UNIVERSIDAD DE LA REPÚBLICA FACULTAD DE AGRONOMÍA ...€¦ · III AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer en primer lugar a mis padres por apoyarme incondicionalmente a lo largo de toda

UNIVERSIDAD DE LA REPÚBLICA FACULTAD DE AGRONOMÍA

INTRODUCCIÓN AL CULTIVO IN VITRO DE Ilex paraguariensis

por

María Emilia ARRIAGA TAMOSIUNAS TESIS presentada como uno de los requisitos para obtener el título de Ingeniero Agrónomo

MONTEVIDEO URUGUAY

2016

II

Tesis aprobada por:

Director: ------------------------------------------------------------------------- Ing. Agr (M.Sc.) Silvia Ross

------------------------------------------------------------------------- Ing. Agr. Dra. Alicia Castillo (INIA Las Brujas)

------------------------------------------------------------------------- Ing. Agr (M.Sc.) Gabriela Jolochin

Fecha: 3 de junio de 2016 Autor: ----------------------------------------------------------------------------

Bach. María Emilia Arriaga Tamosiunas

III

AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer en primer lugar a mis padres por apoyarme

incondicionalmente a lo largo de toda la carrera. A mis hermanos y a mi tía Graciela, por la compañía mientras

redactaba esta tesis. A mi tutora Ing. Agr (M.Sc.) Silvia Ross por su guía, sus consejos,

disposición y ayuda. A todos los compañeros del Laboratorio de Fisiología Vegetal,

especialmente a Evelin por su ayuda inmensurable. A la Dra. Andrea Rodríguez del Laboratorio de Microbiología, por su

ayuda en el reconocimiento de las bacterias. Al Dr. Nelson Bracesco y al Ing. Agr. Andrés Berruti por proporcionar el

material vegetal utilizado en esta tesis.

IV

TABLA DE CONTENIDO

Página

PÁGINA DE APROBACIÓN…………………………………………………….. II

AGRADECIMIENTOS……………………………………………………………. III

LISTA DE CUADROS E ILUSTRACIONES…………………………………… VI

1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………. 1

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA…………………………………………………. 3

2.1. Ilex paraguariensis……………………………………………………... 3

2.1.1. Importancia en Uruguay……………………………………….. 3

2.1.2. Características de la especie………………………………….. 4

2.1.3. Distribución natural…………………………………………….. 5

2.2. PROPAGACIÓN VEGETATIVA……………………………………… 6

2.2.1. Razones por las cuales clonar la especie…………………… 6

2.2.2. Métodos de propagación vegetativa………………………….. 7

2.3. TÉCNICAS DE MICROPROPAGACIÓN……………………………. 8

2.3.1. Etapas del proceso de micropropagación…………………… 8

2.3.2. Composición del medio de cultivo……………………………. 10

2.3.3. Propiedades del ión plata……………………………………… 11

2.3.4. Problemas de la micropropagación…………………………... 12

2.3.5. Factores que afectan la respuesta in vitro…………………… 13

2.3.6. Antecedentes en la micropropagación de la especie………. 16

3. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………. 18

3.1. MATERIAL VEGETAL…………………………………………………. 18

3.1.1. Pre-tratamientos…………………………………………………………… 19

3.1.2. Selección de los explantos………………………………………………. 19

3.2. TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN Y CONTROL OXIDATIVO 19

3.3. MEDIOS DE CULTIVO………………………………………………… 20

3.4. INCUBACIÓN…………………………………………………………... 21

3.5. PARÁMETROS MUESTREADOS Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO….. 22

3.6. IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS………………………………….. 23

3.6.1. Medio de cultivo………………………………………………… 23

3.6.2. Incubación………………………………………………………. 24

3.6.3. Tinción de GRAM………………………………………………. 24

4. RESULTADOS………………………………………………………………… 25

4.1. CONTAMINACIÓN…………………………………………………….. 25

4.1.1. Contaminación por hongos……………………………………. 25

4.1.2. Contaminación por bacterias………………………………….. 28

V

4.2. OXIDACIÓN EN LA ETAPA DE INTRODUCCIÓN……………….... 32

4.3. SOBREVIVENCIA……………………………………………………… 35

5. DISCUSIÓN……………………………………………………………………. 38

6. CONCLUSIONES……………………………………………………………… 41

7. RESUMEN……………………………………………………………………… 42

8. SUMMARY……………………………………………………………………... 43

9. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………… 44

VI

LISTA DE CUADROS E ILUSTRACIONES

Cuadro No. Página

1. Importación de yerba mate en toneladas por año, según país de origen 3

2. Tratamientos evaluados………………………………………………………. 20

3. Formulación de sales y vitaminas del medio MS…………………………... 21

4. Composición del medio Triptona-Extracto de levadura…………………… 23

5. Análisis de la Varianza para la variable: contaminación por hongo……… 25

6. Prueba de comparación múltiple con el método Duncan para la

contaminación por hongo según tratamiento……………………………….. 26


contaminación por hongo según material vegetal…………………………. 27

8. Análisis de la Varianza para la variable: contaminación por bacteria……. 28


contaminación por bacteria según tratamiento…………………………….. 29


contaminación por bacteria según material vegetal……………………… 30

11. Análisis de la Varianza para la variable: oxidación……………………… 32


oxidación según tratamiento………………………………………………… 33


oxidación según material vegetal…………………………………………... 34

14. Análisis de la varianza para la variable: sobrevivencia………………….. 35


sobrevivencia según tratamiento…………………………………………… 36


sobrevivencia según material vegetal……………………………………… 37

VII

Figura No. 1. Kilogramos de yerba mate importados por año en Uruguay……………… 4

2. Mapa de distribución nacional de I. paraguariensis……………………….. 6

3. Pasos básicos en la micropropagación…………………………………….. 9

4. Material Vegetal en el invernadero…………………………………………. 18

5. Explantos recién transferidos al medio de cultivo…………………………. 22

6. Contaminación por hongos según tratamiento…………………………….. 26

7. Contaminación por hongo según material vegetal…………………………. 27

8. Contaminación por bacterias según tratamiento…………………………… 29

9. Contaminación por bacterias según material vegetal……………………… 30

10. Bacterias contaminantes……………………………………………………. 31

11. Colonia de bacterias creciendo en el medio TY………………………….. 31

12. Oxidación según tratamiento……………………………………………….. 33

13. Oxidación según material vegetal………………………………………….. 34

14. Explantos luego de un mes de ser introducidos………………………….. 35

15. Sobrevivencia según tratamiento…………………………………………... 36

16. Sobrevivencia según material vegetal……………………………………... 37

1

1. INTRODUCCIÓN La yerba mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) es una especie

perteneciente a la familia Aquifoliaceae, ampliamente consumida en infusiones en el Sur de América Latina, especialmente en el sur de Brasil, Paraguay, Argentina y Uruguay. La misma al ser consumida presenta beneficios medicinales tales como: estimular el sistema nervioso central, diuresis, hipocolesterolemia, hepatoprotección, anti-oxidante, anti-inflamatoria y anti-reumática (Heck y De Mejia, 2007).

La producción comercial de yerba mate se encuentra en Argentina en

las provincias de Corrientes y Misiones; en Brasil en los estados de: Rio Grande del Sur, Santa Catarina, Paraná y sur de Mato Grosso, y en Paraguay.

Hasta el momento existen muy pocos estudios sobre las poblaciones de

yerba mate uruguayas, y no se conocen cultivos comerciales locales. No es posible concebir el cultivo de ninguna especie vegetal sin contar

con técnicas de propagación eficientes desde el punto de vista económico y productivo. Las técnicas de propagación, ya sea por vía sexual o asexual, son particularmente importantes para la conservación y el mejoramiento genético de la especie. En el caso particular de la yerba mate, la propagación ha sido siempre una de las limitantes importantes para estas actividades. Por lo tanto, es prioritario resolverla para hacer posible cualquier actividad productiva o de conservación.

Las poblaciones de yerba mate nativas se encuentran ubicadas en la

zona este y noreste del país y constituyen un reservorio de variabilidad genética que puede resultar valioso o incluso imprescindible para la selección de materiales potencialmente comerciales para nuestras condiciones climáticas. Sin embargo, el conocimiento sobre estos reservorios es sumamente escaso y no existe una evaluación de su estado de conservación o viabilidad biológica de las poblaciones a largo plazo ni tampoco estudios acerca de las formas de propagación.

2

La micropropagación es la propagación ‘true-to-type’ de un genotipo seleccionado usando técnicas de cultivo in vitro, generalmente asociada a la producción en masa a un precio competitivo (Debergh y Read, 1991). Es una herramienta usada para acelerar el proceso de propagación clonal, y es el método elegido para propagar plantas que de otra forma no podrían ser clonadas, o que su propagación es dificultosa de alguna manera, ya que se realiza en condiciones controladas (Hartmann et al., 2011).

Es por lo expuesto anteriormente que este trabajo pretende aportar al

conocimiento de los materiales nativos de Ilex paraguairensis, a partir de la evaluación de su comportamiento y establecimiento in vitro, para determinar si las técnicas de micropropagación son una alternativa viable para la propagación vegetativa de los materiales presentes en el país.

Se planteó como objetivo general: evaluar el comportamiento in vitro de

materiales nativos de I. paraguariensis, como material inicial para la micropropagación de la especie.

Los objetivos específicos fueron: 1) determinar la eficacia de cuatro

tratamientos de desinfección en materiales vegetales de orígenes distintos, procedentes de una variedad comercial argentina y materiales nativos originarios del departamento de Tacuarembó; y 2) evaluar la sobrevivencia de los explantos de yerba mate nativos en la etapa de establecimiento in vitro.

3

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 ILEX PARAGUARIENSIS

2.1.1 Importancia en Uruguay La yerba mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) es una especie

ampliamente reconocida por su utilización en la infusión conocida como mate en el sur de América Latina. El cultivo se produce principalmente en Argentina en las provincias de Corrientes y Misiones; en Brasil en los estados de: Rio Grande del Sur, Santa Catarina, Paraná y sur de Mato Grosso, y en Paraguay.

Cuadro 1. Importación de yerba mate en toneladas por año, según país

de origen.

2009 2010 2011 2012 2013 2014

BRASIL 27.746,82 28.961,59 31.030,74 30.782,28 32.232,01 30.717,25

ARGENTINA 2.527,59 1.360,02 409,34 89,12 16,47 320,70

PARAGUAY 18,40 11,50 9,16 8,67 85,27 158,54

TOTAL GENERAL 30.292,83 30.333,11 31.449,24 30.880,06 32.333,75 31.196,49

PAÍS de ORIGEN

Peso Neto (Ton)

IMPORTACIÓN DE YERBA MATE

AÑO

Tabla elaborada en bases a datos obtenidos de URUNET; Posición (max.):

0903009000 - YERBA MATE, OTRA.

Si se analizan el volumen de importación de yerba mate realizado por Uruguay entre los años 2009 y 2014, se observa que Brasil es el mayor proveedor de yerba mate en Uruguay, en segundo lugar se ubica Argentina salvo en el año 2013 dónde Paraguay ocupa ese lugar; el resto de los años Paraguay es el tercer proveedor de yerba mate (Cuadro 1). Según Montautti (2013) esto estaría explicado acorde a las preferencias del consumidor uruguayo, ya que la yerba brasilera tendría mayor proporción de lámina foliar que pecíolo en relación a la yerba argentina y un sabor más suave con relación a la paraguaya.

El consumo básico en el período es de 30.500 toneladas anuales,

aunque en los años 2011 y 2013 se percibe un significativo aumento de las importaciones (Figura 1), dando como resultado una tendencia positiva al aumento en la cantidad de yerba importada.

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Figura 1. Kilogramos de yerba mate importados por año en Uruguay.

A pesar de que Uruguay no cuenta con cultivos comerciales de yerba

mate, se lo reconoce como el principal país consumidor (RAU, 2000). Asumiendo la relación entre volumen de yerba mate importado en 2014 y la población de la República Oriental del Uruguay al cierre de dicho año se puede inferir un consumo per cápita de 9,16 kg/año. Esto hace que se presente una oportunidad para el desarrollo del cultivo de I. paraguariensis en el país.

2.1.2 Características de la especie Ilex paraguariensis es una especie de porte arbóreo que alcanza de 15

a 18 metros de altura y 80 centímetros de diámetro. Su follaje es verde, lustroso y persistente; con hojas simples, alternas, discoloras, glabras y coriáceas (Brussa y Grela, 2007).

Es una especie diclina dioica, que presenta inflorescencias más cortas

que las hojas con flores unisexuales que florecen en el mes de noviembre. Su fructificación ocurre entre los meses de marzo y abril y da como resultado una baya drupiforme, globosa de color negro cuando madura que contiene entre 4 a 5 semillas (Brussa y Grela, 2007).

Carvalho, citado por De Quadros (2009), señala que el estado

reproductivo de la especie comienza a los cinco años cuando los árboles se originan a partir de semillas y a los 2 años cuando provienen de propagación vegetativa.

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Dentro de las características propias de Ia especie, se resaltan sus

propiedades medicinales, como por ejemplo: su alta capacidad antioxidante, antitumoral, estimulante, diurética, analgésica y vasodilatadora, así como también su utilidad en la pérdida de peso, lucha contra la obesidad (Heck y De Mejia 2007, Gambero y Ribeiro 2015) y su efecto promotor de la vigilia (Torterolo et al., 2014)

2.1.3 Distribución natural Giberti (1995) indica que el área exacta de distribución natural de I.

paraguariensis aún es motivo de polémicas. El autor cita a Grondona y a Malheiros de Olivera y Rotta como los que han determinado el área más confiable. Ambos trabajos tienen en común señalar el área de distribución natural entre las latitudes 20° sur y el 35° sur; y entre las longitudes 40° oeste y 60° oeste. Ubicándose entre éstas Uruguay, Brasil, Argentina y Paraguay.

Siendo una especie subtropical, está adaptada a inviernos poco

severos, a suelos superficiales y fuertemente lixiviados, y a una distribución pareja de lluvias a lo largo del año (Small y Catling, 2001). Esto implica precipitaciones anuales superiores a los 1200mm, o la existencia de otras fuentes de agua como manantiales o cursos de agua (Giberti, 2011).

Según la clasificación climática de Köppen, Malheiros de Olivera y

Rotta, citados por Giberti (2011), identifican en el área de distribución natural de la especie la predominancia de los climas de tipo Cfb (templado-cálido, sin estación seca y con veranos frescos), Cfa (templado-cálidos, sin estación seca y veranos cálidos) y Cwa (templado-cálidas, inviernos secos), pudiéndose encontrar también áreas de tipo Aw (tropical con invierno seco).

En Uruguay, por ser árboles heliófilos, se encuentran individuos

silvestres en bosque de serranías y quebradas en los departamentos de Cerro Largo, Tacuarembó, Treinta y Tres, Lavalleja y Maldonado (Figura 2); ocupando el estrato más alto del dosel y presentándose en las zonas más bajas y húmedas del bosque (Brussa y Grela, 2007).

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Figura 2. Mapa de distribución nacional de I. paraguariensis.

Fuente: Brussa y Grela (2007).

2.2 PROPAGACIÓN VEGETATIVA

2.2.1 Razones por las cuales clonar la especie

Según Horner (2001), Dutra (2008), las semillas presentan baja calidad genética y fisiológica, dando como resultado limitaciones a nivel de calidad de producto final y baja productividad, por lo que la propagación vegetativa para la producción comercial se presenta como una mejor alternativa ya que origina clones de plantas madres y resuelve este inconveniente.

Es necesario señalar que la semilla de yerba mate muestra una baja tasa

de germinación (generalmente de entre 5 y 20%), como consecuencia de presentar dormancia debido a un embrión inmaduro que posee sustancias inhibitorias y el cual requiere un período de estratificación para superarla (Fowler y Sturion, 2000). Esto imposibilita la siembra inmediata de las semillas en recipientes, siendo esta una razón por la cual se opta por utilizar técnicas de propagación vegetativa (Sturion, 1988).

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2.2.2 Métodos de propagación vegetativa En la propagación vegetativa participa un único progenitor, y la

descendencia (clon) es genéticamente idéntica a dicho parental. Los clones pueden originarse a partir de una célula, de un tejido o de un órgano de la planta madre. En teoría, cualquier parte de la planta puede dar lugar a otra de iguales características.

Dentro de los tipos de propagación vegetativa usados para reproducir

un material vegetal se encuentran los métodos de propagación por estaca y los métodos de propagación in vitro, entre otros.

La propagación por estacas utiliza una porción de tallo, raíz u hoja que

es cortado de la planta madre e inducido a la formación de brotes y raíces a través de la manipulación ambiental, química o mecánica (Hartmann et al., 2011).

Dentro de la técnica de propagación por estacas para yerba mate, se pueden citar los trabajos de Tarragó et al. (2004), Horbach (2008), que muestran que la retención de hojas en las estacas de I. paraguariensis, así como la inmersión de las estacas en solución de 4000mg/L de ácido indolbutírico (AIB) por 10s aumenta el porcentaje de enraizamiento.

Por otro lado, la micropropagación refiere a la introducción, crecimiento,

desarrollo y mantenimiento de tejidos u órganos vegetales en un medio aséptico donde el ambiente, así como también los nutrientes y los reguladores de crecimiento son controlados. Es una herramienta usada para acelerar el proceso de propagación clonal, y es el método elegido para propagar plantas que de otra forma no podrían ser clonadas, o que su propagación es dificultosa de alguna manera (Hartmann et al., 2011).

Dentro de los posibles obstáculos que se puede encontrar en la propagación vegetativa, se reconoce aquel que presentan principalmente las plantas leñosas: la pérdida de juvenilidad o maduración (Thorpe y Harry, 1990).

Según Doorenbos (1965), en las plantas herbáceas los cambios en crecimiento y desarrollo se dan de nudo a nudo, siendo estos rápidos y graduales; mientras que en las leñosas los procesos llevan más tiempo, pudiéndose dividir la ontogenia en dos fases: la juvenilidad y la maduración.

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La juvenilidad está caracterizada por una mayor predisposición a la formación de raíces adventicias y una inhabilidad a la formación de estructuras reproductivas. Esto está explicado según Preece (2010), por la habilidad de las células vegetales a responder a los estímulos hormonales (relación entre auxinas y citoquininas); siendo la etapa de juvenilidad la que posee más células competentes a responder a la presencia de auxinas y de esta forma generar raíces adventicias. Según Geiss et al. (2009), la pérdida de competencia para diferenciar raíces adventicias es uno de los efectos más dramáticos asociados a la pérdida de juvenilidad.

A su vez, Preece (2010) señala que a medida que envejece la planta se

encuentran mayores probabilidades de contaminación por microorganismos y virus, y de esta forma mayores chances de ocurrencia de necrosis por procesos de desinfección.

Por lo tanto, la pérdida de juvenilidad tiene un impacto importante en el

éxito de la propagación clonal, en términos de inducción de raíces en estacas así como también la inducción de organogénesis o embriogénesis in vitro (Beyl, 2014).

2.3 TÉCNICAS DE MICROPROPAGACIÓN

2.3.1 Etapas del proceso de micropropagación Varios autores (Pierik 1987, Debergh y Read 1991, George 1993a,

Hartmann et al. 2011) reconocen por lo menos 5 etapas en el proceso de micropropagación (Figura 3), enumeradas a continuación.

1) Etapa cero: selección de plantas madres y pre-tratamientos. 2) Etapa uno: introducción. 3) Etapa dos: multiplicación. 4) Etapa tres: enraizamiento. 5) Etapa cuatro: aclimatación.

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Figura 3. Pasos básicos en la micropropagación.

Fuente: adaptado de George (1993a).

En la etapa cero, se debe seleccionar el material a introducir de forma

que la contaminación sea reducida. Es por esto que se selecciona de plantas madres que estén libres de cualquier síntoma de enfermedad y posean un crecimiento vigoroso. La etapa cero para esto abarca todos aquellos pre-tratamientos como fungicidas, insecticidas y fertilizantes en el caso de ser necesario, así como también los riegos y cuidados que se hayan realizado antes de la etapa de introducción.

En la etapa uno, o de introducción, se tiene como objetivo lograr un

crecimiento y desarrollo aséptico, es decir, libre de contaminación. Cuando ya se ha elegido el material y se han extraído las partes de las cuales se obtendrán los explantos (porción vegetal que se cultivará in vitro), se efectúa una desinfección para eliminar todos aquellos contaminantes externos (hongos y bacterias) y se mantiene el material en condiciones de asepsia.

Hay una vasta gama de compuestos químicos que se pueden utilizar como desinfectantes para los explantos, pero generalmente se utiliza el etanol al 70% y el hipoclorito de sodio (NaClO) al 1-3%. También resulta últil agregar agentes tensoactivos como el Tween®-20, mientras se agita el explanto con la solución desinfectante. Después de tratar a los explantos con la solución desinfectante se deben remover los restos de producto mediante lavados sucesivos con agua destilada estéril y operando dentro de la cámara de transferencia (Mroginski y Roca, 1991).

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El objetivo de la etapa dos es la producción de brotes, que luego serán capaces de formar una nueva planta, clon de la planta primariamente seleccionada. Los nuevos brotes se subcultivan en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras periódicamente, es así que se aumenta el número de plantas en cada repique. El número de plantas que se obtiene permite alcanzar incrementos exponenciales, siempre y cuando los factores que afectan el crecimiento y desarrollo hayan sido optimizados.

La etapa tres contiene la preparación de los brotes y plantas obtenidas

en la fase anterior, para poder transferirlos al suelo. Esta preparación se caracteriza por la detención de la formación de brotes, la iniciación de la elongación de los mismos y seguidamente la inducción de raíces, que podrá ser in vitro o in vivo.

La aclimatación tiene por objetivo la transferencia de las plántulas

desde los recipientes en dónde se estaban cultivando in vitro hacia otros en dónde se puedan simular las condiciones a campo, es decir, que contenga un sustrato no tan rico en sales y se puedan manipular las condiciones de humedad en la cual la planta crece, con el fin de que ésta termine siendo completamente funcional. Ésta se debe realizar de forma paulatina.

2.3.2 Composición del medio de cultivo El medio de cultivo en el cual crecen los explantos suministra los

nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo. El éxito de la micropropagación es en gran parte influenciada por el medio que se utiliza (George y De Klerk, 2010b). Los ingredientes y las concentraciones de éstos que componen al medio, varían según la especie y la etapa de micropropagación en la cual se esté trabajando (Hartmann et al., 2011).

El medio de cultivo provee al explanto de agua, nutrientes inorgánicos

(macro- y micronutrientes), una fuente de carbohidratos (generalmente sacarosa) que reemplaza el carbono atmosférico que se fijaría en la fotosíntesis; vitaminas, y opcionalmente compuestos orgánicos, aminoácidos, agente solidificante y reguladores de crecimiento (George y De Klerk, 2010b).

Los antibióticos aplicados al medio de cultivo tienen efecto

bacteriostático y pueden ser de gran utilidad para atenuar el efecto de la contaminación bacteriana. Sin embargo, en general, su empleo únicamente se justifica en casos de excepción, y en cultivos de corta duración, ya que la alta especificidad de los antibióticos implica que no previenen la proliferación de

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todos los microorganismos; además de que modifican las propiedades del medio y pueden ser metabolizados por el explanto (Mroginski y Roca, 1991).

Generalmente, el medio de cultivo se encuentra con pH ajustado a 5.7-

5.8 antes del autoclavado; pudiéndose encontrar especies que responden con un crecimiento más acelerado a valores de pH inferiores (George, 1993a).

Según George y De Klerk (2010b) el medio de cultivo más comúnmente

usado es el formulado por Murashige y Skoog (MS) (1962); que se caracteriza por tener altas concentraciones de nitrato, potasio y amonio en comparación con otras formulaciones (Smith, 2013), así como también, presentar bajos niveles de calcio, fósforo y magnesio (George y De Klerk, 2010b).

2.3.3 Propiedades del ión plata

Son varios los autores que encuentran beneficios en el uso del ión plata como potenciador del desarrollo de brotes, al inhibir la acción del etileno, y como funguicida y bactericida.

Kumar et al. (2009) señalan que en la mayoría de los cultivos in vitro, la

aplicación exógena del ion plata en forma de nitrato de plata, regula significativamente la actividad del etileno; encontrando que los efectos fisiológicos que se ven beneficiados por la presencia del nitrato de plata son: organogénesis directa e indirecta, embriogénsis somática, enraizamiento in vitro, inducción de floración, expresión sexual y control de abscisión foliar. Así como también en crecimiento de callo in vitro (Williams et al., 1990)

Strader et al. (2009) encontraron que el nitrato de plata mejora el flujo del

ácido indól-3-acético (IAA) a la vez que bloquea la respuesta al etileno. Indicando que el mejoramiento en el eflujo de IAA por los iones de plata es independiente de la respuesta del etileno.

Por otro lado, los iones de plata con baja toxicidad y un amplio espectro

de actividad antimicrobial son también muy efectivos en reducir enfermedades causadas por hongos; probablemente debido a la destrucción de la integridad de la membrana (Jo et al. 2009, Kim et al. 2012).

Jo et al. (2009) indican que los iones de plata en su actividad

antifúngica están significativamente influenciados por el hipoclorito de sodio (NaClO). Una vez que los cationes del nitrato de plata reaccionan con los iones de cloro, y precipita la forma insoluble (cloruro de plata), el nitrato de plata

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muestra una reducción dramática en su poder antifúngico, así como también antimicrobial.

Las plata tienen la habilidad de anclarse a la pared celular bacteriana y

subsecuentemente penetrar en ella, causando cambios estructurales en la membrana celular como también en la permeabilidad de la misma y la consecuente muerte celular (Prabhu y Poulose, 2012).

También se teoriza que la interacción del ion plata con el sulfuro y el

fósforo del ADN de las bacterias puede ocasionar problemas en la replicación del ADN bacteriano y por lo tanto terminar con los microbios (Prabhu y Poulose, 2012).

2.3.4 Problemas de la micropropagación

El cultivo de tejidos in vitro presenta muchas veces problemas que dificultan la introducción y el establecimiento de los explantos, entre ellos los más frecuentes son la oxidación, la pérdida de vigor, la contaminación, la necrosis y la hiperhidricidad (George 1993a, Hartmann et al. 2011).

Cuando ocurre oxidación generalmente se observa (sobre todo en

especies leñosas) el oscurecimiento en la superficie donde se realizó el corte en el explanto, habiendo también exudado de sustancias fenólicas que oxidan y amarronan el medio tendiendo a inhibir el desarrollo (Hartmann et al., 2011). La oxidación es dependiente del genotipo, de la edad del material y de la época del año, así como también del tratamiento de desinfección (George, 1993a).

Si bien se considera a la micropropagación un sistema aséptico, esto no

es 100% garantido. La contaminación puede originarse desde dos fuentes, siendo una la mala práctica en el laboratorio que no elimina aquellos patógenos de la superficie del tejido vegetal, o a través de patógenos endófitos difíciles de eliminar. Sea cual sea la fuente, la mayoría de las veces la contaminación suprime el crecimiento de los explantos en la etapa de introducción (Casselles, 1991). Es por esto, que el tratamiento de desinfección juega un papel importante en la micropropagación, ya que si no se realiza correctamente puede dar lugar a la oxidación o contaminación de los explantos.

La necrosis en el ápice de los explantos se da particularmente en

especies leñosas. La causa más común de que esto suceda es la deficiencia de calcio en el ápice del explanto, pudiéndose deber a la mala traslocación o absorción desde el medio de cultivo. Aunque también puede deberse al

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crecimiento de callo, mala regulación de hormonas o un largo período sin repicar el material (George, 1993a).

La hiperhidricidad, o vitrificación, ocurre generalmente en explantos que

están creciendo en ambientes con alta humedad relativa, medios líquidos o con bajas concentraciones de agar. Los explantos con esta condición se caracterizan por ser translúcidos, de apariencia suculenta y vidriosa, y presentar dificultades en su desarrollo por baja síntesis de lignina (Hartmann et al., 2011).

La pérdida de vigor está asociada principalmente a la presencia de

compuestos fenólicos (oxidación) y a la vitrificación; aunque no se descarta la posibilidad de pérdida de vigor debido a un largo período de tiempo sin repicar a un medio de cultivo fresco (George, 1993a).

2.3.5 Factores que afectan la respuesta in vitro George (1993a) reconoce tres grupos de factores que influyen en el

crecimiento y la morfogénesis de los tejidos cuando se emplea la micropropagación: el genotipo, el ambiente y factores dependientes del tejido.

Pierik (1987), Mroginski y Roca (1991) afirman que es importante tener

presente la variabilidad asociada al genotipo de las plantas, ya que en igualdad de condiciones de medio y ambiente, las respuestas in vitro del cultivo de un determinado explanto de una especie difieran con el cultivar empleado.

Con respecto al genotipo y los factores dependientes del tejido,

Villalobos y Thorpe (1991) señalan que el estado fisiológico de la planta madre afectan los requerimientos nutricionales y hormonales de los explantos; así como también la edad fisiológica afecta la morfogénesis, siendo que mientras el material madre sea más joven y presente tejidos menos diferenciados mejor será la respuesta in vitro.

Según Bonga, citado por Villalobos y Thorpe (1991), la edad del

explanto es un factor crítico en las especies leñosas, ya que a medida que envejecen los tejidos y pierden la capacidad de diferenciación se dificulta la micropropagación.

A su vez, Villalobos y Thorpe (1991) encuentran que los problemas más

serios en la propagación in vitro de especies de especies leñosas están dados por la variación genética en las respuestas de regeneración y el proceso de maduración; como también por la dificultad por eliminar las infecciones internas, y la secreción de sustancias tóxicas como fenoles y sustancias volátiles.

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El estado de sanidad de los tejidos seleccionados para el cultivo in vitro es otro factor de importancia. Si la planta se encuentra sana al momento de realizar la introducción, es entonces que el cultivo in vitro de esos tejidos será satisfactorio, ya que bajará el porcentaje de contaminación (Pierik, 1987).

Por otra parte, Pierik (1987) señala que el tamaño del explanto es otro

factor que puede incidir en la respuesta in vitro, ya que es más difícil inducir crecimiento en estructuras pequeñas como células, o grupo de células y meristemas, en comparación con estructuras más grandes, como pueden ser hojas o brotes. Esto se debe a que la parte de la planta que se aísla tiene su propia reserva de nutrientes y hormonas; así como también cuando se corta el explanto se debe considerar el porcentaje de tejido dañado (y formación de etileno) respecto al tejido sano.

Dentro del grupo identificado como ambiente, se encuentran el medio, el

ambiente gaseoso, la temperatura, la humedad y la luz; éstos tres últimos siendo los factores físicos.

Según George y Davies (2010a), la composición del medio de cultivo

generalmente varía con los diferentes genotipos y de acuerdo a lo que se quiere cultivar. Una de las razones de esto es la acumulación de diferentes concentraciones de hormonas por parte de los diferentes genotipos, ya que se afecta el crecimiento y la organogénesis in vitro debido a las interacciones que ocurren entre las sustancias de crecimiento endógenas (generalmente no definidas y/o pobremente cuantificadas) y los reguladores de crecimiento sintéticos que se agregan al medio.

Con respecto al ambiente gaseoso, Jackson et al., citados por George y

Davies (2010a) indican que la mayor parte del intercambio gaseoso se efectúa mediante difusión, y es por esto que el oxígeno disponible en el medio de cultivo está influenciado por: la concentración del gas en el ambiente, y de las tasas de difusión con el recipiente y los tejidos. A su vez, un limitado suministro de oxígeno (hipoxia) puede limitar la tasa de crecimiento de los tejidos (George y Davies, 2010a).

En condiciones normales las plantas están sometidas a fluctuaciones

de temperatura entre el día y la noche. De acuerdo con George y Davies (2010a), el crecimiento de los explantos se ve beneficiado con una disminución en la temperatura nocturna porque disminuye la respiración en este período y reduce los costos de calentamiento en las cámaras de crecimiento.

Mientras que Villalobos y Thorpe (1991) señalan que la temperatura de

incubación para la micropropagación para la mayoría de las especies varía

15

entre 24 y 28°C; y que fluctuaciones entre temperaturas diurnas y nocturnas sólo resultan beneficiosas para un reducido número de especies.

Pierk (1987) indica que la temperatura óptima para el crecimiento y desarrollo in vitro es generalmente 3-4°C superior que la óptima in vivo; siendo que la temperatura en los tubos donde se lleva a cabo el cultivo es de 3-4°C superior que en el cuarto de crecimiento, debido al efecto de calentamiento de la irradiación lumínica. Como también recomienda seleccionar temperaturas inferiores en el caso de que se lleven a cabo los procesos de formación de primordios florales, ruptura de dormancia y germinación de semillas.

George y Davies (2010a) sugieren que cuando las temperaturas del aire

y del medio están igualadas y el recipiente que los contiene está debidamente sellado, la humedad relativa debería estar entre 98-99,5% dentro del recipiente y aproximadamente en 70% en la cámara de crecimiento. No recomendándose valores superiores debido a la posible ocurrencia de hiperhidricidad, así como tampoco inferiores por posible desecamiento del medio de cultivo.

En relación a la influencia de la luz en los cultivos in vitro, George y

Davies (2010a) reconocen que existen tres aspectos que influyen en el crecimiento y la morfogénesis in vitro, así como también en la fotomorfogénsis y la fotosíntesis: la longitud de onda, la densidad de flujo y el fotoperíodo.

Para propósitos generales, Mroginski y Roca (1991) recomiendan

utilizar, en el establecimiento de los cultivos, una fuente luminosa compuesta por lámparas fluorescentes (del tipo ‘luz de día’) y lámparas incandescentes que brinden entre 1000 y 4000 lux de iluminación; y un fotoperíodo/escotoperíodo de 16/8 hs.

Otros factores que influyen sobre los explantos son: el agente gelificante que se utiliza en el medio de cultivo; (Sansberro et al., 2001), como también la época del año en la que se realiza la introducción in vitro (Correa da Rosa et al., 2006). Ambos autores realizan estas consideraciones para I. paraguariensis.

Sansberro et al. (2001) concluyen que el establecimiento de explantos de yerba mate no se ve afectado por el tipo de agente gelificante, pero si presenta una gran influencia en el número de brotes regenerados como también en el enraizamiento del mismo, siendo Phytagel™ el agente recomendado.

Por otra parte, Correa da Rosa et al. (2006) señalan que la mayor tasa de sobrevivencia es en invierno, presentando menores tasas de contaminación por bacteria.

16

2.3.6 Antecedentes en micropropagación de la especie

Es preciso aclarar que para I. paraguariensis no se encuentran a la fecha antecedentes en micropropagación o respuesta de la especie in vitro de origen nacional; sin embargo, existen numerosas publicaciones de orígenes brasileño y argentino, y son en estos trabajos los que se sintetizan a continuación.

Varios autores (Zaniolo y Zanette 2004, Horbach 2008, Dutra et al.

2008, Dutra y Gomes da Silva 2009) están de acuerdo en que la desinfección más eficiente y que conlleva mayor tasa de sobrevivencia es la aplicada con hipoclorito de sodio, conjuntamente con otros desinfectantes como el alcohol.

Aunque el período de inmersión en hipoclorito de sodio varía según

autores, Zaniolo y Zanette (2004) indican un tiempo de 10 minutos de inmersión a una concentración de 0,75%, mientras que Horbach (2008) señala como tiempo óptimo de inmersión 25 minutos al 2%.

Se encuentra necesario señalar que todo lo anteriormente expuesto

está influenciado por la época del año en cuando se realice la introducción y los tratamientos previos realizados a la planta madre (Correa da Rosa et al. 2006, Dutra et al. 2008). Correa da Rosa et al. (2006) afirman que los explantos cultivados en invierno presentan menores tasas de contaminación bacteriana y mayores tasas de sobrevivencia.

Por otro lado existen trabajos que encontraron una inviabilidad en la

manutención de los explantos de yerba mate por un tiempo superior al mes, debido a las altas tasas de contaminación y/o recalcitrancia después del establecimiento; presentando un porcentaje de supervivencia máxima de 5,25% (Dutra et al. 2008, Dutra y Gomes da Silva 2009).

Son varios los autores (Sansberro et al. 1999, Mroginski et al. 1999,

Sansberro et al. 2000, Horbach 2008, Dutra et al. 2008) que utilizan la formulación de Murashige y Skoog (MS) diluida cuatro veces y enriquecida con 30g/L de sacarosa y vitaminas completas, como medios de cultivo para las etapas de introducción y multiplicación.

17

Generalmente los autores anteriormente señalados, agregan al medio base la citoquinina 6-bencilaminopurina (BAP), tanto en el medio de introducción como en el de multiplicación, difiriendo cada uno en las concentraciones adicionadas. Por ejemplo, en el trabajo de Sansberro et al. (1999) se adiciona 4,4 p.M de BAP, mientras que Mroginski et al. (1999) agregan 1mg/L y Horbach (2008) 2mg/L.

Sin embargo, Zaniolo y Zanette (2004) señalan una efectiva obtención

de brotes múltiples a partir del subcultivos de segmentos nodales en el medio Woody Plant Medium (WPM) con 8,87 μM de BAP. Mientras que Griebeler et al. (2014) recomiendan el uso del medio Murashige y Skoog (MS) diluido a la mitad con adición de 0,8 μM BAP y 0.5 μM ácido 1-naftalenacético (NAA).

Para el enraizamiento, los trabajos consultados difieren en medios de

cultivo y en tiempo, además de las diferentes técnicas. Sansberro et al. (1999) sugieren que el enraizamiento se efectúe en medio de cultivo ¼ MS con 7.4 μM de ácido indolbutírico (AIB) y 2,5g/L de Phytagel™ durante 10 días, y luego se transfiera a un nuevo medio de ¼ MS en ausencia de reguladores de crecimiento.

Según Sansberro et al. (2000) la mejor inducción de enraizamiento se

consiguió en medio ¼ MS con vermiculita como sustrato y suplementado con 1-1,5% de AIB y 1-2% de 3-Methyl-1-phenyl-5-pyrazolone (PPZ). Mientras que Zaniolo y Zanette (2004) proponen que la inducción de raíces se realice en un medio ½ WPM suplementado con 14,7 μM de AIB, seguida de la transferencia de los brotes a otro medio ½ WPM con 1g/L de carbón activado y exento de hormonas.

Por otro lado, Horbach (2008) indica que el enraizamiento in vitro de

yerba mate puede conseguirse en un período de 30 días en un medio ¼ MS con 3mg/L de AIB; para luego aclimatarse con temperatura y luz controlada en sustratos de arena o cáscara de coco.

18

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 MATERIAL VEGETAL

El material vegetal del cual se parte tiene entre 3 y 4 años de edad y pertenece a plantas madres de dos orígenes diferentes. Dieciséis plantas fueron obtenidas del vivero Santa María, las cuales provienen de semillas de plantas nativas de la Gruta de los Helechos (Tacuarembó, Uruguay). Mientras que tres plantas son clones comerciales de origen policlonal (hijos de clones de madre identificada, no así de padre) del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) de Argentina.

Las plantas madre de origen ‘Gruta de los Helechos’ se mantuvieron en cama caliente durante el invierno, ya que presentaban menor porte que aquellas de origen ‘Comercial’ (Figura 4). Ambos materiales se conservaron en el invernadero al abrigo de temperaturas mínimas y vientos.

Figura 4. Material Vegetal en el invernadero. a) Plantas madres de origen ‘Gruta de los Helechos, b) Planta madre origen ‘Comercial’.

19

3.1.1 Pre-tratamientos

Se realizaron aplicaciones foliares con fungicida Captan a una concentración de 2g/L a las plantas madres tres veces por semana, con el fin de reducir la carga fúngica y minimizar la contaminación en la etapa de introducción. A su vez se fertilizó con Phostrogen® (NPK(MgO3-SO3)) a una concentración 14-10-27(2,5-7.5) por medio de riego para vigorizar el material vegetal.

Como el material madre contenía en general un único tallo y existía una marcada dominancia apical, se efectuaron podas y aplicaciones hormonales de 6-bencilaminopurina (BAP) a una concentración de 8,8 mmol/L cada una semana con el objetivo de contar con más brotes laterales; como sugiere el trabajo realizado por Sansberro et al. (2005).

3.1.2 Selección de los explantos

Se seleccionaron y cortaron de las plantas madres aquellos tallos que se apreciaban más jóvenes y tiernos, colocándolos en una solución de polivinilpirrolidona (PVP) al 1% para prevenir oxidación prematura durante el traslado al laboratorio.

3.2 TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN Y CONTROL OXIDATIVO

En primera instancia los tallos seleccionados se lavaron con detergente y abundante agua corriente para eliminar todas aquellas impurezas que pudiesen contener. Luego de lavados se transfirieron a una solución con captan al 0,5% durante 20 minutos, y posteriormente a una solución con etanol al 70% durante 1 minuto.

Dentro de la cámara de flujo laminar se preparó la solución de hipoclorito de sodio al 2% a partir de una solución comercial con 98g de cloro activo por litro, con 1 gota de Tween® 20 y se procedió a realizar los dos tratamientos: el primero siendo de 15 minutos y el segundo siendo de 25 minutos. Al finalizar los respectivos períodos de tiempo se realizaron 2 enjuagues con agua destilada y uno con ácido cítrico.

Se plantó un explanto (con un único nudo por explanto) por tubo de

ensayo y el mismo fue sellado con dos vueltas de papel film. A continuación se resumen los tratamientos realizados (Cuadro 2).

20

Cuadro 2. Tratamientos evaluados.

Nomenclatura utilizada Tratamiento

Tratamiento 1 (T1) Ausencia de nitrato de plata en el medio de cultivo y 15 minutos de inmersión en hipoclorito de sodio.

Tratamiento 2 (T2) Ausencia de nitrato de plata en el medio de cultivo y 25 minutos de inmersión en hipoclorito de sodio.

Tratamiento 3 (T3) Presencia de nitrato de plata en el medio de cultivo y 15 minutos de inmersión en hipoclorito de sodio.

Tratamiento 4 (T4) Presencia de nitrato de plata en el medio de cultivo y 25 minutos de inmersión en hipoclorito de sodio.

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

El medio de cultivo que se empleó para el establecimiento de los explantes in vitro fue el Murashige y Skoog (MS) con su formulación salina diluida cuatro veces, la totalidad de su formulación vitamínica, más 3% de sacarosa, 0,6% de agar y 0,1mg/L de BAP (Sansberro et al., 2000). Se detalla a continuación en el Cuadro 3 las concentraciones de las sales y vitaminas del medio MS.

Se adicionó al medio de cultivo, para los tratamientos 3 y 4, 1mg/L de nitrato de plata (AgNO3).

21

Cuadro 3. Formulación de sales y vitaminas del medio MS.

Macronutrientes (mg/l) Micronutrientes (mg/l) Vitaminas (mg/l)

NH4NO3 1650 H3BO5 6,2 Myo-inositol 100

CaCl2-2H2O 440 CoCl2-6H2O 0,025 Glicina 2,0

MgSO4-7H2O 370 CuSO4-5H2O 0,025 Ácido Nicotínico

0,5

KNO3 1900 NaEDTA-2H2O 37,2 Piridoxina HCl 0,5

KH2PO4 170 FeSO4-7H2O 27,8 Tiamina HCl 0,1

MnSO4-4H2O 22,3

KI 0,83

Na2MoO4-2H2O 0,25

ZnSO4-7H2O 8,6

Fuente: adaptado de Beyl (2011).

El pH del medio de cultivo fue ajustado en todos los casos a valores de entre

5,8 y 6,2. 3.4 INCUBACIÓN

Una vez transferidos los explantos desinfectados al medio de cultivo, los tubos fueron sellados con dos vueltas de papel film (Figura 5) e incubados en cámara de crecimiento con una intensidad lumínica de 30 µmol.m-2.s-1, una temperatura de 24ºC ± 2ºC y un fotoperiodo de 16 hs luz/8 hs oscuridad.

22

Figura 5. Explantos recién transferidos al medio de cultivo.

3.5 PARÁMETROS MUESTREADOS Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO En el transcurso del primer mes posterior a cada introducción, se cuantificaron las siguientes variables: explantos contaminados con bacteria, con hongos, explantos oxidados y sobrevivencia; para la evaluación de los tratamientos de desinfección así como también del nitrato de plata como agente promotor de sobrevivencia.

El análisis de la información se realizó mediante un diseño experimental factorial 2x4 (2 genotipos y 4 tratamientos), completamente aleatorizado, según el siguiente modelo:

Yij=µ+αi+βj+Ɛij con i=1,2,3,4; j=1,2

Donde Y representa la respuesta al i-ésimo nivel del factor ‘tratamiento’ y

j-ésimo nivel del factor ‘genotipo’, µ representa la media general, αi el efecto que produce el i-ésimo nivel del factor ‘tratamiento’, βj representa el efecto del j-ésimo nivel del factor ‘genotipo’ y Ɛij es el error aleatorio asociado a la observación ij-ésima.

23

El análisis estadístico se realizó en el software estadístico “InfoStat”, versión estudiantil gratuita, donde se llevó a cabo un análisis de varianza y una prueba de comparación múltiple con el método Duncan.

3.6 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS En el transcurso de la investigación se constató la presencia reiterativa

de 3 tipos de bacterias de coloración blanca, rosada/roja y marrón Por lo que se procedió a su identificación para poder determinar a futuro un mejor control de las mismas mediante la incorporación de antibióticos en el medio.

Para esto fue preciso aislar las bacterias y sembrarlas en un medio de crecimiento, incubarlas y posteriormente identificarlas mediante la tinción de GRAM.

3.6.1 Medio de cultivo

Con la ayuda de un ansa de siembra, previamente esterilizada en llama se recogieron muestras desde los tubos de ensayo que contenían los explantos contaminados, y se sembraron en el medio contenido en placas de Petri.

El medio de cultivo que se empleó fue un medio enriquecido para bacterias heterótrofas denominado Medio Triptona-Extracto de levadura (TY) (Cuadro 4). Cuadro 4. Composición del medio Triptona-Extracto de levadura (TY)

Compuesto Cantidad Bacto-Tryptona 5g

Extracto de levadura 3g CaCl2-2H2O 0,87g

Agar 15g pH 6,7

Agua destilada 1000mL

Fuente: Beringer (1974).

24

3.6.2 Incubación

Las bacterias identificadas como blancas y marrones se incubaron por una semana en estufa de cultivo (incubadora bacteriológica) a 27°C ±1, mientras que las rojas se incubaron por dos semanas ya que presentaron un crecimiento más lento.

Posteriormente se preservaron en heladera una semana hasta que se

procedió a realizar la identificación.

3.6.3 Tinción de GRAM

Los pasos para la tinción de GRAM (Cappuccino y Sherman, 2014) se detallan a continuación:

I. Se coloca una gota de agua en el portaobjetos y mediante un ansa esterilizado se transfiere la masa bacterial, mezclando ésta con el agua para que se desagrupe.

II. Se deja secar la preparación y se fija mediante 3 pasadas del preparado a través de la llama del mechero.

III. Se coloca cristal violeta por 1 minuto y se lava con agua. IV. Se fija con lugol durante 1 minuto y se lava con agua. V. Se decolora con solución de alcohol etílico al 95% durante 30

segundos y se lava con agua y alcohol; realizando el último lavado con agua.

VI. Contrastar con Safranina por 1 minuto y lavar con agua. VII. Secar la preparación y examinar con inmersión en aceite.

25

4. RESULTADOS

4.1 CONTAMINACIÓN

4.1.1 Contaminación por hongos En los ensayos realizados con el objetivo de analizar distintos tiempos

de inmersión en NaClO y de analizar los efectos de la presencia de AgNO3, se obtuvieron resultados (Cuadro 5) con diferencias significativas entre tratamientos (p=0,0222) y entre material vegetal (p=0,0273).

Cuadro 5. Análisis de la Varianza para la variable: contaminación por hongo.

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)

F.V gl p-valor

Modelo 4 0,0046

Tratamiento 3 0,0222

Material vegetal 1 0,0273

Error 28

Total 32

CV(%) 140,89

Media (%) 16,34

Al analizar la contaminación por hongos según tratamiento (Figura 6) se

puede observar que los tratamientos que tienen en el medio AgNO3

(tratamientos 3 y 4), son los que presentaron menores porcentajes de contaminación por hongo; siendo el porcentaje de contaminación promedio por hongos de 0,04% para el tratamiento 4 (presencia de AgNO3 e inmersión en NaClO por 25 minutos) y de 4,47% para el tratamiento 3 (presencia de AgNO3 e inmersión en NaClO por 15 minutos). Por otro lado, los tratamientos 1 y 2, que tienen en común la ausencia de AgNO3 fueron los que presentaron los mayores porcentajes de contaminación promedio por hongos, siendo de 28,19% para el tratamiento 1 y de 30,44% para el tratamiento 2.

26

Figura 6. Contaminación por hongos según tratamiento

No se evidenciaron diferencias significativas para los distintos tiempos de inmersión en NaClO (15 ó 25 minutos); pero sí en el factor presencia/ausencia de AgNO3 (Cuadro 6), siendo los tratamientos con presencia de AgNO3 los que presentaron menores porcentajes de contaminación promedio por hongos. Cuadro 6. Prueba de comparación múltiple con el método Duncan para la contaminación por hongo según tratamiento.

Test: Duncan α=0,05

Error: 530,0624 gl: 28

Tratamiento Media n E.E

T4 0,04 10 7,33 A

T3 4,47 9 7,69 A

T1 28,19 7 8,89 B

T2 30,44 7 8,89 B

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

27

Cuando se analizan los ensayos según el material vegetal (Figura 7), se detecta que el material vegetal de origen nativo (‘Gruta de los Helechos’) presenta los porcentajes de contaminación por hongo más notorios con un promedio de 25,59%; a diferencia del material comercial que tiene en promedio un porcentaje de contaminación por hongos de 5,98%. Figura 7. Contaminación por hongo según material vegetal

La diferencia entre los dos materiales es significativa (Cuadro 7), siendo el material comercial el que contuvo menos contaminación por hongos. Cuadro 7. Prueba de comparación múltiple con el método Duncan para la contaminación por hongo según material vegetal.


Error: 530,0624 gl: 28

Material Vegetal Media n E.E

Comercial 5,98 12 6,79 A

Gruta de los Helechos

25,59 21 5,03 B


28

4.1.2 Contaminación por bacterias

A diferencia de la contaminación por hongos, la contaminación por bacterias, en los ensayos realizados con el objetivo de analizar distintos tiempos de inmersión en NaClO y de analizar los efectos de la presencia de AgNO3, no dieron resultados (Cuadro 8) con diferencias significativas entre tratamientos (p=0,6694); pero sí entre material vegetal (p=0,0073).

Cuadro 8. Análisis de la Varianza para la variable: contaminación por bacteria.


F.V gl p-valor

Modelo 4 0,0461



Error 28

Total 32

CV(%) 83,7

Media (%) 21,15

Al estudiar la contaminación por bacteria según los tratamientos

realizados, se puede apreciar que a pesar de que los tratamientos con ausencia de AgNO3 en el medio de cultivo (tratamientos 1 y 2) presentaron las tasas de contaminación más elevadas(Figura 8), siendo el porcentaje promedio de contaminación por bacterias de 25,01% para el tratamiento 1 y de 20,17% para el tratamiento 2, no presentan diferencias significativas (Cuadro 9) con respecto a los tratamientos con presencia de AgNO3, que presentan porcentajes de contaminación promedio de 16,85% (tratamiento 4) y de 14,31% (tratamiento 3).

29

Figura 8. Contaminación por bacterias según tratamiento.

Cuadro 9. Prueba de comparación múltiple con el método Duncan para la contaminación por bacteria según tratamiento.


Error: 313,3777 gl: 28


T3 14,31 9 5,91 A

T4 16,85 10 5,64 A

T2 20,17 7 6,83 A

T1 25,01 7 6,83 A


30

Si se compara la contaminación por bacteria según material vegetal, se observa que el material nativo presentó el mayor porcentaje de contaminación promedio con un 28,45%; en comparación con el material comercial que presentó un 9,72% (Figura 9). Figura 9. Contaminación por bacterias según material vegetal.

Se puede afirmar que el material comercial presentó una diferencia significativa (Cuadro 10) en contaminación por bacteria; siendo esta menor a la contaminación por bacteria que se manifestó en el material vegetal nativo (‘Gruta de los helechos’). Cuadro 10. Prueba de comparación múltiple con el método Duncan para la contaminación por bacteria según material vegetal.


Error: 313,3777 gl: 28




28,45 21 3,87 B

31


En cuanto a la identificación de las bacterias contaminantes (Figura 10);

las colonias de aspecto blanco, corresponden a bacilos GRAM negativo, ya que la tinción de GRAM dio coloración rosada.

Se identificó en microscopio que la contaminación por colonia de

bacterias de aspecto marrón, pertenece a bacilos GRAM positivo y bacilos GRAM negativos; siendo los GRAM negativos bacilos más alargados que los GRAM positivos

Figura 10. Bacterias contaminantes. a) Bacterias marrones; b) Bacterias rojas; c) Bacterias blancas.

Las colonias de aspecto rojizo, no presentaron un crecimiento suficiente

en el medio TY (Beringer, 1974) en el transcurso de un mes para poder identificarlas. Por lo que esto sugiere que estas bacterias presentan un metabolismo autótrofo.

Tanto las bacterias identificadas como marrones, como las blancas, presentaron un crecimiento y desarrollo mayor al de las bacterias rojas/rosadas (Figura 11) en el medio TY (Beringer, 1974).

32

Figura 11. Colonia de bacterias creciendo en el medio TY (Beringer, 1974). a) Bacterias marrones, b) bacterias rojas, c) bacterias blancas

4.2 OXIDACIÓN EN LA ETAPA DE INTRODUCCIÓN Con respecto al control oxidativo, para los ensayos realizados con

distintos tiempos de inmersión en NaClO y en presencia y ausencia de AgNO3, se obtuvieron diferencias significativas (Cuadro 11) tanto entre tratamientos (p=0,0194), como entre material vegetal (p=0,0105).

Cuadro 11. Análisis de la Varianza para la variable: oxidación.


F.V gl p-valor

Modelo 4 0,0085



Error 28

Total 32

CV(%) 153,52

Media (%) 15,43

Los tratamientos que presentaron mayores tasas de oxidación fueron

aquellos que carecían de AgNO3 en el medio de cultivo (Figura 12), siendo el porcentaje de oxidación promedio para el tratamiento 2 de 37,61%, y de 32,58 % para el tratamiento 1. Mientras que los tratamientos que contenían AgNO3 en el medio presentaron los niveles de oxidación más bajos, siendo de 7,38% para el tratamiento 4 y de 5,66% para el tratamiento 3.

33

Figura 12. Oxidación según tratamiento.

Las diferencias fueron significativas entre los tratamientos que

presentaban AgNO3 en el medio con respecto a los que no (Cuadro 12). Se puede afirmar que aquellos tratamientos que carecían de AgNO3 en el medio de cultivo (tratamientos 1 y 2) arrojaron las tasas de oxidación más elevadas, en comparación a los que sí lo presentaban (tratamientos 3 y 4). No existen diferencias significativas entre los distintos tiempos de inmersión en NaClO. Cuadro 12. Prueba de comparación múltiple con el método Duncan para la oxidación según tratamiento.


Error: 561,0589 gl: 28


T3 5,66 9 7,91 A

T4 7,38 10 7,54 A

T1 32,58 7 9,14 B

T2 37,61 7 9,14 B


34

Por su parte, el material vegetal que presentó la tasa más baja de oxidación fue el material nativo de ‘Gruta de los Helechos’ (Figura 13), con un porcentaje de oxidación promedio de 8,93%; mientras que el material comercial presentó porcentaje de oxidación promedio de 32,68%. Figura 13. Oxidación según material vegetal

Las diferencias fueron significativas según el test Duncan de

comparaciones múltiples (Cuadro 13), observándose la mayor oxidación en el material vegetal comercial. Cuadro 13. Prueba de comparación múltiple con el método Duncan para la oxidación según material vegetal.


Error: 561,0589 gl: 28



8,93 21 5,18 A

Comercial 32,68 12 6,98 B


35

4.3 SOBREVIVENCIA En la evaluación de la sobrevivencia se tuvieron en cuenta todas las

pérdidas por contaminación (de bacteria y hongo), por oxidación y por formación de callo (Figura 14). Se encontraron diferencias significativas (Cuadro 14) entre tratamientos (p<0,0001), pero no así entre material vegetal (p=0,0994). Cuadro 14. Análisis de la varianza para la variable: sobrevivencia.


F.V gl p-valor

Modelo 4 <0,0001

Tratamiento 3 <0,0001


Error 28

Total 32

CV(%) 38,05

Media (%) 45,72

Al comparar la sobrevivencia entre tratamientos, se observó que

aquellos tratamientos que en el medio de cultivo contienen en su composición AgNO3 presentan las tasas de sobrevivencia más altas (Figura 15); siendo el porcentaje de sobrevivencia promedio para el tratamiento 3 de 75,35% y de 74,36% para el tratamiento 4. Por otro lado, los tratamientos 1 y 2 presentaron los porcentajes de sobrevivencia más bajos; siendo de 12,72% y 6,71% respectivamente. Figura 14. Explantos luego de un mes de ser introducidos.

36

Figura 15. Sobrevivencia según tratamiento

Las diferencias fueron significativas entre tratamientos (Cuadro 15),

pudiéndose afirmar que los tratamientos que carecían de AgNO3 (tratamientos 1 y 2) en el medio de cultivo presentaron las tasas de sobrevivencia más bajas en comparación con los tratamientos que sí presentaban AgNO3 (tratamientos 3 y 4). No se encontraron diferencias significativas en sobrevivencia entre tratamientos para los distintos tiempos de inmersión en NaClO. Cuadro 15. Prueba de comparación múltiple con el método Duncan para la sobrevivencia según tratamiento.


Error: 302,6700 gl: 28


T2 6,71 7 6,72 A

T1 12,72 7 6,72 A

T4 74,36 10 5,54 B

T3 75,35 9 5,81 B


37

Al analizar las tasas promedio de sobrevivencia según material vegetal (Figura 16) se aprecia que el material comercial presenta un porcentaje de sobrevivencia promedio de 47,7%, mientras que el material nativo ‘Gruta de los Helechos’ presenta un porcentaje promedio de sobrevivencia de 36,86%.

Figura 16. Sobrevivencia según material vegetal.

Sin embargo, las diferencias resultaron no ser significativas entre

ambos materiales (Cuadro 16). Cuadro 16. Prueba de comparación múltiple con el método Duncan para la sobrevivencia según material vegetal.

Test: Duncan

α=0,05

Error: 302,6700 gl: 28


Gruta de los Helchos

36,86 21 3,8 A



38

5. DISCUSIÓN

En la etapa de introducción de un cultivo in vitro es esencial dar con un método de desinfección adecuado que elimine patógenos que puedan dañar a la planta y/o competir con ella; teniendo en cuenta que un período prolongado de desinfección puede ocasionar oxidación de los explantos y por lo tanto poner en juego su sobrevivencia.

Los resultados muestran que la variable contaminación presentó

diferencias significativas entre los tratamientos que contenían en su medio nitrato de plata y los que no; como también existieron diferencias significativas entre materiales vegetales y no así en distintos tiempos de inmersión en hipoclorito de sodio.

Se puede afirmar que la presencia del nitrato de plata en el medio fue

un factor determinante en el control de la contaminación de origen fúngico; esto también fue observado por Jo et al. (2009), Kim et al. (2012), dónde indican los beneficios del ión plata como agente anti-fúngico.

Las bacterias son los contaminantes in vitro más comunes y ocasionan

serios problemas, porque pueden ser sistémicas así como difíciles de detectar y eliminar. Estos microorganismos escapan a los efectos de los esterilizantes superficiales y pueden ser inter o intracelulares. Su distribución puede ser localizada o sistémica por xilema o floema (Hernández y González, 2010). Estas características explicarían las altas tasas de contaminación por bacteria.

Por otra parte, si bien existen evidencias científicas de la acción

antibacterial del ión plata (Prabhu y Poulose, 2012), en los ensayos realizados no existieron diferencias significativas para la contaminación por bacterias, lo que habilita a la posibilidad de que tal vez la concentración de nitrato de plata podría no haber sido la suficiente para ese fin.

Al identificarse tanto bacterias GRAM positivas como GRAM negativas,

se debería, si se quiere combatir la contaminación por bacteria, agregar al medio de cultivo un antibiótico de amplio espectro. Luna et al. (2008) recomiendan la aplicación de cefotaxime en una dosis de 0,5mg/mL en el medio de cultivo, asegurando que esta adición resultó en el cultivo de Ilex dumosa 100% descontaminado y sin suprimir el crecimiento de los brotes.

En referencia al material vegetal, el material nativo presentó mayor

contaminación, tanto fúngica como bacteriana, pudiéndose deber esto a hongos y bacterias endógenas por provenir de un ambiente poco controlado y sin haber sido seleccionado por fenotipo. Se puede reafirmar esta idea con las

39

conclusiones que sacan Pimentel et al. (2006), que verifican la ocurrencia de hongos endófitos en hojas de yerba mate; siendo mayor la ocurrencia de los mismos en plantas provenientes de bosques que de plantas aisladas.

Mroginski y Roca (1991) indican que los explantes provenientes de

vegetales que crecen en invernaderos o en cuartos climatizados son relativamente más fáciles de desinfectar que los que crecen en el campo; por lo tanto, se deberían ajustar más los pre-tratamientos sanitarios a las plantas madres en futuros trabajos.

El período de inmersión en hipoclorito de sodio varía según autores,

Zaniolo y Zanette (2004) indican en su trabajo un tiempo de 10 minutos de inmersión a una concentración de 0,75%, mientras que Horbach (2008) señala como tiempo óptimo de inmersión 25 minutos al 2%. Al no encontrar diferencias significativas entre los tiempos de inmersión efectuados en hipoclorito de sodio (15 minutos y 25 minutos) en ninguna de las variables evaluadas, se recomienda el menor tiempo de inmersión, ya que los tratamientos más prolongados (o con concentraciones más elevadas) son causa de oxidación.

En referencia a la oxidación los resultados mostraron diferencias

significativas entre tratamientos y entre material vegetal, siendo que aquellos tratamientos que contenían en el medio de cultivo nitrato de plata fueron los que presentaron menores tasas de oxidación, así como también el material vegetal nativo en comparación al comercial.

Algunos autores (Goh et al. 1997, Kumar et al. 1998, Ozden-Tokatli et

al. 2005) vinculan a la oxidación con la presencia de etileno en el cultivo. Esto puede estar vinculado a la presencia de ciertos reguladores de crecimiento (Ozden-Tokatli et al., 2005), y por el estrés ocasionado por los cortes de los explantos (Goh et al., 1997).

Según Kumar et al. (1998) la capacidad de regeneración de brotes de

los explantos y la estimulación de la biosíntesis de etileno puede variar dependiente de los reguladores de crecimiento usados, es por esto que Ozden-Tokatli et al. (2005) señalan que posiblemente se libere mayores cantidades de etileno en medios de cultivo que presenten BA.

Beyer et al., Goh et al., citados por Ozden-Tokatli et al. (2005),

recomiendan usar en el medio de cultivo, compuestos que inhiban la acción del etileno, como por ejemplo: nitrato de plata (AgNO3) o tiosulfato de plata, o que inhiban su síntesis como por ejemplo la aminoetoxivinilglicina (AVG); ya que la producción de etileno se ve acentuada por las heridas de corte en los explantos. Así mismo, Ozden-Tokatli et al. (2005) encontraron un efecto positivo del nitrato

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de plata en el control de la oxidación en los explantes de árboles maduros de Pistachio.

Turhan (2004) señala que en la micropropagación, la acumulación

excesiva del gas etileno en los tubos sellados, puede inhibir el crecimiento de las plantas y restringir el establecimiento de plántulas apropiadas para la repropagación. Una forma de resolver este problema es por medio de la aplicación de químicos como el nitrato de plata.

En resumen, las diferencias significativas encontradas entre

tratamientos para la oxidación probablemente se deban al uso de 6-bencilaminopurina (BAP) en el medio y al estrés sufrido por los explantos por los cortes realizados, lo que provoca un aumento de etileno ocasionando la oxidación de los explantos. Al agregar nitrato de plata al medio, se inhibe la acción del etileno y se reduce la oxidación.

En cuanto al material vegetal, los genotipos comerciales presentaron

mayores porcentajes de oxidación en comparación con el material nativo. Esto puede deberse a la sensibilidad de cada genotipo frente a la presencia del etileno, o de su capacidad para sintetizarlo.

La sobrevivencia se calculó en base a las pérdidas por contaminación y

las pérdidas por oxidación en el período de un mes a partir de introducido el material en el medio de cultivo.

Como se mencionó anteriormente, la presencia de nitrato de plata

presenta beneficios por ser un agente antifúngico y por controlar la oxidación al inhibir la acción del etileno. Esto se vio reflejado en el mayor porcentaje de sobrevivencia que tuvieron los explantes que contenían en el medio de cultivo nitrato de plata, en comparación con aquellos que no.

En general, los porcentajes promedios de sobrevivencia para cultivos in

vitro de segmentos nodales de I. paraguariensis, en el período de un mes a partir de la introducción fueron variados. Dentro de la literatura consultada Dutra y Gomes da Silva (2009) reportan la menor sobrevivencia con una tasa del 5,25% debido a altas tasas de contaminación. Luego se encuentran valores de 15% (Dutra et al., 2008), 39% (Horner et al., 2001), 57% (Rosa et al., 2006), 60% (Mroginski et al., 1999), hasta llegar a los valores más elevados provistos por Zaniolo y Zanette (2004) con porcentajes de sobrevivencia de 72,9 y 68,7%.

Si se tienen en consideración estos antecedentes, las tasas de

sobrevivencia obtenidas para los tratamientos que contenían nitrato de plata en el medio son muy buenas, siendo estas de aproximadamente 75%.

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6. CONCLUSIONES Se concluye para este trabajo que en las condiciones experimentales

detalladas anteriormente es posible alcanzar un porcentaje de sobrevivencia de hasta 75% mediante la modificación de la composición del medio de cultivo en la etapa de introducción.

La incorporación de nitrato de plata (AgNO3) fue un factor determinante

tanto para el control de la contaminación de origen fúngico como para el control oxidativo; influyendo esto en la sobrevivencia de los explantos.

No se encontraron diferencias significativas entre los distintos tiempos

de inmersión en hipoclorito de sodio (NaClO), ni en la sobrevivencia entre los distintos materiales vegetales.

A su vez, las plantas de origen nativo presentaron mayor contaminación

tanto por hongos como por bacterias; lo que merece, en futuras investigaciones, un mayor control pre-introducción, cuidando especialmente la sanidad de los materiales madres. En relación a esto, se encontró la reincidente aparición de bacterias GRAM positivo y negativo, recomendándose el uso de antibióticos de amplio espectro en el medio de cultivo para disminuir aún más la contaminación.

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7. RESUMEN La yerba mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) es una especie

perteneciente a la familia Aquifoliaceae, ampliamente consumida en infusiones en el Sur de América Latina. Su propagación ha sido siempre una de las limitantes importantes para la actividad productiva y de conservación. Hasta el momento existen muy pocos estudios sobre las poblaciones de yerba mate uruguayas, y por esto, este trabajo pretende aportar al conocimiento de los materiales nativos de I. paraguairensis, a partir de la evaluación de su comportamiento y establecimiento in vitro, para determinar si las técnicas de micropropagación son una alternativa viable para la propagación vegetativa de los materiales presentes en el país. Para esto se probaron cuatro tratamientos de desinfección en materiales nativos y en clones comerciales de origen policlonal del INTA (Argentina). Los tratamientos consistieron en dos tiempos distintos de inmersión en hipoclorito de sodio (NaClO) de 15 y 25 minutos, y la presencia/ausencia de 1mg/L de nitrato de plata (AgNO3) en el medio de cultivo. El medio de cultivo empleado fue ¼ de sales MS + vitaminas MS + 3% sacarosa + 0,6%agar + 0,1mg/l BAP. En el transcurso del primer mes posterior a cada introducción, se cuantificaron las variables: explantos contaminados con bacteria, con hongos, explantos oxidados y sobrevivencia. Se encontraron diferencias significativas para la contaminación por hongos, oxidación y sobrevivencia entre tratamientos que contenían AgNO3 en el medio y los que no; no presentándose diferencias significativas entre contaminación por bacterias, ni tiempos de inmersión en NaClO. A su vez, se encontraron diferencias significativas entre materiales vegetales para contaminación y oxidación, siendo el material nativo el que presentó mayores tasas de contaminación, mientras que el material comercial presentó mayores tasas de oxidación. No existieron diferencias significativas entre materiales vegetales para la sobrevivencia. Se concluye para este trabajo que la incorporación de nitrato de plata (AgNO3) fue un factor determinante tanto para el control de la contaminación de origen fúngico como para el control oxidativo; influyendo esto en la sobrevivencia de los explantos (75%).

Palabras clave: Cultivo in vitro; Ilex paraguariensis; Micropropagación; Nitrato de plata; Yerba mate.

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8. SUMMARY Ilex paraguariensis A. St.-Hil. is a species from the Aquifoliaceae family,

widely consumed in infusions in southern Latin America. Its propagation has always been one of the major constraints to productive activity and conservation. So far there are very few studies on native populations, and therefore, this paper aims to contribute to the knowledge of native materials of I. paraguairensis, assessing their behavior and in vitro establishment to determine whether micropropagation techniques are a viable alternative option for vegetative propagation of native materials. To do this, four disinfection treatments were tested in native materials and commercial clones of polyclonal origin from INTA (Argentina). Treatments consisted in two different immersion times in sodium hypochlorite (NaClO) for 15 and 25 minutes, and the presence/absence of 1 mg/L silver nitrate (AgNO3) in the culture medium. The culture medium used was: ¼ Murashige and Skoog (MS) salts + MS vitamins + 3% sucrose + 0.6% agar + 0.1 mg/L BAP. During the first month after each introduction, contamination of explants with bacteria and fungus, browning and survival of explants were quantified. Significant differences for fungal contamination, oxidation and survival were found between treatments containing AgNO3 in the medium and those without; there were no significant differences for bacterial contamination or NaClO immersion times. At the same time, significant differences amongst plant materials for contamination and oxidation were found; being the native material the one which had higher rates of contamination, while the commercial material showed higher rates of oxidation. Survival of different plant materials showed no significant differences. It is concluded that the incorporation of silver nitrate (AgNO3) was a determining factor for fungal contamination control and oxidative control; influencing this in the survival of the explants (75%).

Keywords: Ilex paraguariensis; In vitro culture; Micropropagation; Silver nitrate; Yerba-mate.

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