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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
PEDRO HENRIQUE VENDRAMINI
EXPLORANDO AS APLICAÇÕES DA ESPECTROMETRIA DE MASSAS: MONITORAMENTO DE REAÇÕES ORGÂNICAS, MECANISMOS DE FRAGMENTAÇÃO E IMAGEAMENTO COM NOVAS TÉCNICAS DE
IONIZAÇÃO
CAMPINAS
2016
PEDRO HENRIQUE VENDRAMINI
EXPLORANDO AS APLICAÇÕES DA ESPECTROMETRIA DE MASSAS: MONITORAMENTO DE REAÇÕES ORGÂNICAS, MECANISMOS DE FRAGMENTAÇÃO E IMAGEAMENTO COM NOVAS TÉCNICAS DE
IONIZAÇÃO
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto
de Química da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos para
a obtenção do título de Mestre em Química na área
de Química Orgânica
Orientador: Prof. Dr. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO PEDRO HENRIQUE VENDRAMINI, E
ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN.
Ficha catalográfica
CAMPINAS
2016
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin (Orientador)
Prof. Dr. Rodinei Augusti (DQ-UFMG)
Prof. Dr. Igor Dias Jurberg (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).
Este exemplar corresponde à redação final da
Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno PEDRO
HENRIQUE VENDRAMINI, aprovada pela Comissão
Julgadora em 22 de fevereiro de 2016.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a uma
pessoa muito especial, que é a
responsável por fazer com que
muitas teses e dissertações
sejam realizadas com tanta
qualidade no ThoMSon. Dona
Cida essa é especialmente
dedicada à senhora. Muito
obrigado por tudo!
AGRADECIMENTOS
Primeiramente gostaria de agradecer ao meu orientador Prof. Marcos Eberlin
pela oportunidade a mim conferida.
Gostaria também de agradecer a minha tia Landa, por todo o carinho, dedicação
e recepção quando cheguei em Campinas, me acolhendo como um filho.
Agradecer a todos os colegas do laboratório ThoMSon pela companhia durante
esses anos, em especial Bruno Vilachã, Adriana Godoy, Giovana Bataglion, Davila
Zampieri, Nicolas Schwab, Celio Angolini, Eduardo Schmidt, Renan Galaverna,
Marcos Pudenzi, Almas, Bruno de Paula, José Lara, Nubia Miranda e Regina
Sparrapan pelas oportunidades de a cada dia aprender um pouco mais sobre a química e
além dela... sobre a vida!
Agradeço aos docentes que muito me ensinaram, em especial ao prof. Igor Dias,
pelo excelente prof. com o qual aprendi muito. Aos colaboradores da UNICAMP que
prestam um serviço de muita qualidade, especialmente Bel, Janaína, Isabela e Gabi e
muitos outros obrigado pelo carinho e por fazer muito mais do que o vosso dever para
nos ajudar.
Agradeço a todos os meus amigos e familiares que sempre me deram âmino e
motivação para continuar caminhando, mesmo esse caminho me levando e mantendo
cada dia mais longe deles, mas saibam que sempre penso em vocês.
Não poderia deixar de citar algumas pessoas muito queridas que sempre me
deram suporte, que sempre me escutaram, me aconcelharam, me criticaram, me deram
força acima de tudo: Giuliana, Natalia Bressan, Natalia Petean, Ana Lucia, Raduan,
Carlos, Aline, Gisele, Juliana, Péricles, Breno... vocês realmente são pessoas que
aprendi a adimirar respeitar muito. Bruno Corte, Egon, Milena, Juliana, Sarah,
Tathiane, Ariane, Rafaella, Fernanda, André, Bruno Saravali, Eduardo, Fraciele,
Vivian, Debora, Yuri, Ana Leticia, Tatiane... vocês me mostraram que podemos
aprender, crescer, melhorar como profissional e pessoalmente sem competir e passar
por cima de ninguém, e que ajudar o próximo pode ser mais importante que fazer por si
mesmo, vocês são minha inspiração, para a cada dia melhorar e querer ser melhor. Ana
Lucia, Janaína, Thiago e Maurício... vocês são responsáveis diretamente por essa
conquista.
Acima de tudo gostaria de agradecer a minha mãe Osdelha, que se dedicou
muito para que os meus primeiros passos fossem dados. Poucas pessoas podem
imaginar o quanto a senhora fez. Muito obrigado mesmo!
Agradeço à ANP pelo apoio financeiro concedido através da empresa Petrobras
e da rede Geoquímica.
CITAÇÃO
“Todo homem toma os limites do próprio campo de visão como os limites do mundo.”
(Arthur Schopenhauer)
“ A glória é tanto mais tardia quanto mais duradoura há de ser, porque todo o fruto delicioso amadurece lentamente.”
(Arthur Schopenhauer)
“O tempo muda, e com ele mudam as exigências: antes era fundamental saber muito de pouco, hoje
saber muito de pouco e um pouco de tudo, amanhã...”
Anônimo
RESUMO
Aplicações da espectrometria de massas (mass spectrometry - MS) como
ferramenta no monitoramento de reações orgânicas, mecanismos de
fragmentação e na utilização de uma nova fonte de ionização desenvolvida no
laboratório ThoMSon - easy ambient sonic/spray ionization (EASI) em
comparação à técnica clássica desorption electrospray ionization (DESI) são
demonstradas.
Foram realizados dois estudos de mecanismos de reações orgânicas de
compostos heterocíclicos aromáticos por ESI-MS: a reação de N-metilação e
N-metoxicarboxilação do indol com carbonato de dimetila (DMC) utilizando
dois catalisadores (DABCO e DBU), e a dessulfurização oxidativa do tiofeno
com peróxido de hidrogênio catalisada por metil trióxido de rênio (MTO). No
primeiro estudo foi possível avaliar a diferença entre os dois catalisadores, o
DABCO realiza a transferência de metila após reagir com o DMC por uma
única via, enquanto que o DBU realiza tanto a N-metilação quanto a N-
metoxicaboxilação por duas vias. Os resultados são evidências contrárias ao
atual mecanismo proposto na literatura, portanto, novos mecanismos foram
propostos.
No segundo estudo, foi realizado o monitoramento de dessulfurização do
tiofeno com H2O2, catalisado por MTO, com o tiofeno marcado com etiqueta de
carga a fim de facilitar a detecção dos intermediários da reação. Foi possível
então verificar que a polimerização via Diels-Alder ocorre tanto com o sulfóxido
quanto com a sulfona, além de demonstrar o papel do catalisador.
No estudo de fragmentação, foram investigadas as Rodaminas catiônicas B e
6G em um espectrômetro de massas Orbitrap com HCD (higher-energy
collisional dissociation), para melhor entendimento de suas fragmentações
isobáricas (perdas distintas com a mesma massa nominal). O uso de altíssima
resolução e exatidão possibilitou definir os mecanismos envolvidos, incluindo
fragmentações que não seguem a regra do elétron par (regra fundamental de
fragmentação de compostos em espectrometria de massas).
Para a otimização dos procedimentos de imageamento por MS ambiente,
foram feitos estudos de ionização de moléculas biológicas (ácidos graxos,
triglicerídeos e fosfolipídeos) pelas técnicas de DESI e EASI. Comparou-se a
eficiência de ionização e avaliou-se a supressão iônica em dois tipos de
suporte (vidro e papel), para se medir o efeito da dispersão dos analitos.
Ambas as técnicas foram aplicadas para o imageamento em cortes de tecido
cerebral de rato, sendo demostrado que a fonte EASI apresenta desempenho
equivalente a técnica clássica de DESI.
ABSTRACT
New applications of mass spectrometry (MS) as a tool for organic reactions
monitoring, fragmentation mechanisms and the use of a new source of
ionization developed in ThoMSon laboratory - easy ambient sonic / ionization
spray (EASI) compared to classic desorption electrospray ionization (DESI)
technique are demonstrated.
Two studies on organic reactions mechanisms of heterocyclic aromatic
compounds ESI-MS were performed: N-methylation reaction, N-
metoxicarboxilação indole with dimethyl carbonate (DMC) using two catalysts
(DABCO and DBU), and oxidative desulfurization thiophene with hydrogen
peroxide catalyzed by methyl rhenium trioxide (MTO).
In the first study was possible to elucidate the reaction pathways by
which DABCO and DBU catalyze indole N-methylation. Whereas DABCO
performs the methyl transfer after reacting with the DMC by one route, on the
oder hand, DBU performs N-methylation via two different reaction pathways in
addition to performed N-metoxycarboxylation. Both disagree with the current
proposed mechanism. Therefore, new mechanisms have been proposed.
In the second study, charge-tagged thiophene was employed in order to
facilitate detection of the reaction intermediates. It was then possible to verify
that dimerization occurs via Diels-Alder reaction between thiophene-derived
sulfoxide and sulfones, and that SO or SO2 extrusion leads to the desulfurated
product.
On the fragmentation study, cationic Rhodamines B and 6G were investigated
in a Orbitrap mass spectrometry equipped with HCD (higher-energy collisional
dissociation), to better understand their isobaric fragmentation (distinct losses
with the same nominal mass) the use of high resolution and accuracy possible
define the mechanisms involved, including fragmentation that does not follow
the even electron rule.
For the optimization of the environment by MS imaging procedures, ionization
studies were made from biological molecules (fatty acids, triglycerides and
phospholipids) by EASI and DESI techniques. The ionization efficiency was
compared and ion suppression was evaluated in two types of support (glass
and paper) to measure the effect of dispersion of analytes. Both techniques
were applied for imaging in rat brain tissue sections, and demonstrated that the
EASI source has performance equivalent to the DESI conventional technique.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Componentes básicos de um espectrômetro de massas com
exemplos para cada componente. ........................................................................ 21
Figura 2. Gráfico de massa molecular versus polaridade dos compostos
ionizáveis por algumas técnicas de ionização em espectrometria de massas. ..... 22
Figura 3. O sistema ESI (processo de dessolvatação e transporte dos íons
para fase gasosa), onde A- capilar da fonte, B- tubo de transferência, 1-
diferença de potencial entre A e B, 2- cone de Taylor, 3- evaporação do
solvente, 4- explosão Coulombica, 5- ejeção dos íos. .......................................... 24
Figura 4. Esquema de um sistema DESI, a) componentes da fonte DESI (A-
plataforma, B- capilar de transferência, C- plataforma, I- ângulo entre A e C, II-
distância entre A e C, III- distância entre A e B, IV- distância entre B e C, 1-
protrusão do capilar, 2- gás de nebulizador. Em b) e c) podemos ainda ver
ampliações do sistema de ionização, com destaque para insidência de
solvente e a formação da micropelícula de dessorção respectivamente. ............. 25
Figura 5. Esquema de um sistema EASI, mostrando a formação dos íons e
posterior entrada no espectrômetro de massas. ................................................... 26
Figura 6. Espectrômetro de massas híbrido com analisador Q-TOF. ................... 27
Figura 7. Funcionamento do detector MCP, com detalhamento para a
ampliação de sinal via cascata. ............................................................................. 28
Figura 8. Esquema de um espectrômetro de massas híbrido com analisador
Orbitrap. ................................................................................................................ 29
Figura 9. Frequências dos íons quando entram no OT, onde U é o potencial
aplicado pelos eletrodos externo e central, k é a curvatura do campo, são as
frequências e r são os raios, R são características do raio e m/z é a razão
massa sobre carga do íon. .................................................................................... 30
Figura 10. Moléculas com atividade biológica que apresentam como principal
subunidade iodol N-metilado. ................................................................................ 34
Figura 11. ESI(+)-MS da solução reacional com DABCO: (a) t = 0 h; (b) t = 7 h... 38
Figura 12. ESI(+)-MS da solução reacional com DBU: (a) t = 0 h; (b) t = 1 h; (c)
t = 7 h. ................................................................................................................... 41
Figura 13. ESI(+)-MS do produto da reação de formação do indol marcado. ....... 43
Figura 14. Compostos sulfurados encontrados em combustíveis fósseis.36.......... 45
Figura 15. Métodos de dessulfurização. ................................................................ 45
Figura 16. ESI(+)-MS do produto da reação de acoplamento entre o imidazol e
o tiofeno................................................................................................................. 50
Figura 17. ESI(+)-MS da solução reacional em: t = 10 min. .................................. 51
Figura 18. ESI(+)-MS da solução reacional em: (a) t = 60 e (b) t = 180 min. ........ 52
Figura 19. ESI(+)-MS da solução reacional: (A) t = 0 min; (B) t = 60 min. ............. 54
Figura 20. Ampliação do íon m/z 179, espectro experimental, e das massas
teóricas do reagente monocarregado e do produto dessulfurizado dicarregado
em A, B e C respectivamente. ............................................................................... 55
Figura 21. Cinética da reação de dessulfurização do tiofeno com peróxido de
hidrogênio (H2O2), catalisado por metil trióxido de rênio (MTO). ........................... 55
Figura 22. Efeito de Cieplak. ................................................................................. 57
Figura 23. Estrutura da Rodamina B e 6G. ........................................................... 59
Figura 24. Espectro de ESI-MS(MS)n da RB. ...................................................... 61
Figura 25. Ampliação do íons, a) m/z 371 e b) m/z 355 da RB. ............................ 61
Figura 26. Espectro de ESI-MS(MS)n da R6G. ..................................................... 63
Figura 27. Ampliação do íon m/z 371 da R6G. ...................................................... 64
Figura 28. Fragmentações radicalares, A) RB e B) R6G....................................... 66
Figura 29. Perda Neutra para a RB em A) e B), e para a R6G em A) e C). ......... 67
Figura 30. Número de publicações em MSI. (Web of Science: 28/01/2016_
mass spectrometry e imaging). ............................................................................. 68
Figura 31. Padrão estrutural de A) triglicerídeos, B) ácidos graxos e C)
fosfolipídeos.42....................................................................................................... 69
Figura 32. MSI dos padrões de AGs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d)
EASI, sendo à direita o mix dos padrões............................................................... 72
Figura 33. MSI dos padrões de FLs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d)
EASI, sendo à direita o mix dos padrões............................................................... 72
Figura 34. MSI dos padrões de TAGs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d)
EASI, sendo à direita o mix dos padrões............................................................... 73
Figura 35. Espectros de ESI(-) – MS dos padrões de ácidos graxos em
misturas equimolares, onde A) DESI-vidro, B) EASI-vidro, C) DESI-papel, D)
EASI-papel. ........................................................................................................... 74
Figura 36. Espectros de ESI (+) – MS dos padrões de fosfolipídeos em
misturas equimolares, onde A) DESI-vidro, B) EASI-vidro, C) DESI-papel, D)
EASI-papel. ........................................................................................................... 75
Figura 37. Espectros de ESI (+) – MS dos padrões de triglicerídeos em
misturas equimolares, onde A) DESI-vidro, B) EASI-vidro, C) DESI-papel, D)
EASI-papel. ........................................................................................................... 76
Figura 38. MSI de cérebro de rato: a) e b) m/z 782.540, e) e f) m/z 683,504, c),
d), g) e h) m/z 303,208. ........................................................................................ 78
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Tabela dos elementos mais comuns na composição de moléculas
orgânicas e seus isótopos mais abundantes, com suas respectivas massas
nominais e exatas. ................................................................................................ 31
Tabela 2. Principais métodos de ativação na fragmentação, e suas energias
associadas a cada analisador. .............................................................................. 31
Tabela 3. Dados de alta resolução e exatidão de massas para a RB. .................. 62
Tabela 4. Dados de alta resolução e exatidão de massas para a R6G. ................ 64
Tabela 5. Condições padrões utilizadas na aquisição dos espectros de massas
para as fontes DESI e EASI .................................................................................. 71
Tabela 6. Espécies detectadas em cada espectro, íons base e médias das
intensidades absolutas dos íons base de cada espectro, das diferentes
misturas de padrões em seus respectivos suportes. ............................................. 77
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1. Formação de carbonato de dimetila (DMC)....................................... 34
Esquema 2. Mecanismo proposto por Shieh para a N-metilação do indol. ........... 35
Esquema 3. Nova proposta mecanística para a N-metilação do indol com
DMC quando DABCO é utilizado como catalisador. ............................................. 39
Esquema 4. Mecanismo detalhado para a transferência de metila para o indol. .. 40
Esquema 5. Equilíbrio químico ácido-base entre o indol e o metanol. .................. 40
Esquema 6. Nova proposta mecanística para a N-metilação e N-
metoxicarboxilação do indol com DMC catalisado por DBU.................................. 42
Esquema 7. Rota sintética para a formação do indol com etiqueta de carga. ....... 43
Esquema 8. Mecanismo proposto para a oxidação do tiofeno e polimerização
das sulfonas. ......................................................................................................... 46
Esquema 9. Etapas para a síntese do tiofeno marcado com etiqueta de carga
utilizando PF6-como contra íon. . ........................................................................... 52
Esquema 10. Mecanismo proposto para a oxidação do tiofeno, polimerização
dos produtos de oxidação com subsequente eliminação de enxofre. ................... 56
Esquema 11. Possíveis vias para a perda de propano, A) via passo concertado
e B) via radicalar. .................................................................................................. 60
LISTA DE ABREVIATURAS
MS – Mass Spectrometry
MSI – Mass Spectrometry Imaging
NRM – Nuclear Magnetic Ressonance
GC – Gas Chromatography
LC – Liquid Chromatography
CE – Capillary Electrophoreses
EI – Electron Ionization
CI – Chemical Ionization
SIMS – Secondary Ion Mass Spectrometry
MALDI – Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
APPI – Atmospheric Pressure Photoionization
APCI - Atmospheric Pressure Chemical Ionization
ESI – Electrospray Ionization
DESI – Desorption Electrospray Ionization
EASI – Easy Ambient Sonic-Spray Ionization
B – Magnetic Sector
Q - Quadrupole
TOF – Time of Flight
IT – Ion Trap
ICR – Ion Ciclotron Ressonance
OT – Orbitrap
EM – Electron Multiplier
MCP – Microchannel Plate
FT – Fourier Transform
CID – Collision-Induced Dissociation
SID – Source-Induced Dissociation
ETD – Electron-Transfer Dissociation
ECD – Electron Capture Dissociation
HCD – Higher-Energy Collisional Dissociation
m/z – razão massa sobre carga
DMC – Carbonato de dimetila
DABCO – 1,4-diazabiciclo[2,2,2]octano
DBU – 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno
DMAP – 4-Dimetilaminopiridina
MTO – Metil Trióxido de Rênio
T – Tiofeno
BT – Benzotiofeno
DBT – Dibenzotiofeno
BNT – Benzonaftotiofenos
RB – Rodamina B
R6G – Rodamina 6G
ATM - Automatedteller Machine
AG – Ácidos Graxos
TAG – Triglicerídeos
FL - Fosfolipídeos
Sumário
1. Capítulo 1- Introdução Geral ...................................................................21
1.1. Espectrometria de Massas ...............................................................21
1.2. Fontes de Ionização ..........................................................................23
1.2.1. Electrospray Ionization (ESI) .....................................................23
1.2.2. Desorption Electrospray Ionization (DESI) ...............................24
1.2.3. Easy Ambient Sonic-Spray Ionization (EASI) ...........................25
1.3. Analisadores de Massas ...................................................................26
1.3.1. Time of Flight (TOF) ....................................................................26
1.3.2. Orbitrap........................................................................................29
1.4. Aplicações da Espectrometria de Massas ......................................30
1.5. Objetivos ............................................................................................32
2. Capítulo 2- Estudos Mecanísticos ..........................................................32
2.1. Monitoramento de Reações Orgânicas ...........................................32
2.2. Estudo da N-metilação e N-metoxicarboxilação do Indol ..............34
2.2.1. Introdução ...................................................................................34
2.2.2. Parte Experimental .....................................................................35
2.2.3. Resultados e Discussão.............................................................36
2.2.4. Conclusão ...................................................................................43
2.3. Estudo da Dessulfurização Oxidativa do Tiofeno ..........................44
2.3.1. Introdução ...................................................................................44
2.3.2. Parte Experimental .....................................................................46
2.3.3. Resultados e Discussão.............................................................49
2.3.4. Conclusão ...................................................................................58
2.4. Estudo da Fragmentação das Rodaminas ......................................58
2.4.1. Introdução ...................................................................................58
2.4.2. Experimental ...............................................................................60
2.4.3. Resultados e Discussão.............................................................60
2.4.4. Conclusão ...................................................................................67
3. Imageamento com Novas Técnicas de Ionização .................................68
3.1. Introdução ..........................................................................................68
3.2. Parte Experimental ............................................................................70
3.3. Resultados e Discussão ...................................................................71
3.4. Conclusão ..........................................................................................78
4. Conclusões Gerais ..................................................................................79
5. Referências ..............................................................................................80
6. Informação Suplementar – Espectros de RMN e MS............................83
21
1. Capítulo 1- Introdução Geral
1.1. Espectrometria de Massas
A espectrometria de massas (mass spectrometry - MS), é uma técnica que analisa
a razão massa carga (m/z) de um íon. Os primeiros experimentos empregando esta
tecnologia foram realizados no início do século XX por J. J. Thomson.1 A partir do
aprimoramento da tecnologia, novos e melhores espectrômetros de massas foram
desenvolvidos, sempre buscando aprimorar a performace geral dessa importante
ferramenta analítica. A Figura 1 mostra os componentes básicos de um espectrômetro de
massas.2
Figura 1. Componentes básicos de um espectrômetro de massas com exemplos para cada componente.
O sistema de inserção de amostras pode ser feito de modo direto, ou seja, sem
utilização de técnicas de separação hifenadas ao espectrômetro de massas (sistemas
cromatográficos): GC, LC e CE. Quando realizado a inserção direta alguns inconvenientes
podem ocorrer, como o efeito de supressão iônica, que consiste na supressão do sinal de
compostos de menor eficiência de ionização frente a um composto mais ionizável. Esse
efeito é mais acentuado devido ao não fracionamento de amostras complexas (diversas
classes de compostos), em contrapartida temos uma análise mais rápida.3
22
O segundo componente do espectrômetro de massas é a fonte de ionização, essa
pode ser dividida em três grupos: fontes de ionização sob vácuo como: EI, CI e MALDI , a
pressão atmosférica como: APPI, APCI e ESI e ambiente (com pouco ou nenhum preparo
de amostra) como: DESI e EASI.4
A fonte de ionização está diretamente relacionada ao tipo de molécula que se
deseja analisar, pois, cada uma delas apresenta um mecanismo próprio, que promove a
ionização de moléculas de acordo com sua composição estrutural como, por exemplo,
grupos funcionais e insaturações além da massa molecular (Figura 2). Outros dois fatores
importantes da fonte de ionização são: energia transferida durante a ionização, que pode
ser branda, assim proporcionando a formação do íons sem fragmentação, ou altamente
energética o que causa a fragmentação dos íons precursores e o número de cargas que o
íon pode ter: mono, di, tri, tetra ou policarregados, com uma, duas, três, quatro ou mais
cargas, respectivamente.
Figura 2. Gráfico de massa molecular versus polaridade dos compostos ionizáveis por
algumas técnicas de ionização em espectrometria de massas.
23
O terceiro componente é o analisador, onde apesar de todos os tipos analisarem a
m/z de um íon, cada analisador apresenta características próprias, como velocidade de
varredura, resolução (depende apenas do sinal de um íon : R = m / ∆m(½ H)), poder de
resolução (capacidade de resolver dois íons de massa muito próxima, está relacionado
com a resolução mínima para resolver dois íons : Rmin = (m1 + m2) / ∆m) e exatidão
(expresso em um erro da massa experimental frente a massa teórica do composto em
ppm – (mT - mE) / mT). Essas características fazem com que uma escolha adequada deva
ser feita quando se deseja ultilizar um espectrômetro de massas. Além dessas
características alguns analisadores apresentam propriedades que fazem deles
apropriados para determinados tipos de estudo. Tendo em vista essas características de
cada analisador, existem analisadores híbridos – dois tipos de analisadores em um
mesmo espetrômetro de massas, aproveitando o melhor de cada analisador, como os Q-
TOFs e Q-Ts, que são a combinações de analisadores do tipo Q com TOF ou IT,
respctivamente.5
O quarto e último componente é o detector.Ele é responsável pela detecção o íon
seja por impacto como a EM ou a MCP, ou por placas de indução. Este último tipo utiliza
FT (transformada de Fourier), para converter o sinal adquirido no domínio do tempo no
domínio de frequência.6
Para a realização desse trabalho, a introdução da amostra foi direta, três tipos de
fonte de ionização (ESI, DESI e EASI) e dois analisadores híbridos (Q-TOF e Q-OT)
foram utilizados, cada qual com seu detector.
1.2. Fontes de Ionização
1.2.1. Electrospray Ionization (ESI)
O ESI foi um das maiores revoluções em MS, proporcionando um grande avanço
quanto à faixa de massa e à polaridade de moléculas ionizadas, uma vez que antes dela,
apenas moléculas com baixa polaridade (apolar) e com massa molecular baixa eram
analizadas por MS.7
24
A ionização por eletrospray se baseia no desbalanceamento de carga e na
dessorção das gotículas carregadas. Inicialmente aplica-se uma voltagem no capilar pelo
qual flui o solvente com os analitos, atraindo e neutralizando as cargas de sinal oposto à
voltagem aplicada, causando um excesso de carga de mesmo sinal nas gotículas
formadas pela nebulização da amostra. Essas gotículas formadas vão diminuindo de
tamanho pela evaporação do solvente, aumentando a densidade de carga por gotícula,
então, podendo ocorrer dois fenômenos: 1-) o cisalhamento das gotículas (explosão
Coulômbica) em gotículas menores até todo solvente evaporar, liberando os analitos para
a fase gasosa, ou 2-) ejeção dos analitos das gotas para a fase gasosa devido à alta
repulsão iônica (Figura 3).8
Figura 3. O sistema ESI (processo de dessolvatação e transporte dos íons para fase gasosa), onde A- capilar da fonte, B- tubo de transferência, 1- diferença de potencial entre A e B, 2- cone de Taylor, 3- evaporação do solvente, 4- explosão Coulombica, 5- ejeção dos íos.
1.2.2. Desorption Electrospray Ionization (DESI)
A fonte DESI, consiste em aplicar um fluxo de solvente por um capilar, que é
submetido a uma diferença de potencial semelhante ao ESI. Formam-se gotículas que
entram em contato com uma superfície, criando uma micropelícula de solvente que
dessorve os analitos. Gotículas secundárias com analitos são formadas pelo impacto das
gotículas primárias, e direcionadas ao espectrômetro de massas. A Figura 4 ilustra a
fonte de DESI e o processo de ionização ambiente por dessorção, com as variáveis
experimentais que podem ser ajustadas.9
25
Figura 4. Esquema de um sistema DESI, a) componentes da fonte DESI (A- plataforma,
B- capilar de transferência, C- plataforma, I- ângulo entre A e C, II- distância entre A e C, III- distância entre A e B, IV- distância entre B e C, 1- protrusão do capilar, 2- gás de nebulizador. Em b) e c) podemos ainda ver ampliações do sistema de ionização, com destaque para insidência de solvente e a formação da micropelícula de dessorção respectivamente.
1.2.3. Easy Ambient Sonic-Spray Ionization (EASI)
A fonte de ionização EASI se assemelha com a DESI quanto ao mecanismo de
dessorção, mas se diferencia por não ter voltagem aplicada no capilar de formação do
spray, que aumenta a relação sinal/ruído e pelos capilares utilizados em sua construção
serem de diâmetros diferentes, proporcionando uma maior vazão do gás em pressões
menores que as utilizadas pelo DESI. O mecanismo de formação dos íons não são muito
bem estabelecidas, até o momento, a teoria mais aceita é de que a alta vazão do gás
causa um cisalhamento das gotículas muito rápido, de modo que não ocorra a distribuição
adequada de cargas dentro das novas gotículas formadas, causando um
desbalanceamento de carga. A Figura 5 ilustra a fonte de EASI.10
26
Figura 5. Esquema de um sistema EASI, mostrando a formação dos íons e posterior
entrada no espectrômetro de massas.
1.3. Analisadores de Massas
1.3.1. Time of Flight (TOF)
Em um espectrômetro de massas com analisador híbrido do tipo Q-TOF (Figura 6),
o quadrupolo é utilizado para varredura e/ou seleção de íons, enquanto que o TOF é o
analisador.
27
Figura 6. Espectrômetro de massas híbrido com analisador Q-TOF.
Os íons são inseridos no TOF de forma laminar, sofrendo um pulso eletrostático
ortogonalmente à direção de entrada, o que corrige dispersões de energias cinéticas dos
íons existentes na direção do movimento original. Quanto maior a m/z menor será a sua
velocidade (Equação 1), logo maior o tempo do voo do íon em um tubo (Equação 2).
28
A inserção dos íons no analisador TOF de forma laminar é extremamente
importante, pois quanto mais fino for essa lâmina de íons, melhor será a aplicação de um
pulso eletrostático uniforme, ou seja, menor a variação de energia cinética entre as
moléculas, proporcionando maior resolução e poder de resolução dos íons.
A resolução de um TOF pode ser melhorada com a utilização de um ou mais
refletores eletrostáticos que corrigem possíveis diferenças de energia cinética de íons
com mesma m/z, aumentando consequentemente o poder de resolução dos íons. Esse
poder de resolução também pode ser maior com o aumento do tubo de voo.11
O detector utilizado foi o MCP (microchannel plate), que é bem adequado para
analisadores do tipo TOF, que precisam de tempos de chegada precisos e larguras de
pulso estreitas. Além disso, a grande área de detecção da placa de microcanais permite a
detecção de grandes feixes de íons do analisador sem focalização adicional (Figura 7).12
Figura 7. Funcionamento do detector MCP, com detalhamento para a ampliação de sinal
via cascata.
A amplificação do sinal é duas ordens de grandeza acima (102), podendo ainda ser
colocados em série dois ou três detectores, ampliando ainda mais o sinal recebido,
chegando a oito ordens de grandeza (108). No entanto, os detectores de placa de
microcanais têm algumas desvantagens, eles são frágeis, sensíveis ao ar e as suas
grandes placas de microcanais são caras.11
29
1.3.2. Orbitrap
Um espectrômetro de massas com analisador Orbitrap (OT) (Figura 8), funciona
como uma armadilha de íons. Os íons entram rapidamente no analisador através do C-
trap, em forma de funil (squeeze) que concentra os íons antes de transferí-los para o OT.
Os íons, então, orbitam ao redor de um eletrodo central, e oscilam axialmente ao longo
desse eletrodo. Todos os íons entram com a mesma energia, portanto, os íons com
menor m/z fazem maior número de oscilações harmônicas devido à maior velocidade.
Figura 8. Esquema de um espectrômetro de massas híbrido com analisador Orbitrap.
Quando inseridos no OT, os íons apresentam três diferentes tipos de frequências:
rotacional, oscilções radiais e axiais. Essas frequências são determinadas por meio de
transformadas de Fourier (Figura 9), aplicadas após os sensores detectarem as
oscilações dos íons no domínio tempo.
30
Figura 9. Frequências dos íons quando entram no OT, onde U é o potencial aplicado
pelos eletrodos externo e central, k é a curvatura do campo, são as frequências e r são
os raios, R são características do raio e m/z é a razão massa sobre carga do íon.
Após a determinação das frequências, através da frequência axial de cada íon é
construído o espectro de massas. Quanto maior o número de oscilações maior resolução,
assim a resolução cai com o aumento da massa do íons.13
1.4. Aplicações da Espectrometria de Massas
A espectrometria de massas pode ser aplicada nos mais diversos campos da
ciência, como petroquímica,14 alimentos,15 forense,16 polímeros,17 médica,18 ambiental,19
microbiológica,20 etc. Suas aplicações se baseiam na identificação e na caracterização
molecular.21
A exatidão de massa está diretamente correlacionada com a alta resolução do íon,
uma vez que, quanto maior for a resolução mais fino será o espectro contínuo, tornando
mais preciso e com menor erro o centro de massa do espectro contínuo. Com uma
exatidão de massa muito precisa é possível calcular a composição elementar da
molécula, devido ao defeito de massa característico de cada átomo (Tabela 1), sendo que
suas combinações apresentam massas exatas únicas.22
31
Tabela 1. Tabela dos elementos mais comuns na composição de moléculas orgânicas e
seus isótopos mais abundantes, com suas respectivas massas nominais e exatas.
Átomo Massa nominal (u) Massa Exata (u) 1H 1 1,00782 2H 2 2,01410 12C 12 12,00000 12C 13 13,00335 14N 14 14,00307 15N 15 15,00010 16O 16 15,99491 18O 18 17,99916
Entretanto, não é possível saber como esses átomos estão ligados entre si,
impossibilitando a diferenciação de moléculas isobárias (mesma massa molecular), sendo
a fragmentação muito importante para auxiliar nesse tipo de caracterização molecular.
Existem diversos métodos de ativação para dissociar um íon, cada método apresenta
energias diferentes entre si e também entre analisadores, para um mesmo método de
ativação (Tabela 2).4 Um dos métodos de fragmentação mais utilizados é o collision-
induced dissociation (CID).
Tabela 2. Principais métodos de ativação na fragmentação, e suas energias associadas a
cada analisador.
Métodos de Ativação Energia Analisador
CID Baixa
Alta
QqQ, IT, Q-TOF, Q-IT e ICR
TOF e B
SID Baixa
Alta
QqQ, IT, ICR e B-Q
TOF
ECD Baixa ICR
ETD Baixa IT
HCD Alta OB
Existem cinco principais mecanismos de fragmentação em MS: clivagens σ, α e i,
fragmentações subsequentes a transferência 1,2 ou 1,4 de H e rearranjo de Mc Lafferty.
Esses mecanismos explicam tanto fragmentações provenientes de sítio de carga quanto
fragmentações radicalares.23
32
1.5. Objetivos
Esse trabalho envolve duas aplicações da MS, utilizando a alta resolução e a
exatidão para caracterizar e identificar os íons.
I. Elucidação de mecanismo de reação e fragmentação.
a. Elucidar o mecanismo da reação de N-metilação e N-metoxicarboxilação do
indol com carbonato de dimetila (DMC) utilizando 1,4-
diazabiciclo[2,2,2]octano (DABCO) e 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBU)
como catalisador.
b. Elucidar o mecanismo de dessulfurização oxidativa do tiofeno com peróxido
de hidrogênio e metil trióxido de rênio (MTO), utilizando etiqueta de carga
para melhor acompanhamento da reação.
c. Investigar o mecanismo de fragmentação dos isômeros de rodamina – 6G e
B, a fim de detalhar os mecanismos de fragmentação, confirmar quais as
reais fragmentações que formam os íons m/z 399 e 355, e avaliar se
rearranjos1,3-H são possíveis apenas via anel aromático ou pode ocorrer
com outros sistemas.
II. Imageamento por espectrometria de massas.
a. Avaliar a ionização da técnica EASI para as principais classes de compostos
analisadas em imageamento por espectrometria de massas (Mass
Spectrometry Imaging - MSI) ambiente, para determinar a supressão iônica
dentro de uma mesma classe, o perfil de ionização: desprotonação,
protonação, formação de espécies amoniadas, sodiadas e potassiadas, e a
viabilidade de empregar o EASI no MSI.
2. Capítulo 2- Estudos Mecanísticos
2.1. Monitoramento de Reações Orgânicas
O entendimento dos eventos/reações que ocorrem a nível molecular durante uma
reação, são extremamente importante para o seu melhor controle e aprimoramento.
Normalmente os mecanismos são propostos de acordo com a reatividade dos reagentes e
catalisadores empregados. Entretanto, nem sempre é simples e fácil inferir um
33
mecanismo, fazendo-se necessário a utilização de técnicas seletivas de monitoramento
para auxiliar na proposta mecanística como, por exemplo, ressonância magnética nuclear
(Nuclear Magnetic Ressonance - NMR) e MS, assim como também estudos de cálculos
teóricos.24
Estudos por ESI-MS depende muito das características das moléculas
empregadas, bem como dos intermediários formados no meio reacional, uma vez que a
ionização por esta técnica depende da acidez e basicidade dessas moléculas, para que
sejam desprotonadas ou protonadas, respectivamente. Entretanto essa problemática
pode ser solucionada com o uso de etiquetas de carga (líquidos iônicos), que torna a
ionização independente do pH reacional ou mesmo do uso de aditivos para forçar a
ionização.25
O monitoramento de reações pode ser realizado por dois métodos, on-line e off-
line. O monitoramento on-line consiste em acoplar um analisador ao sistema reacional e
assim detectar moléculas com tempo de meia-vida muito pequeno (milesegundos). Já o
monitoramento off-line se baseia em coletas de alíquotas do meio reacional em tempos
pré definidos, diluir essa alíquota afim de estagnar a reação e analisar. Essa metodologia
posssibilita a análise de intermedirários mais estáveis e foi a utilizada nos estudos
abordados nesse trabalho.26
Diversas reações já foram elucidadas por espectrometria de massas mostrando a
importância desses estudos. Alguns exemplos são: reações substituição nucleofílica e
reação eletrofílica aromática além das named reactions – reação de Ugi25(a), Dakin-
West,27 Stille,28 Heck,29 Petasis Borono-Mannich,30 Morita-Baylis-Hillman25(b), Negishi,26(a)
e muitas outras reações.31
Neste trabalho foram estudadas três reações orgânicas clássicas, que não tiveram,
seus mecanismos elucidados quando empregados tais reagentes e catalisadores. Essas
reações se destacam quanto a utilização de reagente mais brandos (menos tóxicos,
corrosivos, etc.) e que atende aos princípios da química verde – N-metilação e N-
metoxicarboxilação, e dessulfurização oxidativa respectivamente.
34
2.2. Estudo da N-metilação e N-metoxicarboxilação do Indol
2.2.1. Introdução
A reação de N-metilação do indol é muito importante na síntese orgânica, uma vez
que esses núcleos indólicos metilados, são relevantes em diversos compostos bioativos
(Figura 7). 32
Figura 10. Moléculas com atividade biológica que apresentam como principal subunidade
iodol N-metilado.
Dentre os agentes alquilantes empregados, o carbonato de dimetila (DMC) se
destaca por atender aos princípios da química verde.33 A síntese do DMC também é
realizada por meio de um processo ecologicamente correto (Esquema 1), utilizando
monóxido de carbono, metanol e oxigênio na presença de sais de cobre.8a
Esquema 1. Formação de carbonato de dimetila (DMC).
O Esquema 2 descreve o ciclo catalítico para a N-metilação do indol proposto por
Shieh e colaboradores. Foram previstas duas etapas principais: primeiro, a
metoxicarboxilação do DABCO (3) pelo DMC (2) e a segunda seria a abstração do H
ácido do indol pelo metóxi, fomando 6. Finalmente, indol N-metilado 7 seria formado pela
abstração da metila por um ataque nucleofílico, regenerarando o catalisador DABCO (3)
35
e liberando CO2.34 Esse mecanismo apresenta o intermediário m/z 171 facilmente
detectado por MS, uma vez que é uma molécula carregada.
Esquema 2. Mecanismo proposto por Shieh para a N-metilação do indol.
2.2.2. Parte Experimental
Síntese do 5-dimetilamino indol (1)
Foram adicionados a um balão de 100 mL: 5-amino indol (216 mg), NaCNBH3 (88
mg) e AcOH glacial (200 µL) em MeOH (11 mL), em seguida foi gotejada por 17 min uma
36
solução de CH2O:H2O:MeOH (0,52:0,86:15,0 mL), o produto foi isolado via extração
líquido/líquido.
Síntese do 5-trimetilamino indol (2)
Foi adicionado CH3I (3,6 mL) e Et2O anidro (17 mL) à solução 2 e deixado sob
agitação por 2 h. O produto foi isolado por extração líquido/líquido e analisado por MS.
Condições Experimentais
No monitoramento da reação foram adicionados a um balão de 15 mL: indol (500
mg), DABCO ou DBU (0.1 eq.), DMF (0.5 mL) e DMC (5.0 mL). A mistura foi mantida sob
agitação e aquecimento (95 °C) durante 8 h.
Monitoramento da Reação
Foi coletada de hora em hora alíquotas de 1 µL da reação diluídas em acetonitrila
(1 mL) e analisadas por ESI (+) – MS. O espectrômetro de massas utilizado foi o
Micromass (Manchester, Reino Unido) QTof instrumento de configuração ESI-QTof com
resolução de massa 5000@400. Foram utilizadas as seguintes condições normais de
funcionamento: voltagem do capilar 3 kV, 8 V do cone e temperatura do gás de
dessolvatação a 100 ºC. ESI-MS/MS foi realizado sob energia de 4-32 kV (CID).
2.2.3. Resultados e Discussão
Primeiramente foi realizado o estudo com o DABCO. A Figura 11 mostra dois
espectros de massas referente ao monitoramento t = 0 e 7 h. No t = 0 h, foram detectadas
moléculas protonadas do solvente [DMF + H] + de m/z 74 e do catalisador [DABCO + H] +
de m/z 113, bem como os seus dímeros e trímeros. Por outro lado, temos no t = 7 h,
novos íons interceptados, que possivelmente são intermediários-chave de reação: N-
37
metilado DABCO 8 de m/z 127, 9 de m/z 244, que é [8 + 1]+ e 11 de m/z 370, que é [8 + 8
+ 6]+ foram claramente detectados como íons muito intensos. Outros adutos, tais como [8
+ 8 + HCO2H] + de m/z 299, [8 + 1 + DMF] + de m/z 317, também foram detectadas.
Um ponto importante foi a ausência do intermediário 5 m/z 171 proposto por Shieh
no (Esquema 2), apesar de sua natureza catiônica e facilidade de detecção por MS,
mostrando que o mecanismo não procede via N-metoxicarboxilação do DABCO. Todos o
íons interceptados foram caracterizados por dissociação induzida por colisão (CID),
utilizando MS tandem.
38
m/z60 100 140 180 220 260 300 340 380
%
0
100186
147113
74
271225
261 320
m/z60 100 140 180 220 260 300 340 380
%
0
100127
370
147299244
169 258 317
m/z 60 100 140 180 220 260 300 340 380
%
0
100 147
127
91
74
97 169 299 203 247 320
Figura 11. ESI(+)-MS da solução reacional com DABCO: (a) t = 0 h; (b) t = 7 h.
De acordo com os íons interceptados m/z 127, 244 e 370 e a não detecção do
intermediário proposto por Shieh, uma nova proposta mecanística foi feita (Esquema 3).
39
Esquema 3. Nova proposta mecanística para a N-metilação do indol com DMC quando
DABCO é utilizado como catalisador.
A proposta mecanística primeiramente envolve o DABCO (nucleófilo mole) (3)
atacando o grupo metila do DMC (2) para formar o primeiro intermediário, o N-metilado
DABCO (8). Em seguida, ocorre a coordenação do indol (1) com 8 para formar 9 (m/z
244). Somente após a formação desse complexo o metóxi (4), abstrai o próton indólico
NH, formando 10 (Esquema 4), que é neutro, mas é detectado por ESI (+) como 11 (m/z
370), ou seja, um aduto entre a espécie neutra e uma molécula de N-metil DABCO [10 +
8]+.
A formação do produto 7, pode ocorrer por duas vias, uma por transferência de
metila “intramolecular” do par iônico 10, regenerando o catalisador para o cíclo catalítico,
ou por fragmentação do aduto 11, liberando uma molécula do intermediário N-metilado
DABCO, o catalisador e o produto 7 (Esquema 4).
40
Esquema 4. Mecanismo detalhado para a transferência de metila para o indol.
O pKa do metanol é inferior ao do indol,35 o que leva a um equilíbrio desfavorável
para o passo de desprotonação no mecanismo de Shieh’s (Esquema 5). Portanto a
formação de 9, seria uma importante etapa para aumentar a acidez do indol, favorecendo
a NH abstração pelo ânion metóxi (Esquema 4).
Esquema 5. Equilíbrio químico ácido-base entre o indol e o metanol.
Shieh15 fez o uso de outras bases DMAP, tribultilamina e DBU como catalisador na
N-metilação do indol. Diante disso, utilizamos outra base DBU, que além da N-metilação
também forma como produto o indol acilado, na tentativa de identificar o catalisador
acilado e comprovar o caráter dualístico do DMC.
41
A Figura 12 mostra três espectros ESI (+) - MS da solução reacional nos tempos t
= 0, 1 e 7 h, usando DBU como catalisador. No espectro de t = 0 h, as moléculas
protonadas de solvente [DMF + H] + de m/z 74, o catalisador [DBU + H] + de m/z 153, e a
reagentes, indol e carbonato de dimetila, foram detectados . Entretanto, mesmo em t = 0
h, também foi detectado o intermediário-chave do ciclo catalítico proposto por Shieh e
colaboradores, ou seja, o carbamato 14 de m/z 211.
m/z 60 100 140 180 220 260 300 340 380
%
0
100 147
74
132
225
213
176
m/z 60 100 140 180 220 260 300 340 380
%
0
100 153
74 147 91
118
305
211
m/z 60 100 140 180 220 260 300 340 380
%
0
100 91
74
147
123 97
153
167
185
Figura 12. ESI(+)-MS da solução reacional com DBU: (a) t = 0 h; (b) t = 1 h; (c) t = 7 h.
42
O íon de m/z 167 correspondendo ao DBU metilado foi observado somente em t =
1 h. No instante t = 7 h dois íons de m/z 132 e 176 foram interceptados, os quais
correspondem aos produtos N-metil indol e ao N-metoxicarboxilado indol,
respectivamente. Nessa mesma alíquota também foi interceptado o íon m/z 225,
caracterizado por CID como sendo o produto de acilação e metilação do catalisador
(Figura 8c).
O Esquema 6 mostra um novo mecanismo proposto para o N-metilação do indol
catalisado pelo DBU. A formação de m/z 225 pode ser racionalizada pela abstração de H-
alfa à ligação C=N pelo metóxi, a partir do DBU N-metoxicarboxilado, seguido de um
ataque nucleofílico a outra molécula de DMC, levando à formação do intermediário 16.
Esquema 6. Nova proposta mecanística para a N-metilação e N-metoxicarboxilação do
indol com DMC catalisado por DBU.
43
Nos estudos com DBU, foi possível interceptar tanto reagente 1 quanto os produtos
7 e 15, porém em baixa intensidade. Para melhor acompanhamento da reação foi
proposto a síntese do indol marcado (LI – sal de amônio quaternário) (Esquema 7), para
acompanhar o consumo do reagente e formação do produto sem a necessidade de
dependência direta com a acidez e basicidade das moléculas empregadas no estudo.
Esquema 7. Rota sintética para a formação do indol com etiqueta de carga.
O produto final da reação foi analisado por ESI(+) – MS, sendo que, pode-se
observar uma mistura de aminas secundárias, terciárias e sais de amônio quaternário
(Figura 13).
Figura 13. ESI(+)-MS do produto da reação de formação do indol marcado.
Portanto, a reação com etiqueta de carga não foi possível ser monitorada, uma vez
que a formação do produto não ocorreu como esperado.
2.2.4. Conclusão
44
Uma nova proposta mecanística para a reação de N-metilação do indol com DMC
catalisada por DABCO foi elaborada, uma vez que o intermediário até então proposto não
foi interceptado, em contrapartida outros intermediários 8 e 11, corroboram a nova
proposta. Outra proposta foi feita quando DBU foi empregado como catalisador, esta pode
formar os produtos indol N-metilado ou N-metoxicaboxilado por dois intermediários cada
(7 via 13 ou 16 e 13 via 14 ou 16). Os intermediários interceptados neste trabalho
representam de modo mais fidedigno os produtos formados, uma vez que o intermediário
N-metoxicarboxilado é interceptado apenas quando DBU é empregado e o produto N-
metoxicarboxilado também é apenas encontrado quando esse catalisador é empregado.
O acompanhamento do consumo de reagente e formação do produto não foi
realizado, visto que a reação de formação do indol com etiqueta de carga não foi
realizada como o esperado, ocorrendo a formação de uma mistura de material de partida
com aminas, secundária e terciária e o produto.
Estudos de cálculos teóricos também estão sendo realizados para melhor suportar
a nova proposta mecanística apresentada nesse trabalho.
2.3. Estudo da Dessulfurização Oxidativa do Tiofeno
2.3.1. Introdução
Para os estudos de dessulfurização foi escolhido o tiofeno, que compõe uma das
classes de compostos orgânicos heterocíclicos mais numerosas presentes no petróleo, a
dos compostos aromáticos sulfurados, que inclui os T e seus alquil substituintes, BT
(enzotiofenos), DBT (dibenzotiofenos), BNT (benzonaftotiofenos), e compostos S-
heterocíclicos similares (Figura 14). Outros tipos de compostos sulfurados que também
podem ser encontrados são: mercaptanas, sulfetos de alquila, sulfeto de hidrogênio e
enxofre elementar.36
45
Figura 14. Compostos sulfurados encontrados em combustíveis fósseis.36
A problemática envolvendo os compostos sulfurados vai desde o envenenamento
dos catalisadores (perda da atividade catalítica) utilizados nos motores automotivos para
a combustão até questões ambientais (poluição). Devido a esses fatores e a legislação
rigorosa, as quantidades desses compostos estão cada vez mais restringidas e, se faz
necessário métodos mais eficientes para o processo de ultra-dessulfurização. São sete os
métodos de dessulfurização conhecidos para combustíveis líquidos, sendo a hidro-
dessufurização o método empregado mais clássico (Figura 15). Entretanto, este método
tem como produto da degradação o ácido sulfídrico (H2S), altamente tóxico, corrosivo e
prejudicial ao meio ambiente. Além de ser necessária a realização do processo sob alta
pressão (50 atm) e temperatura (350 ºC).36
Figura 15. Métodos de dessulfurização.
Outra opção para a dessulfurização é a oxidação que pode ser realizada à baixa
pressão e temperatura, como a dessulfurização oxidativa em sistemas bifásicos, com
peróxido de hidrogênio (H2O2) catalisado por metais de trasição (MT) suportados como:
vanádio (V),37 rênio (Re),38 tungstênio (W)39 e molibdenio (Mo)40.
Mingdon e colaboradores38 recentemente mostraram que a dessulfurização do
tiofeno com metil-trióxido de rênio (MTO), pode gerar dímeros e trímeros do produto de
degradação (Esquema 8). Apesar dos processos de dessulfurização serem muito
estudados, o mecanismo para a sua elucidação ainda é pouco detalhado, uma vez que, a
literatura não reporta como se desdobram esses processos no meio reacional.
46
Esquema 8. Mecanismo proposto para a oxidação do tiofeno e polimerização das sulfonas.
2.3.2. Parte Experimental
Síntese do 2-hidróxido metiltiofeno (1)
Uma solução de NaBH4 (370 mg, 10 mmol) em etanol (100 mL) foi adicionado à solução
de 2-formil tiofeno (935 L, 10 mmol) à 0 °C. A mistura foi agitada por 1 hora, em seguida,
10% de HCl foi adicionada lentamente a mistura até cessar a evolução de gás. O produto
foi extraído com diclorometano, a fase orgânica foi seca com Na2SO4 e o solvente foi
removido sob vácuo. O produto foi purificado por cromatografia em coluna (hexano /
AcOEt, 100: 0-90: 10). Produto 1 foi obtido com um rendimento de 68% (753,2 mg) como
um óleo incolor. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) 2.05 (s, 1H), 4.81 (s, 2H), 6.97 (dd, 1H, J =
3.50, 5.00 Hz), 7.00-7.02 (m, 1H), 7.27 (dd, 1H, J = 1.00, 5.00 Hz); 13C NMR (CDCl3, 125
MHz) 60.0, 125.5, 125.6, 126.9, 144.0.
Síntese do 2-bromo metiltiofeno (2)
47
Foi dissolvido o produto 1 em tolueno, em seguida adicionado HBr em excesso e
aquecido até atingir refluxo em um Dean-Stark. Após 3 h foi realizada a evaporação do
solvente sob vácuo e o produto foi utilizado diretamente na próxima etapa da síntese.
Síntese do 2- metil-1-(2’-tiofenilmetil) imidazolium brometo (3)
1-Metill imidazol (87,7 L, 1,1 mmol) foi adicionado à 2 (177,1 mg, 1 mmol) em acetona (1
mL). A mistura foi agitada por 24 horas, em seguida, a acetona foi separada do óleo
produzido. O resíduo foi lavado três vezes com acetona, e posteriormente secou-se sob
vácuo.
Síntese do 2-cloro metiltiofeno (4)
Foi feito uma solução de SOCl2 (545 L, 7,5 mmol) e NEt3 (1.045 mL, 7,5 mmol) em
diclorometano (50 mL), e adicionado lentamente à solução 1 (570 mg, 5 mmol) à 0 °C. A
mistura foi agitada a 0 ° C durante 30 minutos, em seguida, foi adicionada água ao frasco.
A fase orgânica foi separada, lavada com água, salmoura, e depois secou-se com
Na2SO4. O produto foi purificado por cromatografia em coluna (hexano / AcOEt, 100: 0-95:
5). Produto 4 foi obtido com um rendimento de 74% (492,2 mg) como um óleo incolor. 1H
NMR (CDCl3, 500 MHz) 4.81 (s, 2H), 6.95 (dd, 1H, J = 3.50, 5.00 Hz), 7.07-7.10 (m, 1H),
7.31 (dd, 1H, J = 0.50, 5.00 Hz); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) 40.4, 126.9, 126.9, 127.7,
140.1.
48
Síntese do 2- metil-1-(2’-tiofenilmetil) imidazolium cloreto (5)
1-Metill imidazol (87,7 L, 1.1 mmol) foi adicionado à 4 (132,6 mg, 1 mmol) em acetona (1
mL). A mistura foi agitada por 24 horas, em seguida, a acetona foi separada do óleo
produzido. O resíduo foi lavado três vezes com acetona, e posteriormente secou-se sob
vácuo. Produto 5 foi utilizado no passo seguinte sem purificação adicional.
Síntese do 2- metil-1-(2’-tiofenilmetil) imidazolium hexafluorofosfato (6)
Uma solução aquosa de KPF6 (176 mg, 1,5 mmol) foi adicionada à 5 (1 mL em solução
aquosa) e mantido sob agitação por 5 horas. O produto foi extraído em dicloro metano, a
fase orgânica foi seca com Na2SO4 e o solvente foi removido para dar 6 em 52% de
rendimento (169,1 mg) como um sólido incolor. m.p. 88.1-89.3 °C; 1H NMR (CD2Cl2, 500
MHz) 3.90 (s, 3H), 5.50 (s, 2H), 7.08 (dd, 1H, J = 3.50, 5.00 Hz), 7.26-7.29 (m, 3H), 7.45
(dd, 1H, J = 1.00, 5.00 Hz), 8.51 (s, 1H); 13C NMR (CD2Cl2, 125 MHz) 36.9, 48.2, 122.3,
124.2, 128.4, 129.0, 130.8, 133.7, 136.0.
Condições Experimentais
No monitoramento da reação foram adicionados a um balão de 5 mL: 2- metil-1-(2’-
tiofenilmetil) imidazolium hexafluorofosfato (20 mg), MTO (0,03 eq.) e solução aquosa de
49
H2O2 30% (0,6 mL). A mistura foi mantida sob agitação e aquecimento (60 °C) durante 3
h.
Monitoramento da Reação
Foram coletadas de 30 em 30 minutos alíquotas de 1 µL da reação diluídas em
metanol (1 mL) e analisadas por ESI (+) – MS. O espectrômetro de massas utilizado foi o
Q-Exactive – Thermo Scientific™, espectrômetro híbrido QOB de configuração ESI-QOB
com resolução de massa 140000@400. Foram utilizadas as seguintes condições normais
de funcionamento: voltagem do capilar 5 kV, fluxo de 5 µL.min-1 e tandem ESI-MS/MS foi
realizado sob energia de 10-40 kV (HCD).
2.3.3. Resultados e Discussão
Foram realizados dois estudos de dessulfurização, ambos com etiqueta de carga,
um utilizando como contra íon o Br- e o outro PF6
-. Essa mudança de contra íon foi
importante para evitar reações paralelas envolvendo o Br2 no meio e melhor entendimento
do mecanismo completo de dessulfurização.
Para o primeiro estudo de dessulfurização, a síntese do tiofeno marcado foi
realizada em três etapas (Esquema 8). O material de partida foi o 2-formil tiofeno, que foi
reduzido a 2-hidroximetiltiofeno. Em seguida, foi realizada uma reação de halogenação,
substituindo a hidroxila pelo bromo. A última etapa envolveu uma substituição nucleofílica
do bromo pelo metil imidazol, formando o tiofeno marcado.
Esquema 8. Etapas para a síntese do tiofeno marcado com etiqueta de carga utilizando
Br- como contra íon.
50
O produto da reação foi analisado por ESI-(+) – MS, e foi possível observar que
houve a formação do produto desejado m/z 179,1. Porém, também houve a polimerização
do tiofeno, com formação de dímeros e trímeros m/z 275,1 e 371,1 respectivamente
(Figura 16). Essa polimerização se deve ao fato da posição 2 do tiofeno ser nucleofílica,
competindo com o imidazol pelo ataque nucleofílico.
Figura 16. ESI(+)-MS do produto da reação de acoplamento entre o imidazol e o tiofeno.
Apesar do produto final da reação não ser exatamente o esperado, o íon base do
espectro de massas é o produto desejado e os dímeros e trímeros de tiofeno, não
causariam interferência na reação de oxidação do enxofre. Portanto, foi realizado o
estudo mecanístico com as misturas de mono, di e trímeros de tiofeno marcado.
Logo no início da reação (t = 10 min), foi possível visualizar a formação de
sulfóxido, para todos os tiofenos, mediante ampliação em regiões específicas do espectro
de massas (Figura 17).
51
Figura 17. ESI(+)-MS da solução reacional em: t = 10 min.
Para os polímeros, não é possível saber qual tiofeno é oxidado e se temos apenas
sulfóxidos ou misturas de tiofeno e sulfona para o dímero e tiofeno, sulfóxido e sulfona
para o trímero.
Quando novas alíquotas foram analisadas, não foi observada a formação da
sulfona nem dos produtos de adição [2+4] Diels-Alder. Em contrapartida, foi interceptado
o produto de partida bromado, como reportado na Figura 18.
52
Figura 18. ESI(+)-MS da solução reacional em: (a) t = 60 e (b) t = 180 min.
A formação desse produto se deve provavelmente à oxidação do contra-íon do LI,
gerando espécies de bromo molecular. Esse bromo sofre ataque nucleofílico do tiofeno,
formando o produto e liberando HBr no meio reacional. Após três horas de estudo, o LI
começa a se degradar liberando metil imidazol.
Para o segundo estudo, a síntese do tiofeno marcado foi realizada em quatro
etapas (Esquema 9). O material de partida foi o 2-formil tiofeno, que foi reduzido a 2-
hidroximetiltiofeno. Em seguida, foi realizada uma reação de substituição, que trocou a
hidroxila pelo cloro. Posteriormente foi realizada a substituição nucleofílica do cloro pelo
metil imidazol, e a última etapa envolveu a troca do contra íon Cl- por PF6
-, formando o
substrato de partida para o estudo.
Esquema 9. Etapas para a síntese do tiofeno marcado com etiqueta de carga utilizando
PF6-como contra íon. .
A troca de contra íon por PF6-, foi realizada para evitar reações paralelas ao
mecanismo que desejamos monitorar, como oxidações e reações de substituição
eletrofílica do bromo. Outra alteração nessa reação foi a halogenação que diferentemente
da reação anterior não foi utilizado o Br e sim o Cl, para tentar evitar a polimerização do 1-
metil tiofeno.
Primeiramente foi realizado o monitoramento da reação sem o catalisador (MTO),
para avaliar a oxidação não catalítica do tiofeno, uma vez que é reportado que ocorre
lentamente a reação e utilizamos um substrato (tiofeno marcado) não convencional.
53
Durante o monitoramento da reação não foi observado nenhuma alteração no espectro,
mostrando que mesmo com o tiofeno marcado a reação não ocorre durante as primeiras
horas.
Em seguida foi realizada então a reação com o catalisador. A Figura 19 mostra os
espectros de massas nos t = 0 mim e t = 60 min, no t = 0 min é possível observar apenas
um íon majoritário que é o tiofeno marcado com etiqueta de carga, já no t = 60 min temos
os principais intermediários da reação interceptados m/z 195,1, 211,1 e 203,1 que são
respectivamente o sulfóxido, a sulfona e o produto da adição (2+4) Diels-Alder da sulfona
com o sulfóxido (heterodímero).
54
Figura 19. ESI(+)-MS da solução reacional: (A) t = 0 min; (B) t = 60 min.
Os íons de m/z 195,1 e 211,1 são provenientes de dois intermediários cada, o
monômero e o dímero respectivamente. Uma vez que os intermediários da adição [2+4]
Diels-Alder de dois sulfóxidos ou duas sulfonas (homodímeros), apesentam a mesma m/z
que o intermediário precursor à adição m/z 195,1 e 211,1 respectivamente, entretanto
estes puderam ser diferenciados pelo seu padrão isotópico do 13C, que apresenta 0,5 Da
a mais por ser uma molécula dicarregada, enquanto que o precursor tem 1,0 Da a mais
por ser monocarregado.
O produto da reação apresenta m/z muito semelhante ao material de partida da
reação, uma vez que a diferença entre as duas moléculas são: a substituição de um S do
reagente por O2 no produto, que apresentam mesma massa nominal de 32 Da. Entretanto
a massa exata é diferente 31,972 Da e 31,990 Da, respectivamente, gerando uma
diferença de massa entre as duas moléculas, que pode ser então diferenciadas em um
espectro de massas com analisadores de altíssima resolução (Figura 20).
55
Figura 20. Ampliação do íon m/z 179, espectro experimental, e das massas teóricas do
reagente monocarregado e do produto dessulfurizado dicarregado em A, B e C
respectivamente.
De acordo com os principais intermediários interceptados e suas respectivas
intensidades, foi feito um gráfico de conversão de tiofeno ao produto da adição (2+4)
Diels-Alder dessulfurizado (Figura 21).Apesar de não ser uma análise quantitativa, a
ionização não dependente do pKa, uma vez que todas já apresentam carga. Esses
valores representam de modo muito próximo a quantidade de cada molécula no meio
reacional, visto que a ionização é muito semelhante.
Figura 21. Cinética da reação de dessulfurização do tiofeno com peróxido de hidrogênio
(H2O2), catalisado por metil trióxido de rênio (MTO).
É possivel observar no gráfico que os primeiros intermediádios da reação, o
sulfóxido e a sulfona se mantêm constantes e em baixa porcentagem durante todo o
monitoramento. Isso sugere uma alta taxa de conversão desses intermediários a
homodímeros de mesma m/z e heterodímeros com m/z 203,1. Presumidamente, este fato
56
se deve pelo tiofeno oxidado possuir menor, uma vez que a molécula não é mais
aromática.
Com base nos intermediários interceptados um novo mecanismo para a
dessulfurização do tiofeno com peróxido de hidrogênio catalisado por MTO foi proposto
(Esquema 10).
Esquema 10. Mecanismo proposto para a oxidação do tiofeno, polimerização dos
produtos de oxidação com subsequente eliminação de enxofre.
57
O mecanismo de dessulfurização do tiofeno (1) proposto apresenta três diferentes
rotas para a formação do produto, sendo a formação de sulfóxido (2) comum a todos. Em
seguida, pode ocorrer a formação da sulfona (3), ou a homodimerização de 2 formando
7.41
A partir da formação da sulfona (3) dois caminhos podem levar à formação do
produto. Uma possibilidade é a homodimerização (4), rota 1. Outra alternativa é a
heterodimerização (6) – rota 2. Para ambos os produtos formados, 4 e 6, apenas mais
uma etapa leva a formação do produto 5, que é a retroadição [4+1], eliminando SO242 ou
SO respectivamente.
O homodímero 7 sofre uma retroadição [4+1], levando ao intermediário m/z 171 (8),
que foi interceptado a partir de t = 60 min – rota 3. A oxidação do homodímero 7, levando
a formação de 6 não ocorre, portanto a conversão apenas pode ocorrer via oxidação de 8
sengundo Tashiro e colaboradores.43
Para a formação de 6 temos, uma reação térmica de cicloadição com 6 elétrons ,
portanto uma reação anti-periplanar com formação do produto endo exclusivamente
devido ao efeito de Cieplak,43 ou seja, a estabilização do orbital antiligante do dieno pelo
par de elétrons não ligante do S (Figura 22).
Figura 22. Efeito de Cieplak.
A formação de trímeros reportado por Mingdon e colaboradores38 não foi
observada nesses estudos, um dos motivos para a não formação pode ser as interações
repulsivas do sítios de carga, inviabilizando uma molécula pequena com três cargas
positivas.
58
2.3.4. Conclusão
A partir dos intermediários interceptados no monitoramento primeiro por ESI-
MS/MS, foi possível interceptar a formação de sulfóxido, para o tiofeno marcado assim
como oxidação dos dímeros e trímeros. Mas ocorreram reações paralelas desde a síntese
do tiofeno marcado.
Duas alterações foram necessárias para poder realizar o estudo completo da
dessulfurização, a primeira foi alterar o haleto (Br– por Cl–) empregado na síntese, para
evitar a dimerização do tiofeno, e a segunda foi a troca do contra íon (Cl– por BF6–), para
evitar oxidação do haleto e incorporação do mesmo ao tiofeno.
A partir do espectros de ESI-MS/MS, foi possível determinar três rotas para a
dessulfurização do tiofeno. Essas rotas estão relacionadas com os três diferentes dímeros
possíveis de ser formado, dois homodímeros (4 e 7) a partir do sulfóxido (2) e da sulfona
(3) respectivamente e os isômeros constitucional (heterodímeros 6 ou 8), formados a
partir da oxidação de 7 ou dimerização entre 2 e 3 apenas para 6.
Já a formação de trímeros não foi observada, provavelmente pela repulsão das
etiquetas de cargas dos tiofenos.
2.4. Estudo da Fragmentação das Rodaminas
2.4.1. Introdução
A Rodamina B (RB) está entre os corantes sintéticos mais antigos e mais
comumente usados. Foi amplamente utilizada como corante em produtos têxteis e
indústrias de plástico, e também é um corante fluorescente aplicado na indústria química
orgânica e em estudos biológicos. A Rodamina 6G (R6G), também conhecida por
Rodamina 590, é amplamente utilizado como marcador de fluorescência e como um meio
de emissão de laser.44
Na ciência forense, estes tipos de rodaminas disponíveis comercialmente são usados por
alguns bancos como um recurso de segurança em caixas automáticas (Anti- theft Device
for Machine - ATM).45 Há casos em que estes corantes foram encontrados utilizados
ilegalmente pelos mercados de doces ou padeiros para colorir os diferentes produtos de
confeitaria.46
59
A Rodamina possui uma estrutura complexa e estável. Identificar o mecanismo de
fragmentação de um íon nem sempre é trivial, principalmente quando a sua estrutura é
estável, devido aos tipos de átomos e ligações presentes que requerem altas energias de
fragmentação. Isso leva a diversos fragmentos e esses nem sempre advêm de perdas
óbvias.
Portanto, decidimos estudar isômeros RB e R6G, que apresentam estrutura
policíclica aromática, polifuncionalizada e com pequenas ramificações alquílicas (Figura
23).
Figura 23. Estrutura da Rodamina B e 6G.
A Caracterização da RB apresenta muitas discussões na literatura quando utilizado
MS. Trabalhos envolvendo analisadores de baixa resolução atribuem a perda de 44 Da a
uma molécula de CO2 (que seria uma perda lógica, para moléculas catiônicas), em
contrapartida, trabalhos com analisadores de alta resolução atribuem a perda à liberação
de C3H8. Para a perda de propano, duas propostas são descritas, via anel de 4 membros
ou via radicalar como apresentado no Esquema 11.47
60
Esquema 11. Possíveis vias para a perda de propano, A) via passo concertado e B) via
radicalar.
2.4.2. Experimental
Foram preparadas soluções de RB e R6G em metanol grau HPLC-Sigma-Aldrich,
Brazil Ltda, de pureza 95%, e injetados diretamente no espectrômetro de massas
OrbitrapTM através da fonte ESI, com vazão de 3.0 µL.min-1. A energia de colisão aplicada
na fragmentação variou de 45.00-55.00.
2.4.3. Resultados e Discussão
Primeiramente foi analisada a RB, que apresentou como íon mais intenso o de m/z
399, e outros com baixa intensidade. Esses íons menos intensos são muito relevantes
quando se pretende fazer um estudo do mecanismo de fragmentação (Figura 24), uma
vez que estes nos auxiliam na interpretação da fragmentação.
61
300 340 380 420 460 500 m/z
0
20
40
60
80
100
Re
lati
ve
Ab
un
da
nce
399.17
443.23
413.18 385.15 355.11
371.14 427.20
415.20
Figura 24. Espectro de ESI-MS(MS)n da RB.
Analisar essas massas sem um olhar mais minuncioso, pode levar a equívocos
quanto às reais fragmentações, ou mesmo a desprezar mecanismos paralelos com
perdas “isobáricas”, ou seja, de mesma massa nominal. Portanto foi feito uma ampliação
de 0.3 Da de todos os íons significativos, e desses, apenas 2 espectros apresentaram
duas fragmentações que podem ser confundidas em analisadores de baixa resolução,
que não resolveriam massas tão próximas (Figura 25).
a) b)
Figura 25. Ampliação do íons, a) m/z 371 e b) m/z 355 da RB.
Na Figura 25 a), temos dois íons com defeito de massa muito próximos, que se
referem à perda radicalar de CH2N (m/z 371.15054) e a outra à perda neutra de C2H4 (m/z
62
371.13821). Para o fragmento de m/z 355, foram detectadas tanto a perda de CO2 quanto
de C3H8. Para resolver essas massas temos que ter uma resolução mínima de 60.000, de
acordo com a fórmula Rmin= (2m /∆ m).
A Tabela 3 reporta detalhadamente como foram feitas as atribuições das
fragmentações de acordo com as diferenças de massas e seus defeitos de massas para
perdas “isobáricas”, obtidos pelo espectro de MS/MS de alta resolução.
Tabela 3. Dados de alta resolução e exatidão de massas para a RB.
Íon Precursor Íon Produto Intensidade Diferença
de Massa
Perda Mecanismo de
Fragmentação
Massa
Teórica
Erro (Da)
443,23190 442.22420 2.00e3 1.00770 H Radicalar 1.00783 0.00013
443,23190 428.20842 4.16e3 15.02333 CH3 Radicalar 15.02348 0.00015
443,23190 427,20050 7.54e5 16,03140 CH4 Radicalar 16,03121 -0,00019
443,23190 415,20038 7.73e5 28,03152 C2H4 Perda Neutra 28,03130 -0,00022
443,23190 414.19299 2.54e3 29.03891 C2H5 Radicalar 29.03913 0,00022
443,23190 413,18478 4.72e6 30,04712 C2H6 Radicalar 30,04695 -0,00017
443,23190 399,16940 4.78e7 44,06250 C3H8 Radicalar 44,06260 0,00010
413,18478 385,15344 2.58e6 28,03134 C2H4 Perda Neutra 28,03130 -0,00004
399,16919 371,15054 2.78e5 28,01865 CH2N Radicalar 28,01872 0,00007
399,16940 371,13821 5.97e5 28,03119 C2H4 Perda Neutra 28,03130 0,00011
399,16940 355,17929 1.33e5 43,99011 CO2 Perda Neutra 43,98983 -0,00028
399,16940 355,10684 1.87e6 44,06256 C3H8 Radicalar 44,06260 0,00004
Foram detectadas fragmentações radicalares, tipo de fragmentação comum em
moléculas ionizadas por electron ionization (EI), pois, formam íons com camada aberta
(íons positivo-radicalares). Quando a ionização forma íons catiônicos, como neste caso da
RB, normalmente ocorre a fragmentação com perdas neutras, mantendo a camada
fechada (regra do elétron par). Esse mecanismo de fragmentação radicalar se deve à alta
estabilidade da carga, pela ressonância entre os anéis, levando a perdas não óbvias na
63
fragmentação dessa estrutura, formando de íons distônicos, ou seja, espécies em que a
carga e o radical estão em átomos diferentes. Portanto, ocorre a formação do m/z 399 por
vias radicalares, devido à perda sequencial de radicais etila e metila .
Por outro lado, a formação do íon m/z 399 pode ocorrer por uma via mista, iniciado
por um passo concertado com eliminação de C2H4, seguido por uma etapa radicalar com
eliminação de H e CH3. O passo concertado pode ocorrer por meio de um estado de
transição altamente energético (4 membros), e neste caso especial, ocorre prototropismo
auxiliado por sistema , similar ao descrito por Schroder e colaboradores.48
Esses dois mecanismos explicam a formação de todos os fragmentos da RB.
Sendo pela via de prototropismo, as perdas neutras de CO2 e C2H4, e os demais por via
radicalar, com formação de íons distônicos.
Em seguida foi estudada a fragmentação da R6G, um isômero da RB, que leva à
formação de alguns íons produtos diferentes, mas que deve seguir os mesmos princípios
mecanísticos (Figura 26).
300 340 380 420 460 500 m/z
0
20
40
60
80
100
Rela
tive
Ab
un
da
nce
415.20
443.23
341.16
386.16
312.13 357.12 327.15 399.17 371.14
Figura 26. Espectro de ESI-MS(MS)n da R6G.
64
Para essa molécula temos m/z 415,20 como íon base do espectro, diferentemente
da RB, o que era esperado uma vez que a perda de C3H8 é dificultada por não possuir 2
radicais etila no mesmo nitrogênio. A formação do íon base é facilmente explicada pela
transferência de H do radical etil da função éster para a carbonila via anel de seis
membros tipo McLafferty.
O mesmo procedimento anteriormente descrito foi feito, e apenas um espectro foi
adquirido, que apresentou 3 diferentes íons detectados, m/z 371,13880, m/z 371,15080 e
m/z 371,21131 (Figura 27).
a)
Figura 27. Ampliação do íon m/z 371 da R6G.
A formação desses íons ocorre por diferentes íons precursores, com perdas de
C2H5, CH2N e CO2 respectivamente. Assim como para a RB, a Tabela 4 mostra
resumidamente para a R6G todos os íons de m/z detectados, as atribuições a cada
fragmentação assim como suas vias de formação.
Tabela 4. Dados de alta resolução e exatidão de massas para a R6G.
Íon Precursor Íon Produto Intensidade Diferença
de Massa
Perda Mecanismo de
Fragmentação
Massa
Teórica
Erro (Da)
443,23223 415,20109 7.96e8 28,03114 C2H4 Perda Neutra 28,03130 0,00016
415,20109 400.17779 9.69e6 15.02330 CH3 Radicalar 15,02348 0.00018
415,20109 399,16980 1.53e7 16,03129 CH4 Radicalar 16,03121 -0,00008
415,20109 386,16200 8.31e7 29,03909 C2H5 Radicalar 29,03913 0,00004
415,20109 385,15423 7.58e6 30,04686 C2H6 Radicalar 30,04695 0,00009
65
415,20109 371,21131 2.09e6 43,98978 CO2 Perda Neutra 43,98983 0,00005
399,16980 371,15080 5.61e6 28,01900 CH2N Radicalar 28,01872 -0,00028
386,16200 371,13880 1.17e7 15,02320 CH3 Radicalar 15,02348 0,00028
385,15423 357,12295 4.05e7 28,03128 C2H4 Perda Neutra 28,03130 0,00002
385,15423 341,16454 1.30e8 43,98969 CO2 Perda Neutra 43,98983 0,00014
371,13880 327,14885 2.44e7 43,98995 CO2 Perda Neutra 43,98983 -0,00012
341,16454 312,12558 4.55e7 29,03896 C2H5 Radicalar 29,03913 0,00017
De acordo com os íons detectados, mecanismos de fragmentação foram propostos,
para os dois isômeros: RB e R6G, sendo a Figura 28 correspondente às fragmentações
radicalares e a Figura 29 às perdas neutras.
66
Figura 28. Fragmentações radicalares, A) RB e B) R6G.
67
Figura 29. Perda Neutra para a RB em A) e B), e para a R6G em A) e C).
2.4.4. Conclusão
Foi possível determinar as vias mecanísticas para a formação dos principais
fragmentos detectados no espectro de MS/MS por CID dos isômeros RB e R6G. As
fragmentações radicalares são predominantes, mesmo sendo uma molécula de camada
fechada, indo contra a regra do octeto. Apesar das fragmentações radicalares serem
predominantes, temos também transposições 1,3–H via anel de 4 membros, auxiliadas
pelo sistema π, e transposições 1,5–H para a R6G em específico.
Constatou-se também que há perdas de CO2 para ambos isômeros, e uma nova
fragmentação radicalar com perda de CH2N, que podem ser confundidas juntamente com
a perda de C3H8 em analisadores com resolução insuficiente.
68
3. Imageamento com Novas Técnicas de Ionização
3.1. Introdução
O imageamento por espectrometria de massas (mass spectrometry imaging – MSI),
consiste na combinação entre a informação molecular com a distribuição espacial,
proporcionando diferenciar estruturas (tecidos) de acordo com suas diferentes
composições moleculares.49 A importância do MSI pode ser dimensionada pela Figura
30 que mostra sua crescente aplicação com o decorrer dos anos.
Figura 30. Número de publicações em MSI. (Web of Science: 28/01/2016_ mass
spectrometry e imaging).
Suas primeiras aplicações foram na década de 70 com a fonte de ionização SIMS
(secondary ion mass spectrometry), uma técnica que permite análises tridimencionais e
com alta resolução espacial. Porém, apresenta algumas desvantagens como a faixa de
massa ionizável (ioniza moléculas de baixa massa molecular) e a alta fragmentação
dificultando a identificação das moléculas precurssoras.50
69
Essa limitações foram sanadas com a fonte de MALDI, que permite a ionização
sem fragmentação e uma alta faixa de massa, permitindo a análise desde lipídeos até
proteínas. Seus principais inconvenientes são espectros com muito ruído abaixo de 600
Da, o que dificulta a análise de lipídeos de baixa massa molecular. A escolha da matriz
também é um importante fator a ser considerado, pois, pode influenciar nas classes de
moléculas ionizadas.51
Entretanto ambas as técnicas, SIMS e MALDI, necesssitam de um sistema de
ionização sob vácuo, e dessa forma aparatos elaborados e sofisticados são necessários.
Uma alternativa para essas técnicas veio com o surgimento de novas técnicas de
ionização ambiente como a fonte DESI, que também possibilita a realização de uma
análise mais rápida.52
Apesar de não ter o poder de resolução espacial que a fonte SIMS possui e a
capacidade de ionizar moléculas de alta massa molecular que a fonte de MALDI tem,
DESI apresenta uma vantagem muito significante que é a análise em tempo real, devido
ao pouco preparo requerido para análise, característica que proporcionou a aplicação
desta técnica em diagnósticos na área clínica de oncologia simultaneamente à
intervenção cirúrgica.53
Nos estudos de MSI com fontes de ionização ambiente em tecido animal, algumas
classes de compostos se destacam, como ácidos graxos (AGs), triglicerídeos (TAGs) e
fosfolipídeos (FLs), principalmente pela importância metabólica dessas moléculas (Figura
31).54
Figura 31. Padrão estrutural de A) triglicerídeos, B) ácidos graxos e C) fosfolipídeos.42
70
Impulsionado pelo alto desempenho e praticidade, recentemente diversas fontes de
ionização ambiente vêm sendo desenvolvidas, sempre buscando a ionização de novas
classes de compostos, maior poder de resolução espacial, e outros fatores que possam
aumentar a eficiência e o campo de atuação dessas fontes de ionização ambiente. Dentre
essas a fonte de EASI tem se mostrado eficiente para moléculas que não dependem
diretamente da acidez ou basicidade, ou seja, moléculas que já apresentam carga
(cátions e ânions) são favorecidas por essa técnica em comparação à fonte de DESI.55
Janfelt e Nørgaard 55 reportaram um estudo comparativo entre DESI e EASI. A
fonte EASI empregada nesse estudo foi uma adaptação da fonte DESI, mesma fonte,
porém, sem voltagem aplicada ao capilar de formação do eletrospray. Para todas as
amostras analisadas em seus estudos a EASI apresenta resultados inferiores aos da
DESI quanto ao número de íons detectados, e com intensidade muito inferior com
exceção dos corantes Azul Básico 7 e Rodamina B. Os autores concluem que a fonte
EASI teria menor eficiência de ionização que a fonte DESI. Esse trabalho almeja
comparar DESI e EASI, sendo utilizada a fonte de EASI propriamente e não a fonte de
DESI adaptada.
3.2. Parte Experimental
Preparo dos Padrões
Foram preparadas soluções equimolares dos padrões dos AGs (oleico, linoleico e
linolénico), TAGs (trioleína, tripalmitina, triestearina e trilinoleína), e FLs (fosfatidilcolina -
ovo, esfingomielina - porco, 1-palmitoil-2-oleoil-sn-3-fosfocolina e 1,2-dipalmitoil-sn-
glicero-3-fosfocolina) e feitos spots de 2 µL nas superfícies (vidro e papel).
Preparo do Corte Histológico
Para as análises de tecido cerebral, o tecido foi previamente congelado e em
seguida feito cortes histológicos de 14 µm com o criostato LEICA CM1900, também foram
utilizados vidro e papel como suportes para a análise.
Parâmetros das Fontes DESI e EASI
71
Tabela 5. Condições padrões utilizadas na aquisição dos espectros de massas para as
fontes DESI e EASI
Parâmetro DESI EASI
Capilar Interno* diâmetro interno (µm) 50 100
Capilar Interno* diâmetro externo (µm) 150 200
Capilar Externo* diâmetro interno (µm) 250 373
Capilar Externo* diâmetro externo (µm) 350 565
Vazão do Gás volume (L.min-1) 0,65 2,5
Vazão do Gás pressão (psi) 160 110
Vazão do Gás área (mm2) 0,0314 0,0776
Gás de Nebulização velocidade (m.s-1) 350 536
Voltagem do Spray (kV) modo negativo
modo positivo
-3,2
+5,0
0
0
Vazão do Solvente (µL.min-
1)
papel
vidro
20
3
20
3
*Silica fundida
3.3. Resultados e Discussão
Primeiramente realizamos análises dos padrões de Ags, TAGs e FLs
separadamente e suas respectivas misturas por MSI, nas melhores condições de vazão
do solvente em cada um dos dois suportes: papel e vidro, em ambas as fontes: DESI e
EASI (Figuras 32, 33 e 34), a fim de avaliar a fonte de ionização. Para esse estudo spots
de cada padrão e seu respectivo mix foram aplicados no suporte e feito a análise.
72
Figura 32. MSI dos padrões de AGs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d) EASI,
sendo à direita o mix dos padrões.
Figura 33. MSI dos padrões de FLs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d) EASI,
sendo à direita o mix dos padrões.
73
Figura 34. MSI dos padrões de TAGs analisados por a) e c) DESI, e por b) e d) EASI,
sendo à direita o mix dos padrões.
É possível observar que ocorre supressão iônica similar, tanto com DESI quanto
com EASI, e a intensidade relativa dos compostos é muito semelhante. Para os AGs e os
TAGs, o EASI apresenta maior arraste (dispersão lateral), principalmente quando utilizado
o vidro como suporte, devido às características dos analitos, em contrapartida para os FLs
tanto DESI quanto EASI fornecem excelentes resultados (alta resolução lateral).
Em seguida comparamos os perfis das misturas equimolares de AGs (Figura 35),
FLs (Figura 36) e TAGs (Figura 37).
74
Figura 35. Espectros de ESI(-) – MS dos padrões de ácidos graxos em misturas
equimolares, onde A) DESI-vidro, B) EASI-vidro, C) DESI-papel, D) EASI-papel.
É possível observar o alto grau de similaridade entre os espectros da Figura 35 A)
e B), tanto pelos íons produzidos quanto pela intensidade relativa dos mesmos. Quanto a
27 C) e D), temos uma pequena inversão entre os íons base, m/z 293.0 e 281.1
respectivamente, porém o perfil dos íons é o mesmo e com intensidades relativa
semelhantes.
75
Figura 36. Espectros de ESI (+) – MS dos padrões de fosfolipídeos em misturas
equimolares, onde A) DESI-vidro, B) EASI-vidro, C) DESI-papel, D) EASI-papel.
Na Figura 36, podemos observar que também existe um alto grau de similaridade
quando utilizado o vidro como suporte, como mostrado em A) e B), com predominância
dos adutos de Na+ sobre as espécies protonadas, sendo que utilizando DESI, as
intensidades realtivas das espécies protonadas é ligeiramente maior.
Quando foi utilizado o suporte papel Figura 36 C) e D), foi observada uma maior
divergência em relação às intensidades relativas do íons, enquanto a fonte DESI 28 C)
apresentou predominância de espécies protonadas a fonte EASI D) apresentou um
espectro com intensidades mais equilibradas de espécies protonadas e sodiadas, porém,
com leve preferência por adutos de Na+. Algumas espécies potassiadas também foram
detectadas.
76
Figura 37. Espectros de ESI (+) – MS dos padrões de triglicerídeos em misturas
equimolares, onde A) DESI-vidro, B) EASI-vidro, C) DESI-papel, D) EASI-papel.
Podemos observar na Figura 37 alta similaridade dos perfis. A exemplo dos
demais padrões, para ambos os suportes (vidro e papel), foram identificadas apenas
espécies amoniadas ou sodiadas. Adutos de Na+ são os íons base em 29 A) e B), m/z
901.7 em ambos espectros, e observou-se alta similaridade entre as intensidades
relativas dos íons. Por outro lado 29 C) e D) apresentam predominância de espécies
amoniadas, com inversão de íon base do espectro, m/z 896.8 e 902.8 respectivamente.
A intensidade absoluta dos íons foi calculada para analisar a eficiência de
ionização em ambas as técnicas (DESI e EASI) (Tabela 5). Para a comparação de
77
intensidade absoluta de cada espectro foi selecionada a corrente total iônica (TIC) de três
corridas da análise de MSI, a corrida central de cada análise, 1 mm acima e 1 mm abaixo
da mesma. Foi selecionado para esse estudo o íon base.
Tabela 6. Espécies detectadas em cada espectro, íons base e médias das intensidades
absolutas dos íons base de cada espectro, das diferentes misturas de padrões em seus
respectivos suportes.
Padrão Suporte Técnica
Espécies
identificadas Íons mais intenso
1 mm antes do
centro Centro
1 mm depois do
centro Média
AGs (-)
Vidro
DESI - H+ 281.1 (M-H)
+ 1,96E+06 1,48E+06 1,26E+06 1,57E+06
EASI - H+ 281.1 (M-H)
+ 1,61E+07 1,33E+07 1,35E+07 1,43E+07
Papel
DESI - H+ 293.0 (M-H)
+ 1,23E+05 1,50E+05 1,19E+05 1,31E+05
EASI - H+ 281.1 (M-H)
+ 5,28E+06 5,86E+06 7,37E+06 6,17E+06
FLs (+)
Vidro
DESI H+ ,Na
+ 782.6 (M+Na)
+ 6,28E+05 5,84E+05 5,81E+05 5,98E+05
EASI H+ ,Na
+ 782.6 (M+Na)
+ 5,01E+05 1,79E+06 2,55E+05 8,49E+05
Papel
DESI H+ ,Na
+ ,K
+ 760.6 (M+H)
+ 4,15E+05 3,41E+05 5,56E+05 4,37E+05
EASI H+ ,Na
+ ,K
+ 782.6 (M+Na)
+ 3,17E+05 3,79E+05 3,67E+05 3,54E+05
TAGs (+)
Vidro
DESI NH4+ ,Na
+ 901.7 (M+Na)
+ 6,45E+06 6,69E+06 7,09E+06 6,74E+06
EASI NH4+ ,Na
+ 901.7 (M+Na)
+ 3,32E+06 3,66E+06 3,94E+06 3,64E+06
Papel
DESI NH4+ ,Na
+ 896.8 (M+NH4)
+ 4,77E+05 3,29E+05 3,78E+05 3,95E+05
EASI NH4+ ,Na
+ 902.8 (M+NH4)
+ 2,52E+06 2,50E+06 2,49E+06 2,50E+06
De acordo com a Tabela 6 podemos observar que as intensidades absoluta das
triplicatas não apresentam uma variação grande para a maioria das corridas (apenas a
fonte EASI nas análises de AGs no suporte vidro apresentou uma variação de 10x entre
as intensidades). Os AGs tem intensidades superiores em 10 e 50 vezes para os suportes
vidro e papel respectivamente, quando utilizada a fonte EASI. Para FLs, DESI e EASI
apresentam valores muito semelhantes. Para os TAGs, houve uma discrepância entre os
suportes, no vidro a DESI apresentou intensidade ligeiramente maior (2 vezes), já para o
papel a EASI obteve intensidade 6 vezes maior.
78
Pôde-se observar uma predominância de adutos de Na+ nos TAGs no vidro, em
relação às preferência por espécies amoniadas no papel. Quanto aos PFs, prevalecem
íons Na+, o que pode se dar pela melhor coordenação entre as carbonilas e o cátion,
devido a seu raio atômico. A formação de espécies amoniadas poderia ocorrer com a
mesma estabilidade que nos TGs, porém nesse caso temos uma interação íon-molécula e
não mais iônica.
A Figura 38 mostra um estudo de caso, no qual dois cortes histológicos de cérebro
de rato foram submetidos às análises de DESI e EASI nos modos positivo e negativo.
Figura 38. MSI de cérebro de rato: a) e b) m/z 782.540, e) e f) m/z 683,504, c), d), g) e h)
m/z 303,208.
Nos estudos de caso, é possível visualizar algumas falhas durante as corridas,
porém a resolução espacial em ambos suportes com ambas as fontes de ionização foram
bons, além de que a ionização do EASI sob baixa vazão no suporte vidro não afetou seu
desempenho, assim como a alta vazão no suporte papel não diminuiu a resolução
espacial.
3.4. Conclusão
Nesse estudo comparativo entre as fontes de ionização DESI e EASI, foi possível
definir que a configuração da fonte de ionização foi o fator determinante para a ionização.
79
A fonte EASI foi tão eficiente quanto ou melhor que a fonte DESI, em realação às
intensidades absolutas, o grau de supressão iônica e o perfil de ionização relativa.
O estudo de caso comprova que o EASI pode ser empregado no MSI, sem perda
da qualidade de informação, com resolução espacial mesmo sob alta vazão de solvente,
uma vez que a dessolvatação é alta o suficiente para evitar a formação de um spot
grande.
4. Conclusões Gerais
A utilização de espectrometria de massas de alta e altíssima resolução juntamente
com a exatidão de massa permite estudos em diferentes áreas da ciência, como mostrado
nesse trabalho, que foi abordado desde estudos mecanísticos de reações orgânicas e
mecanismo de fragmentação até estudos com aplicações biológicas, como o de
ionização, realizado por duas diferentes fontes de ionização ambiente.
Para o estudo de mecanismo de reação de N-metilação e N-metoxicarboxilação
apenas a alta resolução foi suficiente para identificar os intermediários e com o MS
tandem caracterizar todos os intermediários.
Por outro lado foi necessário a altíssima resolução para diferenciar reagente e
produto da reação de dessulfurização do tiofeno, uma vez que a diferença da razão
massa/carga das duas molélucas <0,01 Da. Também foi necessário a análise dos
isotopólogos para determinar a formação de homodímeros, uma vez que esses
apresentam mesma m/z que os seus respectivos monômeros. Todos os intermediários
foram devidamente caracterizados por MS tandem.
Para os estudos de fragmentações das Rodaminas, o uso da altíssima resolução
foi suficiente para determinar a diversidade de rotas para a fragmentação e seus diversos
íons produto. Fragmentações radicalares também podem ocorrer em moléculas com sítio
de carga quando essas são muito estáveis, contrariando a regra do octeto. Essas perdas
podem inclusive convergir em estruturas “isobáricas”, que apresentam mesma massa
80
nominal, porém, são provenientes de diferentes tipos de fragmentação com diferentes
perdas.
O último estudo mostra que os avanços da MS, nem sempre se dá no campo do
analisador e sim também no sistema de inserção de amostras e suas aplicações, como é
o caso da aplicação de uma fonte de ionização EASI (homemade), que é muito mais
simples, devido a não aplicação de voltage e trabalha com pressões mais brandas de gás,
em imageamento com o mesmo potencial que a fonte comercial DESI.
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ESI(+)-MS do indol.
84
ESI(+)-MS da reação t = 1 h.
ESI(+)-MS da reação t = 2 h.
ESI(+)-MS da reação t = 3 h.
85
ESI(+)-MS da reação t = 4 h.
ESI(+)-MS da reação t = 5 h.
ESI(+)-MS da reação t = 6 h.
86
ESI(+)-MS da reação t = 8 h.
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 127.
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 147.
87
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 186.
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 244.
88
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 271.
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 299.
89
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 317.
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 370.
5.1. N-metilação e N-metoxicarboxilação do indol com DBU
90
ESI(+)-MS da reação t = 1 h.
ESI(+)-MS da reação t = 2 h.
91
ESI(+)-MS da reação t = 3 h.
ESI(+)-MS da reação t = 1 h.
92
Figure 23. ESI(+)-MS of the reaction at 5h.
ESI(+)-MS da reação t = 6 h.
.
93
ESI(+)-MS da reação t = 8 h.
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 118.
94
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 132.
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 153.
95
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 167.
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 176.
96
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 211.
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 225.
5.2. Dessulfurização oxidativa do tiofeno com MTO
97
RMN 1H do 2- hidroximetiltiofeno.
RMN 13C do 2-hidroximetiltiofeno
98
RMN H1 do 2-cloro metiltiofeno.
RMN 13C do 2-cloro metiltiofeno.
99
RMN 1H do 2- metil-1-(2’-tiofenilmetil) imidazolium hexafluorofosfato (4).
RMN 13C do 2- metil-1-(2’-tiofenilmetil) imidazolium hexafluorofosfato (4).
100
ESI(+)-MS da reação t = 120 min.
ESI(+)-MS da reação t = 180 min.
100 160 220 280 340 400 m/z
0
20
40
60
80
100
Rela
tive
Ab
un
da
nce
179.07
203.06
141.07
100 160 220 280 340 400 m/z
0
20
40
60
80
100
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
179.07
203.06
141.07
101
50 90 130 170 210 250 m/z
0
20
40
60
80
100
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
97.01
179.06
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 179 no t = 0 min.
60 100 140 180 220 260 300 340 380 m/z
0
20
40
60
80
100
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
97.01
83.06
121.08 179.06
275.09 193.03
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 179 no t = 120 min.
102
60 100 140 180 220 260 300 340 380 m/z
0
20
40
60
80
100
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
83.06
96.07 195.57
172.57 121.08 148.58 216.12 244.12
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 195,5.
60 100 140 180 220 260 300 340 380 m/z
0
20
40
60
80
100
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
186.05
125.01
203.05 109.01 97.01
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 203.
103
60 100 140 180 220 260 300 340 380 m/z
0
20
40
60
80
100
Rela
tive
Ab
un
da
nce
83.06
195.57 96.07 181.57
211.58 121.08 134.08 173.11 301.09 319.09
ESI(+)-MS(/MS) do íon m/z 211,5