lentos

1 3 -0,5367 0,16442 -0,66 -0,35 -0,9451 -0,1282

2 210 -0,4922 0,23024 -1,15 0,57 -0,5236 -0,4609

≥3 8 -0,4900 0,18516 -0,72 -0,23 -0,6448 -0,3352

Rápidos: NAT2*4/*4. Intermedios: NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7. Lentos: NAT2*5/*5, NAT2*5/6*, NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7.

En la tabla 21 no se observan diferencias relevantes en los valores de log AFMU/1X, que

puedan ser atribuibles al número de copias del gen NAT2, cuando estos se analizaron

según el genotipo acetilador. Los resultados globales sugieren que las copias extra son

inactivas, ya que entre los acetiladores lentos la presencia de copias extra no incrementa la

capacidad acetiladora, y tampoco lo hace entre los acetiladores intermedios ni los rápidos.

102

4.2.2. Genotipo NAT1.

La frecuencia de los SNPs en la región codificadora del gen NAT1, y que se analizaron en la

población de estudio se muestran en la tabla 22.

Tabla 22. Frecuencia de SNP del gen NAT1 en la población de estudio.

Num rs

Nombre trivial Alelos Num Porcentaje

rs56318881

97C>>>>T

C

T

1000

2

99,8

0,20

rs56379106

190C>>>>T

C

T

992

8

99,92

0,80

rs4987076

445G>>>>A

G

A

972

24

97,59

2,41

rs5030839

559C>>>>T

C

T

994

6

99,4

0,6

rs4986782

560G>>>>A

G

A

952

34

96,65

3,45

rs4986783

640T>>>>G

T

G

943

27

97,22

2,78

A diferencia del gen NAT2, el gen NAT1 está muy bien conservado en el ser humano y las

frecuencias de SNPs observadas fueron bajas.

Los SNPs de mayor frecuencia en esta población de estudio fueron rs4987076 (149 Val/Ile),

rs4986782 (187 Arg/Gln) y rs4986783 (214 Ser/Ala); los demás SNPs, tuvieron frecuencias

103

menores del 1% en la población de estudio. Todos los SNPs analizados se encontraban en

equilibrio de Hardy y Weinberg, como se muestra en la siguiente Tabla.


SNP (Num rs) Aminoácido Frecuencia observada

% Frecuencia observada

% Frecuencia esperada Valor P

97C>>>>T (rs56318881) C/C C/T T/T

33 Arg/Arg 33 Arg/Stop 33 Stop/Stop

499

2 0

99,60 0,40

0

99,60 0,40 0,00

0,964

190C>>>>T (rs56379106) C/C C/T T/T

64 Arg/Arg 64 Arg/Trp 64 Trp/Trp

492

8 0

98,40 1,60

0

98,40 1,60 0,00 0,857

445G>>>>A (rs4987076) G/G G/A A/A

149 Val/Val 149 Val/Ileu 149 Ileu/Ileu

474 24 0

95,18 4,82

0

95,20 4,80 0,00

0,582

559C>>>>T (rs5030839) C/C C/T T/T

187 Arg/Arg 187 Arg/Stop 187 Stop/Stop

494

6 0

98,8 1,2 0

98,80 1,20 0,00

0,892

560G>>>>A (rs4986782) G/A G/A A/A

187 Arg/Arg 187 Arg/Gln 187 Gln/Gln

461 30 2

93,91 5,68 0,41

93,20 6,59 0,21

0,056

640T>>>>G (rs4986783) T/T T/G G/G

214 Ser/Ser 214 Ser/Ala 214 Ala/Ala

459 25 1

94,64 5,15 0,21

94,64 5,86 0,00

0,295

104

4.2.2.1. Relación entre SNPs de NAT1 y los metabolitos de cafeína en orina (log

AFMU/1X).

Para la evaluación de los modelos de dominancia de los SNPs del gen NAT1, con relación a

la actividad metabólica, se omitieron del análisis aquellos SNPs para los que no observamos

homocigotos mutados en la población de estudio (97C>>>>T rs56318881, 190C>>>>T rs56379106,

445G>A rs4987076, 559C>T rs5030839), debido a que no pueden ajustarse a ningún

modelo.

El análisis estadístico demostró que no hay diferencias estadísticamente significativas entre

los valores log AFMU/1X de C/C y de C/T del SNP rs56318881 de NAT1 (p=0,763), entre

los valores de C/C y C/T del SNP rs56379106 (p=0,52), y entre los valores de G/G y G/A

del SNP rs4987076 (p=0,883). En cambio, si que se observaron diferencias

estadísticamente significativas entre los valores de portadores de C/C y C/T del SNP

rs5030839 de NAT1 (p=0,025). Los valores medios ± SE fueron de -0,2162 ± 0,1830 para

C/C y de -0,5050 ± 0,9215 para C/T. Esto sugiere que la variante T se asocia a una menor

capacidad acetiladora, aunque esta asociación no ha podido confirmarse de forma definitiva

debido a la baja frecuencia de la variante T, que no permite la identificación de individuos

homocigotos en la población de estudio. Ello no es extraño ya que, de acuerdo a la

frecuencia alélica, debería aparecer un homocigoto cada aproximadamente 30.000

individuos.

El resto de SNPs de NAT1 pudieron ser analizados en los modelos de dominancia, que se

muestran a continuación. En la siguiente tabla se observa la probabilidad de ajuste al

modelo de dominancia del SNP 560G>A rs4986782.

105

Tabla 24. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs4986782 (187 Arg/Gln)

del gen NAT1 según la relación con el Log AFMU/1X

SNP rs4986782

560G>A Genotipo n Log AFMU/1X ± SE P value AIC BIC

Codominante

G/G 461 -0,23 ± 0,02

0,0002 490,5 507,3 G/A 30 0,06 ± 0,07

A/A 2 -0,66 ± 0,08

Dominante G/G 461 -0,23 ± 0,02

0,0008 494,7 507,3 G/A, A/A 32 0,01 ± 0,07

Recesivo G/G, G/A 491 -0,22 ± 0,02

0,12 503,5 516,1 A/A 2 -0,66 ± 0,08

Sobredominancia G/G, A/A 463 -0,24 ± 0,02

0,0001 490,9 503,5 G/A 30 0,06 ± 0,07

Aditivo 0,0072 496,1 508,7


Bayesiano.

De acuerdo a los resultados de la tabla anterior se observa un modelo de sobredominancia

del SNP rs4986782 (187 Arg/Gln), según la relación de metabolitos en orina log AFMU/1X.

Estos resultados sugieren que este SNP se asocia a la capacidad de acetilación de la cafeína

en la población de estudio. No obstante, el efecto es difícilmente explicable de acuerdo a los

modelos mostrados en la Tabla, ya que no parece existir una clara asociación entre la

presencia de una determinada variante alélica y la capacidad acetiladora.

En la siguiente tabla se observa la probabilidad de ajuste al modelo de dominancia del SNP

640T>G rs4986783.

106

Tabla 25. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para el SNP rs4986783 (Ser/Ala)

del gen NAT1 según la relación con el Log AFMU/1X.

SNP rs4986783

640T>G Genotipo n Log AFMU/1X ± SE P value AIC BIC

Codominante

T/T 459 -0,22 ± 0,02

0,75 500 516,7 TG 25 -0,26 ± 0,08

G/G 1 -0,03 ± 0,0

Dominante T/T 459 0,22 ± 0,02

0,62 498,3 510,9 TG, G/G 26 -0,26 ± 0,08

Recesivo T/T, T/G 484 -0,22 ± 0,2

0,64 498,4 510,9 G/G 1 -0,03 ± 0,0

Sobredominancia T/T, G/G 460 -0,21 ± 0,02

0,54 498,2 510,8 T/G 25 -0,26 ± 0,08

Aditivo 0,7 498,4 511


Bayesiano

Del resultado del análisis de dominancia del SNP rs4986783 (Ser/Ala) del gen NAT1, se

deduce que este SNP no se asocia con la acetilación de cafeína en esta población de

estudio.

4.2.2.2. Análisis de haplotipos del gen NAT1.

Para el análisis de haplotipo y desequilibrio de ligamiento del gen NAT1 se utilizaron

aquellos individuos en los que pudieron analizarse todos los SNPs, que fueron 473. A

diferencia del gen NAT2, para el que existen numerosas aproximaciones empíricas y

matemáticas para la asignación de haplotipos, dichas aproximaciones no existen para el gen

NAT1, de modo que en este caso hemos utilizado procedimientos estándar que se

describen en el capítulo de métodos.

107

El análisis de desequilibrio de ligamiento demostró asociación de dos pares de SNPs (en

rojo en la Figura 35). Estos eran los SNPs 97C>T (rs56318881), y 190C>T (rs56379106) y

los SNPs 445G>A (rs4987076) y 640T>G (rs4986783).

Figura 35. Análisis de desequilibrio de ligamientos SNPs de NAT1.

NAT1.SNP_97: 97C>T rs56318881, NAT1.SNP_190: 190C>T rs56379106, NAT1.SNP_445: 445G>A rs4987076, NAT1.SNP_559: 559C>T rs5030839, NAT1.SNP_560: 560G>A rs4986782, NAT1.SNP_640: 640T>G rs4986783. En rojo aparecen las asociaciones con más alta probabilidad de estar en desequilibrio de ligamiento.

La asociación rs4987076 (149 Val/Ile) y rs4986783 (214 Ser/Ala) ya había sido observada

por otros autores, sin embargo la asociación de los SNPs rs56318881 (33 Arg/Stop), y

rs56379106 (64 Arg/Arg), no había sido descrita previamente.

108

El análisis de haplotipos determinó que existen 7 variantes alélicas en la población de

estudio. La tabla 26 muestra los haplotipos y las frecuencias inferidas.

Tabla 26. Frecuencia de haplotipos del gen NAT1 determinados en la población de estudio.

Alelos rs563188813

3 Arg/Stop

rs56379106

64 Arg/Trp

rs49870761

149 Val/Ile

rs5030839

187 Arg/Stop

rs4986782

187 Arg/Gln rs4986783

214 Ser/Ala

Frec.

NAT1*4 C C G C G T 92,16

NAT1*11 (A ó B) A G 2,41

NAT1*11C G 0,51

NAT1*14 (A ó B) A 3,16

NAT1*15 T 0,62

NAT1*30 A 0,21

NAT1*17 T 0,73

NAT1*19 T 0,10

NAT1*19B T T 0,10

Total 100,00

En este estudio hemos identificado dos haplotipos que no habían sido descritos previamente

y que por lo tanto aún no tenían denominación (en rojo en la Tabla). Estos haplotipos, que

aparecen con la nomenclatura NAT1*30 y NAT1*19B han sido recientemente admitidos por

el Comité Internacional de Nomenclatura de los genes NATs.

Al igual que ocurre con el gen NAT2, la asignación de haplotipos no es completa, ya que

solo se han estudiado los SNPs que pueden tener repercusión funcional. De modo que los

haplotipos clasificados como NAT1*4 pueden incluir también los haplotipos clasificados

como NAT1*3, NAT1*5, NAT1*10, NAT1*16, NAT1*18, NAT1*20, NAT1*21, NAT1*22,

NAT1*23, NAT1*24, NAT1*25, NAT1*26, NAT1*27, NAT1*28 y NAT1*29.

109

Las frecuencias de diplotipos de NAT1 se muestran en la siguiente tabla.


Diplotipo n Acetilador rápido Frec.

Acetilador lento Frec.

*4/*4 402 178 82,80 224 86,82

*4/*11A ó B 22 9 4,19 13 5,03

*4/*11C 3 0 0 3 1,16

*4/*14 27 22 10,24 5 1,94

*4/*15 6 1 0,46 5 1,94

*4/*17 6 1 0,46 5 1,94

*4/*19 1 1 0,46 0 0

*11C/*11C 1 1 0,46 0 0

*14/*14 1 0 0 1 0,39

*14/*19 1 1 0,46 0 0

*30 ó 19B 3 1 0,46 2 0,78

Total 473 215 100 258 100

Como puede observarse, no hay diferencias relevantes salvo en los portadores del diplotipo

*4/*14, entre los que aparece una frecuencia de acetiladores rápidos 5 veces superior a la

de acetiladores lentos. Estos resultados pueden sugerir un efecto directo de la variante *14

en la actividad acetiladora, o bien una asociación (ligamiento) de la variante *14 con

variantes rápidas del gen NAT2.

En las siguientes tablas 28 y 29 se muestran los valores de estadística descriptiva de la

relación de los metabolitos de cafeína en orina (log AFMU/1X) y los valores de p de la

110

comparación entre los diferentes diplotipos NAT1. De nuevo llama la atención el efecto de

diplotipos que contienen la variante *14, que parece tender a fenotipos acetiladores más

rápidos con diferencias estadísticamente significativas (Tabla 29). Sin embargo existe un

individuo homocigoto para la variante *14 que presenta un fenotipo lento, lo que resta

probabilidad a la hipótesis de un efecto directo de la variante *14 en la actividad acetiladora

in vivo.

Tabla 28. Promedios ± SD, min, max e I.C. 95% del log AFMU según los diplotipos NAT1

Diplotipo n Media SD min max 95% CI

min

95% CI

max

*4/*4 402 -0,2163 0,39522 -1,15 0,76 -0,2551 -0,1776

*4/*11A ó B 22 -0,2268 0,40711 -0,68 0,41 -0,4073 -0,0463

*4/*11C 3 -0,5433 0,09387 -0,9472 -0,1395 -0,72 -0,40

*4/*14 27 0,0314 0,44874 -1,52 0,57 -0,1223 0,1851

*4/*15 6 -0,5050 0,22572 -0,66 0,06 -0,7419 -0,2681

*4/*17 6 -0,3700 0,36759 -0,66 0,32 -0,7558 0,0158

*4/*19 1 0,21 - - - - -

*11C/*11C 1 -0,03 - - - - -

*14/*14 1 -0,74 - - - - -

*14/*19 1 0,20 - - - -

*30 ó *19B 3 -0,30 0,60324 -0,80 0,37 -1,7985 1,1985

111

Tabla 29. Comparación T-test entre los diplotipos del gen NAT1 según los valores de log AFMU/1X

Genotipo NAT1 *4/*11AB *4/*11C *4/*14 *4/*15 *4/*17 *Lento/*Lento S.D.

*4/*4 0,907 0,068 0,001 0,025 0,345 0,887 0,716

*4/*11AB 0,045 0,028 0,044 0,444 0,859 0,784

*4/*11C 0,020 0,803 0,472 0,166 0,537

*4/*14 0,003 0,030 0,267 0,198

*4/*15 0,461 0,205 0,464

*4/*17 0,482 0,831

*Lento/*Lento 0,775

Valores inferiores a 0,05 indican diferencia estadística significativa.

Lento/Lento: NAT1*11C/*11C, NAT1*14/*14, NAT1*14/*19.

Nota: Se excluyeron del análisis los diplotipos con frecuencias inferiores a 2 (NAT1*4/*19).

4.2.2.3. Variación en el número de copias del gen NAT1 (CNV)

En la Tabla 30 se observa el número de copias del gen NAT1 según el diplotipo determinado

en la población de estudio. Las frecuencias de variaciones en el número de copias del gen

NAT1 son menores de las que presenta el gen NAT2. Solamente hay 9 participantes que

presentan variaciones CNVs (2,1%). En todos los casos los portadores de CNVs tenían al

menos un alelo *4.

112

Tabla 30. Frecuencias de CNV del gen NAT1 según el genotipo.

NAT1 Diplotipo

Número de copias gen

n 1 2 ≥3

*4/*4 357 6 349 2

*4/*11AB 21 0 20 1

*4/*11C 3 0 3 0

*4/*14 25 0 25 0

*4/*15 4 0 4 0

*4/*17 6 0 6 0

*4/*19 1 0 1 0

*14/*14 1 0 1 0

*14/*19 1 0 1 0

Total 419 6 410 3

En la Tabla 31 se presenta el efecto del número de copias sobre la relación log AFMU/1X.

Tabla 31. Valores de estadística descriptiva del log AFMU/1X según el número de copias del

gen (CNV) en grupos con distintos genotipos NAT1.

Genotipo

NAT1 CNV n Media SD min max

95% CI

min

95% CI

max

Rápidos

1 6 -0,2233 0,49955 -0,66 0,47 -0,7475 0,3009

2 349 -0,2102 0,38845 -0,96 0,76 -0,2511 -1693

≥3 2 -0,3100 0,43841 -0,62 0,0 -4,2489 3,6289

Intermedios

1 0 - - - - - -

2 59 -0,1345 0,41583 -0,72 0,52 -0,2431 0,0264

≥3 1 NA NA NA NA NA NA

Lentos

1 0 - - - - - -

2 2 -0,2700 0,66468 -0,74 0,20 -6,2419 5,7019

≥3 0 - - - - - -

Rápidos: NAT1*4/*4.

Intermedios: NAT1*4/*11AB, NAT1*4/*11C, NAT1*4/*14, NAT1*4/*15, NAT1*4/*17,

NAT1*4/*19

Lentos: NAT1*14/*19, NAT1*14/*14.

113

En la tabla 31 se observa que no existen diferencias en los valores de log AFMU/1X, que se

puedan relacionar con el número de copias del gen NAT1, según el fenotipo acetilador.

Estos datos sugieren que las copias son inactivas, al menos en el caso de los genotipos

NAT2 rápidos en donde se pudieron analizar, pues en los genotipos intermedios y lentos

sólo se presentaron 2 copias de cada gen.

4.3. Integración de los genotipos NAT1 y NAT2 sobre el metabolismo acetilador.

Aunque se asume que la capacidad acetiladora in vivo depende del genotipo NAT2,

resultados obtenidos en esta Tesis sugieren que determinadas variantes del gen NAT1

podrían influenciar la capacidad acetiladora de forma significativa. Por este motivo

procedimos a realizar un análisis combinado de los genotipos NAT1 y NAT2. Para este

análisis los genotipos de NAT2 se dividieron en las categorías de rápidos (NAT2*4/*4),

intermedios (NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7) y lentos (NAT2*5/*5, NAT2*5/6*,

NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7) y se analizaron en su relación con cada uno de los SNPs

de NAT1 rs56379106 (64 Arg/Trp), rs4987076 (149 Val/Ile), rs5030839 (187 Arg/Stop),

rs4986782 (187 Arg/Gln), rs4986783 (214 (Ser/Ala). De este análisis se excluyó el SNP

rs56318881, que sólo se presentó dos individuos heterocigotos.

En la Tabla 32 se observan los valores de estadísitica descriptiva de los valores de log

AFMU/1X para la relación de diplotipos NAT2 y SNPs del gen NAT1.

114

Tabla 32. Valores de estadística descriptiva del log AFMU/1X para la relación de diplotipos NAT2 y SNPs del gen NAT1.

Diplotipo NAT2

190C>>>>T rs56379106 64Arg/Trp

n Media SD min max 95% CI

min 95% CI

max

Rápidos C/C 37 0,2719 0,28481 -0,79 0,57 0,1769 0,3669 C/T 0 - - - - - -

Intermedios C/C 172 0,1420 0,19887 -0,60 0,76 0,1121 0,1720

C/T , T/T 2 0,2600 0,08485 0,20 0,32 -0,5024 1,0224

Lentos C/C 283 -0,5022 0,23908 -1,52 0,57 -0,5302 -0,4743 C/T 6 -0,5017 0,1425 -0,66 -0,27 -0,6541 -0,3492

NAT2 445G>>>>A

rs4987076 149Val/Ileu


min 95% CI

max

Rápidos G/G 35 0,2974 0,24411 -0,70 0,57 0,2136 0,3813 G/A 3 0,0067 0,57873 -0,66 0,38 -1,4310 1,4443

Intermedios G/G 170 0,1385 0,19839 -0,60 0,76 0,1085 0,1686 G/A 5 0,2740 0,10922 0,16 0,41 0,1384 0,4096

Lentos G/G 269 -0,5025 0,22528 -1,15 0,57 -0,5296 -0,4755 G/A 16 -0,4256 0,30524 -0,80 0,37 -0,5883 -0,2630

NAT2 559C>>>>T

rs5030839 187Arg/Stop


min 95% CI

max

Rápidos C/C 37 0,2665 0,28086 -0,70 0,56 0,1728 0,3601 C/T 0 - - - - - -

Intermedios C/C 175 0,1434 0,19797 -0,60 0,76 0,1139 0,1730 C/T 0 - - - - - -

Lentos C/C 247 -0,4838 0,23875 -1,52 0,57 -0,5137 -0,4538 C/T 6 -0,5050 0,22572 -0,66 -0,06 -0,7419 -0,2681

NAT2 560G>>>>A

rs4986782 187Arg/Gln


min 95% CI

max

Rápidos G/G 32 0,2444 0,29371 -0,70 0,56 0,1385 0,3503 G/A 5 0,4080 0,11167 0,27 0,52 0,2693 0,5467

Intermedio G/G 151 0,1470 0,19969 -0,60 0,76 0,1148 0,1791 G/A 20 0,1585 0,12119 -0,13 0,32 0,1018 0,21152

Lentos G/G 278 -0,4959 0,23839 -0,152 0,57 -0,5240 -0,4677

G/A, A/A 7 -0,6929 0,10484 -0,89 -0,59 -0,7898 -0,5959

NAT2 640T>>>>G

rs4986783 214Ser/Ala


min 95% CI

max

Rápidos T/T 33 0,2870 0,24641 -0,70 0,56 0,1996 0,3743 T/G 3 0,0067 0,57873 -0,66 0,38 -1,4310 1,4443

Intermedio T/T 167 0,1400 0,20049 -0,60 0,76 0,1094 0,1706 T/G 4 0,2500 0,10985 0,16 0,41 0,0752 0,4248

Lentos T/T 259 -0,5079 0,23562 -1,52 0,57 -0,5367 -0,4790

T/G, G/G 19 -0,4037 0,28860 -0,72 0,37 -0,5428 -0,2646 Rápidos: NAT2*4/*4; Intermedios: NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7. Lentos: NAT2*5/*5, NAT2*5/6*, NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7.

115

Como se observa en la tabla anterior, los SNPs de NAT1 rs56379106 (64 Arg/Trp),

rs4987076 (149 Val/Ile), rs5030839 (187 Arg/Stop), y rs4986783 (214 Ser/Ala), no tuvieron

efecto significativo en metabolismo acetilador, cuando estos SNP se estratificaron según el

genotipo acetilador de NAT2. De estos resultados se puede interpretar que los SNPs de

NAT1 en combinación con diplotipos NAT2 (clasificados como rápidos, intermedios y lentos)

analizados, no afectan significativamente el metabolismo acetilador de cafeína en esta

población de estudio.

El SNP rs4986782 (187 Arg/Gln; variante NAT1*14), no presentó efecto estadístico

significativo en la relación log AFMU/1X de metabolitos de cafeína en orina, en combinación

con los genotipos NAT2 acetiladores rápidos (p=0,231) e intermedios (p=0,801); sin

embargo cuando se analizó este mismo SNP en combinación con el genotipo NAT2

acetilador lento, si se observa una diferencia estadística significativa (p=0,03), como se

muestra en la siguiente figura.

116

Figura 36. Valores de media e I.C. 95% del log AFMU/1X según las comparaciones de diplotipos NAT2 y su combinación con el SNP rs4986782. NAT2 (R): NAT2*4/*4, NAT2 (I): NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7. NAT2 (L): NAT2*5/*5, NAT2*5/6*, NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7.

Aunque en el análisis aislado de la variante NAT1*14 parecía que se relacionaba con un

fenotipo acetilador más rápido, este efecto no se observa en los individuos con genotipos

acetiladores lentos del gen NAT2 en la figura 36, por lo que es poco probable un efecto

directo de la variante NAT1*14 sobre la capacidad acetiladora.

Para evaluar si los diplotipos del gen NAT2 combinados con los diplotipos del gen NAT1,

presentan efecto sobre el metabolismo de cafeína se realizó un análisis estadístico que no

mostró evidencias de que los diplotipos NAT1 intermedio o lento (que tuvieran al menos un

P=0,231

P=0,030

P=0,801

117

alelo mutado), combinados con los diplotipos NAT2, modificaran la capacidad acetiladora,

como se muestra en la figura 37.

Figura 37. Valores promedio e I.C. 95% del log AFMU/1X según el diplotipo de NAT2 rápidos, intermedios y lentos combinados con diplotipo NAT1 . NAT2R: NAT2*4/*4, NAT2 I: NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7. NAT2 L: NAT2*5/*5, NAT2*5/6*, NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7. NAT1R: NAT1*4/*4 NAT1 I ó L: Al menos un alelo NAT1*11A ó B, NAT1*11C, NAT1*14, NAT1*15, NAT1*17, NAT1*19.

En los anteriores resultados no se observan diferencias estadísticas significativas en la

capacidad acetiladora de acuerdo al efecto de las variantes de NAT1. Globalmente, estos

resultados indican que, en contra de las publicaciones que indicaban que las variaciones

P=0,283

P=0,651 P=0,806

118

genéticas de NAT1 podrían influenciar la capacidad acetiladora in vivo, basándose en la

superposición de sustratos de estas enzimas (ver el capítulo de introducción), en lo que se

refiere al metabolismo de cafeína no hay un efecto relevante de las variaciones en el gen

NAT1.

4.4. Genotipo Xantina oxidasa (Xantina deshidrogenasa).

La frecuencia de los SNPs en la región codificadora del gen Xantina Oxidasa (XO), que

producen sustituciones de aminoácidos y que se analizaron en la población de estudio se

muestran en la siguiente tabla. Debido a disponibilidad de las muestras de ADN, no todos

los participantes pudieron ser incluidos en el análisis.

Tabla 33. Frecuencia de SNP del gen XO en la población de estudio.

SNP Alelos Frecuencias Porcentaje

rs17323225

(646 Ile/Val)

G

A

915

27

97,14

2,86

rs17011368

(703 Ile/Val)

G

A

917

27

97,14

2,86

En la tabla 34 se presentan las frecuencias genotípicas de los SNPs analizados del gen XO

en la población de estudio.

119

Tabla 34 Frecuencias genotípicas de los SNPs del gen XO en la población de estudio.

SNP (Num rs) Aminoácido Frecuencia

observado

% Frecuencia

observado

% Frecuencia

esperada

Valor P

rs17323225

G/G

G/A

A/A

646 Ile/Ile

646 Ile/Val

646 Val/Val

445

25

1

94,48

5,31

0,21

94,27

5,52

0,21 0,313

rs17011368

G/G

G/A

A/A

703 Ile/Ile

703 Ile/Val

703 Val/Val

446

25

1

94,49

5,30

0,21

94,28

5,51

0,21 0,309

Los SNPs del gen XO, analizados en la población de estudio se encuentran en equilibrio de

Hardy-Weinberg y sin diferencia estadísticamente significativa con el modelo teórico.

La evaluación de los modelos de dominancia de los SNP del gen XO, con relación a los

metabolitos de cafeína en orina medida como log AFMU/1X, se observan en la tablas 35 y

36.

120

Tabla 35. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs17323225 (Ile/Val) del

gen XO según la relación con el Log AFMU/1X

SNP rs17323225 Genotipo n Log AFMU/1X ± SE P value AIC BIC

Codominante

G/G 445 -0,21 ± 0,02

0,74 481,8 498,5 G/A 25 -0,19 ± 0,09

A/A 1 -0,51

Dominante G/G 445 -0,21 ± 0,02

0,95 480,4 492,9 G/A, A/A 26 -0,21 ± 0,09

Recesivo G/G, G/A 470 -0, 21± 0,02

0,45 479,9 492,3 A/A 1 -0,51


0,83 480,4 492,9 G/A 25 -0,19 ± 0,09

Aditivo 0,94 480,4 492,9


Bayesiano.

Tabla 36. Probabilidad de ajuste a modelos dominancia para SNP rs17011368 (Ile/Val) del

gen XO según la relación con el Log AFMU/1X

SNP rs17011368 Genotipo n Log AFMU/1X ± SE P value AIC BIC

Codominante

G/G 446 -0,22 ± 0,02

0,62 485,9 502,5 G/A 25 -0,17 ± 0,08

A/A 1 -0,51

Dominante G/G 446 -0,22 ± 0,02

0,62 484,6 497,1 G/A, A/A 26 -0,18 ± 0,08

Recesivo G/G, G/A 471 -0,22 ± 0,02

0,47 484,3 496,8 A/A 1 -0,51


0,51 484,4 496,9 G/A 25 -0,17 ± 0,08

Aditivo 0,74 484,8 497,2


Bayesiano.

121

Los análisis de dominancia de ambos SNPs no se ajustaron a ningún modelo; por lo que se

puede asumir que no tienen efecto, por si solos, sobre el log AFMU/1X en orina en esta

población de estudio.

El análisis de desequilibrio de ligamiento estimó que estos dos SNPs rs17323225 y

rs17011368, presentaron valores D=0,025, D´=0,9229 y un valor de p=0,0001; es decir, que

estos dos SNPs están en claro desequilibrio de ligamiento. El análisis de haplotipos revela

que la población presenta 4 variantes alélicas para los dos SNPs analizados. En la tabla 37

se muestran los haplotipos y las frecuencias inferidas.

Tabla 37. Frecuencia de haplotipos para el gen XO (n=912 alelos)

Alelos rs17323225 rs17011368 Frec.

1 G G 97,01

2 A 0,21

3 A 0,21

4 A A 2,57

Total 100

4.4.1 Efecto de los diplotipos XO, y su combinación con el diplotipo NAT2, sobre el

metabolismo de cafeína in vivo.

Se analizaron las combinaciones de los genotipos XO (clasificados como no mutados y

mutados) y los diplotipos de NAT2, clasificados como rápidos (NAT2*4/*4), intermedios

(NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7) y lentos (NAT2*5/*5, NAT2*5/6*, NAT2*5/*7, NAT2*6/*6,

NAT2*6/*7), y su efecto sobre el log AFMU/1X de cafeína en orina. Los resultados se

muestran en la Tabla 38.

122

Tabla 38. Valores de estadística descriptiva del log AFMU/1X para la relación de diplotipos

NAT2 y algunos SNPs del gen XO.

Diplotipo

NAT2

Gentipo XO n Media SD min max 95% CI

min

95% CI

max

Rápidos No mutados 31 0,2765 0,30630 -0,70 0,57 0,1641 0,3888

Mutados 4 0,2800 0,04320 0,22 0,32 0,2113 0,3487

Intermedio No mutados 153 0,1441 0,18728 -0,60 0,76 0,1142 0,1740

Mutados 9 0,1411 0,26690 -0,46 0,37 -0,0640 0,3463

Lentos No mutados 244 -0,4972 0,23006 -1,52 0,57 -0,5262 -0,4682

Mutados 15 -0,5007 0,27199 -0,80 0,37 -0,6513 -0,3500

NAT2 Rápidos: NAT2*4/*4,

NAT2 Intermedios: NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7.

NAT2 Lentos: NAT2*5/*5, NAT2*5/6*, NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7.

XO No mutados: gen XO sin ningún alelo mutado.

XO Mutados: gen XO con al menos un alelo mutado.

En la figura 38 se muestran los valores promedio e I.C. 95% del log AFMU/1X según el

diplotipo de NAT2 (rápidos, intermedios y lentos) combinados con diplotipo XO. Además se

incluyen los valores de p de la comparación entre los diferenes grupos.

123

Figura 38. Valores promedio e I.C. 95% del log AFMU/1X según el diplotipo de NAT2

rápidos, intermedios y lentos combinados con diplotipo XO .

NAT2(R): NAT2*4/*4.

NAT2(I): NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7.

NAT2 (L): NAT2*5/*5, NAT2*5/6*, NAT2*5/*7, NAT2*6/*6, NAT2*6/*7.

XO (R): Sin ningún alelo mutado.

XO (L): Al menos un alelo mutado.

En estos resultados se observa la ausencia de un efecto significativo de los SNPs

analizados en el gen XO sobre el metabolismo acetilador medido con metabolitos de cafeína

in vivo.

P=0,982

P=0,964 P=0,956

124

5. DISCUSIÓN

125

El uso generalizado de los biomarcadores genéticos como criterios indirectos de valoración

para describir los riesgos, las exposiciones, los efectos de los tratamientos, y los

mecanismos biológicos de acción de los medicamentos es un objetivo largamente

perseguido en la investigación sanitaria. Los biomarcadores genéticos pueden ser utilizados

en la práctica clínica con fines diagnósticos, pronósticos, para la selección del tratamiento, el

ajuste de la dosis y/o el seguimiento de los pacientes. Podríamos definir estos

biomarcadores como una característica objetivamente medible y evaluable que se puede

utilizar como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patológicos o

respuestas farmacológicas frente a una intervención terapéutica. Estos biomarcadores

pueden ser de cinco tipos: mediciones fisiológicas, análisis de sangre y tejidos corporales,

datos genéticos, datos metabólicos, y mediciones obtenidas a partir de imágenes (Agúndez

et al., 2011). En los últimos años la evolución del análisis de los biomarcadores genéticos ha

pasado de estudiar la secuencia del genoma al estudio de la variabilidad interindividual en el

genoma. El desarrollo de estos biomarcadores genéticos para estratificar poblaciones de

pacientes (biomarcadores de selección) entre los que deben o no deben ser tratados con un

medicamento determinado, es uno de los principales instrumentos de la llamada "medicina

personalizada".

Hoy día, la identificación de nuevos biomarcadores es un elemento cada vez más importante

de la medicina predictiva, preventiva y personalizada. Sin embargo, hasta ahora sólo un

pequeño número de biomarcadores se utilizan rutinariamente en la práctica clínica. Hace

treinta años, cuando la farmacogenómica molecular comenzó a desarrollarse, existía la

esperanza de que los biomarcadores genéticos pronto se utilizarían rutinariamente en

tratamientos farmacológicos adaptados a cada paciente y para cada patología. Sin embargo

esta transformación en la práctica clínica habitual no se produjo ni tan rápido ni con la

126

intensidad inicialmente prevista. Actualmente disponemos de recomendaciones terapéuticas

basadas en marcadores farmacogenómicos para un número muy limitado de medicamentos

(alrededor de 1-2% de los medicamentos en el mercado). Estas recomendaciones caen, por

lo general, dentro de una de las siguientes categorías: "no se requiere ninguna acción,

seleccionar un medicamento alternativo, reducir la dosis en un porcentaje determinado, y/o

monitorizar la concentración plasmática”. Por ejemplo, para el tratamiento con fenitoína, se

recomienda reducir la dosis de mantenimiento en un 25% y 50% para los individuos

heterocigotos y homocigotos, respectivamente, de alelos lentos del gen CYP2C9. Aunque se

trata de una mejora sobre la situación anterior al desarrollo de la farmacogenómica,

deberíamos preguntarnos si clasificar a los pacientes en tres categorías, en lugar de una, es

una mejora suficiente.

El uso de cualquier test genético como un biomarcador de respuesta terapéutica o de riesgo

a desarrollar reacciones adversas, requiere la demostración previa de su validez analítica y

clínica, así como su utilidad clínica. El desarrollo de biomarcadores útiles en

farmacogenómica aún requiere un trabajo de investigación adicional para obtener algoritmos

más complejos con una capacidad de predicción mejor que la de clasificar a los pacientes

en metabolizadores rápidos, intermedios o lentos. En este refinamiento de la capacidad

predictiva de los test genéticos es el marco en el que se desarrolla esta Tesis. Se ha elegido

como modelo uno de los polimorfismos de enzimas metabolizadoras de fármacos más

estudiado y mejor conocido, y aún en este caso existen discrepancias entre los fenotipos

inferidos de los test genéticos y los fenotipos reales, así como una amplia variabilidad

interindividual entre los individuos que pertenecen a una determinada categoría según su

genotipo (acetiladores lentos o rápidos).

En esta Tesis nos hemos propuesto una reevaluación de factores genéticos que pueden

influenciar el fenotipo acetilador, siendo conscientes de que la genética es sólo una parte de

127

los factores que deben ser tenidos en cuenta para la predicción de un determinado fenotipo

o respuesta (Agúndez, 2011). Los factores genéticos seleccionados son los que derivan del

propio gen NAT2, tratando de establecer escalones intermedios, es decir, subgrupos entre

los acetiladores rápidos y entre los acetiladores lentos. Adicionalmente, dado que la enzima

NAT1 podría participar parcialmente en la acetilación de fármacos, hemos analizado el

efecto funcional de polimorfismos no sinónimos del gen NAT1. Finalmente, dado que el test

que se utiliza rutinariamente para evaluar la capacidad acetiladora in vivo se basa en las

proporciones de metabolitos de cafeína, hemos analizado si polimorfismos no sinónimos del

gen que codifica la xantino oxidas pueden estar distorsionando el metabolismo de cafeína,

falseando así las predicciones de cómo sería la acetilación de fármacos en cuyo

metabolismo no interviene la xantino oxidasa.

Los resultados obtenidos en este estudio permiten descartar un efecto significativo de los

polimorfismos de la xantino oxidasa en la acetilación de los metabolitos de cafeína, pero nos

han permitido describir las frecuencias de estos polimorfismos y su grado de asociación en

una población de origen caucásico. De forma similar, los resultados que hemos obtenido

acerca de los polimorfismos no sinónimos en el gen NAT1 nos permiten descartar un efecto

relevante en la capacidad acetiladora in vivo. Este es un aspecto controvertido que surgió

basándose en el solapamiento de las especificidades de sustrato de ambas enzimas y en

resultados de otros autores (ver el capítulo de introducción). El diseño de nuestro estudio, en

el que se analizan los efectos de los polimorfismos de NAT1 en distintos subgrupos de

individuos con genotipos NAT2 conocidos, y que además tiene un amplio tamaño muestral,

permite obtener resultados concluyentes en este sentido. Además hemos descrito dos

nuevas variantes alélicas en el gen NAT1 que no habían sido descritas previamente en el

ser humano. Ambas han sido aceptadas por el Comité Internacional de Nomenclatura y se

les ha asignado la denominación de NAT1*19B y NAT1*30.

128

Otro aspecto que no había sido analizado previamente por ningún otro grupo de

investigación es la existencia de variaciones en el número de copias de los genes NAT1 y

NAT2. Estas variaciones aparecen en otros genes que codifican enzimas metabolizadoras

de fármacos y xenobióticos, como CYP2D6, GSTM1 ó GSTT1. Nuestros resultados indican

que aproximadamente el 5% de la población presenta cambios en el número de copias de

NAT2 y aproximadamente el 2% presenta cambios en el número de copias de NAT1. El

cambio más frecuente en el caso de NAT2 es la duplicación o amplificación del gen (más de

3 copias) mientras que para NAT1 el más frecuente es la ausencia de uno de los genes (1

copia). La presencia de copias adicionales del gen NAT2 no muestra una asociación con

una mayor capacidad metabólica, por lo que asumimos que, a diferencia de lo que ocurre

con el gen CYP2D6 (Agundez et al., 1995b), las copias adicionales son copias no

funcionales del gen. Los cambios en el número de copias de NAT1 tampoco se asocian a

cambios en la capacidad acetiladora in vivo.

Cuando se analizó la relación entre los SNPs de NAT2 con la capacidad acetiladora medida,

se observó que los SNPs rs1801280 (114 Ile/Thr) y rs 1799930 (197 Arg/Gln) (los dos más

frecuentes en la población de estudio), presentaban un efecto codominante sobre el fenotipo

acetilador de cafeína; este modelo indica un efecto de dosis génica. Estos resultados

coinciden con estudios de expresión de las actividades de N-acetilación u O-acetilación

catalizada por NAT2 en hepatocitos humanos in vitro e in vivo (Doll et al., 2010; Meisel et al.,

2001) y en roedores (Ogolla et al., 1990).

Tradicionalmente los estudios de fenotipo y genotipo acetilador solamente han subdividido a

la población en dos grupos (acetiladores rápidos y lentos). Nuestros resultados indican de

forma inequívoca que existen dos categorías fenotipicas entre los acetiladores rápidos, y

que este grupo está compuesto en realidad de dos subgrupos: los portadores de dos genes

funcionales y los portadores de un solo gen completamente funcional. La actividad

acetiladora de estos subgrupos se ajusta a sendas campanas de Gauss que se solapan

129

parcialmente, pero que tienen valores medios e intervalos de confianza diferentes y que

muestran diferencias estadísticamente significativas. De modo que, en contra de la

tendencia general, nuestros resultados indican que debe utilizarse la categoría de acetilador

intermedio en los portadores de un genotipo heterocigoto con un solo gen completamente

funcional.

Entre los genotipos acetiladores lentos se encontraron diferencias estadística significativas

entre los diplotipos NAT2*5/*5 (SNP rs1801280) y NAT2*6/*6 (SNP rs1799930) (p=0,001);

siendo el diplotipo NAT2*6/*6, el que presentó una actividad enzimática más baja. Los

resultados obtenidos en esta Tesis permiten subdividir el grupo de acetiladores lentos en

varias categorías fenotípicas que, de nuevo se solapan, pero que se ajustan a diversas

campanas de Gauss y que presentan diferencias estadísticamente significativas. Estas tres

categorías, de mayor a menor actividad acetiladora, son las que corresponden a los

genotipos NAT2*5/*5, *5/*6 y *6/*6. Debido al origen étnico de la población de estudio, no

se ha podido analizar el efecto de las variantes *7 y *14 al corresponder mayoritariamente a

poblaciones de origen oriental y africano, respectivamente. Es necesario realizar estudios

adicionales con estas poblaciones para elucidar el efecto in vivo de estas variantes y

comprobar si permiten la asignación de una nueva categoría entre los acetiladores lentos

portadores de las mismas.

En resumen, nuestros resultados permiten incrementar la precisión de la capacidad

predictiva de la genotipación del polimorfismo acetilador, de dos categorías (acetiladores

rápidos y lentos) a cinco categorías diferentes (dos categorías rápidas y tres lentas). Nuestro

estudio, sin embargo, deja muchos interrogantes que serán analizados en trabajos futuros.

El más llamativo es la existencia de acetiladores rápidos entre individuos con genotipos

acetiladores lentos y viceversa. Hasta el momento los estudios de asociación entre fenotipo

y genotipo, incluido esta Tesis, se han basado tradicionalmente en el análisis de diversos

SNPs dejando el resto de los genes sin explorar. Este abordaje es el único que podía

130

hacerse, por limitaciones técnicas y económicas, para estudiar grandes grupos. Existe un

pequeño porcentaje de la población que presenta las citadas discrepancias y hasta el

momento, debido a que precisamente se trata de un porcentaje pequeño, no se han

realizado estudios con suficiente poder técnico y estadístico para determinar las causas de

estas discrepancias. Afortunadamente en la actualidad disponemos de procedimientos de

secuenciación de nueva generación que hemos utilizado para analizar otros genes (Borras

et al.), y con los que podemos abordar el estudio de estos casos.

Debemos enfatizar el hecho de que el grado de desarrollo y refinamiento predictivo de los

biomarcadores genéticos, como el que se ha realizado en esta Tesis, es un factor que

resulta decisivo en su aplicación clínica. Cuanto más precisa sea la predicción, mayor será

la probabilidad de que estos marcadores tengan un uso generalizado, superando las

dificultades inherentes a los aspectos éticos, legales y sociales. Pero además de los

polimorfismos y las variaciones en el número de copias, deben integrarse en los algoritmos

predictivos otros factores. En este sentido son factores particularmente relevantes aquellos

relacionados con la expresión y la regulación génica, es decir, el perfil transcriptómico del

paciente en el momento en el que se va a realizar el tratamiento, el fenoma del paciente

incluyendo datos clínicos que permiten incrementar el poder predictivo de los test genéticos

(Ladero et al., 2011) y el perfil metabólico del paciente con un determinado fármaco

(Agúndez, 2011). Cuando seamos capaces de integrar estos factores con marcadores

genéticos con una alta capacidad predictiva y capaces de discriminar con una alta precisión

y de forma reproducible diferentes subgrupos de pacientes, dispondremos de biomarcadores

que podrán ser utilizados en la rutina clínica.

131

6. CONCLUSIONES.

132

1.- El metabolismo acetilador in vivo, determinado utilizando cafeína como sustancia

prueba, se correlaciona en el 94% de la población de estudio con el genotipo del gen

NAT2, determinado por la presencia de los tres polimorfismos no sinónimos del gen

rs1801280, rs1799930 y rs1799931.

2.- De acuerdo al genotipo NAT2, los individuos pueden clasificarse en cinco grandes

categorías fenotípicas que, de mayor a menor actividad acetiladora, corresponden a los

genotipos NAT2*4/*4 (acetiladores rápidos), NAT2*4/*5 ó *6 (acetiladores intermedios),

NAT2*5/*5, NAT2*5/*6 y NAT2*6/*6 (acetiladores lentos). Cada uno de estos grupos

presenta actividades metabólicas diferentes de las de los demás grupos.

3.- Se ha observado la presencia de variaciones en el número de copias de los genes

NAT1 y NAT2 en el 2 y el 5%, respectivamente, de la población de estudio. Estas

variaciones no se asocian a cambios en la capacidad acetiladora.

4.- Se han descrito por primera vez dos nuevas variantes alélicas del gen NAT1. Una de

ellas consiste en la sustitución del aminoácido 149 (Val/Ile) de forma aislada. La otra es un

nuevo alelo que combina las variaciones presentes en los alelos NAT1*17 y NAT1*19.

5.- La presencia de los polimorfismos no sinónimos en el gen NAT1 que producen

sustituciones en los aminoácidos 64, 149, 187 ó 214, así como los que producen la

transcripción de proteínas truncadas en los aminoácidos 32 y 186, no inducen cambios

significativos en la actividad acetiladora in vivo de cafeína.

6.- El análisis de dos polimorfismos no sinónimos del gen de la xantino oxidasa indica que

estos polimorfismos aparecen en aproximadamente el 5% de individuos en la población de

estudio, que tienen un alto grado de ligamiento y que su presencia no modifica

significativamente el fenotipo acetilador determinado con cafeína.

133

7. BIBLIOGRAFÍA

134

Abe, M., Deguchi, T., Suzuki, T., 1993, The structure and characteristics of a fourth allele of

polymorphic N-acetyltransferase gene found in the Japanese population. Biochem

Biophys Res Commun 191, 811-816.

Agúndez, J., 2011, BEYOND PHARMACOGENOMICS: INTEGRATION OF ‘OMICS’ IN

ADVERSE DRUG REACTIONS. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 109 14-

31.

Agundez, J.A., 2003, NAT2 Genotyping: Equilibrium Between Accuracy and Feasibility in

Routine Analyses. The Journal of Applied Research 3, 5.

Agundez, J.A., 2008, N-acetyltransferases: lessons learned from eighty years of research.

Curr Drug Metab 9, 463-464.

Agúndez, J.A., 2008, Polymorphism of human N-acetyltransferases and cancer risk. Current

Drugs Metabolism 6, 520-531.

Agúndez, J.A., del Barrio, J., Padró, T., Stephens, C., Farré, M., Andrade, R.J., Badimon, L.,

García-Martín, E., Vilahur, G., Isabel., L.M., 2011, Trends in qualifying biomarkers in

drug safety. Consensus of the 2011 meeting of the Spanish Society of Clinical

Pharmacology. . Frontiers in Pharmacogenetics & Pharmacogenomics In press.

Agundez, J.A., Golka, K., Martinez, C., Selinski, S., Blaszkewicz, M., Garcia-Martin, E., 2008,

Unraveling ambiguous NAT2 genotyping data. Clinical chemistry 54, 1390-1394.

Agundez, J.A., Ladero, J.M., Olivera, M., Abildua, R., Roman, J.M., Benitez, J., 1995a,

Genetic analysis of the arylamine N-acetyltransferase polymorphism in breast cancer

patients. Oncology 52, 7-11.

Agundez, J.A., Ledesma, M.C., Ladero, J.M., Benitez, J., 1995b, Prevalence of CYP2D6

gene duplication and its repercussion on the oxidative phenotype in a white

population. Clin Pharmacol Ther 57, 265-269.

135

Agundez, J.A., Martinez, C., Olivera, M., Ledesma, M.C., Ladero, J.M., Benitez, J., 1994,

Molecular analysis of the arylamine N-acetyltransferase polymorphism in a Spanish

population. Clin Pharmacol Ther 56, 202-209.

Agundez, J.A., Olivera, M., Ladero, J.M., Rodriguez-Lescure, A., Ledesma, M.C., Diaz-

Rubio, M., Meyer, U.A., Benitez, J., 1996a, Increased risk for hepatocellular

carcinoma in NAT2-slow acetylators and CYP2D6-rapid metabolizers.

Pharmacogenetics 6, 501-512.

Agundez, J.A., Olivera, M., Martinez, C., Ladero, J.M., Benitez, J., 1996b, Identification and

prevalence study of 17 allelic variants of the human NAT2 gene in a white population.


Ambrosone, C.B., Kropp, S., Yang, J., Yao, S., Shields, P.G., Chang-Claude, J., 2008,

Cigarette smoking, N-acetyltransferase 2 genotypes, and breast cancer risk: pooled

analysis and meta-analysis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 17, 15-26.

Andres, H.H., Klem, A.J., Schopfer, L.M., Harrison, J.K., Weber, W.W., 1988, On the active

site of liver acetyl-CoA. Arylamine N-acetyltransferase from rapid acetylator rabbits

(III/J). J Biol Chem 263, 7521-7527.

Anitha, A., Banerjee, M., 2003, Arylamine N-acetyltransferase 2 polymorphism in the ethnic

populations of South India. Int J Mol Med 11, 125-131.

Autrup, H., 2000, Genetic polymorphisms in human xenobiotica metabolizing enzymes as

susceptibility factors in toxic response. Mutat Res 464, 65-76.

Badawi, A.F., Hirvonen, A., Bell, D.A., Lang, N.P., Kadlubar, F.F., 1995, Role of aromatic

amine acetyltransferases, NAT1 and NAT2, in carcinogen-DNA adduct formation in

the human urinary bladder. Cancer Res 55, 5230-5237.

Bell, D.A., Badawi, A.F., Lang, N.P., Ilett, K.F., Kadlubar, F.F., Hirvonen, A., 1995,

Polymorphism in the N-acetyltransferase 1 (NAT1) polyadenylation signal:

136

association of NAT1*10 allele with higher N-acetylation activity in bladder and colon

tissue. Cancer Res 55, 5226-5229.

Bell, D.A., Taylor, J.A., Butler, M.A., Stephens, E.A., Wiest, J., Brubaker, L.H., Kadlubar,

F.F., Lucier, G.W., 1993, Genotype/phenotype discordance for human arylamine N-

acetyltransferase (NAT2) reveals a new slow-acetylator allele common in African-

Americans. Carcinogenesis 14, 1689-1692.

Bergstrom, C.P., Wagner, C.R., Ann, D.K., Hanna, P.E., 1995, Hamster monomorphic

arylamine N-acetyltransferase: expression in Escherichia coli and purification. Protein

Expr Purif 6, 45-55.

Blum, M., Demierre, A., Grant, D.M., Heim, M., Meyer, U.A., 1991, Molecular mechanism of

slow acetylation of drugs and carcinogens in humans. Proc Natl Acad Sci U S A 88,

5237-5241.

Blum, M., Grant, D.M., Demierre, A., Meyer, U.A., 1989, N-acetylation pharmacogenetics: a

gene deletion causes absence of arylamine N-acetyltransferase in liver of slow

acetylator rabbits. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 9554-9557.

Blum, M., Grant, D.M., McBride, W., Heim, M., Meyer, U.A., 1990, Human arylamine N-

acetyltransferase genes: isolation, chromosomal localization, and functional

expression. DNA Cell Biol 9, 193-203.

Bolt, H.M., Selinski, S., Dannappel, D., Blaszkewicz, M., Golka, K., 2005, Re-investigation of

the concordance of human NAT2 phenotypes and genotypes. Arch Toxicol 79, 196-

200.

Bonicke, R., Reif, W., 1953, [Enzymatic inactivation of isonicotinic acid hydrizide in human

and animal organism.]. Naunyn-Schmiedebergs Archiv fur experimentelle Pathologie

und Pharmakologie 220, 321-323.

Borlak, J., Reamon-Buettner, S.M., 2006, N-acetyltransferase 2 (NAT2) gene polymorphisms

in colon and lung cancer patients. BMC medical genetics 7, 58.

137

Borras, E., Jurado, I., Hernan, I., Gamundi, M.J., Dias, M., Marti, I., Mane, B., Arcusa, A.,

Agundez, J.A., Blanca, M., Carballo, M., Clinical pharmacogenomic testing of KRAS,

BRAF and EGFR mutations by high resolution melting analysis and ultra-deep

pyrosequencing. BMC cancer 11, 406.

Bouchardy, C., Mitrunen, K., Wikman, H., Husgafvel-Pursiainen, K., Dayer, P., Benhamou,

S., Hirvonen, A., 1998, N-acetyltransferase NAT1 and NAT2 genotypes and lung

cancer risk. Pharmacogenetics 8, 291-298.

Bruhn, C., Brockmoller, J., Cascorbi, I., Roots, I., Borchert, H.H., 1999, Correlation between

genotype and phenotype of the human arylamine N-acetyltransferase type 1 (NAT1).

Biochem Pharmacol 58, 1759-1764.

Butcher, N.J., Arulpragasam, A., Goh, H.L., Davey, T., Minchin, R.F., 2005, Genomic

organization of human arylamine N-acetyltransferase Type I reveals alternative

promoters that generate different 5'-UTR splice variants with altered translational

activities. Biochem J 387, 119-127.

Butcher, N.J., Arulpragasam, A., Minchin, R.F., 2004, Proteasomal degradation of N-

acetyltransferase 1 is prevented by acetylation of the active site cysteine: a

mechanism for the slow acetylator phenotype and substrate-dependent down-

regulation. J Biol Chem 279, 22131-22137.

Butcher, N.J., Boukouvala, S., Sim, E., Minchin, R.F., 2002, Pharmacogenetics of the

arylamine N-acetyltransferases. Pharmacogenomics J 2, 30-42.

Butcher, N.J., Ilett, K.F., Minchin, R.F., 1998, Functional polymorphism of the human

arylamine N-acetyltransferase type 1 gene caused by C190T and G560A mutations.


Butcher, N.J., Ilett, K.F., Minchin, R.F., 2000, Substrate-dependent regulation of human

arylamine N-acetyltransferase-1 in cultured cells. Mol Pharmacol 57, 468-473.

138

Butler, L.M., Millikan, R.C., Sinha, R., Keku, T.O., Winkel, S., Harlan, B., Eaton, A.,

Gammon, M.D., Sandler, R.S., 2008, Modification by N-acetyltransferase 1 genotype

on the association between dietary heterocyclic amines and colon cancer in a

multiethnic study. Mutat Res 638, 162-174.

Butler, M.A., Lang, N.P., Young, J.F., Caporaso, N.E., Vineis, P., Hayes, R.B., Teitel, C.H.,

Massengill, J.P., Lawsen, M.F., Kadlubar, F.F., 1992, Determination of CYP1A2 and

NAT2 phenotypes in human populations by analysis of caffeine urinary metabolites.


Carreon, T., Ruder, A.M., Schulte, P.A., Hayes, R.B., Rothman, N., Waters, M., Grant, D.J.,

Boissy, R., Bell, D.A., Kadlubar, F.F., Hemstreet, G.P., 3rd, Yin, S., LeMasters, G.K.,

2006, NAT2 slow acetylation and bladder cancer in workers exposed to benzidine. Int

J Cancer 118, 161-168.

Cascorbi I, Roots I, J., B. 2000. Homo sapiens arylamine N-acetyltransferase 1 (NAT1) gene,

NAT1*11C allele. In complete cds. Genbank AF308866.

Cascorbi, I., Brockmoller, J., Bauer, S., Reum, T., Roots, I., 1996, NAT2*12A (803A-->G)

codes for rapid arylamine n-acetylation in humans. Pharmacogenetics 6, 257-259.

Cascorbi, I., Drakoulis, N., Brockmoller, J., Maurer, A., Sperling, K., Roots, I., 1995,

Arylamine N-acetyltransferase (NAT2) mutations and their allelic linkage in unrelated

Caucasian individuals: correlation with phenotypic activity. Am J Hum Genet 57, 581-

592.

Cascorbi, I., Roots, I., Brockmoller, J., 2001, Association of NAT1 and NAT2 polymorphisms

to urinary bladder cancer: significantly reduced risk in subjects with NAT1*10. Cancer

Res 61, 5051-5056.

Conlon, M.S., Johnson, K.C., Bewick, M.A., Lafrenie, R.M., Donner, A., 2010, Smoking

(active and passive), N-acetyltransferase 2, and risk of breast cancer. Cancer

epidemiology 34, 142-149.

139

Cornish, V.A., Pinter, K., Boukouvala, S., Johnson, N., Labrousse, C., Payton, M., Priddle,

H., Smith, A.J., Sim, E., 2003, Generation and analysis of mice with a targeted

disruption of the arylamine N-acetyltransferase type 2 gene. Pharmacogenomics J 3,

169-177.

Covolo, L., Placidi, D., Gelatti, U., Carta, A., Scotto Di Carlo, A., Lodetti, P., Picciche, A.,

Orizio, G., Campagna, M., Arici, C., Porru, S., 2008, Bladder cancer, GSTs, NAT1,

NAT2, SULT1A1, XRCC1, XRCC3, XPD genetic polymorphisms and coffee

consumption: a case-control study. Eur J Epidemiol 23, 355-362.

Cribb, A.E., Isbrucker, R., Levatte, T., Tsui, B., Gillespie, C.T., Renton, K.W., 1994,

Acetylator phenotyping: the urinary caffeine metabolite ratio in slow acetylators

correlates with a marker of systemic NAT1 activity. Pharmacogenetics 4, 166-170.

Chatzimichalis, M., Xenellis, J., Tzagaroulakis, A., Sarof, P., Banis, K., Gazouli, M., Bibas,

A., 2010, GSTT1, GSTM1, GSTM3 and NAT2 polymorphisms in laryngeal squamous

cell carcinoma in a Greek population. The Journal of laryngology and otology 124, 5.

Chauhan, N. 2010. New Haplotype NAT2 (Gujarat, India, , National Institute of

Pharmaceutical Education and Research (NIPER) - Ahmedabad, B. V. Patel

Pharmaceutical Education and Research Development (PERD) Centre,).

Chen K, Jiang QT, HQ., H., 2005, Relationship between metabolic enzyme polymorphism

and colorectal cancer. World J Gastroenterol. 11, 331-335.

da Silva, T.D., Felipe, A.V., de Lima, J.M., Oshima, C.T., Forones, N.M., N-Acetyltransferase

2 genetic polymorphisms and risk of colorectal cancer. World J Gastroenterol 17,

760-765.

Daly, A.K., Cholerton, S., Armstrong, M., Idle, J.R., 1994, Genotyping for polymorphisms in

xenobiotic metabolism as a predictor of disease susceptibility. Environ Health

Perspect 102 Suppl 9, 55-61.

140

Dandara, C., Masimirembwa, C.M., Magimba, A., Kaaya, S., Sayi, J., Sommers, D.K.,

Snyman, J.R., Hasler, J.A., 2003, Arylamine N-acetyltransferase (NAT2) genotypes in

Africans: the identification of a new allele with nucleotide changes 481C>T and

590G>A. Pharmacogenetics 13, 55-58.

de Leon, J.H., Vatsis, K.P., Weber, W.W., 2000, Characterization of naturally occurring and

recombinant human N-acetyltransferase variants encoded by NAT1. Mol Pharmacol

58, 288-299.

Deguchi, T., 1992, Sequences and expression of alleles of polymorphic arylamine N-

acetyltransferase of human liver. J Biol Chem 267, 18140-18147.

Deitz AC, Doll MA, Fretland AJ, DW., H. 1997a. Homo sapiens N-acetyltransferase NAT1

(allele NAT1*18A) gene. In complete cds. Genbank AF032677, 1997.

Deitz AC, Doll MA, Fretland AJ, DW., H. 1997b. Homo sapiens N-acetyltransferase NAT1

(allele NAT1*18B) gene. In complete cds. Genbank AF032678, 1997.

Deitz AC, Fretland AJ, Leff MA, Doll MA, DW, H. 1998a. Homo sapiens N-acetyltransferase-

1 (NAT1) gene, NAT1*26B allele. In complete cds. Genbank AF067408.

Deitz AC, Fretland AJ, Leff MA, DW., H. 1998b. Homo sapiens N-acetyltransferase-1 (NAT1)

gene, NAT1*26A allele. In complete cds. Genbank AF071552.

Deitz, A.C., Zheng, W., Leff, M.A., Gross, M., Wen, W.Q., Doll, M.A., Xiao, G.H., Folsom,

A.R., Hein, D.W., 2000, N-Acetyltransferase-2 genetic polymorphism, well-done meat

intake, and breast cancer risk among postmenopausal women. Cancer Epidemiol

Biomarkers Prev 9, 905-910.

Delomenie, C., Sica, L., Grant, D.M., Krishnamoorthy, R., Dupret, J.M., 1996, Genotyping of

the polymorphic N-acetyltransferase (NAT2*) gene locus in two native African

populations. Pharmacogenetics 6, 177-185.

141

Demokan, S., Suoglu, Y., Gozeler, M., Demir, D., Dalay, N., 2010, N-acetyltransferase 1 and

2 gene sequence variants and risk of head and neck cancer. Molecular biology

reports 37, 3217-3226.

Doll, M.A., Jiang, W., Deitz, A.C., Rustan, T.D., Hein, D.W., 1997, Identification of a novel

allele at the human NAT1 acetyltransferase locus. Biochem Biophys Res Commun

233, 584-591.

Doll, M.A., Zang, Y., Moeller, T., Hein, D.W., 2010, Codominant expression of N-acetylation

and O-acetylation activities catalyzed by N-acetyltransferase 2 in human hepatocytes.

J Pharmacol Exp Ther 334, 540-544.

Dong, L.M., Potter, J.D., White, E., Ulrich, C.M., Cardon, L.R., Peters, U., 2008, Genetic

susceptibility to cancer: the role of polymorphisms in candidate genes. Jama 299,

2423-2436.

Dupret, J.M., Grant, D.M., 1992, Site-directed mutagenesis of recombinant human arylamine

N-acetyltransferase expressed in Escherichia coli. Evidence for direct involvement of

Cys68 in the catalytic mechanism of polymorphic human NAT2. J Biol Chem 267,

7381-7385.

Ebisawa, T., Deguchi, T., 1991, Structure and restriction fragment length polymorphism of

genes for human liver arylamine N-acetyltransferases. Biochem Biophys Res

Commun 177, 1252-1257.

Evans, D.A., Manley, K.A., Mc, K.V., 1960a, Genetic control of isoniazid metabolism in man.

British medical journal 2, 485-491.

Evans, D.A., Storey, P.B., Wittstadt, F.B., Manley, K.A., 1960b, The determination of the

isoniazid inactivator phenotype. The American review of respiratory disease 82, 853-

861.

142

Excoffier, L., Lischer, H.E.L., 2010, Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to

perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology

Resources. In press. .

Ferguson, R.J., Doll, M.A., Rustan, T.D., Gray, K., Hein, D.W., 1994, Cloning, expression,

and functional characterization of two mutant (NAT2(191) and NAT2(341/803)) and

wild-type human polymorphic N-acetyltransferase (NAT2) alleles. Drug Metab Dispos

22, 371-376.

Fontana, L., Delort, L., Joumard, L., Rabiau, N., Bosviel, R., Satih, S., Guy, L., Boiteux, J.P.,

Bignon, Y.J., Chamoux, A., Bernard-Gallon, D.J., 2009, Genetic polymorphisms in

CYP1A1, CYP1B1, COMT, GSTP1 and NAT2 genes and association with bladder

cancer risk in a French cohort. Anticancer Res 29, 1631-1635.

Frazier, M.L., O'Donnell, F.T., Kong, S., Gu, X., Campos, I., Luthra, R., Lynch, P.M., Amos,

C.I., 2001, Age-associated risk of cancer among individuals with N-acetyltransferase

2 (NAT2) mutations and mutations in DNA mismatch repair genes. Cancer Res 61,

1269-1271.

Fretland, A.J., Devanaboyina, U.S., Doll, M.A., Zhao, S., Xiao, G.H., Hein, D.W., 2003,

Metabolic activation of 2-hydroxyamino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine in

Syrian hamsters congenic at the N-acetyltransferase 2 (NAT2) locus. Toxicol Sci 74,

253-259.

Fretland, A.J., Doll, M.A., Leff, M.A., Hein, D.W., 2001a, Functional characterization of

nucleotide polymorphisms in the coding region of N-acetyltransferase 1.


Fretland, A.J., Leff, M.A., Doll, M.A., Hein, D.W., 2001b, Functional characterization of

human N-acetyltransferase 2 (NAT2) single nucleotide polymorphisms.


143

Fronhoffs, S., Bruning, T., Ortiz-Pallardo, E., Brode, P., Koch, B., Harth, V., Sachinidis, A.,

Bolt, H.M., Herberhold, C., Vetter, H., Ko, Y., 2001, Real-time PCR analysis of the N-

acetyltransferase NAT1 allele *3, *4, *10, *11, *14 and *17 polymorphism in

squamous cell cancer of head and neck. Carcinogenesis 22, 1405-1412.

Garcia-Closas, M., Malats, N., Silverman, D., Dosemeci, M., Kogevinas, M., Hein, D.W.,

Tardon, A., Serra, C., Carrato, A., Garcia-Closas, R., Lloreta, J., Castano-Vinyals, G.,

Yeager, M., Welch, R., Chanock, S., Chatterjee, N., Wacholder, S., Samanic, C.,

Tora, M., Fernandez, F., Real, F.X., Rothman, N., 2005, NAT2 slow acetylation,

GSTM1 null genotype, and risk of bladder cancer: results from the Spanish Bladder

Cancer Study and meta-analyses. Lancet 366, 649-659.

Garcia-Martin, E., 2008, Interethnic and intraethnic variability of NAT2 single nucleotide

polymorphisms. Curr Drug Metab 9, 487-497.

Gemignani, F., Landi, S., Szeszenia-Dabrowska, N., Zaridze, D., Lissowska, J., Rudnai, P.,

Fabianova, E., Mates, D., Foretova, L., Janout, V., Bencko, V., Gaborieau, V., Gioia-

Patricola, L., Bellini, I., Barale, R., Canzian, F., Hall, J., Boffetta, P., Hung, R.J.,

Brennan, P., 2007, Development of lung cancer before the age of 50: the role of

xenobiotic metabolizing genes. Carcinogenesis 28, 1287-1293.

Gertig, D.M., Hankinson, S.E., Hough, H., Spiegelman, D., Colditz, G.A., Willett, W.C.,

Kelsey, K.T., Hunter, D.J., 1999, N-acetyl transferase 2 genotypes, meat intake and

breast cancer risk. Int J Cancer 80, 13-17.

Gil, J.P., Lechner, M.C., 1998, Increased frequency of wild-type arylamine-N-

acetyltransferase allele NAT2*4 homozygotes in Portuguese patients with colorectal

cancer. Carcinogenesis 19, 37-41.

Gonzalez, M.V., Alvarez, V., Pello, M.F., Menendez, M.J., Suarez, C., Coto, E., 1998,

Genetic polymorphism of N-acetyltransferase-2, glutathione S-transferase-M1, and

144

cytochromes P450IIE1 and P450IID6 in the susceptibility to head and neck cancer. J

Clin Pathol 51, 294-298.

Goodfellow, G.H., Dupret, J.M., Grant, D.M., 2000, Identification of amino acids imparting

acceptor substrate selectivity to human arylamine acetyltransferases NAT1 and

NAT2. Biochem J 348 Pt 1, 159-166.

Grant, D.M., 2008, Structures of human arylamine N-acetyltransferases. Curr Drug Metab 9,

465-470.

Grant, D.M., Blum, M., Beer, M., Meyer, U.A., 1991, Monomorphic and polymorphic human

arylamine N-acetyltransferases: a comparison of liver isozymes and expressed

products of two cloned genes. Mol Pharmacol 39, 184-191.

Grant, D.M., Hughes, N.C., Janezic, S.A., Goodfellow, G.H., Chen, H.J., Gaedigk, A., Yu,

V.L., Grewal, R., 1997, Human acetyltransferase polymorphisms. Mutat Res 376, 61-

70.

Grant, D.M., Lottspeich, F., Meyer, U.A., 1989, Evidence for two closely related isozymes of

arylamine N-acetyltransferase in human liver. FEBS Lett 244, 203-207.

Grant, D.M., Tang, B.K., Kalow, W., 1984, A simple test for acetylator phenotype using

caffeine. Br J Clin Pharmacol 17, 459-464.

Grant, D.M., Tang, B.K., Kalow, W., 2004, A simple test for acetylator phenotype using

caffeine. 1984. Br J Clin Pharmacol 58, S788-793; discussion S794-785.

Gross, M., Kruisselbrink, T., Anderson, K., Lang, N., McGovern, P., Delongchamp, R.,

Kadlubar, F., 1999, Distribution and concordance of N-acetyltransferase genotype

and phenotype in an American population. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 8,

683-692.

Gu, J., Liang, D., Wang, Y., Lu, C., Wu, X., 2005, Effects of N-acetyl transferase 1 and 2

polymorphisms on bladder cancer risk in Caucasians. Mutat Res 581, 97-104.

145

Habalova, V., Salagovic, J., Kalina, I., Stubna, J., 2005, A pilot study testing the genetic

polymorphism of N-acetyltransferase 2 as a risk factor in lung cancer. Neoplasma 52,

364-368.

Hayes, R.B., Bi, W., Rothman, N., Broly, F., Caporaso, N., Feng, P., You, X., Yin, S.,

Woosley, R.L., Meyer, U.A., 1993, N-acetylation phenotype and genotype and risk of

bladder cancer in benzidine-exposed workers. Carcinogenesis 14, 675-678.

Hein, D., Doll, M., 2007. Enzymatic characterization of novel human NAT2 alleles. . In:

Fourth International Workshop on the Arylamine N-acetyltransferases,,

Alexandroupolis, Greece.

Hein David W, Sim Edith , Boukouvala Sotiria , Gran Denis M. t, Minchin Rodney F 2000.

Consensus Human Arylamine N-Acetyltransferase Gene Nomenclature

Hein, D.W., 2002, Molecular genetics and function of NAT1 and NAT2: role in aromatic

amine metabolism and carcinogenesis. Mutat Res 506-507, 65-77.

Hein, D.W., 2006, N-acetyltransferase 2 genetic polymorphism: effects of carcinogen and

haplotype on urinary bladder cancer risk. Oncogene 25, 1649-1658.

Hein, D.W., Doll, M.A., Fretland, A.J., Leff, M.A., Webb, S.J., Xiao, G.H., Devanaboyina,

U.S., Nangju, N.A., Feng, Y., 2000a, Molecular genetics and epidemiology of the

NAT1 and NAT2 acetylation polymorphisms. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 9,

29-42.

Hein, D.W., Doll, M.A., Rustan, T.D., Ferguson, R.J., 1995, Metabolic activation of N-

hydroxyarylamines and N-hydroxyarylamides by 16 recombinant human NAT2

allozymes: effects of 7 specific NAT2 nucleic acid substitutions. Cancer Res 55,

3531-3536.

Hein, D.W., Ferguson, R.J., Doll, M.A., Rustan, T.D., Gray, K., 1994, Molecular genetics of

human polymorphic N-acetyltransferase: enzymatic analysis of 15 recombinant wild-

type, mutant, and chimeric NAT2 allozymes. Hum Mol Genet 3, 729-734.

146

Hein, D.W., Fretland, A.J., Doll, M.A., 2006, Effects of single nucleotide polymorphisms in

human N-acetyltransferase 2 on metabolic activation (O-acetylation) of heterocyclic

amine carcinogens. Int J Cancer 119, 1208-1211.

Hein, D.W., Grant, D.M., Sim, E., 2000b, Update on consensus arylamine N-

acetyltransferase gene nomenclature. Pharmacogenetics 10, 291-292.

Hein, D.W., McQueen, C.A., Grant, D.M., Goodfellow, G.H., Kadlubar, F.F., Weber, W.W.,

2000c, Pharmacogenetics of the arylamine N-acetyltransferases: a symposium in

honor of Wendell W. Weber. Drug Metab Dispos 28, 1425-1432.

Henning, S., Cascorbi, I., Munchow, B., Jahnke, V., Roots, I., 1999, Association of arylamine

N-acetyltransferases NAT1 and NAT2 genotypes to laryngeal cancer risk.


Hickman, D., Palamanda, J.R., Unadkat, J.D., Sim, E., 1995, Enzyme kinetic properties of

human recombinant arylamine N-acetyltransferase 2 allotypic variants expressed in

Escherichia coli. Biochem Pharmacol 50, 697-703.

Hickman, D., Risch, A., Camilleri, J.P., Sim, E., 1992, Genotyping human polymorphic

arylamine N-acetyltransferase: identification of new slow allotypic variants.


Hickman, D., Sim, E., 1991, N-acetyltransferase polymorphism. Comparison of phenotype

and genotype in humans. Biochem Pharmacol 42, 1007-1014.

Hou, S.M., Falt, S., Yang, K., Nyberg, F., Pershagen, G., Hemminki, K., Lambert, B., 2001,

Differential interactions between GSTM1 and NAT2 genotypes on aromatic DNA

adduct level and HPRT mutant frequency in lung cancer patients and population

controls. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10, 133-140.

Hou, S.M., Ryberg, D., Falt, S., Deverill, A., Tefre, T., Borresen, A.L., Haugen, A., Lambert,

B., 2000, GSTM1 and NAT2 polymorphisms in operable and non-operable lung

cancer patients. Carcinogenesis 21, 49-54.

147

Houlston, R.S., Tomlinson, I.P., 2001, Polymorphisms and colorectal tumor risk.

Gastroenterology 121, 282-301.

Hsieh, F.I., Pu, Y.S., Chern, H.D., Hsu, L.I., Chiou, H.Y., Chen, C.J., 1999, Genetic

polymorphisms of N-acetyltransferase 1 and 2 and risk of cigarette smoking-related

bladder cancer. Br J Cancer 81, 537-541.

Huang, C.C., Chien, W.P., Wong, R.H., Cheng, Y.W., Chen, M.C., Chou, M.C., Lee, H.,

2007, NAT2 fast acetylator genotype is associated with an increased risk of colorectal

cancer in Taiwan. Diseases of the colon and rectum 50, 981-989.

Huang, C.C., Chien, W.P., Wong, R.H., Cheng, Y.W., Chen, M.C., Lee, H., 2009, NAT2 fast

acetylator genotype and MGMT promoter methylation may contribute to gender

difference in K-RAS mutation occurrence in Taiwanese colorectal cancer. Environ

Mol Mutagen 50, 127-133.

Huang, Y.S., Chern, H.D., Su, W.J., Wu, J.C., Lai, S.L., Yang, S.Y., Chang, F.Y., Lee, S.D.,

2002, Polymorphism of the N-acetyltransferase 2 gene as a susceptibility risk factor

for antituberculosis drug-induced hepatitis. Hepatology 35, 883-889.

Hubbard, A.L., Moyes, C., Wyllie, A.H., Smith, C.A., Harrison, D.J., 1998, N-acetyl

transferase 1: two polymorphisms in coding sequence identified in colorectal cancer

patients. Br J Cancer 77, 913-916.

Hughes, H.B., Biehl, J.P., Jones, A.P., Schmidt, L.H., 1954, Metabolism of isoniazid in man

as related to the occurrence of peripheral neuritis. American review of tuberculosis

70, 266-273.

Hughes, N.C., Janezic, S.A., McQueen, K.L., Jewett, M.A., Castranio, T., Bell, D.A., Grant,

D.M., 1998, Identification and characterization of variant alleles of human

acetyltransferase NAT1 with defective function using p-aminosalicylate as an in-vivo

and in-vitro probe. Pharmacogenetics 8, 55-66.

148

Husain, A., Barker, D.F., States, J.C., Doll, M.A., Hein, D.W., 2004, Identification of the major

promoter and non-coding exons of the human arylamine N-acetyltransferase 1 gene

(NAT1). Pharmacogenetics 14, 397-406.

Ilett, K.F., David, B.M., Detchon, P., Castleden, W.M., Kwa, R., 1987, Acetylation phenotype

in colorectal carcinoma. Cancer Res 47, 1466-1469.

Ilett, K.F., Kadlubar, F.F., Minchin, R.F., 1999, 1998 International Meeting on the Arylamine

N-Acetyltransferases: synopsis of the workshop on nomenclature, biochemistry,

molecular biology, interspecies comparisons, and role in human disease risk. Drug

Metab Dispos 27, 957-959.

Jaffe, M., Cohn, R., 1887, Ber.dtsch.Chem.Ges. 20, 1.

Jaskula-Sztul, R., Sokolowski, W., Gajecka, M., Szyfter, K., 2001, Association of arylamine

N-acetyltransferase (NAT1 and NAT2) genotypes with urinary bladder cancer risk.

Journal of applied genetics 42, 223-231.

Jennne, J.W., 1965, Partial purification and properties of the isoniazid transacetylase in

human liver. Its relationship to the acetylation of p-aminosalicylic acid. J Clin Invest

44, 1992-2002.

Johns, L.E., Houlston, R.S., 2000, N-acetyl transferase-2 and bladder cancer risk: a meta-

analysis. Environ Mol Mutagen 36, 221-227.

Johnson, N., Bell, P., Jonovska, V., Budge, M., Sim, E., 2004, NAT gene polymorphisms and

susceptibility to Alzheimer's disease: identification of a novel NAT1 allelic variant.

BMC medical genetics 5, 6.

Kashuba, A.D., Bertino, J.S., Jr., Kearns, G.L., Leeder, J.S., James, A.W., Gotschall, R.,

Nafziger, A.N., 1998, Quantitation of three-month intraindividual variability and

influence of sex and menstrual cycle phase on CYP1A2, N-acetyltransferase-2, and

xanthine oxidase activity determined with caffeine phenotyping. Clin Pharmacol Ther

63, 540-551.

149

Katoh, T., Kaneko, S., Boissy, R., Watson, M., Ikemura, K., Bell, D.A., 1998, A pilot study

testing the association between N-acetyltransferases 1 and 2 and risk of oral

squamous cell carcinoma in Japanese people. Carcinogenesis 19, 1803-1807.

Kawamura, A., Graham, J., Mushtaq, A., Tsiftsoglou, S.A., Vath, G.M., Hanna, P.E., Wagner,

C.R., Sim, E., 2005, Eukaryotic arylamine N-acetyltransferase. Investigation of

substrate specificity by high-throughput screening. Biochem Pharmacol 69, 347-359.

Klimcakova, L., Habalova, V., Sivonova, M., Nagy, V., Salagovic, J., Zidzik, J., 2011, Effect

of NAT2 gene polymorphism on bladder cancer risk in Slovak population. Molecular

biology reports 38, 7.

Kocabas, N.A., Sardas, S., Cholerton, S., Daly, A.K., Karakaya, A.E., 2004, N-

acetyltransferase (NAT2) polymorphism and breast cancer susceptibility: a lack of

association in a case-control study of Turkish population. Int J Toxicol 23, 25-31.

Kontani, K., Kawakami, M., Nakajima, T., Katsuyama, T., 2001, Tobacco use and

occupational exposure to carcinogens, but not N-acetyltransferase 2 genotypes are

major risk factors for bladder cancer in the Japanese. Urol Res 29, 199-204.

Krajinovic, M., Ghadirian, P., Richer, C., Sinnett, H., Gandini, S., Perret, C., Lacroix, A.,

Labuda, D., Sinnett, D., 2001, Genetic susceptibility to breast cancer in French-

Canadians: role of carcinogen-metabolizing enzymes and gene-environment

interactions. Int J Cancer 92, 220-225.

Kukongviriyapan, V., Prawan, A., Tassaneyakul, W., Aiemsa-Ard, J., Warasiha, B., 2003a,

Arylamine N-acetyltransferase-2 genotypes in the Thai population. Br J Clin

Pharmacol 55, 278-281.

Kukongviriyapan, V., Prawan, A., Warasiha, B., Tassaneyakul, W., Aiemsa-ard, J., 2003b,

Polymorphism of N-acetyltransferase 1 and correlation between genotype and

phenotype in a Thai population. Eur J Clin Pharmacol 59, 277-281.

150

Ladero, J.M., Martin, E.G., Fernandez, C., Carballo, M., Devesa, M.J., Martinez, C., Suarez,

A., Diaz-Rubio, M., Agundez, J.A., 2011, Predicting response to therapy in chronic

hepatitis C: an approach combining IL28B gene polymorphisms and clinical data.

Journal of gastroenterology and hepatology.

Lee, M.S., Su, L., Christiani, D.C., 2010, Synergistic effects of NAT2 slow and GSTM1 null

genotypes on carcinogen DNA damage in the lung. Cancer Epidemiol Biomarkers

Prev 19, 1492-1497.

Lee, S.Y., Lee, K.A., Ki, C.S., Kwon, O.J., Kim, H.J., Chung, M.P., Suh, G.Y., Kim, J.W.,

2002, Complete sequencing of a genetic polymorphism in NAT2 in the Korean

population. Clinical chemistry 48, 775-777.

Leff, M.A., Fretland, A.J., Doll, M.A., Hein, D.W., 1999, Novel human N-acetyltransferase 2

alleles that differ in mechanism for slow acetylator phenotype. J Biol Chem 274,

34519-34522.

Levy, G., Weber., W., 2002, Arylamine Acteyltransferases, In: Ioannides, C. (Ed.) Enzyme

systems that metabolism drugs and other xenobiotics. John Wille &Sons, LTD, pp.

441-458.

Lin, H.J., Han, C.Y., Lin, B.K., Hardy, S., 1993, Slow acetylator mutations in the human

polymorphic N-acetyltransferase gene in 786 Asians, blacks, Hispanics, and whites:

application to metabolic epidemiology. Am J Hum Genet 52, 827-834.

Lin, H.J., Han, C.Y., Lin, B.K., Hardy, S., 1994, Ethnic distribution of slow acetylator

mutations in the polymorphic N-acetyltransferase (NAT2) gene. Pharmacogenetics 4,

125-134.

Lin, H.J., Probst-Hensch, N.M., Hughes, N.C., Sakamoto, G.T., Louie, A.D., Kau, I.H., Lin,

B.K., Lee, D.B., Lin, J., Frankl, H.D., Lee, E.R., Hardy, S., Grant, D.M., Haile, R.W.,

1998, Variants of N-acetyltransferase NAT1 and a case-control study of colorectal

adenomas. Pharmacogenetics 8, 269-281.

151

Liu, L., Von Vett, A., Zhang, N., Walters, K.J., Wagner, C.R., Hanna, P.E., 2007, Arylamine

N-acetyltransferases: characterization of the substrate specificities and molecular

interactions of environmental arylamines with human NAT1 and NAT2. Chem Res

Toxicol 20, 1300-1308.

Lo-Guidice J-M, Marez D, Barat F, Spire C, Chevalier D, F, B. 1999. Human N-

acetyltransferase 1 (NAT1) gene, NAT1*29 allele. In Genbank AF082903.

Lo-Guidice, J.M., Allorge, D., Chevalier, D., Debuysere, H., Fazio, F., Lafitte, L.J., Broly, F.,

2000, Molecular analysis of the N-acetyltransferase 1 gene (NAT1*) using

polymerase chain reaction-restriction fragment-single strand conformation

polymorphism assay. Pharmacogenetics 10, 293-300.

Loktionov, A., Moore, W., Spencer, S.P., Vorster, H., Nell, T., O'Neill, I.K., Bingham, S.A.,

Cummings, J.H., 2002, Differences in N-acetylation genotypes between Caucasians

and Black South Africans: implications for cancer prevention. Cancer Detect Prev 26,

15-22.

Luca, F., Bubba, G., Basile, M., Brdicka, R., Michalodimitrakis, E., Rickards, O., Vershubsky,

G., Quintana-Murci, L., Kozlov, A.I., Novelletto, A., 2008, Multiple advantageous

amino acid variants in the NAT2 gene in human populations. PloS one 3, e3136.

Ma, Q.W., Lin, G.F., Chen, J.G., Xiang, C.Q., Guo, W.C., Golka, K., Shen, J.H., 2004,

Polymorphism of N-acetyltransferase 2 (NAT2) gene polymorphism in shanghai

population: occupational and non-occupational bladder cancer patient groups.

Biomed Environ Sci 17, 291-298.

Marcus, P.M., Hayes, R.B., Vineis, P., Garcia-Closas, M., Caporaso, N.E., Autrup, H.,

Branch, R.A., Brockmoller, J., Ishizaki, T., Karakaya, A.E., Ladero, J.M., Mommsen,

S., Okkels, H., Romkes, M., Roots, I., Rothman, N., 2000a, Cigarette smoking, N-

acetyltransferase 2 acetylation status, and bladder cancer risk: a case-series meta-

152

analysis of a gene-environment interaction. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 9,

461-467.

Marcus, P.M., Vineis, P., Rothman, N., 2000b, NAT2 slow acetylation and bladder cancer

risk: a meta-analysis of 22 case-control studies conducted in the general population.


Martinez, C., Agundez, J.A., Olivera, M., Martin, R., Ladero, J.M., Benitez, J., 1995, Lung

cancer and mutations at the polymorphic NAT2 gene locus. Pharmacogenetics 5,

207-214.

Matimba, A., Del-Favero, J., Van Broeckhoven, C., Masimirembwa, C., 2009, Novel variants

of major drug-metabolising enzyme genes in diverse African populations and their

predicted functional effects. Human genomics 3, 169-190.

McKay, J.D., Hashibe, M., Hung, R.J., Wakefield, J., Gaborieau, V., Szeszenia-Dabrowska,

N., Zaridze, D., Lissowska, J., Rudnai, P., Fabianova, E., Mates, D., Foretova, L.,

Janout, V., Bencko, V., Chabrier, A., Hall, J., Boffetta, P., Canzian, F., Brennan, P.,

2008, Sequence variants of NAT1 and NAT2 and other xenometabolic genes and risk

of lung and aerodigestive tract cancers in Central Europe. Cancer Epidemiol


Meisel, P., Arndt, D., Scheuch, E., Klebingat, K.J., Siegmund, W., 2001, Prediction of

metabolic activity from genotype: the gene-dose effect of N-acetyltransferase. Ther

Drug Monit 23, 9-14.

Millikan, R.C., Pittman, G.S., Newman, B., Tse, C.K., Selmin, O., Rockhill, B., Savitz, D.,

Moorman, P.G., Bell, D.A., 1998, Cigarette smoking, N-acetyltransferases 1 and 2,

and breast cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 7, 371-378.

Minchin, R.F., 1995, Acetylation of p-aminobenzoylglutamate, a folic acid catabolite, by

recombinant human arylamine N-acetyltransferase and U937 cells. Biochem J 307 (

Pt 1), 1-3.

153

Minchin, R.F., Hanna, P.E., Dupret, J.M., Wagner, C.R., Rodrigues-Lima, F., Butcher, N.J.,

2007, Arylamine N-acetyltransferase I. Int J Biochem Cell Biol 39, 1999-2005.

Minchin, R.F., Kadlubar, F.F., Ilett, K.F., 1993, Role of acetylation in colorectal cancer. Mutat

Res 290, 35-42.

Miners, J.O., Birkett, D.J., 1996, The use of caffeine as a metabolic probe for human drug

metabolizing enzymes. General pharmacology 27, 245-249.

Mittal, R.D., Srivastava, D.S., Mandhani, A., 2004, NAT2 gene polymorphism in bladder

cancer: a study from North India. Int Braz J Urol 30, 279-285; discussion 285-278.

Nothlings, U., Yamamoto, J.F., Wilkens, L.R., Murphy, S.P., Park, S.Y., Henderson, B.E.,

Kolonel, L.N., Le Marchand, L., 2009, Meat and heterocyclic amine intake, smoking,

NAT1 and NAT2 polymorphisms, and colorectal cancer risk in the multiethnic cohort

study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 18, 2098-2106.

O'Neil, W.M., MacArthur, R.D., Farrough, M.J., Doll, M.A., Fretland, A.J., Hein, D.W., Crane,

L.R., Svensson, C.K., 2002, Acetylator phenotype and genotype in HIV-infected

patients with and without sulfonamide hypersensitivity. Journal of clinical

pharmacology 42, 613-619.

Ochs-Balcom, H.M., Wiesner, G., Elston, R.C., 2007, A meta-analysis of the association of

N-acetyltransferase 2 gene (NAT2) variants with breast cancer. Am J Epidemiol 166,

246-254.

Ogolla, F., Ferguson, R.J., Kirlin, W.G., Trinidad, A., Andrews, A.F., Mpezo, M., Hein, D.W.,

1990, Acetylator genotype-dependent expression of arylamine N-acetyltransferase

and N-hydroxyarylamine O-acetyltransferase in Syrian inbred hamster intestine and

colon. Identity with the hepatic acetylation polymorphism. Drug Metab Dispos 18,

680-685.

154

Ohsako, S., Deguchi, T., 1990, Cloning and expression of cDNAs for polymorphic and

monomorphic arylamine N-acetyltransferases from human liver. J Biol Chem 265,

4630-4634.

Ohsako, S., Ohtomi, M., Sakamoto, Y., Uyemura, K., Deguchi, T., 1988, Arylamine N-

acetyltransferase from chicken liver II. Cloning of cDNA and expression in Chinese

hamster ovary cells. J Biol Chem 263, 7534-7538.

Okkels, H., Sigsgaard, T., Wolf, H., Autrup, H., 1997, Arylamine N-acetyltransferase 1

(NAT1) and 2 (NAT2) polymorphisms in susceptibility to bladder cancer: the influence

of smoking. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 6, 225-231.

Okumura, K., Kita, T., Chikazawa, S., Komada, F., Iwakawa, S., Tanigawara, Y., 1997,

Genotyping of N-acetylation polymorphism and correlation with procainamide

metabolism. Clin Pharmacol Ther 61, 509-517.

Olivera, M., Martinez, C., Gervasini, G., Carrillo, J.A., Ramos, S., Benitez, J., Garcia-Martin,

E., Agundez, J.A., 2007, Effect of common NAT2 variant alleles in the acetylation of

the major clonazepam metabolite, 7-aminoclonazepam. Drug metabolism letters 1, 3-

5.

Osian, G., Procopciuc, L., Vlad, L., 2006, NAT2 gene polymorphism and sporadic colorectal

cancer. Prevalence, tumor stage and prognosis. A preliminary study in 70 patients. J

Gastrointestin Liver Dis 15, 347-353.

Ozawa, S., Abu-Zeid, M., Kawakubo, Y., Toyama, S., Yamazoe, Y., Kato, R., 1990,

Monomorphic and polymorphic isozymes of arylamine N-acetyltransferases in

hamster liver: purification of the isozymes and genetic basis of N-acetylation

polymorphism. Carcinogenesis 11, 2137-2144.

Patin, E., Barreiro, L.B., Sabeti, P.C., Austerlitz, F., Luca, F., Sajantila, A., Behar, D.M.,

Semino, O., Sakuntabhai, A., Guiso, N., Gicquel, B., McElreavey, K., Harding, R.M.,

Heyer, E., Quintana-Murci, L., 2006a, Deciphering the ancient and complex

155

evolutionary history of human arylamine N-acetyltransferase genes. Am J Hum Genet

78, 423-436.

Patin, E., Harmant, C., Kidd, K.K., Kidd, J., Froment, A., Mehdi, S.Q., Sica, L., Heyer, E.,

Quintana-Murci, L., 2006b, Sub-Saharan African coding sequence variation and

haplotype diversity at the NAT2 gene. Human mutation 27, 720.

Payton, M.A., Sim, E., 1998, Genotyping human arylamine N-acetyltransferase type 1

(NAT1): the identification of two novel allelic variants. Biochem Pharmacol 55, 361-

366.

Rabstein, S., Unfried, K., Ranft, U., Illig, T., Kolz, M., Rihs, H.P., Mambetova, C., Vlad, M.,

Bruning, T., Pesch, B., 2006, Variation of the N-acetyltransferase 2 gene in a

Romanian and a Kyrgyz population. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15, 138-141.

Rodrigues-Lima, F., Dairou, J., Dupret, J.M., 2008, Effect of environmental substances on

the activity of arylamine N-acetyltransferases. Curr Drug Metab 9, 505-509.

Rodrigues-Lima, F., Delomenie, C., Goodfellow, G.H., Grant, D.M., Dupret, J.M., 2001,

Homology modelling and structural analysis of human arylamine N-acetyltransferase

NAT1: evidence for the conservation of a cysteine protease catalytic domain and an

active-site loop. Biochem J 356, 327-334.

Rodrigues-Lima, F., Dupret, J.M., 2002, 3D model of human arylamine N-acetyltransferase

2: structural basis of the slow acetylator phenotype of the R64Q variant and analysis

of the active-site loop. Biochem Biophys Res Commun 291, 116-123.

Rodriguez, S., Gaunt, T.R., Day, I.N.M. 2009. Hardy-Weinberg Equilibrium Testing of

Biological Ascertainment for Mendelian Randomization Studies, p. kwn359.

Rothman, N., Bhatnagar, V.K., Hayes, R.B., Zenser, T.V., Kashyap, S.K., Butler, M.A., Bell,

D.A., Lakshmi, V., Jaeger, M., Kashyap, R., Hirvonen, A., Schulte, P.A., Dosemeci,

M., Hsu, F., Parikh, D.J., Davis, B.B., Talaska, G., 1996, The impact of interindividual

156

variation in NAT2 activity on benzidine urinary metabolites and urothelial DNA

adducts in exposed workers. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5084-5089.

Rothman, N., Garcia-Closas, M., Hein, D.W., 2007, Commentary: Reflections on G. M.

Lower and colleagues' 1979 study associating slow acetylator phenotype with urinary

bladder cancer: meta-analysis, historical refinements of the hypothesis, and lessons

learned. International journal of epidemiology 36, 23-28.

Ruiz JD, A.J., Martínez C, García-Martín E 2009a. NAT1 (N-acetyltransferase 1 (arylamine

N-acetyltransferase)). In Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol.

Ruiz JD, A.J., Martínez C, García-Martín E. 2009b. NAT2 (N-acetyltransferase 2 (arylamine

N-acetyltransferase)). In Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol.

Sabbagh, A., Langaney, A., Darlu, P., Gerard, N., Krishnamoorthy, R., Poloni, E.S., 2008,

Worldwide distribution of NAT2 diversity: implications for NAT2 evolutionary history.

BMC genetics 9, 21.

Sanderson, S., Salanti, G., Higgins, J., 2007, Joint effects of the N-acetyltransferase 1 and 2

(NAT1 and NAT2) genes and smoking on bladder carcinogenesis: a literature-based

systematic HuGE review and evidence synthesis. Am J Epidemiol 166, 741-751.

Sekine, A., Saito, S., Iida, A., Mitsunobu, Y., Higuchi, S., Harigae, S., Nakamura, Y., 2001,

Identification of single-nucleotide polymorphisms (SNPs) of human N-

acetyltransferase genes NAT1, NAT2, AANAT, ARD1 and L1CAM in the Japanese

population. J Hum Genet 46, 314-319.

Selinkski S, Blaszkewicz M, Agúndez JA, Martínez C, García-Martín E, Hengstler JG, K., G.,

2011, Clarifying haplotype ambiguity of the aromatic amine metabolizing enzyme

NAT2 in German, Spanish, Hungarian, Pakistani, and Venezuelan cohorts. Frontiers

in Bioscience, In press.

157

Shishikura, K., Hohjoh, H., Tokunaga, K., 2000, Novel allele containing a 190C>T

nonsynonymous substitution in the N-acetyltransferase (NAT2) gene. Human

mutation 15, 581.

Silverman, B.W., 1986, Density Estimation for Statistics and Data Analysis. Chapman and

Hall, New York.

Sim, E., Lack, N., Wang, C.J., Long, H., Westwood, I., Fullam, E., Kawamura, A., 2008,

Arylamine N-acetyltransferases: structural and functional implications of

polymorphisms. Toxicology 254, 170-183.

Sinclair, J.C., Sandy, J., Delgoda, R., Sim, E., Noble, M.E., 2000, Structure of arylamine N-

acetyltransferase reveals a catalytic triad. Nature structural biology 7, 560-564.

Smelt, V.A., Upton, A., Adjaye, J., Payton, M.A., Boukouvala, S., Johnson, N., Mardon, H.J.,

Sim, E., 2000, Expression of arylamine N-acetyltransferases in pre-term placentas

and in human pre-implantation embryos. Hum Mol Genet 9, 1101-1107.

SolÃ©, X., GuinÃ³, E., Valls, J., Iniesta, R., Moreno, V.c. 2006. SNPStats: a web tool for the

analysis of association studies, pp. 1928-1929.

Song, D.K., Xing, D.L., Zhang, L.R., Li, Z.X., Liu, J., Qiao, B.P., 2009, Association of NAT2,

GSTM1, GSTT1, CYP2A6, and CYP2A13 gene polymorphisms with susceptibility

and clinicopathologic characteristics of bladder cancer in Central China. Cancer

Detect Prev 32, 416-423.

Stephens, M., Smith, N.J., Donnelly, P., 2001, A new statistical method for haplotype

reconstruction from population data. Am J Hum Genet 68, 978-989.

Straka, R.J., Burkhardt, R.T., Lang, N.P., Hadsall, K.Z., Tsai, M.Y., 2006, Discordance

between N-acetyltransferase 2 phenotype and genotype in a population of Hmong

subjects. Journal of clinical pharmacology 46, 802-811.

158

Svensson, C., Hein, D., 2005, Phenotypic and genotypic characterization of N-acetylation.,

In: Lash, L.H. (Ed.) Drug Metabolism and Transport: Molecular Methods and

Mechanisms. The Humana Press, Totowa, NJ, pp. 173-195.

Tamer, L., Ercan, B., Ates, N.A., Degirmenci, U., Unlu, A., Ates, C., Dirlik, M., Atik, U., 2006,

N-acetyltransferase 2 gene polymorphism in patients with colorectal carcinoma. Cell

Biochem Funct 24, 131-135.

Tanira MOM, Simsek M, Al Balushi K, Al Lawatia K, Al Barawani H, RA., B., 2003,

Distribution of arylamine N-acetyltransferase 2 (NAT2) genotypes among Omani

Arabs. . SQU J. Sci. Res. Med. Sci. 5, 5.

Taylor, J.A., Umbach, D.M., Stephens, E., Castranio, T., Paulson, D., Robertson, C., Mohler,

J.L., Bell, D.A., 1998, The role of N-acetylation polymorphisms in smoking-associated

bladder cancer: evidence of a gene-gene-exposure three-way interaction. Cancer

Res 58, 3603-3610.

Teixeira, R.L., Silva, F.P.J., Silveira, A.R., Cabello, P.H., Mendonca-Lima, L., Rabahi, M.F.,

Kritski, A.L., Mello, F.C., Suffys, P.N., de Miranda, A.B., Santos, A.R., Sequence

analysis of NAT2 gene in Brazilians: Identification of undescribed single nucleotide

polymorphisms and molecular modeling of the N-acetyltransferase 2 protein

structure. Mutat Res 683, 43-49.

Teixeira, R.L., Silva, F.P.J., Silveira, A.R., Cabello, P.H., Mendonca-Lima, L., Rabahi, M.F.,

Kritski, A.L., Mello, F.C., Suffys, P.N., de Miranda, A.B., Santos, A.R., 2010,

Sequence analysis of NAT2 gene in Brazilians: Identification of undescribed single

nucleotide polymorphisms and molecular modeling of the N-acetyltransferase 2

protein structure. Mutat Res 683, 6.

Terry, P.D., Goodman, M., 2006, Is the association between cigarette smoking and breast

cancer modified by genotype? A review of epidemiologic studies and meta-analysis.

Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15, 602-611.

159

Trepanier, L.A., Cribb, A.E., Spielberg, S.P., Ray, K., 1998, Deficiency of cytosolic arylamine

N-acetylation in the domestic cat and wild felids caused by the presence of a single

NAT1-like gene. Pharmacogenetics 8, 169-179.

Trepanier, L.A., Ray, K., Winand, N.J., Spielberg, S.P., Cribb, A.E., 1997, Cytosolic

arylamine N-acetyltransferase (NAT) deficiency in the dog and other canids due to an

absence of NAT genes. Biochem Pharmacol 54, 73-80.

Upton, A., Johnson, N., Sandy, J., Sim, E., 2001, Arylamine N-acetyltransferases - of mice,

men and microorganisms. Trends Pharmacol Sci 22, 140-146.

Vagena, E., Fakis, G., Boukouvala, S., 2008, Arylamine N-acetyltransferases in prokaryotic

and eukaryotic genomes: a survey of public databases. Curr Drug Metab 9, 628-660.

Vatsis, K.P., Martell, K.J., Weber, W.W., 1991, Diverse point mutations in the human gene

for polymorphic N-acetyltransferase. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 6333-6337.

Vatsis, K.P., Weber, W.W., 1993, Structural heterogeneity of Caucasian N-acetyltransferase

at the NAT1 gene locus. Arch Biochem Biophys 301, 71-76.

Vatsis, K.P., Weber, W.W., Bell, D.A., Dupret, J.M., Evans, D.A., Grant, D.M., Hein, D.W.,

Lin, H.J., Meyer, U.A., Relling, M.V., et al., 1995, Nomenclature for N-

acetyltransferases. Pharmacogenetics 5, 1-17.

Vaziri, S.A., Hughes, N.C., Sampson, H., Darlington, G., Jewett, M.A., Grant, D.M., 2001,

Variation in enzymes of arylamine procarcinogen biotransformation among bladder

cancer patients and control subjects. Pharmacogenetics 11, 7-20.

Vineis, P., Kogevinas, M., Simonato, L., Brennan, P., Boffetta, P., 2000, Levelling-off of the

risk of lung and bladder cancer in heavy smokers: an analysis based on multicentric

case-control studies and a metabolic interpretation. Mutat Res 463, 103-110.

Vineis, P., Marinelli, D., Autrup, H., Brockmoller, J., Cascorbi, I., Daly, A.K., Golka, K.,

Okkels, H., Risch, A., Rothman, N., Sim, E., Taioli, E., 2001, Current smoking,

160

occupation, N-acetyltransferase-2 and bladder cancer: a pooled analysis of genotype-

based studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10, 1249-1252.

Wagner, C.R., Bergstrom, C.P., Koning, K.R., Hanna, P.E., 1996, Arylamine N-

acetyltransferases. Expression in Escherichia coli, purification, and substrate

specificities of recombinant hamster monomorphic and polymorphic isozymes. Drug

Metab Dispos 24, 245-253.

Walraven, J.M., Doll, M.A., Hein, D.W., 2006, Identification and characterization of functional

rat arylamine N-acetyltransferase 3: comparisons with rat arylamine N-

acetyltransferases 1 and 2. J Pharmacol Exp Ther 319, 369-375.

Wang, H., Vath, G.M., Gleason, K.J., Hanna, P.E., Wagner, C.R., 2004, Probing the

mechanism of hamster arylamine N-acetyltransferase 2 acetylation by active site

modification, site-directed mutagenesis, and pre-steady state and steady state kinetic

studies. Biochemistry 43, 8234-8246.

Ward, A., Summers, M.J., Sim, E., 1995, Purification of recombinant human N-

acetyltransferase type 1 (NAT1) expressed in E. coli and characterization of its

potential role in folate metabolism. Biochem Pharmacol 49, 1759-1767.

Watanabe, M., Sofuni, T., Nohmi, T., 1992, Involvement of Cys69 residue in the catalytic

mechanism of N-hydroxyarylamine O-acetyltransferase of Salmonella typhimurium.

Sequence similarity at the amino acid level suggests a common catalytic mechanism

of acetyltransferase for S. typhimurium and higher organisms. J Biol Chem 267,

8429-8436.

Weber, W.W., Hein, D.W., 1979, Clinical pharmacokinetics of isoniazid. Clin Pharmacokinet

4, 401-422.

Weber, W.W., Hein, D.W., 1985, N-acetylation pharmacogenetics. Pharmacol Rev 37, 25-79.

Wessa, P. 2008. Kernel Density Estimation (v1.0.6) in Free Statistics Software (v1.1.23-r5)

(Office for Research Development and Education,).

161

Wikman, H., Thiel, S., Jager, B., Schmezer, P., Spiegelhalder, B., Edler, L., Dienemann, H.,

Kayser, K., Schulz, V., Drings, P., Bartsch, H., Risch, A., 2001, Relevance of N-

acetyltransferase 1 and 2 (NAT1, NAT2) genetic polymorphisms in non-small cell

lung cancer susceptibility. Pharmacogenetics 11, 157-168.

Woolhouse, N.M., Qureshi, M.M., Bayoumi, R.A., 1997, A new mutation C759T in the

polymorphic N-acetyltransferase (NAT2) gene. Pharmacogenetics 7, 83-84.

Wu, H., Dombrovsky, L., Tempel, W., Martin, F., Loppnau, P., Goodfellow, G.H., Grant, D.M.,

Plotnikov, A.N., 2007, Structural basis of substrate-binding specificity of human

arylamine N-acetyltransferases. J Biol Chem 282, 30189-30197.

Yang, M., Katoh, T., Delongchamp, R., Ozawa, S., Kohshi, K., Kawamoto, T., 2000,

Relationship between NAT1 genotype and phenotype in a Japanese population.


Ye, Z., Parry, J.M., 2002, Meta-analysis of 20 case-control studies on the N-

acetyltransferase 2 acetylation status and colorectal cancer risk. Med Sci Monit 8,

CR558-565.

Yoshida, K., Osawa, K., Kasahara, M., Miyaishi, A., Nakanishi, K., Hayamizu, S., Osawa, Y.,

Tsutou, A., Tabuchi, Y., Shimada, E., Tanaka, K., Yamamoto, M., Takahashi, J.,

2007, Association of CYP1A1, CYP1A2, GSTM1 and NAT2 gene polymorphisms with

colorectal cancer and smoking. Asian Pac J Cancer Prev 8, 438-444.

Yuliwulandari, R., Sachrowardi, Q., Nishida, N., Takasu, M., Batubara, L., Susmiarsih, T.P.,

Rochani, J.T., Wikaningrum, R., Miyashita, R., Miyagawa, T., Sofro, A.S., Tokunaga,

K., 2008, Polymorphisms of promoter and coding regions of the arylamine N-

acetyltransferase 2 (NAT2) gene in the Indonesian population: proposal for a new

nomenclature. J Hum Genet 53, 201-209.

162

Zang, Y., Doll, M.A., Zhao, S., States, J.C., Hein, D.W., 2007a, Functional characterization of

single-nucleotide polymorphisms and haplotypes of human N-acetyltransferase 2.

Carcinogenesis 28, 1665-1671.

Zang, Y., Zhao, S., Doll, M.A., Christopher States, J., Hein, D.W., 2007b, Functional

characterization of the A411T (L137F) and G364A (D122N) genetic polymorphisms in

human N-acetyltransferase 2. Pharmacogenet Genomics 17, 37-45.

Zhang, J., Qiu, L.X., Wang, Z.H., Wang, J.L., He, S.S., Hu, X.C., 2010, NAT2 polymorphisms

combining with smoking associated with breast cancer susceptibility: a meta-analysis.

Breast cancer research and treatment 123, 877-883.

Zhangwei, X., Jianming, X., Qiao, M., Xinhua, X., 2006, N-Acetyltransferase-1 gene

polymorphisms and correlation between genotype and its activity in a central Chinese

Han population. Clin Chim Acta 371, 85-91.

Zhao, B., Lee, E.J., Yeoh, P.N., Gong, N.H., 1998, Detection of mutations and polymorphism

of N-acetyltransferase 1 gene in Indian, Malay and Chinese populations.


Zheng, W., Deitz, A.C., Campbell, D.R., Wen, W.Q., Cerhan, J.R., Sellers, T.A., Folsom,

A.R., Hein, D.W., 1999, N-acetyltransferase 1 genetic polymorphism, cigarette

smoking, well-done meat intake, and breast cancer risk. Cancer Epidemiol


Zhu, Y., Doll, M.A., Hein, D.W., 2002, Functional genomics of C190T single nucleotide

polymorphism in human N-acetyltransferase 2. Biological chemistry 383, 983-987.

Zhu, Y., Hein, D.W., 2008, Functional effects of single nucleotide polymorphisms in the

coding region of human N-acetyltransferase 1. Pharmacogenomics J 8, 339-348.

Zhu, Y., States, J.C., Wang, Y., Hein, D.W., 2011, Functional effects of genetic

polymorphisms in the N-acetyltransferase 1 coding and 3' untranslated regions. Birth

Defects Res A Clin Mol Teratol 91, 77-84.

163

Zienolddiny, S., Campa, D., Lind, H., Ryberg, D., Skaug, V., Stangeland, L.B., Canzian, F.,

Haugen, A., 2008, A comprehensive analysis of phase I and phase II metabolism

gene polymorphisms and risk of non-small cell lung cancer in smokers.

Carcinogenesis 29, 1164-1169.

Zupa, A., Sgambato, A., Bianchino, G., Improta, G., Grieco, V., G, L.A.T., Campisi, B.,

Traficante, A., Aieta, M., Cittadini, A., 2009, GSTM1 and NAT2 polymorphisms and

colon, lung and bladder cancer risk: a case-control study. Anticancer Res 29, 1709-

1714.

Documents

UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA FACULTAD DE MEDICINA