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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
TEMA:
¨ ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y FITOQUÍMICO PRELIMINAR
DEL SHIITAKE (Lentinula edodes) ¨
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO
PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y
FARMACÉUTICO.
AUTORAS:
Berrús Jiménez Helen Ellinor
Segarra Rodríguez Joselyn Daniela
TUTORA:
Q.F. María Elena Jiménez Heinert MS.c
GUAYAQUIL - ECUADOR
2019
i
ii
iii
iv
v
vi
vii
viii
ix
x
xi
xii
ÍNDICE GENERAL
RESUMEN ........................................................................................................... xix
ABSTRACT ........................................................................................................... xx
INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1
CAPÍTULO I. PROBLEMA ...................................................................................... 2
I.1 Planteamiento del problema ........................................................................... 2
I.2 Formulación del problema .............................................................................. 2
I.3 Justificación e importancia .............................................................................. 3
I.4 Hipótesis ......................................................................................................... 3
I.5 Objetivos ......................................................................................................... 4
I.5.1 Objetivo general ........................................................................................ 4
I.5.2 Objetivos específicos ................................................................................ 4
I.6 Operacionalización de variables ..................................................................... 5
CAPÍTULO II. MARCO TEÓRICO .......................................................................... 6
II.1 Generalidades ............................................................................................... 6
II.2 Tipos de hongos ............................................................................................ 7
II.3 Estructura de la seta ...................................................................................... 8
II.3.1 Sombrero o píleo ..................................................................................... 8
II.3.2 Himenio .................................................................................................... 9
II.3.3 Pie o estípite ............................................................................................ 9
II.3.4 Anillo o velo ............................................................................................. 9
II.3.5 Volva ........................................................................................................ 9
II.3.6 Micelio .................................................................................................... 10
II.4 Clasificación de las setas ............................................................................. 10
II.5 Hongos comestibles..................................................................................... 10
II.6 Características del hongo ............................................................................ 11
II.7 Condiciones de crecimiento ......................................................................... 12
II.7.1 Incubación: ............................................................................................ 12
II.7.2 Browning o formación de micoderma café ............................................. 13
II.7.3 Formación de primordios ....................................................................... 13
II.7.4 Desarrollo del cuerpo fructífero y cosecha ............................................. 14
xiii
II.7.5 Inactivación de los bloques .................................................................... 15
II.8 Taxonomía Lentinula edodes ....................................................................... 16
II.9 Propiedades ................................................................................................. 16
II.10 Hábitat de crecimiento ............................................................................... 17
II.11 Condiciones de crecimiento y desarrollo ................................................... 17
II.11.1 Temperatura ........................................................................................ 18
II.11.2 Humedad ............................................................................................. 18
II.11.3 Luz ....................................................................................................... 18
II.11.4 Aireación .............................................................................................. 18
II.12 Composición nutricional ............................................................................. 19
II.13 Compuestos bioactivos. ............................................................................. 19
II.13.1 β- glucanos .......................................................................................... 20
II.13.2 Polisacáridos ....................................................................................... 21
II.13.3 Lentinan ............................................................................................... 21
II.13.4 Eritadenina ........................................................................................... 21
II.13.5 Quitina y quitosano .............................................................................. 22
II.13.6 Ergosterol ............................................................................................ 22
II.14 Acción farmacológica ................................................................................. 22
II.14.1 Antioxidante ......................................................................................... 22
II.14.2 Antitumoral ........................................................................................... 23
II.14.3 Antiviral ................................................................................................ 23
II.14.4 Efecto hipocolesterolémico y antihipertensivo ..................................... 24
II.14.5 Inmunoestimulante ............................................................................... 24
II.14.6 Antimicrobiana ..................................................................................... 24
CAPÍTULO III. MARCO METODOLÓGICO .......................................................... 25
III.1 Tipo de Investigación .................................................................................. 25
III.2 Equipos, Aparatos, Materiales y Reactivos ................................................. 25
III.2.1 Materiales de laboratorio ...................................................................... 25
III.2.2 Equipos de Laboratorio ......................................................................... 26
III.2.3 Reactivos .............................................................................................. 26
III.3 Muestra ....................................................................................................... 27
III.4 Metodología Experimental .......................................................................... 27
xiv
III.4.1 Evaluación Macro morfológica de la Seta ............................................. 27
III.5 Secado ........................................................................................................ 28
III.6 Molienda ..................................................................................................... 28
III.7 Almacenamiento ......................................................................................... 28
III.8 Parámetros Físico – Químicos .................................................................... 29
III.8.1 Humedad Residual ............................................................................... 29
III.8.2 Cenizas totales ..................................................................................... 30
III.8.3 Cenizas solubles en agua ..................................................................... 31
III.8.4 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico ................................................ 32
III.9 Tamizaje Fitoquímico .................................................................................. 32
III.9.1 Ensayo de Sudán.................................................................................. 33
III.9.2 Ensayo de Dragendorff ......................................................................... 33
III.9.3 Ensayo de Mayer .................................................................................. 34
III.9.4 Ensayo de Wagner ............................................................................... 34
III.9.5 Ensayo de Baljet ................................................................................... 34
III.9.6 Ensayo de Borntrager ........................................................................... 35
III.9.7 Ensayo de Liebermann - Buchard......................................................... 35
III.9.8 Ensayo de Catequinas .......................................................................... 36
III.9.9 Ensayo de Resinas ............................................................................... 36
III.9.10 Ensayo de Fehling .............................................................................. 36
III.9.11 Ensayo de Espuma ............................................................................. 36
III.9.12 Ensayo de Cloruro Férrico ................................................................... 37
III.9.13 Ensayo de Ninhidrina .......................................................................... 37
III.9.14 Ensayo de Shinoda ............................................................................. 38
III.9.15 Ensayo de Antocianidinas ................................................................... 38
III.10 Análisis por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas
(CG-EM) ............................................................................................................ 42
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................... 43
IV.1 Evaluación Macromorfológica de las setas ................................................ 43
IV.2 Determinación de los parámetros fisicoquímicos ....................................... 45
IV.2.1 Determinación de Humedad Residual .................................................. 45
IV.2.2 Determinación de cenizas .................................................................... 46
xv
IV.4 Identificación de compuestos por Cromatografía de Gases acoplado a
Espectrometría de Masas (CG/EM). .................................................................. 51
CONCLUSIONES ................................................................................................. 53
RECOMENDACIONES ......................................................................................... 54
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 55
GLOSARIO ........................................................................................................... 62
ANEXOS ............................................................................................................... 66
xvi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Operacionalización de variables ................................................................ 5
Tabla II. Parámetros de Incubación. ..................................................................... 12
Tabla III. Parámetros de formación de micoderma café ....................................... 13
Tabla IV. Parámetros de formación de primordios. ............................................... 14
Tabla V. Parámetros para el desarrollo de cuerpo fructífero y cosecha. .............. 15
Tabla VI. Taxonomía del shiitake .......................................................................... 16
Tabla VII. Análisis estadístico de los parámetros morfológicos de muestras de
setas de Lentinula edodes ¨desglose¨ ................................................................... 44
Tabla VIII. Análisis estadístico de los parámetros morfológicos de muestras de
setas de Lentinula edodes ¨consolidado¨ .............................................................. 45
Tabla IX. Resultado de porcentaje Humedad residual de setas de Lentinula
edodes .................................................................................................................. 45
Tabla X. Resultado de porcentaje de Cenizas totales de setas de Lentinula
edodes. ................................................................................................................. 46
Tabla XI. Resultado de porcentaje de Cenizas solubles en agua de setas de
Lentinula edodes ................................................................................................... 47
Tabla XII. Resultado de porcentaje de Cenizas insolubles en ácido de setas de
Lentinula edodes. .................................................................................................. 47
Tabla XIII. Resultados del Tamizaje Fitoquímico de Lentinula edodes ................. 50
Tabla XIV. Resultados de la Cromatografía de Gases acoplado a Espectrometría
de Masas (CG/EM) de Lentinula edodes. ............................................................. 52
xvii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Cuerpo fructífero...................................................................................... 6
Figura 2. Partes de la seta ..................................................................................... 8
Figura 3. Shiitake proveniente de Quito ............................................................... 16
Figura 4. Procedimiento para realizar los extractos .............................................. 39
Figura 5. Ensayos a realizar en los diferentes extractos. ..................................... 40
Figura 6. Ensayos a realizar en los diferentes extractos ...................................... 41
Figura 7. Perfil cromatográfico de hongo seco y triturado .................................... 52
xviii
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Pre tratamiento de la muestra - secado y pulverizado ........................... 66
Anexo 2. Determinación de Humedad Residual ................................................... 67
Anexo 3. Determinación de Cenizas Totales ........................................................ 67
Anexo 4. Extractos ............................................................................................... 67
Anexo 5. Tamizaje Fitoquímico de los extractos Etéreo, Alcohólico y Acuoso ..... 67
xix
¨ ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y FITOQUÍMICO PRELIMINAR DEL
SHIITAKE (Lentinula edodes) ¨
Autores: Helen Ellinor Berrús Jiménez; Joselyn Daniela Segarra Rodríguez
Tutor: Q.F. María Elena Jiménez Heinert M.Sc.
RESUMEN
El shiitake es considerado un macrohongo, compuesto principalmente por proteínas, triterpenos, aminoácidos y polisacáridos, resaltando entre ellos, el lentinan y pleuran los cuales son utilizados en la industria farmacéutica por su abundante actividad biológica. Los hongos comestibles son cada vez más usados, por sus sabores y la cantidad de propiedades que suelen presentar, de tal manera mejoran la salud de los consumidores, así como el shiitake que resalta por sus cualidades consagrándolo como un alimento funcional. En Ecuador son muy pocos los lugares que cultivan el Lentinula edodes y que a pesar de todos sus beneficios no ha sido lo suficientemente expuesto a la sociedad. Realizar la evaluación de la composición química y metabolitos secundarios de la seta del hongo cultivado en Ecuador es el objetivo principal de la investigación y fue comprobado por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM), tamizaje fitoquímico y parámetros físico químicos como cenizas totales, humedad relativa. La cromatografía permitió verificar los compuestos bioactivos mayoritarios, aminoácidos y entre otros metabolitos. El resultado de la humedad residual fue de 7.48%, cenizas totales 7.3%, cenizas solubles en agua 6.1% y cenizas insolubles en ácido 5.6%, encontrándose dentro de los parámetros normales. Los resultados de la variedad cultivada en Ecuador concuerdan con los resultados reportados anteriormente para el macrohongo cultivado en Asia.
Palabras clave: Lentinula edodes, lentinan, pleuran.
xx
“PRELIMINARY PHARCHEMICAL AND PHYTOCHEMICAL STUDY OF
SHIITAKE (Lentinula edodes)”
Authors: Helen Ellinor Berrús Jiménez; Joselyn Daniela Segarra Rodríguez
Advisor: Q.F. María Elena Jiménez Heinert M.Sc.
ABSTRACT
Shiitake is considered a macrohongo, composed mainly of proteins, triterpenes, amino acids and polysaccharides, highlighting among them, lentinan and pleura which are used in the pharmaceutical industry for its abundant biological activity. Edible mushrooms are increasingly used, for their flavors and the amount of properties they usually present, thereby improving the health of consumers, as well as shiitake that stands out for its qualities, consecrating it as a functional food. In Ecuador there are very few places that cultivate Lentinula edodes and that despite all its benefits it has not been sufficiently exposed to society. Performing the evaluation of the chemical composition and secondary metabolites of the mushroom mushroom grown in Ecuador is the main objective of the research and was verified by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), phytochemical screening and physical chemical parameters such as total ashes, relative humidity. Chromatography allowed to verify the majority bioactive compounds, amino acids and among other metabolites. The residual moisture result was 7.48%, total ashes 7.3%, water soluble ashes 6.1% and acid insoluble ashes 5.6%, being within normal parameters. The results of the variety grown in Ecuador coincide with the results previously reported for macrohong grown in Asia.
Keywords: Lentinula edodes, lentinan, pleuran.
1
INTRODUCCIÓN
El shiitake (Lentinula edodes), es un hongo medicinal utilizado para fortalecer el
sistema inmune, muy apreciado en la medicina tradicional china. Desde siglos atrás
los países asiáticos incluyen en su dieta diaria diferentes tipos de hongos, y es
debido a su ingesta que se les atribuye el bajo índice de enfermedades y mejor
calidad de vida. En los monasterios, se llegó a relacionar su longevidad con la
propiedad de dicha seta. Se conoce que algunos budistas vivían más años que
aquellos que no lo consumían.
En la Industria Farmacéutica, se procesa un compuesto derivado del hongo, que
en la actualidad se incorpora a varios tratamientos para diversas enfermedades, por
lo cual se ha incrementado el cultivo en esta década. La producción mundial de
hongos la encabeza el champiñón (Agaricus bisporus), y como segundo está el
shiitake (Lentinula edodes), con un 25%.
En Ecuador en los últimos años, hay un reducido crecimiento en el mercado por
el cultivo de shiitake, y el estudio de parte de algunas empresas para el desarrollo
de medicamentos no ha sido favorable. El hongo crece en un ambiente áspero, se
desarrolla en materiales leñosos o ricos en fibra como los troncos de cierto tipo de
árboles. Para sus producciones de ciclo corto se utiliza otros materiales que tengan
una composición similar, por lo general se usan residuos de la industria maderera,
incorporándole un ambiente natural.
El shiitake sobresale por su olor, color, sabor, textura; posee más proteínas que
los vegetales; se destaca por poseer al polisacárido conocido como lentinan, del
mismo que se ha demostrado características anti-infecciosas y anti-cancerígenas.
Presenta vitaminas del grupo B, que contribuyen al balance metabólico, mejorando
la función del sistema inmune y reduciendo el colesterol (Romero, Martinez, &
Huato, 2015).
2
CAPÍTULO I. PROBLEMA
I.1 Planteamiento del problema
Los hongos han creado desde siempre una gran incertidumbre por la forma de
desarrollarse en el medio ambiente, así como por su diversidad; se destacan por
sus atributos farmacológicos y como alimentos funcionales proporcionando una
buena salud física y reduciendo enfermedades.
La comercialización de hongos comestibles en Norte América, Europa y Asia ha
tenido un gran apogeo debido a su valor nutritivo, entre ellos el shiitake (Lentinula
edodes) que consumido en una dieta normal se lo puede referir como un
nutraceútico, conociendo todos sus beneficios se crea la necesidad de incluirlo en
el mercado ecuatoriano de una manera accesible y económica.
Lentinula edodes es una seta procedente de Asia, además de poseer
propiedades medicinales y alimenticias, sobresalen sus altos contenidos de
proteínas y un componente denominado lentinan el cual es conocido por presentar
características anti infecciosas y anticancerígenas. No se reportan investigaciones
hechas en Ecuador, que profundicen estudios acerca de los metabolitos presentes
en la seta de Lentinula edodes, para poder conocer más de los componentes activos
y sus funciones para el beneficio del ser humano.
I.2 Formulación del problema
¿Presentará la seta del shiitake (Lentinula edodes) cultivado en Ecuador
componentes bioactivos con propiedades medicinales y alimenticias?
3
I.3 Justificación e importancia
Los hongos constituyen una gran fuente de sustancias bioactivas que tienen
diversos usos, por ejemplo, aplicaciones dentro del campo alimenticio y
farmacéutico; el shiitake se muestra como una plataforma viable para la obtención
de proteínas, fibras, polisacáridos, ácidos orgánicos y otras sustancias utilizadas
para la elaboración de medicamentos, siendo la esperanza para el control de
diversas enfermedades que aquejan al hombre moderno.
Lentinula edodes ocupa el segundo lugar de cultivo a nivel mundial, antecedido
por el champiñón blanco (Agaricusbisporus). El shiitake posee metabolitos como la
eritadenina y lentinan que se les atribuye la característica de ser agentes biológicos
para la prevención de ciertos tipos de cáncer, además de tener efecto antioxidante
y disminuir los niveles de colesterol en sangre (Rivera, Albarracín, & Lares, 2017).
El proyecto es muy importante porque se podrán conocer los componentes
bioactivos de la seta del shiitake (Lentinula edodes) cultivadas en Ecuador, y a su
vez se identificarán los metabolitos secundarios y así en las siguientes
investigaciones se podrían determinar la utilidad farmacológica de estos.
I.4 Hipótesis
El shiitake, cultivado en Ecuador, posee componentes bioactivos beneficiosos
para la salud del ser humano.
4
I.5 Objetivos
I.5.1 Objetivo general
Evaluar la composición química y metabolitos secundarios de la seta ecuatoriana
del shiitake (Lentinula edodes).
I.5.2 Objetivos específicos
Caracterizar fisicoquímica y macro morfológicamente la seta del shiitake
(Lentinula edodes).
Determinar cualitativamente la presencia o ausencia de metabolitos
secundarios mediante tamizaje fitoquímico de la seta del shiitake (Lentinula
edodes).
Identificar los metabolitos secundarios presentes en la seta del shiitake
(Lentinula edodes) por CG-EM.
5
I.6 Operacionalización de variables
Tabla I. Operacionalización de variables
Fuente: Autores.
TIPO VARIABLES CONCEPTUALIZACIÓN INDICADOR
Dependientes
Características
macro morfológicas
-Tamaño
-Peso
Unidad de medida
(S.I)
Características
farmacológicas
- Humedad
- Cenizas totales
-Cenizas insolubles en agua
-Cenizas insolubles en ácido
Porcentaje (%)
Metabolitos
secundarios
-Tamizaje fitoquímico
-Perfil cromatográfico
-Pruebas positivas
-Picos
cromatográficos
Independiente Tipo de muestra -Nombre de la especie
-Lugar de cultivo Seta
6
CAPÍTULO II. MARCO TEÓRICO
II.1 Generalidades
Los hongos componen un grupo de seres vivos diferentes a las plantas y los
animales, desde 1969 fueron clasificados en un reino denominado Fungí que
comprende levaduras, mohos y setas (Montes, 2003).
Según (Pacheco, 2013) los hongos son definidos como “macrofungos con un
cuerpo fructífero característico que puede ser tanto epigeo como hipogeo”. Se
denomina hongo al cuerpo fructífero, los cuales producen esporas o también
denominadas células reproductoras, que se encuentran ubicadas debajo del
sombrero (figura 1).
Se debe por su reproducción asexual y se desempeñan únicamente a nivel fe
tejidos. Carecen de clorofila, por lo que su forma de vivir es saprofita; dependiendo
Figura 1. Cuerpo fructífero (Pacheco, 2013)
7
de materia orgánica en descomposición mejorando de esta manera su eficacia y
cultivo (Almendros, 2012).
Lentinula edodes, es conocido con el nombre de shiitake oriundo de China. El
primer lugar donde fue cultivado ocurrió probablemente en la región montañosa de
esta nación, luego fueron introducidas en Japón, que es hoy en día el mayor
productor del hongo (Andrade, 2014).
En la actualidad se cultiva y se considera dentro del grupo de hongos comestibles
de mayor consumo en el mundo. Principalmente consumido en América Latina con
una producción de 86.8%. En Ecuador se reporta pocas investigaciones sobre
cultivos de seta comestible siendo la ciudad de Aloag una de las pioneras en la
implementación de hongos shiitake en el mercado ecuatoriano (Andrade, 2014).
II.2 Tipos de hongos
La seta es la parte comestible del hongo, denominada también como carpóforo,
pero no todos estos organismos poseen setas, por ejemplo, las levaduras. Los
hongos se dividen en cinco grupos: ficomycetes, mixomycetes, ascomycete,
basidiomycetes y deutromycetes, entre los grupos que proporcionan más setas
están los basidiomicetes que se reproducen sexualmente y sus células encargadas
de la producción de las esporas se denominan basidios. El grupo ascomycete puede
tener una reproducción asexual, la cual es frecuente e involucra la producción de
conidióforos. En cuanto a la reproducción sexual desarrolla hifas de la cepa
masculina que origina un anteridio o femenina que produce un ascogonio (Kuhar &
Papinutti, 2013).
8
II.3 Estructura de la seta
Según (Rodríguez, 2011) las setas generalmente constan de las siguientes
partes: micelio, volva, pie, himenio, laminilla, lamina y sombrero las mismas que se
las puede observar en la figura 2.
Figura 2. Partes de la seta (Pacheco, 2013)
II.3.1 Sombrero o píleo
Es la parte carnosa del hongo, suelen tener diferentes formas que van desde
redondeada, sombrilla, plana o ahuecada. En la parte superior puede presentar
verrugas o placas.
9
II.3.2 Himenio
Es la parte reproductora del hongo, es decir donde se desarrollan las esporas, se
encuentra en la parte inferior de la seta, debajo del sombrero, suele encontrarse en
forma de laminillas, tubos, arrugas o venosidades.
II.3.3 Pie o estípite
Se caracteriza por sostener la parte superior del hongo, puede tener las
siguientes formas: grueso, fino, corto, abombado, retorcido o excéntrico, lo cual
permitirá clasificar a las distintas especies.
II.3.4 Anillo o velo
Esta parte suele ser doble, sencillo y caído, su función es proteger el himenio
cuando el hongo esta joven.
II.3.5 Volva
Se encuentra presente en ciertas setas en su fase de crecimiento, tiene parecido
a una capucha, es el resto del velo que cubre algunas especies en el instante de
fructificar, puede quedarse sobre el sombrero en forma de verrugas, en el borde en
forma de cortina, en el pie en forma de anillo y en la base del pie como volva.
10
II.3.6 Micelio
Parte del hongo formado por un filamento filiforme de característica microscópica
y delgada que reciben el nombre de hifas. Pueden presentar septos, si los tabiques
están ausentes se lo denomina micelio continuo.
II.4 Clasificación de las setas
Se clasifican según la forma de alimentarse, entre ellas resaltan, las setas
parásitas que viven a costas de organismos como animales, plantas, insectos e
incluso otros hongos, ocasionando daños. Las setas simbióticas son las que se
alimentan por asociación con distintos organismos vivos y por último las saprófitas
son aquellas que viven sobre materia orgánica en descomposición. Además, existen
setas de diversa utilidad, por ejemplo, comestibles, venenosas o tóxicas y
alucinógenas (Rodríguez, 2011).
II.5 Hongos comestibles
Los hongos representan una gran biodiversidad, y son organismos que muestran
cualidades importantes utilizadas como alimentos e incluso en la elaboración de
antibióticos. En la actualidad los hongos son considerados fundamentales en la
dieta, ya que proporcionan numerosos nutrientes, vitaminas, fibras, proteínas,
incluso son libres de colesterol, siendo así que son utilizados en medicina
tradicional. Se ha comprobado los beneficios en algunas enfermedades como por
ejemplo en el tratamiento de Parkinson, hipertensión, Alzhéimer, además participan
en reducir la probabilidad de cáncer por sus atributos antitumorales. Debido a todas
sus propiedades se incluyen en suplementos dietéticos (Valverde, Hernández, &
Paredes, 2015).
11
Los hongos comestibles son una gran fuente de proteínas entre ellas destacan
la valina, leucina, ácidos aspárticos y glutamina. La composición química que
contenga una seta depende de las características de crecimiento, cosecha, post
cosecha, condiciones de almacenamiento y procesamiento. Algunos de los
azúcares presentes en Lentinula edodes son: manitol 23.3g y trehalosa 13.22g, la
especie Pleurotus ostreatus; presenta 0.01g de fructosa, 0.54 g de manitol y
trehalosa 4.42g (Valverde, Hernández, & Paredes, 2015).
Dentro de los hongos comestibles destaca el shiitake por sus características
organolépticas con increíbles propiedades medicinales y alimenticias, además de
ser utilizado como sustrato al emplear los residuos agrícolas y forestales, en general
posee más proteínas, vitaminas, aminoácidos y minerales que los vegetales. Por
estas cualidades de la seta su producción ha ido incrementando, alcanzando así el
segundo lugar en la escala de producción de hongos medicinales y comestibles del
mundo (Romero, Martinez, & Huato, 2015).
II.6 Características del hongo
El sombrero del shiitake va desde 5 a 12 cm de ancho, tiene un umbón color
castaño claro. La parte superior del sombrero está cubierta por escamas
blanquecinas, de manera simultánea las laminillas nacen y se desarrollan juntas, de
forma libre. El pie del hongo se caracteriza por ser corto y cubierto por escamas
fibrosas, el anillo puede ser de color blanquecino o castaño claro; el sombrero tiene
la característica de ser firme, además de poder secarse y rehidratarse fácilmente
(Ancco, 2013).
Los cuerpos fructíferos tienen acción terapéutica debido a los compuestos
bioactivos que presenta. A nivel mundial solo el 6% de la diversidad fúngica ha sido
estudiado a pesar de existir una extensa gama de hongos comestibles que pueden
12
ser añadidos a la dieta diaria y ser consumidos con seguridad (Estrada & Bautista,
2016).
II.7 Condiciones de crecimiento
Según (Villegas, 2007) para un buen crecimiento del hongo se encuentran las
siguientes etapas y parámetros:
II.7.1 Incubación:
Entiende desde el primer día de la inoculación hasta que se note la presencia de
ampollas en las bolsas o “popcorning” y los primeros indicios de coloración café,
parámetros que se indican en la tabla II.
Tabla II. Parámetros de Incubación.
PARÁMETROS
pH inicial 5.5 -5.6 Concentración
de CO2
>10000
ppm
Temperatura
de
incubación
21-27°C Intercambio de
aire fresco
0-1 volumen
de aire/hora
Humedad
relativa 95-100%
Requerimiento
de luz 50 - 100 Lux
Duración 25 - 30 días
OBSERVACIÓN: Antes de la fructificación el
requerimiento de luz puede descender a 35 - 45 Lux.
Fuente: Autores.
13
II.7.2 Browning o formación de micoderma café
El browning inicia cuando se adhiere el sustrato y el metabolismo empieza a
contrarrestar junto con la temperatura del núcleo. Se diferencia por la formación de
ampollas seguido por una coloración café responsables de impedir la deshidratación
del bloque (Stamet & Chilton, 1893) .
Las condiciones para la formación de micoderma se detallan en la tabla III.
Tabla III. Parámetros de formación de micoderma café
PARÁMETROS
Temperatura 10-21°C
Humedad
relativa > 90
Duración 20 - 30 días
Concentración
de CO2 < 1000 ppm
Requerimiento
de luz 50 -100 Lux
Fuente: Autores.
II.7.3 Formación de primordios
Comprende desde el popcorning hasta la existencia de los primeros primordios.
Antes del popcorning se produce un choque térmico, sumergiendo los bloques de
agua a 5-16ºC durante 12 a 24 horas o reduciendo la temperatura ambiental (o
enfriándolos a 4-8ºC durante 12-24 horas, en nevera (Stamet & Chilton, 1893).
14
Los indicadores para la formación de primordios se encuentran descritos en la
tabla IV.
Tabla IV. Parámetros de formación de primordios.
PARÁMETROS
pH inicial 4.2 - 4.6 Concentración
de CO2 < 10000 ppm
Temperatura
10-16°
(frio)
16 -21°C
(caliente)
Intercambio
de aire fresco
4-7 volumen
de aire/hora
Humedad
relativa 95-100%
Requerimiento
de luz
500 - 2000
Lux
Duración 5 - 7 días
Fuente: Autores.
II.7.4 Desarrollo del cuerpo fructífero y cosecha
En la tabla V se exponen los parámetros para el proceso de crecimiento del
cuerpo fructífero del hongo y cosecha.
15
Tabla V. Parámetros para el desarrollo de cuerpo fructífero y cosecha.
PARÁMETROS
Duración 5 -8 días Concentración
de CO2 < 1000 ppm
Temperatura
16 -18°C
(frio)
21 -27°C
(cálido)
Intercambio
de aire fresco
4-8 volumen
de aire/hora
Humedad
relativa 60 - 80%
Requerimiento
de luz
500 - 2000
Lux
OBSERVACIÓN: Niveles de luz por debajo de 500 Lux
causan elongación del estípite
Fuente: Autores
La cosecha ocurre cada 2 a 3 semanas durante 8 a 12 semanas y muchas veces
hasta 16 semanas.
II.7.5 Inactivación de los bloques
Abarca desde el primer día de cosecha hasta cuando se forma una capa café de
células muertas en el bloque.
Temperatura: 21-25ºC
Humedad relativa: 30-50%
Duración: 7-10 días
16
Figura 3. Shiitake proveniente de Quito
II.8 Taxonomía Lentinula edodes
El shiitake (figura 3) es descrito como un macrohongo basidiomiceto clasificado
taxonómicamente por (Pegler, 1983) en la tabla VI.
Tabla VI. Taxonomía del shiitake
Fuente: Autores
II.9 Propiedades
La presencia de polisacáridos, flavonoides, triterpenos y otros compuestos hacen
que los hongos comestibles sean considerados como alimentos funcionales. La
cultura asiática lo destaca como nutraceútico, se lo utiliza como droga según lo
reporta la farmacopea oriental. Se destacan diversos metabolitos presentes en el
micelio y el cuerpo fructífero atribuyéndoles actividades antivirales, antitumorales,
antiparasitarias, reguladoras de presión sanguínea y antinflamatorias. El estípite y
el píleo contiene lentinan que dispone de propiedades inmunoestimuladoras y
CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA
Reino Fungí
División Basidiomycota
Clase: Basidiomycetes
Subclase: Agaricomycetidae
Familia: Agaricaceae
Género: Lentinula
Cepa: Lentinula edodes
17
anticancerígenas, el shiitake posee quitina, ergosteroles y eritadenina los cuales
hacen que un alimento sea enriquecido a nivel medicinal y nutricional (Estrada &
Bautista, 2016).
II.10 Hábitat de crecimiento
Los hongos necesitan materia viva y muerta para su crecimiento y desarrollo,
adquieren sus nutrientes por el crecimiento en materia orgánica muerta denominada
saprófitos, crecen en asociación con otros organismos (simbióticos) y con daño a
otros organismos (patógenos o parasíticos). Lentinula edodes se desarrolla sobre
diferentes especies de madera en descomposición. Se cultiva ampliamente en Asia
Oriental, pero no en zonas frías ya que su temperatura óptima se encuentra
alrededor de 24°C (De Turris, 2013).
El ciclo de vida de L. edodes posee la fase vegetativa y reproductiva; cuando las
esporas de la seta se desarrollan en un ambiente oportuno da paso a la formación
del micelio seguido de la aparición de primordios hasta llegar a la segregación de
nuevas esporas para que dé inicio a un nuevo ciclo (Zavatela, 2015).
II.11 Condiciones de crecimiento y desarrollo
Distintos factores físicos, además de nutricionales afectan el crecimiento y
desarrollo del shiitake (Rodriguez, 2013).
18
II.11.1 Temperatura
La temperatura óptima esta alrededor de los 25ºC para la correcta producción de
metabolitos secundarios como es el polisacárido lentinan derivado del micelio de la
seta, que se reporta útil en el tratamiento de ciertos cánceres (Rodriguez, 2013).
II.11.2 Humedad
La humedad relativa se encuentra entre el 95 a 100%, dentro de este porcentaje
el hongo se desarrolla de manera óptima, aunque los valores pueden variar
dependiendo de las etapas de crecimiento. Un contenido de 50-75% de la humedad
del sustrato facilita el desarrollo del micelo (Arango, 2013).
II.11.3 Luz
Los hongos son organismos no fotosintéticos, micelios del shiitake han sido
cultivados en la oscuridad para obtener un crecimiento óptimo. Sin embargo la luz
podría inducir el origen de los primordios en ciertas especies, además de ser
necesaria para el desarrollo de otras etapas del órgano reproductor de esporas
(Rodriguez, 2013).
II.11.4 Aireación
El shiitake es un organismo aerobio, por lo cual es sumamente significativo tener
el nivel de oxígeno apropiado para sembrar los micelios. El crecimiento vegetativo
podría aumentar cuando el nivel de dióxido de carbono aumenta levemente, como
19
pasa normalmente en áreas confinadas debido a las actividades respiratorias del
micelio (Ancco, 2013).
II.12 Composición nutricional
Se ha reportado que el píleo tiende a tener más beneficios nutricionales y
organolépticos, sin embargo, existe información de otras propiedades beneficiosas
en el estípite, causado por sus diversos compuestos bioactivos como son la quitina,
β-glucanos, eritadenina, ergosteroles, y ácidos grasos, además de altos niveles de
fibra. La fibra alimentaria insoluble favorece la función intestinal, consigue aumentar
el bolo fecal, optimizando el peristaltismo, su parte soluble tiende a tener
propiedades beneficiosas asociadas con el rol en la función fisiológica humana
como la disminución del nivel de colesterol y de la presión sanguínea, también
previene los problemas gastrointestinales y actúa protegiendo la aparición de
diferentes tipos de cáncer (Kvammen, 2018).
El shiitake tiene bajo índice calórico, alto nivel proteico, posee vitaminas del grupo
B y elevadas cantidades de riboflavina y niacina; definitivamente con un perfil de
altas propiedades nutricionales. El consumo de esta seta ayuda a contrarrestar el
desarrollo de enfermedades en las personas (Martinez, Sobal, Morales, & Martínez,
2014).
II.13 Compuestos bioactivos.
La variedad de la especie, sustrato, el cultivo, procesamiento y las condiciones
de almacenamiento son algunos de los factores que afectan la concentración de los
compuestos. Ligninas, triterpenos y polisacáridos, son los metabolitos presentes
20
que poseen la particularidad de dar al hongo su propiedad medicinal (Barros,
Ferrerira, & Queirós, 2007).
Los extractos acuosos y metanólicos del shiitake presentan compuestos fenólicos
los cuales se caracterizan por su elevada capacidad antioxidante. Otros de los
compuestos presentes son las ligninas, polímeros que se encuentran en las paredes
celulares del L. edodes con la característica antiviral, capaz de impedir en cierta
manera el avance del VIH (Rosero, 2015).
El valor nutricional del shiitake es sumamente elevado debido a que contiene 18
aminoácidos incluyendo los esenciales, además de contener concentraciones de
Na, Ca, Mg, Mn y P, etc. El perfil lipídico del L. edodes evidencia concentraciones
de ácido palmítico, ergosterol, dihidroxicolecalciferol y ácido linoleico. El shiitake
posee niveles menores de lípidos saturados y mayor cantidad de poliinsaturados
(Rivera, Albarracín, & Lares, 2017).
II.13.1 β- glucanos
Los β- glucanos son los compuestos bioactivos de la fibra que se encuentran
presentes en los hongos, estos compuestos se encargan de estimular la respuesta
inmune, además son hipoglucémicos, antioxidantes y anticancerígenos. También
contienen beneficios medicinales, incrementan la producción de insulina, participan
en la disminución de colesterol y LDL en sangre. El L. edodes en su cuerpo
fructífero posee el lentinan, que es un β- glucano; el cual inhibe la proliferación de
células cancerígenas en animales (Mendiola, 2017).
21
II.13.2 Polisacáridos
La pared celular del hongo, es el sitio que presenta mayor bioactividad, ahí se
encuentran la celulosa, quitina y β-glucanos estos polisacáridos presentan mayor
actividad antitumoral, antiviral e inmunomoduladora (Castro, 2018).
En la actualidad, en Japón se han desarrollado productos farmacéuticos
demostrados con éxito a partir de las setas del shiitake, un polisacárido como el
lentinano que se administra por inyección para prolongar la vida de pacientes con
cáncer gástrico y carcinoma colorrectal (Ancco, 2013).
II.13.3 Lentinan
Es el polisacárido con mayor presencia en el hongo Lentinula edodes (shiitake).
A la configuración de las moléculas de glucosa en estructura de hélice del lentinan
se le atribuye la actividad biológica. Este polisacárido fue aislado por primera vez
en el año de 1970, en donde se comprobó que sus acciones como antitumoral e
inmunomoduladora eran mejores que las de otros hongos comestibles (Yan, 2012).
II.13.4 Eritadenina
Es un derivado acíclico de la adenosina, metabolito secundario presente en el
shiitake, que cumple la actividad de reducir los niveles de colesterol en sangre, este
efecto se ha estudiado en animales de experimentación, comprobando que una
dieta de hongo fresco es eficaz en disminuir el colesterol sérico (Rivera, Albarracín,
& Lares, 2017).
22
II.13.5 Quitina y quitosano
Gran porcentaje de quitina se encuentra en el estípite del hongo seco y molido.
Esta parte, que actúa como base del sombre o píleo del shiitake es abundante en
quitina fúngica; además el estípite se usa para preparar quitosano que al igual que
la quitina poseen atributos biológicos como biocompatibilidad, biodegradabilidad,
propiedades curativas a heridas y actividades antimicrobianas y hemostáticas
(Rivera, Albarracín, & Lares, 2017).
II.13.6 Ergosterol
El estípite y el píleo del Lentinula edodes contienen ergosterol el cual es precursor
de la vitamina D, teniendo esta un papel importante en la absorción del calcio y
mineralización de los huesos. Los hongos al ser la única fuente no animal y no
alimenticia pueden proveer cantidades esenciales de vitamina D2 que es la principal
forma dietética. Se ha demostrado que al exponer el shiitake a la radiación UV, esta
cumple una valiosa función ya que el ergosterol de la pared celular del hongo se
transforma en pre vitamina D, que después se isomeriza térmicamente resultando
finalmente la vitamina D2 (Cardwell & Bornman, 2018).
II.14 Acción farmacológica
II.14.1 Antioxidante
Debido a las múltiples propiedades que presentan los hongos, la población ha
visto bastante interesada por consumo, su poder antioxidante es gracias al selenio,
tocoferoles, compuestos fenólicos, ergotioneína, carotenoides, entre otros. Se ha
encontrado mediante investigaciones que existen en la afinidad entre la facultad de
23
captar radicales libres y los fenoles, estos compuestos son los que tienen la
capacidad antioxidante. Los hongos al ser fuente de polisacáridos cooperan a
aumentar los sistemas de defensa contra daños oxidativos (Castro, 2018).
El selenio es indispensable en los procesos antioxidantes del cuerpo humano,
desempeñándose como un componente no proteico del glutatión peroxidasa,
estimulando las funciones de α-tocoferol y así beneficiando a los mecanismos de
reparación del DNA. La ergotioneína es un aminoácido presente en las setas
conocido como un antioxidante in vivo protector de las células contra el daño
oxidativo (Yan, 2012).
II.14.2 Antitumoral
El shiitake posee lentinan, que es un polisacárido antitumoral. Estudios
epidemiológicos comprueban que el consumo de setas con esta actividad
farmacológica reduce el riesgo de padecer tumores, ensayos en ratas albinas
señalan la inhibición de tumoraciones en un 80 a 100% (Wasser, 2011).
II.14.3 Antiviral
Se ha demostrado que extractos del shiitake en conjunto con zidovudina (AZT)
un medicamento que es utilizado para el tratamiento del VIH, suprime la expresión
del antígeno del virus más fuerte que aquellos que solo eran tratados solo con AZT
in vitro (Martínez, 2010).
24
II.14.4 Efecto hipocolesterolémico y antihipertensivo
Los ensayos en ratones que fueron alimentados con shiitake y una dieta rica en
lípidos, evidenciaron la reducción de los niveles de colesterol; así también se
comprobó el descenso de la presión sanguínea en ensayos con ratones hipertensos
(Martínez, 2010).
II.14.5 Inmunoestimulante
Los hongos comestibles poseen la capacidad de estimular el sistema inmune. El
micelio es una de las partes que contiene sustancias con efecto inmunoestimulante,
los polisacáridos con estructuras de terpenos, β- glucanos y lectinas, podrían usarse
como potenciadores para atenuar la inmunosupresión provocada por quimioterapia
(González, 2018).
II.14.6 Antimicrobiana
La mayoría de los compuestos presentes en las setas son usados como
antibacterianos y fungicidas en productos alimenticios. (Hassegawa, 2014) Indica
que: “Los extractos aislados del Lentinula edodes se muestran activos frente a
algunas bacterias como Streptococcus spp., Actinomyces spp., Lactobacillus spp. y
Porphyromonas spp.”
25
CAPÍTULO III. MARCO METODOLÓGICO
III.1 Tipo de Investigación
Este estudio fue experimental y de tipo exploratorio, debido a que en el Ecuador
el shiitake no goza de una comercialización abundante, por el desconocimiento de
sus propiedades y beneficios para la salud.
III.2 Equipos, Aparatos, Materiales y Reactivos
III.2.1 Materiales de laboratorio
Matraces Erlenmeyer 250 ml, 100 ml
Pipetas Graduadas 2 ml, 5 ml y 10 ml
Beakers 50 ml, 100 ml y 250 ml
Agitadores de Vidrio
Embudos
Espátulas
Probetas 250 ml
Papel filtro
Crisoles
Cápsulas
Papel filtro libre de cenizas
Pinza para crisoles
Desecador
Lápiz graso
Regla
Papel aluminio
26
Vidrio de Reloj
Piseta
Matraz Aforado
Rejilla de Asbesto
Gradilla
Tubos de Ensayo
Capilares
III.2.2 Equipos de Laboratorio
Estufa
Balanza analítica
Mufla
Reverbero
Cromatógrafo
III.2.3 Reactivos
Éter Etílicos
Metanol
Agua destilada
Etanol
Reactivo de Dragendorff
Reactivo de Wagner
Reactivo de Bouchardat
Reactivo de Mayer
Cloruro Férrico 5%
Reactivo de Benedict
27
Reactivo de Fehling A y Fehling B
Hidróxido de Sodio 10%
Anhídrido Acético 6%
Ácido Clorhídrico 20%
Reactivo de Baljet
Reactivo de Borntranger
Reactivo de Ninhidrina
Reactivo de Shinoda
Reactivo de Sudan III y Sudan IV
III.3 Muestra
El material vegetal usado fue el hongo fresco shiitake (Lentinula edodes) y se
recolectó en la Granja Orgánica Intiwasi, de la Comuna Tumbaco, ciudad de Quito,
Pichincha, Ecuador, el 3 de febrero del 2019, época de invierno. El hongo se
encontró en condiciones normales de temperatura 24 - 25°C para su recolección.
Se trabajó con una cantidad de ciento cincuenta setas seleccionadas por su
semejanza en diámetro, los defectuosos fueron descartados.
III.4 Metodología Experimental
III.4.1 Evaluación Macro morfológica de la Seta
La descripción macro morfológica se realizó a simple vista. Se muestrearon y
evaluaron cincuenta de las ciento cincuenta setas, según el método indicado en la
Norma Militar Estándar 105E, a los cuales se les efectuaron mediciones de diámetro
28
con ayuda de un vernier y se determinó el peso de cada hongo empleando una
balanza Mettler Toledo AL 204, se analizó la forma y coloración respectiva.
Se calculó la media, desviación estándar y coeficiente de variación.
III.5 Secado
Luego de la evaluación macro morfológica de la seta se procedió a esparcirlos
en papel aluminio para realizar el secado en la estufa Memmert, en un tiempo de 48
horas a 40°C, según lo citado en (Nollet, 2008).
III.6 Molienda
Una vez seca la muestra, se procedió a molerla en un molino de cuchilla hasta
obtener un polvo grueso.
III.7 Almacenamiento
Se almacenó en frascos de vidrio de boca ancha con tapa rosca, a una
temperatura promedio de 25°C para su posterior análisis.
29
III.8 Parámetros Físico – Químicos
III.8.1 Humedad Residual
El procedimiento está basado en la metodología descrita por (Miranda & Cuéllar,
2001).
Se empleó el método gravimétrico, de la muestra de laboratorio, con el grado de
trituración que determina la norma específica. Se pesó 2g con desviación permisible
de 0.5 mg y se transfirieron a una cápsula de porcelana previamente tarada y
desecada a 105 ºC hasta masa constante; seguidamente se desecó a 105 ºC
durante 3h. La cápsula se colocó en la desecadora donde se dejó enfriar a
temperatura ambiente y se pesó, colocándose nuevamente en la estufa durante 1h,
volviéndose a pesar, hasta obtener una masa constante.
Los resultados se obtuvieron por la siguiente expresión:
Hr = 𝑀2−𝑀1
𝑀2−𝑀 𝑥 100
Donde:
Hr = pérdida en peso por desecación (%)
M2 = masa de la cápsula con la muestra de ensayos (g)
M1 = masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (g)
M = masa de la cápsula vacía
100 = factor matemático para el cálculo
30
III.8.2 Cenizas totales
El procedimiento está basado en la metodología descrita por (Miranda & Cuéllar,
2001).
Se determinó la masa de no menos de 2.0 g ni más de 3.0 g de la porción de
ensayo pulverizada y tamizada con una desviación permisible de 0.5 mg en un crisol
de porcelana, previamente tarado. Se procedió a incinerar en una mufla a una
temperatura entre 550 - 600°C hasta obtener un residuo de color blanco o grisáceo
(3 a 4h aproximadamente). Se depositó el sistema (crisol-muestra) en un desecador,
para que se enfríe a temperatura ambiente y se volvió a pesar, repitiéndose el
proceso por duplicado hasta que no difirieran en más de 0.5 mg por g (masa
constante).
Los resultados se obtuvieron por la siguiente expresión:
CT = 𝑀2−𝑀
𝑀1−𝑀 𝑥 100
Donde:
CT = porcentaje de cenizas totales en base hidratada.
M = masa del crisol vacío (g)
M1 = masa del crisol con la porción de ensayo (g)
M2 = masa del crisol con la ceniza (g)
100 = factor matemático para los cálculos
31
III.8.3 Cenizas solubles en agua
El procedimiento está basado en la metodología descrita por (Miranda & Cuéllar,
2001).
A las cenizas totales obtenidas previamente, se le añadió 20 ml de agua. El crisol
se tapó y se hirvió suavemente a la llama del mechero por 5 minutos. La solución
se filtró a través de un papel de filtro libre de cenizas. El papel filtro con el residuo
se transfirió al crisol inicial, se carbonizó en un mechero y luego se incineró en una
mufla a 500 - 650ºC, por 3 horas. Posteriormente se colocó en una desecadora y
cuando alcanzó la temperatura ambiente se pesó.
Los resultados se obtuvieron por la siguiente expresión:
Ca = 𝑀2−𝑀
𝑀1−𝑀 𝑥 100
Donde:
Ca = porcentaje de cenizas solubles en agua en base hidratada
M2 = masa del crisol con las cenizas totales (g)
Ma = masa del crisol con las cenizas insolubles en agua (g) M1 = masa del crisol
con la muestra de ensayo (g)
M = masa del crisol vacío
100 = factor matemático
32
III.8.4 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico
Para la determinación de sustancias minerales insolubles en ácido clorhídrico se
utilizó igualmente el método gravimétrico para las cenizas totales y estas se
disolvieron en 3 ml de HCL al 10%. Se calentó en baño hirviente por 5 minutos.
Posteriormente se filtró cuantitativamente a través de papel filtro libre de cenizas
inmediatamente el crisol y el filtro se enjuagaron con agua caliente; a continuación,
se colocó el filtro en el crisol y se procedió a incinerar. El procedimiento se realizó
por triplicado. Los valores obtenidos se sustituyen en la ecuación:
% 𝑑𝑒 𝐶. 𝑖𝑛𝑠𝑜𝑙𝑢𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑒𝑛 á𝑐. =Nx100
𝑃
Donde:
N: g de cenizas insolubles de la muestra
P: g de la muestra
III.9 Tamizaje Fitoquímico
Estudio fitoquímico de Lentinula edodes (shiitake)
Identificación de Metabolitos Secundarios por Tamizaje Fitoquímico
El tamizaje fitoquímico fue realizado a la seta; previamente secada y pulverizada,
según procedimiento descrito por (Miranda & Cuéllar, 2001).
33
Se utilizó un sistema de extracción sucesiva de solventes de polaridad creciente
(menor a mayor polaridad); sobre la misma seta, para obtener que cada metabolito
fuera extraído correctamente, según su selectividad por el disolvente empleado.
La droga cruda se extrajo sucesivamente con éter etílico, etanol y agua, para
obtener los extractos los mismos que se pueden observar en el anexo 4; a los cuales
se les realizaron diferentes ensayos detallados en él anexo 5; los ensayos
realizados a la muestra de seta se detallan a continuación:
III.9.1 Ensayo de Sudán
Permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos grasos; para ello,
a la alícuota de la fracción en el solvente de extracción, se le añadió 1 ml de una
solución diluida en agua del colorante Sudán III o Sudán IV. Se calentó en baño de
agua hasta evaporación del solvente. Se consideró positivo si en el resultado
obtenido aparecen gotas o una película coloreada de rojo en el seno del líquido o
en las paredes del tubo de ensayo.
III.9.2 Ensayo de Dragendorff
Este ensayo es útil para distinguir en un extracto la presencia de alcaloides; para
ello, si la alícuota del extracto estuvo disuelta en un solvente orgánico, este se
evaporó en baño de agua y el residuo se redisolvió en 1 ml de ácido clorhídrico al
1% en agua. Si el extracto fue acuoso, a la alícuota se le añadió 1 gota de ácido
clorhídrico concentrado (se calentó suavemente y se dejó enfriar hasta acidez). Con
la solución acuosa ácida se realizó el ensayo, añadiendo 2 gotas del reactivo de
Dragendorff, si hubo opalescencia se consideró (+), turbidez definida (++),
precipitado (+++).
34
III.9.3 Ensayo de Mayer
Se procedió de la misma forma descrita anteriormente, hasta obtener la solución
ácida. Se añadió una pizca de cloruro de sodio en polvo, se agitó y filtró. Luego se
agregó 2 o 3 gotas de la solución reactiva de Mayer, si se observó opalescencia (+),
turbidez definida (++), precipitado coposo (+++).
Observación: En el caso de alcaloides cuaternarios y/o amino-óxidos libres,
estos sólo se encontrarán en el extracto acuoso y para considerar su presencia la
reacción debe ser (++) o (+++), en todos los casos, ya que un resultado (+) puede
provenir de una extracción incompleta de bases primarias secundarias o terciarias.
III.9.4 Ensayo de Wagner
Se partió igual que en los casos anteriores hasta obtener la solución ácida. Luego
se añadió 2 gotas del reactivo y se clasificó los resultados de la misma forma.
III.9.5 Ensayo de Baljet
El ensayo de Baljet ayuda a identificar cualitativamente, compuestos con
agrupamiento lactónico, en particular cumarinas, aunque otros compuestos
lactónicos pueden dar positivo al ensayo. Para ello, si la alícuota del extracto no se
encontraba en alcohol, se debió evaporar el disolvente en baño de agua y
redisolverse en la menor cantidad de alcohol (1 ml). En estas condiciones se
adicionó 1ml del reactivo, considerándose un ensayo positivo la aparición de
coloración (++) o precipitado rojo (+++) respectivamente.
35
III.9.6 Ensayo de Borntrager
Reconoce quinonas en un extracto vegetal. Para ello; si la alícuota del extracto
no se encontraba en cloroformo, se debió evaporar el solvente en baño de agua, y
el residuo redisolverse en 1 ml de cloroformo. Luego se adicionó 1 ml de hidróxido
de potasio al 5% en agua, se agitó mezclando las fases y se dejó en reposo hasta
su ulterior separación. Se consideró positivo, si la fase acuosa alcalina (superior) se
coloreó de rosado (++) o rojo (+++).
III.9.7 Ensayo de Liebermann - Buchard
Evidencia la presencia de triterpenos y/o esteroides; por ambos poseer un núcleo
del androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6. Para ello; si
la alícuota del extracto no se encontraba en cloroformo, se debió evaporar el
solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 ml de cloroformo. Luego se
adicionó 1 ml de anhídrido acético y se mezcló bien. Por la pared del tubo de ensayo,
se dejó resbalar 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar, considerándose
un ensayo positivo el cambio rápido de coloración:
Rosado-azul muy rápido
Verde intenso-visible rápido
Verde oscuro-negro final de la reacción
Observación: A veces el ensayo queda en dos fases o desarrollo de color. Muy
pocas veces puede observarse el primer cambio. El tercer cambio generalmente
ocurre cuando el material evaluado tiene cantidades importantes de estos
compuestos.
36
III.9.8 Ensayo de Catequinas
Para ello se tomó; con la ayuda de un capilar, una gota de la solución alcohólica
obtenida y se la aplicó sobre un papel de filtro. Sobre la mancha se aplicó una
solución de carbonato de sodio. La aparición de una mancha verde carmelita a la
luz UV, indicó un ensayo positivo.
III.9.9 Ensayo de Resinas
Para detectar este tipo de compuesto se adicionó a 2 ml de la solución
alcohólica, 10 ml de agua destilada. La aparición de un precipitado indicó un ensayo
positivo.
III.9.10 Ensayo de Fehling
Este ensayo declara la existencia de azúcares reductores. Para ello; si la alícuota
del extracto no se encontraba en agua, se debió evaporar el solvente en baño de
agua y el residuo redisolverse en 2 ml de agua, luego se adicionó 2 ml del reactivo
y se calentó la mezcla en baño de agua por 5 minutos. El ensayo se consideró
positivo si la solución se coloreó de rojo o apareció precipitado rojo.
III.9.11 Ensayo de Espuma
Indica la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpénica. Para
ello; si la alícuota no se encontraba en agua, previamente se diluyó con cinco veces
su volumen en agua y se agitó la mezcla fuertemente durante 5 minutos. El ensayo
37
se consideró positivo si apareció espuma en la superficie del líquido, de más de 2
mm de altura y persistió por más de 2 minutos.
III.9.12 Ensayo de Cloruro Férrico
Manifiesta compuestos fenólicos y/o taninos en un extracto vegetal. En extracto
alcohólico, el ensayo determina tanto fenoles como taninos. Para ello, a una alícuota
del extracto alcohólico se le adicionó 3 gotas de una solución de tricloruro férrico al
5% en solución salina fisiológica (cloruro de sodio al 0.9% en agua). En extracto
acuoso, el ensayo determina fundamentalmente taninos. Para ello, a una alícuota
del extracto, se le añadió acetato de sodio para neutralizar, y tres gotas de una
solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica. Un ensayo positivo
puede dar los siguientes resultados:
Desarrollo de una coloración rojo-vino, compuestos fenólicos en general.
Desarrollo de una coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos.
Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotanicos.
III.9.13 Ensayo de Ninhidrina
Demuestra la existencia o ausencia de aminoácidos libres y/o aminas en general.
Para ello, se tomó una alícuota del extracto en alcohol, si el extracto se encontraba
en otro solvente orgánico, se mezcló con 2 gotas de solución al 2% de ninhidrina en
agua y se calentó la mezcla por 5 minutos en baño de agua. El ensayo se consideró
positivo si se desarrolló un color azul violáceo.
38
III.9.14 Ensayo de Shinoda
Evidencia la presencia de flavonoides en un extracto vegetal. Si la alícuota del
extracto se encontraba en alcohol, se diluyó previamente con 1 ml de ácido
clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico, después de la
reacción se esperó por 5 min, se añadió 1 ml de alcohol amílico, se mezclaron las
fases y se dejó reposar hasta su separación. Si la alícuota del extracto se
encontraba en agua, se procedió de igual forma, a partir de la adición del ácido
clorhídrico concentrado.
El ensayo se consideró positivo si el alcohol amílico se coloreó de amarillo, naranja
carmelita o rojo (intensos).
III.9.15 Ensayo de Antocianidinas
Para ello se calentó 2 ml del extracto etanólico por 10 minutos con 1 ml de ácido
clorhídrico concentrado. Se dejó enfriar y se adicionó 1 ml de agua y 2 ml de alcohol
amílico, luego se agitó y se dejó en reposo hasta la separación de sus fases. El
ensayo se consideró positivo porque se desarrolló un color rojo a marrón en la fase
amílica.
A continuación, se presenta el esquema para realizar los extractos (figura 4), y
los procedimientos empleados en el tamizaje fitoquímico en las figuras 5 y 6.
39
Fuente: Autores
30 – 50 g de material vegetal
Extraer con 90 – 150 ml de éter etílico por maceración durante
48 horas a temperatura ambiente.
Filtrar
Extracto Etéreo
Medir volumen y
calcular concentración.
Residuo sólido
Secar y pesar
Extraer con 3 veces el peso del residuo en volumen con etanol por
maceración durante 48 horas.
Filtrar
Residuo sólido
Secar y pesar
Extracto Alcohólico
Medir volumen y
calcular concentración.
Extraer con 3 veces el peso del residuo en volumen con agua destilada por
maceración durante 48 horas.
Filtrar
Residuo sólido
Secar y pesar
Extracto Acuoso
Medir volumen y
calcular concentración.
Figura 4. Procedimiento para realizar los extractos
40
Figura 5. Ensayos a realizar en los diferentes extractos.
Fuente: Autores
Extracto Etéreo
Dividir fracciones
5 ml
Ensayo de Sudán
(Aceites y grasas)
6 ml
(dividir en 3 porciones)
Ensayos de Dragerndorf, Mayer y Wagner
(Alcaloides)
5 ml
Ensayo de Baljet
(Lactonas y Coumarinas)
5 ml
Ensayo de Liebermann -Buchard
(Triterpenos - esteroides)
Extracto Acuoso
Dividir fracciones
6 ml
(dividir en 3 porciones)
Ensayos de Dragerndorf, Mayer y Wagner
(Alcaloides)
2 ml
Ensayo de Fehling
(Az. reductores)
2 ml
Ensayo de Cloruro Férrico
(Taninos)
2 ml
Ensayo de espuma
(Saponinas)
2 ml
Ensayo de Mucilagos
1 - 2 gotas
Ensayo de Principios amargos
41
Figura 6. Ensayos a realizar en los diferentes extractos
Fuente: Autores
Extracto Alcohólico
Dividir fracciones
1 ml Ensayo de Catequinas
2 ml Ensayo de Resinas
2 ml Ensayo de Fehling
(Az. reductores)
2 ml Ensayo de Baljet
(Lactonas)
2 ml Ensayo de Lieberman - Buchard
(Triterpenos y/o esteroides)
2 ml Ensayo Espuma
(Saponinas)
2 ml Ensayo de Cloruro Férrico
(Fenoles y taninos)
2 ml Ensayo de Ninhidrina
(Aminoácidos)
2 ml Ensayo de Borntrager
(Quinonas)
2 ml Ensayo de Shidona
(Flavonoides)
2 ml Ensayo de Antocianidina
6 ml
(Dividir en 3 porciones)
Ensayos de Dragendorff, Mayer y Wagner
(Alcaloides)
42
III.10 Análisis por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de
masas (CG-EM)
En el análisis del polvo seco del shiitake (Lentinula edodes) se utilizó para la
identificación de compuestos las siguientes condiciones de trabajo:
Se utilizó 2 mg de polvo seco de shiitake, el mismo que fue derivatizado con 120
µl del reactivo BSTFA (N, O-Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida). Esta mezcla se la
dejó reaccionar durante 2 horas a 80°C en baño de agua.
Posteriormente el sobrenadante se colocó en un vial de vidrio previo a la inyección
mediante CG-EM.
La detección de compuestos se efectuó por cromatografía de gases acoplado a
espectrometría de masas (CG-EM) en un equipo marca Agilent Technologies
(Sistema 7890ª GC y 5975C inert XL MSD con detector de triple eje. Se empleó una
columna DB-5MS (30 m de longitud x 0.25mm de diámetro interno) y 0,25
micrómetros de espesor de película utilizando helio (He) como gas de arrastre en
un flujo de 1,2 ml/min.
Se inyectó 2ul de muestra derivatizada en modo Splitless. La temperatura de
inyección fue de 70°C, la temperatura del horno se mantuvo en 70°C por 2 min y se
incrementó hasta 300°C a 5°C/min con un tiempo de espera de 6 min. La
temperatura de line a de transferencia fue de 300°C y la temperatura del detector
fue de 230°C. Los compuestos fueron identificados mediante comparación con los
espectros de masas de la biblioteca del equipo: Wiley, 9na edición y NIST 2011. El
rango de screening empleado fue de 40-600 u.m.a con un voltaje de
electroionización de 70 Ev. Todas las condiciones cromatográficas se especifican
en forma de reporte generado por el equipo.
43
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN
IV.1 Evaluación Macromorfológica de las setas
La seta posee un sombrero de color castaño claro u oscuro con tonos rojizos con
un himenio de color blanquecino y un tronco beige rodeado de un anillo efímero de
color blanquecino a castaño claro. La forma del sobrero es asimétrica de 5-12 cm
de ancho, seguido del tallo corto y central.
En la evaluación morfológica de la seta se consideró su diámetro, peso y el color
de las superficies externas e internas, obteniendo un promedio de 6,14 cm de ancho
y 18,16 g para el peso.
Se realizó un análisis estadístico en comparación de los parámetros en estudio,
cuyos resultados son desglosados en la tabla VII y el consolidado estadístico se
detalla en la tabla VIII.
44
Tabla VII. Análisis estadístico de los parámetros morfológicos de muestras de setas de Lentinula edodes ¨desglose¨
Fuente: Autores.
PARÁMETROS
# Intensidad de Color
ANCHO (cm) PESO (g) Exterior (Castaño claro u oscuro) Interior (Blanco o beige)
1 Castaño oscuro Beige 4,30 21,88 2 Castaño oscuro Beige 6,20 15,78 3 Castaño oscuro Beige 5,50 14,02 4 Castaño claro Blanco 6,70 12,91 5 Castaño claro Blanco 6,50 25,49 6 Castaño claro Blanco 5,70 24,13 7 Castaño claro Blanco 6,90 15,50 8 Castaño claro Blanco 6,40 22,63 9 Castaño claro Blanco 5,90 24,35
10 Castaño claro Blanco 6,00 28,53 11 Castaño claro Blanco 6,50 13,90 12 Castaño claro Blanco 6,40 18,95 13 Castaño oscuro Beige 4,40 11,19 14 Castaño claro Blanco 4,60 9,44 15 Castaño claro Blanco 6,70 16,81 16 Castaño claro Blanco 4,90 19,74 17 Castaño claro Blanco 4,40 12,86 18 Castaño claro Blanco 5,60 16,89 19 Castaño oscuro Beige 6,20 23,33 20 Castaño claro Blanco 5,80 8,50 21 Castaño claro Blanco 5,60 31,51 22 Castaño oscuro Beige 5,50 13,87 23 Castaño oscuro Beige 6,90 20,14 24 Castaño oscuro Beige 7,60 22,94 25 Castaño oscuro Beige 4,70 13,53 26 Castaño claro Blanco 6,60 25,25 27 Castaño oscuro Beige 6,60 8,85 28 Castaño claro Blanco 5,50 12,44 29 Castaño claro Blanco 6,40 33,64 30 Castaño oscuro Beige 6,50 17,26 31 Castaño oscuro Beige 5,70 18,35 32 Castaño oscuro Beige 6,00 11,57 33 Castaño oscuro Beige 5,90 25,27 34 Castaño claro Blanco 6,70 21,40 35 Castaño oscuro Beige 6,20 23,37 36 Castaño oscuro Beige 7,20 24,83 37 Castaño oscuro Beige 7,40 19,17 38 Castaño oscuro Beige 6,40 17,31 39 Castaño claro Blanco 6,20 10,50 40 Castaño claro Blanco 7,20 20,57 41 Castaño claro Blanco 8,00 14,92 42 Castaño claro Blanco 7,00 13,48 43 Castaño oscuro Beige 6,40 16,75 44 Castaño oscuro Beige 6,20 19,69 45 Castaño oscuro Beige 6,90 16,25 46 Castaño claro Blanco 5,90 17,67 47 Castaño claro Blanco 7,20 15,00 48 Castaño claro Blanco 4,90 17,39 49 Castaño oscuro Beige 6,20 8,43 50 Castaño claro Blanco 5,80 20,02
PROMEDIO 6,14 18,16
DESVIACIÓN ESTANDAR (DS) 0,842 5,839
COEFICIENTE DE VARIACIÓN (CV) 13,72% 32,14% VARIANZA 0,709 34,093
45
Tabla VIII. Análisis estadístico de los parámetros morfológicos de muestras de setas de
Lentinula edodes ¨consolidado¨
CÁLCULOS ESTADISTICOS (N=50)
PARÁMETROS Promedio Desviación Estándar (SD)
Varianza Coeficiente de Variación
(CV)
Seta completa
Ancho 6,14 cm 0,842 0,709 13,72%
Peso 18,16 g 5,839 34,093 32,14%
Fuente: Autores
IV.2 Determinación de los parámetros fisicoquímicos
IV.2.1 Determinación de Humedad Residual
En la determinación de humedad residual del polvo de Lentinula edodes se
presentó una variación de valores con un promedio de 7,48%, resultado que se
encuentra dentro de los parámetros permitidos para este tipo de productos de
acuerdo con la norma Codex STAN 38-1981 citada por (Torres, Ocampo,
Rodríguez, & Chang, 2017), para el polvo de hongos comestibles desecados debe
ser máximo 9% m/m (tabla IX).
Tabla IX. Resultado de porcentaje Humedad residual de setas de Lentinula edodes
CÁPSULAS
MASA DE CÁPSULAS
VACIAS (m)
GRAMOS DE
MUESTRA (g)
MASA DE CÁPSULA + MASA
DE MUESTRA
(M2)
CÁPSULA +
MUESTRA DESECADA
(M1)
% DE HUMEDAD RESIDUAL
1 20,339 2,238 22,577 22,416 7.15
2 30,174 2,238 32,412 32,242 7.60
3 24,067 2,217 26,284 26,128 7.00
4 21,689 2,220 23,909 23,730 8.00
5 33,160 2,230 35,390 35,226 7.40
6 33,868 2,128 35,996 35,831 7.70
x̄ HUMEDAD RESIDUAL 7.48
DESVIACIÓN ESTANDAR (DS) 0.37
COEFICIENTE DE VARIACIÓN (CV) 4.9
Fuente: Autores.
46
IV.2.2 Determinación de cenizas
La determinación de cenizas es un parámetro de calidad para observar el
porcentaje de minerales que se encuentran en la muestra de ensayo; se realizaron
en seis crisoles, obteniendo un porcentaje promedio de 7,3% valor que está dentro
del límite permitido (6,9% - 10,5% en base seca) de acuerdo a (Manzi, Gambelli,
Marconi, Vivanti, & Pizzoferrato, 1999) valores que se indican en la tabla X.
Los datos de los crisoles del 1 al 3 se utilizaron para cenizas solubles en agua
obteniendo un promedio de 6,12% (tabla XI) y del 4 al 6 para cenizas insolubles en
ácido con un promedio de 5,66% (tabla XII); presentado un mayor porcentaje de
cenizas solubles en agua que insolubles en ácido debido a que es mayor la
diferencia en peso entre las cenizas totales y el residuo; después del tratamiento
con agua.
IV.2.2.1 Cenizas totales
Tabla X. Resultado de porcentaje de Cenizas totales de setas de Lentinula edodes.
CRISOLES
MASA DE CRISOL VACIO
(M)
GRAMOS DE
MUESTRA
MASA DE CRISOL + MUESTRA
(M1)
CRISOL + MUESTRA
DESECADA (M2)
% DE CENIZAS TOTALES
1 25,143 2,498 27,641 25,315 6.9
2 26,836 2,499 29,335 27,014 7.1
3 27,033 2,448 29,480 27,211 7.2
4 27,835 2,481 30,316 28,028 7.7
5 28,223 2,454 30,677 28,409 7.6
6 28,493 2,486 30,978 28,671 7.1
x̄ % CENIZAS TOTALES 7.3
DESVIACIÓN ESTANDAR (DS) 0.31
COEFICIENTE DE VARIACIÓN (CV) 4.2
Fuente: Autores
47
IV.2.2.2 Cenizas solubles en Agua
Tabla XI. Resultado de porcentaje de Cenizas solubles en agua de setas de Lentinula edodes
CRISOLES
MASA DE CRISOL CON CT
(M2)
MASA DE CRISOL CON Ca
(Ma)
MASA DE CRISOL + MUESTRA
(M1)
MASA DE CRISOL
VACIO (M)
GRAMOS DE
MUESTRA
% DE CENIZAS
SOLUBLES EN AGUA
1 25,315 25,176 27,641 25,143 2,498 5.58
2 27,014 26,859 29,335 26,835 2,499 6.19
3 27,211 27,049 29,480 27,033 2,448 6.58
x̄ % CENIZAS SOLUBLES EN AGUA 6.12
DESVIACIÓN ESTANDAR (DS) 0.41
COEFICIENTE DE VARIACIÓN (CV) 6.7
Fuente: Autores
IV.2.2.3 Cenizas insolubles en Ácido
Tabla XII. Resultado de porcentaje de Cenizas insolubles en ácido de setas de Lentinula edodes.
CRISOLES
GRAMOS DE
MUESTRA (P)
CRISOLES CON
CENIZAS TOTALES
CRISOLES CON
CENIZAS INSOLUBLES
GRAMOS DE CENIZAS
INSOLUBLES DE LA
MUESTRA (N)
% CENIZAS INSOLUBLES
EN ÁCIDO
4 2,481 28,028 27,888 0,140 5.64
5 2,455 28,409 28,269 0,140 5.71
6 2,485 28,671 28,531 0,140 5.64
x̄ % CENIZAS INSOLUBLES EN ÁCIDO 5.66
DESVIACIÓN ESTANDAR (DS) 0.04
COEFICIENTE DE VARIACIÓN (CV) 0.7
Fuente: Autores
IV.3 Tamizaje fitoquímico
La evaluación de los parámetros de calidad continuó con el tamizaje fitoquímico
realizado en la seta del shiitake.
48
Se pudo observar que L. edodes presenta una diversidad de compuestos donde
se evidencia potencial farmacológico. Se verificó la presencia de alcaloides en los
tres extractos mediante los ensayos de Dragendorff y Wagner pese a que los
alcaloides no son característicos del shiitake; es importante resaltar que en estos
ensayos se pueden producir falsos positivos si en los extractos hay presencia de
compuestos con agrupamiento lactónico como por ejemplo la 2 – pirrolidinona; 2 -
piperidona o abundantes azúcares (Pereira & Vega, 2014).
En el ensayo de Liebermann – Buchard tanto en el extracto etéreo como en el
extracto alcohólico se demostró reacción positiva en compuestos como triterpenos
y/o esteroides, mostrando una coloración rápida desde rosado-azul hasta verde
oscuro-negro en donde se dio fin a la reacción.
La presencia de resinas en el extracto alcohólico puede atribuirse a los diferentes
tipos de sustratos utilizados para el desarrollo y crecimiento del hongo ya que este
metabolito no es propio del shiitake (Valenzuela & Saavedra, 2009).
En el ensayo de Cloruro Férrico se demostró la presencia de fenoles en los
extractos acuoso y alcohólico; por otro lado, el ensayo de Shinoda para el extracto
alcohólico y acuoso reconoció la existencia de flavonoides.
El ensayo de ninhidrina en el extracto alcohólico se mostró positivo, demostrando
así que el espécimen posee aminoácidos; para la determinación de aceites y grasas
se empleó el ensayo de Sudán indicando que la muestra contiene estos metabolitos.
Para el análisis de azúcares reductores se cumplió con el ensayo de Fehling
exponiendo la ausencia de estos compuestos, pese a que estudios realizados por
49
(Ramos, 2015) indica que el shiitake presenta mayores niveles de azucares tales
como fructosa, manitol y trehalosa; probablemente se evidencia un falso negativo,
resultado que puede deberse a que el grupo carbonilo que da el poder reductor se
encuentra combinado y no pueda presentar esta reacción (Rojas & Ontaneda,
2018).
Así mismo los ensayos como Baljet, Brorntrager, espuma, catequinas y
antocianidinas mostraron resultados negativos en los diferentes extractos;
resultados que se presentan a continuación en la tabla XIII.
50
Tabla XIII. Resultados del Tamizaje Fitoquímico de Lentinula edodes
ENSAYOS METABOLITOS EXTRACTOS
ÉTER ACUOSO ALCÓHOLICO
Ensayo de Dragendorff
Alcaloides + + +++
Ensayo de Wagner
Alcaloides +++ ++ +++
Ensayo de Mayer
Alcaloides - + +
Ensayo de Liebermann -
Buchard
Triterpenos y/o Esteroides
+ +
Ensayo de Brorntrager
Quinonas - -
Ensayo de Baljet
Agrupamientos lactónicos y coumarinas
- -
Ensayo de Fehling
Azúcares reductores
- -
Ensayo de Resinas
Resinas +
Ensayo de Cloruro Férrico
Fenoles y taninos
+ +
Ensayo de Catequinas
Catequinas -
Ensayo de Espuma
Saponinas - -
Ensayo de Shinoda
Flavonoides + +
Ensayo de Antocianidinas
Antocianidinas -
Ensayo de Ninhidrina
Aminoácidos +++
Ensayo de Sudán
Aceites y grasas
+++
Leyenda: (+) coloración, (++) turbidez, (+++) precipitado, (-) negativo, n/a (rojo).
Fuente: Autores
51
IV.4 Identificación de compuestos por Cromatografía de Gases acoplado a
Espectrometría de Masas (CG/EM).
En este análisis se realizó la corrida del sobrenadante de la muestra derivatizada;
por medio de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas se
encontraron como compuestos mayoritarios: galactitol; ácido n-hexadecanoico;
ácido 9, 12 octadecadienoico (z-z); ácido octadecanoico; trehalosa; ácido fosfórico
y xilitol; los mismos que son detallados en la tabla XIV, ordenados según el tiempo
de retención de manera ascendente, los mismos que se pueden visualizar en la
figura 7.
Comparando los resultados del tamizaje fitoquímico con los compuestos
identificados por CG/EM, se puede afirmar, que el resultado positivo en el ensayo
de Sudán para compuestos grasos puede estar relacionado con el ácido n-
hexadecanoico (ácido palmítico), ácido 9, 12 octadecadienoico (ácido α-linolénico);
ácido octadecanoico (ácido esteárico), mientras que xilitol, trehalosa y galactitol son
azúcares reportados en investigaciones preliminares realizadas por otros autores
sobre los componentes bioactivos del Lentinula edodes.
52
Tabla XIV. Cromatografía de Gases acoplado a Espectrometría de Masas (CG/EM) de
Lentinula edodes.
RESULTADOS
COMPUESTO FÓRMULA TIEMPO DE RETENCIÓN
(min)
ABUNDANCIA Unidades (%
Área ± DE)
Ácido fosfórico H3PO4 12.780 3.76 ± 0.16
Xilitol C5H12O5 23.803 9.25 ± 0.13
Galactitol o dulcitol C6H14O6 28,235 44.43 ± 0.63
Ácido hexadecanoico C16H32O2 30.313 1.21 ± 0.09
Ácido 9,12-octadecadienoico
C18 H32O2 33.251 1.76 ± 0.04
Ácido octadecanoico C18 H36O2 33.880 2.28 ± 0.09
Trehalosa C12H22O11 41.672 11.30 ± 1.57
Fuente: Autores.
Fuente: Autores.
10.00 15 .00 20 .00 25 .00 30 .00 35 .00 40 .00 45 .00 50 .00
5e+07
1e+08
1 .5e+08
2e+08
2 .5e+08
3e+08
3 .5e+08
4e+08
4 .5e+08
5e+08
T ime-->
Abundanc e
T IC: SH A1.D \ da ta .ms
Figura 7. Perfil cromatográfico de hongo seco y triturado
53
CONCLUSIONES
La evaluación macromorfológica mostró un resultado promedio de 6.14 cm
para el ancho del sombrero y 18.16 g para el peso de la seta; en la caracterización
fisicoquímica se obtuvieron resultados con una media de: 7,48% para humedad;
7,3% cenizas totales; 6,12% cenizas solubles en agua y 5,66% cenizas insolubles
en HCl valores que se encuentran dentro de los rangos aceptables.
Se demostró la existencia de metabolitos secundarios mediante la realización
del tamizaje fitoquímico siendo los flavonoides, aminoácidos y aceites los
compuestos con mayor presencia.
De acuerdo a los datos obtenidos del análisis del perfil cromatográfico, se
identificó la composición química del shiitake (Lentinula edodes) obteniendo 7
compuestos mayoritarios destacando entre ellos los aminoácidos y el polialcohol
derivado de la galactosa denominado galactitol con una abundancia de 44.43 ± 0.63.
54
RECOMENDACIONES
Realizar un método de extracción adecuado para identificar el componente
lentinan.
Identificar metabolitos con otras técnicas cromatográficas (HPLC).
Comparar químicamente setas del hongo shiitake de diferentes lugares del
país.
Reforzar y ampliar los estudios en la seta ecuatoriana del shiitake para
comprobar si posee todos los componentes bioactivos atribuidos.
55
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GLOSARIO
Alzheimer: Enfermedad progresiva que afecta a la memoria y otras
importantes funciones mentales.
Anteridio: Estructura sexual masculina que produce los anterozoides. En
algas y hongos son unicelulares (salvo las Charophyceas), en el resto de los
vegetales presenta una envoltura de células estériles cubriendo el tejido
esporógeno.
Ascogonio: Cuerpo fructífero de las Ascomicetas donde se originan los
ascos.
Ascomycete: Definición genérica que identifica a los Ascomycetes cuyo
cuerpo frutal es un cleistotecio. Entre ellos existen especies sésiles y estipitadas,
superficiales, de crecimiento semiinmerso en el sustrato o completamente inmerso.
Basidiomycetes: Hongos que se reproducen por basidiosporas, las cuales
se forman en unas estructuras claviformes llamadas basidios.
Basidios: Es una estructura microscópica productora de esporas encontrado
en los himenóforos de los cuerpos fructíferos de los hongos basidiomicetos.
Castanea: Género de plantas de la familia de las fagáceas, nativas de las
regiones templadas del hemisferio norte, conocidas comúnmente como castaños.
Clorofila: Es el pigmento fotorreceptor responsable de la primera etapa en
la transformación de la energía de la luz solar en energía química.
Cuerpo fructífero: Es comúnmente se llama “hongo”, son los cuerpos
fructíferos de los mismos, encargados de producir las esporas cuya función es la
reproducción sexual.
Elaeocarpus: Es un género botánico de plantas perteneciente a la familia
Elaeocarpaceae.
Eritadenina: Compuesto químico que se encuentra en los hongos shiitake.
Es un inhibidor de la S-adenosil-L-homocisteina hidrolasa (SAHH) y tiene actividad.
Fase reproductiva: Son todas las etapas por las que atraviesa la planta una
vez que supera la fase vegetativa y entra en producción.
63
Fase vegetativa: Corresponde a una de las fases de desarrollo de las
plantas. Esta fase se refiere a la fase de crecimiento de la planta hasta que ésta
alcanza el estado reproductivo, corresponde así a la fase juvenil.
Ficomycetes: Clase de hongos (Phycomycetes) unicelulares saprófitos o
parásitos de plantas o de animales. Los Ficomicetes, llamados comúnmente
hongos-alga.
Hifas: Son las unidades estructurales de la mayoría de los hongos, sobre
todo en los filamentos. Presentan tabiques transversales en forma de número
regular, con un poro de comunicación en el centro, son hifas septadas.
Inmunomoduladores: Sustancia que actúa regulando el sistema inmune,
mediante el aumento o la disminución de la capacidad de producir anticuerpo.
Lentinan: Polisacárido termolábil del shiitake, que tiene actividad
antitumoral.
Levaduras: Hongo unicelular que produce enzimas capaces de provocar la
fermentación alcohólica de los hidratos de carbono. No posee micelios.
Lithocarpus: Es una especie de roble nativo de Japón perteneciente a la
familia de las fagáceas.
Macrofungos: Se refiere a hongos de gran tamaño, aquellos que podemos
ver a simple vista.
Mixomycetes: Grupo taxonómico de hongos, frecuentes sobre madera, con
dos fases en su ciclo de vida, un vegetativo móvil, constituido por un plasmodio
(masa de protoplasma desprovista de pared celular), y otra reproductora, fijo al
sustrato, formada por los esporangios.
Mohos: Son organismos microscópicos que viven en la materia animal o
vegetal. Poseen un micelio vegetativo.
Nutracéutico: Sustancias químicas o biológicas activas que pueden
encontrarse como componentes naturales de los alimentos o adicionarse a los
mismos. Se presenta en una matriz no alimenticia (píldoras, cápsulas, polvo, etc.),
y que, administrada en dosis superior a la existente en esos alimentos, presume un
efecto favorable sobre la salud, mayor al que posee el alimento normal.
64
Organismo aeróbico: Se denomina aerobios a los organismos que
necesitan del oxígeno para vivir o a los procesos que lo necesitan para poder
desarrollarse.
Parkinson: Trastorno del sistema nervioso central que afecta el movimiento
y suele ocasionar temblores.
Periodo de incubación: Es el intervalo de tiempo entre la invasión por un
agente y la aparición de los primeros signos o síntomas.
Polisacáridos: Son moléculas largas compuestas por un número variable de
unidades de glucosa unidas entre sí.
Primordios: Es el estado rudimentario en que se encuentra un órgano en
formación, usualmente protegido en el interior de una yema en las espermatofitas.
Quercus: Es un género de árboles perteneciente a la familia de las fagáceas.
Reino Fungí: Designa a un taxón o grupo de organismos eucariotas entre
los que se encuentran los mohos, las levaduras y los organismos productores de
setas.
Reproducción asexual: Forma de reproducción que se produce sin la fusión
de células sexuales, sino por otros medios, como la fisión o la gemación.
Saprofito: Que se alimenta de materia vegetal o animal muerta.
Sésil: Sentada, carente de peciolo en el caso de las hojas o de pedúnculo o
pedicelo en las flores.
Seta: Nombre genérico con que se designa a cualquier hongo cuya forma
consiste en un sombrero sostenido por un pie.
Shiitake: Es una seta con potencial comestible y medicinal que pertenece al
Reino Fungí.
Simbiosis: Asociación de dos seres de distinta especie en la que ambos
resultan beneficiadas.
Sustancias bioactivas: Componentes de los alimentos que influyen en la
actividad celular y en los mecanismos fisiológicos y con efectos beneficiosos para
la salud.
Sustrato: Un sustrato de cultivo es un medio material en el que se
desarrollan las raíces de las plantas, limitado físicamente en su volumen, aislado
65
del suelo para impedir el desarrollo de las raíces en el mismo y capaz de
proporcionar a la planta el agua y los elementos nutritivos que demande, y a las
raíces el oxígeno necesario para su respiración.
Zidovudina: Fue el primer medicamento antirretroviral (ARV), aprobado
en 1987 como un medicamento indicado para personas con infección por VIH por
su efecto en la supresión de la replicación viral.
66
ANEXOS
Ilustración 1 Hongos Receptados enviados desde Quito
Ilustración 2 Hongo Shiitake fresco
Ilustración 3 Secado en Estufa a 40°C Ilustración 4 Muestra Pulverizada después
del secado
Anexo 1. Pre tratamiento de la muestra - secado y pulverizado
67
Ilustración 5 Cantidad en gramos de espécimen utilizado
Ilustración 6 Muestra en el desecador
Anexo 2. Determinación de Humedad Residual
68
Ilustración 7 Crisol previamente pesado
Ilustración 8 Incineración de la muestra
Ilustración 9 Muestra en la mufla previo al desecador.
Anexo 3. Determinación de Cenizas Totales
69
Ilustración 10 Extracto Etéreo
Ilustración 11 Extracto Alcohólico Ilustración 12 Extracto Acuoso
Anexo 4. Extractos
70
Extracto Etéreo
Ilustración 13 Sudan III Positivo
Ilustración 14 Baljet Negativo
Ilustración 15 Liebermann Buchard
Positivo
Ilustración 16 Wagner (+++)
Ilustración 17 Mayer ( - )
Ilustración 18 Dragendorff ( + )
Anexo 5 Tamizaje Fitoquímico de los extractos Etéreo, Alcohólico y Acuoso
71
Ilustración 19 Espuma: Alcohol y Acuoso Negativo
Ilustración 20 Fehling en: Alcohol y Acuoso Negativo
Ilustración 21 Dragendorff Acuoso (+) y Alcohólico (+++)
Ilustración 22 Wagner Acuoso (++) Alcohólico (+++)
72
Ilustración 24 Mayer Acuoso (+) Alcohólico (+)
Ilustración 25 Shinoda Acuoso (+) Alcohólico (+)
Ilustración 26 Resina extracto Alcohólico (+)
Ilustración 27 Antocianidinas extracto Alcohólico (-)
Ilustración 28 Catequinas Extracto Alcohólico (-)
Ilustración 29 Ninhidrina extracto Alcohólico (+++)