Universidad Nacional de Rosario - Facultad de … · Inmunidad humoral: detección de anticuerpos. Técnicas: aglutinación, inmunofluorescencia indirecta, ... Detección específica

Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR - Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 1 - 2018

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Laboratorio 6:

Métodos directos (IV)

e indirectos Investigación molecular inmunológica de antígenos:

Fundamentos. Técnicas: precipitación, aglutinación,

inmunofluorescencia directa, ELISA, Western Blot,

Electroforesis, cromatografía gaseosa, citometría de flujo,

etc.

Métodos indirectos: Investigación molecular inmunológica.

Inmunidad humoral: detección de anticuerpos. Técnicas:

aglutinación, inmunofluorescencia indirecta, ELISA,

Western Blot, etc. Inmunidad celular: In vivo: reacciones de

hipersensibilidad retardada mediada por células. In vitro:

estado funcional del sistema T.

2018

Universidad Nacional de Rosario - Facultad de Ciencias Médicas

Área Injuria

Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología

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Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 6 - 2018

1

Laboratorio de habilidades Nº 6 Métodos inmunológicos: directos e indirectos Detección específica de moléculas mediantes pruebas inmunológicas

Método directo: Detección de antígeno (Ag) Método indirecto: Detección de anticuerpos (Ac)

Introducción Gran parte de los progresos alcanzados en la microbiología clínica, según hemos visto en los laboratorios de habilidades, se deben al perfeccionamiento de los métodos analíticos de medida. La introducción de los procedimientos basados en las reacciones inmunológicas (antes de la era genómica) han representado un importante avance en el análisis de moléculas de interés en biología animal y vegetal difíciles de medir empleando los métodos convencionales habituales. Dentro de los procedimientos moleculares inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac. La propiedad que tienen las inmunoglobulinas (Ig) de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser visualizada por los fenómenos de precipitación, aglutinación, marcado con moléculas fluorescentes, con radioisótopos o con enzimas, hace que estos métodos se empleen ampliamente aún hoy en la era genómica. Existen diversos métodos basados en distintos procedimientos para visualizar la presencia de Ag o Ac en muestras biológicas humanas. Estos son la justificación del presente laboratorio de habilidades. Objetivos Al finalizar el encuentro el alumno debe ser capaz de: Aproximarse a los fundamentos y aplicaciones de los principales recursos técnicos,

metodológicos y estrategias empleadas en los campos de la microbiología. Familiarizarse con las técnicas básicas moleculares inmunológicas que permiten el análisis del

estudio microbiológico. Comprender las aplicaciones de métodos y técnicas en el estudio de distintos procesos

infecciosos humanos e interpretar sus resultados. Distinguir la sensibilidad y especificidad de las diferentes técnicas empleadas.

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Mapa conceptual

Inmunidad humoral Antígeno

Proviene del griego “anti”: con propiedades contrarias y “geno”: crea oposición. Es una molécula que puede ser reconocida por el sistema inmune adaptativo desencadenando la formación de Ac. Son usualmente proteínas o polisacáridos. Esto incluye partes de bacterias (cápsula, pared celular, flagelos, fimbrias y toxinas), de virus y de otros microorganismos. Los lípidos y ácidos nucleicos son antigénicos solo cuando se combinan con proteínas y polisacáridos. También pueden funcionar como Ag moléculas del ambiente, no-microbianas, exógenos, como por ejemplo: polen, clara de huevo, proteínas de tejidos y órganos trasplantados, o proteínas en la superficie de glóbulos rojos transfundidos.

Anticuerpo En 1890, E. von Behring y S. Kitasato describieron la actividad de los Ac contra la difteria y la toxina tetánica. Propusieron la teoría de la inmunidad humoral, que establecía la existencia de un mediador en el suero sanguíneo que podría reaccionar con un Ag extraño.

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Los Ac (Ig) son glicoproteínas del tipo gamma globulina. Pueden encontrarse de forma soluble en la sangre u otros fluidos corporales. Está constituido por unidades estructurales básicas, cada una de ellas con dos grandes cadenas pesadas y dos cadenas ligeras de menor tamaño, que forman, por ejemplo, monómeros con una unidad, dímeros con dos unidades o pentámeros con cinco. Los Ac son sintetizados por los linfocitos B. Aunque la estructura general de todos ellos es muy semejante, una pequeña región del ápice de la proteína es extremadamente variable, lo cual permite la presencia de millones de Ac, cada uno con un extremo ligeramente distinto. A esta parte de la proteína se la conoce como región hipervariable. Cada una de estas variantes se puede unir solo a una “diana”, que es lo que se conoce como Ag (epitope) y reconocerla entre millones de moléculas diferentes que poseemos en nuestro organismo. La amplia cantidad de Ac y su diversidad se genera por combinaciones al azar de un juego de segmentos genéticos que codifican diferentes lugares de unión al antígeno (paratope). Posteriormente sufren mutaciones aleatorias en la zona del gen del Ac, lo cual origina una diversidad aún mayor. Los genes de los Ac también se reorganizan en un proceso conocido como conmutación de clase de Ig que cambia la base de la cadena pesada por otra, creando un isotipo de anticuerpo diferente que mantiene la región variable específica para el antígeno diana. La producción de anticuerpos es la función principal del sistema inmunitario humoral. La interacción in vitro Ag ó Ac La unión Ag-Ac es reversible y están implicados enlaces no covalentes. Como ya vimos, cada Ag está definido por su Ac, los cuales interactúan por complementariedad espacial. La zona donde el Ag se une al Ac recibe el nombre de epitope o determinante antigénico, mientras que el área correspondiente de la molécula del Ac es el paratope. Se realiza en 2 etapas: interacción primaria (no visible) e interacción secundaria (aparición de un fenómeno visible). Las segundas son más sencillas y económicas que las primeras pero para su detección es necesario mayor cantidad y calidad de Ag o Ac. Esto se relaciona directamente con la sensibilidad y la especificidad de cada prueba a realizar. La mayor limitación es la producción de Ag ó Ac específicos comerciales para la realización de las pruebas. En la actualidad se producen reactivos de alta pureza en gran escala comercial por medio de técnicas de biología molecular donde pueden modificarse las moléculas para incrementar su reactividad y/o afinidad. Se usan moléculas producidas por metodología recombinante (por ej.: el DNA recombinante es resultado del uso de diversas técnicas que los biólogos moleculares utilizan para manipular las moléculas de DNA y difiere de la recombinación genética que ocurre sin intervención externa dentro de la célula), cuyo propósito es la de poder introducir cambios (modificaciones) en la secuencia del gen que las codifica (por ejemplo cambiar un grupo químico específico) que facilitan su purificación, la hacen más antigénica o producen anticuerpos específicos para un epitope o para un paratope determinado.

Epitope Paratope

Anticuerpo

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La detección de Ag es prueba indudable de una infección activa o reciente, en una muestra biológica del sitio de infección o en muestras donde el microorganismo está ubicado en otro lugar pero se eliminan por allí. La presencia de Ac específicos (suero del paciente) es demostración que el agente infeccioso está (IgM) o estuvo (IgG) presente en ese hospedero.

Son técnicas rápidas, simples y altamente específicas. Se realizan las determinaciones tanto de Ag como de Ac con las mismas técnicas inmunológicas de laboratorio. Pueden realizarse cuando el paciente comenzó la terapia antimicrobiana o su patología la produce una toxina del microorganismo. Es decir que la técnica es la misma, lo que cambia es la muestra: si es directamente de la muestra biológica; es un ensayo directo y si la hacemos con suero del paciente el ensayo se llamará indirecto.

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Producción de Ac monoclonales comerciales

Suero del paciente: deben extraerse entre 5 y 10 ml de sangre, dejar que coagule a temperatura ambiente (20 minutos) y separar el suero por centrifugación (1000-1200 g durante 10 minutos). Una vez separado el suero, puede mantenerse a 4-6 ºC durante una semana, pero es preferible congelarlo a -20 ºC (se conserva años si se evita la descongelación y congelación repetidas). Entonces es bueno a esta altura recordar el concepto de título. Para la titulación tanto de Ag como de Ac en distintos fluidos biológicos. Es importante destacar que NO es posible determinar la concentración cuantitativa exacta de Ag ni de Ac sino que será posible calcular un título de Ag o de Ac. Para ello, se realiza la interacción de diluciones seriadas del suero del paciente con cantidades constantes de Ag o diluciones seriadas del material biológico del paciente (Ag) con cantidades constantes de Ac.

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Macrodilución

Microdilución

Se elige arbitrariamente como título a la inversa de la máxima dilución de suero (Ac) o material biológico (Ag)

que produce interacción visible.

Por ejemplo: Una muestra de líquido cefalorraquídeo la diluimos a la mitad 10 veces consecutivas, luego a cada dilución le aplicamos la técnica elegida para que reaccione con anticuerpos específicos conocidos. Observamos hasta qué dilución dio positiva la interacción Ag-Ac: Titulo de Ag XX.

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/512 1/1024 1/2048 1/4096

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Paciente 1

Dilución 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Reactiva

a:

Técnica + + + + + + + ‐ ‐ ‐ 128 dil

Concluimos que la reacción en LCR investigando la presencia de un Ag XX fue reactiva hasta 128 dil. Por lo que el agente etiológico de la patología que cursa es el que posee el Ag XX. Paciente 2:

Dilución 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024

Técnica ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ No

reactiva

El agente etiológico de la patología que cursa el paciente 2 no posee el Ag XX ensayado. Los métodos directos son reactivos o no son reactivos según la sensibilidad que tenga la técnica empleada.

En cambio en los métodos indirectos podemos trabajar con 2 muestras de suero de un mismo paciente tomadas a diferentes tiempos (día 1 y a los 15 días) para comparar mediante alguna técnica el título de Ac en ambas muestras e interpretar los resultados

Ejemplos:

Paciente 3: Seroconversión Día 1

Dilución 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Reactivo

a:

Técnica + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 2 dil

Día 15


a:

Técnica + + + + + + + ‐ ‐ ‐ 128 dil

Resultado: Infección activa del agente etiológico cuyo Ag, es específico del Ac ensayado Paciente 4

Día 1


a :

Técnica + + + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 8 dil

Día 15

Dilución ½ ¼ 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Reactivo

a :

Técnica + + + + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 16 dil

Resultado: la patología que cursa en este momento no se debe al agente etiológico, cuyo Ag XX específico no induce la formación del Ac ensayado. Tuvo la infección a ese Ag en el pasado: Ac (IgG) de memoria inmunológica.

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Paciente 5: Seroconversión

Día 1

Dilución 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024

Técnica ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ No

reactiva

Día 15

Dilución 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Reactiva

a:

Técnica + + + + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 16 dil

Resultado: Infección activa del agente etiológico cuyo Ag XX es específico del Ac ensayado

Se denomina SEROCONVERSIÓN a la aparición de Ac o al aumento del título de Ac (IgG) en 4 veces en un período entre 2 y 4 semanas.

1ra muestra 2da muestra Significado

(‐) (‐) Paciente susceptible

(+) (ej 1:8) (+) (ej 1:8; 1:16) Paciente Inmune

(+) (ej 1:4) (+) (ej 1:2) Paciente Inmune

(‐) (+) ( hasta 1/64) Infección actual

(+) ( 1:8) (+) (> 1:128) Infección actual

¿Qué necesitamos para la realización de estas técnicas? Las técnicas más utilizadas en estos momentos son:

Aglutinación Son útiles tanto para detectar Ag (aglutinación directa) como Ac (aglutinación indirecta). Se basan en que tanto sea el Ag como el Ac conocido debe estar adherido por su fragmento Fc en un medio líquido a un soporte esférico (partícula de látex, glóbulo rojo, oro coloidal, gelatina u otro material) y se debe enfrentar con una gota de la muestra biológica o del suero del paciente. Se forma una aglutinación visible macroscópicamente de partículas que nos indican la presencia de la interacción Ag-Ac. Es una técnica poco sensible por lo que se utiliza mayormente para identificación de microorganismos (Laboratorio de Habilidades Nº 3) debido a que requiere gran cantidad de microorganismos en la muestra si buscamos identificarlos después de su aislamiento en medios de cultivo. Con ello obtenemos el serotipo del microorganismo hallado o simplemente se lo identifica (género y especie). Se pueden realizar sobre un portaobjeto. Si la aglutinación es poco visible se puede colocar en un aglutinoscopio (vidrio con fuente de luz) o sobre un vidrio oscuro.

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Si el soporte es un glóbulo rojo la técnica recibe el nombre de hemoaglutinación

Inmunofluorescencia - Directa (IFD) o Indirecta (IFI) La fluorescencia es la propiedad que tiene una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a radiaciones de baja longitud de onda y alta energía (UV, RX). Las radiaciones absorbidas (invisibles al ojo) son transformadas en luz visible o sea de una luz de mayor longitud de onda que la incidente. La absorción de luz por parte de la molécula de fluorocromo (sustancias que emiten un fotón cuando son excitados por un fotón incidente) la eleva a un estado de excitación en el cual contiene mayor energía. La molécula permanece en estado de excitación por un período de tiempo muy corto. El retorno a un nivel de energía menor es acompañado por emisión de luz (fluorescencia). IFD

Se realiza en 1 solo paso. Se coloca la muestra sobre un porta objeto y se le adiciona un Ac marcado con fluoresceína. Se deja interaccionar y se enjuaga. La observación de una fluorescencia (con microscopio de fluorescencia) es reacción positiva. La ausencia de fluorescencia verde manzana es ausencia de Ag o sea reacción negativa. Ej: Los virus se pueden detectar por la producción de proteínas víricas cuando se están multiplicando en una célula mediante Ac específicos para esas proteínas marcados.

IFI Esta técnica se realiza en 2 pasos: 1- Interacción del Ag conocido con el suero del paciente (Ac?) 2- Revelado: colocar un anticuerpo específico para la Fc del Ac marcado con fluoresceína. Observación de fluorescencia verde manzana nos dice que es una reacción positiva, que en la muestra había Ac específicos para el Ag que estaba en el soporte.

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Con un solo Ac marcado puedo realizar todas las IFI porque es específico a la fracción constante de las Ig .

Ventajas: - Se pueden obtener resultados rápidos - No es necesario realizar cultivos - Se pueden identificar un microorganismo muerto o uno en un grupo mixto

Desventajas: - Costos en reactivo y equipo - Debe ser realizado por personal muy especializado. - Los resultados no son 100% específicos.

ELISA (Enzimoinmunoanálisis) Se realizan en microplacas de 96 pocillos fondo en U de plástico o un soporte de nitrocelulosa al que se le ha fijado un Ag o un Ac conocido según lo que desee estudiar. Para evitar problemas de comprensión vamos a describir esta técnica suponiendo que deseo investigar en una muestra de endocérvix la presencia de Chlamydia trachomatis (Ct) ó sea la realización de técnica de ELISA directa.

- En los pocillos o en la tira se fija el Ac específicos para Ct (comercial) se le añade una gota de la suspensión del hisopado endocervical extraído de la paciente. Si tienen Ag de Ct estos se fijarán a los Ac que están.

- Para revelar la existencia de esos Ag fijados se añade otro Ac dirigido también contra el Ag de Ct pero marcado con una enzima.

- Se le adiciona un sustrato (incoloro) sobre el que actúa la enzima - Aparece un color debido a un producto coloreado cuya intensidad puede medirse con un

colorímetro. Cuando en la muestra no existe Ag buscado (Ag Ct) no se produce color.

A lo largo de estos últimos años se ha ido optimizando esta técnica ganando sensibilidad y especificidad. Observemos por ejemplo lo que ocurrió con la detección de la infección por HIV.

ELISA 1ra. generación: No tan sensible y específico. Por ejemplo para HIV se usaban como Ag lisado de virus.

ELISA 2da. generación: Ya se usaban proteínas recombinantes y/o péptidos sintéticos. Ya se podía detectar HIV1 y HIV2.

ELISA 3ra. generación: tipo sándwich, utilizan un Ag marcado como conjugado. Gran sensibilidad.

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ELISA 4ta. generación: Detectan Ag (p24) y Ac. Acortan el período ventana. Gran sensibilidad.

Quimioluminiscencia Se utilizan moléculas que producen luz generalmente por oxidación (quimioluminiscencia) como ser: luminol, isoluminol, esteres de acridina ó adamantil dioxietano

HRP: Peroxidasa de rábano

Inmunocromatografía

La inmunocromatografía se basa en el desplazamiento de una muestra a través de una membrana de nitrocelulosa. La muestra es añadida en un extremo de la tira en la zona del conjugado, el cual está formado por un Ac específico contra el epitope o uno de los epitopes del Ag a detectar y un reactivo de detección. Si la muestra contiene el Ag problema, éste se unirá al conjugado formando un complejo inmune (Ag-Ac) y se desplazará a través de la membrana de nitrocelulosa. Sino, migrarán el conjugado y la muestra sin unirse.

La zona control está formada por un tercer Ac que reconoce al reactivo de detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el Ac se unirá al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea es un control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas. Son técnicas muy sensibles, simples y rápidas. No es necesario de reactivos adicionales ni instrumental.

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Se presenta en varios formatos pero generalmente en tira, en el cual la muestra problema fluye a lo largo de un sustrato sólido por medio de una acción capilar. Ejemplo de utilización: Detección de HIV en campañas masivas - Test de embarazo disponible a la venta en farmacias.

Western blot En las técnicas antes descriptas para las reacciones serológicas pueden haber situaciones en que resulten positivas y no nos permiten conocer contra que Ag o mezcla de Ag se ha producido esa reacción. Pueden ser muy sensibles pero también puede ocurrir que nos den falsos positivos. Es por esta razón que se hace una segunda técnica para confirmar denominada Western blot. Se basa en los siguientes pasos:

1. Se separan determinados Ag conocidos por electroforesis en gel de poliacrilamida. Este gel no es muy confiable para realizar interacción entre Ag-Ac.

2. Se transfieren los Ag separados a una membrana de nitrocelulosa. 3. Se cubre la membrana con suero del paciente (Ac????) 4. Se cubre luego con otro Ac marcado (específico para la fracción Fc del posible Ac del

paciente). 5. Revelado según la marca que tenga el 2do. Ac: enzima, fluorescencia, etc.

LIA (Line Inmunoassay) Inmunoensayo comercial en línea con proteínas y péptidos sintéticos de VIH-1 y VIH-2 impregnadas en tiras de nitrocelulosa.

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Se observan siempre bandas utilizadas como control de procedimiento y de peso molecular, ausencia de bandas en la muestra del paciente resulta no reactivo.

RIBA (Recombinant inmunoblot assay) En la actualidad los Ag se obtienen individualmente por una técnica recombinante (introduciendo un gen que codifica al Ag en una bacteria distinta, la cual producirá el Ag puro). Se coloca cada uno de los Ag que se desea estudiar en distintos puntos de la tira de nitrocelulosa y se revela como un WB.

Inmunidad Celular Pruebas cutáneas de hipersensibilidad mediadas por células

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Ag (desencadena respuesta de inmunidad celular) Pápula indurada: paciente sensibilizado Inoculación: intradérmica Mecanismo: reacción mediada por macrófagos activados por el interferón y producido por

los linfocitos T CD4. Microorganismos: micobacterias, Brucella, Histoplasma, Leishmania, Paracoccidioides, etc. Lectura 48-72 hs. (precoces de hs. No corresponde a una respuesta celular) Interpretación: mm de induración. Si se considera positiva, solo indica que ha habido

contacto previo con el agente etiológico, cercano o lejano pero no se correlaciona con enfermedad actual.

Ensayo de Interferón gamma (IGRA): reemplaza a la determinación de PPD para micobacterias, detecta la producción de interferón gamma por los linfocitos T CD4, inducida por los macrófagos que le presentan el Ag. Son más útiles en los inmunodeprimidos y en los vacunados por BCG.

Actividades Punto de partida 1) ¿Cuándo un método microbiológico es directo o indirecto? 2) ¿En qué se basan las técnicas empleadas en los métodos inmunológicos tanto directos como

indirectos? 3) ¿Qué significa un resultado no detectable? 4) ¿Qué es un título? ¿Qué nos informa? 5) ¿Qué es la seroconversión inmunológica?

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1- Un joven exconvicto de 22 años concurre a una consulta médica por decaimiento, vómitos y fiebre de hace casi 1 semana de evolución. Pensaba que se le pasaría en unos días. Ante el diagnóstico presuntivo de hepatitis viral se le solicita la realización en el laboratorio de distintos marcadores hepáticos. El laboratorio le remite el siguiente informe: Muestra: suero sanguíneo Investigación molecular inmunológica: Detección de anticuerpos Se realizaron las siguientes determinaciones por la técnica de enzimoinmuno ensayo indirecta (ELISA) con anticuerpos monoclonales específicos para cada determinación

Detección de IgM HDV: reactivo Detección de Ag HBsV: reactivo Detección de IgM HAV: no reactivo Detección de Ig G HAV: reactivo hasta 1/16 dil Detección de Ig totales HCV: no reactivo Detección de Ig G HBsV: no reactivo Detección de IgG CMV: reactivo hasta 1/256 dil Detección de Ig M Epstein Barr: no reactivo

Con estos datos Ud concluye: a) No está infectado con hepatitis B pero tiene una hepatitis por CMV b) Tiene una HBV crónica y cursa una HAV aguda c) Tiene una hepatitis C aguda y está infectado con HBV d) Esta inmune a hepatitis B e) Tiene una hepatitis D aguda y es portador del HBV f) Cursa una patología compatible con mononucleosis infecciosa y tiene una infección por CMV g) Nunca tuvo hepatitis A o no se vacunó h) El paciente no tiene hepatitis viral i) Tiene una hepatitis tóxica medicamentosa

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2- Una joven de 18 años, oriunda del Chaco, se presenta en la guardia de un hospital en Rosario. En el interrogatorio no refiere seguimiento obstétrico alguno. A pronto de su llegada, da a luz un niño de bajo peso con alteraciones psicomotoras y síntomas neurológicos a quien se le indica la realización de exámenes de laboratorio que luego de realizados, Ud. recibe el siguiente informe: Muestra: sangre entera/EDTA - Observación directa en fresco (Método de Strout)

No se observan formas vegetativas flageladas de protozoarios. - Investigación molecular genómica: Técnica de amplificación por reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) de un fragmento de ADN del kinetoplasto del Tripanosoma cruzi Resultado: No detectable

Muestra: suero sanguíneo - Investigación molecular inmunológica: Detección de anticuerpos:

VDRL (anticardiolipina -Técnica de aglutinación no treponémica) Resultado: No reactiva FTA-Abs (Absorción de ac.fluorescentes anti T. pallidum – Técnica inmunofluorescencia

indirecta IFI) Resultado: no reactivo

Toxoplasma gondii (Técnica por inmunofluorescencia indirecta) Resultados: Ig totales: reactiva hasta 1/ 512 dil IgM: reactiva hasta 1/ 256 dil

Virus Rubéola: (Técnica ELISA) Resultado: Ig M: no reactiva IgM (por captura): no reactiva

IgG: reactiva hasta 1/32 dil Muestra: cordón umbilical y líquido amniótico Examen bacteriológico - Observación directa en fresco por campo oscuro: No se observan morfología bacteriana

compatible con espirilos - Investigación molecular inmunológica: Detección de antígenos Treponema pallidum (Técnica

con anticuerpos fluorescentes-IFD) Resultado: Negativo

El niño padece una infección congénita a: - Trypanosoma cruzi ( Chagas congénito) - Virus Rubeola (Rubeola congénita) - Treponema pallidum ( Sífilis congénita) - Toxoplasma gondii (Toxoplasmosis congénita)

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Situación problemática de integración Un paciente conviviente con HIV diagnosticado desde hace 1 año no adhirió a tratamiento alguno, retorna a la consulta luego de ese período por dolor y dificultad en la deglución de alimentos y fuerte dolor en el pecho a la altura del esternón. Decaído y en mal estado general. Se le solicita la realización de distintas determinaciones que se presentan en el informe: 1) Examen micológico de biopsia esofágica

Observación microscópica directa en fresco: Se observan elementos levaduriformes Cultivo e identificación: Se obtuvo desarrollo de Candida albicans Pruebas de sensibilidad a los antifúngicos- Método de difusión con tabletas Sensible a: fluconazol – itraconazol – ketoconazol – voriconazol - caspofungina

anfotericina B 2) Parasitológico de materia fecal

Observación directa e fresco: Se observan ooquistes compatibles morfológicamente con Cystoisopora belli Coloracion de Ziehl-Neelsen modificado (previa concentración por método de flotación): Se observan ooquistes ácido-alcohol resistente Investigación de Cryptosporidium parvum (Técnica de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de un fragmento de ADN especifico del C. parvum) Resultado: detectable

3) Investigación molecular inmunológica :Detección de antígenos Ag HBsV (Método por ELISA): negativo HIV (Método por ELISA -proteína del core): positivo Western Blot para detección proteína core HIV: positivo

4) Investigación molecular inmunológica: Detección de anticuerpos Frente a HBCV (Método por ELISA):

Ig G: reactivo hasta 1/16 dil Frente a Toxoplasma gondii

IgG: detectable hasta 1/64 dil IgM por captura: negativo

Frente a Citomegalovirus (Método IFI): IgG detectable hasta 1/32 dil IgM: negativo

Frente a HCV (Método ELISA) Ig G: no detectable

Frente a HDV (Método ELISA) Ig G: no reactivo

5) Lavado broncoalveolar- Investigación de Pneumocystis jirovecii (técnica por IFD): detectable

Con estos datos, ¿cuál o cuáles premisas son ciertas? a) Paciente infectado con un retrovirus que a su vez tiene infección por hongos oportunistas b) Paciente portador de HBV infectado por HDV que adquirió una infección por lentivirus c) Paciente no infectado por CMV ni por HCV pero que adquirió una infección por Pneumocystis

jirovecii d) Paciente inmune a la hepatitis B infectado por Toxoplasma gondii y Cryptosporidium parvum e) Paciente que cursó una hepatitis por HCV y está infectado por coccidios

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Sinopsis

Para terminar… Comenzamos este caminar por el laboratorio de diagnóstico microbiológico clínico proponiéndoles descubrir el fascinante mundo microbiano capaz de injuriar al hombre y cómo detectarlo. Esperamos haber contribuido en algo. Los esfuerzos, realmente, no fueron pocos. Hicimos todo lo que estuvo a nuestro alcance y un poquito más. Quedamos a disposición de Uds. Hasta pronto.

Cuerpo docente Cátedra Microbiología, Parasitología y Virología

Facultad de Ciencias Médicas UNR

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