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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD CIENCIAS QUÍMICAS
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TEMA: DESARROLLO DE RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES A BASE DE EXTRACTOSHIDROALCOHÓLICOS DE HOJAS DE Mangifera indica L.
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTARAL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO
AUTORES:
LLERENA CHÉVEZ INGRID PAMELA
SABANDO CEVALLOS JULIO ARCESIO
TUTORA:
Q.F. LEILA PRIAS MOGRO Msc.
CO-TUTORA:
Q.F. CELESTE CARRILLO TOMALA
GUAYAQUIL - ECUADOR
2018
II
FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓNTÍTULO Y SUBTÍTULO: “DESARROLLO DE RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES A BASE DE EXTRACTOS
HIDROALCOHÓLICOS DE HOJAS DE Mangifera indica L.”
AUTOR(ES) (apellidos/nombres): LLERENA CHÉVEZ INGRID PAMELASABANDO CEVALLOS JULIO ARCESIO
REVISOR(ES)/TUTOR(ES)(apellidos/nombres):
Ph.D Ing. RAÚL DÍAZ TORRES (REVISOR)
Q.F. LEILA PRIAS MOGRO Msc. (TUTORA)INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
UNIDAD/FACULTAD: FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
MAESTRÍA/ESPECIALIDAD:
GRADO OBTENIDO: TERCER NIVEL – QUIMICO FARMACEUTICO
FECHA DE PUBLICACIÓN: 16 DE MARZO 2018 No. DE PÁGINAS: 76
ÁREAS TEMÁTICAS: Tecnologia de Alimentos
PALABRAS CLAVES/KEYWORDS:
Recubrimiento comestible, barra de zanahoria, quitosano, extracto hidroalcohólico,vida útil.
RESUMEN/ABSTRACT (150-250 palabras): La conservación de alimentos se ha convertido en un tematrascendental para la industria alimenticia, debido a las mermas por deterioro que se producen por diversos factores,lo que repercute en pérdidas económicas significativas, que obligan a buscar nuevos métodos de conservación paraalargar la vida útil o vida en anaquel de los alimentos sin alterar su calidad. En éste trabajo se elaborórecubrimientos comestibles a base de extractos hidroalcohólicos de hojas de mango, aprovechando de esta manerasus propiedades antioxidantes, antinflamatorios e hipoglucemiantes que presentan las hojas, con la utilización delquitosano el cual tiene propiedades de conservar las características sensoriales, al ser un biopolímero que se adhiereal alimento. Se evaluó la actividad antimicrobiana in vitro de los recubrimientos comestibles frente a cuatropatógenos: Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Enterococcus faecalis. Todos losrecubrimientos presentaron actividad. Los recubrimientos se aplicaron a zanahorias mínimamente procesadas poraspersión y fueron almacenadas a 3°C durante 12 días. Se evaluó la calidad sanitaria del producto mediante ladeterminación de aerobios mesófilos y coliformes desde el día del tratamiento y posteriormente cada 3 días hastallegar al día 12. Los mismos intervalos de tiempo fueron aplicados para la evaluación sensorial donde se usaronevaluadores previamente entrenados y, de acuerdo a los resultados obtenidos se seleccionó el recubrimientocomestible con mayor aceptación en las diferentes características sensoriales.
ADJUNTO PDF: SI NO
CONTACTO CON AUTOR/ES: Teléfono: 0993299821 E-mail: [email protected]
CONTACTO CON LAINSTITUCIÓN:
Nombre: SEDE CIENCIAS QUIMICAS
Teléfono: 042293680
E-mail: www.fcq.ug.edu.ec
X
III
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IX
X
AGRADECIMIENTO
Agradecemos a Dios quien siempre nos cuida y nos guía en el camino de nuestras
vidas.
Agradecemos sincera y cariñosamente a nuestros familiares por ser quienes nos
apoyan siempre en los momentos más necesarios.
A nuestros amigos que nos han apoyado directa e indirectamente comprendiendo el
esfuerzo que amerita ésta carrera.
Al Ing. Raúl Díaz, a la Dra. Gabriela Carrillo y a cada uno de los profesores que nos
ayudaron para la realización de este trabajo.
Una agradecimiento especial a nuestra querida “pasante” Gabriela Bravo que sin dudar
nos brindó un gran apoyo durante los momentos más requeridos.
Un honorífico agradecimiento a Q.F. Celeste Carrillo Tomalá, quien siempre apostó
por nosotros; guiándonos con paciencia y compartiéndonos sus conocimientos en las
aulas como nuestra Docente y en el transcurso del trabajo de titulación. Enseñándonos
el significado y sacrificio de nuestra carrera.
Y finalmente, a nuestra tutora Q.F. Leila Prias Msc., quien confió firmemente en
nuestras capacidades y habilidades para culminar con éxito esta labor.
Ingrid Llerena Chévez & Julio Sabando Cevallos
XI
DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado a mi madre Teresa Chévez por ser el pilar fundamental de
mi vida, una gran amiga y la persona que más admiro.
A mi padre Geovanny Llerena quien me ha inculcado siempre el respeto, la
solidaridad y humildad que debe caracterizar al ser humano.
A Giancarlo, Christian y Betsy porque son mi más grande orgullo y siempre me
alentaron a seguir adelante.
Y a mi amada abuelita Petita, porque gracias a ella soy quien soy.
Ingrid Llerena Chévez
XII
DEDICATORIA
A mi madre Narcisa Cevallos y a mi padre Franklin Sabando por darme siempre los
mejores consejos y valores para afrontar la vida.
A mis hermanos mayores por estar presente en todo mi proceso académico.
Y todas esas personas que estuvieron ahí ayudándome para la realización de esta
tesis.
Julio Sabando Cevallos
XIII
ÍNDICERESUMEN.......................................................................................................................... XIX
ABSTRACT ......................................................................................................................... XX
INTRODUCCIÓN....................................................................................................................1
PROBLEMA............................................................................................................................5
HIPÓTESIS ............................................................................................................................5
OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................5
OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................................5
VARIABLES........................................................................................................................6
VARIABLES DEPENDIENTES........................................................................................6
VARIABLES INDEPENDIENTES....................................................................................6
VARIABLE INTERVINIENTE Y ALTERNA......................................................................6
OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES .........................................................................7
CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA...........................................................................11
1.1. ANTECEDENTES...................................................................................................11
1.2. Mangifera indica L. .....................................................................................................12
1.2.1. TAXONOMÍA...................................................................................................13
1.2.2. VARIEDAD TOMMY ATKINS SELECCIONADA..............................................14
1.3. PRODUCTOS MÍNIMAMENTE PROCESADOS..................................................... 15
1.4. RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES .....................................................................16
1.4.1. PROPIEDADES QUE POSEEN LOS RECUBRIMIENTOS ALIMENTICIOS....17
1.4.2. TIPOS DE RECUBRIMIENTOS ALIMENTICIOS.............................................18
1.5. QUITINA.................................................................................................................19
1.6. QUITOSANO..........................................................................................................20
1.6.1. OBTENCION DE QUITOSANO .......................................................................21
1.6.2. USOS DEL QUITOSANO ................................................................................22
1.7. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS ......................... 23
1.7.1. MACERACIÓN ................................................................................................ 24
1.7.2. DIGESTIÓN.....................................................................................................25
1.8. FENOLES...............................................................................................................25
1.9. MICROORGANISMOS INDICADORES DE CALIDAD SANITARIA........................ 26
1.9.1. AEROBIOS MESÓFILOS ................................................................................27
1.9.2. COLIFORMES TOTALES Y FECALES ........................................................... 28
XIV
1.10. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA .........................................................................29
1.11. MICRORGANISMOS PATÓGENOS DE INTERÉS.............................................29
1.11.1. Staphylococcus aureus ................................................................................29
1.11.2. Enterococcus faecalis ..................................................................................30
1.11.3. Escherichia coli ............................................................................................ 32
1.11.4. Pseudomonas aeruginosa............................................................................33
CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS ..........................................................................36
2.1. MATERIAL VEGETAL ............................................................................................ 36
2.2. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS................................ 37
2.3. ELABORACIÓN DEL RECUBRIMIENTO COMESTIBLE........................................38
2.4. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA ..........................................39
2.4.3. Técnica de Kirby Bauer modificado. ................................................................ 39
2.5. PREPARACIÓN DE LAS ZANAHORIAS MÍNIMAMENTE PROCESADAS CON LOSRECUBRIMIENTOS COMESTIBLES ...............................................................................40
2.6. EVALUACIÓN O ANÁLISIS SENSORIAL............................................................... 41
2.7. EVALUACIÓN DE LA CALIDAD SANITARIA ......................................................... 42
2.8. RECUENTO TOTAL DE AEROBIOS MESÓFILOS Y RECUENTO DE E.COLI/COLIFORMES.........................................................................................................43
2.9. MÉTODOS DE ANÁLISIS ESTADÍSTICO .............................................................. 43
CAPITULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN......................................................................45
3.1. DETERMINACIÓN DE HUMEDAD DEL MV MOLIDO............................................45
3.2. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA.............................................................................45
3.3. EVALUACIÓN DE LA CALIDAD SANITARIA ......................................................... 47
3.4. EVALUACIÓN SENSORIAL ...................................................................................50
CAPÍTULO IV: CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................58
CONCLUSIONES: ............................................................................................................58
RECOMENDACIONES.....................................................................................................59
BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................................... 60
ANEXOS............................................................................................................................... 67
XV
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I Cuadro de las Variables Independientes y Dependientes del experimento Invitro ............................................................................................................................. 8Tabla II Cuadro de las Variables Independientes y Dependientes del experimento Invivo .............................................................................................................................. 9Tabla III Clasificación Taxonómica del mango .......................................................... 13Tabla IV “Descripción de la hoja de Mangifera indica L. variedad Tommy Atkins” .... 14Tabla V Volúmenes para la elaboración de los recubrimientos comestibles y control.................................................................................................................................. 38Tabla VI Recubrimientos usados como tratamiento en los bastones de zanahorias. 41Tabla VII Porcentajes de humedad del material vegetal seco y molido .................... 45Tabla VIII: Medición de los halos de inhibición de los diferentes tratamientos frente alos patógenos estudiados.......................................................................................... 46Tabla IX Códigos de los recubrimientos comestibles y los blancos .......................... 71Tabla X Resultados de UFC/g obtenidos en el recuento de coliformes totales ........ 74Tabla XI Resultados de UFC/g obtenidos en el recuento de aerobios mesófilos ..... 75
XVI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estructura química de la quitina (Izquierdo, Universidad Pública de Navarra,2014) ......................................................................................................................... 20Figura 2 Estructura química del quitosano (Izquierdo G. , 2014) ............................. 21Figura 3 Diagrama de la obtención del quitosano (Izquierdo G. , 2014) .................. 21Figura 4 Fotografía microscópica de Staphylococus aureus (Jiménez, 2016) ......... 30Figura 5 Micrografía de Enterococcus faecalis. Tinción de Gram (Microbiology inPictures, 2015) .......................................................................................................... 31Figura 6 : Micrografía electrónica de escaneo coloreada de Escherichia coli, cultivadaen cultivo y adherida a un cubreobjetos (National Institute of Allergy and InfectiousDiseases, 2012). ....................................................................................................... 33Figura 7 Colonias de aislamientos hospitalarios de P. aeruginosa. Se aprecian losdiferentes pigmentos producidos sobre agar Mueller Hinton, luego de 48 h deincubación a 28 °C. (Merino L. , 2007) ...................................................................... 34
XVII
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Crecimiento bacteriano de aerobios mesófilos de los recubrimientoscomestibles durante los 12 días de almacenamiento................................................ 48Gráfico 2: Crecimiento bacteriano de Coliformes totales de los recubrimientoscomestibles durante los 12 días de almacenamiento................................................ 49Gráfico 3: Resultados de la evaluación sensorial en el atributo color ....................... 51Gráfico 4: Resultados de la evaluación sensorial en el atributo aspecto................... 52Gráfico 5: Resultados de la característica textura ..................................................... 54Gráfico 6: Resultados de la característica textura ..................................................... 54Grafico 7: Resultados de la característica masticabilidad ......................................... 55Grafico 8: Resultados de la característica de olor ..................................................... 56Grafico 9: Resultados de la característica sabor ....................................................... 57
XVIII
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo A: Recolección y preparación de la muestra .................................................. 67Anexo B: Preparación de extractos y quitosano....................................................... 68Anexo C: Preparación de las zanahorias .................................................................. 69Anexo D: Formato para la evaluación sensorial ........................................................ 70Anexo E: Evaluación sensorial .................................................................................. 70Anexo F: Análisis de la calidad sanitaria ................................................................... 71Anexo G; ANTIBIOGRAMA....................................................................................... 76
XIX
RESUMEN
La conservación de alimentos se ha convertido en un tema trascendental para
la industria alimenticia, debido a las mermas por deterioro que se producen por
diversos factores, lo que repercute en pérdidas económicas significativas, que obligan
a buscar nuevos métodos de conservación para alargar la vida útil o vida en anaquel
de los alimentos sin alterar su calidad.
En éste trabajo se busca elaborar recubrimientos comestibles a base de
extractos hidroalcohólicos de hojas de mango, aprovechando de esta manera sus
propiedades antioxidantes, antinflamatorios e hipoglucemiantes, con la utilización del
quitosano el cual tiene propiedades de conservar las características sensoriales, al ser
un biopolímero que se adhiere al alimento.
Se evaluó la actividad antimicrobiana in vitro de los recubrimientos
comestibles frente a cuatro patógenos: Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli y Enterococcus faecalis, aunque presento una baja actividad
antimicrobiana, estos fueron muchos mejores a las pruebas control.
Los recubrimientos se aplicaron a zanahorias mínimamente procesadas por
aspersión y fueron almacenadas a 3°C durante 12 días (288 horas). Se evaluó la
calidad sanitaria del producto mediante la determinación de aerobios mesófilos y
coliformes desde el día del tratamiento y posteriormente cada 3 días hasta llegar al día
12.
Los mismos intervalos de tiempo fueron aplicados para la evaluación sensorial
donde se usaron evaluadores previamente entrenados y, de acuerdo a los resultados
obtenidos se seleccionó el recubrimiento comestible con mayor aceptación en las
diferentes características sensoriales.
Palabras claves: recubrimiento comestible, barra de zanahoria, quitosano, extracto
hidroalcohólico, vida útil.
XX
ABSTRACT
The conservation of food has become a much analyzed subject for the food
industry because of the deterioration of products due to various factors. The losses are
significantly large for this field, representing economic losses which forces them to seek
new conservation methods to extend the shelf life or shelf life of food without altering
its quality. In this work we seek to make edible coatings based on hydroalcoholic
extracts of 50% mango leaves obtained by digestion and 90% obtained by maceration,
taking advantage of the properties demonstrated in previous research, with the
combination of a biopolymer that is chitosan.
The in vitro antimicrobial activity of the edible coatings was evaluated against
four pathogens: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli
and Enterococcus faecalis. All the coatings showed a low inhibitory activity against
these bacteria. The coatings were applied to carrots minimally processed by spray and
stored at 3 ° C for 12 days (288 hours). The sanitary quality of the product was
evaluated by means of the determination of mesophilic and coliform aerobes, on the
day of treatment and then every 3 days until reaching 12 days.
These same time intervals were applied for the sensory evaluation where
previously trained judges were used and under this criterion the edible coating with
greater sensory acceptance according to the analysis of variance applied would be
chosen. Variability analysis was also applied with a 95% confidence level to the data
obtained in the antimicrobial activity and in the evaluation of sanitary quality.
Keywords: edible coating, carrot stick, chitosan, hydroalcoholic extract, , shelf
life.
1
INTRODUCCIÓN
Uno de los mayores problemas que enfrenta la industria alimenticia son las
pérdidas anuales causadas por el ataque microbiano a los productos hortofrutícolas
que pueden ocurrir durante la cadena de suministro. Se estima que las pérdidas de
éstos productos se encuentran entre el 5 y 25% en países desarrollados y entre el 20
y 50% en países en vías de desarrollo (FAO, 2011). Otros factores que influyen son:
el tipo de alimento, deterioros fisiológicos, factores químicos o factores de orden
tecnológico como el inadecuado proceso de recolección. Además, el uso de empaques
no apropiados durante el almacenamiento y transporte puede causar cambios en la
calidad e inocuidad del alimento, debido a que en éstos procesos están presentes
factores como el oxígeno y la humedad (Fernández et al., 2015; Restrepo & Aristízabal,
2010).
Según la Organización de la Naciones Unidas para la Alimentación y la
Agricultura (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) la contaminación de
los alimentos con microorganismos patógenos provoca pérdidas significativas en la
industria alimentaria y en la economía de los comerciantes y productores. (Valenzuela
& Arias, 2012) Una de las opciones que empleó la industria alimenticia para evitar este
tipo de problemas fue el uso de antibióticos como una solución que prometía, más que
nada, combatir el crecimiento antimicrobiano indeseado en los alimentos.(Serrano,
2013) Sin embargo, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha considerado que
“el uso abusivo de los antibióticos es una de las principales causas del incremento de
la resistencia bacteriana y uno de los mayores problemas de salud pública”
(Organización Mundial de la Salud, 2017).
2
Por consiguiente, es de suma importancia el uso de alternativas nuevas o
métodos tecnológicos que ayuden a disminuir las pérdidas incrementando la vida de
anaquel de los alimentos perecibles, sin perjudicar la salud de los consumidores. Entre
éstas tecnologías se encuentran los tratamientos térmicos, atmósferas controladas,
eliminación de agua, entre otros, que son considerablemente costosas y en muchas
ocasiones perjudican las características organolépticas del alimento. Sin embargo,
durante la última década la alternativa más viable para la industria alimenticia ha sido
el empleo de los recubrimientos comestibles como una estrategia natural y al mismo
tiempo una alternativa tecnológica. A partir de ello, se ha producido un incremento
considerable en el número de trabajos e investigaciones cuyo propósito es estudiar la
habilidad de diversos materiales para elaborar recubrimientos y analizar sus
propiedades, ventajas y desventajas (Pérez, 2015; Velázquez y Guerrero, 2014;
Valenzuela y Arias, 2012).
Los recubrimientos comestibles se encuentran dentro de los conocidos como
“empaques activos” porque interaccionan con el producto o con su entorno para
mejorar uno o más aspectos de su calidad o seguridad (Rodríguez et al., 2014). Los
recubrimientos comestibles son empleados con el objetivo principal de evitar la pérdida
de humedad en los alimentos, retrasar el envejecimiento y evitar el ataque microbiano
indeseable sin alterar la calidad organoléptica ni nutritiva que puedan provocar el
rechazo del consumidor. El crecimiento microbiano puede producir toxiinfecciones
alimentarias dependiendo del microorganismo por ello es imprescindible, sobre todo,
mantener la seguridad alimentaria. Por otra parte, los recubrimientos son una
alternativa para preservar la frescura de frutas y vegetales incrementando su vida útil.
Se define como vida útil al período durante el cual presenta niveles aceptables de
calidad desde los puntos de vista de inocuidad, valor nutricional y sensorial. (Ancos et
al., 2015; Morales, 2011).
Actualmente existe otro grupo que son usados como cubiertas activas, las
“ceras” que son elaboradas por ceras autorizadas como aditivos alimentarios, resinas
3
o combinaciones de las mismas, a diferencia de los recubrimientos comestibles (o
“edible coating” según la literatura anglosajona) que son formulados a base de
polisacáridos, proteínas, y otras combinaciones (Goméz, 2015). Pero el inconveniente
que presenta el encerado es que solamente la parte del alimento que estaba en
contacto con el cepillo, recibía cera, es decir que no se realiza de manera uniforme
(Gómez, 2015; Hancco, 2014).. Esto no sucede con los recubrimientos cuando son
aplicados a un alimento por aspersión o inmersión. Los recubrimientos comestibles
son sustancias que se aplican en el exterior de los alimentos convirtiéndose en un
material de empaque delgado que puede ser consumido como parte del alimento, ya
que son elaborados a partir de biopolímeros no tóxicos y biodegradables que hacen al
producto final apto y seguro para el consumo (Sánchez et al., 2011).
Según lo expuesto por Falguera et al. (2011) los recubrimientos deben
presentar ciertas exigencias funcionales que permitan controlar o aminorar las causas
de alteración de los alimentos a recubrir, algunas de estas ventajas y propiedades son:
• Ser protectores de la acción física, química y mecánica preservando su textura,
prolongan la vida útil de alimentos a través del control sobre el desarrollo de
microorganismos.
• Pueden regular distintas condiciones de interface o superficiales del alimento, a
través del agregado de aditivos como antioxidantes, agentes antimicrobianos y
nutrientes. Haciéndolos libres de tóxicos y seguros para la salud, con una
tecnología simple para su elaboración.
• Presentan propiedades de barrera como transferencia de distintas sustancias,
adecuada permeabilidad al vapor de agua, solutos y una permeabilidad
selectiva a gases y volátiles, desde el alimento hacia el exterior y viceversa.
Debido a su composición química rica en nutrientes las frutas y vegetales
frescos se consideran como productos perecibles dado a su tendencia inherente a
deteriorarse por razones fisiológicas y por invasión de plagas, infecciones y
enfermedades. Existe un grupo de alimentos que son aún más susceptibles, son los
4
denominados productos mínimamente procesados o de IV gama. Son productos
frescos y se procesan con el objetivo de proveer al consumidor un alimento listo para
consumir y gracias a dichas características se han convertido en los preferidos por los
consumidores y los principales en cuestión para la aplicación de recubrimientos
comestibles. (Escobar, 2013)
Las plantas poseen un sin número de propiedades que ayudarían a prolongar
la vida útil de los alimentos. Actualmente, se han hecho varias investigaciones sobre
el uso de extractos vegetales como parte de la composición de un recubrimiento
comestible. En Ecuador, en el año 2015, se evaluó la actividad antimicrobiana de la
corteza del árbol de Mangifera indica L. obteniendo resultados positivos (Ortiz, Díaz y
Carrillo, 2015). Estos resultados sirvieron para la elaboración de un recubrimiento
comestible utilizando el quitosano como polímero, ésta solución demostró poseer un
sinergismo en la propiedad antibacteriana frente a microorganismos de interés
sanitario como Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y
Listeria monocytogenes (Ortiz et al., 2015).
El propósito de éste trabajo es la elaboración de recubrimientos comestibles a
base de extractos hidroalcohólicos de hojas de Mangifera indica L. para aumentar la
vida útil de productos mínimamente procesados, en este caso se aplicaron a bastones
de zanahorias. Se evaluó la actividad antimicrobiana de éstos recubrimientos frente a
cuatro patógenos para garantizar la inocuidad del alimento. La calidad sanitaria en los
bastones de zanahoria se evaluó mediante el análisis de coliformes totales y aerobios
mesófilos. Además, la evaluación sensorial se realizó en base a parámetros de calidad
para determinar la vida de anaquel de los bastones de zanahorias que fueron
almacenados durante 12 días a temperatura de refrigeración (3 ± 1°C).
5
PROBLEMA¿Los recubrimientos comestibles a base de extractos hidroalcohólicos de
hojas de Mangífera indica L. tendrán actividad antimicrobiana aumentando la vida útil
de productos mínimamente procesados?
HIPÓTESISLos recubrimientos comestibles a base de extractos hidroalcohólicos de
hojas de Mangifera indica L. tienen actividad antimicrobiana aumentando la vida útil
de productos mínimamente procesados.
OBJETIVO GENERALEvaluar la efectividad de recubrimientos comestibles elaborados a base de
extractos hidroalcohólicos de hojas de Mangifera indica L.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS1. Determinar la actividad antimicrobiana de los recubrimientos comestibles a base
de extractos de hojas de Mangifera indica L.
2. Evaluar la calidad sanitaria de las zanahorias tratada con los recubrimientos
elaborados a base de extractos de hojas de Mangifera indica L.
3. Evaluar sensorialmente los alimentos tratados con los recubrimientos
comestibles elaborados con extractos de hojas de Mangifera indica L.
6
VARIABLES
VARIABLES DEPENDIENTES Actividad antimicrobiana
Evaluación sensorial
Recuento de Aerobios mesófilos
Recuento de Coliformes totales
VARIABLES INDEPENDIENTES Concentración de extracto hidroalcohólico
Concentración del polímero
Tiempo de almacenamiento
VARIABLE INTERVINIENTE Y ALTERNA
Estación del año que se recoge el material vegetal
7
OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES
CONCEPTUALIZACION
EXPERIMENTO IN VITRO
Variable Independiente
Tipo de recubrimiento: Elaboración del recubrimiento comestible en base a los diferentes extractos hidroalcohólicos.
Variable Dependiente
Actividad antimicrobiana: Capacidad inhibitoria del crecimiento microbiano.
8
Tabla I Cuadro de las Variables Independientes y Dependientes del experimento In vitro
TIPO DEVARIABLE VARIABLE DIMENSIONES INDICADOR ÍNDICE ESCALA
INDEPENDIENTE Tipo derecubrimiento
Sin extracto deHidroalcohólico
Concentración dealcohol
Porcentaje(%) Ordinal
Con extracto obtenidopor maceración
Concentración deextracto
Porcentaje(%) Ordinal
Con extracto obtenidopor digestión
Concentración deextracto
Porcentaje(%) Ordinal
DEPENDIENTE Actividadantimicrobiana
Frente a Pseudomonas
aeruginosaHalo de inhibición Milímetros
(mm) Intervalo
Frente a Staphylococcus
aureusHalo de inhibición
Milímetros(mm) Intervalo
Frente a Escherichia
ColiHalo de inhibición Milímetros
(mm) Intervalo
Frente a Enterococcus
FaecalisHalo de inhibición Milímetros
(mm) Intervalo
Fuente Propia
9
EXPERIMENTO IN VIVO
Variable Independiente
Tiempo de almacenamiento: Magnitud física con la que medimos la duración o separación de acontecimientos.
Variable Dependiente
Evaluación sensorial: Evaluación de las propiedades organolépticas.
Calidad sanitaria: Cantidad de colonias de microorganismos estudiadas
Tabla II Cuadro de las Variables Independientes y Dependientes del experimento In vivo
TIPO DE VARIABLE VARIABLE DIMENSIONES INDICADOR ÍNDICE ESCALA
INDEPENDIENTE Tiempo dealmacenamiento
Tiempo dealmacenamiento Tiempo transcurrido Días Nominal
DEPENDIENTE Evaluaciónsensorial
Color, olor, sabor,fracturabilidad,
aspecto, textura almasticar,
masticabilidad
Distancia en la escala cm Numeral
10
Evaluaciónsanitaria
Recuento deAerobios mesófilos Cantidad de colonias
formadas por ciertoperiodo de tiempo
UFC/g Nominal
Recuento deColiformes totales
Cantidad de coloniasformadas por ciertoperiodo de tiempo
UFC/g Nominal
11
CAPÍTULO I: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.1.1. ANTECEDENTES
El uso recubrimientos comestibles no es una tecnología actual, ciertamente
desde hace mucho tiempo han sido empleados. Krochta, Baldwin y Nisperos
previamente citado en Velásquez y Guerrero (2014) mencionaron que durante los
siglos XII y XIII se practicó en China la inmersión en ceras de naranjas y limones para
retardar la perdida de agua. También, en Inglaterra, durante el siglo XVI, se utilizó un
recubrimiento con manteca para prevenir la pérdida de humedad en alimentos. En la
actualidad, los recubrimientos comestibles son aplicados a una gran variedad de
productos, además se han realizado, y se siguen realizando, investigaciones y
experimentos sobre recubrimientos comestibles probando distintos componentes y
estudiando la interacción de los componentes del recubrimiento comestible frente al
alimento.
En Brasil, se evaluó el efecto de una película de almidón de yuca (2 %) sobre
papayas (Carica papaya L.) almacenadas a temperatura ambiente (25 ± 2 ºC) y a 8 °C
con 82 % de humedad relativa durante 6 días de almacenamiento. Se realizaron
análisis de pérdida de peso, color, pH, acidez, carotenoides totales, vitamina C y
sólidos solubles totales, cada tres días de almacenamiento. La película comestible de
almidón de yuca resultó ser una buena alternativa para la preservación de la papaya
durante seis días de almacenamiento, en relación a los parámetros pH, grados Brix,
acidez y carotenoides (Almeida, 2011).
En Colombia, se evaluó la calidad fisicoquímica, funcional y microbiológica de
moras de castilla previamente tratadas con recubrimientos comestibles (RC) a base
de goma gellan (0,5%p/v), gelatina (0,2%p/v) y dos tipos de caseína (micelar y
caseinato de calcio 0,1%p/v) combinados con glicerol como plastificante, natamicina
12
como agente antifúngico y aceite de canola como compuesto funcional. Los resultados
sobre la vida útil de la fruta fueron positivos. (Valenzuela, 2014)
Por otra parte, desde la antigüedad, las especies vegetales han sido utilizadas
como conservantes naturales con el fin de retardar el deterioro de los alimentos debido
a las propiedades antimicrobianas y antioxidantes que éstas poseen. En los últimos
años ha aumentado el interés de disminuir el uso de conservantes químicos y
reemplazarlos por extractos vegetales (López, 2013). Otra investigación llevada a cabo
en Brasil consistía en evaluar la actividad antimicrobiana in vitro del extracto
hidroalcohólico de las hojas de Mangifera indica L., donde se determinó, por el método
de difusión en disco, poseer actividad frente al S. aureus, proporcionando evidencia
científica para su potencial uso terapéutico (Meneses, et al., 2014).
Guerra & Román (2016), demostraron que el extracto hidroalcohólico de las
hojas de Mangifera indica L. inhiben el crecimiento de Staphylococcus aureus y
Pseudomona aeuroginosa por el método de difusión en agar, utilizando pozos en lugar
de discos. En el mismo año Zambrano y García, (2016), determinaron la capacidad
antioxidante de extractos obtenidos de las hojas de Mangifera indica L. por diferentes
métodos de extracción cuyos resultaron demostraron que el extracto con mayor
cantidad de compuestos fenólicos fue el obtenido por extracción asistida por
ultrasonido al 50% de la variedad Edward.
1.2. Mangifera indica L.
El mango (Mangifera indica L.) es un fruto originario de India se ha cultivado
hace 2.000 años A.C aproximadamente. Dentro de su composición presenta el
componente activo “Xantona glicosilada” conocido también como Mangifera y éste
presenta compuestos como polifenoles, flavonoides, terpenoides, fitoesteroles,
azucares y lípidos (Vílchez et al, 2010).
13
El mango es una fruta tropical reconocida a nivel mundial por su dulzura y
exquisito sabor. En la actualidad Ecuador produce mango para exportación llegando
a todas partes del mundo, en especial al mercado de Estados Unidos con un 79% de
su exportación total, la Unión Europea es el segundo mercado al que exporta el
Ecuador. La variedad Tommy Atkins es la más consumida, seguida de la variedad
Kent (Zambrano, 2015)
1.2.1. TAXONOMÍA
Sauco (2009) indicó que el mango es la planta de mayor importancia dentro de
la familia de las Anacardiaceas Cronquist describió la clasificación taxonómica como
se presenta en la Tabla I.
Tabla III Clasificación Taxonómica del mango
Origen India
Familia Anacardaceae
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Subdivisión Magnoliophytina
Clase Rosidae
Orden Sapindales
Genero Mangifera
Especie Mangifera indica L.
Nota: Fuente (Saúco, 2009).
El mango es una planta que alcanza fácilmente los 4 metros en un clima tropical,
y en los climas subtropicales no llega a sobrepasar los 10 metros. En cuanto a las
14
hojas del mango son espaciadas irregularmente y alternadas a lo largo de las ramas,
liso en ambas superficies, un peciolo largo o corto, oblongo lanceolado, coriáceo, de
color verde oscuro brillante en la parte superior mientras que la parte posterior es un
verde amarillento, entre 10cm a 40 cm de longitud y de 2 a 10 cm, de ancho. Las hojas
jóvenes son de color violeta rojizo o bronceado, posteriormente se tornan de color
verde oscuro (Zambrano, 2015).
1.2.2. VARIEDAD TOMMY ATKINS SELECCIONADA
El fruto del mango Tommy atkins posee un tamaño grande 13 cm de largo,
posee una forma oval, oblonga, resiste muy bien a los daños mecánicos, también
presenta un mayor período de conservación, aunque no tiene mucho sabor, presenta
poco aroma y llega a pesar aproximadamente 700g (Fundación Mango Ecuador,
2015).
Los compuestos que se encuentran en la composición química de las hojas
están: Ácido cuxantinico (45%), cuxantona, ácido hipúrico, acido benzoico,
bufadienolidos, cardenolidos, esteroles insaturados, flavonoides (mangiferina,
kaempferol, quercetina, etc.), leucoantocianinas, antocianidas (delfinidina, petunidina,
poconidina, cianidina), polifenoles, taninos gálicos y catequinicos, taraxerol, friedelina,
lupeol y β-sitosterol (Ortiz et al., 2015).
Tabla IV “Descripción de la hoja de Mangifera indica L. variedad TommyAtkins”
15
Característica Expresión
Hoja joven Coloración antociánica Cobrizo
Hoja adulta
Longitud del limbo Corta
Anchura Estrecha
Forma Lanceolada
Ondulación del margen Ausente
Forma de ápice Obtusa
Forma de la base Atenuada
Longitud del peciolo Media
Nota: Fuente (Coello et al., 2000).
1.3. PRODUCTOS MÍNIMAMENTE PROCESADOS
Los alimentos o productos mínimamente procesados son frutas y hortalizas de
IV Gama, por ser preparadas para ser consumidas en el momento sin ninguna otra
operación adicional por parte del consumidor (Rotondo, Ferratto, y Firpo, 2015)
Los vegetales y frutas pasan por un proceso de selección, posteriormente
pasan a ser lavadas, cortadas y envasadas (comúnmente en atmósferas modificadas).
Por motivos de preservar mejor el alimento se preparan y conservan en refrigeración,
puesto que tienen una vida útil limitada, entre una semana y 10 días. Estos productos
son aún más perecederos, en comparación con los vegetales o frutos sin procesar, ya
que están cortadas, lavadas y troceadas (Moreno, 2016).
16
Hay que tomar en consideración que al momento de pelar y trocear un alimento
este aumenta la superficie de tejido haciéndolo más susceptible a alteraciones
microbianas; además, del incremento de la tasa respiratoria, la producción de
hormonas que favorecen la maduración (etileno) y metabolismo de los compuestos
fenólicos que aceleran la senescencia de los productos hortofrutícolas (Ramos B. ,
Miller, Brandao, Teixeira, & Silva, 2013).
Tomando todas las precauciones y utilizando métodos que preserven al
alimento, ninguno proceso de desinfección pueden controlar todos los parámetros que
mantienen la calidad y vida útil de un alimento de IV gamma. Por este motivo, es
necesario realizar estudios adicionales usando combinaciones de métodos o usos de
microbiota competitiva para mejorar y ampliar la seguridad de los alimentos (Ramos et
al., 2013).
1.4. RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES
Son un tipo de material de envoltura o capa delgada empleado en la industria
alimenticia que se adhieren a la superficie del alimento y que puede ser consumido
como parte del mismo, debido a que proviene de polímeros biodegradables, no tóxicos,
con el propósito de extender la vida útil e incrementar la calidad de los alimentos
durante su conservación. Proporcionar también una efectiva barrera contra los riesgos
que generan las condiciones ambientales existente (Sánchez et al., 2011). Los
materiales poliméricos usados en los recubrimientos son las proteínas o polisacáridos
en solución hidrocoloide que proporcionan un sistema mejorado las propiedades
mecánicas (Restrepo y Aristizabal, 2010).
17
1.4.1. PROPIEDADES QUE POSEEN LOS RECUBRIMIENTOS ALIMENTICIOS
Según las investigaciones de Restrepo y Aristizabal, (2010), los
recubrimientos deben presentar ciertas exigencias funcionales que permitan controlar
o aminorar las causas de alteración de los alimentos a recubrir, algunas de estas
ventajas y propiedades son:
Ser libres de tóxicos y seguros para la salud.
Deben requerir una tecnología simple para su elaboración.
Ser protectores de la acción física, química y mecánica.
Presentan propiedades sensoriales: deben ser transparentes y no ser
detectados durante su consumo.
Mejoran las propiedades mecánicas y preservan la textura.
Prolongan la vida útil de alimentos a través del control sobre el desarrollo de
microorganismos.
Pueden regular distintas condiciones de interface o superficiales del alimento, a
través del agregado de aditivos como antioxidantes, agentes antimicrobianos y
nutrientes.
Presentan propiedades de barrera como transferencia de distintas sustancias,
adecuada permeabilidad al vapor de agua, solutos y una permeabilidad
selectiva a gases y volátiles, desde el alimento hacia el exterior y viceversa.
La formación de una barrera física para gases permite a los recubrimientos
conservar la calidad de frutas y vegetales, produciendo una atmósfera modificada que
reduce la disponibilidad de O2 e incrementan la concentración de CO2 (Ramos et al.,
2010).
Los recubrimientos pueden servir para la adición de un amplio rango de
aditivos, con el objetivo de proporcionar mayores atributos al control de
microorganismos y calidad (Ramos et al., 2010).
18
1.4.2. TIPOS DE RECUBRIMIENTOS ALIMENTICIOS
A BASE DE LÍPIDOS, CERAS Y RESINAS
Los componentes más conocidos y empleados en este grupo son cera de
abeja, cera de carnauba y candelilla, triglicéridos, monoglicéridos acetilados, ácidos
grasos, alcoholes grasos y tenso activos tales como ésteres de sacarosa (Maldonado
y Valencia, 2016; Beverlya y James, 2012).
Los recubrimientos con base lipídica tienen la características, de reducir la
deshidratación de los productos debido a su baja polaridad, asumiendo una escasa
permeabilidad de vapor de agua. Sin embargo estos compuestos tienen propiedades
mecánicas pobres y en ciertas ocasiones mala apariencia, por esta razón los
recubrimientos a base de lípidos, ceras y resinas no se encuentran puros, son
mezclados con otras sustancias como polisacáridos, dando combinaciones que
proporcionan mayor estabilidad al recubrimiento (Ramos et al., 2010).
A BASE DE PROTEÍNAS
Las sustancias proteicas que más se utilizan para elaborar recubrimientos son
el suero de leche, gluten de trigo, extractos de caseína, proteína de soya, queratina
(Han y Genadios, 2005; Krochta, 2002). Para la realización de un recubrimiento
proteico hay que tomar en cuenta las diversas alergias existentes, como la celiaquía e
intolerancia al suero de leche. Los recubrimientos a base de proteínas presentan
mejores propiedades como barrera de gases, su defecto radica en la naturaleza
hidrofílica, dado que la resistencia al vapor de agua es menor. (Ramos et al., 2010)
A BASE DE POLISACÁRIDOS
19
Los recubrimientos con base de polisacáridos se han utilizado para recubrir
frutos, debido a sus propiedades mecánicas de adherencia y flexibilidad en la
superficie de los productos hortofrutícolas (Ramos et al., 2010).
Los polímeros de los polisacáridos contienen grupos hidroxilos de carácter
hidrofílico, debido a esto poseen una alta adherencia (Guerreiro et al., 2017; Valencia,
et al., 2011). Forman un recubrimiento con una excelente barrera frente al intercambio
gaseoso, pero reduce la protección a la perdida de humedad (Valencia, Palou, y Pérez,
2011). Poseen monómeros de carácter simple en comparación a los de las proteínas,
y debido a la complejidad de su estructura molecular, resultan flexibles ya que no
forman grietas al ser colocadas en el alimento. (Han, 2014; Lacroix y Vu, 2014).
1.5. QUITINA
Por su amplia distribución en la naturaleza la quitina es el segundo polisacárido
en abundancia, después de la celulosa. Fue descubierta por Braconnot en 1811
cuando estudiaba las sustancias derivadas del Agaricus volvaceus y otros hongos.
Posteriormente Odier, en un artículo sobre insectos, reportó que había encontrado en
algunos insectos la misma sustancia que forma la estructura de las plantas, llamándola
“quitina” (del griego tunic, envoltura). En 1843 Payen inició una controversia que duró
más de cien años sobre las diferencias entre la quitina y la celulosa, en parte porque
se pensaba que la presencia de nitrógeno reportada en algunas investigaciones se
debía a residuos de proteínas que no podían ser completamente eliminados de las
muestras. (Velásquez, 2003)
Se ha encontrado quitina en el exoesqueleto de insectos, cangrejos,
camarones, langostas y en las estructuras internas de otros invertebrados. (European
20
chitin society, 2017). La quitina se compone de unidades ß (1-4) del aminoazúcar N-
acetil-glucosamina (Ver figura 1) (European chitin society, 2017).
Esta sustancia se utiliza en diversas aplicaciones como: un agente floculante,
en curación de heridas, un agente de tamaño y fortalecimiento para papel, y un
vehículo de entrega para productos farmacéuticos y genes. (European chitin society,
2017). Este polisacárido tiene actividad antimicrobiana, inmunogénica, antitumoral,
anticoagulante, y cicatrizante. Su escasa solubilidad ha limitado su utilización, por este
motivo es que se convierte la quitina en quitosano (Izquierdo, 2014).
Figura 1 Estructura química de la quitina (Izquierdo, 2014)
1.6. QUITOSANO
El quitosano también se lo denomina quitosana o quitosan, es un polímero
lineal formado predominantemente por unidades de glucosamina, que se forma de la
des acetilación de la N-acetil glucosamina (Ver figura 2), la unidad que forma a la
quitina (Lizardi, 2015).
Se disuelve fácilmente en soluciones diluidas de la mayoría de los ácidos
orgánicos tales como: ácido fórmico, acético, cítrico y tartárico; y también en ácidos
minerales diluidos a excepción del ácido sulfúrico. Su grado de des acetilación (DD)
varía desde un 60% hasta un 90% y los pesos moleculares (MW), se reportan de 50
21
hasta 2000 KDa, atribuyéndose esta heterogeneidad a la falta de control durante el
procesamiento (Mármol, et al., 2012).
Figura 2 Estructura química del quitosano (Izquierdo, 2014)
1.6.1. OBTENCION DE QUITOSANO
Figura 3 Diagrama de la obtención del quitosano (Izquierdo, 2014)
La producción de quitosano a partir de quitina requiere de condiciones severas
para que se dé la reacción de des acetilación (Ver figura 3). Normalmente se utilizan
soluciones alcalinas concentradas a altas temperaturas (alrededor de los 100°C). Se
sabe que esta reacción se da en la naturaleza y varios organismos, principalmente
hongos, tienen enzimas desacetilasas; sin embargo, su uso en condiciones de
laboratorio ha resultado ineficiente, lo que ha impedido el desarrollo de métodos para
la producción enzimática de quitosano. (Lizardi, 2015)
22
1.6.2. USOS DEL QUITOSANO
Alimentos.
El quitosano se utiliza en la creación de empaques y recubrimientos comestibles
con características antibacterianas que ayudan a prolongar la vida útil de anaquel de
productos hortofrutícolas y carnes. Se emplea también en la industria del vino, jugos y
bebidas como clarificante. En el área nutricional tiene un notable uso nutracéutico
como fibra no digerible en formulaciones recomendadas para reducción de peso.
(Lizardi, 2015)
Agrícola.
Se lo utiliza en el control de enfermedades y plagas. El quitosano puede actuar
sobre organismos patógenos, o incitar mecanismos defensivos en la planta contra
diferentes ataques que pueda sufrir antes y después de la cosecha. Su acción está
vinculado a su estructura química (Mármol, et al., 2012).
Lizardi (2015) concluyo en su estudio “ Que tanto quitina como quitosano son
considerados fitoestimulantes y son empleados en formulaciones contra diversas
plagas, fertilizantes y como recubrimiento de semillas para favorecer su germinación.“
Textiles.
Se usa quitosano como agente antibiótico y a condicionante en fibras y textiles.
(Lizardi, 2015)
Medicina y farmacología.
23
En los recientes años el uso de quitosano se ha empleado en la producción de
suturas quirúrgicas y apósitos. En la farmacología se hacen distintos productos a base
de quitosano, los cuales se emplean como vehículos para la entrega de fármacos
(Lizardi, 2015).
Procesos químicos, bioquímicos y de ingeniería ambiental.
Las diferentes propiedades de la quitina y el quitosano se utilizan para nuevos
procesos de adsorción y eliminación de pigmentos, metales, compuestos de interés o
contaminantes. Una gran cantidad de quitosano se utiliza en el tratamiento de aguas,
como un agente coagulante, y en la remediación de terrenos contaminados. Se utiliza
en la microbiología como parte de estructuras de soporte para la inmovilización de
microorganismos y enzimas. (Lizardi, 2015)
Otros usos potenciales
Actualmente existe un esfuerzo de investigación considerable tanto en las áreas
ya mencionadas como en otras muy diversas. Como ejemplo se puede mencionar la
investigación para la obtención de materiales compuestos con distintas funciones
(biodegradabilidad, respuesta a cambios ambientales, auto-reparación,
biocompatibilidad, etc.). (Lizardi, 2015)
1.7. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS
El proceso de extracción de compuestos fenólicos en diferentes plantas y
frutas está influenciado por su naturaleza química, por el método empleado y la
presencia de substancias interferentes. (Contini et al., 2008)
24
Estableciendo que el rendimiento en la extracción de los compuestos fenólicos
y su actividad antioxidante no sólo dependen de la naturaleza del disolvente y del
método de extracción, sino también de los compuestos bioactivos y de la estructura de
la matriz del producto, dado que los extractos de polifenoles presentes en las plantas
son una mezcla de diferentes clases de polifenoles, solubles en el sistema de solvente
empleado (Zapata, Cortes, & Rojano, 2013).
Las mezclas de disolventes más utilizados en el proceso de extracción de
polifenoles son acuosas con un solvente polar como lo son etanol, metanol y acetona
(Moure et al., 2001). Suhaj (2006) expuso que “las soluciones de metanol y agua son
eficientes para compuestos polifenolicos de matrices fibrosas, como las frutas, debido
a su grado de polaridad, en cambio las mezclas de acetona con agua son útiles para
la obtención de poli fenoles en matrices proteicas.”
1.7.1. MACERACIÓN
Voight y Bosrschein (1982) indicaron que la maceración es el método de extracción
más simple. Es un proceso que se emplea para extraer activos de un sólido hacia un
líquido. El producto sólido contiene ciertos compuestos que poseen solubilidad con el
líquido que se utiliza como solvente y el propósito es de extraer eso compuestos
químicos de interés. El conjunto de droga a extraer se lo debe proteger de la luz y se
agita constantemente todos los días; el tiempo que dura la maceración es diverso, las
distintas Farmacopeas tienen un rango que oscila entre siete y diez días. Este proceso
se lo realiza a temperatura ambiente. (Capasso, 2011).
Los solventes más frecuentemente empleados son el agua y al alcohol o
combinaciones de ambos, aunque se pueden utilizar vinos tintos o blancos. La
maceración en agua tiene el inconveniente de ser contaminado por hongos
25
velozmente, esto por el contrario no sucede en las soluciones de alcohol o
hidroalcohólicas (Capasso, 2011).
1.7.2. DIGESTIÓN
Según Shelles (1992) “Es una extracción que se realiza a una temperatura
suave durante el proceso, que oscila alrededor de los 50 o 60 °C”. La digestión es una
forma de maceración pero se somete a un leve calentamiento durante el proceso de
extracción. Es importante que la esta temperatura que se aplica no altere
los principios activos del material vegetal y así lograr una mayor eficiencia en la
utilización del menstruo (Mora, 2017).
1.8. FENOLESLos fenoles han sido considerados durante años compuestos de gran interés
en el área de desarrollo por sus múltiples aplicaciones en diversas industrias. Se han
empleado en producción de tintes, papel, cosméticos, aditivos alimenticios, etc.
(Bravo, 1998).
Químicamente, los compuestos fenólicos son sustancias que poseen un anillo
aromático, con uno o más grupos hidroxilos(Agudelo, et al, 2013). Los nutriólogos,
epidemiólogos así como la industria alimenticia, han mostrado un gran interés en los
polifenoles por ser los antioxidantes más abundantes en la dieta. Según Garcia et, al.
(2011) “la ingesta media está estimada en alrededor de 1g, lo cual supone 10 veces
más que la ingesta de vitamina C, 100 veces más que vitamina E”.
Los compuestos fenólicos son el grupo más extenso de sustancias no
energéticas presentes en los alimentos de origen vegetal. Muchos investigadores han
26
señalado que los polifenoles presentes en plantas son antioxidantes eficientes, con
una actividad antioxidante más potente que las vitaminas (Rodríguez, et al, 2012).
Según Gimeno, (2004) “la cebolla, el té, el vino tinto, el cacao son alimentos
ricos en fenoles. Estas sustancias influyen en la calidad, aceptabilidad y estabilidad de
los alimentos, ya que actúan como colorantes, antioxidantes y proporcionan sabor”.
Los compuestos polifenolicos tienen propiedades captadoras de radicales libres,
(Barberán , 2013) . Son unos potentes secuestradores de especies reactivas de
oxígeno y son capaces de inhibir a enzimas productoras de radicales libres (Doreteo,
Díaz, Terry, & Rojas, 2013).
Diferentes investigaciones han avalado los diversos efectos beneficiosos de la
ingesta de fenoles y polifenoles sobre la salud, en particular sobre el sistema
cardiovascular (Mercado et al, 2013). La concentración plasmática de polifenoles es
muy variable, dependiendo principalmente de la estructura química y de la fuente de
origen, por lo que la ingesta de forma continua durante suficiente tiempo para mantener
la concentración plasmática elevada (Quiñones, Miguel, & Aleixandre, 2012).
1.9. MICROORGANISMOS INDICADORES DE CALIDAD SANITARIA
Los microorganismos son seres vivos no visibles al ojo humano, están
presentes en todas partes, en el piso, aire, agua, en los alimentos y en toda actividad
corporal. De este modo se llama microorganismo a las bacterias, hongos y levaduras
(Andino y Castillo, 2010).
Los microorganismos de interés sanitario se separan en dos grandes grupos
según la función que ejercen sobre el alimento. Los microorganismos benéficos son
27
aquellos que favorecen al desarrollo de un nuevo producto alimenticio el ejemplo más
claro es el yogurt, y los dañinos aquellos que son capaces de modificar químicamente
y físicamente al alimento hasta volverlo no apto para el consumo humano (Doyle y
Meachat, 2015).
1.9.1. AEROBIOS MESÓFILOS
La palabra mesófilos significa que son afines a temperatura media (30-37°C)
y la palabra aerobios que son dependientes de oxígeno. En efecto, éste grupo de
microorganimos están incluidos los capaces de desarrollarse en presencia de oxígeno
a una temperatura comprendida entre los 20°C y 45°C con una óptima entre 30°C y
40°C (Pascual, 1992; Passalacqua, et al., 2014).
Además el análisis de aerobios mesófilos, en condiciones ya establecidas, es
uno de los indicadores de calidad más utilizados. Es un método que estima la
microbiota total de un alimento natural o procesado sin especificar tipos de
microorganismos. El recuento de aerobios mesófilos manifiesta la calidad sanitaria de
un alimento, las condiciones que fue manipulado y las condiciones higiénicas de las
materias primas. (Cconchoy, et al., 2013).
Un recuento alto o bajo de aerobios mesófilos no asegura la ausencia o
presencia de microorganismos patógenos y sus toxinas. El análisis de éstas bacterias
se aplica a todos los alimentos con excepcion a los productos fermentados o
madurados tales como en quesos, ciertos embutidos, yogurt, etc. (Passalacqua, et al.,
2014).
En resumen, la utilidad de las bacterias mesofílicas aerobias en la
microbiología de alimentos tienen los siguientes objetivos:
28
Ser un indicador de la posible presencia de microorganismos patógenos.
Ser un indicador del valor comercial de un alimento.
Ser un indicador de las condiciones higiénicas en las que ha sido manejado un
alimento.
Ser un indicador de la idoneidad de un ingrediente cuando va a ser incorporado
a un alimento.
Para seguir la eficiencia de un proceso de saneamiento o preservación.
Para predecir la vida de anaquel de un alimento, ya que generalmente existe
una relación directa entre el grado de descomposición y el contenido microbiano
(Passalacqua, et al., 2014).
1.9.2. COLIFORMES TOTALES Y FECALES
Son bacilos Gram negativos no esporulados, aerobios o anaerobios
facultativos que fermentan la lactosa con producción de gas dentro de la 48 h de
incubación a 35 ± 2 °C. (Camacho, et al., 2009)
Los coliformes útiles como microorganismos indicadores de sanidad de
alimentos y agua. Entre los coliformes más importantes se encuentra la E.coli,
Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. Los coliformes se clasifican en Totales y
Fecales. Entre las caracteristicas principales son poseer morfología bacilar, pueden
ser aerobias o anaerobias facultativas, son no formadoras de endosporas, son Gram
Negativas y fermentan la lactosa produciendo ácido y gas en 24-38 hrs. a 36 °C
(Castro, 2009).
Los coliformes fecales poseen las mismas caracteristicas de los totales a
diferencia que ellos crecen con lactosa y la fermentan a 44.5 °C ± 2 °C produciendo
ácido y gas en las primeras 48 hrs. de incubación, son termotolerantes. En este grupo
29
se incluyen a cepas de los géneros Klebsiella y Escherichia siendo esta última el más
útil indicador de calidad de alimentos (Carrillo, 2008)
Un positivo de E.coli como resultado en un análisis es mucho más grave que
las bacterias coliformes por sí solos, ya que indica que los productos están en contacto
con los desechos humanos o animales. (Camacho, et al., 2009)
1.10. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
La actividad antimicrobiana es la habilidad o capacidad de un producto o
sustancia de inhibir a un patógeno o microorganismo determinado. (Lizardi, 2015). La
actividad o potencia de un antibiótico puede ser demostrada mediante el efecto
inhibitorio frente a un microorganismo específico. En los análisis de potencia se
compara cuantitativamente el efecto de una muestra sobre un sistema biológico con el
efecto producido de un estándar del cual ya se ha determinado exactamente su
actividad. El resultado que se obtiene es un valor de potencia relativo al del estándar
de referencia. Si se prueban las muestras en diferentes concentraciones se puede
determinar una concentración inhibitoria mínima del antibiótico hacia ese
microorganismo (Silva, 2009).
1.11. MICRORGANISMOS PATÓGENOS DE INTERÉS
1.11.1. Staphylococcus aureus
El médico Alexander Ogston en 1880 descubrió la bacteria Staphylococcus
auerus, y desde entonces es considerada un patógeno con un gran potencial para
causar múltiples infeciones tanto en el ser humano como en animales. S.aureus es la
más virulenta en la especie, dando casos confirmados de infección de la piel y tejidos
blandos hasta infecciones graves que amenazan con la vida (Cervantes, et al., 2014).
30
Figura 4 Fotografía microscópica de Staphylococus aureus (Jiménez, 2016)
El género Staphylococcus está formado por cocos Gram positivos, con un
diámetro de 0.5 a 1.5 μm, agrupados como células únicas, en pares, tétradas, cadenas
cortas o formando racimos de uvas. Son bacterias anaerobias productoras de
enterotoxinas termoestables ampliamente distribuidas en el medio ambiente y
presentes en las mucosas de los animales y personas, transmitiéndose al ser humano
a través de alimentos contaminados, generando una toxiinfección
alimentaria.(Cervantes, et al, 2014)
1.11.2. Enterococcus faecalis
La especie enterocóccica pertenecía al género Streptococcus hasta el año de
1984. Schleifer y Klipper-Balz demostraron la hibridación genética de ADN y ARN de
éstas especies. Por ello, se clasificaron a las enterocóccicas en un nuevo género
denominado enterococcus. Las primeras bacterias de éste género fueron E. faecalis y
E. faecium. (Prats et al., 2013).
Enterococcus faecalis poseen formas esféricas u ovoides y su tamaño oscila
entre 0,6 – 2,0 um. Son cocos Gram positivos, no forman endosporas. La mayoría de
tiempo se presentan en forma de pares o cadenas cortas, no presentan movilidad.
31
Tienen la capacidad de fermentar la lactosa y un amplio rango de carbohidratos, son
catalasa negativa (Díaz, Rodríguez y Zhurbenko, 2010).
Figura 5 Micrografía de Enterococcus faecalis. Tinción de Gram (Microbiology in Pictures,
2015)
Los enterococos se han encontrado en casi todos los animales de sangre
caliente. En el ser humano son flora normal del tracto gastrointestinal, tracto
genitourinario, vías respiratorias superiores, cavidad oral, piel, vagina y uretra
femenina. En el humano, la concentración de éste microorganismo en las heces es de
108 UFC/g (Prats et al, 2013). Enterococcus faecalis también está relacionado
directamente con patologías que pueden producir gastroenteritis, enfermedades
respiratorias, conjuntivitis y dermatitis, entre otras enfermedades (Díaz, Rodrígez, &
Zhurbenko, 2010).
El control de la calidad sanitaria de alimentos, sedimentos y aguas destinadas
al consumo humano, la agricultura, la industria y la recreación se lleva a cabo mediante
bacterias o grupos de ellas que actúan como indicadoras de contaminación fecal (Díaz,
Rodrígez, & Zhurbenko, 2010). Como ya se mencionó, el hábitat normal de
Enterococcus faecalis es el tracto intestinal de los animales de sangre caliente, por
ello se encuentra dentro del grupo de microorganismos indicadores de ese tipo de
32
contaminación. Debido a su amplia distribución pueden encontrarse en los alimentos,
especialmente en los de origen animal. Suelen considerarse mejores indicadores de
calidad sanitaria que los coliformes porque mueren más lentamente, debido a que son
muy resistentes a condiciones adversas como congelación, desecación y como
resultado sobreviven más que éstos(Díaz, et al., 2010). También se hallan en las
superficies del entorno ambiental, en el agua y en la vegetación. Esto se debe a la
contaminación por heces de animales y en aguas no tratadas (Prats et al, 2013).
1.11.3. Escherichia coli
Carbet (2016) afirma que “La bacteria Escherichia coli fue inicialmente aislada
y descrita por el pediatra alemán Escherich en 1885, quien demostró su existencia
como huésped habitual del intestino. La denominó Bacterium coli commune, que
puede traducirse como bacteria común del colón”.
Es un bacilo con forma de bastón que mide aproximadamente 2 µm de largo y
0,5 µm de diámetro. Es una bacteria anaerobia facultativa, generalmente móvil gracias
a la presencia de flagelos peritricos, no formadora de espora aquello que es una
característica de la familia Enterobacteriaceae (Alvares, 2014). Cuando la bacteria es
sometida a tinción de Gram se tiñe de rojo (Gram- negativa). Es capaz de fermentar la
glucosa y la lactosa, son catalasas positivas, oxidasas negativas (Molina y Eslava,
2015).
E. coli es una bacteria mesófila. Su óptimo desarrollo se encuentra en el
entorno de la temperatura corporal de los animales de sangre caliente (35-43 ºC). La
temperatura límite de crecimiento se sitúa alrededor de 7 ºC, lo que indica que un
control eficaz de la cadena de frío en las industrias alimentarias es esencial para evitar
el crecimiento de E. coli en los alimentos. (Canet, 2016)
33
E. coli junto con otras bacterias son partícipes en el buen funcionamiento del
proceso digestivo, además de ser responsable de producir vitaminas B y K. Molina &
Eslava (2015) menciona que en 1944, Kauffman propuso un esquema para la
clasificación de E. coli utilizando sueros de conejos inmunizados con las variedades
de los antígenos O (somático), H (flagelar) y K (capsular)”
Figura 6 : Micrografía electrónica de escaneo coloreada de Escherichia coli, cultivada encultivo y adherida a un cubreobjetos (National Institute of Allergy and Infectious Diseases,
2012).
El antígeno O es un polisacárido termoestable, que forma parte del
lipopolisacárido (LPS) presente en la membrana externa de la bacteria. El antígeno K
corresponde al polisacárido capsular que envuelve a la bacteria. Actualmente se
conocen un total de 185 antígenos somáticos, 56 flagelares y 60 capsulares. La
combinación específica de los antígenos O y H define el serotipo de una bacteria, en
tanto que la identificación del antígeno somático hace referencia al serogrupo de la
cepa de E. coli. (Molina y Eslava, 2015).
1.11.4. Pseudomonas aeruginosa
Gessard en 1882 fue la primera persona en aislar la Pseudomonas aeruginosa
en un cultivo puro de heridas cutáneas. (Montero, 2012). Es un bacilo Gram negativo,
aerobio y patógeno oportunista. Es considerado una bacteria altamente versátil, capaz
34
de sobrevivir con bajos niveles de nutrientes y crecer en rangos de temperatura que
oscilan entre 4 a 42°C. (Ochoa et al., 2013).
Es muy común encontrar Pseudomonas aeruginosa en el suelo y fuentes
hídricas como lagos y ríos en concentraciones desde 10/100 ml hasta > 1 000/100 ml.
Es capaz de sobrevivir en agua destilada y agua desionizada, hay presencia tanto en
ambientes oligotróficos con un alto número de nutrientes, como aguas residuales
(Pascaul, 1992).
Las diferentes cepas de esta especie presentan un color verde brillante, aunque
se han observado muchas cepas que desarrollan pigmentos fluorescentes (Figura 7)
como la (pioverdina) pigmento amarillo verdoso o la piocianina (pigmento azul
hidrosoluble) y con menos frecuencia producen porrubina (pigmento rojo) o
pomelanina (marrón negruzco) (Luján, 2006)
Figura 7 Colonias de aislamientos hospitalarios de P. aeruginosa. Se aprecian los diferentespigmentos producidos sobre agar Mueller Hinton, luego de 48 h de incubación a 28 °C. (Merino
L. , 2007)
P. aeruginosa produce una amplia variedad de factores de virulencia, por lo
tanto, la patogénesis de ésta bacteria puede ser descripta como multifactorial. Algunos
de estos factores son: el flagelo, fimbrias (Pili), matriz exopolisacárida, toxinas,
exoenzimas y biopelículas. Algunos bastante estudiados son el alginato (producido por
35
un subgrupo de cepas), polímero de polisacáridos, que facilita la adherencia a la
superficie epitelial pulmonar, es una barrera para los fagocitos, para los antibióticos,
inhibe a los anticuerpos y atenúa la respuesta del hospedero. (Delgado y Morales,
2015)
36
CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS
2.1.MATERIAL VEGETAL
El material vegetal (MV) utilizado consistió en hojas de mango de la variedad
Tommy Atkins, proporcionadas por una hacienda productora de ésta fruta, ubicada en
el Cantón Milagro de la provincia del Guayas.
2.1.1. Recolección
El material vegetal fue recolectado de plantas adultas en perfecto estado, es
decir, libres de plagas, insectos o de algún material extraño; con ayuda de un cuchillo
de acero inoxidable.
2.1.2. Preparación de la materia vegetal
Se eliminó la tierra adherida a las hojas con ayuda de un lavatubo limpio y con
abundante agua potable. Para el secado, las hojas se pusieron en bandejas de
aluminio que se colocaron en una estufa marca Biobase modelo BOV-V151F a una
temperatura de 40°C por 48 horas con la finalidad de eliminar el contenido de agua.
Al terminar el secado, las hojas fueron trituradas en un molino pulverizador marca IKA
modelo MF 10 tasc. El material vegetal molido fue colocado en recipientes de vidrio
estériles debidamente rotulados. Se determinó la humedad del MV molido utilizando
una balanza infrarroja marca Ohaus (los análisis se realizaron por triplicado). El
porcentaje de humedad aceptada es menor al 12%. Esto es para evitar la proliferación
de hongos o la alteración de los componentes químicos del tejido vegetal, las muestras
finalmente fueron colocadas en recipientes de vidrio, adecuadamente sellados y
protegidos de la acción de la luz para su posterior uso.
37
2.2.OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS
2.2.1. Maceración
Se pesó en una balanza de precisión marca Ohaus 10 g de MV seco y triturado
fueron pesados en una balanza marca Ohaus, y seguidamente colocados en un vaso
de precipitación de 250 ml; la muestra fue humectada con 15 ml de una solución
hidroalcohólica al 90% (previamente preparada) con agitación por 5 minutos. El
procedimiento fue repetido hasta obtener 100 ml del extracto de muestra.
Posteriormente, el vaso de precipitación fue tapado y envuelto completamente con
papel aluminio, rotulado y almacenado en oscuridad durante 7 días, realizando una
agitación leve cada día. Al cumplirse el tiempo establecido se procedió a filtrar el
extracto, el cuál fue envasado en un recipiente de vidrio estéril, y consecuentemente
rotulado y cubierto con papel aluminio hasta su uso.
2.2.2. Digestión
Para realizar la extracción por digestión se procedió a pesar, en una balanza
de precisión, 10 g de MV triturado, el cuál fue colocado en un matraz de fondo plano
de 500 ml, y humedecido con 15 ml de una solución hidroalcohólica al 50%
(previamente preparada) con agitación por 5 minutos. El procedimiento fue repetido
hasta obtener 100 ml del extracto de muestra. Inmediatamente, el matraz conteniendo
el extracto fue conectado a un refrigerante y se procedió a calentar a un rango de
temperatura entre 35°C a 50°C por 2 horas. Después, el extracto fue filtrado y colocado
en un recipiente de vidrio estéril, el cual fue rotulado y cubierto de papel aluminio hasta
su uso.
38
2.3.ELABORACIÓN DEL RECUBRIMIENTO COMESTIBLE
2.3.1. Elaboración de la solución de quitosano
En una balanza limpia se pesaron 4 g de lactato de quitosano que fueron
trasladados a un matraz de 100 ml, donde se adicionaron 96 ml de agua y con la ayuda
de un agitador magnético Corning PC-353 STIRRER se lo dejo agitando hasta que la
solución no mostrara presencia de grumos, para obtener una solución de lactato de
quitosano 4%.
2.3.2. Elaboración de los recubrimientos comestibles
De acuerdo con el diseño experimental, se plantearon y desarrollaron seis
recubrimientos preparados al 15%, 20% y 25% de los extractos obtenidos por
maceración y digestión. En todos los recubrimientos la concentración de quitosano fue
de 2%, utilizando como disolvente una solución hidroalcohólica al 50%. Los volúmenes
de los extractos y de la solución de quitosano empleados para la elaboración de los
recubrimientos se detallan en la tabla V.
Tabla V Volúmenes para la elaboración de los recubrimientos comestibles ycontrol
15% 20% 25% CONTROLI
CONTROLII
Sol. Quitosano (4%) 50 ml 50 ml 50 ml - 50 ml
VOLUMEN DE EXTRACTO(50 y 90%)
15 ml 20 ml 25 ml - -
Sol. Hidroalcohólica
(50%)35 ml 30 ml 25 ml 100 ml 50 ml
Volumen final 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml
Fuente propia
39
2.4.EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANAEste proceso se realizó en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de
Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil
2.4.1. Microorganismos
Para realizar la evaluación o determinación de la actividad antimicrobiana se
utilizaron cepas de Pseudomona aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus
(ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) y Enterococcus faecalis (ATCC 29212)
las cuales fueron proporcionadas por un Laboratorio de Servicios. Las cepas fueron
mantenidas en caldo infusión cerebro corazón (ICC).
2.4.2. Preparación de las suspensiones microbianas.
Para la preparación de las suspensiones microbianas, los tubos de caldo
infusión cerebro corazón conteniendo las cepas fueron incubados por 24 horas a 37°C
en la incubadora marca Mehmet. Después de 24 horas de incubación, se preparó una
suspensión de cada cepa, las cuales fueron ajustadas a 0,5 en la escala Mc. Garland,
equivalente a 1.5 x 108 UFC/ml.
2.4.3. Técnica de Kirby Bauer modificado.
Para determinar la actividad antimicrobiana de los recubrimientos frente a los
microorganismos propuestos se empleó la técnica de Kirby Bauer modificado. La
suspensión ajustada a 0,5 en la escala de Mc Farland se sembró en el agar Mueller
Hinton, después de 15 minutos se procedió a perforar pozos de 5 mm de diámetro.
Utilizando una pipeta automática Labnet se colocaron 100 μL de cada uno de los
recubrimientos en los pozos. Las cajas Petri preparadas fueron incubadas a 37°C
durante 24 horas. Luego de este período se realizó la lectura de los halos de inhibición
(mm). Todos los ensayos de actividad antimicrobiana se realizaron por triplicado. Se
40
utilizó solución de alcohol al 50% como primer control, y como segundo control una
solución de quitosano al 2%.
2.5.PREPARACIÓN DE LAS ZANAHORIAS MÍNIMAMENTE PROCESADASCON LOS RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES
Las zanahorias fueron adquiridas en un mercado popular de la ciudad de
Guayaquil. Las zanahorias fueron desinfectadas y lavadas con una solución de
hipoclorito de sodio al 0.1%. Posteriormente fueron enjuagadas con abundante agua
purificada esterilizada y después proceder al corte de los bastones.
La piel de la zanahoria fue retirada con ayuda de un cuchillo de acero
inoxidable esterilizado para eliminar cualquier posible contaminación. Posteriormente,
con la misma herramienta las zanahorias fueron cortadas en forma de bastones
(Culinary Institute of America, 2011); esto considerando que dicha forma del producto
final elaborado sería más apetecible por los consumidores. Las dimensiones del corte
fueron aproximadamente de 5 cm de largo y 1 cm de ancho, con un peso entre 7.5 - 9
g. Todo éste proceso se realizó asépticamente y en las mismas condiciones para todos
los bastones.
Los recubrimientos comestibles fueron aplicados sobre los bastones por
aspersión con ayuda de un atomizador, colocando previamente sobre una rejilla para
evitar que se acumule un exceso del recubrimiento sobre el producto. Las muestras
de zanahoria así tratadas se las dejó secar a temperatura ambiente durante un período
de 3 minutos. Este procedimiento se lo realizó en dos caras de los bastones, cubriendo
en cada caso los laterales de la muestra. Una vez realizados los tratamientos se
procedió a preparar las muestras tanto para la evaluación sensorial como para la
evaluación de la calidad sanitaria (análisis microbiológico de aerobios mesófilos y
coliformes).
41
2.6.EVALUACIÓN O ANÁLISIS SENSORIAL
Se realizó el análisis sensorial para poder determinar la aceptabilidad y control
de calidad de los bastones de zanahorias tratadas. Para la evaluación sensorial se
seleccionaron 12 bastones de zanahorias ya recubiertas y se colocaron en bandejas
de poliestireno espumado (tipo 2P) blancas. Cada bandeja fue rotulada indicándose la
fecha de elaboración, y el código del recubrimiento comestible aplicado. Los
tratamientos para la evaluación sensorial se realizaron por duplicado; los códigos se
indican en la tabla VI. El grupo control se llevó a cabo seleccionando bastones de
zanahoria sin tratamiento, únicamente sometidas a un proceso de lavado; estos
controles se realizaron por duplicado. Adicionalmente, en la etiqueta del producto se
registró también, el día en que se realizaría la evaluación sensorial y el análisis
microbiológico; esto es Día 0, Día 3, Día 6, Día 9 y Día 12.
Tabla VI Recubrimientos usados como tratamiento en los bastones dezanahorias
EXTRACCIÓN DIGESTIÓN
Concentraciones 15% 20% 25% 15% 20% 25%
Réplicas151M 201M 251M 151D 201D 251D
152M 202M 252M 152D 202D 251D
Fuente propia
Una vez colocados los bastones de zanahoria en las bandejas, las mismas
fueron cubiertas totalmente con plástico de PVC. Luego se las almacenó en
refrigeración a 3±1 °C (excepto las del Día 0 ya que la evaluación sensorial se realizó
el mismo día del tratamiento). Por consiguiente, se necesitaron 14 bandejas por día:
12 bandejas tratadas (6 recubrimientos por duplicado) y 2 bandejas como grupo
control, dando un total de 70 bandejas.
42
Con un grupo de jueces previamente entrenados, se evaluaron sensorialmente
todos los bastones de zanahorias en una prueba de escalas de categorías. Los
atributos determinados fueron: aspecto, color, olor, fracturabilidad, sabor, textura al
masticar y masticabilidad. El formato se presenta en el Anexo D. A los jueces se les
entrego una hoja con la cata y un bastón de zanahoria por cada recubrimiento, entre
cada evaluación se les proporcionaba agua para neutralizar los sabores y evitar que
el tratamiento anterior influyera de alguna manera en el tratamiento posterior
.
2.7.EVALUACIÓN DE LA CALIDAD SANITARIA
Los grupos de microorganismos que se utilizaron para el análisis de estabilidad
microbiológica fueron E. coli, Coliformes totales y Aerobios mesófilos también
conocidos como indicadores de calidad sanitaria. El análisis de estabilidad empezó el
día del tratamiento a los bastones (Día 0), luego se realizó el análisis microbiológico
cada 3 días hasta llegar al día 12.
Para la evaluación de la calidad sanitaria se seleccionaron 4 bastones tratados
y se colocaron en bandejas de poliestireno espumado (tipo 3D) blancas. Cada bandeja
fue rotulada con la fecha de elaboración y el código del recubrimiento comestible
aplicado. Para los controles se usaron zanahorias sin tratamiento. La determinación
se realizó por triplicado para cada recubrimiento y para el grupo control. En este caso,
también se incluyó en la etiqueta la fecha en que se realizaría el análisis
microbiológico.
Una vez colocados los bastones de zanahoria en las bandejas
correspondientes fueron cubiertas completamente con plástico de PVC. Luego se las
almacenó en refrigeración a 3±1 °C (excepto las del Día 0 ya que el análisis
microbiológico se realizó el mismo día del tratamiento).
43
2.8.RECUENTO TOTAL DE AEROBIOS MESÓFILOS Y RECUENTO DE E.COLI/COLIFORMES
Los grupos de microorganismos analizados fueron E. coli, Coliformes totales y
Aerobios mesófilos usados como indicadores de calidad sanitaria. El análisis se realizó
cada 3 días durante el tiempo de almacenamiento de 12 días. Para ésta determinación
se necesitaron 21 bandejas por día: 18 bandejas (6 formulación por triplicado) y 3
bandejas (grupo control).
Se utilizaron Placas Petrifilm™ para recuento Total de Aerobios y para el
recuento de E.coli/Coliformes. El área de trabajo fue desinfectada antes de realizar las
determinaciones y se mantuvo el área estéril utilizando un mechero de Bunsen. En
una funda ziploc se pesaron 10 g de la muestra y se agregaron 90 ml de agua de
peptona para obtener una dilución 1:10, luego se agitó la dilución en un vortex por 1
minuto. Se sembraron 1000 μL de la dilución con pipeta automática Labnet
colocándolos en el centro de la película inferior de las placas Petrifilm para aerobios
mesófilos y E. coli/coliformes. Una vez realizadas las siembras, se esperó un minuto
para que el gel de las placas solidificara. Posteriormente se incubaron las placas E.
coli/coliformes por 24 h ± 2 h a 35 °C ± 1 °C y para aerobios mesófilos se incubaron
las placas por 48 h ± 2 h a 35 °C ± 1 °C. Se contaron las colonias de las placas en un
contador de colonias estándar marca Reichert Quebec Darkfield.
2.9.MÉTODOS DE ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El estudio estadístico se realizó mediante el análisis de varianza (ANOVA) con
ayuda del programa IBM SPSS Statistics, versión 22, con un nivel de confianza del
95%.
44
El rango de aceptación para análisis sensorial se determinó con los jueces.
Para el sabor, color, olor, textura y masticabilidad, un rango entre 11 a 7 se consideró
como “alta aceptabilidad”, 6 a 4 “aceptabilidad moderada” y de 3 a 0 se la considera
“rechazo del producto”. En forma contrario, para el aspecto 0 a 3 se consideró “alta
aceptabilidad”, 6 a 4 “aceptabilidad moderada” y de 7 a 11 “rechazo del producto” esto
debido que se consideró a la característica de aspecto vinculada con el tiempo. Y con
respecto a la fracturabilidad solo se considera “aceptable” el rango de 7 a 3 y los demás
valores se los considera “rechazo del producto”. El rango de aceptación de esta
característica es más amplio que el resto puesto que dicho atributo no puede ser
medido fácilmente.
45
CAPITULO III: RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1.DETERMINACIÓN DE HUMEDAD DEL MV MOLIDO
Los valores de humedad obtenidos de cada frasco que contenía MV molido se
detallan en la tabla VII. Se encuentran dentro del rango establecido y no presentan
diferencias significativas entre el contenido de MV molido de cada frasco.
Tabla VII Porcentajes de humedad del material vegetal seco y molido
N° FRASCO #1 FRASCO #2 FRASCO #3 FRASCO #4
1 7% 8.6% 8.50% 6.50%
2 7.3% 8.08% 8% 6.59%
3 6.99% 7.99% 8.39% 6.7%
PROMEDIO 7.09% 8.22% 8.29% 6.59%
Fuente propia.
3.2.ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
La Sociedad Latinoamericana de Fitomedicina en el documento “Técnicas de
comprobación de la actividad terapéutica de las plantas medicinales” indica que si el
halo es mayor a 9 mm, el resultado es positivo, si el halo está entre 6-9 mm, la actividad
se considera intermedia o moderada y si el halo es inferior a 6 mm se considera
negativo o de actividad baja. Estos valores sólo se aplican para extractos vegetales
(Guerra & Roman, 2016). Al no haber una investigación previa sobre la inhibición
bacteriana en los recubrimientos comestibles, no podemos afirmar que estos entran
en este rango ya que por poseer otros componentes además de los extractos
hidroalcohólicos, aún no se han establecidos límites sobre la actividad antimicrobiana
in vitro para recubrimientos comestibles, pero si se han realizado varias
investigaciones sobre el tema.
46
Las mediciones de los halos inhibitorios y los resultados indicaron que no
existen diferencias significativas (P≤0,05) entre los 6 recubrimientos. Sin embargo, si
hay significancia entre los controles y los recubrimientos, ya que las soluciones de
lactato de quitosano y alcohol etílico al 50% no presentaron inhibición frente a los
patógenos de estudio. Los resultados en los halos inhibitorios se describen en la tabla
VIII. Esto concuerda con lo señalado por Arabcibia, Alemán, Calvo, López, y Moreno
(2014)y Sun, Wang y Kadouh (2004) quienes demostraron en sus investigaciones que
la película de quitosano tiene un efecto menor o inclusive no tiene efecto contra
algunas cepas bacterianas evaluadas. Sin embargo, otros autores, como Dutta,
Tripahi, y Mehrotra (2009) señalan que la película de quitosano posee actividad
antibacteriana contra hongos, bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Los resultados de ésta investigación indican que el recubrimiento elaborado
con una concentración de 25% por digestión presentó halos de mayor diámetro frente
a Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis y
Escherichia coli, seguido del recubrimiento de 20% por maceración. Estos resultados
se asemejan a los obtenidos por Silva et al. (2017) donde evaluaron la actividad
antimicrobiana de microcristales de curcumina in vitro que se aplicaron como
recubrimientos sobre zanahorias mínimamente procesadas demostrando que poseían
actividad frente a E. coli, S. aureus y P. aeruginosa.
Por otro lado, Khalifaa, Barakata, y Mansysa (2016) elaboraron y evaluaron la
actividad antimicrobiana de un recubrimiento de aceite de oliva incorporado en
quitosano aplicadas a manzanas y fresas frente a varias bacterias (B. cereus, E. coli,
E. coli O16, E. coli O26, E. coli O103, E. coli O121, E. coli O157, L. monocytogenes,
S. typhi, S. Typhimurium, Staph. aureus and Yersinia Spp.), sus resultados también
mostraron que todas las fórmulas de revestimiento exhibidas tenían actividad
antibacteriana contra los patógenos analizados.
Tabla VIII: Medición de los halos de inhibición de los diferentes tratamientosfrente a los patógenos estudiados.
47
TratamientosPseudomonas Staphylococcus Escherichia Enterococcus
aeruginosa aureus Coli Faecalis
B0 mm 0 mm 2 mm 0 mm0 mm 0 mm 2 mm 0 mm0 mm 0 mm 0 mm 0 mm
Q0 mm 0 mm 0 mm 0 mm0 mm 0 mm 0 mm 0 mm0 mm 0 mm 0 mm 0 mm
15M8 mm 6 mm 8 mm 8 mm6 mm 6 mm 8 mm 4 mm8 mm 8 mm 6 mm 8 mm
20M10 mm 2 mm 8 mm 10 mm8 mm 6 mm 6 mm 10 mm8 mm 10 mm 8 mm 8 mm
25M8 mm 4 mm 6 mm 8 mm8 mm 8 mm 6 mm 6 mm6 mm 10 mm 6 mm 6 mm
15D8 mm 8 mm 6 mm 8 mm8 mm 6 mm 8 mm 8 mm6 mm 4 mm 6 mm 6 mm
20D10 mm 8 mm 10 mm 10 mm10 mm 10 mm 10 mm 8 mm10 mm 8 mm 8 mm 8 mm
25D10 mm 10 mm 10 mm 10 mm10 mm 10 mm 10 mm 10 mm10 mm 10 mm 10 mm 10 mm
Fuente propia.
3.3.EVALUACIÓN DE LA CALIDAD SANITARIA
De acuerdo a los resultados obtenidos se comprobó que el crecimiento de
aerobios mesófilos y coliformes aumentaba con los días de almacenamiento a 3°C,
debido a que los bastones de zanahoria tienen los nutrientes necesarios para el
desarrollo de las bacterias. Sin embargo, se pudo observar que los tratamientos
redujeron el desarrollo microbiológico en comparación al control, como se puede
observar en el grafico 1.
48
Los resultados obtenidos en el recuento de aerobios mesófilos mostraron que
en el día 0, el recubrimiento 25D presentó menor carga microbiana en comparación a
los otros tratamiento y control. (UFC/g). A los 3 días de almacenamiento no cambiaron
considerablemente, sin embargo en los días 6 y 9 de los niveles logarítmicos
comenzaron a cambiar entre los tratamientos y el control, presentando en estos últimos
una mayor carga microbiana. Los recubrimientos 20D y 25D resultaron tener menor
crecimiento microbiano que los demás recubrimientos en el día 6. Finalmente, a los 12
días de almacenamiento el nivel logarítmico mayor fue de 104.
Los resultados obtenidos en ésta investigación concuerdan con algunos
autores. Silva et al. (2017) realizaron un recuento de aerobios mesófilos en las
zanahorias mínimamente procesadas tratadas con microcristales de curcumina donde
el crecimiento bacteriano fue significativamente menor que en el grupo de control (p
<0,05) en todo el intervalo de tiempo durante el cual se realizó el análisis. López et al
0
1
2
3
4
5
6
D0 D3 D6 D9 D12
Aero
bios
mes
ofilo
s (Lo
g U
FC/g
)
Días de almacenamiento a 3°C
B
15M
20M
25M
15D
20D
25D
Gráfico 1: Crecimiento bacteriano de aerobios mesófilos de los recubrimientos
comestibles durante los 12 días de almacenamiento
49
(2012) investigaron el efecto de un recubrimiento comestible de quitosano en fresas
donde también se puede observar que todos los tratamientos presentaron una
reducción significativa (P≤0,05) con respecto al control durante todo el
almacenamiento.
Los resultados obtenidos en el recuento de coliformes indicaron que todos los
bastones tratados presentaban una carga microbiológica (UFC/g) menor en
comparación con el control, siendo los recubrimientos 20D y 25D los que presentaron
menor carga microbiológica. El crecimiento bacteriano al día 3 de almacenamiento no
se elevó considerablemente sin embargo el recubrimiento 25D seguía presentando
menor carga. Hasta el día 6 donde todos los recubrimientos de maceración
presentaron mayor número de colonias que el control. Caso contario a los
recubrimientos elaborados a base de extractos por digestión. A los 9 y 12 días de
almacenamiento el nivel logarítmico coincidieron tanto para el grupo control como para
los tratamientos. Estos resultados se observan en el gráfico 2.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
D0 D3 D6 D9 D12
(Log
UFC
/g)
COLIFORMES
B
15M
20M
25M
15D
20D
25D
Gráfico 2: Crecimiento bacteriano de Coliformes totales de los recubrimientos
comestibles durante los 12 días de almacenamiento
50
La desinfección se realizó minuciosamente siguiendo las buenas prácticas de
higiene. Debido a la sanitización que se les dio a las zanahorias al pelarlas y a la buena
asepsia al momento de cortar los bastones, no se evidenció E. coli en los tratamiento
y controles durante los 12 días almacenamiento.
Ecuador no tiene una norma INEN para productos mínimamente procesados
por lo que no hay límites microbiológicos para este tipo de alimentos. Pero según lo
referenciado en la Resolución Ministerial N° 615-2003-SA/DM de España los datos
obtenidos en la evaluación de la calidad sanitaria están dentro de los límites
establecidos que se exponen en la tabla IX.
TABLA IX: Frutas y hortalizas frescas semiprocesadas (lavadas, desinfectadas,peladas, cortadas y/o pre cocidas), refrigeradas y/o congeladas
BacteriasLimite por gramo
M M
Aerobios Mesófilos 104 106
Escherichia coli 10 102
3.4.EVALUACIÓN SENSORIAL
Los resultados obtenidos demostraron que la calidad general de las zanahorias
tratadas con el recubrimiento fue mejor (p<0,05) que el control en la conservación de
sus características organolépticas, destacando color, sabor y aspecto. Siendo los
51
bastones de zanahorias tratadas con recubrimientos a base de extracto hidroalcohólico
por el método de digestión la más aceptada por los evaluadores siendo el
recubrimiento 25D con el mayor rango de aceptación.
COLOR Y ASPECTO
El color y el aspecto son propiedades que no reflejan el valor nutricional o
funcional de los alimentos, pero son unos de los atributos más importantes en la
calidad del mismo, puesto que estos determinan la aceptabilidad de un producto.
Los resultados obtenidos mostraron una disminución en la aceptación de los
controles a partir del tercer día como lo muestra en el grafico 3 y 4 en comparación a
las zanahorias tratadas con recubrimiento. Esta pérdida de color se debe al proceso
de blanqueamiento que sufren las zanahorias mínimamente procesadas.
Gráfico 3: Resultados de la evaluación sensorial en el atributo color
0
2
4
6
8
10C
15M
20M
25M15D
20D
25D
DÍA 0
DÍA 3
DÍA 6
DÍA 9
DÍA 12
52
Gráfico 4: Resultados de la evaluación sensorial en el atributo aspecto
Existe un debate muy extenso sobre que podría producir la decoloración de las
zanahorias. Kato y Watada (1997) señalaron que el aumento de la tasa respiratoria y
producción de etileno se debe a los daños físicos durante el corte o troceado, lo cual
concuerda con Chervin, et al. (1992) quienes indican que las zanahorias mínimamente
procesadas tienden a tener una tasa respiratoria cuatro a cinco veces mayor que las
zanahorias enteras. El aumento de la respiración acelera el proceso natural de
blanqueamiento al aumentar los procesos bioquímicos (Huxsoll & Bolin, 1989). Otros
autores discrepan al teorizar que el motivo del blanqueamiento es la formación de
lignina en la superficie de los cortes (Bolin & Huxsoll, 1999).
La aplicación de un recubrimiento comestible a los bastones de zanahoria
produce una reducción de la respiración con respecto al grupo control, gracias a la
cualidad del quitosano en formar barreras semipermeable estas disminuyen la difusión
de gases y controlan de esta manera la respiración como indica. (Carrasco, Villaroel,
& Cevallos, 2002)
0
2
4
6
8
10C
15M
20M
25M15D
20D
25D
DÍA 0
DÍA 3
DÍA 6
DÍA 9
DÍA 12
53
Los recubrimientos a base de extracto hidroalcohólico por el método de
maceración, tienen una coloración verde intensa causada por una alta concentración
de clorofila extraída de las hojas de mango, la cual no afecta al producto en los
primeros días, pero se intensifica al sexto día (esto se observa en el gráfico 3)
provocando una tonalidad no característica que provoca cierto desinterés.
Por este motivo las zanahorias tratadas con recubrimientos de extracto
hidroalcohólico por el método de digestión tienen una mayor aceptación, puesto que
además de poseer las barreras semipermeables, también tienen una coloración idónea
para las zanahorias. Todos los recubrimientos elaborados con los extracto
hidroalcohólico de digestión no presentan gran diferencia en la evaluación del
parámetro color con relación al tiempo, siendo por tanto este método de extracción el
más recomendado tomando en consideración aspecto y color.
Un vegetal que se deshidrata tiende a arrugarse debido a que la pared celular
al no tener agua se deforma. La deshidratación puede ser minimizada con la reducción
de la respiración celular, la cual puede ser reducida por el aumento en la humedad
relativa o por la disminución de la temperatura ambiente (Barros, Goes, & Minami,
1994)
TEXTURA, MASTICABILIDAD Y FRACTURABILIDAD
Los parámetros de textura, masticabilidad y fracturabilidad de un alimento de
cuarta gama están ligados al proceso de solubilización de las pectinas el cual
contribuye al ablandamiento de los tejidos como consecuencia de la reducción de la
fuerza de cohesión entre las células. Este proceso transforma la estructura celular, la
cohesión de las células y las reacciones bioquímicas, ocurridas como consecuencia
de la pérdida de turgencia celular o de la acción de enzimas hidrolíticas de la pared
celular, produciendo un ablandamiento de los diferentes tipos de vegetales. (Chitarra
y Chitarra, 2005)
54
Los bastones de zanahoria son afectados por el tiempo de almacenamiento,
observándose pérdida de firmeza a lo largo del tiempo, independientemente del
tratamiento. Por este motivo no hubo gran variación en las notas sensoriales por parte
de los evaluadores como se observa en los Gráficos 5, 6 y 7.
Gráfico 5: Resultados de la característica fracturabilidad
Gráfico 6: Resultados de la característica textura
0
2
4
6
8
10C
15M
20M
25M15D
20D
25D
DÍA 0
DÍA 3
DÍA 6
DÍA 9
DÍA 12
0
2
4
6
8
10C
15M
20M
25M15D
20D
25D
DÍA 0
DÍA 3
DÍA 6
DÍA 9
DÍA 12
55
Grafico 7: Resultados de la característica masticabilidad
OLOR
Los bastones tratados con el recubrimiento alimenticio de maceración
presentan un olor muy fuerte al momento de tratarlos, debido a su alta concentración
de alcohol (90%). Este problema se resuelve dejando secar el recubrimiento por unos
minutos, puesto que el alcohol es muy volátil. Esto se evidencia ya que en la evolución
sensorial mostrado en el grafico 8.
0
2
4
6
8
10C
15M
20M
25M15D
20D
25D
DÍA 0
DÍA 3
DÍA 6
DÍA 9
DÍA 12
56
Grafico 8: Resultados de la característica de olor
SABOR
El sabor es un punto crítico en un producto alimenticio ya que sin importar las
demás características, si un alimento no tiene buen sabor es rechazado. Alegria, et al.
(2009) estipulan que el incremento de azucares simples y la disminución de ácidos
orgánicos en el tejido vegetal afecta la relación acido/dulce los cuales determinan el
sabor de un producto, el lixiviado por el corte puede generar pérdidas hasta del 60%
de azúcares, ácidos y demás compuestos, haciendo a los productos de cuarta gama
alimentos muy susceptibles a cambios negativos.
Los resultados mostrados en el Grafico 9, los bastones control y los bastones
tratados con el recubrimiento 15M presentaron a lo largo de los primeros nueve días
una disminución en el sabor, sin embargo los valores de las evaluaciones se
mantenían entre las categorías de dulce e insípido, ya en el día doce los evaluadores
le dieron una nota redondeada a 5 (insípido). Los recubrimientos 20M y los
recubrimientos elaborados con el extracto obtenido de digestión se mantuvieron con
notas altas al pasar los doce días de estudio.
02468
1012
C
15M
20M
25M15D
20D
25D
DÍA 0
DÍA 3
DÍA 6
DÍA 9
DÍA 12
57
En la característica del sabor los diferentes componentes que se extrajeron de
las hojas de mango pudieron alterar considerablemente el sabor característico de las
zanahorias, pero los resultados establecieron una aceptación a estos cambios con
algunas excepciones como el recubrimiento 25M el cual tuvo una nota sensorial baja
desde el día 9 (3,67) entrando al rango de amargo.
Grafico 9: Resultados de la característica sabor
02468
10C
15M
20M
25M15D
20D
25D
DÍA 0
DÍA 3
DÍA 6
DÍA 9
DÍA 12
58
CAPÍTULO IV: CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
CONCLUSIONES:
Se determinó la actividad antimicrobiana a los 6 recubrimientos comestibles
elaborados a base de extractos de hojas de Mangifera indica L. frente a Pseudomona
aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Enterococcus faecalis usando
dos grupos controles. Todos los recubrimientos presentaron cierta actividad frente a
las bacterias mencionadas pero los recubrimientos 20D y 25D presentaron una mayor
medición en sus halos. La actividad de los controles fue nula.
Se evaluó la calidad sanitaria de las zanahorias tratadas con los
recubrimientos. El crecimiento microbiano aumentaba con el tiempo de
almacenamiento, sin embargo el recubrimiento comestible que actuó mejor retardando
el crecimiento de coliformes totales fue el 25D y para aerobios mesófilos fue el
recubrimiento 25M.
Finalmente, con un grupo de jueces entrenados se evaluó sensorialmente los
bastones de zanahoria tratados con los recubrimientos comestibles elaborados con
extractos de hojas de Mangifera indica L. El recubrimiento con mayor aceptación fue
el elaborado con extracto hidroalcohólico de digestión al 25% ya que mostró un
resultado positivo para los parámetros de aspecto y color. El color del recubrimiento
propiamente dicho ayudó relativamente a enmascarar la senescencia de los bastones
de zanahorias y al tener una mayor concentración de extracto, tiene una mayor
cantidad de compuestos que actuaron en los demás parámetros evaluados.
59
Esta investigación demostró que los recubrimientos comestibles a base de
extracto hidroalcohólicos si poseen efectividad en relación al aumento de la vida útil
de zanahorias mínimamente procesada.
RECOMENDACIONES
1. Aumentar la concentración de la solución de quitosano en los recubrimientos
comestibles y realizar pruebas con diferentes clases de quitosano para evaluar
la efectividad del biopolímero.
2. Clarificación de los extractos hidroalcohólicos para evitar que influyan en el color
de los alimentos mínimamente procesados.
3. Realizar pruebas aumentando la concentración de los extractos
hidroalcohólicos.
4. Estudiar métodos para extraer de alcohol de los recubrimientos comestibles
para evitar la percepción de este solvente en los alimentos sin perder los
componentes extraídos.
60
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67
ANEXOS
Anexo A: Recolección y preparación de la muestra
Secado de lamuestra (48h/40°c)
Secado de lamuestra (48h/40°c)
Secado de lamuestra (48h/40°c)
Secado de lamuestra (48h/40°c)
Trituración demuestra (400rpm)
Trituración demuestra (400rpm)
Trituración demuestra (400rpm)
Trituración demuestra (400rpm)
Selección y recolección de hojas de mango
Selección y recolección de hojas de mango
Selección y recolección de hojas de mango
Selección y recolección de hojas de mango
Prueba de humedad de muestra triturada
Prueba de humedad de muestra triturada
68
Anexo B: Preparación de extractos y quitosano
Pesado de lamuestra
Pesado de lamuestra
Pesado de lamuestra
Pesado de lamuestra
Extracción porMaceración
(7dias)
Extracción porMaceración
(7dias)
Extracción porMaceración
(7dias)
Extracción porMaceración
(7dias)
Extracción pordigestión
Extracción pordigestión
Extracción pordigestión
Extracción pordigestión
Filtrado deMaceración
Filtrado deMaceración
Filtrado deMaceración
Filtrado deMaceración
Digestión (2horas)
Digestión (2horas)
Digestión (2horas)
Digestión (2horas)
Filtrado deDigestión
Filtrado deDigestión
Filtrado deDigestión
Filtrado deDigestión
Solución de quitosano al 4%: se colocó 4g por 100ml, y se locoloco en un agitador magnético 110 rpm durante 4 horas
Solución de quitosano al 4%: se colocó 4g por 100ml, y se locoloco en un agitador magnético 110 rpm durante 4 horas
Solución de quitosano al 4%: se colocó 4g por 100ml, y se lo
69
Anexo C: Preparación de las zanahorias
Pelado y corte de zanahorias
Pelado y corte de zanahorias
Pelado y corte de zanahorias
Pelado y corte de zanahorias
Aplicación delrecubrimiento
Aplicación delrecubrimiento
Aplicación delrecubrimiento
Aplicación delrecubrimiento
Preparación de las bandejas y almacenamiento en refrigeración (3°C)
Preparación de las bandejas y almacenamiento en refrigeración (3°C)
Preparación de las bandejas y almacenamiento en refrigeración (3°C)
Preparación de las bandejas y almacenamiento en refrigeración (3°C)
70
Anexo D: Formato para la evaluación sensorial
.
Anexo E: Evaluación sensorial
71
Tabla IX Códigos de los recubrimientos comestibles y los blancos
N
°
BLANCOS
MA
CER
AC
IÓN
90
%
CONCENTRACIONES(%P/V)
DIG
ESTI
ON
50%
CONCENTRACIONES(%P/V)
CONTROL I CONTROL II 15% 20% 25% 15% 20% 25%
1 C1 Q1 151M 201M 251M 151D 201D 251D
2 C2 Q2 152M 202M 252M 152D 202D 252D
3 C3 Q3 153M 203M 253M 153D 203D 253D
Fuente propia.
Anexo F: Análisis de la calidad sanitaria
Tratamiento de las muestras y almacenamiento de las Petrifilm
Tratamiento de las muestras y almacenamiento de las Petrifilm
72
DIA 0
DIA 3
DIA 6
DIA 9
Recuento de aerobios mesófilos
Recuento de aerobios mesófilos
Recuento de aerobios mesófilos
Recuento de aerobios mesófilos
Recuento de coliformes totales
Recuento de coliformes totales
Recuento de coliformes totales
Recuento de coliformes totalesRecuento de coliformes totales
Recuento de coliformes totales
Recuento de coliformes totales
Recuento de coliformes totales
Recuento de aerobios mesófilos
Recuento de aerobios mesófilos
Recuento de aerobios mesófilos
Recuento de aerobios mesófilosRecuento de coliformes totales
Recuento de coliformes totales
Recuento de aerobios mesófilos
Recuento de aerobios mesófilos
73
Recuento de coliformes totales
Recuento de coliformes totales
Recuento de coliformes totales
Recuento de coliformes totales
Recuento de aerobios mesófilos
Recuento de aerobios mesófilos
Recuento de aerobios mesófilos
Recuento de aerobios mesófilos
74
Tabla X Resultados de UFC/g obtenidos en el recuento de coliformes totales
EXTRACCIÓN SOLUCIONES CODIGOColiformes totales UFC/g
D0 D3 D6 D9 D12
BLANCOS
B1 1x102 3x102 3x103 20x103 23x103
B2 1x102 2x102 1x103 25x103 16x103
B3 9x102 3x102 8x102 69x102 23x103
MACERACIÓN
15%
151M 2x10 2x102 4x103 40x102 22x103
152M 1x102 5x10 2x103 18x103 12x103
153M 1x102 3x10 2x103 15x103 13x103
20%
201M 2x102 6x10 5x103 58x102 9x103
202M 8x10 9x10 5x103 78x102 7x103
203M 3x10 3x102 3x103 16x103 41x103
25%
251M 5x10 1x10 9x103 25x103 17x103
252M 2x10 1x102 5x103 27x103 9x103
253M 2x10 50x10 6x103 16x103 8x103
DIGESTION
15%
151D 2x10 6x10 1x103 13x103 17x103
152D 6x10 2x10 1x103 12x103 10x103
153D 3x10 2x102 6x102 14x103 20x103
20%
201D 3 3x10 5x10 72x102 30x103
202D 2x10 4x10 2x102 22x102 27x103
203D 2x10 13 3x102 11x103 31x103
25%
251D 12 8 5x10 3x102 12x103
252D 2 5 8x10 10x102 40x103
253D 7 9 7x10 10x103 13x103
75
Tabla XI Resultados de UFC/g obtenidos en el recuento de aerobios mesófilos
EXTRACCION SOLUCIONES CODIGOAerobios mesófilos (UFC/g)
D0 D3 D6 D9 D12
BLANCOS
B1 70x102 94x102 98x10ᶺ3 10x104 20x104
B2 95x102 6x103 68x10ᶺ3 70x104 38x104
B3 50x102 9x103 80x10ᶺ3 55x104 26x104
MACERACIÓN
15%
151M 28x102 62x102 43 x10ᶺ3 96x103 58x104
152M 12x103 40x102 38x10ᶺ3 10x104 43x104
153M 46x102 76x102 51x102 25x103 60x104
20%201M 70x102 64x102 90x102 68x103 18x104
202M 35x102 53x102 70x102 35x103 20x104
203M 30x102 56x102 73x103 50x103 68x104
25%
251M 46x102 49x10 36x103 18x104 34x104
252M 28x102 20x102 56x103 35x103 48x104
253M 15x102 30x102 70x102 11x103 32x104
DIGESTIÓN
15%
151D 34x102 89x10 89x102 16x104 46x104
152D 30x102 36x102 10x104 13x104 26x104
153D 38x102 45x10 74x103 14x104 68x104
20%
201D 58x102 24x102 26x102 13x103 52x104
202D 34x102 24x102 30x102 12x103 38x104
203D 24x102 12x102 20x102 18x103 4x104
25%
251D 5x102 16x102 74x102 11x103 24x104
252D 17x10 18x102 32x102 17x103 18x104
253D 7x102 10x102 60x102 20x10ᶺ3 32x10ᶺ4
76
Anexo G: Antibiograma
Preparación de agar Mueller Hinton
Preparación de agar Mueller Hinton
Preparación de agar Mueller Hinton
Preparación de agar Mueller Hinton
Lectura del halo de inhibicion
Lectura del halo de inhibicion
Lectura del halo de inhibicion
![PO specification 0262-MI20-80PO-9120-4-0[1]](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/54780b8d5806b501198b46f6/po-specification-0262-mi20-80po-9120-4-01.jpg)