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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
CONRADO DE CAMPOS GONÇALVES
CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FUNCIONAL DE CHAPERONAS
ESSENCIAIS PARA A SOLUBILIZAÇÃO DE AGREGADOS PROTEICOS:
O PAPEL DE CHIP DE SORGHUM BICOLOR E DO SISTEMA DE
DESAGREGAÇÃO HUMANO ENVOLVENDO HSPB1.
CAMPINAS
2018
CONRADO DE CAMPOS GONÇALVES
CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FUNCIONAL DE CHAPERONAS ESSENCIAIS
PARA A SOLUBILIZAÇÃO DE AGREGADOS PROTEICOS: O PAPEL DE CHIP DE
SORGHUM BICOLOR E DO SISTEMA DE DESAGREGAÇÃO HUMANO
ENVOLVENDO HSPB1.
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Biologia Funcional e Molecular, na Área de Bioquímica.
Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO CONRADO DE CAMPOS GONÇALVES E ORIENTADA PELO PROF. DR. CARLOS HENRIQUE INÁCIO RAMOS
CAMPINAS 2018
Campinas, 29 de agosto de 2018
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos
Prof. Dr. Cláudio Chrysostomo Werneck
Profa. Dra. Ljubica Tasic
Profa. Dra. Juliana Helena Costa Smetana
Prof. Dr. Vadim Viviani
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
“Don’t panic”
Douglas Adams
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),
que tornou possível a realização desta tese de doutorado através do apoio financeiro
concedido pela bolsa de doutorado no país (processo 2014/00076-0) e pela bolsa estágio de
pesquisa no exterior (BEPE - processo 2016/03764-0).
À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) agradeço imensamente pela
oportunidade de frequentar desde a graduação uma das melhores universidades do país, o
que me propiciou um profundo crescimento profissional e humano. Em particular, agradeço
aos Institutos de Biologia e de Química, pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia
Funcional e Molecular e pela magnífica infra-estrutura e equipe de funcionários que
possibilitam o desenvolvimento de pesquisa e ensino de altíssima qualidade. Também
agradeço aos funcionários e às instalações do CNPEM (Centro Nacional de Pesquisa em
Energia e Materiais), onde se situam o LNBio (Laboratório Nacional de Biociências) e o LNLS
(Laboratório Nacional de Luz Síncronton) e onde foram realizados alguns experimentos aqui
mostrados.
Ao Prof. Dr. Carlos H. I. Ramos pela oportunidade de trabalhar em seu
laboratório, pela orientação ao longo desses anos e pela extensa contribuição para minha
formação, tanto em caráter teórico e experimental, quanto em caráter científico,
estimulando o pensamento crítico e propondo novas idéias.
Ao Prof. Dr. Jason Young e à McGill University, pela possibilidade de desenvolver
um projeto de pesquisa numa das universidades mais conceituadas no exterior, contribuindo
para meu amadurecimento científico e pessoal.
Aos membros da banca examinadora pela contribuição intelectual nesta etapa
final do trabalho para que a tese ficasse a melhor possível, particularmente agradeço ao
Prof. Dr. Claudio C. Werneck e à Profa. Dra. Juliana H. C. Smetana que participaram também
da banca da qualificação.
A todos os demais professores que de alguma forma participaram da minha
formação, desde o ensino básico até a pós-graduação. Em especial agradeço à Profa. Dra.
Fernanda R. Gadelha e ao Prof. Dr. Eduardo de F. Peloso por terem despertado em mim,
durante a iniciação científica, o interesse e a curiosidade necessários no início da carreira; e
ao Prof. Dr. Marcelo C. Dornelas, meu orientador durante o mestrado, pelos diversos
ensinamentos em biologia molecular e vegetal.
A todos os integrantes, passados e presentes, do grupo de pesquisa do Prof.
Carlos Ramos pelo apoio, ótima convivência e compartilhamento de experiências ao longo
desses anos. Particularmente agradeço a minha amiga Aline, pelas conversas, conselhos e
boas horas de almoço (mesmo que no bandejão). Agradeço também aos membros do grupo
do Prof. Jason Young, Michael, Yogita, Jeff, Imad e Sam pela gentileza, recepção, ótima
convivência e por terem feito minha adaptação muito mais fácil.
Aos meus amigos proteicos, Anne, Gláucia, Natália e Josi, por todas as
discussões, gritarias, risadas, aconselhamentos e conversas no (café) laboratório e fora dele.
Com certeza vocês fizeram o trabalho cotidiano muito mais produtivo e divertido, “como se
fossemos amigos”. Em especial, agradeço muito a essas duas mulheres maravilhosas: à
Gláucia por ter sido minha primeira tutora no laboratório e por todos os ensinamentos
teóricos e experimentais, químicos e biofísicos que possibilitaram esta tese de acontecer; e à
Anne por toda organização, ajuda, discussões, puxões de orelhas e planejamentos de
experimentos.
A todos meus amigos, hoje espalhados pelo mundo, mas que fizeram cada um a
seu modo e por certo tempo parte da minha trajetória, auxiliando a moldar minha
personalidade e trazendo momentos de muita alegria, diversão, aprendizado e ternura. Aos
meus amigos conterrâneos, agradeço muito a amizade do Henrique, Felipe, Erick, Gabriel e
Grace. As minhas delícias Edilene, Nati, Lia, Erica, Naty, Vicky e Camila sou muito grato por
ter tido a oportunidade de saber que pessoas tão maravilhosas existem e passaram pelo
meu caminho. Agradeço ainda ao Hugo, Lucas e Victor, com quem morei a maior parte da
graduação. Foram momentos muito bons e sinto muito a falta de todos.
À toda minha família, todos essenciais nessa trajetória, sou grato por todo apoio,
amor e respeito oferecidos ao longo de toda minha vida. Em especial, agradeço muito aos
meus tios Paulo e Ana pelo carinho. A minha prima Calissa, por todo apoio, apreço e
amizade. As minhas tias madrinhas Tata e Nei pela atenção, carinho e pelo esforço por
terem feito parte da minha educação e da construção do meu caráter durante a infância e
adolescência.
Aos meus avós queridos, Ercília e Daniel, a quem dedico este trabalho, por todo
carinho, humildade e honestidade que me foram transmitidos de forma tão simples e
natural, algo que nenhum doutorado é capaz de ensinar.
Agradeço ao meu irmão Rômulo pelo ótimo convívio e por todas as discussões,
muitas vezes calorosas, mas certamente produtivas, sempre abrindo minha cabeça para
diferentes possibilidades e visões de mundo.
Ao meu pai, Cláudio, pelo respeito e amor a seu modo, pelo incentivo ao estudo
desde muito cedo e pelo orgulho que transpassa barreiras.
A minha mãe, Tânia, pelo amor, pela garra, por toda ajuda e pela luta incansável
para oferecer aos filhos sempre a melhor condição de vida possível. Certamente minha mãe
personifica os conceitos de dedicação, abnegação e amor incondicional.
Ao meu companheiro, Fabilo, pelo conforto, paciência, amizade, amor e, acima
de tudo, pelo companheirismo em todas as horas, nos longos planos traçados para o futuro,
nos momentos de dificuldades e frustrações e nas decisões mais dificieis a serem tomadas.
E por fim, aos meus eternos nenéns, Lana e Marvin, pelo olhar, inocência,
lealdade e amor incontestáveis e impossíveis de serem encontrados em seres humanos.
Muito obrigado a todos.
Conrado de Campos Gonçalves
RESUMO
A regulação da homeostase celular realizada pelo sistema de controle de qualidade proteico (PQC) é
muito complexa e depende da ação de múltiplos processos orquestrados tanto pelas chaperonas
moleculares quando pelo sistema ubiquitina-proteosomo. Em condições metabólicas normais, mas
principalmente em situações de estresse celular, é extremamente importante que todos esses
processos ocorram eficientemente, evitando assim o acúmulo de proteínas não funcionais que
podem gerar graves consequências para as células. Desse modo, o estudo estrutural e funcional das
proteínas que compõem o sistema PQC torna-se bastante relevante por produzir conhecimento com
alto potencial de gerar inovações terapêuticas e biotecnológicas. Neste trabalho, conduzimos nossos
estudos para a compreensão de duas proteínas muito importantes, cujas funções estão diretamente
relacionadas com o direcionamento do destino de substratos proteicos. Primeiramente, o objeto de
investigação foi a co-chaperona CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP). Assim, sua sequência gênica foi
identificada através da homologia com o ortólogo de Arabidopsis, clonada e utilizada para
superexpressão em E. coli. Após o estabelecimento de um protocolo de purificação, alguns
parâmetros conformacionais foram determinados. Nossos resultados indicam que essa co-chaperona
é um dímero alongado em solução, com estrutura rica em hélices-α e relativamente bem estável em
situações de estresse térmico. Além disso, caracterizamos a formação de complexos entre ela e a
chaperona Hsc70 e avaliamos sua atividade de auto-ubiquitinação e de ubiquitinação de outros
substratos proteicos. Outro alvo de investigação foi o papel da sHsp HspB1 no sistema humano de
desagregação de proteínas. Os resultados obtidos apoiam um modelo que explica o mecanismo de
desagregação no qual HspB1 ativada por fosforilação é responsável por co-agregar com
polipeptídeos desenovelados durante estresse térmico. Quando isso ocorre, o sistema da Hsp70,
formado por Hsp70, Hsp40 e Hsp110, é capaz de extrair peptídeos dos agregados e também
promover a dissociação de HspB1 em dímeros, sendo que esse processo permite uma desagregação
mais eficiente. Mostramos que a fosforilação de HspB1 é importante para ativação da proteína,
desestabilização dos oligômeros, mas não para a formação imediata de dímeros, a qual ocorre
durante o processo de desagregação, por estimulação das chaperonas. Os dímeros de HspB1 se
reorganizam espontaneamente em oligômeros permitindo o recomeço do ciclo para uma nova
rodada de desagregação, exceto para o mutante GPG onde a desestabilização foi forçada
artificialmente. De maneira geral, acreditamos que nossos resultados contribuem para o melhor
entendimento da relação entre estrutura e função de CHIP de uma planta e fornecem informação
para a compreensão do mecanismo de solubilização de agregados em células humanas.
ABSTRACT
The maintenance of cellular homeostasis by the protein quality control (PQC) system is very complex
and relies on multiple processes governed by molecular chaperones and ubiquitin-proteasome
system. During normal metabolic conditions, but especially during stress conditions, it is extremely
important that all these processes occur efficiently in the cell, avoiding the deposition of non-
functional polypeptides which may cause damage. Therefore, the investigation of structural and
functional aspects of proteins that belong to PQC system is quite relevant to gain information to
terapheutic and biotechnology innovation. Thus, in this work, we aim to understand two very
important proteins, whose functions are directly related to protein triage decisions in the cell. First,
we investigate details about the co-chaperone CHIP from Sorghum bicolor (SBCHIP) and report on the
sequence of the gene of interest identified through homology with the ortholog present in
Arabidopsis. Additionally, the gene was cloned, used for superexpression in E. coli and the protein
was purified and characterized as a dimer, rich in α-helix secondary structure and stable under
thermal stress conditions. We also characterized the assembly of SbCHIP and HsHsc70 in complexes
and evaluated SbCHIP activity of auto-ubiquitination and ubiquitination of other protein substrates.
In addition, our research focus was on the role of the human HspB1 in the protein disaggregation
activity of Hsp70 system. Taken together, our results support a model of disaggregation in which
unfolded polypeptide co-aggregates with oligomers of activated HspB1. Hsp70 and co-chaperones
(Hsp40 and Hsp110) extract the substrate from the aggregates, but also help to disassemble HspB1
into dimers, and this is required for efficient disaggregation. Activation of HspB1 by phosphorylation
is important to destabilize oligomers, but not for the immediate formation of dimers. We propose
that after disassembly aided by chaperones, HspB1 dimers reassemble spontaneously into oligomers,
which allows the cycle to restart for a new round of disaggregation, except for the GPG mutant. In
conclusion, the data presented here provides a better understanding of the relationship between
structure and function of CHIP from a plant and also contributes to the understanding of the
mechanism of solubilization of protein aggegates in human cells.
Sumário
Introdução geral ....................................................................................................................... 12
As proteínas e o enovelamento proteico ........................................................................................... 12
Chaperonas moleculares e sua importância para homeostase celular ............................................. 15
Capítulo 1. Caracterização da co-chaperona CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP) ................. 26
1.1. Introdução .............................................................................................................................. 26
1.2. Objetivos ................................................................................................................................ 34
1.3. Material e métodos ................................................................................................................ 35
1.4. Resultados .............................................................................................................................. 55
1.5. Discussão ................................................................................................................................ 77
1.6. Conclusões.............................................................................................................................. 88
Capítulo 2. O papel da HspB1 humana na desagregação de substrato pelo sistema da
Hsp70 ........................................................................................................................................ 90
2.1. Introdução .............................................................................................................................. 90
2.2. Objetivos ................................................................................................................................ 97
2.3. Material e métodos ................................................................................................................ 98
2.4. Resultados ............................................................................................................................ 106
2.5. Discussão .............................................................................................................................. 135
2.6. Conclusões............................................................................................................................ 146
Considerações finais ...............................................................................................................148
Referências bibliográficas .......................................................................................................151
Anexos .....................................................................................................................................163
12
Introdução geral
As proteínas e o enovelamento proteico
As proteínas constituem uma das classes de biomoléculas mais importantes e
abundantes encontradas em todos os seres vivos, participando de uma imensa diversidade
de processos celulares. Elas estão presentes em todas as partes da célula e exibem uma
ampla variedade de tamanhos, estruturas e funções (Voet e Voet, 2011). Alguns exemplos
dos papéis que as proteínas podem desempenhar são os fatores de transcrição,
responsáveis pela expressão e regulação da informação genética; as enzimas, responsáveis
por permitir que as reações químicas do metabolismo sejam realizadas; os canais seletivos
que controlam a entrada e saída de substâncias nas células; hormônios e neutransmissores
que agem como sinalizadores de informação intra e intercelular; anticorpos, importantes
para o reconhecimento de antígenos, viabilizando a existência do sistema imune; ou ainda
apresentam função estrutural, como colágeno e elastina (Marzzoco e Torres, 2011).
Na maioria dos casos, a função de uma proteína está intimamente relacionada
com a aquisição de uma estrutura tridimensional específica. Assim, para serem capazes de
executar tantas funções diferentes, as proteínas apresentam estruturas complexas e
sofisticadas que dependem fundamentalmente da sequência de aminoácidos que as
compõe, ou seja, de sua estrutura primária. A infinita possibilidade de combinações dos 20
aminoácidos que podem compor uma proteína possibilita essa imensa diversidade de
conformações tridimensionais, de forma que cada proteína possui uma sequência de
aminoácidos única que culmina em uma conformação específica, responsável por
determinar uma função em particular (Voet e Voet, 2011).
Até atingirem essa conformação nativa funcional, as proteínas se organizam em
diferentes níveis de estrutura. A estrutura primária, como foi dito, consiste apenas da
sequência de aminoácidos, os quais são ligados pela formação da ligação peptídica. Essa
ligação ocorre entre o grupamento amina de um aminoácido e o grupamento carboxila de
outro e apresenta um caráter planar (com ressonância como em ligações duplas), pelo qual
não é possível haver rotação do polipeptídeo. Apesar disso, as ligações que ocorrem entre o
grupo amina e o Cα e entre o Cα e a carbonila são ligações simples que podem rotacionar
em diferentes ângulos de torções, permitindo que as cadeias polipeptídicas assumam várias
orientações. Devido à possibilidade de torção dessas ligações e também a interações locais,
13
especialmente ligações de hidrogênio, entre os grupamentos amino e carbonila de um
resíduo com os mesmos grupamentos de resíduos próximos, são formadas as estruturas
secundárias. Hélices-α e folhas-β são as estruturas secundárias típicas formadas nas
proteínas, mas muitas outras podem existir, inclusive estruturas desordenadas (Voet e Voet,
2011).
A estrutura terciária ocorre pela organização tridimensional da cadeia
polipeptídica completa, neste caso predominam interações não locais das cadeias laterais
dos resíduos de aminoácidos que resultam no dobramento das estruturas secundárias.
Ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas e interações hidrofóbicas são muito
importantes para determinação da estrutura terciária. Finalmente, quando as proteínas são
formadas por mais de uma cadeia polipeptídica, seja pela organização em oligômeros ou
pela interação com outras proteínas, acontece a formação da estrutura quaternária (Voet e
Voet, 2011).
Dessa maneira, a conformação correta de uma proteína só pode ser alcançada
sob um conjunto particular de condições celulares através do processo denominado
enovelamento, o qual leva à formação de uma estrutura estável, com energia livre de Gibbs
mínima (Anfinsen, 1973). O enovelamento geralmente é um processo espontâneo que
ocorre devido a um fenômeno conhecido como colapso hidrofóbico, pelo qual os resíduos
hidrofóbicos de uma proteína são internalizados no cerne da estrutura, ao passo que os
resíduos polares e carregados se localizam na superfície da estrutura, expostos ao contato
com o solvente aquoso. O isolamento dos resíduos hidrofóbicos desse ambiente aquoso
estabiliza energeticamente a proteína e compensa termodinamicamente pela entropia
desfavorável causada pela formação de uma estrutura organizada (Levitt e Warshel, 1975;
Goloubinoff, 2014).
A complexidade envolvida no processo de enovelamento pode ser mais bem
compreendida através de um esquema de energia em forma de funil (Baldwin, 1995; Hartl et
al., 2011). Neste esquema (Figura 1), as proteínas desenoveladas encontram-se na região de
máxima energia livre. Durante o enovelamento, os polipeptídeos devem se organizar e
atingir níveis mais baixos de energia livre, pelo processo favorecido pelo colapso hidrofóbico
e definido pela sequência primária de cada proteína. Para isso, eles podem seguir diferentes
vias de enovelamento, atingindo diferentes estados intermediários. Para alcançar o estado
14
nativo enovelado, cada intermediário deve ultrapassar barreiras energéticas que muitas
vezes é possibilitada pelo auxílio das chaperonas moleculares.
Uma vez que o enovelamento depende de um ambiente aquoso
termodinamicamente favorável, a conformação de uma proteína pode não ser atingida ou
ainda pode ser perdida pelo seu desenovelamento completo ou parcial, causado por
mudanças nas condições ambientais. O ambiente celular é altamente concentrado e
populoso em termos de quantidade de proteína e, por isso, pode facilitar o
desenovelamento proteico e a formação de agregados. Essa condição pode ser ainda mais
estimulada sob situações de estresse que perturbam a homeostase da célula, como
variações osmóticas, de pH ou temperatura, por exemplo. (Ferreira e De Felice, 2001; Ramos
e Ferreira, 2005). Quando isso acontece, as proteínas expõem seus resíduos hidrofóbicos
que estavam internalizados, o que facilita a formação de agregados amorfos e/ou fibrilas
amilóides, que apesar de termodinamicamente favoráveis, geralmente são muito grandes e
bastante tóxicos para as células. Nestes casos, formas intermediárias de enovelamento (mal
enoveladas ou parcialmente desenoveladas) se tornam muito numerosas, favorecendo a
formação e deposição de agregados. O acúmulo intracelular de proteínas mal enoveladas
pode ser uma séria ameaça para a saúde dos organismos. A deposição de grandes agregados
provoca perda de função proteica e toxicidade, que pode culminar em diversos distúrbios,
como doenças neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer e fibrose cística), câncer e até
indução de apoptose (Ferreira e De Felice, 2001; Ramos e Ferreira, 2005; Tipping et al.,
2015).
15
Figura 1: Esquema de energia livre de Gibbs em forma de funil para o processo de enovelamento proteico. Proteínas desenoveladas encontram-se na região de máxima energia livre. Durante o enovelamento, os polipeptídeos devem atingir níveis mais baixos de energia livre, favorecido pelo colapso hidrofóbico e por sua sequência primária. Para isso, eles podem seguir diferentes vias de enovelamento, representadas pelas enrugações na superfície de energia do funil, atingindo diferentes estados intermediários. Para alcançar o estado nativo enovelado, cada intermediário deve ultrapassar barreiras energéticas, muitas vezes só possíveis através do auxílio das chaperonas moleculares. Em condições de estresse, o processo de agregação pode predominar, gerando espécies como agregados amorfos ou fibrilas amilóides, cuja formação, apesar de termodinamicamente favorável, pode ser muito tóxica e danosa para as células (adaptado de Gonçalves e Ramos, 2016).
Chaperonas moleculares e sua importância para homeostase celular
Uma complexa rede de proteínas, capaz de preservar a homeostase proteica
(proteostase) e evitar a deposição de agregados, está presente nas células de todos os seres
vivos constituindo o chamado Controle de Qualidade Proteico (protein quality control - PQC).
Esse sistema é responsável pela manutenção da proteostase maximizando o enovelamento
de polipeptídeos e eliminando aqueles danificados ou mal enovelados. Para isso, o PCQ é
formado pelo sistema de chaperonas moleculares e pelo sistema ubiquitina-proteosomo
(ubiquitin-proteasome system - UPS), os quais funcionam em conjunto, estabelecendo o
balanço perfeito entre enovelamento e degradação de proteínas celulares.
16
O funcionamento do UPS será discutido com mais detalhes no próximo capítulo,
então aqui serão exploradas as principais características e funções do sistema de chaperonas
moleculares. Por definição, uma chaperona molecular é “uma proteína que se liga e
estabiliza a conformação de outra proteína cliente instável, possibilitando seu correto
destino in vivo e facilitando os processos de enovelamento, oligomerização, transporte para
um compartimento subcelular e regulação da conformação em estados ativos e inativos”
(Hendrick e Hartl, 1993). Neste sentido, as chaperonas são capazes de realizar muitas
funções celulares fundamentais, entre elas: assegurar que polipeptídeos recém-sintetizados
atinjam o enovelamento correto do estado nativo, auxiliar a associação e dissociação de
complexos multiproteicos, translocação através de membranas de proteínas destinadas a
diferentes compartimentos celulares, prevenção da formação de agregados proteicos,
reenovelamento de polipeptídeos mal enovelados e ressolubilização de agregados formados
em situações de estresse (Hartl et al., 1992; Hartl e Hayer-Hartl, 2002; Tiroli-Cepeda e
Ramos, 2011).
Para que todas essas funções possam ser realizadas eficientemente existem
diversos tipos de chaperonas moleculares, organizadas em cinco famílias principais que são
nomeadas de acordo com a massa molecular do monômero em Hsp60, Hsp70, Hsp90,
Hsp100 e sHsps (Figura 2). O termo Hsp (de Heat shock protein) é derivado do fato de que as
primeiras chaperonas foram identificadas por terem sua expressão altamente elevada em
condições de estresse térmico. De fato, muitas chaperonas são altamente expressas em
diversas condições de estresse, mas também durante condições de alta síntese proteica,
como em divisão celular, por exemplo. Muitas delas ainda são expressas constitutivamente
durante o metabolismo normal das células, o que faz com que nem todas as chaperonas
sejam Hsps e vice-versa (Lindquist e Craig, 1988; Aldea et al., 2007).
Na grande maioria dos casos, as chaperonas funcionam sendo auxiliadas pelas
co-chaperonas. Interessantemente, as chaperonas são relativamente bem conservadas nos
diferentes organismos, tanto em sequência primária como em número de genes, de modo
que organismos unicelulares possuem um número de chaperonas semelhante ao de
organismos mais complexos. Em contrapartida, o número e a variedade das co-chaperonas
aumenta significativamente de acordo com a complexidade do organismo, o que
provavelmente foi necessário evolutivamente para que o PQC fosse capaz de lidar com a
17
maior complexidade intracelular dos organismos superiores. Dessa forma, as co-chaperonas
interagem de forma mais específica com proteínas clientes desenoveladas, prevenindo sua
agregação e entregando-as para a chaperona adequada. A interação entre chaperonas, co-
chaperonas e proteínas clientes forma grandes complexos, muito importantes para o
funcionamento adequado desse sistema (Bukau e Horwich, 1998; Taipale et al., 2014).
Figura 2: Esquema das principais famílias de chaperonas e suas funções nas células. Polipeptídeos nascentes desenovelados apresentam seus resíduos hidrofóbicos expostos e interagem com as chaperonas holders (geralmente as sHsps e as Hsp40). Estas entregam o substrato para o sistema da Hsp70 que pode enovelá-lo até seu estado nativo através do consumo de ATP, redistribuí-lo para outras enovelases como Hsp90 ou Hsp60, ou ainda enviá-los para degradação pelo sistema ubiquitina-proteosomo. Durante situações de estresse, podem ser formados agregados proteicos que são dissociados por desagregases como as Hsp100 e então direcionados para reenovelamento ou degradação (adaptado de Gonçalves e Ramos, 2016).
18
As chaperonas ainda podem ser classificadas de acordo com suas funções e
mecanismos de interação com o substrato em três classes principais (Figura 2): as
enovelases (ou foldases), as desagregases e as holders (Mayer, 2010; Tiroli-Cepeda e Ramos,
2011). Atualmente já se sabe que uma mesma chaperona ou um complexo multichaperona
pode apresentar mais de uma ou até todas essas funções, de forma que essa classificação
deva ser considerada de forma mais geral. Assim, as enovelases clássicas são as proteínas
das famílias Hsp60 (também chamadas chaperoninas), Hsp70 e Hsp90, responsáveis por
estabelecer o ambiente propício para aquisição da conformação correta do substrato,
processo que normalmente envolve gasto de energia através de ciclos de atividade ATPásica
(Wegele et al., 2004; Boshoff, 2015). As desagregases são as chaperonas capazes de interagir
com substratos agregados e auxiliar na remoção de polipeptídeos desses agregados,
também de forma ATP-dependente. Primariamente as desagregases eram representadas
pela família Hsp100 (chaperonas ClpB/Hsp104/Hsp101) de bactérias, fungos e plantas, mas
evidências recentes mostraram que o sistema formado de Hsp70 e outras co-chaperonas
também desempenham esta função. As desagregases podem trabalhar em conjunto com as
enovelases para desagregação e reenovelamento de substratos (Zietkiewicz et al., 2004;
Rampelt et al., 2012; Nillegoda et al., 2015). Por fim, as holders interagem com proteínas
clientes e as entregam para outras chaperonas, prevenindo sua agregação e enovelamento
incorreto, de maneira independente da hidrólise de ATP. As sHsps e co-chaperonas, como as
Hsp40 e as proteínas TPR, são as principais holders conhecidas (Summers et al., 2009; Tiroli-
Cepeda e Ramos, 2011; Garrido et al., 2012; Haslbeck e Vierling, 2015).
Uma vez que as chaperonas funcionam em grandes complexos proteicos, com
co-chaperonas e proteínas clientes, o bom entendimento do sistema PQC depende do
estudo dos múltiplos processos orquestrados pelas diversas chaperonas expressas nas
células em diferentes condições. Dessa forma, a seguir será apresentado um breve resumo
com informações gerais sobre as principais famílias importantes para compreensão das
motivações que levaram aos objetivos propostos neste trabalho.
19
- A maquinaria de enovelamento da Hsp70
As proteínas da família Hsp70 são as chaperonas mais importantes e conhecidas
devido ao papel central que desempenham no sistema PQC. Elas são proteínas expressas em
todos os organismos, encontradas em diferentes compartimentos celulares e constituem o
principal centro funcional de enovelamento e direcionamento de proteínas clientes, sendo
extremamente importantes para determinação do destino apropriado de substratos
proteicos. Dentre os diversos processos biológicos com os quais estão envolvidas, incluem-
se: enovelamento de proteínas recém-sintetizadas para o estado nativo, prevenção de
agregação, solubilização e reenovelamento de agregados e de proteínas mal enoveladas e
transporte através da membrana. Estruturalmente, as Hsp70 são formadas por dois
domínios conservados, ligados por um linker flexível: na porção N-terminal está o domínio
de ligação a nucleotídeo (nucleotide-binding domain - NBD) e na porção C-terminal
encontra-se o domínio de ligação ao substrato (substrate-binding domain - SBD) (Hartl et al.,
1992; Young, 2010; Silva e Borges, 2011; Mayer e Kityk, 2015). As proteínas dessa família
apresentam alta identidade de sequência nos ortólogos encontrados em diferentes espécies,
sendo que sua estrutura tridimensional e o mecanismo de ação também parecem ser
conservados em eucariotos (Young, 2010).
O sistema da Hsp70 é composto pelas proteínas Hsp70, pelas co-chaperonas
Hsp40 e por fatores de troca de nucleotídeos (nucleotide exchange factors - NEFs), das
famílias Hsp110 ou Bag. Em conjunto, essas proteínas estão no centro no sistema PQC
porque recebem e distribuem proteínas não nativas para outras chaperonas e para o UPS. As
co-chaperonas Hsp40 são conhecidas como DnaJs (ou J-proteins) devido à presença do
domínio J, conservado e específico dessa família. Essas co-chaperonas são muito diversas e
importantes, pois propiciam uma diversidade funcional para o sistema que não seria possível
apenas com as Hsp70 conservadas (Vos et al., 2008; Kakkar et al., 2012; Cyr e Ramos, 2015).
Em outras palavras, a diversidade das Hsp40 explica como o sistema conservado das Hsp70
pode atuar nos mais diferentes substratos proteicos existentes nas células, especialmente de
organismos mais complexos.
Por esse motivo, as Hsp40 são classificadas em três classes A, B e C (DnaJA,
DnaJB e DnaJC), de acordo com os domínios que as compõem, além do domínio J. As DnaJA
apresentam o domínio J na região N-terminal, seguido de uma região flexível rica em glicinas
20
e fenilalaninas (região GF), de um motivo zinc-finger e do domínio C-terminal (CTD). As
DnaJB possuem os mesmos domínios, com exceção do motivo zinc-finger, que é substituído
por uma região flexível, desordenada e rica em glicinas e metioninas (região GM). Já as
DnaJC são as mais diversas por conterem apenas o domínio J em alguma posição da
proteína, e dependendo da proteína ele está anexado a diversos tipos de domínios
especializados (Kampinga e Craig, 2010).
O mecanismo de funcionamento das Hsp70 ocorre através de ciclos consecutivos
de ligação, enovelamento e liberação de substrato, que acontecem no SBD e que são
regulados pela atividade de hidrólise de ATP no NBD. O ciclo acontece da seguinte maneira
(Figura 3): quando o NBD está ligado a ATP, o SBD encontra-se no estado aberto e com baixa
afinidade pelo substrato. Neste estado, as Hsp40s interagem com o NBD e induzem a
hidrólise de ATP. Diferentes Hsp40s são capazes de entregar diferentes substratos proteicos
e estimular atividade ATPásica da Hsp70. Uma vez que o NBD passa a ter ADP ligado a ele,
ocorre mudança conformacional e o SBD fica no estado fechado, apresentando alta
afinidade pelo substrato. Após a ação de enovelamento do substrato pela Hsp70, os fatores
de troca de nucleotídeos (NEFs) entram em ação, promovendo troca de ADP por ATP no NBD
e a liberação do substrato, ao reverter a mudança conformacional do SBD para o estado
aberto. O ciclo é então reiniciado e pode se repetir diversas vezes até que o enovelamento
adequado do substrato seja atingido (Borges e Ramos, 2005; Young, 2010).
Diferentemente de Hsp70 e Hsp40, os NEFs não são bem conservados em
bactérias (GrpEs) e eucariotos; em humanos e leveduras, os mais abundantes são
provenientes da família Hsp110/Sse, estruturalmente relacionada aos domínios NBD e SBD
das Hsp70, e da família Bag, que apresenta o domínio BAG conservado que interage com
NBD e tem a função NEF (Oh et al., 1999; Vos et al., 2008; Bracher e Verghese, 2015).
21
Figura 3: Esquema do sistema de enovelamento formado por Hsp70, Hsp90 e co-chaperonas. Polipeptídeos desenovelados são reconhecidos pelas co-chaperonas Hsp40, as quais entregam o substrato para Hsp70. Quando o NBD da Hsp70 está ligado a ATP, o SBD encontra-se no estado aberto e com baixa afinidade pelo substrato. Então, as Hsp40 interagem com o NBD e induzem a hidrólise de ATP. Uma vez que o NBD está ligado a ADP, este induz a mudança conformacional do SBD para o estado fechado de alta afinidade pelo substrato. Após a ação de enovelamento da proteína cliente, Hsp110 (NEF) promovendo troca de ADP por ATP no NBD da Hsp70, revertendo a mudança conformacional do SBD para o estado aberto e estimulando a liberação do substrato. Alguns substratos precisam ser entregues para Hsp90. Neste caso, a co-chaperona Hip medeia a interação de Hsp70 e Hsp90 e a transferência do substrato. A co-chaperona Hop é importante para estabilizar a dimerização de Hsp90 e para promover a troca de nucleotídeos, regulando a interconversão do estado aberto e fechado de Hsp90, o enovelamento e a liberação do substrato na forma nativa (adaptado de Gonçalves e Ramos, 2016).
- A família Hsp90
O sistema da Hsp70 também coopera com as chaperonas moleculares da família
Hsp90, gerando uma complexa maquinaria que realiza diversas funções essenciais durante o
(re)enovelamento proteico. A interação com Hsp70 é muito importante para a entrega de
substratos para Hsp90, uma vez que esta não se liga a polipeptídeos récem sintetizados
(Wegele et al., 2004). Diferentemente das Hsp70 que possuem atividade promíscua, as
Hsp90 parecem ser mais seletivas; apesar de reconhecerem um grande número de
substratos diferentes, eles são preferencialmente fatores de transcrição e proteínas kinases.
Essa característica faz das Hsp90 chaperonas essenciais durante o desenvolvimento e
crescimento de células eucaróticas e na manutenção da conformação de proteínas
22
envolvidas na transdução de sinal, controle do ciclo celular e apoptose. Além disso, as Hsp90
apresentam sequência de aminoácidos altamente conservada e estão distribuídas em fungos
(Hsp82), animais (Hsp90 α e β) e plantas (Buchner, 1999; Silva e Ramos, 2012).
Estruturalmente, Hsp90 é composta de um domínio N-terminal conservado e
com atividade ATPásica, seguido de um domínio central flexível (domínio M) e do domínio C-
terminal, responsável pel dimerização da proteína e pela interação com co-chaperonas. O
homodímero forma uma estrutura em forma de “V”, ligado pelo C-terminal, que pode se
abrir ou fechar de acordo com a ligação ao nucleotídeo no N-terminal (Buchner, 1999; Silva e
ramos, 2012). Em um mecanismo semelhante ao visto para Hsp70, a ligação com
nucleotídeos afeta a conformação de Hsp90 e a interação com substratos, além disso, a
interação com co-chaperonas específicas também é importante para regulação desse ciclo
(Figura 3). Assim, quando não há nucleotídeos ligados ao domínio N-terminal do
homodímero de Hsp90, este se encontra na conformação aberta, podendo receber
substratos de outras co-chaperonas ou do sistema da Hsp70. A interação com substrato e
com co-chaperonas induz a ligação de ATP e a mudança para a conformação fechada, a qual
propicia o ambiente adequado para o enovelamento do substrato. Ocorre então a hidrólise
do ATP, que muda novamente a conformação para o estado aberto e libera o substrato,
podendo reiniciar o ciclo de enovelamento (Young et al., 2001).
Desse modo, as co-chaperonas de Hsp90 desempenham um papel fundamental
para a regulação de sua atividade enovelase. As principais co-chaperonas são Hip, Hop,
Aha1, p23 e CHIP e são responsáveis por acelerar e estabilizar o enovelamento, promover a
interconversão do estado aberto e fechado (ligado a ATP ou ADP), modular a formação de
complexos com proteínas cliente específicas e também mediar a transferência de substrato
de Hsp70 para Hsp90. A maioria dessas co-chaperonas possuem um domínio TPR, o qual
será abordado com mais detalhes no próximo capítulo, mas que é conservado e capaz de se
ligar no motivo MEEVD presente no C-terminal das Hsp90 (Blatch e Lässle, 1999; Scheufler et
al., 2000; Wandinger et al., 2008).
23
- As desagregases da família Hsp100
As proteínas da família Hsp100, também conhecidas como Hsp101, Hsp104 ou
ClpB em plantas, leveduras e bactérias respectivamente, são chaperonas com atividade
ATPásica intrínseca e que pertencem à superfamília das AAA+ ATPases (Snider e Houry,
2008; Hodson et al., 2012). Em situações de estresse muito intenso, agregados proteicos
podem ser formados mesmo na presença das chaperonas Hsp70 e Hsp90, especialmente em
organismos muito sujeitos às mudanças do ambiente, como bactérias, fungos e plantas.
Dessa forma esses organismos apresentam as chaperonas Hsp100 que são responsáveis pela
atividade de desagregase, removendo polipeptídeos da superfície de substratos agregados e
permitindo que eles sejam reenovelados ou enviados para degradação; a colaboração das
Hsp100 com o sistema da Hsp70 é essencial para que isso ocorra. Visto que Hsp70 e Hsp100
constituem os dois principais centros funcionais do sistema de desagregação nesses
organismos, este sistema foi denominado bichaperona, apesar de diversas outras co-
chaperonas também estarem envolvidas nesse processo (Glover e Lindquist, 1998). Além da
atividade de desagregase, as proteinas Hsp100 ainda desempenham diversas outras
atividades nas células, como tolerância ao estresse, tráfico intracelular de proteínas,
regulação do ciclo celular, regulação gênica e transposição de DNA (Schirmer et al, 1996).
Detalhes sobre o mecanismo de ação desse sistema serão abordados no capítulo 2.
Com relação à conformação, todas as Hsp100 se associam em uma estrutura em
forma de anel. Mudanças nessa conformação ocorrem devido a um ciclo de ligação e
hidrólise de ATP, desencadeando a desagregação do substrato através de sua translocação
através do poro central presente na estrutura. Dependendo de cada Hsp100 a conformação
de anel pode variar, mas elas geralmente compartilham alguns domínios conservados. O
domínio N-terminal (NTD) contribui para a alta afinidade de interação que as Hsp100 tem
por substratos agregados; além disso, elas apresentam um ou dois domínios de ligação a
nucleotídeo (NBD), os quais ligam ATP e ADP e são responsáveis pela atividade ATPásica.
Formando o NBD, existem os motivos canônicos walker A e walker B e os motivos sensor-1 e
sensor-2, que são importantes para ligação e hidrólise de ATP. O número de NBDs que as
Hsp100 apresentam permite sua classificação em classe I (dois NBDs) ou classe II (um NBD).
As proteínas de classe I se associam em hexâmeros na presença de ATP, enquanto as de
classe II geralmente são menores (Mokry et al., 2015).
24
As Hsp100 podem ainda ser divididas de acordo com a presença de um domínio
M (middle domain), normalmente situado após o primeiro NBD. Embora este domínio seja
dispensável para a atividade ATPásica, ele é essencial para reativação de agregados
proteicos (Desantis e Shorter, 2012). Há ainda a região C-terminal que está envolvida com a
oligomerização e interação com co-chaperonas (Mackay et al., 2008).
- A família das small Heat shock proteins (sHsps)
As chaperonas da família sHsp são assim denominadas por apresentarem
monômeros com baixa massa molecular (12 a 43 kDa). Assim como as Hsp70, elas estão
presentes em todos os organismos, procariotos e eucariotos, entretanto elas evoluíram
independentemente nesses organismos e são as chaperonas menos conservadas entre as
diferentes espécies; mesmo em uma mesma espécie, diferentes membros desta família
apresentam baixa identidade de sequência. Isso provavelmente ocorreu ao longo da
evolução, porque as sHsps constituem a primeira defesa das células contra condições
estressantes. Nessas situações, essas chaperonas têm sua expressão muito aumentada e sua
principal função é reconhecer, de maneira promíscua, resíduos hidrofóbicos expostos de
uma ampla diversidade de substratos desenovelados, se ligar a eles e prevenir sua agregação
independentemente da hidrólise de ATP. Dessa forma, a diversidade de sequências das
sHsps reflete a diversidade de susbtrato com as quais elas devem interagir. Por esse motivo,
quando essas chaperonas são expressas, elas frequentemente são endereçadas para
compartimentos celulares específicos, como citosol, mitocôndria, cloroplastos e retículo
endoplasmático (Buchner et al., 1998; Halsbeck et al., 1999; Waters, 2013; Halsbeck e
Vierling, 2015).
Apesar de não serem conservadas, as sHsps estão agrupadas numa mesma
família pela presença do domínio α-cristalino na região central da proteína (α-crystallin
domain - ACD). Este domínio, formado de cerca de 90 resíduos de aminoácidos, é
conservado, rico em folhas-β antiparalelas e responsável pela dimerização das sHsps. Os
domínios N-terminal (NTD) e C-terminal (CTD) flanqueiam o ACD e apresentam sequência e
tamanho altamente variáveis, além disso, são regiões hidrofóbicas de estrutura desordenada
e que estão envolvidas com oligomerização e ligação de substrato. Pouco se sabe sobre o
mecanismo de ligação das sHsps ao substrato se comparado com o conhecimento que se
25
tem sobre o mecanismo de chaperonas ATP-dependentes como Hsp70 e Hsp90, por
exemplo (Sudnitsyna et al., 2012; Haslbeck e Vierling, 2015; Arbach et al., 2017).
Apesar do monômero de baixa massa molecular, sHsps podem formar enormes
complexos oligoméricos e adquirir estrutura quaternária com diferentes arranjos, muitas
delas formam discos achatados com uma cavidade central, onde os substratos ficam
protegidos quando interagem com o N-terminal das proteínas. Os dímeros de sHsps são
considerados as unidades básicas para a formação dos oligômeros e, como a dimerização se
dá através do conservado ACD, podem ser formados homo ou heterodímeros que podem
originar heteroligômeros. A oligomerização é uma característica bastante importante dessas
chaperonas e bastante discutida na literatura. Esse assunto será abordado com mais
detalhes no capítulo 2, mas em resumo, entende-se que a oligomerização das sHsps existe
como um processo dinâmico, regulado por modificações pós-traducionais e que está de
alguma forma relacionada com a função dessas proteínas (MacDonald et al., 2012; Heibaut
et al., 2016).
26
Capítulo 1. Caracterização da co-chaperona CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP)
1.1. Introdução
1.1.1. O sistema ubiquitina-proteosomo (UPS) e seu papel na degradação de
substratos proteicos
A integridade dos processos celulares depende da manutenção da homeostase
proteica. Assim, as proteínas devem permanecer em suas conformações nativas funcionais
enquanto necessário, porque caso isso não ocorra, polipeptídeos mal enovelados podem
gerar agregados tóxicos que se acumulam e ocasionam doenças e morte celular (Hartl et al.,
1992; Hartl e Hayer-Hartl, 2002).
A principal função das chaperonas moleculares para contribuir com a
manutenção da proteostase é prevenir a formação de agregados e propiciar um ambiente
favorável para o (re)enovelamento de polipeptídeos. Outro lado também essencial nesse
contexto é a degradação de polipeptídeos, que deve acontecer caso o enovelamento correto
não possa ser atingido ou não haja mais necessidade de proteínas que foram altamente
expressas em determinada condição. A degradação das proteínas não apenas auxilia a
manter a célula saudável como também ajuda a manter um balanço de energia e um pool de
aminoácidos no citosol. A síntese de aminoácidos no metabolismo é um processo de alto
custo, então reciclá-los foi a melhor maneira encontrada pelos organismos para manter a
homeostase celular com o menor custo energético possível (Myung et al., 2001).
As duas vias de degradação proteica mais importantes descritas para a maioria
das células eucarióticas são o sistema ubiquitina-proteosomo (UPS) e a autofagia. A
autofagia é realizada pelos lisossomos e envolve principalmente a degradação de organelas
celulares (mitocôndrias, peroxissomos, ribossomos, etc), organismos infecciosos e grandes
agregados proteicos. Já o UPS é responsável pela degradação de 80 a 90% das proteínas em
geral, incluindo proteínas com expressão temporariamente regulada, de curta meia-vida ou
danificadas, estando mais intimamente relacionado com o sistema chaperona no controle de
qualidade proteico (Lilienbaum, 2013).
O UPS apresenta um mecanismo altamente conservado através do qual as
células eucarióticas regulam seu nível de proteínas citosólicas e nucleares. O proteosomo é
um grande complexo multiproteico de mais de 2 MDa cuja estrutura se assemelha a de um
barril com uma cavidade proteolítica central onde os substratos são degradados (Tanaka,
27
2009). Uma vez que a via do UPS degrada uma ampla gama de substratos proteicos, os
organismos desenvolveram uma maneira de dividir esse processo em duas etapas
consecutivas: a primeira em que o reconhecimento de substrato é específico e seletivo,
através da cascata de ubiquitinação; e a segunda em que ocorre a degradação
indiscriminada do substrato, mediada pelo centro proteolítico do proteosomo.
Para que a degradação de proteínas aconteça pelo UPS, elas devem ser
primeiramente marcadas pela ligação de múltiplas moléculas de ubiquitina através de uma
série de reações enzimáticas sequenciais. A ubiquitina é uma pequena proteína globular de 8
kDa composta de 76 resíduos de aminoácidos altamente conservados desde leveduras até
mamíferos (Vijay-Kumar et al., 1987). A ubiquitinação não sinaliza apenas para degração, a
adição de apenas uma molécula de ubiquitina pode sinalizar o endereçamento para uma
localização subcelular ou ainda pode servir para indução de atividade de algumas proteínas.
Assim, é necessária a ligação de uma cadeia de poli-ubiquitina para que o substrato seja
sinalizado para degradação pelo proteosomo (Johnson et al., 1992).
A cascata de conjugação de ubiquitina acontece da seguinte forma (Figura 4):
primeiramente ocorre a ativação da ubiquitina por uma enzima E1 (enzima de ativação da
ubiquitina). Nessa etapa, o grupamento carboxila da glicina 76 da ubiquitina é conjugado
num resíduo de cisteína da enzima E1 através de uma ligação tioéster e da hidrólise de ATP.
Em seguida, a ubiquitina ativada é transferida para um resíduo de cisteína da enzima E2
(enzima de conjugação da ubiquitina). No último passo ocorre a transferência da ubiquitina
da enzima E2 para enzima E3 (E3 ubiquitina ligase) e então a ubiquitina é conjugada na
proteína substrato pela formação de uma ligação amida isopeptídica entre o grupamento
carboxila da glicina 76 da ubiquitina e o grupamento amina da cadeia lateral de um resíduo
de lisina do substrato. Em alguns casos, não é observada a ligação covalente entre ubiquitina
e a enzima E3 e a transferência de ubiquitina para o substrato ocorre diretamente da enzima
E2 em um complexo formado por E2-E3-substrato. Após a conjugação de uma molécula de
ubiquitina, a cadeia de poliubiquitina é formada pela repetição da mesma cascata de
reações, através da ligação covalente do grupo carboxila da glicina 76 da ubiquitina com a
um resíduo de lisina de outra ubiquitina já ligada no substrato (Scheffner et al., 1995;
Hershko e Ciechanover, 1998; Myung et al., 2001).
28
Figura 4: Esquema de funcionamento do sistema ubiquitina-proteosomo (UPS). Para que a degradação de proteínas aconteça pelo UPS, elas devem ser marcadas pela ligação de múltiplas moléculas de ubiquitina através de uma série de reações enzimáticas sequenciais. O primeiro passo da cascata de ubiquitinação envolve a ativação da ubiquitina por uma enzima E1 (enzima de ativação da ubiquitina). Nessa etapa, o grupamento carboxila da glicina 76 da ubiquitina é conjugada num resíduo de cisteína da enzima E1, através de uma ligação tioéster e da hidrólise de ATP. Em seguida, a ubiquitina ativada é transferida para um resíduo de cisteína da enzima E2 (enzima de conjugação da ubiquitina). No último passo ocorre a transferência da ubiquitina da enzima E2 para enzima E3 (E3 ubiquitina ligase) e então a ubiquitina é conjugada na proteína substrato pela formação de uma ligação amida isopeptídica entre o grupamento carboxila da glicina 76 da ubiquitina e o grupamento amina da cadeia lateral de um resíduo de lisina do substrato. Após a conjugação de uma molécula de ubiquitina, a cadeia de poliubiquitina é formada pela repetição da mesma cascata de reações, através da ligação covalente do grupo carboxila da glicina 76 da ubiquitina com a um resíduo de lisina de outra ubiquitina já ligada no substrato.
É interessante realçar que a etapa de ubiquitinação para degradação proteica
apresenta especificidade ao substrato. Essa especificidade não é determinada pelas enzimas
E1, pois existe apenas uma família altamente conservada destas proteínas, mas sim pela
diversidade das enzimas E3. Cada uma delas é capaz de ubiquitinar especificamente um ou
poucos substratos, através da interação também específica com uma ou algumas enzimas
E2, de forma que diferentes combinações de enzimas E2 e E3 permitem a marcação seletiva
de proteínas intracelulares específicas. As E3 ubiquitina ligases podem reconhecer
substratos de diferentes formas dependendo do tipo de substrato que será encaminhado
para degradação; para substratos mal enovelados, por exemplo, o reconhecimento de
29
substrato depende predominantemente da cooperação com o sistema de chaperonas
moleculares (Esser et al., 2004). A co-chaperona CHIP é a principal responsável pela
colaboração entre o sistema de chaperonas e o UPS.
1.1.2. A co-chaperona CHIP é o elo entre o sistema chaperona e o UPS
A proteína CHIP (do inglês Carboxyl terminus of Hsp70-Interacting Protein)
recebeu esse nome porque foi inicialmente identificada em experimentos de busca por
proteínas humanas que continham o domínio TPR (Tetratricopeptide Repeat) responsável
pela interação com as chaperonas Hsp70 e Hsp90. De fato, CHIP é uma co-chaperona que
interage tanto com Hsp70 quanto com Hsp90 e ainda modula sua atividade chaperona
(Ballinger et al., 1999). Além disso, CHIP também é uma E3 ubiquitina ligase capaz de
ubiquitinar substratos e marcá-los para degradação pelo proteosomo (Jiang et al., 2001), o
que a torna o principal elo entre os processos de enovelamento proteico, mediado pelo
sistema chaperona, e de degradação, mediada pelo UPS (McDonough e Patterson, 2003).
Devido a essas funções, CHIP é uma proteína fundamental para a manutenção da
proteostase celular ao estabelecer o balanço correto entre enovelamento e degradação, fato
que a diferencia de outras co-chaperonas, como as Hsp40 ou outras TPR, porque ela está
primariamente envolvida no direcionamento dos complexos de chaperonas para degradação
e não no estabelecimento da o (re)enovelamento proteico. Em células humanas, o RNAm de
CHIP foi encontrado altamente expresso em tecidos com alta taxa metabólica e de turnover
de proteína, como músculo estriado esquelético e coração. Em tecidos de pâncreas e
cérebro a expressão observada foi um pouco menor, mas ainda assim significativa (Ballinger
et al., 1999).
Estruturalmente, CHIP é uma proteína conservada e constituída de três regiões
principais: o domínio TPR, uma região de dimerização e o domínio U-box (Paul e Ghosh,
2014). O domínio TPR é composto de três repetições em sequência do motivo TPR, o qual
consiste de 34 resíduos de aminoácidos pouco conservados na sequência primária, mas
conservado na estrutura terciária formada de uma alça de duas hélices-α antiparalelas
separadas por um loop (Figura 5). Em CHIP e na maioria dos domínios TPR, os três motivos
presentes compreendem seis hélices-α que se dobram e formam um groove que acomoda a
interação com o motivo conservado EEVD situado na região C-terminal de Hsp70 e Hsp90
30
(Blatch e Lässle, 1999). Em experimentos de interação de CHIP com essas chaperonas
moleculares, foi relatado que CHIP bloqueia a estimulação da atividade ATPásica de Hsp70
mediada por Hsp40 e como consequência promove a acumulação dessa chaperona em seu
estado aberto, de baixa afinidade a substrato, prevenindo a ligação e reenovelamento de
substratos desenovelados (Ballinger et al., 1999). Além disso, há evidências de que CHIP
inibe a função de Hsp90 de regular a conformação de substratos dessa chaperona, como
receptores de glicocorticóides (Connel et al., 2001).
Detalhes sobre a estrutura quaternária da proteína CHIP foram obtidos para o
homólogo presente em camundongos (MmCHIP) através de difração de raios X (Zhang et al.,
2005). Nesta estrutura, observou-se que CHIP forma um homodímero assimétrico, sendo
que a região central da proteína consiste de um hairpin de hélices-α que é o principal
responsável pela interface de dimerização (Figura 5). A formação de dímeros não é
recorrente em outras E3 ubiquitina ligases, mas no caso de CHIP parece ser essencial para
sua atividade, visto que um mutante de CHIP humana sem o segmento do hairpin não foi
capaz de dimerizar e também perdeu sua atividade de ubiquitinação de substrato (Nikolay et
al., 2004).
O próximo domínio presente em CHIP é o U-box que foi primeiramente
reconhecido na proteína Ufd2 de levedura, capaz de produzir cadeias de poliubiquitina
através de cadeias de oligoubiquitinas previamente formadas (Koegl et al., 1999). O domínio
U-box é estruturalmente semelhante aos domínios RING-finger encontrados em muitas
outras E3 ubiquitinas ligases, mas é estabilizado por ligações de hidrogênio em vez de
ligações de zinco (Aravid e Koonin, 2000). Em CHIP, o domínio U-box apresenta um hairpin
curto de duas folhas-β separando duas hélices-α (Figura 5). Como uma E3 ubiquitina ligase,
CHIP utiliza esse domínio para interagir com enzimas E2, em uma interação altamente
específica que determina a identidade da proteína substrato e a natureza da ubiquitinação.
São duas famílias de E2 relatadas com as quais CHIP pode interagir: Ubc4/5 que envolve a
poliubiquitinação da lisina 48 da ubiquitina e promove degradação pelo proteosomo; e
Ubc13 que envolve a ubiquitinação da lisina 63 e tem papel regulatório (Edkins, 2015).
31
Figura 5: Esquema da estrutura primária e estrutura terciária de CHIP de camundongo (MmCHIP) obtida por difração de raios X. A proteína CHIP é composta por três domínios importantes: o domínio TPR de interação com outras chaperonas (tons de verde), o hairpin de dimerização (tons de azul) e o domínio U-box (tons de vermelho) de ubiquitinação do substrato (Zhang et al., 2005; PDB: 2C2L).
Ao interagir com as enzimas E2 e as chaperonas moleculares, CHIP ubiquitina
proteínas desnaturadas ou mal enoveladas que são substratos dessas chaperonas. Em
parceria com Hsp90, CHIP ubiquitina substratos desnaturados capturados pela porção C-
terminal do dímero dessa chaperona sem necessidade de auxílio da região N-terminal de
atividade ATPásica (Murata et al., 2001). Com relação à Hsp70, CHIP diminui afinidade pelo
substrato pela regulação da atividade ATPásica, mas tanto Hsp70 quanto Hsp40 são
necessários para que o substrato desenovelado seja ubiquitinado. Além de ubiquitinar
proteínas substratos das chaperonas, CHIP também ubiquitina as próprias Hsp70 e Hsp90,
mostrando que essa co-chaperona também desempenha um importante papel regulatório
ao reestabelecer os níveis basais dessas chaperonas após a indução de resposta ao estresse
(Kundrat e Regan, 2010a).
32
- O papel de CHIP em plantas e o modelo Sorghum bicolor
A grande maioria dos estudos sobre CHIP foi realizada com os homólogos de
animais, especialmente com a proteína humana, de camundongo, de Drosophila, C. elegans
e peixe zebra. Em plantas, já foi identificada por análise de sequência pelo menos uma cópia
do gene que codifica essa proteína em diversos genomas vegetais (Copeland et al., 2016). No
entanto, apesar de ter sido identificada há quase 20 anos, poucos são os trabalhos que
descrevem o papel de CHIP em plantas como macromolécula intermediadora entre o
sistema chaperona e o UPS na regulação da degradação proteica. Além disso, a maioria
desses estudos envolve experimentos funcionais in vivo de silenciamento e superexpressão
do homólogo de Arabidopsis thaliana (AtCHIP), não tendo sido relatado nenhuma
caracterização estrutural mais aprofundada sobre essa co-chaperona em vegetais.
Em A. thaliana foi identificada uma única cópia do gene que codifica AtCHIP e
que tem sua expressão aumentada em resposta a tratamentos de indução de estresses
térmico (a 7 ou 38 °C) e osmótico (na presença de NaCl e Na2SeO4). Porém, observou-se que
a superexpressão constitutiva induzida de AtCHIP tornou as plantas mais suscetíveis ao
estresse térmico (Yan et al., 2003). Também já foi confirmada a atividade de E3 ubiquitina
ligase de AtCHIP, assim como sua capacidade de interagir com Hsc70 e de enviar substratos
para degradação; a maioria dos substratos estudados estão relacionados com proteínas
precursoras endereçadas a cloroplasto (Shen et al., 2007; Lee et al., 2009). Estudos recentes
apontam que AtCHIP também pode contribuir para regulação da imunidade de plantas de
Arabidopsis, uma vez que mutantes knockout se mostraram mais susceptíveis à doença
causada por um fungo patógeno virulento (Hyaloperonospora arabidopsidis). Em
contrapartida, a superexpressão de AtCHIP na planta causou maior resistência à doença em
baixas temperaturas (Copeland et al., 2016).
Considerando as funções descritas para CHIP em Arabidopsis, percebe-se que
essa co-chaperona também está envolvida na manutenção da homeostase proteica celular
em plantas, contribuindo para regulação entre os sistemas chaperona e proteosomo. Devido
à falta de informação e à importância do controle de qualidade proteico em plantas, o
estudo do funcionamento de chaperonas moleculares nesses organismos torna-se muito
necessário e relevante, apresentando alto potencial de produção de espécies vegetais mais
tolerantes a estresses bióticos e abióticos. Nosso grupo de pesquisa já caracterizou algumas
33
das principais chaperonas moleculares presentes em cana-de-açúcar (Cagliari et al., 2011;
Silva et al., 2013; Tiroli-Cepeda et al., 2014). Dessa maneira, a principal motivação desta
etapa do trabalho é contribuir com informações funcionais e estruturais da proteína CHIP de
Sorghum bicolor (SbCHIP).
Sorghum bicolor é uma espécie monocotiledônea originária do nordeste da
África e pertencente à mesma família da cana (Poaceae). Atualmente, o sorgo é o quinto
cereal mais produzido do mundo, especialmente em regiões tropicais e subtropicais, atrás
do arroz, trigo, milho e cevada (Dillon et al., 2007). Seu cultivo extensivo se deve ao
consumo do grão como alimento humano, principalmente em regiões semi-áridas
subsaharianas, e também na produção de farinha, xarope, amido industrial e bebidas
alcoólicas; além disso, o sorgo é amplamente utilizado como forragem para alimentação de
animais e na produção de biocombustíveis.
Cientificamente, o sorgo é bastante utilizado como uma espécie modelo
representante das monocotiledôneas com metabolismo de fotossíntese C4, apresentando
propriedades bioquímicas e morfológicas que aumentam a assimilação de carbono a altas
temperaturas. Essa planta é capaz de crescer em diferentes temperaturas, altitudes
elevadas, solos contaminados e se recupera após períodos de seca, o que a torna espécie de
estudo interessante de resistência a vários tipos de estresse (Hamblin et al., 2005).
Geneticamente, o sorgo já teve seu genoma sequenciado e por ter um tamanho
relativamente pequeno (730 Mb) também o torna um bom modelo de plantas C4 para
estudos genômicos funcionais (Paterson et al., 2009).
Em resumo, o homólogo de CHIP de Sorghum bicolor foi escolhido por esta ser
uma planta de regiões tropicais semi-áridas, altamente tolerante a estresse térmico e que
pode contribuir significativamente para o entendimento mais aprofundado do controle de
qualidade proteico em vegetais. Ademais, também foi considerado o grau de parentesco de
sorgo com cana, espécie para qual o grupo já possui vários trabalhos com outras chaperonas
moleculares, facilitando o estudo, quando for o caso, de interação entre proteínas, mesmo
que cada proteína seja de uma dessas espécies.
34
1.2. Objetivos
A motivação deste trabalho provém da importância da co-chaperona CHIP no
controle de qualidade proteico como o principal elo de regulação entre o sistema chaperona
e o sistema de degradação do proteosomo. A falta de compreensão que se tem sobre esse
sistema em plantas e a relevância da contribuição que pode ser gerada foram consideradas,
fornecendo conhecimento na produção potencial de espécies vegetais mais tolerantes a
estresses bióticos e abióticos. Dessa forma, o objetivo principal deste trabalho é a
caracterização funcional e estrutural da proteína CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP). Para
isso, os objetivos específicos propostos foram:
(1) Otimizar a sequência que codifica a proteína SbCHIP para expressão ótima em E.
coli e estabelecer um protocolo para a purificação dessa co-chaperona.
(2) Caracterizar a proteína SbCHIP através de técnicas biofísicas, determinando
parâmetros hidrodinâmicos em solução e obtendo informações estruturais da proteína.
(3) Investigar a possível interação de SbCHIP com chaperonas moleculares importantes
para o controle de qualidade proteico celular, como Hsp70.
(4) Caracterizar a função de ubiquitinação de SbCHIP em substratos proteicos e
também nas chaperonas moleculares Hsp70.
35
1.3. Material e métodos
Exceto quando indicado, os experimentos desenvolvidos nesta etapa do trabalho
foram realizados sob orientação do Prof. Dr. Carlos Ramos nas dependências de seu
laboratório situado no Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP).
1.3.1. Estratégia de clonagem
Para obtenção da proteína CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP) isolada em solução,
primeiramente foi necessário construir um clone para induzir a expressão dessa proteína
recombinante em E.coli. Para isso, foi realizada uma busca por alinhamento de sequências
(BLAST) contra um banco de dados (Altschul et al., 1990) usando como isca a sequência de
RNAm de CHIP de Arabidosis thaliana (AtCHIP, GI:145338228). Através dessa busca foi
encontrada a sequência de nucleotídeos que codifica SbCHIP (GI: 242077965), anotada como
E3 ubiquitin-protein ligase CHIP isoform X1 [Sorghum bicolor].
Para realizar uma análise de similaridade de sequência de SbCHIP, foi feito um
alinhamento com sequências de proteínas homólogas de camundongo (MmCHIP), humano
(HsCHIP), Drosophila (DmCHIP), peixe zebra (DrCHIP), C. elegans (CeCHIP) e Arabidopsis
thaliana (AtCHIP), usando o programa Clustal Omega (Goujon et al., 2010; Sievers et al.,
2011). O alinhamento obtido foi utilizado para a obtenção de uma matriz de similaridade
através do programa MEGA 7.0, o qual gerou um cladograma de topologia final com método
Neighbor-joining (Kumar et al., 2016).
Para expressão de SbCHIP em E. coli, a sequência de RNAm foi otimizada usando
o programa OPTIMIZER (Puigbò et al., 2007), que substitui os códons raros de E. coli (aqueles
para os quais a bactéria não possui RNAt em abundância) por códons mais frequentemente
encontrados nessa bactéria. Para verificar a eficácia da substituição dos códons também foi
usado o programa Rare Codon Analysis Tool (GenScript).
Para decidir quais enzimas de restrição seriam utilizadas para clonagem da
sequência de RNAm de SbCHIP em plasmídeo de expressão, foi usado o programa NEBcutter
v2.0 (Vincze et al., 2003) que informa as enzimas de restrição conhecidas para as quais há
sítios de clivagem na sequência de interesse e também as enzimas não clivam em nenhuma
região da sequência, podendo assim ser utilizadas para clonagem. O programa mostrou que
36
não havia sítios de restrição das enzimas NdeI (5’ - CATATG - 3’) e XhoI (5’- CTCGAG - 3’), logo
elas foram as eleitas para a inserção da sequência no vetor (Figura 6A). Outras
características da proteína foram verificadas através do programa ProtParam Tool (Gasteiger
et al., 2005).
O vetor escolhido para clonagem foi o pET28a (Novagen), que contém diversos
sítios para enzimas de restrição e é amplamente utilizado para indução da expressão de
proteínas recombinantes em E. coli. A inserção da sequência desejada nesse vetor foi
realizada pela empresa Epoch Life Science, que gerou o plasmídeo pET28a-His-SbCHIP. A
construção foi confirmada pelo sequenciamento de DNA, usando os primers propostos pelo
manual do vetor nos sentidos forward e reverse (T7 promoter primer e T7 terminator primer,
respectivamente, Figura 6A).
1.3.2. Expressão das proteínas recombinantes
A escolha do pET28a como vetor de expressão ocorreu devido à algumas
características importantes que ele apresenta. A inserção de sequências em determinada
região desse plasmídeo propicia que a proteína seja expressa contendo uma cauda de poli-
histidina (cauda poli-His) composta de 20 resíduos de aminoácidos
(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH), incluindo 6 resíduos de histidinas seguidos (Figura 6A). Essa
cauda facilita o processo de purificação da proteína, como será explicado a seguir com mais
detalhes.
Além da cauda, esse plasmídeo confere resistência ao antibiótico canamicina à
bactéria e permite também que se tenha controle sobre a indução da expressão da proteína
de interesse através da presença da sequência do promotor T7 (Figura 6A). Isso ocorre pela
adição de um indutor análogo a 1,6-aldolactose ao meio de cultura da bactéria, sendo o IPTG
(isopropril β-D-1-tiogalactopiranosideo) o indutor mais comumente usado. Essa molécula é
capaz de se ligar ao operador O, componente do promotor lacUV5 do operon lac do genoma
da bactéria (Figura 6B). Esse operador está normalmente reprimido pelo produto do gene
lac I, mas na presença de um indutor, o repressor se desliga do operador e permite a
expressão da T7 RNA polimerase. Essa polimerase é originária do prófago do bacteriófago
lisogênico T7 e foi integrada no genoma de algumas cepas de E. coli. Graças à presença da T7
RNA polimerase, é possível ativar o promotor T7 do plasmídeo pET28a e, assim, induzir a
37
expressão da proteína recombinante (Studier et al., 1990). A especificidade dos promotores
envolvidos é bastante alta, permitindo o controle do momento da expressão da proteína
recombinante logo após a adição do IPTG.
A expressão de proteínas pelo plasmídeo pET28a só ocorre caso sejam utilizadas
cepas específicas de E. coli, como a BL21(DE3). Essa cepa é ideal para uso com sistemas de
expressão baseados no promotor T7 porque, como mencionado, essas bactérias possuem o
prófago do bacteriófago T7 integrado em seu genoma, logo, na presença do agente indutor
IPTG, elas expressam a enzima T7 RNA polimerase que está sob controle do promotor
lacUV5 (Figura 6B). Além disso, essa linhagem é capaz de tolerar o grande acúmulo de RNAm
e proteínas recombinantes que pode ocorrer durante a indução, não propiciando a
degradação de proteínas porque não expressam determinadas proteases comuns em E. coli.
Dessa maneira, células de E. coli BL21(DE3) foram transformadas com o
plasmídeo contendo a sequência de interesse. Para isso, células competentes descongeladas
a 4 °C em banho com gelo foram incubadas por 30 min após adição de 1 μL da solução
estoque do plasmídeo. Em seguida, as células foram submetidas a um choque térmico a 42
°C por 1,5 min e rapidamente incubadas no gelo por mais 2 min. Depois disso, 800 μL de
meio SOC (20 g/L de peptona; 5 g/L de extrato de levedura; 500 mg/L de NaCl; 2,5 mM de
KCl; 10 µM de MgCl2; 20 µM de glicose) foram adicionados e as células foram incubadas a 37
°C por 60 min. As células foram, então, plaqueadas em meio LB sólido (10 g/L de triptona; 5
g/L de extrato de levedura; 10 g/L de NaCl, ágar 1,5%) acrescido de 30 µg/mL de canamicina
e cultivadas a 37 °C, overnight.
38
Figura 6: Estratégia de clonagem e expressão de proteína recombinante no plasmídeo pET28a. (A) Mapa da região de clonagem e expressão do plasmídeo pET28a. A posição das enzimas de restrição, NdeI e XhoI, usadas para inserção da sequência otimizada de nucleotídeos que codifica SbCHIP está destacada em vermelho. Além disso, é mostrada a sequência que codifica a cauda de poli-histidina (His-tag), e as regiões do promotor T7 e do operador lac, responsáveis pela regulação do controle de indução de expressão pela adição do indutor IPTG. (B) Esquema do funcionamento do sistema pET para expressão de proteínas recombinantes. A presença do indutor IPTG impede a ligação do repressor lac e permite a transcrição do gene da T7 RNA polimerase. Esta, por sua vez, ativa o promotor T7 e induz a transcrição do gene da proteína de interesse (imagem adaptada da original, encontrada no manual da Novagen).
39
Para que a transformação seja bem-sucedida, as bactérias devem estar
competentes, isto é, capazes de internalizar o plasmídeo. Para isso, as células são cultivadas
em meio LB sólido a 37 °C overnight. Em seguida, uma colônia isolada é transferida para 20
mL de meio PSI (16 g/L de peptona, 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de NaCl, 0,4 g/L de
KH2PO4, 0,5 g/L de Na2HPO4), onde é cultivada a 37 °C overnight, sob agitação de 200 rpm.
Após o crescimento, 5 mL do pré-inóculo foram transferidos para 200 mL de meio PSI e
cultivados nas mesmas condições até atingir A600nm entre 0,45 e 0,50, quando as células
foram incubadas no gelo por 10 min. Elas foram, então, centrifugadas a 3500 rpm por 10 min
a 4 °C, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspendido em 25 mL de
tampão I (30 mM KOH, 50 mM MgCl2, 100 mM RbCl2, 13 mM CaCl2, 30 mM ácido acético e
13,5%, glicerol pH 5,8) e incubado no gelo por 15 min. Após outra centrifugação, a 3500 rpm
por 15 min a 4 °C, o precipitado foi ressuspendido gentilmente em 8 mL de tampão II MOPS
(0,084 g/L [ácido 3-(Nmorfolino) propanosulfonico], 100 mM CaCl2, 10 mM RbCl2, 13,5 %
Glicerol). As células foram distribuídas em alíquotas de 100 µL, congeladas em nitrogênio
líquido e armazenadas a -80 °C.
Finalmente, para indução de expressão de proteínas recombinantes, células de E.
coli BL21(DE3) foram transformadas com o plasmídeo pET28a-His-SbCHIP e cultivadas em
100 mL de meio LB líquido contendo 30 µg/mL de canamicina a 37 °C overnight sob agitação
de 200 rpm. Em seguida, 25 mL foram transferidos para 500 mL de meio LB também
acrescidos de antibióticos e cultivadas a 37 °C até atingirem A600nm entre 0,6 e 0,8. Neste
momento, 0,5 mM de IPTG foram adicionados e as bactérias cresceram em diferentes
temperaturas por diferentes tempos. Para a proteína SbCHIP foram feitos testes para
determinação de tempo e temperatura de ótimos de expressão. Após esses períodos, as
células foram centrifugadas a 3500 rpm por 15 min a 4 °C e o precipitado foi armazenado a -
20 °C.
Outras chaperonas utilizadas neste trabalho foram expressas utilizando clones já
construídos de acordo com protocolos já estabelecidos pelo grupo (Silva et al., 2013; Tiroli-
Cepeda et al., 2014). A Tabela 1 resume as condições utilizadas para expressão das
chaperonas.
40
Tabela 1: Condições utilizadas para expressão das proteínas recombinantes em E. coli BL21(DE3).
Proteína Organismo Vetor Temperatura (°C) Tempo (h)
SbCHIP Sorghum bicolor pET28a 30 5
HsHsc70 Homo sapiens pET28a 37 4
1.3.3. Lise das células bacterianas
Os precipitados congelados, formados pelas bactérias que expressaram as
proteínas recombinantes, foram ressuspendidos em tampão de lise, composto de 20 mM de
Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, 750 µM de PMSF, 20 ng/mL
de lisozima e 2,5 µL de RQ1 RNase-free DNase (Promega 1u/µL). Após incubação por 30 min
no gelo, as células foram lisadas por sonicação usando Misonix Ultrasonic Liquid Processor,
com 10 pulsos de 12 s intercalados por 1,5 min e amplitude de 40 W. A suspensão foi
centrifugada a 13000 rpm por 1 h a 4 °C, o sobrenadante foi filtrado com filtro de 0,45 μM
(Millex® GV) e utilizado para posterior purificação.
1.3.4. Purificação das proteínas
- Cromatografia de afinidade ao níquel
A cromatografia de afinidade ao níquel foi a primeira etapa de purificação
utilizada neste trabalho devido à presença da cauda poli-His na porção N-terminal das
proteínas. Essa técnica se baseia na interação reversível entre uma proteína alvo e um
ligante específico presente na matriz de uma resina cromatográfica. Essa interação pode
ocorrer de várias formas, como com anticorpos ou sondas nos quais se liga a proteína de
interesse, receptores que ligam hormônios ou, como no caso aqui utilizado, por afinidade a
íons metálicos imobilizados (IMAC). Neste último caso, ocorre a interação entre espécies
doadoras de elétrons presentes na superfície de proteínas, como grupamentos tiol dos
resíduos de cisteína, indol do triptofano ou imidazol da histidina, com íons metálicos
coordenados em um suporte sólido (Porath, 1992).
Para isso, utilizou-se a coluna HisTrapTM HP (GE Healthcare) de 5 mL pré-
empacotada e coordenada com íons de Ni+2, os quais atuam como centros de adsorção e
interagem com os grupamentos imidazol existentes nos resíduos de histidina da cauda de
poli-His. Após a ligação na coluna e etapas de lavagem para eluição das proteínas
41
contaminantes presentes no extrato celular bacteriano, a proteína pode ser eluída da coluna
por competição com outras moléculas doadoras de elétrons, como o imidazol, por exemplo.
O processo de purificação foi feito com a coluna de afinidade acoplada ao
sistema de FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) AKTA (Amershan Pharmacia Biotech).
Para isso, o lisado obtido da sonicação e centrifugação das células bacterianas foi aplicado na
coluna previamente equilibrada com tampão A (Tabela 2). Em seguida, 10 volumes de coluna
(CV) do mesmo tampão foram utilizados para eluição das proteínas contaminantes que não
interagem na coluna (flowthrough). A partir de então, iniciou-se um gradiente linear
crescente de tampão B, que contém maior concentração do competidor imidazol (500 mM)
até atingir 100% deste em 30 CV de eluição. A cromatografia foi feita sob fluxo de 3 mL/min
e pressão máxima de 0,3 MPa. Os tampões utilizados para este etapa da purificação para
cada proteína estão indicados na Tabela 2.
Tabela 2: Tampões utilizados para cromatografia de afinidade.
Proteína Tampões
SbCHIP e HsHsc70
A 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5; 250 mM NaCl; 20 mM imidazol
B 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5; 250 mM NaCl; 500 mM imidazol
- Cromatografia de exclusão por tamanho ou filtração em gel
A próxima etapa de purificação empregada para obtenção de proteínas puras foi
a cromatografia de exclusão por tamanho ou filtração em gel. Este tipo de cromatografia é
um método muito utilizado e bem conhecido de separação de moléculas dependendo de seu
tamanho e massa molecular. Para que a separação ocorra, a fase estacionária das colunas de
filtração em gel é formada por um material poroso, que pode consistir de uma matriz de
poliacrilamida, agarose ou dextran, pelo qual as moléculas de diferentes tamanhos são
filtradas (Duong-Ly e Gabelli, 2014). As moléculas podem entrar ou não nos poros da resina,
dependendo do seu tamanho e do tamanho dos poros formados. Moléculas maiores são
incapazes de entrar nesses poros, percorrem um caminho menor e são eluídas num volume
de eluição menor do que moléculas pequenas, cujas dimensões possibilitam que elas
percorram um caminho maior, passando pelo interior desses poros (Sepsey et al., 2014).
42
As colunas de exclusão por tamanho são caracterizadas pelas resinas que a
compõe, pelo seu volume morto e pelo volume final. O tipo de resina determina o tamanho
dos poros e a capacidade de separação da coluna, isto é, o tamanho máximo e mínino das
moléculas que podem ser separadas. Moléculas com tamanho maior ou igual ao máximo de
separação serão eluídas no volume morto da coluna, que também corresponde ao volume
não ocupado pela fase estacionária. Moléculas com tamanho menor ou igual ao mínimo de
separação serão eluídas no volume final da coluna. Além de ser usada na purificação de
proteínas, a cromatografia de exclusão por tamanho pode também ser usada como
ferramenta para caracterização de parâmetros hidrodinâmicos das proteínas, uma vez que
seu princípio de funcionamento está intimamente ligado ao tamanho das moléculas.
A coluna utilizada para purificação das proteínas deste trabalho foi a HiLoad
Superdex 200 XK 26/60 (GE Healthcare) acoplada ao sistema de FPLC (Fast Protein Liquid
Chromatography) ÄKTA (Amershan Pharmacia Biotech). O tampão utilizado para esta etapa
de purificação para SbCHIP e HsHsc70 é composto de 20 mM de Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5 e
250 mM de NaCl. Em todas as corridas de filtração em gel, a coluna foi primeiramente
equilibrada com pelo menos um CV de tampão, em seguida a amostra foi aplicada na coluna
e eluída com um CV de tampão, em fluxo de 2,5 mL/min e pressão máxima de 0,5 MPa.
Absorbância a 280 nm foi monitorada para determinar o volume de eluição das proteínas
eluídas.
1.3.5. Determinação da concentração e grau de pureza das proteínas
Durante a purificação, as frações coletadas nas etapas cromatográficas foram
analisadas por eletroforese de SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Para isso, as amostras foram
diluídas na proporção 1:1 com tampão de amostra para eletroforese (Tris-HCl 50 mM pH 6,8;
DTT 100 mM; SDS 2%; azul de bromofenol 0,1% e glicerol 10%) e aplicadas em gel de
poliacrilamida juntamente com um padrão de massa molecular (Broad Range Promega).
Para o gel: foram preparados o gel de empacotamento, contendo 6% de mix acrilamida/bis-
acrilamida, 150 mM Tris pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% de persulfato de amônio e TEMED e o gel de
separação contendo 10-15% de mix acrilamida/bis-acrilamida, 400 mM Tris pH 8,8, 0,1%
SDS, 0,1% de persulfato de amônio e TEMED. A eletroforese foi realizada no aparato Mini-
PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad) com corrente fixa de 15 A por gel. Os géis foram corados em
solução etanol:ácido acético:água 5:1:15 (v:v:v) e Coomassie Brilliant Blue R (Bio-Rad) 0,25%
43
e descorado em ácido acético:etanol:água 3:2:35 (v:v:v). As proteínas tiveram seu grau de
pureza avaliada pela análise quantitativa comparativa das bandas de interesse observadas
pelos SDS-PAGE através do programa ImageJ (Schneider et al., 2012).
Após o processo de purificação, a concentração das proteínas foi determinada
pelo método de Edelhock (Edelhoch, 1967), pelo qual foi medida absorbância das amostras a
280 nm, assumindo que os resíduos de triptofano e tirosina foram completamente expostos
na presença de 6M de cloreto de guanidina em tampão 25 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 6,5. As
amostras foram incubadas durante 10 min a temperatura ambiente e a absorbância foi
medida utilizando o espectrofotômetro GenesysTM 10S UV-Vis (Thermo Scientific). Os valores
de absorbância foram convertidos em concentração de proteína através da lei de Beer-
Lambert:
onde A é a absorbância, l é o comprimento do caminho ótico (cm), ε é o
coeficiente de absorbância molar (M-1.cm-1) e C é a concentração molar (mol/L).
O coeficiente de absorbância molar da proteína foi calculado, pela fórmula
abaixo (Pace et al., 1995), levando em consideração os coeficientes de absorbância molar
dos resíduos de triptofano, tirosina e cistina:
( ) ( ) ( )
1.3.6. Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD)
Dicroísmo circular é uma técnica espectropolarimétrica amplamente usada para
o estudo da conformação e estabilidade de proteínas, fornecendo informações sobre a
composição global de estrutura secundária. Esse método utiliza a luz circularmente
polarizada resultante da combinação de dois feixes de luz linearmente polarizados, um na
horizontal e outro na vertical. A luz circularmente polarizada à direita e à esquerda é incidida
na amostra e moléculas quirais com estruturas assimétricas são capazes de absorver essa
luz. A diferença de absorção à esquerda e à direita resulta em uma luz elipticamente
polarizada e o ângulo (θ) é a elipticidade medida em mdeg (Corrêa e Ramos, 2009).
44
As proteínas são moléculas quirais tanto pela característica assimétrica da
ligação peptídica quanto pelas interações formadas na estrutura secundária. Desse modo,
proteínas com diferente composição de estrutura secundária apresentam espectros de CD
característicos (Figura 7). Proteínas ricas em hélices-α apresentam bandas negativas a 222 e
208 nm e uma banda positiva a 193 nm; proteínas com folhas-β bem definidas apresentam
uma banda negativa a 217 nm e uma banda positiva a 195 nm; e proteínas com estrutura
desordenada apresentam baixa elipcidade acima de 210 nm e uma banda negativa a 200 nm
(Greenfield, 2006).
Para a obtenção dos espectros de CD de SbCHIP foi utilizado o
espectropolarímetro J-720 (JASCO) sob fluxo constante de 10 L/min de N2. As amostras de
proteínas em diferentes concentrações foram colocadas em cubetas de quartzo de 1 mm de
caminho óptico. Os espectros foram obtidos pela média acumulada de 16 espectros de 200 a
260 nm medidos a 20 nm/min com 1 s de tempo de resposta, subtraídos da média de sinal
obtido do tampão. A temperatura da cela foi mantida constante a 25 °C através de um
sistema interno de controle (Peltier Type Control System PFD 425S- Jasco).
Figura 7: Perfil de dicroísmo circular para estruturas secundárias de proteínas. Proteínas compostas majoritariamente por hélicea-α apresentam espectro com uma banda positiva em 190 nm e duas bandas negativas em 208 e 222 nm. As proteínas ricas em folhas-β apresentam uma banda positiva em torno de 195 nm e uma banda negativa em torno de 217 nm. E proteínas com estrutura desordenada apresentam banda negativa próxima de 200 nm.
45
Para o tratamento dos dados, o sinal de CD medido (mdeg) foi convertido para
elipticidade molar residual ([θ]) que é definida pela seguinte equação:
[ ]
onde θ é a elipticidade em miligraus (mdeg), MM é a massa molecular da
proteína (g/mol), C é a concentração da proteína (mg/mL), l é o comprimento do caminho
ótico (cm) e n é o número de resíduos de aminoácidos da respectiva proteína. Para calcular a
fração de hélices-α (fH) presente na estrutura de SbCHIP foi utilizada a equação abaixo e a
elipcidade molar residual a 222 nm (Morriset et al., 1973).
[ ]
Além de determinar a composição de estrutura secundária, pode-se utilizar o CD
como sonda para acompanhar o desenovelamento de proteínas induzido por temperatura
ou por agentes desnaturantes. Para desenovelamento induzido por temperatura o sinal de
CD a 222nm de 5 µM de SbCHIP foi monitorado em cubeta de quartzo de 2 mm ao longo do
aumento de temperatura de 20 até 90 °C; enquanto para o desenovelamento induzido por
ureia, o sinal foi monitorado em soluções contendo 5 µM de SbCHIP e concentrações
crescentes de ureia de 0 até 8 M. O valor da temperatura média no ponto de transição (Tm)
e concentração média de ureia no ponto de transição (Cm) foram obtidos pelo ajuste
sigmoidal da curva de desenovelamento de cada experimento.
1.3.7. Espectroscopia de fluorescência intrínseca do triptofano
A técnica de espectroscopia de fluorescência é baseada na capacidade de uma
substância de emitir luz quando excitada por radiações como a luz ultravioleta (UV), por
exemplo. A fluorescência ocorre quando um elétron de uma molécula retorna ao seu estado
fundamental, emitindo fótons de luz, depois de ser excitado para um estado quântico mais
elevado por algum tipo de energia. Esta técnica pode ser usada no estudo de proteínas
porque existem três aminoácidos capazes de emitir fluorescência quando excitados por luz
UV: o triptofano (W), a tirosina (Y) e a fenilalanina (F), todos com anéis aromáticos em sua
46
estrutura. Em comparação com os outros resíduos, o sinal de fluorescência do W é o mais
intenso quando há excitação a 280 ou 295 nm e a medida de seu espectro de emissão
apresenta intensidade máxima de fluorescência em comprimentos de onda (λ) diferentes de
acordo com a polaridade do meio que se encontra. Por esse motivo, essa técnica permite
utilizar os resíduos de triptofano como sonda local para obtenção de informações sobre a
conformação de proteínas. Quando a proteína está enovelada, os resíduos de triptofano
geralmente estão localizados no interior na proteína, num ambiente apolar não exposto ao
solvente, e fluorescem em λ < 340 nm. No entanto, quando a proteína é desenovelada, pela
adição de um agente desnaturante como ureia, por exemplo, este resíduo é exposto ao
solvente, encontra-se em um ambiente polar e fluoresce em λ >340 nm (Lakowicz, 2006).
Dessa forma, os experimentos para medir emissão de fluorescência de triptofano
foram conduzidos a 25 °C com amostras de SbCHIP a 4 µM em tampão 20 mM
Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl, na ausência e presença de 8M de ureia, em
cubetas de quartzo de quatro faces polidas de 1 x 1 cm de caminho ótico. Os espectros de
emissão foram medidos com excitação a 280 nm, os dados foram coletados a cada 1 nm
dentro do intervalo de 300 a 400 nm usando fluorímetro Cary Eclypse (Varian). A análise dos
dados foi realizada através da observação do comprimento de onda máximo (λ máx) e do
cálculo do centro de massa espectral (<λ>), pela equação abaixo, onde λi corresponde a cada
comprimento de onda e Fi à intensidade de fluorescência em λi.
∑
∑
1.3.8. Fluorimetria de varredura diferencial (DSF)
Além da medida de CD, utilizou-se o DSF para analisar a estabilidade térmica de
SbCHIP. Essa técnica utiliza uma sonda que fluoresce quando se liga em resíduos
hidrofóbicos são expostos pelo desenovelamento da proteína induzido por temperatura.
Para tal, ao longo da rampa de temperatura de 25 a 97 °C a 1,8 °C/min, a emissão de
fluorescência da sonda excitada a 575 nm foi monitorada em tempo real através do
equipamento StepOne Plus real-time PCR System (Applied Biosciences). O experimento foi
realizado em quadruplicata para cada concentração de proteína utilizada (2,5, 5 ou 10 µM).
As reações foram preparadas com volume final de 20 µL em tiras de 8 poços, como descrito
47
no manual do fabricante Protein Thermal Shift Dye Kit (Thermo Fisher Scientific).
Resumidamente, cada reação continha: 5 µL de tampão Protein Thermal Shift™, 2,5 µL da
sonda Diluted Protein Thermal Shift Dye™ (10x) e 12,5 µL de proteína SbCHIP de forma que a
concentração final fosse uma das indicadas. Os brancos continham 12,5 µL de tampão. As
tiras foram tampadas e centrifugadas por 1 min a 1000 rpm (4 °C). O programa utilizado para
a obtenção dos dados foi StepOne Software 2.3 e o programa utilizado para o tratamento
dos dados e cálculo das derivadas das curvas foi Protein Thermal Shift Software 1.1.
1.3.9. Calorimetria de varredura diferencial (DSC)
A calorimetria de varredura diferencial (DSC) é uma técnica termo analítica
utilizada para a determinação da estabilidade térmica de uma proteína através da medida de
mudanças de calor associadas à desnaturação proteica induzida por aumentos de
temperatura constantes. Normalmente, proteínas em solução estão em equilíbrio entre suas
formas nativa e desenovelada, o aumento de temperatura desloca o equilíbrio induzindo a
desnaturação da molécula e o DSC mede a entalpia do processo de desenovelamento
resultante dessa desnaturação (Bruylants et al., 2005).
Basicamente, o sistema do DSC consiste de uma célula de referência e uma
célula de amostra que devem permanecer na mesma temperatura enquanto elas são
aquecidas. A célula de referência deve ser preenchida com tampão e a célula de amostra
com a proteína de interesse em solução. Conforme ocorre o aumento de temperatura nas
duas células, a absorção de calor que acontece quando a proteína desenovela causa
diferença de temperatura entre a célula de amostra e a célula de referência. O sistema do
DSC é programado para igualar a diferença de temperatura entre as células, através da
liberação de diferença de potencial (DP) usada para manter a temperatura igual entre as
células (Figura 8). Essa medida é convertida na quantidade de calor que compreende a
mudança de calor gerada pelo desenovelamento proteico (Bruylants et al., 2005; Johnson,
2013).
48
Figura 8: Esquema ilustrando a composição do sistema de DSC. O sistema é composto por uma célula de referência e uma célula de amostra que devem permanecer na mesma temperatura enquanto elas são aquecidas. A célula de referência deve ser preenchida com o tampão e a célula de amostra com a proteína de interesse em solução. Conforme ocorre o aumento de temperatura nas duas células, a absorção de calor que acontece quando a proteína desenovela causa diferença de temperatura entre a célula de amostra e a célula de referência. O sistema, então, é programado para igualar a diferença de temperatura entre as células, através da liberação de diferença de potencial (DP) que é convertida na quantidade de calor que compreende a mudança de calor que gerou o desenovelamento ou interação entre as proteínas (esquema adaptado do site do fabricante Malvern).
Os experimentos foram realizados com amostras de SbCHIP a 50 e 200 µM em
tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl, o mesmo tampão foi utilizado
como referência. Inicialmente, para calibração do equipamento foram realizadas 20
varreduras de 20 a 90 °C utilizando tampão na célula de referência e na célula de amostra.
Para a determinação da estabilidade térmica da SbCHIP, foram realizadas duas varreduras de
20 a 35 °C e em seguida duas varreduras de 20 a 90 °C. A média das varreduras de tampão-
tampão foi subtraída da primeira varredura (20 a 90 °C) obtida com as amostras de proteína.
Os experimentos foram realizados em MicroCal VP-DSC (Malvern) e a análise dos dados foi
feita pelo programa Origin® 7.0 VP-DSC pelo qual foi possível subtrair as varreduras do
tampão, gerar uma linha base e calcular parâmetros calorimétricos temperatura no ponto
médio de transição (Tm), variação de entalpia (ΔH).
49
1.3.10. Cromatografia de exclusão por tamanho acoplada a um detector multi-ângulo
de espalhamento de luz (SEC-MALS)
Para determinação da massa molecular de SbCHIP, e consequentemente seu
estado oligomérico em solução, foi utilizada a técnica de SEC-MALS. Essa técnica acopla o
detector de absorbância a 280 nm monitorada de uma cromatografia analítica de exclusão
por tamanho (SEC) com detectores de espalhamento de luz em diferentes ângulos (MALS) e
um detector de índice de refração (RI), fornecendo uma medida de massa molecular
absoluta de moléculas em solução (Wyatt, 1993).
Os experimentos de SEC-MALS foram realizados em coluna Superdex 200 10/300
GL (GE Healthcare) de 25 mL, conectada ao sistema ÄKTA FPLC (Amershan Pharmacia
Biotech) para medição de absorbância a 280 nm. Esse sistema está acoplado aos
equipamentos: miniDAWN TREOS (Wyatt Technologies), que possui os três detectores de
espalhamento de luz localizados em 3 ângulos diferentes em relação à amostra; e Optilab T-
rEX (Wyatt Technologies), que mede o índice de refração (IR) da amostra, corrigindo assim
sua concentração para o calculo da massa molecular. A análise dos dados foi realizada pelo
software ASTRA (Wyatt Technologies).
A cromatografia analítica foi feita sob fluxo constante de 0,5 mL/min, com
pressão máxima de 1,5 Mpa com coluna previamente equilibrada com tampão 20 mM
Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl, com do detector de espalhamento de luz acusando
valores inferiores a 0,02 V e a leitura do índice de refração acusando valores inferiores a
0,001 RIU. Foram aplicados 500 μL de SbCHIP em diferentes concentrações, previamente
centrifugadas por 15 minutos a 13.000 x g e filtradas em 0,22 μM. A massa molecular média
de SbCHIP foi determinada pela média da triplicata dos experimentos realizados.
A técnica de SEC-MALS também foi utilizada para determinação da interação
entre SbCHIP e HsHsc70. Para isso, as proteínas SbCHIP e HsHsc70 foram incubadas por 4 h a
4 °C separadamente ou em conjunto em três proporções de concentração diferentes: 50 µM
SbCHIP e 25 µM HsHsc70; 25 µM SbCHIP e 50 µM HsHsc70 e 50 µM SbCHIP e 50 µM
HsHsc70. Após incubação, as amostras foram aplicadas na coluna Superdex 200 Increase
10/300 GL (GE Healthcare) de 22 mL, conectada aos detectores acima mencionados de
absorbância, espalhamento de luz e índice de refração. Ao longo da cromatografia foram
coletadas frações de 0,5 mL, as quais foram analisadas por SDS-PAGE 12%. Os perfis
50
cromatográficos, o SDS-PAGE e as massas medidas em cada pico obtido foram utilizados
para caracterização da formação de complexos entre as proteínas.
1.3.11. Espalhamento de luz dinâmico (DLS)
O espalhamento de luz dinâmico (DLS) foi utilizado para a determinação do
coeficiente de difusão de SbCHIP. Essa técnica mede as flutuações da intensidade de
espalhamento de luz das partículas em solução ao longo do tempo. Essas flutuações são
decorrentes do movimento Browniano ao qual as partículas estão sujeitas em solução,
sendo que a intensidade de movimentação é inversamente proporcional ao tamanho das
partículas, ou seja, moléculas pequenas movem-se mais rapidamente e espalham menos luz
do que moléculas maiores (Bloomfield, 1981; Banachowicz, 2006; Jachimska et al., 2008). A
análise das flutuações de intensidade de espalhamento de luz ao longo do tempo permite a
determinação do coeficiente de difusão da proteína, que pode ser convertido em
distribuição de tamanho pela equação de Stokes-Einstein (Edward, 1970).
As medidas foram realizadas em equipamento Zetasizer Nano ZS-Zen 3600
(Malvern) a 25 °C usando cubetas de plástico de 1 cm contendo 50 µM de SbCHIP em
tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl. A curva de distribuição de
coeficiente de difusão foi obtida pela média de 50 leituras de 60 s e o valor médio de
coeficiente de difusão (D) foi obtido pela média de experimentos em quadruplicata.
1.3.12. Filtração em gel analítica (GFA) para determinação de raio hidrodinâmico
Além de auxiliar na purificação e caracterização da massa molecular absoluta de
proteínas, a GFA também pode ser utilizada para determinação do raio hidrodinâmico (Rh)
das proteínas em solução. Utilizando proteínas modelos globulares com massa e Rh
conhecidos é possível construir uma curva padrão que associa o Rh com o coeficiente de
distribuição dessas proteínas pela eluição na coluna de filtração em gel utilizada. O
coeficiente de distribuição (Kav) é determinado com base no volume de eluição (Ve) de cada
proteína, no volume morto (Vo) e no volume total (Vt) da coluna cromatográfica, segundo a
fórmula abaixo:
51
Dessa forma, para os experimentos de filtração em gel analítica foi utilizada a
coluna de Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) de 25 mL, previamente equilibrada com
tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl e conectada ao sistema ÄKTA FPLC
(Amershan Pharmacia Biotech). O fluxo da corrida foi de 0,5 mL/min, pressão máxima de 1,5
MPa e absorbância a 280 nm foi monitorada para determinação do volume de eluição de
cada proteína. Para determinar o volume morto da coluna foram utilizados 2 mg/mL de azul
de dextran e para a curva padrão foram utilizadas 1 mg/mL das proteínas indicadas na
Tabela 3 obtidas do Gel Filtration Calibration Kit (GE Healthcare). O volume de eluição da
proteína SbCHIP a 50 µM também foi utilizado para obter seu coeficiente de distribuição na
GFA, nas mesmas condições utilizadas. Com o coeficiente de distribuição das proteínas
modelo construiu-se um gráfico de Rh em função de (-log Kav)1/2 e a partir do ajuste linear
dos pontos obteve-se uma equação de reta utilizada para estimar o Rh de SbCHIP.
Tabela 3: Proteínas modelos utilizadas na GFA para determinação de Rh.
Proteína MM (kDA) Rh (Å)
Ribonuclease A 13,7 16,4
Anidrase carbônica 29,0 23,0
Ovalbumina 43,0 30,5
Conalbumina 75,0 36,5
Aldolase 158,0 48,1
Ferritina 440,0 61,0
52
1.3.13. Análise dos parâmetros hidrodinâmicos
A fim de comparar os parâmetros de massa molecular, coeficiente de difusão (D)
e raio hidrodinâmico (Rh) obtidos pelas técnicas biofísicas com parâmetros teóricos
calculados considerando a proteína como uma esfera rígida não hidratada de mesma massa,
as seguintes equações foram utilizadas, sendo a primeira conhecida como equação de
Stokes-Einstein:
(
)
onde D é o coeficiente de difusão (cm2/s), Kb é constante de Boltzman (1,38 x 10-
23 J/K), T é a temperatura (K), π é 3,14, η é a viscosidade do solvente (da água, 1,002 x 10-2
Poise), Rh é o raio hidrodinâmico (m), MM é a massa molar (g/mol), Vbar é o volume parcial
específico (da água 0,7269 cm3/g) e N é o número de avogrado (6,023 x 1023 Da/g).
Para obter informações sobre o formato da proteína foi utilizado o fator de
Perrin (f/f0), definido como a razão da medida do coeficiente friccional da proteína (f) com o
de uma esfera de mesma massa (f0). O coeficiente fricional está relacionado com o
coeficiente de difusão da proteína, de acordo com a fórmula abaixo. Considerando uma
mesma temperatura e a constante de Boltzman, o fator de Perrin pode ser calculado pela
razão entre coeficiente de difusão (D) da proteína e o D teórico (Harold e Erickson, 2009).
1.3.14. Espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS)
Espalhamento de raios X a baixo ângulo é um método bastante utilizado para a
caracterização estrutural em baixa resolução (até 8 nm) de proteínas em solução,
fornecendo informações a respeito do seu tamanho e formato. O experimento consiste de
uma solução de moléculas aplicada em um porta-amostra sobre a qual incide um feixe de
raios X monocromático, onde a intensidade de luz espalhada é detectada por um detector
de raios X. O padrão de espalhamento do tampão também é medido e subtraído do
53
espalhamento obtido para a solução de amostra e o padrão resultante está relacionado ao
tamanho e formato intrínseco da proteína de interesse em solução (Kikhney e Svergun,
2015). Os experimentos de SAXS são geralmente realizados em fontes de luz síncrotron que
geram raios X de alta intensidade, dessa maneira a coleta de dados foi conduzida no
Laboratório Nacional de Luz Síncroton (LNLS) encontrado no Centro Nacional de Pesquisa em
Energia e Materiais (CNPEM) na linha de luz D11A – SAXS1. As medidas foram realizadas a 20
°C em célula de mica de 1 mm com um feixe de raios X monocromático de comprimento de
onda igual a 1,488 Å. A amostra permanece a uma distância de cerca de 1000 mm,
resultando em uma faixa do vetor de espalhamento efetivo de 0,015 < q < 0,32 Å-1, onde s é
a magnitude do vetor de espalhamento definido por q = (4π/λ)sinθ (θ é o ângulo de
espalhamento).
Durante a coleta, as curvas de intensidade de espalhamento foram corrigidas
para a resposta do detector, pela intensidade do feixe incidente e absorção da amostra. De
acordo com a tolerância da amostra à exposição aos raios X, foram determinados os tempos
de exposição de cada coleta, sendo realizadas 10 coletas em cada tempo (20, 60 ou 100 s).
As coletas foram realizadas com amostras de SbCHIP em diferentes concentrações (10 a 60
µM) em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl.
Várias características da amostra podem ser obtidas diretamente pela curva de
espalhamento, como dimensão máxima (Dmax), raio de giro (Rg) e o formato da proteína em
estudo, em especial nos casos em que as amostras são monodispersas, onde todas as
partículas em solução são idênticas (Kikhney e Svergun, 2015). O processamento de dados
foi realizado através dos programas contidos no ATSAS (Franke et al., 2017). Através da
aproximação de Guinier, foi possível obter o raio de giro (Rg) da proteína (Guinier, 1939); a
dimensão máxima de partícula (Dmáx) foi obtida através da função P(r). Outra análise
realizada a partir das curvas de espalhamento é a análise de Kratky pela qual se tem
informações sobre o grau de enovelamento, rigidez e flexibilidade da estrutura proteica
(Glatter e Kratky, 1982; Mertens e Svergun, 2010).
54
1.3.15. Ensaio de ubiquitinação
Com a finalidade de determinar a atividade de ubiquitinação da proteína SbCHIP
foram feitos ensaios de ubiquitinação in vitro usando o kit E2-Ubiquitin Conjugation (Abcam
139472) e seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante com ligeiras modificações. Com
exceção da enzima E3 (SbCHIP), da pirofosfatase (Sigma-Aldrich® I1643) e dos alvos de
ubiquitinação (SsHsp70, SsHsp90, HsHsc70 e luciferase), todos os componentes da reação
foram fornecidos pelo fabricante. As seguintes enzimas E2 de conjugação à ubiquitina foram
utilizadas: UbcH1 (UBE2K), UbcH3 (UBE2R1), UbcH5a,b,c (UBE2D1/2/3), UbcH6 (UBE2E1),
UbcH7 (UBE2L3), UbcH8 (UBE2E2), UbcH10 (UBE2C) e UbcH13/Mms2 (UBE2N).
Em resumo, foram preparadas reações de 20 µL contendo: 1x tampão de
ubiquitinação, 2,5 µM de ubiquitina biotinilada, 20 U/mL de pirofosfatase, 1 mM de DTT, 5
mM Mg-ATP, 100 nM de enzima E1 (enzima de ativação da ubiquitina), 2,5 µM de enzima E2
e 5 µM de SbCHIP (E3 ubiquitina ligase). As reações para avaliar a ubiquitinação de
substratos proteicos continham todos esses componentes e também 5 µM de um dos alvos
utilizados: SsHsp70, SsHsp90, HsHsc70 ou luciferase; nesses casos a concentração de SbCHIP
foi de 2,5 µM. Como controles negativos foram preparadas reações na ausência de SbCHIP e
de enzima E2.
As reações foram, então, incubadas por 4 h a 37 °C. Nos tempos de 1 e 4 h foram
coletadas alíquotas de 10 µL das reações, às quais foram adicionados 10 µL de tampão não-
redutor para SDS-PAGE (2x Non-reducing gel loading buffer). As amostras foram então
separadas por SDS-PAGE gradiente de 10 a 15% e analisadas por Western Blotting. Para
detecção das proteínas ubiquitinadas foi usada Streptavidin-HRP (Sigma-Aldrich® S9420),
que tem alta afinidade pela biotina fusionada na ubiquitina utilizada nas reações. Além disso,
também foram usados anticorpos específicos para detecção de HsHsp70 e SsHsp70
(HSP70/HSC70 Plant antibody SPC-312D – StressMarq), da Myc-Luciferase (c-Myc tag
antibody 9E10 – Invitrogen) e da His-SsHsp90 (Anti-His Antibody 27-4710-01 – GE
Healthcare).
55
1.4. Resultados
1.4.1. Análise de similaridade de sequências e obtenção do clone que codifica
SbCHIP
Para a sequência que codifica a proteína SbCHIP e, então, obtê-la pura em
solução, a sequência otimizada foi inserida em plasmídeo de expressão pET28a, entre os
sítios de clivagem das enzimas NdeI e XhoI, o que permitiu a inserção de uma sequência que
codifica uma cauda de poli-histidina na região N-terminal da proteína. As sequências de
nucleotídeos e aminoácidos obtidas a partir do sequenciamento confirmatório da clonagem
estão mostradas na Figura 9.
O clone é constituído por 888 nucleotídeos que codificam 295 resíduos de
aminoácidos, que incluem a cauda de poli-His (resíduos 1-21), seguida pelo domínio TPR
(resíduos 21-133), da região de dimerização (137-213) e do domínio U-box (resíduos 220-
284). Considerando resíduos da sequência primária, calculou-se a massa molecular de 33
kDa e o pI teórico de 6,7. Existem 5 resíduos de triptofano na sequência de SbCHIP, os quais
facilitam a determinação da concentração da proteína em solução, pela medida de
absorbância a 280 nm, e permitem que os experimentos de fluorescência intrínseca sejam
realizados, levando em conta a polaridade do meio do ambiente do fluoróforo.
56
Figura 9: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos da proteína His-SbCHIP. A proteína é formada por 295 resíduos de aminoácidos, totalizando 33 kDa e incluindo uma cauda de poli-histidina na região N-terminal (cinza), o domínio TPR de interação com chaperonas (verde), o hairpin de dimerização (azul) e o domínio U-box de ubiquitinação de proteínas clientes (vermelho).
Com o intuito de determinar as relações de similaridade entre a sequência de
aminoácidos da SbCHIP com outras proteínas homólogas de outras espécies, foi realizado
um alinhamento de sequências (Figura 10A). Nele, é possível observar que alguns resíduos
são conservados na proteína, especialmente no domínio U-box na região C-terminal. Em
termos de identidade, obteve-se que a proteína CHIP de Arabidopsis thaliana (AtCHIP) é a
mais similar à SbCHIP, com 58% de identidade; as demais proteínas provenientes de animais
apresentaram identidade de cerca de 35% em relação à SbCHIP (Figura 10C). Como
consequência, o cladograma de similaridade realça a proximidade de AtCHIP com SbCHIP,
formando um clado isolado; enquanto que as CHIP de animais formam outro clado. A
proteína Ufd2 de levedura, a primeira proteína identificada com domínio U-box e conhecida
por ser uma E4 ubiquitina ligase, foi utilizada como grupo externo.
57
Figura 10: Análise de similaridade de sequência da proteína SbCHIP. (A) Alinhamento da sequência de aminoácidos de SbCHIP com proteínas homólogas de camundongo (MmCHIP), humano (HsCHIP), Drosophila (DmCHIP), peixe zebra (DrCHIP), C. elegans (CeCHIP) e Arabidopsis thaliana (AtCHIP). (B) O alinhamento obtido foi utilizado para a obtenção de uma matriz de similaridade que gerou um cladograma pelo método de Neighbor-joining. (C) Matriz de porcentagem de identidade das sequências utilizadas no alinhamento. Pode-se perceber que vários resíduos que compõem os domínios TPR (N-terminal) e U-box (C-terminal) são altamente conservados em todas as espécies. A proteína de A. thaliana foi a que apresentou maior identidade (~60%) enquanto as demais apresentaram cerca de 35% de identidade.
1.4.2. Padronização da expressão e purificação de SbCHIP
O plasmídeo contendo a sequência que codifica a proteína SbCHIP foi
transformado em células competentes de E. coli BL21(DE3) para padronização das condições
ótimas de expressão. Para isso, foram realizados testes em pequena escala usando
diferentes temperaturas (20, 25, 30 e 37 °C) e tempos de indução (2 h, overnight), através da
análise por SDS-PAGE de amostras dos lisados totais de bactérias (Figura 11A) e das frações
58
solúveis e insolúveis resultantes da centrifugação desses lisados (Figura 11B a E). Como é
possível observar no SDS-PAGE, destaca-se uma banda mais intensa que migrou com massa
molecular entre 31 e 45 kDa, correspondendo à expressão da proteína SbCHIP. Percebe-se
ainda que para todas as temperaturas testadas, maior foi a quantidade de proteína expressa
conforme maior o tempo de indução (Figura 11A), porém também aumentou a quantidade
de SbCHIP presente na fração insolúvel (P) (Figuras 11B a E). Dessa forma, considerando o
menor tempo de indução para maior quantidade de proteína solúvel (S), determinou-se que
a melhor condição de expressão ocorreu a 30 °C por 5 h (Figura 11D).
Após a determinação da condição ótima para expressão de SbCHIP em E. coli,
essa condição foi repetida em larga escala (500 mL de meio de cultura) para as etapas de
purificação. A presença da cauda de poli-histidina permitiu que a cromatografia de afinidade
ao níquel fosse a primeira etapa utilizada (Figura 12A e B). Após a lise das células bacterianas
que expressaram SbCHIP, o lisado foi aplicado na coluna cromatográfica, seguido de
lavagens com tampão A para remoção das proteínas com pouca ou nenhuma interação com
o níquel da resina. Em seguida, a proteína foi eluída através de um gradiente linear
crescente de tampão B em três picos principais (Figura 12A e B). No primeiro pico, eluído
com 25% de tampão B (125 mM de imidazol), a proteína SbCHIP foi observada juntamente
com uma banda de menor massa molecular. No segundo e no terceiro picos, eluídos com
40% e 50% de tampão B (200 e 250 mM de imidazol) respectivamente, a proteína foi eluída
já com alto grau de pureza.
59
Figura 11: Teste de expressão da proteína His-SbCHIP em diferentes tempos e temperaturas. O plasmídeo pET28a-His-SbCHIP foi transformado em E. coli BL21(DE3) e as células foram cultivadas a 37 °C em meio LB contendo 30 µg/mL de canamicina até atingir A600nm entre 0,6 e 0,8. A expressão da proteína foi induzida pela adição de 0,5 mM de IPTG nas temperaturas e tempos indicados. Em seguida, as células foram centrifugadas, ressupendidas em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 8,0; 200 mM NaCl; 20 mM imidazol e lisadas por sonicação. (A) O lisado obtido foi analisado por SDS-PAGE 12% ou foi centrifugado gerando as frações solúvel (S) e insolúvel (P) de indução a (B) 20 °C, (C) 25 °C, (D) 30 °C e (E) 37 °C. As frações de cada condição também foram analisadas por SDS-PAGE 12%. (M) padrão de massa molecular; (NI) fração não induzida, antes da adição de IPTG; (P) precipitado fração insolúvel; (S) lisado solúvel. Verificamos que a proteína foi expressa em maior quantidade na fração solúvel se induzida a 30 °C por 5h.
60
As frações do pico dois da cromatografia de afinidade ao níquel foram utilizadas
para a cromatografia de exclusão por tamanho (Figuras 12C e D), que poderia separar
diferentes estados oligoméricos da proteína e também impurezas não observáveis no SDS-
PAGE, como açúcares e ácidos nucléicos. No entanto, a proteína foi predominantemente
eluída em um único pico, com volume de ~200 mL, indicando uma única espécie em solução.
Também foi observado um pico menos intenso em 130 mL, mas que não mostrou bandas
visíveis no SDS-PAGE.
Através destas etapas cromatográficas, a proteína SbCHIP foi obtida pura, com
grau de pureza acima de 95% e com rendimento de aproximadamente 85 mg/L de indução.
Após a determinação da concentração das frações contendo a proteína pura, esta foi
armazenada a 4 °C para uso posterior. O processo de purificação foi repetido a cada 30 dias,
tempo em que se garantiu estabilidade da proteína, sem que houvesse desenovelamento,
degradação e/ou agregação.
A concentração máxima de SbCHIP obtida diretamente após a purificação foi de
cerca de 60 µM. A fim de obter maiores concentrações de amostra, necessária para alguns
experimentos, inicialmente foi testada a concentração da proteína através do uso de
concentradores com filtro para centrífuga Amicon®, porém, verificou-se precipitação da
proteína nos concentradores. Dessa forma, a evaporação no vácuo (utilizando Eppendorf
Concentrator Plus) foi utilizada como método alternativo para obtenção de SbCHIP em
solução em alta concentração. Através desse método, a concentração máxima alcançada foi
de até cerca de 450 µM, permanecendo solúvel quando dialisada em tampão 20 mM
Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 500 mM NaCl.
61
Figura 12: Purificação da proteína His-SbCHIP por cromatografia de afinidade ao níquel e de exclusão por tamanho. Após a indução de expressão proteica a 30 °C por 5h, as células foram centrifugadas e ressuspendidas em tampão A. Em seguida, as células foram lisadas por sonicação e o lisado foi centrifugado. O sobrenadante resultante foi aplicado em coluna HisTrapTM HP (GE Healthcare) de 5 mL com fluxo de 3 mL/min. (A) Cromatograma da afinidade ao níquel obtido na purificação, no qual observa-se que depois da etapa de lavagem com 10 volumes de coluna (CV) de tampão A, SbCHIP foi eluída em três picos, um primeiro com 25% de tampão B (125 mM de imidazol), onde são observadas outras impurezas, um segundo predominante com 40% de tampão B (200 mM de imidazol) e um terceiro com 50% de tampão B (250 mM de imidazol). (B) As frações coletadas durante a cromatografia de afinidade ao níquel foram analisadas por SDS-PAGE 12%. (M) padrão de massa molecular; (I) input aplicado na coluna; (FT) flowthrough; (W) lavagem. (C) Cromatograma da exclusão por tamanho. Nesta etapa, as frações do pico 2 da etapa anterior foram aplicadas na coluna HiLoad Superdex200 XK 26/60 (GE Healthcare) de 360 mL pré-equilibrada em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl, sob fluxo constante de 2,5 mL/min. Observa-se a eluição majoritária de SbCHIP no volume de ~200 mL. (D) As frações coletadas durante a cromatografia de exclusão por tamanho foram analisadas por SDS-PAGE 12%. (M) padrão de massa molecular; (I) input aplicado na coluna. Através destas etapas observa-se que a proteína foi obtida em alto grau de pureza (> 95%) e com rendimento de ~85 mg/L de indução.
62
1.4.3. Caracterização da composição de estrutura secundária e estabilidade térmica
Ensaios de dicroísmo circular foram realizados para verificar o enovelamento de
SbCHIP purificada e para caracterizar sua composição de estrutura secundária. A forma do
espectro de CD obtido (Figura 13A), com dois mínimos de sinal de -21000 e -19000
deg.cm2.dmol-1 em 222 e 208 nm respectivamente, indica uma proteína com estrutura
composta predominantemente por hélices-α. O cálculo de fração de hélices-α (fH) indicou
uma quantidade aproximada de 55% de hélices-α.
Outra técnica empregada para avaliar o estado de enovelamento da proteína
SbCHIP foi a fluorescência intrínseca do triptofano, utilizada para investigar alterações locais
nos domínios onde este resíduo é encontrado na proteína. Através da excitação a 280 nm de
amostras de SbCHIP na ausência e presença de ureia e da medida dos espectros de emissão
de fluorescência, observou-se λ máximo de emissão de 335 nm para SbCHIP sem ureia e de
357 nm para a proteína na presença de ureia. O centro de massa (<λ>) calculado para os
espectros foi de 344 e 356 nm, na ausência e presença de ureia, respectivamente.
Figura 13: Espectros de dicroísmo circular e de emissão de fluorescência intrínseca do triptofano obtido para SbCHIP. (A) Os espectros de CD foram medidos usando 10 µM de SbCHIP em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl, usando cubeta de quatzo de 1 mm a 20 °C. Após subtração do espectro do tampão, os dados convertidos para elipcidade molar [θ] e estão representados como uma média de 16 espectros para cada proteína. A forma do espectro, com mínimos em 208 e 222 nm nm, indica composição de estrutura secundária composta majoritariamente de hélices-α. (B) Espectros de emissão de fluorescência foram obtidos com SbCHIP a 4 μM em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl na ausência e presença de 8 M de uréia, pela excitação da amostra a 280 nm em cubeta de 1 cm. Os dados foram coletados a cada 1 nm no intervalo de 300 a 400 nm. São mostradas a média de 4 espectros acumulados. Para SbCHIP nativa observou-se um máximo de emissão a 335 nm, enquanto na presença de 8 M de ureia, o máximo de emissão foi alterado para 357 nm.
63
O dicroísmo circular também foi utilizado para caracterização da estabilidade
térmica de SbCHIP, através da medida a 222 nm e com aumento de temperatura de 20 a 90
°C. Na curva de desenovelamento induzido por temperatura (Figura 14A), pode-se observar
que o sinal de CD manteve-se estável em cerca de -20000 deg.cm2.dmol-1 no aquecimento
de 20 até 42 °C. De 42 a 50 °C, o sinal diminuiu drasticamente atingindo valores de -2500
deg.cm2.dmol-1 e permaneceu dessa forma até 90 °C (quadrados pretos, Figura 14A). A
temperatura média no ponto de transição (Tm) obtida pelo ajuste sigmoidal da curva de
desenovalemanto foi de 46 ± 1 °C.
Após o aumento de temperatura, a amostra foi resfriada de 90 para 20 °C.
Durante todo o resfriamento (círculos vermelhos, Figura 14A) o sinal de CD permaneceu em
torno de -2500 deg.cm2.dmol-1, indicando que a proteína não foi capaz de se reenovelar
espontaneamente após o desenovelamento térmico. Além disso, foi possível observar
agregação e precipitação da amostra na cubeta após o aquecimento da amostra até 90 °C.
Ademais, quando SbCHIP foi aquecida até a Tm (46 °C) e depois resfriada (círculos azuis,
Figura 14A) o sinal de CD também não retornou ao valor inicial.
A técnica de DSF também foi realizada para obter informações sobre a
estabilidade térmica de SbCHIP. Através do aquecimento da amostra de 20 a 90 °C e de uma
sonda que fluoresce quando se liga em regiões hidrofóbicas foi possível caracterizar o
processo de desenovelamento da proteína. Pela derivada da emissão de fluorescência em
função da temperatura (Figura 14B) determinou-se a temperatura média no ponto de
transição de SbCHIP a 2,5, 5 e 10 µM. A Tm obtida foi de 46 °C e não houve variação em
função das concentrações testadas de SbCHIP.
Através de DSC foi possível realizar uma análise térmica da proteína SbCHIP,
obtendo-se informações complementares de sua estabilidade. Pelo termograma obtido da
variação de capacidade calorífica (Cp) em função da temperatura de 20 a 75 °C (Figura 14C),
foram observados dois picos de detecção de variação de calor entre as células do
equipamento. O primeiro pico, que se inicia a 40 °C e termina em 48 °C, é endotérmico com
valor máximo de Cp de 33,2 kCal/mol/°C. Já o segundo (de 48 °C a 55 °C), mostrou-se
exotérmico com Cp máximo a 51 °C de -13,5 kCal/mol/°C. Pelo ajuste não linear do primeiro
pico terminou-se a temperatura média no ponto de transição (Tm) igual a 46 ± 1 °C.
64
Figura 14: Caracterização da estabilidade de SbCHIP. (A) Desenovelamento térmico monitorado por CD. As curvas de desenovelamento induzido por temperatura foram obtidas com 5 µM de SbCHIP em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl através da medida de CD a 222 nm em cubeta de quartzo de 2 mm sob aumento de temperatura de 1 °C/min de 20 a 90 °C (quadrados pretos). A capacidade de reenovelamento espontânea foi avaliada pela medida de CD nas mesmas condições durante o resfriamento de 90 a 20 °C (círculos vermelhos) e de 46 °C a 20 °C (círculos azuis). O ajuste sigmoidal da curva (linha preta) foi utilizado para obtenção da Tm de 46 ± 1 °C. (B) Caracterização da estabilidade térmica por DSF. A proteína SbCHIP a 2,5, 5 e 10 µM foi incubada com tampão Protein Thermal Shift™, e a sonda Diluted Protein Thermal Shift Dye™ ao longo de uma rampa de temperatura de 25 a 97 °C a 1,8 °C/min. A emissão de fluorescência da sonda excitada a 575 nm foi monitorada e a curva representa a derivada da fluorescência em cada reação em função da temperatura para concentração de proteína testada. (C) Análise térmica por DSC. Amostras da proteína SbCHIP a 50 µM em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl foram utilizadas para realização de quatro varreduras sequenciais sob aumento constante de temperatura, duas primeiras de 20 a 35 °C e as duas últimas de 20 a 75 °C. A medida de diferença de potencial gerada da terceira varredura foi subtraída do tampão e normalizada para concentração de SbCHIP. Após a determinação manual de uma linha base, o termograma obtido (linha preta) foi ajustado através de um modelo não linear (linha vermelha), a partir do qual se obteve Tm = 46 ± 1 °C. (D) Desenovelamento e reenovelamento induzido por ureia monitorado por CD. A curva de desenovelamento (quadrados pretos) foi obtida através da medida de CD a 222 nm com 5 µM de SbCHIP em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl, em concentrações crescentes de ureia (0 a 8 M) em cubeta de quartzo de 2 mm. Pelo ajuste da curva obteve-se a Cm de 3,4 ± 0,1 M. A curva de reenovelamento (círculos vermelhos) foi obtida pela leitura de CD nas mesmas condições, mas partindo de uma solução da proteína em 8M de ureia e diminuindo até 1 M. Observa-se que quando desenovelada por um agente desnaturante, SbCHIP foi capaz de readquirir a estrutura secundária perdida.
65
Além disso, também foi caracterizado o desenovelamento de SbCHIP induzido
por um agente desnaturante (ureia). A proteína foi submetida à incubação com
concentrações crescentes de ureia e seu sinal de CD foi monitorado em 222 nm (quadrados
pretos, Figura 14D). É possível observar que o sinal permaneceu estável até a concentração
de 2,5 M de ureia, em seguida o sinal diminui drasticamente até 5 M de ureia, indicando que
em concentrações maiores essa a proteína está pelo menos parcialmente desenovelada,
com sinal de aproximadamente -2500 deg.cm2.dmol-1. A concentração de ureia no ponto
médio de transição (Cm) foi de 3,4 ± 0,1 M. Também foi analisado o reenovelamento de
SbCHIP, partindo de uma solução da proteína em 8M de ureia e diminuindo até 1 M (círculos
vermelhos, Figura 14D). Observa-se que a proteína readquire a estrutura secundária perdida,
atingindo a partir de 1,5 M de ureia o valor inicial de sinal de CD.
1.4.4. Caracterização de parâmetros hidrodinâmicos
Pelos experimentos de SEC-MALS foi possível determinar a massa absoluta da
proteína em solução. Através da medida de absorbância, espalhamento de luz e índice de
refração obteve-se um perfil cromatográfico com a distribuição de massa molecular em
função do volume de eluição para SbCHIP em diferentes concentrações, de 15 a 60 µM
(Figura 15A). Por este experimento, confirmou-se que a proteína encontra-se como uma
única espécie em solução, sendo eluída em um único pico com volume de eluição de
aproximadamente 18 mL. A massa molecular absoluta média medida para SbCHIP foi de 65 ±
4 kDa, indicando que a proteína é um dímero em solução, uma vez que a massa teórica do
monômero é de 33 kDa. Tanto volume de eluição quanto a massa molecular não foram
afetados pela variação de concentração, nas condições testadas.
Para determinação do coeficiente de difusão (D) da SbCHIP foram realizados
experimentos de DLS. Pela curva de distribuição de D em função da intensidade de luz
espalhada, obteve-se um D de 4,9 ± 0,5 cm2/s. Corroborando os dados de filtração em gel,
um único pico estreito de distribuição de D sugere uma amostra monodispersa, com apenas
uma espécie em solução. Foram testadas diferentes concentrações de SbCHIP, mas não
foram observadas mudanças no coeficiente de difusão em função da concentração, por isso
aqui está representada a distribuição de D obtida com SbCHIP a 50 µM (Figura 15B).
66
Figura 15: Caracterização de parâmetros hidrodinâmicos de SbCHIP. (A) Determinação da massa molecular absoluta de SbCHIP em solução por SEC-MALS. Diferentes concentrações da proteína foram aplicadas na coluna de exclusão por tamanho Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) de 25 mL, equilibrada com tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl e conectada ao sistema ÄKTA FPLC (Amershan Pharmacia Biotech), para detecção de absorbância a 280 nm, ao miniDAWN TREOS (Wyatt Technologies), para detecção de espalhamento de luz em 3 ângulos diferentes, e ao Optilab T-rEX (Wyatt Technologies) para detecção do índice de refração. A partir da análise desses dados, obteve-se uma massa molecular média de 65 ± 4 kDa, não houve variação da massa em função das concentrações de proteína testadas. Os dados indicam a presença de dímeros em solução. (B) Determinação do coeficiente de difusão (D) de SbCHIP por DLS. As medidas foram realizadas em equipamento Zetasizer Nano ZS-Zen 3600 (Malvern) a 25 °C usando cubetas de plástico de 1 cm contendo 50 µM de SbCHIP em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl. A curva de distribuição de coeficiente de difusão foi obtida pela média de 50 leituras de 60 s e o valor médio obtido foi de 4,9 ± 0,5 x 10-7 cm2/s. (C) Determinação do raio hidrodinâmico (Rh) de SbCHIP por GFA. Perfil cromatográfico de 50 µM de SbCHIP e de 1 mg/mL de cada proteína modelo (a) ferritina, (b) aldolase, (c) conalbumina, (d) ovalbumina, (e) anidrase carbônica e (f) ribonuclease A, aplicadas na coluna de exclusão por tamanho Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) de 25 mL, equilibrada com tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl e conectada ao sistema ÄKTA FPLC (Amershan Pharmacia Biotech) para monitoramento da absorbância 280 nm. (D) Curva de calibração construída através dos valores de Rh e dos coeficientes de distribuição (-logKav)1/2 das proteínas modelo. A reta obtida do ajuste linear foi usada para determinar o valor de Rh de SbCHIP de 36 ± 4 Å. Esse valor representa a média de três experimentos independentes.
67
Para medir experimentalmente o raio hidrodinâmico (Rh) da proteína foi usada a
filtração em gel analítica (GFA). Primeiramente, foram obtidos os perfis cromatográficos de
proteínas modelo globulares de massa molecular e Rh conhecidos (Figura 15C e Tabela 4).
Através dos volumes de eluição obtidos para cada proteína modelo e dos coeficientes de
distribuição (Kav) calculados a partir deles, construiu-se uma curva de calibração de Rh em
função de (-logKav)1/2. A equação de reta gerada do ajuste linear dessa curva foi utilizada
para obtenção do Rh de SbCHIP (Figura 15D), através do volume de eluição e coeficiente de
distribuição obtidos no experimento de cromatografia com essa proteína. Como se pode
observar, SbCHIP foi eluída em torno de 18 mL, muito próximo à conalbumina, e o Rh obtido
foi de 36 ± 4 Å.
Tabela 4: Resultados obtidos da GFA com SbCHIP e as proteínas modelo utilizadas.
Proteína Volume de eluição (mL) Rh (Å) Kav (-logKav)1/2
(a) Ferritina 21,87 61,0 0,23 0,79
(b) Aldolase 20,18 48,1 0,41 0,62
(c) Conalbumina 18,64 36,5 0,51 0,54
(d) Ovalbumina 17,44 30,5 0,58 0,48
(e) Anidrase carbônica 15,79 23,0 0,67 0,41
(f) Ribonuclease A 12,86 16,4 0,78 0,32
SbCHIP 18,37 36 ± 4 0,57 0,49
Através da equação de Stokes-Einstein foi possível calcular os parâmetros
hidrodinâmicos preditos para uma esfera rígida não hidratada com a mesma massa de um
dímero de SbCHIP (66 kDa) e comparar esses valores com aqueles obtidos
experimentalmente (Tabela 5). A partir desses dados, calculou-se o fator de Perrin (f/fo) pela
razão entre o fator friccional medido da proteína (f) e o fator friccional de uma esfera rígida
não hidratada (fo). Os cálculos realizados com os valores de D e Rh medidos para a SbCHIP
resultaram em fatores de Perrin no valor de 1,6 e 1,3, respectivamente, sugerindo que a
proteína não apresenta formato esférico.
68
Tabela 5: Parâmetros hidrodinâmicos medidos e calculados pela equação de Stokes-Einstein.
Parâmetro Medido Calculadoa
Rh (Å) 36 ± 4 27
D (cm2/s) 4,9 ± 0,5 x 10 -7 8,2 x 10 -7
a, calculados considerando uma esfera rígida não hidratada de massa igual ao dímero (66 kDa) de
SbCHIP.
1.4.5. Determinação de estrutura de baixa resolução por SAXS
Para caracterização da estrutura de SbCHIP em baixa resolução foram obtidas
curvas de SAXS com amostras da proteína em diferentes concentrações. Nas menores
concentrações analisadas (10 e 20 µM) não foram obtidos bons resultados, pois o sinal de
espalhamento foi semelhante ao do tampão, com alta relação sinal-ruído que impossibilitou
o tratamento adequado dos dados.
As curvas de espalhamento de raios X obtidas para as demais concentrações (30,
40, 50 e 60 µM) são mostradas no gráfico da intensidade de espalhamento em função do
vetor q de espalhamento (Figura 16A). Pode-se observar pela sobreposição das curvas
normalizadas que as diferentes concentrações utilizadas apresentaram o mesmo perfil de
espalhamento e que não houve agregação da proteína durante exposição aos raios X nas
condições analisadas.
Através da aproximação de Guinier (LnI(q) x q2) obteve-se o coeficiente angular
do ajuste da reta, pelo qual calculou-se o raio de giro (Rg) de SbCHIP de 4,1 ± 0,3 nm (canto
inferior esquerdo da Figura 16A). O mesmo valor de Rg foi determinado para as quatro
concentrações de proteína utilizadas. As curvas de espalhamento também foram analisadas
pelo programa ATSAS, pelo qual se obteve o gráfico de distribuição de distância P(r) em
função do Rg, aqui apresentado para a concentração de 50 µM (Figura 16B). Pelo formato da
curva de função de distribuição foi possível verificar que a proteína em solução apresenta
formato globular, com regiões alongadas, uma vez que difere de uma curva simétrica
característica para proteínas esféricas.
Através dos resultados obtidos das curvas de SAXS é possível gerar modelos de
envelope de proteína que contribuem para o entendimento de sua estrutura em baixa
resolução. Os modelos mais condizentes podem ser validados através dos parâmetros
69
hidrodinâmicos medidos e apresentados acima. A análise dos dados para gerar envelopes da
proteína SbCHIP está em andamento, sendo realizada em colaboração com a pesquisadora
de pós-doutorado Dra. Gláucia Pinheiro e com o Prof. Leandro Barbosa (IF-USP).
Figura 16: Curvas de SAXS da proteína SbCHIP em diferentes concentrações. (A) Curvas de espalhamento de raios X da SbCHIP em diferentes concentrações em tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl. A curva apresentada para cada concentração refere-se à média normalizada de 10 coletas com tempos de exposição aos raios X de 100 s. Os pontos iniciais da curva de 50 µM foram utilizados para realizar a análise de Guinier e cálculo de Rg da proteína (canto inferior esquerdo). A análise comparativa do Rg da SbCHIP em diferentes concentrações mostrou que a proteína apresentou Rg de ~4,1 ± 0,3 nm. (B) Função de distribuição de distância P(r) para a SbCHIP na concentração de 50 µM, pela qual podemos observar que a proteína apresenta formato parcialmente globular, com regiões alongadas em solução.
1.4.6. Caracterização da interação entre SbCHIP e a chaperona Hsp70
A chaperona Hsp70 humana (HsHsc70) foi utilizada para caracterização da
interação com SbCHIP através da técnica de SEC-MALS. Para isso, as duas proteínas foram
incubadas por 4 h a 4 °C separadamente ou em conjunto em diferentes proporções de
concentração (Figura 17). Quando SbCHIP e HsHsc70 foram incubadas e aplicadas
isoladamente na coluna, elas foram eluídas nos volumes de 14,0 e 14,2 mL,
respectivamente. A eluição em volume próximos é esperada, visto que o monômero de
HsHsc70 tem cerca de 71 kDa e o dímero de SbCHIP apresenta cerca de 66 kDa.
Nos casos em que as proteínas foram incubadas juntas e, então, aplicadas na
coluna de separação, foram observados diferentes perfis cromatográficos dependendo da
razão de concentração entre elas. Quando SbCHIP esteve em concentração superior (50 µM)
em relação a HsHsc70 (25 µM) foi observada a eluição de 3 picos, o primeiro com 12,0 mL,
70
um ombro com 13,3 mL, seguido de outro pico eluído com 14,0 mL (Figura 17A). Em situação
contrária, em que SbCHIP está em concentração menor (25 µM) do que HsHsc70 (50 µM),
também foram observados 3 picos bem definidos: o primeiro com 12,0 mL, o segundo com
13,3 e o terceiro com 14,2 mL (Figura 17B). Quando houve incubação com concentrações
equimolares das proteínas (50 µM de cada) foi observada a eluição das proteínas em apenas
dois picos majoritários, com 12,0 mL e 13,3 mL (Figura 17C).
A análise dos cromatogramas obtidos para todas as condições sugere a formação
de complexos entre SbCHIP e HsHsc70 nos picos 1 e 2 (P1 e P2), uma vez que volumes de
eluição menores indicam a presença de moléculas maiores em solução. Esses resultados
foram confirmados através da análise por SDS-PAGE das frações coletadas durante a eluição
desses picos. Para todas as proporções testadas, observou-se nos géis que as proteínas
isoladas estão presentes em sua maioria no pico 3, ao passo que quando incubadas em
conjunto há um deslocamento tanto de HsHsc70 mas principalmente de SbCHIP para os
picos 1 e 2. Nos casos em que há excesso de HsHsc70 ou SbCHIP, a permanência do terceiro
pico (P3) indica que não houve formação de complexos de interação por parte da molécula
de maior concentração (Figura 17 A e B).
A distribuição de massa molecular absoluta das moléculas eluídas em cada pico
também foi determinada, com o objetivo de corroborar a hipótese da formação de
complexos e também inferir a estequiometria dos complexos formados (Tabela 6). Em todas
as condições, a massa obtida para o pico 1 foi de cerca de 135 kDa, indicando a interação de
um dímero de SbCHIP (66 kDa) com um monômero de HsHsc70 (70 kDa). Curiosamente, a
massa obtida para o pico 2 foi de ~100 kDa, o que corresponde à massa de um complexo de
um monômero de SbCHIP (33 kDa) com um monômero de HsHsc70 (70 kDa). Para o pico 3, a
massa obtida foi em torno de 75 kDa, indicando o excesso de SbCHIP ou HsHsc70, que não
formaram complexos entre si.
71
Figura 17: Interação de SbCHIP com HsHsc70 determinada por GFA. As proteínas SbCHIP e HsHsc70 foram incubadas a 4 °C por 4 h isoladamente (curvas vermelhas e azuis) ou em conjunto (curvas pretas) em diferentes concentrações: (A) 50 µM SbCHIP e 25 µM HsHsc70, (B) 25 µM SbCHIP e 50 µM HsHsc70, (C) 50 µM SbCHIP e 50 µM HsHsc70. Após incubação, as amostras foram separadas em uma cromatografia de exclusão por tamanho, usando coluna Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare) previamente equilibrada com tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl. Durante a eluição das amostras, foram coletadas frações a cada 0,5 mL e aquelas que correspondem aos picos observados nos cromatograma (de 10 a 16 mL) foram analisadas por SDS-PAGE 12%. As curvas e os géis com as proteínas isoladas (azul e vermelho) foram repetidas nos painéis A, B e C para facilitar a comparação dos resultados.
72
Tabela 6: Massas moleculares absolutas medidas por SEC-MALS para cada pico obtido da eluição de amostras contendo SbCHIP e HsHsc70 em diferentes proporções de concentração.
Concentração (µM) Massa molecular (kDa)
SbCHIP HsHsc70 Pico 1 Pico 2 Pico 3
50 25 133 ± 4 94 ± 2 78 ± 1
25 50 133 ± 1 102 ± 16 75 ± 1
50 50 137 ± 2 100 ± 3 -
A técnica de GFA foi empregada novamente a fim de obter mais informações
sobre a formação de complexos entre SbCHIP e HsHsc70. Para isso, as amostras contendo o
complexo formado por SbCHIP e HsHsc70 (P1, Figura 17) foram reaplicadas na mesma
coluna de exclusão por tamanho. Pode-se observar que parte das proteínas foram eluídas
em um pico com mesmo volume de eluição do P1 (cerca de 12 mL), mas que também houve
eluição de proteínas com 14 mL, sugerindo a presença de moléculas de SbCHIP e HsHsc70
dissociadas (Figura 18). Esses resultados indicam que o complexo está em equilíbrio na
solução e que sua formação pode ser dependente da concentração das proteínas.
73
Figura 18: Caracterização da estabilidade da interação entre SbCHIP e HsHsc70. Cromatogramas obtidos a partir da eluição da amostra contendo o mix de SbCHIP e HsHsc70 (linha preta) e da eluição da reinjeção do complexo isolado (pico 1) formado na condição anterior (linha vermelha). Na primeira condição as proteínas foram incubadas a 4 °C por 4 h e separadas em uma cromatografia de exclusão por tamanho, usando coluna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) previamente equilibrada com tampão 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7,5, 250 mM NaCl. O primeiro pico obtido, que corresponde ao complexo formado por um monômero de HsHsc70 e um dímero de SbCHIP foi reaplicado na coluna, nas mesmas condições mencionadas.
1.4.7. Caracterização da atividade de ubiquitinação de SbCHIP
Para determinar a atividade de ubiquitinação da SbCHIP foram realizados ensaios
usando proteínas humanas purificadas a fim de reconstituir o sistema de ubiquitinação in
vitro. Primeiramente, para avaliar a especificidade de interação de SbCHIP com diferentes
enzimas E2 para conjugação de ubiquitina foram utilizadas oito diferentes enzimas E2
(UbcH1, UbcH3, UbcH5a,b,c, UbcH6, UbcH7, UbcH8, UbcH10 e UbcH13/Mms2) na ausência e
presença de SbCHIP.
Para maioria das enzimas E2 testadas (UbcH1, UbcH3, UbcH6, UbcH7, UbcH8 e
UbcH10) observou-se que, tanto na ausência como na presença de SbCHIP, a ubiquitina
permaneceu conjugada na própria enzima E2, fato evidenciado pelas bandas intensas de
proteínas que migraram entre 17 e 32 kDa, indicando que essas enzimas E2 não interagiram
com SbCHIP (Figura 19). A ubiquitina é uma molécula de 8 kDa, assim o padrão de migração
das enzimas E2 ubiquitinadas variou de acordo com a massa molecular de cada uma.
74
Em contraste, quando foram usadas as enzimas UbcH5 e UbcH13, foi observada
a conjugação de ubiquitina em SbCHIP (Ub-SbCHIP) através da detecção de bandas migrando
entre 32 e 46 kDa (Figura 19), que corresponde à massa esperada para um monômero de
SbCHIP (33 kDa) conjugado a uma (41 kDa) ou duas (49 kDa) moléculas de ubiquitina (8 kDa).
Nessas condições, nota-se também um arraste e bandas menos intensas entre 46 e 75 kDa,
que podem indicar a ligação de cadeias de poli-ubiquitina em SbCHIP. Não houve diferença
na conjugação de SbCHIP com ubiquitina após 1 ou 4 h de reação.
É interessante realçar que na ausência de SbCHIP, a ubiquitina permaneceu em
sua maioria conjugada às enzimas UbcH5 ou UbcH13, sendo detectada nas bandas que
migraram entre 17 e 25 kDa, uma vez que suas formas monoméricas tem cerca de 17 kDa.
Em todas as reações, pode-se observar também a presença de uma banda entre 100 e 135
kDa que provavelmente corresponde à enzima E1 (118 kDa) ubiquitinada.
Figura 19: Caracterização da atividade de ubiquitinação da proteína SbCHIP na presença de diferentes enzimas E2. Reações contendo 1x tampão de ubiquitinação, 2,5 µM de ubiquitina biotinilada, 20 U/mL de pirofosfatase, 1 mM de DTT, 5 mM Mg-ATP, 100 nM de enzima E1 de ativação da ubiquitina e 2,5 µM de enzima E2 de conjugação da ubiquitina, na ausência ou presença de 5 µM de SbCHIP (enzima E3) foram incubadas a 37 °C por 1 h. Em seguida, foi adicionado tampão não redutor para SDS-PAGE para parar as reações e para possibilitar a separação por SDS-PAGE gradiente (10 a 15%). A ubiquitinação foi verificada por Western Blotting pela detecção da ubiquitina biotinilada pelo uso de Streptavidin-HRP.
75
Sabendo que as enzimas E2, UbcH5 e UbcH13, foram capazes de interagir com
SbCHIP e conjugar ubiquitina, as mesmas foram utilizadas nos próximos experimentos para
avaliar a capacidade de SbCHIP de conjugar ubiquitina em outros substratos proteicos.
Foram usados como alvo de ubiquitinação as proteínas de planta SsHsp70 e SsHsp90, a
proteína humana HsHsc70 e também luciferase de Photinus pyralis, como uma proteína alvo
genérica (Figura 20).
Em todos os casos, independente do substrato ou da enzima E2 utilizada, é
possível observar na Figura 20, que na ausência de SbCHIP e de enzima E2, a ubiquitina
permenece conjugada na enzima E1, migrando com massa entre 100 e 135 kDa. E seguida,
quando UbcH5 ou UbcH13 estão presentes, foram detectadas bandas entre 17 e 25 kDa,
indicando que a ubiquitina permenece conjugada a elas. Entretanto, nas reações em que
tanto enzima E2 quanto SbCHIP estavam presentes, pode-se observar bandas fracas de
ubiquitina conjugada a SbCHIP (migrando entre 32 e 46 kDa), mas principalmente detecta-se
ubiquitina conjugada nos substratos SsHsp70 (73 kDa), SsHsp90 (82 kDa), HsHsc70 (72 kDa) e
luciferase (67 kDa). Isso pode ser notado pela migração de bandas entre 75 e 135 kDa, que
evidencia a atividade de SbCHIP de atuar E3 ubiquitina ligase. Não foram observadas
diferenças de padrão de ubiquitinação dos substratos ao utilizar UbcH5 ou UbcH13 como
enzima E2, umas vez que ambas foram eficientes em conjugar ubiquitina e interagir com
SbCHIP. Também não foram observadas diferenças de ubiquitinação das reações após
incubação por 1 ou 4h (dados não mostrados).
Curiosamente, houve diferença no padrão de ubiquitinação dependendo do
substrato utilizado. Para SsHsp70 e SsHsp90, pode-se observar pelo menos 5 bandas entre
75 e 135 kDa, indicando a conjugação de pelo menos 5 moléculas de ubiquitina.
Diferentemente, para HsHsc70 e luciferase, foram observadas apenas uma ou duas bandas,
sugerindo que menos moléculas de ubiquitina foram conjugadas nesses substratos.
76
Figura 20: Caracterização da atividade de ubiquitinação da proteína SbCHIP em diferentes substratos proteicos. Reações contendo 1x tampão de ubiquitinação, 2,5 µM de ubiquitina biotinilada, 20 U/mL de pirofosfatase, 1 mM de DTT, 5 mM Mg-ATP, 100 nM de enzima E1 de ativação da ubiquitina, 5 µM da proteína alvo (A e E) SsHsp70, (B e F) SsHsp90, (C e G) HsHsc70 ou (D e H) luciferase, na presença e ausência de 2,5 µM de enzima E2 de conjugação de ubiquitina (UbcH5 ou UbcH13) e 2,5 µM de SbCHIP (E3 ubiquitina ligase) foram incubadas a 37 °C por 1 h. Em seguida, foi adicionado tampão não redutor para SDS-PAGE para parar as reações e para possibilitar a separação por SDS-PAGE gradiente (10 a 15%). A ubiquitinação foi verificada por Western Blotting pela detecção da ubiquitina biotinilada pelo uso de Streptavidin-HRP e pela detecção das proteínas alvos através de anticorpos específicos.
77
1.5. Discussão
1.5.1. Análise da sequência, expressão e purificação de SbCHIP
A caracterização estrutural de chaperonas e co-chaperonas de plantas é recente
e menos vasta se comparada com o conhecimento já obtido para essas proteínas em outros
organismos. Nosso grupo está entre os pioneiros nessa área, com interesse particular em
proteínas de gramíneas (família Poaceae) de grande interesse comercial, como sorgo e cana-
de-açúcar. Dessa forma, visamos neste trabalho o estudo da co-chaperona CHIP de Sorghum
bicolor (SbCHIP).
A sequência que codifica a proteína foi clonada em vetor de expressão e a
análise do sequenciamento do clone pET28a-His-SbCHIP confirmou a presença da sequência
desejada. A sequência de aminoácidos de SbCHIP é formada por 295 resíduos, constituindo
uma proteína com massa molecular teórica de 33 kDa. Em outros organismos, CHIP
apresenta sequência primária variando de 280 a 305 resíduos e massa moleculares
semelhantes, em Arabidopsis, AtCHIP tem 32 kDa e em humanos, HsCHIP tem 35 kDa.
A análise de similaridade de sequência indicou que SbCHIP apresenta ~60% de
identidade com AtCHIP e cerca de 35% de identidade com os homólogos presentes em
animais. A região de maior identidade foi observada no domínio U-box. A baixa identidade
de sequência primária entre SbCHIP e os homólogos de animais pode ser explicada pelo
domínio TPR, responsável pela interação de CHIP com o motivo EEVD presente na região C-
terminal das chaperonas moleculares Hsp90 e Hsp70. Esse domínio pode apresentar
sequência primária bastante diferenciada entre homólogos de diferentes espécies, porém
sempre atinge uma conformação tridimensional conservada de hélices-α antiparalelas,
formando uma estrutura como um bolsão que comporta o motivo EEVD com alta afinidade.
Nessa estrutura, resíduos básicos, geralmente de lisina e asparagina (identificados como
“two-carboxylate clamp”) são conservados e essenciais para a interação com EEVD
(Scheufler et al., 2000).
Estudos recentes investigando a interação das proteínas humanas CHIP e Hsp70,
através da estrutura cristalográfica do complexo formado entre os domínios isolados TPR de
CHIP e C-terminal de Hsp70, identificaram os principais resíduos presentes na interface de
interação. No TPR de HsCHIP, os resíduos identificados foram: Q27, K30, N34, F37, V59, V61,
Y62, N65, L68, V94, K95, F99, L129, F131 e D134 (Zhang et al., 2015). Desses 15 resíduos,
78
observa-se no alinhamento aqui realizado que 10 são conservados entre SbCHIP e HsCHIP
(sublinhados). Isso indica que apesar do TPR de SbCHIP não apresentar grande identidade
com demais homólogos, provavelmente sua estrutura tridimensional deve ser conservada e
a maioria dos resíduos que compõem a interface de interação com as chaperonas foi
mantida evolutivamente.
Na região central de dimerização também não foi observada alta similaridade.
Apesar disso, SbCHIP foi encontrada como um dímero em solução, indicando que ainda
assim este domínio pode estar envolvido na dimerização. A estrutura conhecida dessa região
em MmCHIP e DrCHIP é a de um hairpin de hélices-α que mantém contato com a mesma
região na outra proteína para formar um homodímero (Zhang et al, 2005). No entanto, na
estrutura de MmCHIP, observou-se um dímero assimétrico, em que o hairpin de uma
proteína é prolongado e o da outra é truncado (Figura 5); em contrapartida, na estrutura de
DrCHIP a interface de dimerização é simétrica composta por dois hairpins completos (Xu et
al., 2006). Isso pode ser causado pelo fato de que estruturas cristalinas são estáticas e
representam apenas um estado da proteína, ou mesmo porque a estrutura de DrCHIP não
corresponde à proteína completa, mas sim com o domínio TPR deletado. Por outro lado,
também é plausível que haja mudanças dinâmicas na estrutura dimérica de CHIP que
permite a troca de conformação dos hairpins helicoidais entre prolongados e truncados, de
forma que a mesma conformação possa existir simultaneamente para ambos os
monômeros.
Para expressão de SbCHIP recombinante em E. coli, os testes com diferentes
condições de temperatura e tempos de ação do agente indutor (IPTG) mostraram que a
melhor condição para expressão da SbCHIP foi por 5 h após adição de IPTG, a 30 °C. Nessa
condição, foi observada melhor relação entre quantidade de proteína produzida e sua
presença na fração solúvel do lisado de células bacterianas.
SbCHIP foi obtida com alto grau de pureza (> 95%) e rendimento de 85 mg/L
após duas etapas cromatográficas. Na primeira, a cromatografia de afinidade ao níquel, a
proteína já apresentou alto grau de pureza, mas a segunda etapa, cromatografia de filtração
em gel, foi realizada ainda assim para eliminar possíveis contaminantes agregados,
contaminantes não visíveis no SDS-PAGE e separar possíveis diferentes estados oligoméricos.
79
Entretanto, a proteína foi eluída, na maioria das vezes, em um único pico, indicando que
apenas um estado oligomérico estava presente em solução.
1.5.2. Análise de estrutura secundária e estabilidade de SbCHIP
O espectro de dicroísmo circular medido para SbCHIP mostrou-se compatível
com o espectro de uma proteína enovelada com composição de estrutura secundária rica
em hélices-α, por apresentar dois mínimos de sinal em 208 e 222 nm. A análise do espectro
permitiu determinar que aproximadamente 55% da estrutura de SbCHIP é composta de
hélices-α. Essa predominância concorda com a quantidade de 60% de hélices-α medida para
HsCHIP em estudos anteriores (Millan et al., 2013) e também com o que já foi discutido
sobre a estrutura conhecida para CHIP de camundongo e de D. rerio (Zhang et al., 2005; Xu
et al., 2006). Tanto o domínio TPR quanto o hairpin de dimerização são formados
basicamente de hélices-α antiparalelas. Além disso, o domínio U-box também apresenta
duas hélices-α. A composição das folhas-β presentes no U-box não foi detectada,
provavelmente porque são apenas duas folhas-β curtas e porque a contribuição de sinal de
CD de hélices-α em geral é maior do que de folhas-β, o que pode mascarar sua detecção em
proteínas muito ricas em hélices-α.
Na sequência primária de SbCHIP podem ser encontrados cinco triptofanos, os
quais foram utilizados como sonda local da estrutura terciária em espectros de emissão de
fluorescência. Quatro desses triptofanos estão localizados nos domínios TPR, portanto são
úteis para monitorar o enovelamento desta região. O outro triptofano está localizado na
porção C-terminal. Contudo, é importante realçar que o espectro de fluorescência avalia a
soma da emissão de todos estes resíduos, permitindo uma análise geral e não individual dos
mesmos.
Os experimentos de fluorescência de triptofano confirmaram o estado
enovelado da proteína obtida após a purificação. Nos espectros medidos para SbCHIP o λ
máximo obtido foi de 335 nm e centro de massa (<λ>) de 344 nm, bastante semelhante com
o obtido para HsCHIP, com λmáx = 333 nm e <λ> = 342 nm (Millan et al., 2013). Quando os
espectros foram medidos com SbCHIP em solução com 8M de ureia, o λmáx e <λ> foram
deslocados para 357 e 356 nm, respectivamente. Esse deslocamento na emissão de
fluorescência está relacionado com a mudança de polaridade do ambiente em que os
resíduos de triptofano se encontram, de forma que na ausência de ureia pelo menos um
80
resíduo de triptofano estava localizado no interior da proteína, um ambiente hidrofóbico. Já
na presença de uréia, um ou mais resíduos de triptofano foram expostos ao solvente,
passando para um ambiente hidrofílico. Isso sugere mudança do estado enovelado para o
estado desenovelado, observado pelo deslocamento do λ máximo e <λ> (Ramos, 2004).
Quanto à estabilidade térmica de SbCHIP, os dados obtidos por CD, DSF e DSC
trouxeram informações complementares para caracterização da proteína. O modo de
obtenção da estabilidade térmica por essas técnicas é distinto, pois são sondas de processos
complementares que ocorrem durante o desenovelamento proteico. O CD mede a diferença
de absorção da luz circularmente polarizada a direita e a esquerda ao interagir com
estruturas quirais presentes nas estruturas secundárias formadas nas proteínas, ou seja, a
sonda são as estruturas secundárias dependentes de interações locais. O DSF monitora a
emissão fluorescência de uma sonda que fluoresce quando se liga em resíduos hidrofóbicos
expostos quando a proteína desnatura. Já o DSC mede a variação de calor proveniente do
rompimento de todas as interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio importantes para
manutenção da conformação.
Apesar disso, os resultados obtidos por CD, DSF e DSC foram muito coerentes
entre si; em todos os métodos, observou-se que a proteína se mantém estável até cerca de
40 °C. Acima dessa temperatura foi observada uma única transição cooperativa que pode
indicar desenovelamento de dois estados (enovelado e desenovelado), com temperatura no
ponto médio (Tm) medida de 46 °C. Por CD e DSC, também se verificou que esse
desenovelamento é irreversível, gerando agregação e precipitação. Isso pode ser avaliado no
CD porque o sinal não foi readquirido durante o resfriamento, e no DSC pela presença de um
pico exotérmico observado a 51 °C no termograma medido. Por serem técnicas que utilizam
sondas de processos diferentes do desenovelamento e pela semelhança no perfil de
desnaturação obtido por elas, pode-se concluir que a perda de conformação global dos
domínios que compõem SbCHIP ocorre simultaneamente à perda de estrutura secundária da
proteína.
Estudos da estabilidade térmica de chaperonas moleculares de cana-de-açúcar,
como Hsp90 e Hsp100, realizados pelo nosso grupo mostraram essas proteínas são bastante
estáveis ao desenovelamento induzido por temperatura, apresentando Tm de
aproximadamente 60 °C (Cagliari et al., 2011; Silva et al., 2013). As sHsps citosólicas de cana
81
apresentam estabilidade térmica ainda maior, mostrando pouca perda de estrutura
secundária mesmo quando a proteína foi aquecida até 90 °C (Tiroli-Cepeda e Ramos, 2010).
A significativa estabilidade observada nas chaperonas de plantas em alta temperatura é
muito condizente com a forma de sobrevivência desses organismos, uma vez que são sésseis
e estão expostos a condições extremas de estresses bióticos e abióticos. Sendo assim, as
chaperonas bastante potentes das plantas propiciam uma característica bem definida nesses
organismos que consiste em sua resposta ao estresse através de aclimatização e resistência
a essas condições (Vierling, 1991). Em comparação com essas chaperonas, a estabilidade
térmica de SbCHIP pode ser considerada baixa. Todavia, CHIP é uma co-chaperona e em
situações de estresse essas proteínas são geralmente encontradas em grandes complexos,
interagindo com outras chaperonas, o que pode ser importante para garantir sua
estabilidade (Breiman, 2014).
Com relação à estabilidade na presença de agente desnaturante, os
experimentos utilizando ureia revelaram que a proteína apresenta desenovelamento
também aparentemente de dois estados e com uma transição de concentração de ureia no
ponto médio de transição (Cm) de 3,5 M. Diferentemente do desenovelamento induzido por
temperatura, neste caso a desnaturação foi reversível. Estudos de estabilidade térmica e
química realizados com HsCHIP selvagem mostraram resultados bastante semelhantes, com
Tm de 46 °C e Cm de 3,5 M. Interessantemente, nesse estudo demonstrou-se que o domínio
TPR tem um papel muito importante na estabilidade de CHIP. Mutantes de deleção do TPR
(HsCHIP-ΔTPR) se mostraram menos estáveis (Tm = 36 °C e Cm = 1,1 M) ao passo que a
deleção do U-box (HsCHIP-ΔUbox) não causou tanta variação de estabilidade (Tm = 45 °C e
Cm = 3,3 M) (Millan et al., 2013).
1.5.3. Análise dos parâmetros hidrodinâmicos
Os experimentos para caracterização estrutural da SbCHIP foram realizados com
o intuito de obter parâmetros hidrodinâmicos da proteína em solução. Através das técnicas
de SEC-MALS, DLS, GFA e SAXS foram medidos parâmetros como a massa molecular
absoluta, coeficiente de difusão (D), raio hidrodâmico (Rh) e raio de giro (Rg) de SbCHIP em
solução. Esses e outros parâmetros medidos estão sumarizados na Tabela 7. Para fins de
comparação, os mesmos parâmetros foram calculados pela equação de Stokes-Einstein
82
considerando uma esfera rígida não hidratada com a mesma massa do dímero (66 kDa) de
SbCHIP.
Tabela 7: Resumo das técnicas utilizadas e dos parâmetros hidrodinâmicos medidos para SbCHIP.
Técnica Parâmetro medido Valor obtido
CD Composição de hélice-α 55%
Fluorescência λmáx emissão (W) sem/com ureia 335/357 nm
CD, DSF, DSC Tm 46 ± 1 °C
CD Cm 3,4 ± 0,1 M
SEC-MALS MM em solução 65 ± 4 kDa
DLS Coeficiente de difusão (D) 4,9 ± 0,5 x 10-7 cm2/s
GFA Raio hidrodinâmico (Rh) 36 ± 4 Å
SAXS Raio de giro (Rg) 41 ± 3 Å
Nos experimentos de SEC-MALS o valor de massa molecular medido foi de 65
kDa e, a partir dele, foram calculados Rh de 26 Å e D de 8,2 x 10-7 cm2/s, esses valores são
muito próximos dos valores teóricos obtidos para uma esfera com a massa do dímero. Na
literatura há diversas evidências mostrando que CHIP de vários organismos forma
homodímeros em condições fisiológicas, sendo que a interface de dimerização já foi
caracterizada em estruturas cristalinas de HsCHIP e DrCHIP (Nikolay et al., 2004; Zhang et al.,
2005; Xu et al., 2006). Ambas as estruturas demonstram contribuição das hélices-α7 e α8 do
hairpin central e também do domínio U-box, apesar de discordarem em relação à dinâmica e
simetria de formação do dímero. Mutantes de HsCHIP construídos sem esse hairpin são
incapazes de dimerizar e ainda apresentam atividade de ubiquitinação inferior à da proteína
selvagem, evidenciando que a dimerização é essencial para a atividade ubiquitina E3-ligase
da CHIP (Nikolay et al., 2004).
As técnicas de DLS e GFA foram utilizadas para obter o coeficiente de difusão (D)
e o raio hidrodinâmico (Rh) de SbCHIP, que fornecem informação sobre o tamanho da
proteína em solução. Os valores de D e Rh medidos experimentalmente para SbCHIP em
solução foram de 4,9 x 10-7 cm2/s e de 36 Å, respectivamente. O Rh obtido para HsCHIP
utilizando a mesma técnica foi de 39 Å (Millan et al., 2013). Os valores de D e Rh medidos por
83
DLS e GFA diferem daqueles calculados usando a massa do dímero de SbCHIP (66 kDa). A
equação de Stokes-Einstein usada para calcular os parâmetros hidrodinâmicos considera
uma molécula esférica rígida e não hidratada com a massa do dímero. Dessa maneira, a
comparação dos valores medidos com os valores calculados permite inferir informações
sobre o formato da proteína em solução. Em outras palavras, se SbCHIP fosse uma proteína
com formato aproximadamente esférico, Rh e D obtidos experimentalmente seriam
semelhantes àqueles calculados levando em conta a massa de um dímero.
Matematicamente, pode-se utilizar o fator de Perrin (f/f0) para avaliar o formato
da proteína, ele é calculado pela razão do fator friccional experimental (f), obtido pela
medida de D e/ou Rh, com o fator friccional teórico (f0). Quanto mais a forma de uma
proteína se aproxima de uma esféra, mais semelhantes são f e f0, logo Perrin é mais próximo
de 1. Os valores obtidos para SbCHIP foram de 1,3 e 1,6 quando Rh e D foram usados,
respectivamente, o que indica a um formato não esférico para essa proteína.
Os resultados obtidos por SAXS concordam com a forma alongada observada
para SbCHIP. O raio de giro (Rg) medido por esta técnica foi de 41 Å. Por definição, o Rg é a
distância média do centro de massa de uma molécula até cada elemento de massa dessa
molécula. Já o Rh é definido como o raio de uma esfera rígida em solução com a mesma
massa da molécula de interesse. Normalmente, proteínas em solução não existem como
esferas rígidas, então o Rh geralmente reflete o tamanho aparente adotado pela proteína
solvatada. Ambos, Rg e Rh são usados para obter informação sobre o tamanho de uma
proteína e a razão Rg/Rh também fornece conhecimento sobre formato. O valor
característico de Rg/Rh para uma proteína globular esférica é 0,775, o que significa que Rg é
menor que Rh. Por outro lado, quando moléculas desviam desse formato, apresentando
estruturas não esféricas ou alongadas, a razão Rg/Rh tende a ser maior que 0,775, pois Rg
tende a ser maior que Rh (Smilgies e Folta-Stogniew, 2015).
A razão Rg/Rh obtida para SbCHIP é de 1,14, indicando novamente uma estrutura
que difere de uma esfera, sendo provavelmente alongada em solução. Como
complementação a esse resultado, a função de distribuição de distância P(r) obtida a partir
da curva de espalhamento do SAXS também sugere que a proteína em solução apresenta
estrutura globular, composta por regiões alongadas. Partículas globulares esféricas
normalmente apresentam perfis de função de distribuição de distância simétricos, em forma
84
de sino, enquanto partículas não esféricas frequentemente mostram perfis não simétricos,
com ombros e oscilações que correspondem às distâncias intra e inter subunidades
(Mertens e Svergun, 2010). Dessa forma, os resultados de SAXS corroboram os valores de
parâmetros hidrodinâmicos obtidos anteriormente, que também indicam a presença de
moléculas alongadas (fator de Perrin f/fo = 1,6).
É interessante notar que co-chaperonas frequentemente apresentam esse
formato alongado e formam interações flexíveis com as chaperonas, uma vez que muitas
vezes agem como pontes, possibilitando a interação do substrato no complexo formado pelo
sistema chaperona (Borges et al., 2005; Onuoha et al., 2008; Smith et al., 2013). A análise
dos dados para gerar a estrutura em baixa resolução da proteína SbCHIP ainda está em
andamento, sendo realizada em colaboração com a pesquisadora de pós-doutorado Dra.
Gláucia Pinheiro e o Prof. Dr. Leandro Barbosa (IF-USP).
Além do tratamento das curvas de SAXS, estão em andamento experimentos
para obtenção de cristais de SbCHIP a fim de adquirir informações sobre sua estrutura
tridimensional em alta resolução. Dessa forma, enviamos amostras de SbCHIP pura em
diferentes concentrações para o Laboratório Automatizado de Cristalização de Proteínas
(ROBOLAB) situado no Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), no CNPEM (proposta:
23595). Análises preliminares indicam a formação de cristais de SbCHIP em algumas
condições testadas (Anexos - Figura A1) e, por isso, estamos em busca de colaboração para
realizar coletas de difração de raios X e resolver a estrutura da proteína.
1.5.4. Interação com chaperonas e função de ubiquitinação de SbCHIP
Além da caracterização conformacional, o estudo das interações formadas entre
CHIP e outras chaperonas, como Hsp90 e Hsp70, é essencial para o melhor entendimento de
sua função. Alguns detalhes sobre a interação entre CHIP e Hsp70 já foram descritos na
literatura. Resultados de ITC usando CHIP humana e um peptídeo da região C-terminal de
Hsp70 (contendo o motivo IEEVD), apontam que a afinidade de interação é forte,
apresentando Kd de aproximadamente 1 µM (Kundrat e Regan, 2010b). Além disso, a
interação foi observada por pull-down e GFA usando as proteínas completas, pelos quais
foram obtidos complexos de 210 kDa que indicam a ligação de um dímero de CHIP com dois
monômeros de Hsp70. O complexo formado é dinâmico e flexível, de modo que ambas as
85
proteínas podem se mover independentemente a fim de acomodar outras proteínas clientes
(Smith et al., 2013).
Como já foi discutido, o motivo IEEVD da Hsp70 é muito importante para
interação entre essas chaperonas. Apesar disso, a interface de interação ainda é discutida na
literatura porque alguns estudos apontam que IEEVD são os únicos resíduos envolvidos na
interação, o que conferiria mobilidade e flexibilidade ao complexo (Smith et al., 2013). Por
outro lado, experimentos de RMN sugerem que também há interação entre do TPR com
outras regiões do SBD (lid e tail) da Hsp70, uma vez que o mutante Hsp70-lid-tail-ΔGPTIEEVD
foi capaz de induzir pequenas perturbações de deslocamento químico no espectro de 15N-
CHIP-TPR (Zhang et al., 2015).
Apesar da alta afinidade de interação descrita para CHIP e Hsp70 humanas, não
conseguimos caracterizar a interação de SbCHIP com Hsp70 de cana (SsHsp70), então como
alternativa, foi utilizada a proteína humana HsHsc70. Através de SEC-MALS e SDS-PAGE
confirmamos a formação de dois tipos de complexos entre essas proteínas, um com massa
de ~136 kDa, possivelmente formado entre um monômero de HsHsc70 (72 kDa) e um
dímero de SbCHIP (66 kDa), e outro com massa de ~100 kDa, correspondendo à massa de
um monômero de HsHsc70 e um monômero de SbCHIP. Esses resultados divergem em certo
aspecto de estudos anteriores que indentificaram complexos de 210 kDa, em que um dímero
de CHIP se liga em dois monômeros de Hsp70 (Kundrat e Regan, 2010b). Além disso, a
formação de complexos com monômeros de SbCHIP implica na indução de separação do
dímero desta proteína. Outros experimentos são necessários para responder a essa questão,
mas a possibilidade de dissociação dos dímeros corrobora a idéia de que a dimerização pode
ser dinâmica e que pode haver mudança conformacional dos hairpins helicoidais, em
especial durante interação com Hsp70.
Nossos experimentos indicam ainda que há um equilíbrio, dependente da
concentração de cada proteína, para formação e dissociação desses dois tipos de complexos.
Os resultados indicam que em concentrações equimolares de HsHsc70 e SbCHIP o equilíbrio
é deslocado para a formação dos complexos, sendo que aproximadamente 50% deles
apresenta 136 kDa e os outros 50% tem 100 kDa. Quando há concentrações maiores de uma
ou outra proteína, ainda há formação de complexos, mas parte das moléculas da proteína
mais concentrada permanece dissociada. Além disso, a interação dos complexos formados
86
mostrou-se transiente, uma vez que foi possível observar sua dissociação quando foram
reaplicados na coluna de separação. Esses resultados são coerentes com o que já foi
relatado na literatura através de experimentos de RMN que indetificaram complexos
dinâmicos e bastante flexíveis, permitindo que CHIP pudesse identificar diferentes regiões
de Hsp70 para realizar a ubiquitinação (Smith et al., 2013).
Tão importante quanto a característica de interagir com chaperonas moleculares
é a capacidade de CHIP de ubiquitinar substratos proteicos. A ubiquitinação é uma
modificação pós-traducional que envolve em muitos aspectos a homeostase celular,
sinalização e regulação proteica, sendo um processo complexo que depende da ação
sequencial de três enzimas: uma enzima E1 de ativação da ubiquitina, dependente de ATP,
uma enzima E2 de conjugação da ubiquitina e uma enzima E3 de ligação da ubiquitina ao
substrato (Pickart, 2001).
Nossos resultados obtidos através dos ensaios in vitro de ubiquitinação
mostraram que SbCHIP foi capaz de conjugar ubiquitina na presença de duas das oito
enzimas E2 testadas, UbcH5 e UbcH13. UbcH5 já foi relatada em vários estudos como
interatora de HsCHIP, participando da reação de ubiquitinação inclusive em suas diferentes
isoformas UbcH5 a, b, c e d (Jiang et al., 2001; Murata et al., 2001; Kundrat e Regan, 2010b;
Soss et al., 2011; Soss et al., 2015). Além disso, a interação com outras enzimas E2, como
UbcH7 e UbcH13 também já foi observada em estudos anteriores (Murata et al., 2001;
Zhang et al., 2005), os quais sugerem que diferentes enzimas E2 produzem diferentes
produtos de ubiquitinação, de forma que a enzima E2 é que determina o resultado da
transferência de ubiquitina (Soss et al., 2011).
Estudos contemplando a estrutura do complexo formado entre CHIP e UbcH5 ou
Ubc13 mostraram que a especificidade de ligação de CHIP com alguma enzima E2 ocorre
através de determinantes similares, incluindo principalmente o motivo chave S-P-A presente
nas E2 entre os resíduos 90 e 100 (Xu et al., 2008). A interação de CHIP com UbcH5,
especificamente, ocorre através da hélice central e do longo loop do domínio U-box de CHIP
com a hélice N-terminal e os loops L4 e L7 da enzima E2 (Xu et al., 2008).
A auto-ubiquitinação de CHIP é uma característica já bastante descrita na
literatura (Murata et al., 2001; Kundrat e Regan, 2010b; Soss et al., 2011; Soss et al., 2015).
Os trabalhos usando diferentes enzimas E2 apontam que dependendo da enzima utilizada,
87
elas são responsáveis por estabelecer mono ou poli-ubiquitinação de CHIP (Soss et al., 2011).
Em nossos resultados, usando UbcH5, verificamos uma banda bastante intensa migrando
entre 32 e 46 kDa, o que indica atividade majoritária de mono e biubiquitinação. No entanto,
também observamos um arraste e bandas menos intensas de maior massa molecular (entre
46 e 75 kDa), que pode sugerir a extensão da cadeia de ubiquitina para 3 ou 4 moléculas.
Esses resultados convergem com o que já foi relatado na literatura, uma vez que a atividade
de UbcH5 ocasiona prioritariamente a poli-ubiquitinação de SbCHIP (Soss et al., 2011; Soss et
al., 2015). Atividade semelhante também foi observado utilizando UbcH13 nas reações de
ubiquitinação.
Além da auto-ubiquitinação, CHIP também deve ser capaz de ubiquitinar diversas
outras proteínas. Especificamente, o papel de regular a concentração celular de chaperonas,
como Hsp70 e Hsp90, já é bem documentada. Neste trabalho, foram utilizadas as
chaperonas de cana-de-açucar, SsHsp70 e SsHsp90, assim como a chaperona humana Hsc70
como chaperonas alvo da ubiquitinação de SbCHIP, em conjunto com UbcH5 e UbcH13.
Nossos resultados indicam que SbCHIP é uma proteína essencial para a transferência de
ubiquitina da enzima E2 para o substrato, atuando com uma E3 ubiquitina ligase. Além disso,
verificamos que na ausência de um substrato proteico, a ubiquitinação ocorre na própria
SbCHIP, no entanto, na presença de substrato, existe uma preferência para que nele ocorra
a conjugação da ubiquitina. É interessante ressaltar que as chaperonas de plantas possuem
um padrão de poli-ubiquitinação, pela adição de pelo menos 5 moléculas de ubiquitina tanto
em SsHsp70 como em SsHsp90, ao passo que em HsHsc70 apenas um ou duas moléculas de
ubiquitinas foram conjugadas.
Ensaios in vitro, usando UbcH5 como enzima E2, mostram que as chaperonas
humanas Hsp90, Hsp70 e Hsc70 são alvos de poli-ubiquitinação de CHIP, especialmente
quando não estão ligadas a proteínas clientes desenoveladas (Murata et al., 2001; Kundrat e
Regan, 2010b; Soss et al., 2015). Nesses estudos, foram descritos 12 resíduos de lisina em
Hsp70, 16 resíduos em Hsc70 e 13 resíduos em Hsp90 capazes de sofrer ubiquitinação
(Kundrat e Regan, 2010b; Soss et al., 2015). A existência de vários sítios de ubiquitinação
nessas chaperonas está de acordo com o modelo de interação entre essas proteínas, uma
vez que o domínio TPR de CHIP se liga ao motivo EEVD presente na região bastante flexível
88
de Hsp70 e Hsp90. Essa flexibilidade fornece a mobilidade necessária para que CHIP tenha
acesso para ubiquitinar diferentes regiões da chaperona alvo (Smith et al., 2013).
Além da regulação do nível celular das chaperonas, CHIP atua na ubiquitinação
de uma ampla gama de outros substratos proteicos. Assim, neste trabalho, a proteína
luciferase de Photinus pyralis também foi utilizada como proteína alvo genérica para
ubiquitinação com auxílio de SbCHIP. Nessas reações, também verificamos que essa co-
chaperona é capaz de ubiquitinar a luciferase, tanto com UbcH5 quanto com UbcH13. Já
foram reportados resultados usando luciferase como alvo de ubiquitinação de HsCHIP
(Murata et al., 2001), mas diferente do observado aqui, a luciferase só sofreu ubiquitinação
quando desenovelada a 45 °C por 5 min na presença de Hsp90, sugerindo que esse substrato
precisa ser reconhecido por uma chaperona para que CHIP tenha acesso para realizar a
ubiquitinação (Murata et al., 2001). Nossos experimentos foram realizados com luciferase
não desenovelada e na ausência de qualquer chaperona e pudemos observar luciferase
conjugada com uma ou duas moléculas de ubiquitina. Talvez se desenovelada, haja
possibilidade de ocorrer a poli-ubiquitinação desse substrato, no entanto, novos
experimentos devem ser realizados para respondermos a esta questão.
1.6. Conclusões
- A sequencia que codifica a proteína SbCHIP foi eficientemente clonada em
vetor de expressão pET28a. A melhor condição para expressão heteróloga foi a 30 °C por 5h.
A proteína foi obtida purificada em um único estado oligomérico com rendimento de 85
mg/L de indução e em alto grau de pureza (> 95%) após duas etapas de purificação.
- A análise de similaridade de sequências mostrou que SbCHIP apresenta maior
parentesco com AtCHIP (60%). Em relação aos homólogos de CHIP animais, cerca de 35% de
similaridade foi observada. Apesar da baixa similaridade de sequência primária, o domínio U-
box é bastante conservado e resíduos específicos do TPR importantes para interação com
chaperonas são conservados entre as espécies.
- A proteína purificada foi obtida no estado enovelado, confirmado por CD e
espectroscopia de fluorescência, com composição de estrutura secundária rica em hélices-α
(55%).
89
- A estabilidade térmica de SbCHIP foi avaliada por CD, DSF e DSC. Verificou-se
que a proteína é estável até 40 °C e apresenta desenovelamento com uma única transição
de Tm de 46 °C. O desenovelamento é irreversível e gera agregados precipitados a partir de
51 °C. Observou-se ainda que a perda de conformação global dos domínios que compõem
SbCHIP ocorre simultaneamente à perda de estrutura secundária da proteína.
- O desenovelamento induzido por ureia apresentou uma única transição de Cm
de 3,4 M, possivelmente de dois estados, sendo completamente reversível após a
diminuição da concentração de ureia.
- Foram obtidos parâmetros hidrodinâmicos para SbCHIP através de SEC-MALS,
DLS, GFA e SAXS. A proteína se apresenta como um dímero em solução (65 kDa), com
coeficiente de difusão (D) de 4,9 x 10-7 cm2/s, raio hidrodinâmico (Rh) de 36 Å e raio de giro
(Rg) de 41 Å.
- A análise dos parâmetros hidrodinâmicos, como f/f0 = 1,6, Rg/Rh = 1,1 e a
distribuição P(r), permitiu concluir que a proteína apresenta formato não esférico,
possivelmente alongado em solução. O tratamento dos dados de SAXS ainda precisa ser
realizado e possobilitará a obtenção de uma estrutura em baixa resolução de SbCHIP.
- Através de SEC-MALS e SDS-PAGE, caracterizamos a formação de dois tipos de
complexos entre SbCHIP e HsHsc70: um com ~136 kDa, formado por um monômero de
HsHsc70 e um dímero de SbCHIP, e outro com ~100 kDa, provavelmente composto por um
monômero de Hsc70 e um monômero de SbCHIP.
- Ensaios de ubiquitinação in vitro mostraram que SbCHIP, na presença das
enzimas E2, UbcH5 e UbcH13, é capaz de uma ou duas moléculas de ubiquitina. SbCHIP
também se mostrou capaz de conjugar ubiquitina em outros substratos proteicos, como as
chaperonas de planta SsHsp70 e SsHsp90, a chaperona humana HsHsc70 e a proteína
luciferase.
90
Capítulo 2. O papel da HspB1 humana na desagregação de substrato pelo
sistema da Hsp70
2.1. Introdução
2.1.1. O sistema da Hsp70 e seu papel na desagregação de substratos
Enfatizando os tópicos abordados anteriormente, é de extrema importância para
a manutenção da homeostase celular que as proteínas tenham seu destino devidamente
determinado, seja pelo seu correto enovelamento realizado pelo sistema chaperona ou por
sua degradação mediada pelo sistema ubiquitina-proteosomo. Em condições de estresse, a
formação de agregados proteicos é facilitada nas células porque as proteínas tendem a
perder sua estrutura nativa e a expor seus resíduos hidrofóbicos, levando à formação de
grandes agregados amorfos e à perturbação proteostase. Nesses casos, o acúmulo de
proteínas mal enoveladas e agregadas pode ser muito grave, causando perda de função e
ganho de toxicidade, o que pode culminar em doenças neurodegenerativas como Parkinson,
Alzheimer e fibrose cística, câncer e morte celular (Ramos e Ferreira, 2005; Luheshi et al.,
2008).
Como forma de defesa contra essas situações, as células devem se livrar desses
agregados o mais rápido possível e o sistema chaperona é o responsável pela desagregação
desses substratos. Muitos organismos como bactérias, fungos e plantas estão sujeitos aos
vários tipos de estresses ambientais e por isso apresentam um sistema de desagregação
muito eficiente, denominado bichaperona (Glover e Lindquist, 1998; Nillegoda et al., 2017).
Esse sistema é composto de diversas proteínas, mas recebe este nome porque duas delas
compõem o centro funcional do complexo: as Hsp70 e as desagregases da família Hsp100
(superfamília AAA+ ATPases). As Hsp100s são chaperonas hexaméricas que apresentam um
poro central por onde os polipeptídeos de agregados são ligados e separados por um
mecanismo de rotação através desse poro. Quando isso acontece, o sistema da Hsp70 é
ativado pela desagregase Hsp100 e reenovela o substrato em sua conformação nativa (Mogk
et al., 2015).
Diferentemente desses organismos, os metazoários não expressam desagregases
da superfamília AAA+ ATPases, visto que as proteínas Hsp100 foram perdidas durante a
evolução. Até mesmo a existência da atividade de desagregação não era completamente
aceita, apesar de existirem evidências de que os agregados precisavam ser de alguma forma
91
resolubilizados nas células animais (Kampinga, 1993). Assim, por muito tempo o modo como
o processo de desagregação ocorre pernameceu desconhecido, até recentemente quando
estudos mostraram que as Hsp70 em cooperação com co-chaperonas específicas
apresentam essa tipo de atividade. Nesses trabalhos foi mostrado que, além de Hsp70, a
desagregação exige a presença de uma co-chaperona Hsp40 de classe B (DJB1) e um fator de
troca de nucleotídeo (NEF), Hsp110 ou a homóloga Apg2. A presença adicional de uma
Hsp40 de tipo A (DJA2) torna o processo mais eficiente por possibilitar a desagregação de
agregados de diferentes tamanhos. Os experimentos foram realizados in vitro com
chaperonas humanas purificadas e confirmados por experimentos in vivo em C. elegans
(Shorter, 2011; Rampelt et al., 2012; Nillegoda et al., 2015).
O papel de cada componente do sistema de desagregação durante esse processo
ainda não foi completamente descoberto. Evidências indicam que as Hsp70 atuam como a
principal proteína funcional do sistema. As Hsp40 provavelmente são responsáveis pelo
recrutamento dos substratos agregados e também da Hsp70, estimulando sua atividade
ATPásica e regulando o ciclo de funcionamento da Hsp70. Essas atividades já foram bem
documentadas em processos de (re)enovelamento e também de prevenção de agregação
(Tzankov et al., 2008; Nillegoda et al., 2017). Desse modo, a função da Hsp110 na
desagregação é a menos conhecida, uma vez que não se sabe ainda se apenas sua atividade
NEF ou também o domínio de ligação ao substrato estão envolvidos nos processo. Já foi
relatado que esta proteína é necessária apenas em reações de desagregação com DJB1, mas
alguma reativação de substrato já foi observada quando ambas DJB1 e DJA2 estavam
presentes formando heterocomplexos nas reações (Gao et al., 2015; Nillegoda et al., 2015).
Alguns modelos já foram propostos para explicar como o processo de
desagregação ocorre, sendo o primeiro deles nomeado de “clamp and walk”. Segundo este
modelo, Hsp110 teria um papel muito importante, não apenas de NEF, mas atuando
também como uma ATPase que controla o ciclo de ligação ao substrato, assim como Hsp70.
Dessa maneira, Hsp110 e Hsp70 formariam um heterodímero que alterna entre os estados
ligado ao ATP e ao ADP, ligando e liberando polipeptídeos da superfície dos agregados. Esse
processo de ligação e liberação sequencial de substrato promoveria que o complexo Hsp70-
Hsp110 se movimentasse ao longo da superfície do agregado, fornecendo a energia
necessária para a remoção dos polipeptídeos que fazem parte dele (Mattoo, 2013). Essa
92
hipótese é reforçada por evidências de que Hsp110 não atua só como NEF, mas também
pode se ligar a substratos (Goeckeler et al., 2008; Xu et al., 2012). No entanto, mutações no
domínio N-terminal de Hsp110, que eliminam sua atividade ATPásica, não afetaram o
processo de desagregação de substratos. Enquanto que mutantes que perderam atividade
de troca de nucleotídeo (NEF) foram deficientes no auxílio da desagregação proteica
(Rampelt et al., 2012). Isso pode sugerir que a ligação de substrato pela Hsp110 pode estar
envolvida na desagregação, mas não como parte do ciclo ATPase. Consistentemente, outra
NEF, Bag1, que é estruturalmente diferente de Hsp110 por não possuir domínio de ligação
ao substrato ou ATP apresentou baixa atividade de desagregação.
Embora a maquinaria da Hsp70 seja o centro funcional para desagregação em
metazoários, chaperonas da família sHsp também estão envolvidas. A proteína Hsp26 de
levedura foi a primeira sHsp associada com atividade de desagregação quando células de
levedura que não expressavam Hsp26 mostraram ser incapazes de desagregar luciferase
após choque térmico. Além disso, experimentos in vitro apontam que quando luciferase e
Hsp26 foram co-agregados, os agregados foram mais facilmente solubilizados pela
chaperona Hsp104 de levedura (AAA+ Hsp100), Ssa1 (Hsp70) e Ydj1 (Hsp40) (Cashikar et al.,
2005). Hsp26 também foi eficiente em auxiliar o sistema da Hsp70 humano em desagregar
luciferase in vitro (Nillegoda et al., 2015). A outra sHsp existente em leveduras, Hsp42, não
foi capaz de substituir Hsp26 nessas atividades (Ungelenk et al., 2016).
Chaperonas sHsps humanas provavelmente estão envolvidas na desagregação
proteica, ocupando o papel observado para Hsp26. Entretanto, a participação dessas
proteínas humanas ainda não havia sido estudada anteriormente. Um trabalho sugere que
HspB5 foi capaz de promover a desagregação de substratos amilóides por Hsp70, DJB1 e
Hsp110, mas as reações levaram cerca de 30 dias (Duennwald et al., 2012), o que é um
tempo muito longo em comparação com as 2 ou 3 horas que as células demoram para
ressolubilizar agregados (Gupta et al., 2011).
Apesar de ser provável que as sHsps humanas estão envolvidas na desagregação,
possivelmente o mecanismo de funcionamento dessas chaperonas é diferente, visto que
diferentes sHsps expressas em um mesmo organismo são pouco conservadas. E quando a
comparação é entre sHsps humanas e de levedura por exemplo, a divergência é tão grande
que o alinhamento delas é muito difícil. Devido a isso, não é possível usar a homologia com
93
Hsp26 para identificar quais das 10 sHsps humanas apresentariam papel no sistema de
desagregação e quais não estariam envolvidas, como Hsp42.
2.1.2. A família sHsp e HspB1 humana
As proteínas da família small Heat-shock proteins (sHsps) compõem a primeira
linha de defesa das células em condições de estresse, por serem chaperonas moleculares
ubíquas que exibem atividade independente de ATP para prevenir a agregação de proteínas
enoveladas incorretamente (Halsbeck e Vierling, 2015). Elas são caracterizadas por sua baixa
massa molecular (12 a 43 kDa) e por apresentarem em sua estrutura um domínio
conservado e rico em folhas-β denominado domínio α-cristalino (ACD). Em contraste com o
ACD, as regiões que o flanqueiam N-terminal (NTS) e C-terminal (CTS) são muito variáveis
entre as sHsps de uma mesma espécie e ainda mais entre espécies diferentes (Figura 21A),
de forma que elas evoluíram diferentemente em metazoários, plantas e fungos, pois
compartilham baixíssima identidade o que torna difícil inclusive encontrar homólogos por
alinhamento de sequências em buscas por BLAST, por exemplo (Carra et al., 2017).
Organismos unicelulares como bactérias e leveduras contêm apenas uma ou
duas sHsps (IbpA e IbpB em E. coli; Hsp26 e Hsp42 em S. cerevisiae). Por outro lado,
eucariotos multicelulares podem apresentar várias sHsps com diferentes funções e
afinidades por substratos e encontradas em diferentes compartimentos celulares (Mymrikov
et al., 2017); existem 16 genes que codificam sHsps em C. elegans e plantas superiores
comumente expressam no mínimo 12 delas (Waters, 2013; Haslbeck e Vierling, 2015). Além
do número, o estado oligomérico das sHsps varia muito em diferentes organismos. Em
bactérias e fungos, elas são descritas como dímeros funcionais, enquanto em organismos
superiores muitas sHsps podem ser encontradas como grandes complexos multiméricos de
diferentes tamanhos, dependendo do número de subunidades associadas (24 a 40). Dímeros
também já foram relatados e eles são formados mesmo nos grandes oligômeros,
constituindo a unidade de dissociação destes. Dessa forma, embora as sHsps apresentem
uma baixa massa molecular, elas são encontradas principalmente como oligômeros
polidispersos formados por 10 a 24 subunidades nas células (Haslbeck e Vierling, 2015;
Jovcevski et al., 2015). A atividade das sHsps é frequentemente modulada por modificações
pós-traducionais, especialmente fosforilação de resíduos específicos na região N-terminal
94
(Figura 21C) e há indícios na literatura de que a atividade está relacionada com a formação e
dissociação dos oligômeros (Jovcevski et al., 2015).
Figura 21: Estrutura tridimensional e mecanismo de regulação do estado oligomérico e da atividade de sHsps. Estrutura cristalográfica do (A) monômero e do (B) dodecâmero formado pela sHsp de trigo HSP16.9, exemplificando a estrutura dos domínios N-terminal, α-cristalino e C-terminal obtida para uma sHsp eucariótica (van Montfort et al., 2001; PDB: 1GME). (C) Resumo esquemático do efeito da fosforilação ou de mutações de substituição de serinas especifícas de HspB1 na oligomerização e na atividade chaperona dessa sHsp (adaptado de Jovcevski et al., 2015).
Em humanos existem 10 sHsps diferentes (HspB1 a HspB10) que podem ser
encontradas como grandes ou pequenos oligômeros e apresentam diferentes propriedades
bioquímicas e padrões de expressão, sendo algumas ubíquas e outras tecido-específicas
(Mymrikov et al., 2017). Como mencionado, os dímeros são as menores unidades funcionais
e em alguns casos se associam para formação de grandes oligômeros. O conservado ACD é
muito importante para sHsps uma vez que a dimerização ocorre pelo pareamento simétrico
antiparalelo das folhas-β7 desse domínio (Baranova et al., 2011). Porque o ACD é
conservado, não apenas homodímeros, mas heterodímeros podem ser formados entre
diferentes sHsps humanas e já foram relatados entre algumas delas, como HspB1 e HspB6
ou HspB4 e HspB5 (Skouri et al., 2012; Heirbaut et al., 2016).
95
HspB1 é a sHsp humana mais expressa em diferentes tecidos, principalmente em
condições estressantes, e é caracterizada por formar grandes oligômeros. Os homodímeros
são formados através de ligações de dissulfeto pelas folhas-β presentes no ACD. Embora o
CTS de sHsps não seja conservado, HspB1 e todas as outras sHsp que formam oligômeros
(HspB4, HspB5 e HspB7) contêm um motivo IxI/V altamente conservado nessa região
(Delbecq et al., 2012). O motivo IxI/V é responsável pela oligomerização, sendo que estudos
com sHsps de planta mutantes nessa região resultaram na dissociação de subunidades. Em
contraste, estudos com HspB4 e HspB5 mostraram que os mutantes IxI/V preservam sua
capacidade de oligomerizar, mas aumentam sua atividade chaperona de prevenção de
agregação. O mesmo estudo, no entanto, afirmou que o motivo IxI/V participa de interações
de subunidades com ACD ou com região IxI/V em outro monômero, sugerindo que ele
desempenha um papel na oligomerização, mas outras regiões também podem estar
envolvidas (Pasta et al., 2004).
Assim como o papel do motivo IxI/V na oligomerização das sHsps, não há
consenso na literatura sobre a função dos estados diméricos ou oligoméricos de HspB1. No
entanto, é bem aceito que a fosforilação de resíduos de serina específicos seja importante
para a regulação funcional do HspB1. Experimentos com mutações que mimetizam
fosforilação, pela substituição das serinas por aspartatos, mostraram que os mutantes
apresentam menor atividade chaperona que a proteína selvagem (Rogalla et al., 1999). No
entanto, outros estudos apontam que a fosforilação leva à dissociação de oligômeros em
dímeros, aumentando a atividade da chaperona (Hayes et al., 2009; Jovcevski et al., 2015). A
fosforilação de HspB1 por MAPKAPK-2 e MAPKAPK-3 foi detectada in vivo em inúmeros
resíduos de serina, com serinas 15, 78 e 82 sendo as mais predominantemente modificadas
(Figura 21C; Arrigo, 2011).
Funcionalmente, as sHsps humanas mais estudadas são HspB1, HspB5 (αB-
crystallin), HspB6 e HspB8 e a maior parte do conhecimento que se tem sobre elas baseia-se
em ensaios in vitro de prevenção de agregação usando proteínas modelo como substrato
(Mymrikov et al., 2017). A função de prevenção de agregação, entretanto, pode não estar
relacionada com a capacidade de promover desagregação de substrato em conjunto com o
sistema da Hsp70. O papel das sHsps na desagregação foi descrito apenas para as proteínas
de bactérias e leveduras, organismos que dependem do sistema de desagregação
96
bichaperona (com Hsp70 e Hsp100). O modelo aceito para esse sistema sugere que as sHsps
ativadas por temperatura se ligam aos substratos desenovelados independentemente de
ATP para formar complexos que são morfologicamente diferentes dos agregados de
proteínas formados na ausência de sHsps. Esses complexos consistem de um núcleo
formado pelo substrato e pela sHsp e uma superfície dinâmica rica em sHsps que permite
que o substrato seja resgatado eficientemente pelo sistema de desagregação e
reenovelamento Hsp70-Hsp100 (Żwirowski et al., 2017).
Levando essas informações em consideração, uma das principais motivações
deste trabalho é aumentar o conhecimento existente sobre o mecanismo do processo de
solubilização de grandes agregados pelo sistema humano de desagregação. O acúmulo
desses agregados gerado por diversas condições celulares causa perda de função proteica,
provocando diversas doenças degenerativas e câncer. Sendo assim, a ampliação do
conhecimento sobre esse processo torna-se muito relevante, uma vez que consiste no
principal método de defesa celular contra essas situações danosas. A compreensão do
mecanismo desse sistema envolvendo sHsps e sua manipulação apresenta alto potencial de
gerar novas abordagens terapêuticas contra doenças causadas pelo acúmulo de agregados
proteicos.
97
2.2. Objetivos
Devido a sua importância como embasamento para futuros processos
terapêuticos e biotecnológicos, o conhecimento sobre o processo de desagregação de
substratos em metazoários é um tópico de grande interesse. Por sua complexidade
envolvendo diversas chaperonas, esse processo só foi identificado recentemente e
permanece como principal alvo de descoberta dos maiores grupos mundiais focados no
estudo das chaperonas moleculares. O papel das sHsps humanas nesse processo ainda
permanece desconhecido e por isso o objetivo geral desse trabalho foi fornecer maior
conhecimento da atividade de desagregação da maquinaria da Hsp70 e investigar o papel de
uma sHsp humana neste processo. Para tal, nossos objetivos específicos foram:
(1) Clonar a sequência que codifica a chaperona humana HspB1 em vetor de expressão
em E. coli, expressar e estabelecer um protocolo para a purificação dessa proteína.
(2) Caracterizar a atividade de desagregação da maquinaria da Hsp70 humana in vitro,
estabelecendo os requisitos mínimos das chaperonas necessárias para que a atividade
aconteça.
(3) Caracterizar funcionalmente a interação de HspB1-WT e seus mutantes funcionais
com agregados proteicos.
(4) Investigar o papel de HspB1-WT e seus mutantes funcionais como potenciais
parceiros de Hsp70/Hsp40/Hsp110 no processo de desagregação.
98
2.3. Material e métodos
Para atingir os objetivos propostos para esta etapa deste trabalho, um projeto
foi desenvolvido em colaboração com o grupo de pesquisa do Dr. Jason C Young. Assim,
alguns experimentos foram realizados no laboratório do Prof. Dr. Carlos Ramos, mas a maior
parte deles foi realizada durante estágio no exterior, sob orientação do Dr. Young, nas
dependências de seu laboratório na McGill University (Montréal, Canadá).
2.3.1. Clonagem, expressão e purificação das proteínas
Uma pequena base teórica sobre as principais técnicas usadas para obtenção das
proteínas puras em solução já foi abordada no capítulo anterior, então, aqui serão
apresentadas de forma geral como foram obtidas as proteínas utilizadas nesta etapa do
trabalho.
Para a obtenção da chaperona HspB1, o vetor contendo a sequência que codifica
essa proteína (Frt-V5-HspB1) foi adquirido da compania Addgene. A fim de clonar essa
sequência em vetor específico para indução de expressão heteróloga em E. coli, o gene de
HspB1 foi amplificado por PCR utilizando o par de primers HspB1_WT 1 e 2 (Tabela 8) e
inserido no plasmídeo pPROEX-Hta usando as enzimas de restrição BamHI e XhoI (New
England Biolabs). A construção foi verificada através de sequenciamento. Assim como o
vetor pET28a, pPROEX permite que proteína seja expressa fusionada com uma cauda de
poli-histidina em sua porção N-terminal e a indução de expressão pode ser controlada pela
adição de IPTG no meio de cultura.
Para construção de mutantes funcionais de HspB1 foi utilizada a metodologia de
mutagênese sítio dirigida QuikChange (Agilent Technologies) com pequenas adaptações. Em
resumo, o clone contendo a sequência que codifica a proteína selvagem (pPROEX-His-HspB1-
WT) foi amplificado por PCR usando os primers com as mutações desejadas (Tabela 8) e uma
DNA polimerase de alta fidelidade (Pfu). Em seguida, os produtos da PCR foram tratados
com a enzima de restrição DpnI para digestão do DNA metilado parental e, então, usados na
transformação de células de E. coli supercompetentes da cepa XL10-Gold. Para construção
dos triplos mutantes esse processo foi repetido usando o clone já com a sequência de um
mutante e outra combinação de pares de primers. Todas as mutações foram confirmadas
por sequenciamento dos plasmídeos.
99
Tabela 8: Primers utilizados para clonagem em vetor de expressão e mutagênese
Nome Sequência
HspB1-WT-1 5’- GGCCCCGGATCCGATGACCGAGCGCCGCGTC -3’
HspB1-WT-2 5´- GGCCGGCTCGAGTTACTTGGCGGCAGTCTCATC -3’
HspB1-S15D-1 5'- CCTGCGGGGCCCCGACTGGGACCCCTTC -3'
HspB1-S15D-2 5'- GAAGGGGTCCCAGTCGGGGCCCCGCAGG -3'
HspB1-S78D-S82D-1 5'- GCCGCGCGCTCGACCGGCAACTCGACAGCGGGGTCT -3'
HspB1-S78D-S82D-2 5'- AGACCCCGCTGTCGAGTTGCCGGTCGAGCGCGCGGC -3'
HspB1-GPG-1 5'- CGCGACTCGAAGGTGCCTGGGCCGGTGATCTCGTTGGA -3'
HspB1-GPG-2 5'- TCCAACGAGATCACCGGCCCAGGCACCTTCGAGTCGCG -3'
A Tabela 9 mostra os mutantes construídos para mimetizar a fosforilação de
resíduos específicos de serinas através da substituição das serinas 15, 78 e 82 por
aspartatos. Além disso, usando o triplo mutante também foi construído um mutante de
dissociação do oligômero pela substituição do motivo IPV da região C-terminal pela
sequência GPG.
Tabela 9: Mutantes funcionais construídos para HspB1
Nome do mutante Aminoácidos mutados
HspB1-1D HspB1-S15D
HspB1-2D HspB1-S78D-S82D
HspB1-3D HspB1-S15D-S78D-S82D
HspB1-3D-GPG HspB1-S15D-S78D-S82D-I181G-V183G
A fim de expressar as proteínas em larga escala para purificação, células de E. coli
BL21(DE3) transformadas com o plasmídeo que codifica a proteína de interesse foram
cultivadas em 1 L de meio LB com 100 µg/mL de ampicilina ou 50 µg/mL de canamicina a 37
°C até atingir A600nm entre 0,6 e 0,8. A indução de expressão foi iniciada com a adição de 1
mM de IPTG ao meio de cultura. A expressão de HspB1-WT foi inicialmente testada a 37 °C
por 1, 2 e 4h; 30 °C por 2 e 4h; e 18 °C overnight. Depois disso, as células foram
100
centrifugadas usando Avanti® J-26 XP (rotor JLA-8.1000) a 4500g por 20 min e os pellets
resultantes foram ressuspendidos em Tampão de Equilíbrio (tampão EQ, Tabela 12),
congeladas em nitrogênio líquido e mantidas a -80 °C para uso posterior. Para purificação, as
células foram descongeladas e lisadas em um homogeneizador de alta pressão (Emulsiflex
Avesti), o lisado foi centrifugado a 50000 rpm por 1 h a 4 °C em ultracentrífuga Optima L-90K
(rotor type 70 Ti).
Outras proteínas utilizadas nesta etapa do trabalho já haviam sido clonadas pelo
grupo do Dr. Jason Young, tendo seu protocolo de expressão e purificação já padronizado
(Tzankov et al., 2008; Baaklini et al., 2012). Os plasmídeos utilizados e as condições de
expressão das proteínas são mostrados na Tabela 10.
Tabela 10: Plasmídeos de clonagem e condições de expressão das proteínas utilizadas
Proteína Vetor Temperatura (°C) Tempo (h)
His-HspB1-WT e mutantes pPROEX 37 4
His-Hsp70, His-Hsc70, His-Hsp110 pPROEX 30 4
His-DJA2 pPROEX 37 1
His-DJB1 pET28a 37 2
His-Myc-Luciferase pET3a 30 3
Uma vez que todas as proteínas expressas continham a cauda de poli-histidina
em sua sequência, a primeira etapa de purificação envolveu uma cromatografia de afinidade
ao níquel em coluna contendo 5 mL de resina Ni Sepharose (Nuvia IMAC Ni-charged resin).
Para HspB1-WT e os mutantes, esta foi a única etapa cromatográfica seguida apenas de uma
diálise overnight em tampão G (Tabela 12). As purificações de outras chaperonas
envolveram outras etapas, como cromatografia de exclusão por tamanho (HiPrep 16/60
Sephacryl S-300 HR – GE Healthcare) e/ou cromatografia de troca iônica (HiTrapQ HP – GE
Healthcare). Essas etapas cromatográficas foram realizadas usando sistema ÄKTA FPLC
(Amersham Bioscience) a 4 °C. As frações coletadas de cada etapa foram analisadas por SDS-
PAGE 10 ou 15%. Após a purificação, a concentração das proteínas foi determinada através
da medida de sua absorbância a 280 nm, foram congeladas em nitrogênio líquido e mantidas
101
a -80 °C. Quando necessário, as proteínas foram concentradas usando concentradores de
centrífuga (Amicon®). Os tampões e etapas de purificação usadas para cada proteína estão
detalhados nas Tabelas 11 e 12.
Tabela 11: Condições de purificação das proteínas utilizadas
Proteína HspB1, mutantes
e luciferase Hsp70, Hsc70, Hsp110 e DJB1
DJA2
Afinidade ao níquel
Tampão EQ A A C
Tampão EL A B C
Troca iônica Tampão EQ - D -
Tampão EL - D -
Exclusão por tamanho - Tampão G Tampão H
Diálise Tampão G - -
Tabela 12: Tampões utilizados para purificação das proteínas utilizadas
Nome Composição
Tampão de Equilíbrio A (Tampão EQ A) 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 500 mM NaCl; 20 mM imidazol
Tampão de Eluição A (Tampão EL A) 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 100 mM NaCl; 500 mM imidazol
Tampão EL B 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 300 mM imidazol
Tampão EQ C 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 750 mM NaCl; 60 mM imidazol
Tampão EL C 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 500 mM NaCl; 1 M imidazol
Tampão EQ D 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 50 mM NaCl
Tampão EL D 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 600 mM NaCl
Tampão G 20 mM Hepes-KOH pH 7,5; 100 mM KOAc; 5 mM MgOAc2
Tampão H 20 mM Hepes-KOH pH 7,5; 500 mM NaCl; 5 mM MgOAc2
Tampão CD 20 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,5; 100 mM NaCl
102
2.3.2. Dicroísmo circular
Para a espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD), amostras de HspB1 e seus
mutantes foram primeiramente dialisadas em Tampão CD (Tabela 12) e centrifugadas a
20000 x g por 15 min a 4 °C. As medições foram realizadas usando 500 µL de proteína a 10
µM em cubetas de quartzo de 1 mm no espectropolarímetro Chirascan, com fenda de 1 nm
e intervalos de 0,5 s. Os espectros foram obtidos de 200 a 260 nm e os sinais em mdeg
foram convertidos para elipcidade molar [θ], sendo representados como uma média de 16
espectros para cada proteína. A fim de auxiliar a interpretação dos resultados de CD, o
programa IUPred foi utilizado para predição de tendência de estrutura desordenada das
proteínas (Dosztányi et al., 2005).
Para obtenção de curvas de desenovelamento induzido por temperatura,
amostras de HspB1 a 30 µM tiveram seu sinal de CD monitorado a 217 e 208 nm, em cubetas
de quartzo de 1 mm sob aumento de temperatura de 1 °C/min de 20 a 90 °C. Além disso,
durante o aumento da temperatura, espectros foram medidos a cada 10 °C.
2.3.3. Filtração em gel analítica
O estado oligomérico de HspB1 e dos mutantes funcionais foram verificados por
filtração em gel analítica usando coluna de exclusão por tamanho Superdex 200 10/300 GL
(Ge Healthcare) previamente equilibrada com Tampão G. Através do sistema ÄKTA FPLC,
amostras de 500 µL de HspB1 a 10 µM foram aplicadas na coluna com fluxo de 0,5 mL/min a
4 °C. Absorbância a 280 nm foi monitorada durante a eluição para detectar a presença de
proteína e seu volume de eluição.
2.3.4. Espalhamento de luz dinâmica (DLS)
O tamanho dos oligômeros formados por HspB1 e também dos agregados de
luciferase formados na presença de HspB1 foram estimados através da medida de
coeficiente de difusão por DLS e convertidos para raio hidrodinâmico (Rh) e diâmetro pela
equação de Stokes-Einstein (Edward, 1970). As medidas foram realizadas em equipamento
Zetasizer Nano ZS-Zen 3600 (Malvern) a 25 °C usando cubetas de plástico de 1 cm contendo
as proteínas HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG a 20 µM em solução em tampão G. Para
a medida de tamanho dos agregados, 2 µM de luciferase nativa foram incubados na
ausência ou na presença de 20 µM de HspB1-WT, HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG a 45 °C por
103
15 min. As curvas de distribuição de tamanho representam a média obtida de 10 leituras de
60 s em cada condição.
2.3.5. Ensaio de agregação térmica da luciferase
A fim de determinar a capacidade de HspB1 e seus mutantes de interagir e co-
agregar com substrato, foram realizados ensaios de agregação térmica da luciferase. Para
tal, reações de 360 µL de volume final, em Tampão G, foram preparadas com 2 µM de His-
Myc-luciferase purificada na forma nativa e 1 mM de DTT na presença de diferentes
concentrações de HspB1. As reações foram então incubadas a 37 °C por 60 min, sendo que
nos tempos de 0, 5, 10, 15, 30 e 60 min, alíquotas de 50 µL foram transferidas para cubetas
de quatzo e a agregação da luciferase foi acessada pela medida do espalhamento de luz
detectada a 320 nm em espectrofotômetro DU730 UV-Vis (Beckman Coulter). A agregação
espontânea da luciferase na ausência de sHsps foi monitorada como controle.
2.3.6. Ensaio de enovelamento da luciferase pelo sistema da Hsp70
A fim de determinar a atividade de reenovelamento de substrato do sistema da
Hsp70 e de padronizar a quantidade de luciferase ativa, foram realizados ensaios de
enovelamento da luciferase. Para isso, 2 µM de His-Myc-luciferase foram desnaturados em
Tampão G contendo 6 M de cloreto de guanidina (Gdn-Cl) e 1 mM de DTT por 10 min em
temperatura ambiente. Em seguida 1 µL de luciferase desnaturada foi adicionado em 99 µL
de reações de reenovelamento contendo 2 mM de ATP e as chaperonas purificadas e
incubados a 30 °C por 60 min. Nos tempos 0, 5, 15, 30 e 60 min, alíquotas de 2 µL das
reações foram adicionados a 25 µL de luciferina (Luciferase Assay Reagent – Promega) para
medir a recuperação da atividade da luciferase em luminômetro de tubo SIRIUS (Berthold). A
concentração final de proteínas nas reações foi: 20 nM de luciferase, 4 µM de Hsp70, 1 µM
de Hsp110, 4 µM de DJA2 e 4 µM de DJB1 (Tzankov et al., 2008).
104
2.3.7. Ensaio de desagregação seguido de reenovelamento da luciferase pelo sistema
da Hsp70
O conceito usado neste ensaio é muito similar ao do ensaio de enovalemanto da
luciferase, porém em vez de luciferase desnaturada, aqui o substrato utilizado foram
agregados de luciferase induzidos por temperatura. Para tal, 2 µM de His-Myc-luciferase
nativa foram inicialmente agregadas pela incubação a 45 °C por 15 min em Tampão G
contendo 1 mM de DTT na ausência ou presença de 20 µM de HspB1. Em seguida, 1 µL de
luciferase agregada foi adicionada em 99 µL das reações de desagregação seguida de
reenovelamento, contendo 2 mM de ATP e um mix com as chaperonas indicadas. As reações
foram, então, incubadas a 30 °C por 180 min (Rampelt et al., 2012). Nos tempos 0, 15, 30,60,
90, 120 e 180 min, alíquotas de 2 µL de reação foram adicionados em 25 µL de luciferina
(Luciferase assay reagent – Promega) e a recuperação de atividade da luciferase foi medida
em luminômetro em tubo SIRIUS (Berthold). As concentrações finais de proteínas nas
reações, salvo indicação contrária, foram: 20 nM de luciferase, 200 nM de HspB1, 2 µM de
Hsp70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1.
2.3.8. Ensaio de desagregação da luciferase
A quantificação da recuperação de atividade dos agregados de luciferase para
detectar desagregação é uma forma indireta de verificar esse processo porque é necessário
que a luciferase esteja em sua forma nativa para que sua atividade seja medida, em outras
palavras, é preciso que os agregados sejam desagregados e em seguida reenovelados, visto
que ambos os processos são realizados pela mesma maquinaria da Hsp70.
Como forma de detectar a desagregação mais diretamente, desvinculada do
reenovelamento da luciferase, esse ensaio de desagregação foi desenvolvido com objetivo
de verificar a dissociação dos grandes agregados em monômeros de luciferase, não
necessariamente enovelados. Para isso, 2 µM de His-Myc-luciferase foram inicialmente
agregadas pela incubação a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT na
ausência ou presença de 20 µM de HspB1. Em seguida, 6 µL da luciferase agregada foram
adicionadas em 594 µL de reações de desagregação contendo 2 mM de ATP e as chaperonas
indicadas com incubação a 30 °C. Nos tempos 0 e 180 min, 200 µL das reações foram
aplicados em coluna de separação por tamanho Superose 12 10/300 GL (GE Healthcare) a
0,5 mL/min a 4 °C. Frações de 1 mL dos volumes de eluição de 6 a 18 mL foram coletadas e
105
as proteínas de cada fração foram precipitadas. Para precipitação, foram adicionados em
cada fração 500 µL de solução 50% de ácido tricloroacético (TCA) e 1,5 µL de 10 mg/mL de
ovalbumina (proteína carreadora). Após incubação no gelo por 15 min, as amostras foram
centrifugadas a 20000 x g por 30 min a 4 °C e o sobrenadante foi descartado. Logo após, os
precipitados foram lavados com 200 µL de acetona gelada seguida de centrifugação a 20000
x g por 20 min a 4 °C. Os sobrenadantes foram descartados novamente e as amostras foram
secas na capela em temperatura ambiente por 15 min. Os precipitados formados foram
ressuspendidos em 30 µL de tampão de amostra para SDS-PAGE com 1 µL de 1M Tris-base
pH 11. Finalmente, as amostras foram agitadas vigorosamente a 1300 rpm por 15min a 37 °C
usando um agitador (Thermomixer R – Eppendorf). As amostras de proteína precipitada de
cada fração foram aplicadas em SDS-PAGE 12% e detectadas por Western Blotting usando
um anticorpo específico para reconhecer a cauda Myc da luciferase (c-Myc tag antibody
9E10 – Invitrogen) e anticorpo específico para reconhecer HspB1 (anti-Hsp27 5D12-A12 –
StressMarq Biosciences).
2.3.9. Estatística
Os experimentos foram feitos em replicatas pelo menos 3 vezes. Em todas as
figuras, as barras de erro representam desvios padrão da média dos experimentos. A
significância foi determinada por testes t de Student não pareados com p < 0,05. Se as barras
de erro não foram mostradas, n < 3 e a análise estatística não foi calculada.
106
2.4. Resultados
2.4.1. Clonagem, expressão e purificação da HspB1-WT e seus mutantes
O primeiro objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo para obtenção
da proteína HspB1 isolada em solução. Para isso, o gene que a codifica foi clonado em
plasmídeo de expressão pPROEX-Hta que permitiu a inserção de uma cauda de poli-histidina
na região N-terminal da proteína, antes da primeira metionina. A clonagem foi confirmada
por sequenciamento e as sequências de nucleotídeos e aminoácidos obtidas são mostradas
na Figura 22.
Figura 22: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos da proteína His-HspB1-WT. Os resíduos de nucleotídeos alvos de mutações estão destacados em vermelho. Para obter a proteína ativa, mutações sítio específicas que mimetizam a fosforilação foram realizadas; as serinas 15, 78 e 82 foram então substituídas por aspartatos. Para obtenção de mutantes de dissociação do oligômero, mutações foram feitas no motivo IPV encontrado na região C-terminal da proteína, para isso, a isoleucina 181 e a valina 183 foram substituídas por glicinas. A sequência da cauda que inclui a poli-histidina está destacada em azul.
107
Após a obtenção do clone pPROEX-His-HspB1-WT, o mesmo foi usado como
molde para construção de mutações sítio dirigidas de substituição de resíduos específicos de
serina por aspartatos, mimetizando assim a fosforilação que ocorre nessa proteína para
regulação de sua atividade nas células. As serinas 15, 78 e 82 foram substituídas (Figura 22) e
foram gerados clones para o mutante simples (HspB1-1D ou S15D), mutante duplos (HspB1-
2D ou S78D-S82D) e mutante triplo (HspB1-3D) em que as três serinas sofreram mutação.
Posteriormente, o clone do mutante triplo foi usado como molde para construção de um
mutante ativo com dissociação do oligômero pela substituição do motivo IPV por GPG.
Os plasmídeos codificando as proteínas de interesse foram então utilizados para
expressão recombinante em E. coli. Inicialmente foram feitos testes de expressão em
pequena escala da HspB1-WT para determinação da melhor temperatura e tempo de
indução da proteína solúvel. Foram testadas as condições de 37 °C por 1, 2 e 4 h; 30 °C por 2
e 4 h; e 18 °C overnight. Os lisados obtidos em cada condição foram aplicados em resina com
níquel coordenado para determinar se as proteínas expressas tem afinidade a essa resina e
para avaliar com maior clareza, sem a presença de todas as proteínas do lisado, qual a
condição ótima de expressão. As frações insolúveis (precipitado) e solúveis (sobrenadante)
do lisado das células bacterianas em cada condição, assim como as frações da eluição da
afinidade ao níquel, foram analisadas por SDS-PAGE (Figura 23). Pode-se observar que a
proteína foi expressa em grande quantidade em todas as condições testadas, assim, a
condição ótima de expressão foi determinada pela menor quantidade de HspB1-WT
observada na fração insolúvel (P) e maior quantidade da proteína solúvel sem outras
impurezas (L, E1 e E2). A indução de expressão em grande escala para HspB1-WT ocorreu a
37 °C durante 4 h, considerada a melhor condição.
108
Figura 23: Teste de expressão da proteína His-HspB1-WT em diferentes tempos e temperaturas. O plasmídeo pPROEX-His-HspB1-WT foi transformado em E. coli BL21(DE3) e as células foram cultivadas a 37 °C em meio LB contendo 100 µg/mL de ampicilina até atingir A600nm entre 0,6 e 0,8. A expressão da proteína foi induzida pela adição de 1 mM de IPTG nas temperaturas e pelos tempos indicados. Em seguida, as células foram centrifugadas, ressupendidas em Tampão EQ A e lisadas com nitrogênio por congelamento seguido de descongelamento três vezes consecutivas na presença de 1 mg/mL. O lisado obtido foi tratado com 0,3 mg/mL de DNase e centrifugado; o sobrenadante resultante foi aplicado em coluna contendo resina carregada com níquel. Após etapas de lavagem com Tampão EQ A, a proteína foi eluída com tampão EL B. As frações foram então analisadas por SDS-PAGE 15%. (M) padrão de massa molecular; (P) precipitado; (L) lisado solúvel; (FT) flowthrough; (W) lavagem; (E) eluição. Verificamos que a proteína foi expressa em grande quantidade na fração solúvel em todas as condições testadas, mas decidimos que 37 °C por 4h foi a melhor condição de expressão.
Uma vez determinada condição ótima de expressão, a mesma foi realizada em
larga escala (6 L de meio de cultura) para obtenção de HspB1-WT pura. Como mencionado
anteriormente, as proteínas recombinantes possuem uma cauda de poli-histidina que
permite a utilização da cromatografia de afinidade níquel como primeira etapa de
purificação (Figura 24). Para tal, após a aplicação do lisado na coluna com resina Ni
Sepharose (FT) e lavagem com Tampão EQ A para evitar ligação inespecífica de proteínas
(W), impurezas foram removidas pela eluição com ~25% de Tampão EL A (125 mM de
imidazol), essa porcentagem foi determinada previamente através de cromatografia com
gradiente linear com o tampão de eluição. A proteína HspB1-WT foi eluída com 100% de
109
Tampão EL A. É possível observar que parte da proteína foi eluída logo após a injeção (FT),
seja porque a quantidade de proteína aplicada saturou a resina ou porque não houve ligação
dessas moléculas na resina. No entanto, nesta etapa cromatográfica a proteína foi obtida
com rendimento de ~30 mg/L de indução e com alto grau de pureza. As frações obtidas da
eluição de HspB1-WT foram então dialisadas em Tampão G e tiveram sua concentração
determinada antes de serem congeladas e armazenadas a -80 °C.
Inicialmente, durante o estabelecimento do protocolo de purificação, uma etapa
de cromatografia de exclusão por tamanho foi testada após a afinidade ao níquel, usando
coluna HiLoad 16/600 Superdex 200. No entanto, como será mostrado adiante, essa etapa
não foi eficiente na separação de nenhuma impureza ou de diferentes estados oligoméricos
de HspB1-WT.
Figura 24: Purificação da proteína His-HspB1-WT por cromatografia de afinidade ao níquel. Após a indução de expressão proteica a 37 °C por 4h, as células foram centrifugadas e ressuspendidas em tampão EQ A. Em seguida, as células foram lisadas usando homogeneizador de alta pressão e o lisado foi centrifugado. O sobrenadante resultante foi aplicado em coluna contendo 5 mL de resina Ni Sepharose com fluxo de 1 mL/min. (A) Cromatograma obtido na purificação, no qual observa-se que depois da etapa de lavagem com 10 volumes de coluna (CV) de Tampão EQ A, impurezas inespecíficas foram eluídas com 5 CV usando 20% de Tampão EL A (pico 1). A proteína HspB1-WT foi eluída com 100% de Tampão EL A (pico 2). (B) As frações coletadas durante a cromatografia foram analisadas por SDS-PAGE 15%. (M) padrão de massa molecular; (I) input aplicado na coluna; (FT) flowthrough; (W) lavagem. Através desta etapa cromatográfica a proteína foi obtida em grande quantidade (~30 mg/L de indução) e com alto grau de pureza.
110
Todos os outros mutantes funcionais de HspB1 tiveram sua expressão induzida
nas mesmas condições da proteína selvagem. A purificação também foi realizada com a
mesma metodologia descrita e eles se comportaram de maneira muito parecida ao que foi
mostrado na Figura 24. Impurezas foram removidas com 25% de Tampão EL A, a proteína foi
eluída com 100%, o rendimento e grau de pureza também foram semelhantes.
2.4.2. Caracterização conformacional da HspB1-WT e seus mutantes
Após a purificação das proteínas, algumas técnicas biofísicas foram utilizadas
para obtenção de informações sobre características conformacionais dessas moléculas em
solução. Inicialmente, a filtração em gel analítica foi usada para determinação do estado
oligomérico da HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG em solução (Figura 25). Pode-se
observar nos cromatograma obtidos que HspB1-WT e HspB1-3D apresentaram basicamente
o mesmo padrão de eluição, sendo totalmente eluídas no volume morto da coluna (entre 7 e
8 mL). A eluição no volume morto da coluna implica que as moléculas apresentam tamanho
grande demais para a resolução de separação da coluna. No caso da Superdex 200 10/300
GL, a resolução varia de 10 kDa a 1 MDa, o que indica que essas proteínas apresentam
tamanho igual ou superior a 1 MDa, ou seja, são grandes oligômeros em solução. Para o
mutante de dissociação do oligômero, HspB1-3D-GPG observa-se que a maior parte das
moléculas também foi eluída como grande oligômero, no entanto, cerca de 20% foi eluída
com ~14 mL, sugerindo a presença de dímeros em solução.
111
Figura 25: Determinação do estado oligomérico de HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG por GFA. Amostras das proteínas a 10 µM foram aplicadas na coluna analítica de exclusão por tamanho Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) previamente equilibrada com Tampão G. Observa-se que toda HspB1-WT foi eluída no volume morto da coluna indicando a presença de grandes oligômeros em solução. HspB1-3D também exibiu o mesmo padrão, o que sugere que a fosforilação dos resíduos não é suficiente para regular a oligomerização dessa proteína. Já HspB1-3D-GPG foi eluída em sua maior parte no volume morto, indicando a presença de oligômeros, porém cerca de 20% foi eluída próximo de 14 mL, indicando a presença de moléculas diméricas em solução. Nas curvas de eluição de HspB1-3D e HspB1-3D-GPG foram somados os valores de 0,2 e 0,4, respectivamente, na absorbância relativa a fim de facilitar a visualização, evitando a sobreposição das curvas.
Para confirmar se as proteínas foram expressas e purificadas corretamente
enoveladas e também para determinar sua composição de estrutura secundária, foram
realizados experimentos de espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD). Os espectros de
CD obtidos para HspB1-WT e HspB1-3D, nas mesmas concentrações, apresentam formato
muito semelhante (Figura 26A), praticamente sobrepostos. O mínimo de sinal obtido em 217
nm indica uma estrutura secundária composta majoritariamente de folhas-β. O espectro de
HspB1-3D-GPG também apresentou mínimo em 217 nm, no entanto, pode-se observar um
vale de sinal positivo em torno de 230 nm, o que sugere composição rica tanto em folhas-β
quanto em estruturas desordenadas.
A predição de tendência de desordem realizada pelo programa IUPred para as
proteínas HspB1-WT e HspB1-3D-GPG mostra que para as duas proteínas as regiões N-
terminal e ACD tem baixa tendência de apresentarem estrutura desordenada (< 0,5). Por
outro lado, a região C-terminal, contendo o motivo de oligomerização IPV, mostrou ter alta
112
tendência de ser desordenada (> 0,5), sendo maior ainda para o mutante HspB1-3D-GPG,
especialmente na região da mutação I181G e V183G (Figura 26E). Combinados com os
resultados de CD, esses dados podem sugerir que a oligomerização, pelo motivo IPV,
estabiliza a região C-terminal. Mas no mutante GPG, que apresenta dímeros em solução, a
oligomerização não acontece e a região fica estruturada desordenadamente em solução.
Para determinação da estabilidade térmica das proteínas, seu enovelamento foi
monitorado por CD a 217 nm ao longo do aumento de temperatura de 20 a 90 °C (Figura
26B). As curvas de desenovelamento foram similares para HspB1-WT e os mutantes, para os
quais não se observou perda de sinal de CD nesse comprimento de onda, sugerindo que
essas proteínas podem ser altamente estáveis ao aumento de temperatura. Para avaliar essa
estabilidade, o desenovelamento de HspB1 foi monitorado a 217 e também a 208 nm e
espectros de CD foram medidos a cada 10 °C enquanto a temperatura aumentava (Figuras
26C e D). Novamente, em 217 nm não foi observada perda de sinal de CD, porém em 208 nm
percebe-se que ocorre um ganho intenso de sinal a partir dos 60 °C. Observando os
espectros medidos a cada 10 °C, pode-se perceber que os espectros mantem seu formato
até 60 °C e depois disso ele muda, apresentando um mínimo em 200 nm, o que sugere perda
das estruturas de folha-β e ganho de estrutura desordenada. Apesar disso, mesmo com
aquecimento até 90 °C, não foi detectada agregação ou precipitação das amostras.
113
Figura 26: Espectroscopia de dicroísmo circular de HspB1-WT e seus mutantes funcionais. (A) Espectros de CD das proteínas HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG foram medidos usando as proteínas a 10 µM em cubeta de quatzo de 1 mm. Os sinais obtidos em mdeg foram convertidos para elipcidade molar [θ] e estão representadas como uma média de 16 espectros para cada proteína. A forma dos espectros, com mínimo em 217 nm, indica composição de estrutura secundária rica em folhas-β. (B) Curvas de desenovelamento térmico de HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG foram obtidas com 30 µM de proteína pela medida de sinal de CD a 217 nm em cubeta de quartzo de 1 mm sob aumento de temperatura de 1 °C/min de 20 a 90 °C. Não foi observada perda de sinal de CD nesse comprimento de onda para nenhuma das proteínas. (C) Espectros de CD da proteína HspB1-WT a 15 µM foram medidos a cada 10 °C durante o aumento de temperatura de 20 a 90 °C. (D) Curvas de desenovelamento da HspB1-WT obtida pela detecção de sinal de CD a 217 e 208 nm. Esses resultados indicam que a proteína é estável até 60 °C, a partir da qual sua estrutura começa a se desestabilizar em estruturas desordenadas, sugerida pelo mínimo de sinal a 208 nm. (E) Predição teórica da tendência de desordem das proteínas HspB1-WT e HspB1-3D-GPG realizada através do programa IUPred (Dosztányi et al., 2005).
114
Para caracterização do tamanho dos oligômeros formados por HspB1-WT e pelos
mutantes funcionais foram feitas medidas de espalhamento de luz dinâmico (DLS). Os
valores de coeficiente de difusão obtidos foram convertidos em raio hidrodinâmico (Rh) e
depois em diâmetro, pelos quais se obteve a distribuição de tamanho de cada proteína
(Figura 27). As curvas indicam a presença de grandes moléculas em solução, com diâmetros
de 28, 38 e 33 nm para HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG, respectivamente. Além
disso, para HspB1-WT e HspB1-3D, os picos mais estreitos sugerem que as amostras são
monodispersas. No caso de HspB1-3D-GPG, o pico largo indica que a amostra é polidispersa,
provavelmente devido à presença de moléculas de diferentes tamanhos em solução, ou seja,
os oligômeros e dímeros observados pela GFA.
Figura 27: Caracterização do tamanho dos oligômeros de HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG pelo diâmetro obtido por DLS. As proteínas HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG a 20 µM em tampão G foram utilizadas para medida de coeficiente de difusão em equipamento Zetasizer Nano (Malvern) a 25 °C usando cubeta de plástico de 1 cm. Foram realizadas 10 leituras de 60 s e a média da distribuição de coeficiente de difusão obtida dessas leituras foi convertida para distribuição de tamanho (diâmetro, em nm) pela equação de Stokes-Einstein. Observou-se que a proteína selvagem e os mutantes apresentam tamanhos similares, com diâmetro médio estimado de aproximadamente 35 nm (ou raio hidrodinâmico, Rh = ~17 nm).
115
2.4.3. Ensaio de agregação da luciferase
O primeiro ensaio realizado para caracterização funcional de HspB1-WT e dos
mutantes de fosforilação foi o de agregação de substrato, no caso luciferase. Para isso,
diferentes concentrações de HspB1-WT, HspB1-1D, HspB1-2D ou HspB1-3D foram incubadas
com luciferase a 37 °C. A agregação espontânea da luciferase, na ausência de HspB1, foi
monitorada como controle e BSA foi utilizada como controle negativo. Pode-se observar que
a proteína selvagem e o mutante simples (HspB1-1D) não foram eficazes na prevenção de
agregação, uma vez que houve aumento de espalhamento de luz em todas as concentrações
testadas (Figura 28A e B). No entanto, quando luciferase foi aquecida na presença de HspB1-
2D, na razão de 1:10, o espalhamento de luz medido foi reduzido para 70% (Figura 28C).
HspB1-3D foi mais eficiente, visto que concentrações crescentes dessa proteína resultaram
na diminuição do espalhamento de luz de luciferase, de forma que nas razões 1:2,5, 1:5 e
1:10 o espalhamento foi de 75, 55 e 45%, respectivamente, em relação ao controle (Figura
28D). Maiores concentrações de HspB1-3D testadas não mostraram maior efeito do que a
razão 1:10. Esses dados sugerem que as mutações que mimetizam a fosforilação da HspB1
foram capazes de torná-la ativa, capaz de interagir com o substrato agregado. Além disso,
quanto maior o número de resíduos fosforilados, mais a proteína se torna ativa, de modo
que HspB1-3D provavelmente pode interagir com regiões hidrofóbicas de luciferase
expostas pelo choque térmico. Esses resultados mostram ainda que a fosforilação é
importante para a ativação de HspB1, mas que esse processo é independente do estado
oligomérico da proteína, uma vez que HspB1-3D foi a mais ativa, mas ainda assim encontra-
se como oligômero em solução.
116
Figura 28: Ensaio in vitro de agregação da luciferase com HspB1-WT e os mutantes de fosforilação. Luciferase nativa a 2 µM foi incubada em Tampão G contendo 1 mM de DTT e diferentes concentrações de (A) HspB1-WT, (B) HspB1-1D, (C) HspB1-2D e (D) HspB1-3D a 37 °C por 60 min. Nos tempos 0, 5, 10, 15, 30 e 60 min, agregação da luciferase foi medida pelo espalhamento de luz detectado a 320 nm. A agregação espontânea da luciferase na ausência de HspB1 foi monitorada em cada caso como controle. (E) Representação comparativa da agregação da luciferase após 60 min na presença de diferentes concentrações de HspB1-WT, mutantes e BSA.
117
Para compreender melhor a relação entre HspB1 e o substrato durante
agregação induzida pelo choque térmico, o tamanho das moléculas formadas foi avaliado
por DLS usando luciferase agregada na ausência ou presença de HspB1-WT e dos mutantes
funcionais, na proporção de 1:10 (Figura 29). Pela distribuição de tamanho obtida em cada
caso, pode-se observar que luciferase nativa, encontrada como um monômero de cerca de
67 kDa, apresentou diâmetro de ~11 nm. Quando a mesma foi aquecida na ausência de
HspB1, os agregados formados são muito grandes, com diâmetro de cerca de 1600 nm,
tamanho muito próximo do obtido se a luciferase é aquecida na presença de HspB1-WT. No
entanto, quando há HspB1-3D durante o choque térmico, os agregados de luciferase
formados apresentaram tamanho de 150 nm. Esses resultados indicam que as moléculas
formadas ainda são grandes, maiores do que os grandes oligômeros de HspB1 (de ~35 nm,
Figura 29), mas bem menores que os agregados formados apenas por luciferase.
Esse tipo de experimento envolvendo espalhamento de luz é clássico para
caracterização da atividade de sHsps e é muitas vezes chamado de ensaio de atividade de
prevenção da agregação. No caso de luciferase e HspB1, observa-se que a sHsp não está
necessariamente prevenindo a agregação da luciferase, uma vez que o tamanho das
moléculas formadas após o choque térmico ainda é grande, mas é bem menor que na
agregação espontânea da luciferase, sugerindo que HspB1-3D está sendo responsável pela
formação de agregados diferentes daqueles formados em sua ausência.
118
Figura 29: Caracterização do tamanho dos agregados de luciferase formados com HspB1 pelo diâmetro obtido por DLS. Luciferase nativa a 2 µM foi incubada na ausência ou na presença de 20 µM de HspB1-WT, HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG em tampão G a 45 °C por 15 min. Os agregados foram utilizados para medida de coeficiente de difusão em equipamento Zetasizer Nano (Malvern) a 25 °C usando cubeta de plástico de 1 cm. Foram realizadas 10 leituras de 60 s e a média da distribuição de coeficiente de difusão obtida dessas leituras foi convertida para distribuição de tamanho (diâmetro, em nm) pela equação de Stokes-Einstein. É possível perceber que os agregados formados na ausência de HspB1 ou com HspB1-WT são muito grandes (diâmetro de ~1600 nm), enquanto os agregados formados na presença de HspB1-3D e HspB1-3D-GPG são menores, com diâmetro de 41 e 148 nm, respectivamente.
2.4.4. Ensaio de desagregação seguido de reenovelamento da luciferase
Uma vez que se observou que HspB1-3D é ativa e capaz de formar agregados
com a luciferase, o próximo passo foi investigar o seu papel na desagregação de substrato.
Nos ensaios de desagregação seguida de reenovelamento, agregados de luciferase foram
usados como substrato e foram gerados pelo aquecimento a 45 °C na ausência ou presença
de HspB1-WT e HspB1-3D. Em seguida, os co-agregados foram incubados na presença de
diferentes combinações de chaperonas moleculares, incluindo Hsp70, Hsp110 e duas Hsp40
das classes A e B (DJA2 e DJB1) e atividade da luciferase foi medida para avaliar a
desagregação do substrato. É importante enfatizar que para que a atividade de luciferase
seja medida é necessário que a luciferase tenha sida desagregada e em seguida reenovelada,
atingindo sua conformação nativa para ter atividade. Como a maquinaria da Hsp70 é
119
responsável por ambos os processos, esse método analisa desagregação e reenovelamento
intrinsicamente relacionados.
Para efeito de comparação com os resultados do ensaio de desagregação
seguido de reenovelamento, também foram realizados ensaios de reenovelamento da
luciferase. Os dois são ensaios muito similares e a diferença está no tipo de luciferase
fornecida como substrato para as chaperonas. Enquanto no ensaio de desagregação seguida
de reenovelamento, a luciferase foi agregada por aumento temperatura; no ensaio de
reenovelamento, a luciferase foi apenas desenovelada em solução contendo 6 M de cloreto
de guanidina. Dessa forma, em um ensaio são utilizados agregados proteicos e no outro são
utilizadas proteínas desenoveladas como substrato. Em ambos, a regeneração da atividade
da luciferase é monitorada para avaliar o reenovelamento ou a desagregação seguida de
reenovelamento.
Quando luciferase foi agregada na presença de HspB1-WT, as chaperonas não
foram capazes de desagregar e reativar mais do que 5% do substrato, independente da
combinação (Figuras 30A). O mesmo foi observado para quando luciferase foi agregada na
ausência de proteínas e também na presença de BSA (Figura 30C). No entanto, o triplo
mutante de fosforilação, HspB1-3D parece desempenhar um papel importante no processo
de desagregação, uma vez que foi observada reativação da luciferase quando estas proteínas
foram co-agregadas durante o choque térmico.
Em termos dos requisitos de chaperonas necessários para que a desagregação
ocorra, observou-se que a presença de Hsp70 foi absolutamente necessária. Quando Hsp70,
Hsp110 e ambas as Hsp40 (DJA2 e DJB1) estavam presentes foi obtido o máximo de
reativação da luciferase (~25%). O NEF Hsp110 mostrou-se fundamental para o processo,
visto que nas condições em que estava ausente a reativação da luciferase não foi maior que
7%. As co-chaperonas também são requisitos essenciais, na sua ausência apenas 1% da
luciferase foi reativada. Quando DJA2 e DJB1 foram usadas separadamente, obteve-se
reativação de 15% e 9% da luciferase, respectivamente, sendo que a máxima reativação de
25% foi observada quando ambas estavam presentes ao mesmo tempo, sugerindo que os
tipos A e B de Hsp40 devem apresentar funções diferentes e complementares nos agregados
(Figura 30C).
120
O ensaio de reenovelamento foi realizado por duas razões importantes (Figura
30D). Primeiro porque a atividade máxima de luciferase reativada nesse ensaio foi usada
como 100% no ensaio de desagregação, representando o total de atividade de luciferase
nativa reenovelável. Esse total, obtido na presença de Hsp70 e DJA2, foi muito próximo
(96%) da atividade medida da luciferase nativa, aquela que não sofreu agregação ou
desenovelamento, na mesma concentração. Além disso, é interessante comparar a diferença
dos requisitos de chaperonas necessários para o processo de desagregação e de
reenovelamento (Figura 30D). Para o reenovelamento, a presença de apenas uma Hsp40 foi
essencial, a DJA2 da classe A, visto que o máximo de reativação foi obtido na presença de
Hsp70 e DJA2 (96%); a adição de Hsp110 não influenciou significativamente no
reenovelamento alcançado (92%). Mais que isso, DJB1 parece inibir o reenovelamento da
luciferase, porque quando DJA2 e DJB1 são adicionados na reação ao mesmo tempo, a
reativação foi inferior a DJA2 sozinha (53%). A presença de Hsp110 novamente não se
mostrou muito eficiente, sendo 92% com DJA2, comparado com 40% se DJB1 estava
presente e 63% se ambas Hsp40 foram adicionadas.
Outro aspecto que merece ser considerado é o tempo necessário para atingir a
máxima reativação de luciferase nos dois processos. Enquanto a desagregação leva de 2 a 3
h para acontecer, o reenovelamento mostrou máxima reativação entre 30 e 60 min de
reação, depois dos quais a atividade de luciferase começa a diminuir.
121
Figura 30: Ensaio in vitro de desagregação seguido de reenovelamento da luciferase com HspB1-WT e HspB1-3D. Luciferase nativa a 2 µM foi agregada a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT na presença de (A) HspB1-WT ou (B) HspB1-3D. A ausência de HspB1 e a presença de BSA foram usadas como controle negativo. Em seguida, luciferase agregada foi diluída 1:100 em Tampão G contendo 2 mM de ATP e as chaperonas indicadas em cada condição. As reações foram incubadas a 30 °C e a regeneração de atividade da luciferase foi medida em diferentes pontos ao longo de 180 min. A concentração final de proteína nas reações foi: 20 nM de luciferase, 200 nM de HspB1, 2 µM de Hsp70, 0,5 µM Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. (C) Representação comparativa da regeneração da atividade da luciferase após 180 min quando a mesma foi agregada na ausência (controle) ou presença de HspB1-WT, HspB1-3D ou BSA. (D) Ensaio de reenovelamento da luciferase na presença das chaperonas indicadas. Luciferase nativa a 2 µM foi desnaturada em Tampão G contendo 6 M de cloreto de guanidina e 1 mM de DTT por 10 min em temperatura ambiente. A luciferase desnaturada foi diluída 1:100 em reações de reenovelamento contendo 1 mM de ATP e o mix das chaperonas indicadas. As reações foram incubadas a 30 °C por 60 min, durante os quais a atividade da luciferase foi medida. As porcentagens de desagregação estão representadas em relação ao máximo de atividade de luciferase obtida pelo reenovelamento (100%).
A concentração final de chaperonas presente nos experimentos mostrados acima
foram de 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. Estas
concentrações foram otimizadas através da titulação de cada chaperona individualmente
(Figura 31), com exceção de Hsp70 e Hsp110 que foram tituladas juntas mantendo sempre a
122
razão de 4:1, visto que esta é a razão ótima já observada em experimentos de
reenovelamento (Tzankov et al., 2008). Pode-se observar que na titulação de Hsp70 e
Hsp110 (Figura 31A) atinge-se um platô de reativação da luciferase nas concentrações de 2 e
0,5 µM, respectivamente, sendo que as concentrações de 4 e 1 µM foram apenas
ligeiramente superiores. Para DJA2 (Figura 31B), o máximo de reativação foi atingido na
concentração de 2 µM, concentrações maiores ou menores foram menos eficientes nos
processos de desagregação e reenovelamento. E por fim, a titulação de DJB1 (Figura 31C)
revelou que as concentrações de 0,5 e 1 µM foram as mais eficientes, ligeiramente superior
para 1 µM da co-chaperona.
Figura 31: Titulação das chaperonas no ensaio de desagregação seguido de reenovelamento da luciferase. Luciferase nativa a 2 µM foi agregada a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT e 20 µM de HspB1-3D. Luciferase agregada foi diluída 1:100 em Tampão G contendo 2 mM de ATP e as chaperonas indicadas em cada condição. As reações foram incubadas a 30 °C e a regeneração de atividade da luciferase foi medida em diferentes pontos ao longo de 180 min. (A) Hsp70 e Hsp110 foram tituladas mantendo uma razão de 4:1 (Hsp70:Hsp110). A concentração final de DJA2 e DJB1 foi de 2 e 1 µM, respectivamente. (B) Titulação de DJA2. A concentração final das chaperonas foi: 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110 e 1 µM de DJB1. (C) Titulação de DJB1. A concentração final das chaperonas foi: 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110 e 2 µM de DJA2. As porcentagens de desagregação estão representadas em relação ao máximo de atividade de luciferase obtida pelo reenovelamento (100%).
123
A desagregação seguida de reenovelamento da luciferase também foi realizada
utilizando outra isoforma abundante de Hsp70 e outro tipo de NEF. Hsp70 (HSPA1A/B) é
expressa durante condições celulares normais, mas é regulada para aumentar sua expressão
sob condições de estresse, enquanto Hsc70 (HSPA8) é constitutivamente expressa (Gething
e Sambrook, 1992). Quando Hsp70 e Hsc70 foram utilizadas (juntamente com Hsp110, DJA2
e DJB1) nas reações de desagregação de agregados formados com HspB1-3D (Figura 32A),
Hsp70 foi capaz de reativar ~25% da luciferase e Hsc70 apenas 10%. Além disso, para Hsc70
a combinação de DJA2 e DJB1 não se mostrou mais eficiente do que quando as co-
chaperonas foram usadas separadamente, visto que a reativação de luciferase foi a mesma
(~10%) quando apenas DJA2 ou ambas estavam presentes na reação. Quando apenas DJB1
foi adicionada a reativação foi de cerca de 3%.
Outra família abundante de NEF no citosol de células humanas são as proteínas
Bag (Bag1 a Bag5). Elas não são estruturalmente relacionadas com Hsp110 ou Hsp70 e não
podem ligar substratos diretamente, visto que apresentam um domínio conservado BAG que
interage com NBD de Hsp70 e os outros domínios são bastante variáveis entre as proteínas
da família. Bag1 é a proteína mais estudada e possui um domínio ubiquitin-like e o domíno
BAG na região C-terminal. Assim como Hsp110, Bag1 promove o enovelamento de substrato
pela ação de troca de nucleotídeo na Hsp70, numa razão ótima de 1:1 (Tzankov et al., 2008).
Além da proteína Bag1 completa, também foi utilizado o domínio Bag isolado (C-
Bag1) no ensaio de desagregação seguido de reenovelamento com HspB1-3D, Hsp70 e as
Hsp40, a razão 1:1 com Hsp70 foi mantida (Figura 32B). Observou-se nos experimentos que
na presença de Hsp70, Bag1, DJA2 e DJB1 a reativação da luciferase foi de aproximadamente
15%, sendo menos eficiente se comparada com Hsp110 (~25%). No entanto, na presença de
do domínio C-Bag1 nas mesmas condições cerca de 20% da luciferase foi reativada. Como
observado anteriormente, nas condições sem Hsp40 ou quando DJA2 e DJB1 foram usadas
separadamente, a reativação da luciferase não é mais eficiente.
124
Figura 32: O efeito de Hsc70 e outros NEFs no ensaio de desagregação seguido de reenovelamento da luciferase. Luciferase nativa a 2 µM foi agregada a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT e 20 µM de HspB1-3D. Luciferase agregada foi diluída 1:100 em Tampão G contendo 2 mM de ATP e as chaperonas indicadas em cada condição. As reações foram incubadas a 30 °C e a regeneração de atividade da luciferase foi medida em diferentes pontos ao longo de 180 min. (A) Representação comparação da atividade de desagregação da luciferase obtida para Hsp70 e Hsc70 após 180 min. A concentração final de chaperonas foi 2 µM de Hsp70 ou Hsc70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. (B) O efeito de Hsp110, Bag1 e C-Bag1 na desagregação seguida de reenovelamento da luciferase após 180 min. A concentração final de chaperonas foi 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110 ou 2 µM de Bag1 ou 2 µM de C-Bag1, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. As porcentagens de desagregação estão representadas em relação ao máximo de atividade de luciferase obtida pelo reenovelamento (100%).
2.4.5. O mutante de dissociação do oligômero HspB1-3D-GPG
Uma vez que se observou que HspB1 fosforilada (HspB1-3D) é um oligômero
ativo e desempenha um papel importante na formação de agregados capazes de serem
ressolubilizados e reenovelados pelas chaperonas, o mutante HspB1-3D-GPG também foi
utilizado nos experimentos. Essa mutação perturba o motivo IPV presente na região C-
terminal que é responsável pela oligomerização de HspB1. Como foi mostrado pela
cromatografia de exclusão por tamanho (Figura 25) cerca de 20% das moléculas foram
eluídas em volume diferente do volume morto do oligômero, pelo menos logo após a
purificação. Assim como realizado com HspB1-WT e os mutantes de fosforilação, o primeiro
ensaio realizado com HspB1-3D-GPG foi o de agregação térmica da luciferase (Figura 33A).
Pode-se observar que esse mutante foi mais eficiente do que os demais na prevenção de
aumento do espalhamento de luz da luciferase (Figura 33B), sendo que um mínimo de 20%
125
do espalhamento foi observado nas razões de 1:10 de luciferase para HspB1-3D-GPG,
seguido de 23, 26 e 55% nas razões 1:5, 1:2,5 e 1:1, respectivamente.
O experimento de DLS realizado para determinar o tamanho dos agregados
formados na presença de HspB1-WT e dos mutantes funcionais mostrou que os agregados
formados na presença de HspB1-3D-GPG foram os menos, apresentando Rh de 41 nm (Figura
29).
Figura 33: Ensaio in vitro de agregação térmica da luciferase usando HspB1-3D-GPG. Luciferase nativa a 2 µM foi incubada em Tampão G contendo 1 mM de DTT e diferentes concentrações de (A) HspB1-3D-GPG a 37 °C por 60 min. Nos tempos 0, 5, 10, 15, 30 e 60 min, agregação da luciferase foi medida pelo espalhamento de luz detectado a 320 nm. A agregação espontânea da luciferase na ausência de HspB1 foi monitorada como controle. (B) Representação comparativa da agregação da luciferase após 60 min na presença de diferentes concentrações de HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG. Pode-se observar que HspB1-3D-GPG foi mais eficiente que a proteína selvagem e que os outros mutantes na co-agregação com o substrato, reduzindo para 20% o espalhamento de luz da luciferase na proporção 1:10.
A desagregação seguida de reenovelamento da luciferase também foi mais
eficiente quando os agregados foram formados na presença de HspB1-3D-GPG (35%)
quando comparado com HspB1-3D (25%), se Hsp70, Hsp110, DJA2 e DJB1 estavam presentes
na reação (Figura 34A e C). Os requisitos de chaperonas foram muito similares, sendo que
Hsp70, Hsp40 e Hsp110 foram essenciais. Apesar da presença de ambas Hsp40 também
tenha resultado na melhor condição de reativação, é interessante apontar que os agregados
gerados na presença de HspB1-3D-GPG foram mais reativados quando DJB1 (26%) estava
presente separadamente, se comparado com DJA2 (20%), diferentemente do que foi
observado para os agregados com HspB1-3D.
126
Figura 34: Ensaio in vitro de desagregação seguido de reenovelamento da luciferase com HspB1-3D-GPG. Luciferase nativa a 2 µM foi agregada a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT e (A) 20 µM de HspB1-3D-GPG. Luciferase agregada foi diluída 1:100 em Tampão G contendo 2 mM de ATP e as chaperonas indicadas em cada condição. As reações foram incubadas a 30 °C e a regeneração de atividade da luciferase foi medida em diferentes pontos ao longo de 180 min. A concentração final de proteína nas reações foi: 20 nM de luciferase, 200 nM de HspB1, 2 µM de Hsp70, 0,5 µM Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. (B) Titulação de HspB1-3D e HspB1-3D-GPG durante agregação da luciferase. O experimento foi realizado conforme descrito acima, mas luciferase nativa foi agregada na presença de diferentes concentrações de HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG. As concentrações finais das chaperonas foram: 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. (C) Representação comparativa da regeneração da atividade da luciferase após 180 min quando a mesma foi agregada na ausência (controle) ou presença de HspB1-WT, HspB1-3D, HspB1-3D-GPG ou BSA. As porcentagens de desagregação estão representadas em relação ao máximo de atividade de luciferase obtida pelo reenovelamento (100%). As barras correspondentes à agregação da luciferase sozinha (controle), ou luciferase agregada na presença de BSA, HspB1-WT e HspB1-3D foram repetidas da Figura 30C para facilitar a comparação dos resultados.
127
A filtração em gel analítica mostrou que HspB1-3D-GPG apresenta dois estados
em solução, grandes oligômeros e dímeros, e os resultados acima mostram que os
agregados formados com este mutante foram mais eficientemente reativados que aqueles
formados com HspB1-3D. Por isso, a próxima questão que surge desses resultados é se os
dímeros de HspB1 seriam a forma mais ativa desta proteína. Para responder esta questão,
HspB1-3D-GPG altamente concentrada foi aplicada em coluna de cromatografia de exclusão
por tamanho para que os oligômeros e dímeros fossem isolados (Figura 35A). Como
esperado, os dois picos que correspondem a esses estados oligoméricos foram observados, a
maior parte sendo eluída no volume morto (oligômeros) e o restante eluindo em cerca de 14
mL (dímeros). As frações de cada pico foram concentradas para o volume original e, após
incubação de 3 h no gelo, foram reaplicadas na mesma coluna individualmente. As
cromatografias realizadas com as formas isoladas fornecem informação sobre se os
oligômeros e dímeros podem ser isolados ou se as formas estão em equilíbrio, deslocando-o
para um ou outro estado dependendo de sua quantidade em solução. A cromatografia dos
oligômeros isolados mostrou que uma pequena parte das moléculas permanece podendo se
dissociar em dímeros, uma vez que um pequeno pico eluído em 14 mL foi observado. Em
contraste, os dímeros não foram capazes de se reorganizar em oligômeros, permanecendo
neste estado após seu isolamento pela primeira cromatografia.
O dicroísmo circular realizado com oligômeros e dímeros isolados adicionou
informações interessantes relacionadas com a conformação dessas moléculas (Figura 35B).
O espectro de HspB1-3D-GPG mostrado na Figura 26A apresenta mínimo em 217 nm,
indicando a composição rica em folhas-β assim como HspB1-WT e HspB1-3D, mas também
um vale de sinal positivo em torno de 230 nm, sugerindo composição de estruturas
desordenadas. Os oligômeros isolados de HspB1-3D-GPG apresentam espectro de CD muito
similar ao visto para HspB1-WT e HspB1-3D sem o vale de sinal positivo em 230 nm; este
padrão foi observado apenas nos dímeros isolados, sugerindo que os dímeros apresentam
domínios desordenados que provavelmente se organizam durante a oligomerização.
Funcionalmente, o ensaio de desagregação seguido de reenovelamento (Figura
35C e D) mostrou que os agregados formados com os oligômeros foram reativados tão
eficientemente (37%) quanto aqueles formados com HspB1-3D-GPG total (35%) na presença
128
de Hsp70, Hsp110, DJA2 e DJB1. Por outro lado, quando luciferase foi agregada na presença
dos dímeros apenas 13% de reativação foi observada na melhor condição.
Figura 35: Caracterização conformacional e funcional de oligômeros e dímeros isolados de HspB1-3D-GPG. (A) 500 µL de HspB1-3D-GPG a 500 µM foram aplicados em coluna de filtração em gel analítica Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) previamente equilibrados com Tampão G. Frações dos picos 1 e 2 foram coletadas e concentradas separadamente para o volume de 500 µL. Após incubação de 3 h no gelo, as amostras isoladas dos picos 1 e 2 foram reaplicadas na mesma coluna de separação a fim de verificar se oligômeros e dímeros encontravam-se em equilíbrio em solução. (B) Espectros de CD da proteína HspB1-3D-GPG total e dos oligômeros e dímeros isolados foram medidos usando 10 µM de proteína em cubeta de quartzo de 1mm. Os sinais obtidos em mdeg foram convertidos para elipcidade molar [θ] e estão representadas como uma média de 16 espectros para cada proteína. (C) Ensaio in vitro de desagregação seguida de reenovelamento da luciferase. Os experimentos foram realizados como descrito anteriormente, mas luciferase nativa foi agregada na presença de 20 µM de HspB1-3D-GPG total ou 20 µM de oligômeros (pico 1) ou dímeros (pico 2) isolados. A concentração final de proteínas nas reações foi: 20 nM de luciferase, 200 nM de HspB1_3D_GPG, 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1. (D) Representação comparativa da regeneração da atividade da luciferase após 180 min quando a mesma foi agregada na presença de HspB1-3D-GPG total ou oligômeros (pico 1) e dímeros (pico 2) isolados. As porcentagens de desagregação estão representadas em relação ao máximo de atividade de luciferase obtida pelo reenovelamento (100%).
129
2.4.6. Ensaio de desagregação da luciferase
Nos experimentos mostrados até aqui, a desagregação da luciferase foi
observada pela medida de sua atividade, o que implica que desagregação e reenovelamento
deveriam necessariamente estar ocorrendo nas reações. A fim de mensurar a atividade de
desagregação desvinculada da atividade de reenovelamento, o ensaio de desagregação foi
modificado de forma que a retirada de luciferase dos agregados pelas chaperonas fosse
detectada sem a necessidade da mesma readquirir sua forma nativa. É interessante
investigar a desagregação mais diretamente porque mais luciferase poderia estar sendo
desagregada do que reenovelada, então a medida de atividade da luciferase poderia não
representar a verdadeira desagregação de substrato. Sendo assim, as reações de
desagregação foram preparadas da mesma forma, mas em vez de medir a atividade de
luciferase ao longo de 180 min, elas foram analisadas por cromatografia de exclusão por
tamanho e Western Blotting, nos tempos 0 e 3 h. A ideia por traz desta metodologia é que os
agregados de luciferase e HspB1 formados no choque térmico no início da reação são
grandes e eluídos no volume morto da coluna. Quando a desagregação é promovida pelas
chaperonas após 3 h de reação, moléculas monoméricas de luciferase são removidas destes
agregados e seriam então eluídas em volume de eluição que corresponderia a 67 kDa.
Estes experimentos foram realizados na presença (Figura 36) e na ausência
(Figura 37) das chaperonas moleculares. A luciferase nativa foi eluída como monômero nas
frações entre 12 e 14 mL, enquanto os agregados formados e utilizados no início da reação
foram eluídos no volume morto da coluna (entre 7 e 8 mL), independente do tipo de HspB1
usada na co-agregação com luciferase, como esperado.
Quando luciferase foi agregada na presença de HspB1-WT, sua detecção foi de
4% relativa ao total de proteína aplicada na cromatografia de filtração em gel. A baixa
detecção pode ser resultado da perda de proteína ocasionada porque mais etapas
experimentais foram adicionadas para detecção da desagregação, como filtração em gel,
precipitação das proteínas das frações coletadas e Western Blotting. Especialmente grandes
agregados podem ser resistentes ao SDS ou ficarem acumulados no filtro das colunas
cromatográficas, não sendo assim detectados pelo Western Blotting. Diferentemente, a
detecção de luciferase foi de cerca de 50% do total aplicado quando agregada na presença
de HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG, sugerindo, como já foi observado, que os agregados
130
formados com estas sHsps são menores e diferentes dos formados espontaneamente ou
com HspB1-WT.
Neste contexto, ~15% da luciferase foi observada eluída como monômero (12 a
14 mL) após 3 h de reação quando agregada com HspB1-3D-GPG e na presença de
chaperonas. Nestas condições, se a agregação ocorreu com HspB1-3D, cerca de 7% da
luciferase foi desagregada e menos de 1% quando HspB1-WT foi utilizada (Figura 36A e B).
Quando esses experimentos foram realizados na ausência de chaperonas como controle,
luciferase foi eluída no volume morto independente da HspB1 usada durante a agregação
(Figura 37). Esses resultados indicam que o processo de desagregação é realmente
dependente de chaperonas e que os mutantes HspB1-3D e HspB1-3D-GPG são necessários
na co-agregação com luciferase para que os agregados formados possam ser
ressolubilizados.
131
Figura 36: Ensaio in vitro de desagregação da luciferase detectada por Western Blotting na presença de HspB1-WT, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG. (A) Luciferase nativa a 2 µM foi agregada a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT na presença de 20 µM de HspB1-WT, HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG. Luciferase agregada foi diluída 1:100 em Tampão G contendo 2 mM de ATP e as chaperonas (2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1) e incubada a 30 °C. Nos tempos 0 e 3 h as reações foram aplicadas em coluna de filtração em gel analítica Superose 12 10/300 GL. Frações de 1 mL foram coletadas do volume morto até 18 mL de volume de eluição e cada fração teve suas proteínas precipitadas usando BCA. As amostras foram então aplicadas em SDS-PAGE 12% e o conteúdo de luciferase e HspB1 de cada fração foi detectado por Western Blotting usando anticorpos específicos. A quantidade total de proteína antes da cromatografia de filtração em gel foi aplicada no SDS-PAGE diluída 1:10. Quantificação da intensidade das bandas para (B) luciferase e (C) HspB1 foi realizada, a banda da quantidade total de proteína (T) multiplicada por 10 foi considerada como 100%.
132
Além da detecção do substrato luciferase, a detecção de HspB1 também revelou
informações interessantes sobre o papel dessa sHsp na desagregação. Na presença de
chaperonas (Figura 36A e C) observou-se que HspB1-WT foi eluída no volume morto nos
tempos 0 e 3 h. HspB1-3D também foi eluída no volume morto no início da reação, como já
observado, mas curiosamente cerca de 5% foi observada entre 12 e 14 mL de eluição após 3
h de reação, indicando que este mutante foi dissociado em dímeros. Já HspB1-3D-GPG,
como esperado para o tempo 0 h, teve cerca de 20% detectada como dímero e o restante
como oligômero, porém, após 3 h de reação a porcentagem de dímeros detectada
aumentou para 45%.
Em contraste, nos experimentos na ausência de chaperonas (Figura 37A e C),
HspB1-3D não foi observada eluindo como dímero e HspB1-3D-GPG aumentou a quantidade
de dímeros de 25 para 30% apenas. Esses resultados sugerem que os oligômeros de HspB1
são necessários para desagregação, mas que após o processo ocorrer monômeros de
luciferase e dímeros de HspB1 são liberados como produtos; os dímeros liberados são então
reorganizados em oligômeros a menos que o motivo IPV tenha sido perturbado. Além disso,
chaperonas são essenciais para que a desagregação de substrato e a dissociação dos
oligômeros aconteçam.
Para determinar se a ligação de HspB1 ao substrato ou às chaperonas é
importante para dissociação dos oligômeros em dímeros, o mesmo ensaio mostrado acima
foi realizado na ausência de luciferase e a eluição de HspB1 foi detectada na presença
(Figura 38A e B) e ausência (Figura 38C e D) das chaperonas moleculares. Observou-se que
HspB1-WT foi majoritariamente eluída no volume morto na presença ou ausência de
chaperonas. Quando chaperonas estavam presentes nas reações, 6% da HspB1-3D foi
detectada como dímeros após 3 h de reação. Para HspB1-3D-GPG, a porcentagem de
dímeros aumentou entre o início até 3 h de reação, de 25% para 48% na presença de
chaperonas comparado com 15% para 30% na ausência delas. Esses dados sugerem que a
presença de chaperonas e não do substrato apresenta um papel importante na liberação de
HspB1 como dímeros em solução.
133
Figura 37: Ensaio in vitro de desagregação da luciferase detectada por Western Blotting na ausência de chaperonas. (A) Luciferase nativa a 2 µM foi agregada a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT na presença de 20 µM de HspB1-WT, HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG. Luciferase agregada foi diluída 1:100 em Tampão G contendo apenas 2 mM de ATP e incubada a 30 °C. Nos tempos 0 e 3 h as reações foram aplicadas em coluna de filtração em gel analítica Superose 12 10/300 GL. Frações de 1 mL foram coletadas do volume morto até 18 mL de volume de eluição e cada fração teve suas proteínas precipitadas usando BCA. As amostras foram então aplicadas em SDS-PAGE 12% e o conteúdo de luciferase e HspB1 de cada fração foi detectado por Western Blotting usando anticorpos específicos. A quantidade total de proteína antes da cromatografia de filtração em gel foi aplicada no SDS-PAGE diluída 1:10. Quantificação da intensidade das bandas para (B) luciferase e (C) HspB1 foi realizada e a banda da quantidade total de proteína (T) multiplicada por 10 foi considerada como 100%.
134
Figura 38: Eluição de HspB1-Wt, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG após choque térmico na ausência e presença de chaperonas. As proteínas a 20 µM foram incubadas a 45 °C por 15 min em Tampão G contendo 1 mM de DTT. Após o choque térmico, as amostras foram diluídas 1:100 em Tampão G contendo 2 mM de ATP e incubadas na (C) ausência ou (A) presença de 2 µM de Hsp70, 0,5 µM de Hsp110, 2 µM de DJA2 e 1 µM de DJB1 a 30 °C. Nos tempos 0 e 3 h as reações foram aplicadas em coluna de filtração em gel analítica Superose 12 10/300 GL. Frações de 1 mL foram coletadas do volume morto até 18 mL de volume de eluição e cada fração teve suas proteínas precipitadas usando BCA. As amostras foram então aplicadas em SDS-PAGE 12% e o conteúdo de HspB1 de cada fração foi detectado por Western Blotting usando anticorpo específico. A quantidade total de proteína antes da cromatografia de filtração em gel foi aplicada no SDS-PAGE diluída 1:10. Quantificação da intensidade das bandas na (B) presença (D) ausência de chaperonas foi realizada e a intensidade obtida da banda da quantidade total de proteína (T) multiplicada por 10 foi considerada como 100%.
135
2.5. Discussão
2.5.1. Caracterização conformacional de HspB1-WT e dos mutantes funcionais
As small Heat shock proteins (sHsps) são chaperonas extremamente importantes
para as células em condições estressantes, cuja principal função é a prevenção de agregação
de polipeptídeos mal enovelados gerados nessas condições (Haslbeck e Vierling, 2015).
Recentemente, também foi relatada a possível participação dessas chaperonas (Hsp26 de
levedura) no processo de desagregação em organismos unicelulares e multicelulares
(Rampelt et al., 2012; Nillegoda et al., 2015). Uma vez que nenhuma sHsp humana foi
caracterizada nesse sentido, neste trabalho utilizamos uma abordagem in vitro para
demostrar que HspB1 está ativa na sua forma fosforilada e, assim, está envolvida no
processo de desagregação de substratos em conjunto com a maquinaria da Hsp70 humana.
Para isso, a sequencia que codifica HspB1 selvagem foi clonada em vetor de
expressão e então utilizado para construção de mutantes (HspB1-3D) que mimetizam a
fosforilação em resíduos específicos de serinas (S15, S78 e S82). Esses resíduos foram
identificados em trabalhos anteriores através de experimentos in vivo pela fosforilação
causada pelas kinases MAPKAPK-2 e MAPKAPK-3 (Arrigo, 2011). Além da fosforilação, outra
característica importante para o estudo de HspB1 é sua associação em grandes oligômeros,
devido à presença do motivo IPV (Delbecq et al., 2012) e por este motivo, também foi
construído o mutante HspB1-3D-GPG de desestabilização dos oligômeros.
Após a purificação de HspB1-WT e desses mutantes funcionais, algumas técnicas
foram utilizadas para verificação dessas características conformacionais já descritas
anteriormente na literatura. A associação de HspB1 em oligômeros foi verificada através dos
experimentos de cromatografia de filtração em gel, nos quais as proteínas HspB1-WT e
HspB1-3D foram eluídas no volume morto da coluna, indicando a eluição de moléculas de
alta massa molecular. De fato, estudos demonstram que os oligômeros de HspB1 podem
atingir até 1 MDa (Rogalla et al., 1999; Mymrikov et al., 2016). A eluição das HspB1 no
volume morto da cromatografia provavelmente sugere que as proteínas são grandes
oligômeros, mas também há possibilidade de serem apenas agregados em solução. Esses
agregados poderiam ser formados durante a expressão heteróloga e purificação etambem
seriam eluidos no volume morto, devido ao seu grande tamanho.
136
A fim de abordar essa questão, a técnica de DLS foi utilizada para estimar o
tamanho das partículas de HspB1-WT e dos mutantes em solução. Devido ao grande
tamanho dos oligômeros e à estrutura desordenada das regiões NTD e CTD, existe uma
dificuldade técnica do estudo estrutural de sHsps humanas que explica a pouca informação
sobre a conformação de HspB1 encontrada na literatura. Os diâmetros obtidos para as
proteínas foram semelhantes entre si, variando entre 30 e 35 nm (Rh de 15 a 17 nm),
tamanho que pode ser considerado grande para a maioria das proteínas. Apesar de
apresentarem diversos tamanhos e estruturas, a grande maioria das proteínas possui massa
molecular entre 20 e 300 kDa, com Rh entre 3 e 10 nm; a proteína BSA, por exemplo, tem 66
kDa e Rh de 3,5 nm (Axelsson, 1978). Assim, em comparação com outras proteinas, as HspB1
purificadas se mostraram bastante grandes, mas não atingem tamanhos tão grandes quanto
agregados proteicos podem apresentar. A medida do tamanho de agregados de luciferase,
por exemplo, resultou em Rh de aproximadamente 1600 nm. Dessa forma, confirmamos que
as HspB1 não foram purificadas como agregados, mas sim como grandes oligômeros cujo
tamanho se assemelha ao de pequenas organelas, como ribossomos eucarióticos, por
exemplo, que tem diâmetro de 25 a 30 nm (Wilson e Doudna Cate, 2012).
Para o mutante HspB1-3D-GPG foram observados oligômeros, mas a
cromatografia de filtração em gel da HspB1-3D-GPG indicou também que esse mutante é
capaz de dissociar cerca de 20% das moléculas em dímeros. Apesar de ser bem estabelecido
que HspB1 sofre oligomerização e que pode se dissociar, o mecanismo de regulação
envolvido nesse processo e a função fisiológica desses estados oligoméricos ainda não são
completamente conhecidos. Alguns resultados sugerem que os oligômeros correspondem à
forma inativa da proteína e que a dissociação em dímeros, estimulada pela fosforilação, é
importante para ativação de HspB1. No entanto, a caracterização in vitro da atividade
chaperona de sHsps humanas é bastante controversa; alguns grupos foram capazes de
observar a atividade de prevenção de agregação com sHsps selvagens usando diferentes
substratos (Mymrikov et al., 2016), enquanto outros autores concluíram que as proteínas
selvagens são oligoméricas e não funcionais, necessitando de algum tipo de ativação
(Jovcevski et al., 2015). Em nossos experimentos verificamos que o mutante HspB1-3D, que
mimetiza a fosforilação, não foi capaz de se dissociar em dímeros, o que indica que a
fosforilação é importante para ativação da proteína, mas não necessariamente que isso
137
depende da formação de dímeros. Alguns indícios ainda sugerem que o aumento da
temperatura resulta no deslocamento do equilíbrio de oligômeros para dímeros (Stengel et
al., 2010), no entanto, isso não foi observado em nossos experimentos de cromatografia de
filtração em gel.
A fim de obter mais informações sobre a estrutura dessas proteínas, espectros
de dicroísmo circular foram medidos para HspB1-WT e para os mutantes. Eles revelaram que
apesar da alta massa molecular, as proteínas foram purificadas enoveladas, o que também
corrobora a presença de oligômeros em solução, em vez de grandes agregados amorfos
como poderia-se imaginar a princípio. Os espectros de CD mostram que HspB1-WT e os
mutantes apresentam composição de estrutura secundária rica em folhas-β, condizendo
com a estrutura conhecida do domínio α-cristalino (ACD) conservado nesta família de
chaperonas (Baranova et al., 2009; Baranova et al., 2011). Nos espectros do mutante HspB1-
3D-GPG, além das folhas-β, também foi possível detectar a contribuição de estruturas
desordenadas na proteína, pela presença de uma banda positiva a 230 nm. A estrutura das
regiões do NTD e CTD não é conhecida, mas predições indicam que esses domínios são
flexíveis e desordenados (Sudnitsyna et al., 2012), então, possivelmente eles estão
contribuindo no espectro de HspB1-3D-GPG. Quando espectros dos oligômeros e dímeros
isolados foram obtidos, percebeu-se que nos dímeros ainda é possível detectar a
contribuição de estrutura desordenada, enquanto nos oligômeros o espectro é semelhante
aos das HspB1-WT e HspB1-3D. Isso pode fornecer informações sobre a importância da
oligomerização na estabilidade conformacional dessa chaperona. Esses resultados sugerem
que a interação dos motivos IPV de duas moléculas de HspB1 pode tornar a região C-
terminal mais estruturada, o que não acontece nos dímeros, nos quais essa região está solta.
Essa hipótese foi reforçada pela nossa análise de tendência de desordem, que estimou
grande tendência de estruturas desordenadas, principalmente para região C-terminal, para
HspB1-WT e HspB1-3D, mas que é ainda maior no mutante HspB1-3D-GPG.
As proteínas HspB1 foram produzidas com intenção de caracterizar seu papel em
ensaios de agregação induzida por temperatura, então é interessante obter informações
sobre sua estabilidade térmica através da medida de curvas de desenovelamento térmico
por CD. Nas curvas obtidas para HspB1-WT e os mutantes funcionais, monitoradas a 217 nm,
não foi observada perda de estrutura secundária mesmo quando as temperaturas atingiram
138
90 °C, o que poderia indicar que essas proteínas permanecem estáveis até essa temperatura.
No entanto, quando o sinal de CD de HspB1-WT foi monitorado a 217 e 208 nm verificou-se
que essas proteínas permanecem estáveis até 65 °C e que perdem sua estrutura de folhas-β
em temperaturas superiores. Apesar disso, os espectros obtidos ao longo do aumento de
temperatura, mostraram que HspB1-WT não desenovela completamente mesmo a 90 °C, em
vez disso torna-se rica em estruturas desordenadas, com mínimo de sinal próximo de 200
nm. Não foi observada agregação das amostras durante o processo e as proteínas
readquirem a conformação inicial após o resfriamento. Esses resultados indicam que essas
proteínas são bastante estáveis à variação de temperatura e permitiram que as proteínas
fossem utilizadas nos ensaios de agregação de luciferase realizados a 37 e 45 °C.
2.5.2. O papel de HspB1 de co-agregar com substrato e possibilitar sua desagregação
Os primeiros experimentos para investigar a função de HspB1-WT e dos
mutantes foram os ensaios de agregação com luciferase a 37 °C. Os resultados indicam que
os mutantes de fosforilação duplos e triplos de HspB1 apresentam atividade de co-
agregação com substrato. A razão 1:10 entre luciferase e os mutantes de HspB1 foi a mais
eficiente, diminuindo em 30, 60 e 80% o espalhamento de luz da luciferase na presença de
HspB1-2D, HspB1-3D e HspB1-3D-GPG, quando comparados com o controle na ausência de
HspB1. Este ensaio é clássico para caracterização de sHsps e normalmente é denominado
ensaio de prevenção de agregação do substrato. Nesse caso, as sHsps interagiriam com o
substrato e impediriam o colapso hidrofóbico, protegendo a formação de agregados. Nossos
resultados sugerem que em vez de prevenir a agregação, HspB1 co-agrega com o substrato e
o prepara para desagregação pelo sistema da Hsp70.
Dessa maneira, a diminuição de espalhamento de luz da luciferase observada no
ensaio de agregação seria reflexo da formação de co-agregados menores formados por
luciferase e HspB1. Essa hipótese foi corroborada tanto nos ensaios de desagregação quanto
nos experimentos de DLS. Por DLS, foi determinado o tamanho das partículas formadas por
luciferase após choque térmico de 45 °C na ausência e na presença de HspB1-WT e dos
mutantes funcionais. No estado nativo, a luciferase apresentou diâmetro de 11 nm e,
quando exposta ao choque térmico, formou agregados de cerca de 1600 nm. No entanto,
quando luciferase foi agregada na presença de HspB1-3D ou HspB1-3D-GPG, as moléculas
formadas foram de 148 e 41 nm respectivamente, o que sugere que não houve prevenção
139
de agregação da luciferase, mas sim formação de co-agregados ainda bastante grandes se
comparados com o tamanho da luciferase nativa. A atividade de formação de co-agregados
com o substrato também já foi relatada recentemente para as sHsps diméricas de bactérias,
IbpA e IbpB, e de levedura, Hsp26 e Hsp42 (Ungelenk et al., 2016; Żwirowski et al., 2017).
Ainda sobre o ensaio de co-agregação com a luciferase, é interessante o fato de
que o mutante HspB1-3D-GPG é o mais eficiente nesse processo. Esse mutante foi o único
capaz de formar dímeros em solução, o que pode sugerir que a mudança de estado
oligomérico está relacionada com a ativação de HspB1, mas não é estritamente necessária
para que isso ocorra, visto que o mutante oligomérico HspB1-3D também se mostrou
funcional na co-agregação com luciferase. Esses resultados indicam que os processo de
fosforilação e dissociação podem estar ocorrendo em mecanismos complexos para
regulação funcional de HspB1. Reitera-se, no entanto, que a fosforilação dessa proteína não
está estimulando necessariamente a dimerização para regular sua ativação funcional, como
discutido na literatura (Rogalla et al., 1999; Mymrikov et al., 2017; Mogk e Bukau, 2017).
Uma vez estabelecida a função de co-agregação de HspB1 fosforilada, estas
proteínas foram usadas em ensaios para investigar a atividade de desagregação da
maquinaria da Hsp70. Os resultados revelaram que a ausência de HspB1 ou a presença de
HspB1-WT não foi suficiente para criar agregados de luciferase que as chaperonas pudessem
ressolubilizar e reenovelar no estado nativo, condizendo com o que foi observado por DLS.
Contudo, os mutantes de fosforilação parecem desempenhar um papel importante no
processo de desagregação, ao gerar agregados com a luciferase que fossem susceptíveis à
reativação pelas chaperonas. HspB1-3D-GPG foi um pouco mais eficiente do que HspB1-3D
na reativação da luciferase (35 e 25 %, respectivamente), quando utilizadas durante choque
térmico na proporção 1:10 com o substrato.
Com relação às chaperonas requeridas para formar o sistema de desagregação,
verificamos que a reativação do substrato agregado foi a maior quando as chaperonas
presentes na reação foram Hsp70, DJA2, DJB1 e Hsp110. Diferentemente do que foi
observado no ensaio de reenovelamento, no qual luciferase desenovelada foi
completamente reenovelada apenas pela presença de Hsp70 e DJA2. Além de mais
chaperonas necessárias para a desagregação, o tempo de reação também chama a atenção.
O processo de desagregação parece ser um processo mais complexo e demorado, levando
140
pelo menos 120 min para acontecer, ao passo que o reenovelamento de quase 100% da
luciferase ocorreu em 30 a 60 min.
Em nossos experimentos, Hsp70 foi confirmada como a principal chaperona
funcional do sistema de desagregação, visto que na sua ausência a atividade de luciferase
não é reativada. Duas proteínas da família Hsp70 foram testadas: Hsp70 (HSPA1A), que tem
sua expressão aumentada durante condições de estresse celular, e Hsc70 (HSPA8) que é
expressa constitutivamente (Gething e Sambrook, 1992). Além do padrão de expressão,
essas proteínas apresentam funções biológicas e mecanismos de regulação diferentes (Seo
et al., 2016). Não foram observadas diferenças significativas na função de reenovelamento
de luciferase por Hsp70 e Hsc70, porém a reativação de agregados foi mais eficiente quando
mediada por Hsp70. Isso pode ser reflexo do (re)enovelamento de polipeptídeos ser um
processo que deve acontecer em todas as células em diversas situações, tanto em condições
de metabolismo normal quanto em condições de estresse. Dessa forma, é compreensível
que ambas Hsp70 e Hsc70 sejam capazes de realizá-lo eficientemente. No entanto, a
formação de agregados ocorre mais comumente sob condições estressantes, o que poderia
explicar porque Hsp70 tem melhor atividade de desagregação que Hsc70.
A presença concomitante de duas Hsp40 de classes diferentes (classes A e B) foi
a melhor combinação para desagregação, corroborando trabalhos anteriores que mostraram
que DJA2 e DJB1 possuem funções complementares em diferentes tamanhos de agregados.
Os resultados de seus experimentos in vitro mostram que na presença de baixas
concentrações de DJB1 e excesso de DJA2 não há ressolubilização de agregados de luciferase
muito grandes, enquanto que agregados menores foram solubilizados completamente. Em
contraste, em baixas concentrações de DJA2 e excesso de DJB1, não foi observada a
solubilização de agregados pequenos (Nillegoda et al., 2015). Esses resultados sugerem que
as proteínas Hsp40 das classes A e B operam em diferentes tamanhos de substratos e sua
presença concomitante é a melhor condição para solubilizar todos os tamanhos de
agregados. O mesmo grupo também demonstrou que as proteínas Hsp40 são capazes de
agir dessa maneira porque formam heterocomplexos que modulam a função de Hsp70
(Nillegoda et al., 2015; Nillegoda et al., 2018).
A titulação de DJA2 e DJB1 nos ensaios de desagregação seguidos de
reenovelamento revelou que a razão 2:1 foi a condição ótima para reativar luciferase. Esses
141
resultados podem sugerir outra diferença de função de DJA2 e DJB1 além da atuação em
diferentes tamanhos de agregados. Isso porque observamos que nos ensaios de
reenovelamento Hsp70 e DJA2 são suficientes para reenovelar a luciferase, ao passo que a
presença de DJB1 inibe essa atividade. Já na desagregação seguida de reenovelamento
ambas DJA2 e DJB1 são necessárias, mas com DJA2 em maior concentração (razão 2:1). Isso
pode indicar que DJA2 está envolvida nos processos, de desagregação e reenovelamento, ao
passo que DJB1 é importante apenas para desagregação.
Além disso, não conseguimos observar a atuação de DJA2 e DJB1 em diferentes
tamanhos de agregados, porque a co-agregação com os oligômeros de HspB1 não gerou
agregados pequenos. Em todos nossos experimentos, os agregados foram maiores que 40
nm e foram eluídos no volume morto da coluna. Essa diferença provavelmente foi causada
porque nos experimentos de Nillegoda e colaboradores foi utilizada Hsp26 que é dimérica e
deve ter possibilitado a formação de agregados menores e maiores, ao passo que a co-
agregação com HspB1 gerou apenas agregados grandes.
A co-chaperona Hsp110 foi outro requisito fundamental para que a
desagregação fosse bem-sucedida, diferindo novamente do reenovelamento que requer
apenas Hsp70 e DJA2. Para desagregação seguida de reenovelamento, a reativação máxima
na ausência de Hsp110 foi de apenas 7%, o que corrobora outros estudos de desagregação
mostrando que Hsp110 é necessária para a solubilização de agregados de proteínas in vitro
(Rampelt et al., 2012). Nesses estudos a desagregação de substrato só foi possível com a
atividade de NEF de Hsp110 e seus ortólogos, sendo que NEFs como Bag1 não foram capazes
de auxiliar nesse processo, o que indicaria que Hsp110 poderia ter uma atividade maior na
desagregação de substrato além de trocar nucleotídeo para Hsp70 (Rampelt et al., 2012).
No entanto, em nossos experimentos verificamos que a reativação do substrato
foi sim mais eficaz com Hsp110 (27%), mas também ocorreu na presença de Bag1 (15%).
Neste caso, luciferase foi co-agregada com HspB1-3D e as chaperonas Hsp70, DJA2 e DJB1
estavam presentes na reação. Pode haver uma relação entre as proteínas DnaJ e os
diferentes NEFs usados para desagregação. Como dito, experimentos comparando a
atividade de Hsp110 e Bag1 na presença de Hsc70, mostraram que Bag1 não auxiliou a
solubilização de agregados de luciferase ou malato desidrogenase (MDH) formados com
Hsp26 quando DJB1 foi usada, mas teve um efeito parcial para desagregar luciferase se DJA2
142
estava presente (Rampelt et al., 2012). Em nossos experimentos nos quais os agregados
foram formados com HspB1-3D, Bag1 teve efeito tanto quando DJB1 quanto DJA2 estavam
nas reações. O domínio C-Bag1 que compreende a parte C-terminal de Bag1, incluindo
apenas o domínio Bag, responsável pela ligação ao NBD da Hsp70 e pela troca de
nucleotídeos no ciclo ATP/ADP também foi testado no ensaio de desagregação. C-Bag1 foi
menos eficiente (20%) do que Hsp110 (25%) na desagregação e reativação da luciferase,
porém mais eficiente do que Bag1 completa (15%), sugerindo que não há especificade das
Hsp110 para desagregação e que a atividade NEF dessas proteínas é a única função
necessária para que o processo aconteça.
A função de HspB1-3D-GPG na desagregação foi inicialmente testada usando um
mix de oligômeros e dímeros em solução. Contudo, os estados oligoméricos isolados co-
agregados com luciferase no ensaio de desagregação mostraram resultados interessantes.
Diferentemente do observado na literatura, de que os dímeros compreendem a forma ativa
de HspB1, foram os oligômeros de HspB1-3D-GPG os mais eficazes no auxilio às chaperonas
para solubilização de agregados. Isso sugere que a capacidade de dissociação em dímeros de
HspB1 é importante para auxiliar a desagregação do substrato, não os dímeros em si.
Para aprofundar o entendimento do mecanismo de atuação de HspB1 na
formação de agregados e também para desenvolver um método para detecção direta da
desagregação de luciferase, independente do reenovelamento, o ensaio de desagregação foi
adaptado e acoplado com uma filtração em gel analítica. Através deste método, verificou-se
que o choque térmico da luciferase na ausência ou presença de HspB1 a 45 °C gerou sempre
agregados grandes, eluídos no início da reação no volume morto. Esta confirmação é muito
importante porque elimina a possibilidade de que uma pequena parte da luciferase
permanece monomérica e desenovelada após o choque térmico, o que implicaria que sua
reativação estivesse sendo causada unicamente pela atividade de reenovelamento das
chaperonas.
Os resultados obtidos a partir deste ensaio também corroboram os dados
obtidos pelo ensaio de desagregação seguido de reenovelamento, pois confirma a
importância da presença de HspB1-3D e HspB1-3D-GPG na co-agregação com substrato.
Nesse sentido, observou-se que os agregados formados com HspB1-WT foram pouco
desagregados, enquanto que com HspB1-3D e HspB1-3D-GPG a desagregação foi mais
143
eficiente, auxiliando as chaperonas a tornar grandes agregados em monômeros de luciferase
(~62 kDa). Na ausência do sistema da Hsp70 não houve desagregação de luciferase.
Além disso, observou-se que, após 3 h da reação na presença de chaperonas,
houve estimulação de mudança no estado oligomérico de HspB1-3D-GPG e,
interessantemente, também de HspB1-3D. Em todas as condições, isso não foi observado
para HspB1-WT. Para o mutante HspB1-3D, foi dectectado deslocamento da eluição de uma
pequena parte das moléculas, de forma que a maior parte das moléculas ainda foi eluída
principalmente como oligômero, mas uma pequena porcentagem foi eluída dissociada em
dímeros. Essa dissociação, foi observada para HspB1-3D apenas nas reações onde as
chaperonas moleculares estavam presente e foi independente da presença ou não de
luciferase (substrato da reação). Se a maquinaria da Hsp70 não estava na reação, mas o
substrato foi adicionado, essa dissociação não foi observada. Em contraste, quando as
reações foram realizadas na ausência de luciferase e na presença do sistema da Hsp70, a
dímeros de HspB1 foram detectados, sugerindo que a interação de HspB1 com outras
chaperonas é uma exigência para que os mutantes de fosforilação de HspB1 se dissociem em
dímeros. De maneira semelhante, a dissociação em dímeros de HspB1-3D-GPG, que já era
observada mesmo no início das reações, foi estimulada após 3 h de reação na presença das
chaperonas, sendo eluído principalmente como dímero e apenas uma pequena parte
permaneceu no estado de oligômero. Dessa forma, esses resultados sugerem que a
presença de chaperonas não foi importante apenas para a solubilização da luciferase, mas
também para estimular a dissociação de HspB1 ativa.
Considerando todos nossos resultados em conjunto, eles suportam um modelo
de desagregação no qual polipeptídeos agregados durante estresse térmico co-agregam com
oligômeros de HspB1 ativados por fosforilação. Hsp70 e as co-chaperonas do sistema são
capazes de extrair peptídeos dos agregados e também promover a dissociação de HspB1 em
dímeros, sendo que processo permite uma desagregação mais eficiente (Figura 39). A
ativação de HspB1 pela fosforilação é importante para desestabilizar oligômeros, mas não
para a formação imediata de dímeros, a qual é estimulada durante o processo de
desagregação pelo sistema da Hsp70. Os dímeros de HspB1 se reorganizam
espontaneamente em oligômeros, permitindo o recomeço do ciclo para uma nova rodada de
desagregação, exceto para o mutante GPG onde a desestabilização foi forçada
144
artificialmente. Isso explicaria por que HspB1-3D é majoritariamente oligomérica após as
reações de desagregação e porque a atividade de desagregação de HspB1-3D é apenas
ligeiramente menor do que a de HspB1-3D-GPG, embora a quantidade final de dímeros
HspB1-3D seja muito menor.
Figura 39: Modelo de desagregação de substrato envolvendo HspB1 e a maquinaria da Hsp70 humana. Os resultados apresentados suportam um modelo de desagregação no qual polipeptídeos desenovelados co-agregam com oligômeros de HspB1 ativados por fosforilação. Hsp70 e as co-chaperonas do sistema são capazes de extrair o substrato dos agregados, mas também auxiliar a dissociação de HspB1 em dímeros. Após essa dissociação, os dímeros HspB1 se reorganizam espontaneamente em oligômeros, permitindo o recomeço do ciclo para uma nova rodada de desagregação.
Estudos recentes envolvendo as sHsps diméricas de E. coli (IbpA e IbpB) sugerem
que os dímeros são extraídos dos agregados durante a solubilização. Os agregados formados
na presença de IbpA/B foram mais facilmente solubilizados pela DnaK (Hsp70 bacteriana) e
pelo chaperona ClpB (da família Hsp100), do que na sua ausência. Além disso, DnaK teve um
papel específico de ligar em IbpA/B e liberá-las dos agregados, como um primeiro passo da
reação de desagregação (Żwirowski et al., 2017). No entanto, IbpA/B são constitutivamente
dímeros e não podem formar oligômeros como HspB1 e outras sHsps humanas sHSPs, dessa
forma, é provável que IbpA/B permaneçam como dímeros nos agregados e promovam a
desagregação alterando a disposição dos polipeptídeos do substrato. No nosso modelo o
mecanismo de funcionamento de HspB1 deve ser diferente porque os dímeros HspB1 co-
145
agregados com o substrato se mostraram inativos na desagregação, sugerindo que a co-
agregação com oligômeros é um passo necessário. Essa hipótese é nova e contraria o
pensamento mais aceito atualmente de que a conversão de oligômeros de sHsps em
espécies menores é parte do seu mecanismo de ativação, suportado principalmente por
experimentos de prevenção de agregação com HspB1-WT e HspB1-3D (Rogalla et al., 1999;
Jovcevski et al., 2015). Contudo, a diferença de função de desagregação entre dímeros e
oligômeros é marcante e não esta relacionada com a capacidade de ligar substrato. A
principal função de dissociação do oligômero de Hspb1 pode, portanto, ser a solubilização de
agregados, em vez da ativação de ligação ao substrato.
Em células humanas, grandes agregados podem ser eliminados por autofagia,
sem serem necessariamente dissociados em peptídeos individuais (Gamerdinger et al., 2009;
Arndt et at., 2010). A importância da solubilização de agregados ainda precisa ser
determinada, mas pode haver vantagens desse processo em comparação com autofagia. A
desagregação parece ser um processo mais rápido e, se os substratos não forem
reenovelados, a degradação pelo sistema proteosomo também é relativamente rápido.
Solubilização seguida por degradação pode então ser um modo mais eficiente de utilização
dos recursos celulares.
146
2.6. Conclusões
- A sequencia que codifica a proteína HspB1 foi clonada em vetor de expressão,
expressa e purificada com rendimento de ~30 mg/L de indução e em alto grau de pureza (>
95%) após uma etapa de purificação. Também foram obtidos mutantes funcionais que
mimetizam a fosforilação de resíduos específicos de serina (HspB1-1D, 2D e 3D) e um
mutante que induz a dissociação dos oligômeros. Esses mutantes foram construídos,
expressos e purificados usando o mesmo protocolo estabelecido para a proteína selvagem.
- A proteína HspB1-WT e o mutante HspB1-3D foram purificados como
oligômeros em solução. A maior parte de HspB1-3D-GPG também estava no estado
oligomérico, mas cerca de 20% das moléculas foram eluidas como dímeros.
- As proteínas obtidas foram purificadas enoveladas com composição de
estrutura secundária rica em folhas-β (~40%). Os dímeros obtidos pelo mutante HspB1-3D-
GPG também mostraram contribuição de estruturas desordenadas. Uma vez que a
oligomerização ocorre pela região C-terminal (motivo IPV), podemos especular que no
oligômero essa região permanece estruturada, não sendo detectada nos espectros de CD de
HspB1-WT, HspB1-3D ou os oligômeros de HspB1-3D-GPG.
- Tanto a proteína selvagem como os mutantes funcionais apresentaram
estabilidade térmica semelhante. A estrutura secundária não foi perdida até 65 °C; em
temperaturas superiores as proteínas adquirem estrutura desordenada, mas não agregam e
nem precipitam.
- Os mutantes de fosforilação de HspB1 confirmaram que esse tipo de
modificação é essencial para ativação da proteína, tornando-a capaz de interagir com o
substrato e formar agregados proteicos capazes de serem ressolubilizados pelo sistema da
Hsp70. HspB1-2D e HspB1-3D foram eficientes nessa co-agregação, formando co-agregados
de menor tamanho se comparados com aqueles formados na presença de HspB1-WT ou na
ausência de sHsps.
- A co-agregação do substrato com uma HspB1 ativada é essencial para que a
maquinaria da Hsp70 tenha acesso aos agregados e possa realizar a atividade de
desagregação.
- A maquinaria de desagregação é mais eficiente quando composta pela proteína
central Hsp70, um NEF e as co-chaperonas Hsp40. Quando estavam presentes DJA2 (classe
147
A) e DJB1 (classe B), a reativação do substrato foi mais eficiente. Hsp70 se mostrou mais
eficiente que Hsc70 e Hsp110 foi mais eficaz que Bag1 ou C-Bag1.
- Apesar de menos eficientes, Bag1 e C-Bag1 foram capazes de atuar na
maquinaria de desagregação de substrato, indicando que a atividade de troca de
nucleotídeo parace ser a única função dessa co-chaperonas no sistema.
- A mutação no motivo IPV torna HspB1 mais eficiente e promove a
desestabilização do oligômero, dissociando mais facilmente a proteína em dímeros. Tanto a
co-agregação quanto a desagregação foram mais eficientes com o mutante HspB1-3D-GPG.
- A presença de chaperonas não foi importante apenas para a solubilização da
luciferase, mas também para estimular a dissociação de HspB1 fosforilada.
- No modelo proposto, sugerimos que a etapa de co-agregação de polipeptídeos
agregados durante estresse térmico com HspB1 ativada por fosforilação é essencial para
garantir acesso do sistema da Hsp70. Hsp70 e as co-chaperonas do sistema são capazes de
extrair peptídeos dos agregados e também promover a dissociação de HspB1 em dímeros,
sendo que processo permite uma desagregação mais eficiente. Os dímeros de normalmente
HspB1 se reorganizam espontaneamente em oligômeros, permitindo o recomeço do ciclo
para uma nova rodada de desagregação.
148
Considerações finais
A regulação da homeostase celular realizada pelo sistema de controle de
qualidade proteico é muito complexa e depende da ação de múltiplos processos
orquestrados tanto pelas chaperonas moleculares quando pelo sistema ubiquitina-
proteosomo. Em condições metabólicas normais, mas principalmente em situações de
estresse celular, é extremamente importante que todos esses processos ocorram
eficientemente, evitando o acúmulo de proteínas não funcionais que podem gerar graves
consequências para as células. Sendo assim, o estudo estrutural e funcional das proteínas
que compõem o sistema PQC torna-se bastante relevante por produzir conhecimento com
alto potencial de gerar inovações terapêuticas e biotecnológicas, seja no entendimento de
doenças neurodegenerativas e câncer ou na produção de espécies vegetais mais tolerantes a
diferentes tipos de estresses abióticos.
Neste trabalho, conduzimos nossos estudos para a compreensão de duas
proteínas muito importantes, cujas funções estão diretamente relacionadas com o
direcionamento do destino de substratos proteicos. No capítulo 1, o objeto de investigação
foi a co-chaperona CHIP de Sorghum bicolor (SbCHIP). Primeiramente, sua sequência gênica
foi identificada através da homologia com o ortólogo de Arabidopsis, clonada e utilizada
para superexpressar a proteína em E. coli. Um protocolo de purificação foi estabelecido, o
que possibilitou a determinação de parâmetros conformacionais para SbCHIP. Nossos
resultados indicam que essa co-chaperona é um dímero alongado em solução, com estrutura
rica em hélices-α e relativamente bem estável em situações de estresse térmico. Além disso,
observamos a formação de complexos entre ela e outra chaperona essencial, a Hsc70, e
caracterizamos sua atividade de auto-ubiquitinação e de ubiquitinação de outros substratos
proteicos. Desse modo, acreditamos que nossos resultados contribuem para o melhor
entendimento da regulação da homeostase proteica em plantas, através do maior
conhecimento da relação entre estrutura e função de CHIP a fim de mediar o enovelamento
e a degradação de proteínas.
Apesar do avanço obtido até aqui, outras questões ainda precisam ser
esclarecidas. Dessa forma, ainda estamos trabalhando no tratamento dos dados de SAXS
para a obtenção de uma estrutura em baixa resolução. Além disso, temos experimentos em
andamento para obtenção de cristais de SbCHIP a fim de podermos determinar sua
149
estrutura tridimensional por difração de raios X (Anexos – Figura A1). Em relação à interação
de SbCHIP com chaperonas moleculares, é importante caracterizar a formação de complexo
também com a chaperona Hsp90, visto que é uma das principais parceiras de CHIP para
regulação da ubiquitinação de substratos. Alguns indícios dessa interação já foram obtidos
por ITC (dados não apresentados), mas a característica dinâmica e transiente da interação
dificulta a reprodutibilidade desta técnica. Também é interessante o estudo de Hsp90 como
substrato de ubiquitinação de SbCHIP, como sugerido em alguns trabalhos com proteínas
humanas. Ainda nesse sentido, é pertinente realizar experimentos de screening com outras
enzimas E2 com as quais SbCHIP pode interagir e ubiquitinar substratos, determinando
assim o espectro de funcionalidade de SbCHIP em relação à proteina homóloga humana.
No capítulo 2, o alvo de investigação foi o papel da sHsp HspB1 no sistema
humano de desagregação de proteínas. O estudo da desagregação em metazoários é um
tópico atual de grande interesse terapêutico e que permanece como principal alvo de
pesquisa dos maiores grupos mundiais focados no estudo das chaperonas moleculares.
Devido à sua complexidade, envolvendo um complexo com múltiplas chaperonas, esse
processo só foi identificado recentemente e este trabalho é o pioneiro na caracterização do
envolvimento de uma sHsp. Com nossos resultados, sugerimos um modelo de desagregação
no qual HspB1 ativada por fosforilação é responsável por co-agregar com polipeptídeos
desenovelados durante estresse térmico. Quando isso ocorre, o sistema da Hsp70, formado
por Hsp70, Hsp40 e Hsp110, é capaz de extrair peptídeos dos agregados e também
promover a dissociação de HspB1 em dímeros, sendo que esse processo permite uma
desagregação mais eficiente. Dessa forma, a fosforilação de HspB1 é importante para
ativação da proteína, desestabilização dos oligômeros, mas não para a formação imediata de
dímeros, a qual ocorre durante o processo por estimulação das chaperonas. Os dímeros de
HspB1 se reorganizam espontaneamente em oligômeros permitindo o recomeço do ciclo
para uma nova rodada de desagregação, exceto para o mutante GPG onde a
desestabilização foi forçada artificialmente. Entendemos que nossos resultados são bastante
relevantes e contribuem para a compreensão do mecanismo de solubilização de agregados
em células humanas e por isso estamos trabalhando em um manuscrito para publicação
desses dados.
150
Apesar da nossa contribuição, ainda existem aspectos do mecanismo de
desagregação que precisam ser esclarecidos. Neste trabalho a luciferase foi utilizada como
proteína cliente modelo, devido à facilidade experimental de medir sua atividade e,
portanto, de detectar seu reenovelamento e desagregação. Seria interessante, no entanto,
testar outros substratos, especialmente proteínas humanas, a fim de ampliar o espectro de
atuação de sistema no ambiente celular.
Além disso, a HspB1 foi a primeira sHsp humana com papel descrito neste tipo
de complexo. Sabemos que há pelo menos outras 9 proteínas dessa família que são
expressas nas células e que também podem contribuir neste processo para manutenção da
proteostase. É particularmente intrigante investigar o papel de mais de uma sHsp ao mesmo
tempo na desagregação, uma vez que já foi relatada a existência de heterocomplexos dessas
chaperonas, que podem ter sua eficiência ainda mais realçada em condições de estresse
celular. Mecanismos mais específicos, como por exemplo, de reconhecimento de substratos
pelas sHsps ou mesmo de entrega desses substratos para Hsp40 e o sistema Hsp70 também
permanecem desconhecidos e precisam ser investigados para ampliar o conhecimento sobre
esse processo tão importante nas células de diversos organismos.
151
Referências bibliográficas
Aldea M, Garí E, Colomina N. 2007. Control of cell cycle and cell growth by molecular chaperones.
Cell Cycle. 6(21):2599-603.
Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. 1990. Basic local alignment search tool. Journal
Molecular Biology. 215:403-410.
Anfinsen CB. 1973. Principles that govern the folding of protein chains. Science. 181:223–230.
Aravind L e Koonin EV. 2000. The U-box is a modified RING finger - a common domain in
ubiquitination. Curr Biol. 10(4):R132-4.
Arbach H, Butler C, McMenimen KA. 2017. Chaperone activity of human small heat shock protein-
GST fusion proteins. Cell Stress Chaperones. 22(4):503-515.
Arndt V, Dick N, Tawo R, Dreiseidler M, Wenzel D, Hesse M, Furst DO, Saftig P, Saint R, Fleischmann
BK, Hoch M, Hohfeld J. 2010. Chaperone-assisted selective autophagy is essential for muscle
maintenance. Curr Biol. 20:143-148.
Arrigo AP. 2011. Structure-functions of HspB1 (Hsp27). Methods Mol Biol. 787:105-19.
Axelsson I. 1978. Characterization of proteins and other macromolecules by agarose gel
chromatography. J. Chromatogr. A. 152(1):21-32.
Baaklini I, Wong MJ, Hantouche C, Patel Y, Shrier A, Young JC. 2012. The DNAJA2 substrate release
mechanism is essential for chaperone-mediated folding. J Biol Chem. 287(50):41939-54.
Baldwin RL. 1995. The nature of protein-folding pathways – the classical versus the new view. J
Biomol NMR. 5:103–109.
Ballinger CA, Connell P, Wu Y, Hu Z, Thompson LJ, Yin LY, Patterson C. 1999. Identification of CHIP, a
novel tetratricopeptide repeat-containing protein that interacts with heat shock proteins and
negatively regulates chaperone functions. Mol Cell Biol. 19(6):4535-45.
Banachowicz E. 2006. Light scattering studies of proteins under compression. Biochim Biophys Acta.
1764(3):405-13.
Baranova EV, Beelen S, Gusev NB, Strelkov SV. 2009. The taming of small heat-shock proteins:
crystallization of the alpha-crystallin domain from human Hsp27. Acta Crystallogr Sect F Struct
Biol Cryst Commun. 65:1277-8.
Baranova EV, Weeks SD, Beelen S, Bukach OV, Gusev NB, Strelkov SV. 2011. Three-dimensional
structure of α-crystallin domain dimers of human small heat shock proteins HspB1 and HspB6.
J Mol Biol. 411(1):110-22.
Blatch GL e Lässle M. 1999. The tetratricopeptide repeat: a structural motif mediating protein-
protein interactions. Bioessays. 21(11):932-9.
152
Bloomfield VA. 1981. Quasi-elastic light scattering applications in biochemistry and biology. Annu Rev
Biophys Bioeng. 10:421-50.
Borges JC e Ramos CH. 2005. Protein folding assisted by chaperones. Protein Pept Lett. 12(3):257–
261.
Borges JC, Fischer H, Craievich AF, Ramos CH. 2005. Low resolution structural study of two human
Hsp40 chaperones in solution. DJA1 from subfamily A and DJB4 from subfamily B have
different quaternary structures. J Biol Chem. 280(14):13671-81.
Boshoff A. 2015. Chaperonin-co-chaperonin interactions. Subcell Biochem. 78:153–178.
Bracher A e Verghese J. 2015. GrpE, Hsp110/Grp170, HspBP1/Sil1 and BAG domain proteins:
nucleotide exchange factors for Hsp70 molecular chaperones. Subcell Biochem. 78:1–33.
Breiman A. 2014. Plant Hsp90 and its co-chaperones. Curr Protein Pept Sci. 15(3):232-44.
Bruylants G, Wouters J, Michaux C. 2005. Differential scanning calorimetry in life science:
thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med
Chem. 12(17):2011-20.
Buchner J, Ehrnsperger M, Gaestel M, Walke S. 1998. Purification ans characterization of small heat
shock proteins. Methods Enzymol. 290:339-49.
Buchner J. 1999. Hsp90 and co. – a holding for folding. Trends Biochem Sci. 24:136–141.
Bukau B e Horwich AL. 1998. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell. 92:351-366.
Cagliari TC, da Silva VC, Borges JC, Prando A, Tasic L, Ramos CH. 2011. Sugarcane Hsp101 is a
hexameric chaperone that binds nucleotides. Int J Biol Macromol. 49(5):1022-30.
Carra S, Alberti S, Arrigo PA, Benesch JL, Benjamin IJ, Boelens W, Bartelt-Kirbach B, Brundel BJJM,
Buchner J, Bukau B, Carver JA, Ecroyd H, Emanuelsson C, Finet S, Golenhofen N, Goloubinoff P,
Gusev N, Haslbeck M, Hightower LE, Kampinga HH, Klevit RE, Liberek K, Mchaourab HS,
McMenimen KA, Poletti A, Quinlan R, Strelkov SV, Toth ME, Vierling E, Tanguay RM. 2017.
The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress
Chaperones. 22(4):601-611.
Cashikar AG, Duennwald M, Lindquist SL. 2005. A chaperone pathway in protein disaggregation.
Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J Biol Chem.
280(25):23869-75.
Connell P, Ballinger CA, Jiang J, Wu Y, Thompson LJ, Höhfeld J, Patterson C. 2001. The co-chaperone
CHIP regulates protein triage decisions mediated by heat-shock proteins. Nat Cell Biol. 3(1):93-
6.
Copeland C, Ao K, Huang Y, Tong M, Li X. 2016. The evolutionarily conserved E3 ubiquitin ligase
AtCHIP contributes to plant immunity. Front Plant Sci. 7:309.
153
Corrêa DH e Ramos CHI. 2009. The use of circular dichroism spectroscopy to study protein folding,
form and function. Afr J Biochem Res. 3:164-173.
Cyr DM e Ramos CH. 2015. Specification of Hsp70 function by type I and type II Hsp40. Subcell
Biochem. 78:91–102.
Delbecq SP, Jehle S, Klevit R. 2012. Binding determinants of the small heat shock protein, αB-
crystallin: recognition of the 'IxI' motif. EMBO J. 31(24):4587-94.
Desantis ME e Shorter J. 2012. The elusive middle domain of Hsp104 and ClpB: location and function.
Biochim Biophys Acta. 1823:29-39.
Dillon SL, Shapter FM, Henry RJ, Cordeiro G, Izquierdo L, Lee LS. 2007. Domestication to crop
improvement: genetic resources for Sorghum and Saccharum (Andropogoneae). Ann Bot.
100(5):975-89.
Dosztányi Z, Csizmok V, Tompa P, Simon I. 2005. IUPred: web server for the prediction of intrinsically
unstructured regions of proteins based on estimated energy content. Bioinformatics.
21(16):3433-4.
Duennwald ML, Echeverria A, Shorter J. 2012. Small heat shock proteins potentiate amyloid
dissolution by protein disaggregases from yeast and humans. PLoS Biol. 10(6):e1001346.
Edelhoch H. 1967. Spectroscopic Determination of tryptophan and tyrosine in proteins. Biochemistry.
6:1948-54.
Edkins AL. 2015. CHIP: a co-chaperone for degradation by the proteasome. Subcell Biochem. 78:219-
42.
Edward JT. 1970. Molecular volumes and the Stokes-Einstein equation. J Chem Educ. 47:261-270.
Esser C, Alberti S, Höhfeld J. 2004. Cooperation of molecular chaperones with the
ubiquitina/proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1695(1-3):171-88.
Ferreira ST e De Felice FG. 2001. Protein dynamics, folding and misfolding: from basic physical
chemistry to human conformational diseases. FEBS Lett 498:129–134.
Franke D, Petoukhov MV, Konarev PV, Panjkovich A, Tuukkanen A, Mertens HDT, Kikhney AG,
Hajizadeh NR, Franklin JM, Jeffries CM, Svergun DI. 2017. ATSAS 2.8: a comprehensive data
analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. J Appl Crystallogr.
50:1212-1225.
Gamerdinger M, Hajieva P, Kaya AM, Wolfrum U, Hartl FU, Behl C. 2009. Protein quality control
during aging involves recruitment of the macroautophagy pathway by BAG3. EMBO J. 28:889-
901.
154
Gao X, Carroni M, Nussbaum-Krammer C, Mogk A, Nillegoda NB, Szlachcic A, Guilbride DL, Saibil
HR, Mayer MP, Bukau B. 2015. Human Hsp70 disaggregase reverses Parkinson's-linked α-
synuclein amyloid fibrils. Mol Cell. 59(5):781-93.
Garrido C, Paul C, Seigneuric R, Kampinga HH. 2012. The small heat shock proteins family: the long
forgotten chaperones. Int J Biochem Cell Biol. 44:1588–1592.
Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, Duvaud S, Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A. 2005. Protein
Identification and analysis tools on the ExPASy Server. (In) John M Walker (ed): The Proteomics
Protocols Handbook. Human Press. 571-607.
Gething MJ e Sambrook J. 1992. Protein folding in the cell. Nature. 355:33–45.
Ghai R, Falconer RJ, Collins BM. 2013. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and
applied research--survey of the literature from 2010. J Mol Recognit. 25(1):32-52.
Glatter O e Kratky O. 1982. Porod G. In: Small Angle X-Ray Scattering. London: Academic Press. 17–
52.
Glover JR e Lindquist S. 1998. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues
previously aggregated proteins. Cell. 94:73–82.
Goeckeler JL, Petruso AP, Aguirre J, Clement CC, Chiosis G, Brodsky JL. 2008. The yeast Hsp110,
Sse1p, exhibits high-affinity peptide binding. FEBS Lett. 582(16):2393-6.
Goloubinoff P. 2014. Recent and future grand challenges in protein folding, misfolding, and
degradation. Front Mol Biosci. 1:1.
Gonçalves CC e Ramos CHI. 2016. Molecular Chaperones and HSPs in Sugarcane and Eucalyptus.
In: Asea A, Kaur P, Calderwood S. Heat Shock Proteins and Plants. Heat Shock Proteins.
Springer. 10:245-282.
Goujon M, McWilliam H, Li W, Valentin F, Squizzato S, Paern J, Lopez R. 2010. A new bioinformatics
analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Res. 38:695-699.
Greenfield NJ. 2006. Using dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nat Protoc.
1:2876-2890.
Guinier A, 1939. La diffraction des rayons X aux très petits angles; application a l’etude de
phenomenes ultramicroscopiques. Ann Phys. 12:161–237.
Gupta R, Kasturi P, Bracher A, Loew C, Zheng M, Villella A, Garza D, Hartl FU, Raychaudhuri S. 2011.
Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8(10):879-84.
Hamblin MT, Salas Fernandez MG, Casa AM, Mitchell SE, Paterson AH, Kresovich S. 2005. Equilibrium
processes cannot explain high levels of short- and medium-range linkage disequilibrium in the
domesticated grass Sorghum bicolor. Genetics. 171(3):1247-56.
155
Harold P Erickson HP. 2009. Size and shape of protein molecules at the nanometer level determined
by sedimentation, gel filtration and electron microscopy. Biol Proced Online. 11:32-51.
Hartl FU e Hayer-Hartl M. 2002. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded
protein. Science 295:1852–1858.
Hartl FU, Bracher A, Hayer-Hartl M. 2011. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.
Nature. 475:324–332.
Hartl FU, Martin J, Neupert W. 1992. Protein folding in the cell: the role of molecular chaperones
Hsp70 and Hsp60. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 21:293–322.
Haslbeck M e Vierling E. 2015. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their
function in protein homeostasis. J Mol Biol. 427(7):1537-48.
Haslbeck M, Walke S, Stromer T, Ehrnsperger M, White HE, Chen S, Saibil HR, Buchner J. 1999. Hsp26:
a temperature-regulated chaperone. EMBO J. 18:6744–6751.
Hayes D, Napoli V, Mazurkie A, Stafford WF, Graceffa P. 2009. Phosphorylation dependence of Hsp27
multimeric size and molecular chaperone function. J Biol Chem. 284(28):18801-7.
Heirbaut M, Lermyte F, Martin EM, Beelen S, Verschueren T, Sobott F, Strelkov SV, Weeks SD. 2016.
The preferential heterodimerization of human small heat shock proteins HspB1 and HspB6 is
dictated by the N-terminal domain. Arch Biochem Biophys. 610:41-50.
Hendrick JP e Hartl FU. 1993. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu Rev
Biochem. 62:49–384.
Hershko A, Ciechanover A. 1998. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67:425-79.
Hodson S, Marshall JJ, Burston SG. 2012. Mapping the road to recovery: the ClpB/Hsp104 molecular
chaperone. J Struct Biol. 179:161-171.
Jachimska B, Wasilewska M, Adamczyk Z. 2008. Characterization of globular protein solutions by
dynamic light scattering, electrophoretic mobility and viscosity measurements. Langmuir.
24(13):6866-72.
Jiang J, Ballinger CA, Wu Y, Dai Q, Cyr DM, Höhfeld J, Patterson C. 2001. CHIP is a U-box-dependent
E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. J Biol Chem.
276(46):42938-44.
Johnson CM. 2013. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Arch
Biochem Biophys. 531(1-2):100-9.
Johnson ES, Bartel B, Seufert W, Varshavsky A. 1992. Ubiquitin as a degradation signal. EMBO J.
11(2): 497–505.
156
Jovcevski B, Kelly MA, Rote AP, Berg T, Gastall HY, Benesch JL, Aquilina JA, Ecroyd H. 2015.
Phosphomimic destabilize Hsp27 oligomeric assemblies and enhance chaperone activity. Chem
Biol. 22(2):186-95.
Kakkar VV, Prins LC, Kampinga HH. 2012. DNAJ proteins and protein aggregation diseases. Curr Top
Med Chem. 12:2479–2490.
Kampinga H H. 1993. Thermotolerance in mammalian cells. Protein denaturation and aggregation,
and stress proteins. J Cell Sci. 104(1):11–17.
Kampinga HH e Craig EA. 2010. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional
specificity. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010. 11(8):579-92.
Kikhney AG e Svergun DI. 2015. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and
intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589:2570-7.
Koegl M, Hoppe T, Schlenker S, Ulrich HD, Mayer TU, Jentsch S. 1999. A novel ubiquitin factor, E4, is
involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96(5):635-44.
Kumar S, Stecher G, Tamura K. 2016. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for
bigger datasets. Mol Biol Evol. 33(7):1870-4.
Kundrat L e Regan L. 2010a. Identification of residues on Hsp70 and Hsp90 ubiquitinated by the
cochaperone CHIP. J Mol Biol. 395:587–594.
Kundrat L e Regan L. 2010b. Balance between folding and degradation for Hsp90-dependent client
proteins: a key role for CHIP. Biochemistry. 49(35):7428-38.
Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4.
Nature. 277:680-685.
Lakowicz JR. 2006. Principles of fluorescence spectroscopy. 10.1007/978-0-387-46312-4.
Lee S, Lee DW, Lee Y, Mayer U, Stierhof YD, Lee S, Jürgens G, Hwang I. 2009. Heat shock protein
cognate 70-4 and an E3 ubiquitin ligase, CHIP, mediate plastid-destined precursor degradation
through the ubiquitin-26S proteasome system in Arabidopsis. Plant Cell. 21(12):3984-4001.
Levitt M e Warshel A. 1975. Computer simulation of protein folding. Nature 253:694–698.
Lilienbaum A. 2013. Relationship between the proteasomal system and autophagy. Int J Biochem Mol
Biol. 4(1):1-26.
Lindquist S e Craig EA. 1988. The heat-shock proteins. Annu Rev Genet. 22:631-677.
Luheshi LM, Crowther DC, Dobson CM. 2008. Protein misfolding and disease: from the test tube to
the organism. Curr Opin Chem Biol. 12(1):25-31.
Mackay RG, Helsen CW, Tkach JM, Glover JR. 2008. The C-terminal extension of Saccharomyces
cerevisiae Hsp104 plays a role in oligomer assembly. Biochemistry. 47:1918-1927.
Marzzoco A e Torres BB. 2011. Bioquímica Básica. 3ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan.
157
Mattoo RU, Sharma SK, Priya S, Finka A, Goloubinoff P. 2013. Hsp110 is a bona fide chaperone using
ATP to unfold stable misfolded polypeptides and reciprocally collaborate with Hsp70 to
solubilize protein aggregates. J Biol Chem. 288(29):21399-411.
Mayer MP e Kityk R. 2015. Insights into the molecular mechanism of allostery in Hsp70s. Front Mol
Biosci. 20:58.
Mayer MP. 2010. Gymnastics of molecular chaperones. Mol Cell. 39:321–331.
McDonald ET, Bortolus M, Koteiche HA, Mchaourab HS. 2012. Sequence, structure, and dynamic
determinants of Hsp27 (HspB1) equilibrium dissociation are encoded by the N-terminal
domain. Biochemistry. 51:1257-1268.
McDonough H e Patterson C. 2003. CHIP: a link between the chaperone and the proteasome
systems. Cell Stress Chaperones. 8(4):303-8.
Mertens HD e Svergun DI. 2010. Structural characterization of proteins and complexes using small-
angle X-ray solution scattering. J Struct Biol. 172(1):128-41.
Millan IC, Squillace AL, Gava LM, Ramos CH. 2013. The stability of the wild-type and deletion mutants
of human C-terminus Hsp70-interacting protein (CHIP). Protein Pept Lett. 20(5):524-9.
Mogk A e Bukau B. 2017. Role of sHsps in organizing cytosolic protein aggregation and
Disaggregation. Cell Stress Chaperones. 22(4):493-502.
Mogk A, Kummer E, Bukau B. 2015. Cooperation of Hsp70 and Hsp100 chaperone machines in
protein disaggregation. Front Mol Biosci. 19; 2:22.
Mokry DZ, Abrahao J, Ramos CH. 2015. Disaggregases, molecular chaperones that resolubilize protein
aggregates. An Acad Bras Cienc. 87:1273–1292.
Morriset JD, David JSK, Pownall HJ, Gotto AM. 1973. Interaction of an apolipoprotein (Apolp-Alanine)
with phosphatidylcholine. Biochemistry. 12:1290–1299.
Murata S, Minami Y, Minami M, Chiba T, Tanaka K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that
ubiquitylates unfolded protein. EMBO Rep. 2(12):1133-8.
Mymrikov EV, Daake M, Richter B, Haslbeck M, Buchner J. 2017. The chaperone activity and
substrate spectrum of human small heat shock proteins. J Biol Chem. 292(2):672-684.
Myung J, Kim KB, Crews CM. 2001. The ubiquitin-proteasome pathway and proteasome inhibitors.
Med Res Rev. 21(4):245–273.
Nikolay R, Wiederkehr T, Rist W, Kramer G, Mayer MP, Bukau B. 2004. Dimerization of the human E3
ligase CHIP via a coiled-coil domain is essentiaç for its activity. J Biol Chem. 279(4):2673-8.
Nillegoda NB, Wentink AS, Bukau B. 2018. Protein disaggregation in multicellular organisms. Trends
Biochem Sci. S0968-0004(18)30024-0.
158
Nillegoda NB, Kirstein J, Szlachcic A, Berynskyy M, Stank A, Stengel F, Arnsburg K, Gao X, Scior
A, Aebersold R, Guilbride DL, Wade RC, Morimoto RI, Mayer MP, Bukau B. 2015. Crucial Hsp70
co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524(7564):247-51.
Nillegoda NB, Stank A, Malinverni D, Alberts N, Szlachcic A, Barducci A, De Los Rios P, Wade
RC, Bukau B. 2017. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in
eukaryotes. Elife. 6.
Oh HJ, Easton D, Murawski M, Kaneko Y, Subjeck JR. 1999. The chaperoning activity of Hsp110.
Identification of functional domains by use of target deletions. J Biol Chem. 274(22):15712-8.
Onuoha SC, Coulstock ET, Grossmann JG, Jackson SE. 2008. Structural studies on the co-chaperone
Hop and its complexes with Hsp90. J Mol Biol. 379(4):732-44.
Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T. 1995. How to measure and predict the molar absorption
coefficient of a protein. Protein Science. 4:2411-2423.
Pasta SY, Raman B, Ramakrishna T, Rao ChM. 2004. The IXI/V motif in the C-terminal extension of
alpha-crystallins: alternative interactions and oligomeric assemblies. Mol Vis. 10:655-62.
Paterson AH, Bowers JE, Bruggmann R, Dubchak I, Grimwood J, Gundlach H, Haberer G, Hellsten U,
Mitros T, Poliakov A, Schmutz J, Spannagl M, Tang H, Wang X, Wicker T, Bharti AK, Chapman J,
Feltus FA, Gowik U, Grigoriev IV, Lyons E, Maher CA, Martis M, Narechania A, Otillar RP,
Penning BW, Salamov AA, Wang Y, Zhang L, Carpita NC, Freeling M, Gingle AR, Hash CT, Keller
B, Klein P, Kresovich S, McCann MC, Ming R, Peterson DG, Mehboob-ur-Rahman, Ware D,
Westhoff P, Mayer KF, Messing J, Rokhsar DS. 2009. The Sorghum bicolor genome and the
diversification of grasses. Nature. 457(7229):551-6.
Paul I e Ghosh MK. 2014. The E3 ligase CHIP: insights into its structure and regulation. Biomed Res
Int. 2014:918183.
Pickart CM. 2001. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem. 70:503-33.
Porath J. 1992. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 4:263-81). Duong-
Ly KC e Gabelli SB. 2014. Gel filtration chromatography (size exclusion chromatography) of
proteins. Methods Enzymol. 541:105-14.
Puigbò P, Guzmán E, Romeu A, Garcia-Vallvé S. 2007. OPTIMIZER: A web server for optimizing the
codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Research. 35:126-131.
Ramos CH e Ferreira ST. 2005. Protein folding, misfolding and aggregation: evolving concepts and
conformational diseases. Protein Pept Lett. 12:213-222.
Ramos CH. 2004. A spectroscopic-based laboratory experiment for protein conformational studies.
Biochem Mol Biol Educ. 32(1):31-4.
159
Rampelt H, Kirstein-Miles J, Nillegoda NB, Chi K, Scholz SR, Morimoto RI, Bukau B. 2012. Metazoan
Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31(21):4221-35.
Scheffner M, Nuber U, Huibregtse JM. 1995. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme
ubiquitin thioester cascade. Nature. 373(6509):81-3.
Scheufler C, Brinker A, Bourenkov G, Pegoraro S, Moroder L, Bartunik H, Hartl FU, Moarefi I. 2000.
Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-
Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101(2):199-210.
Schirmer EC, Glover JR, Lindquist S. 1996. Hsp100/Clp proteins: a common mechanism explains
diverse functions. Trends Biochem Sci. 21:289-296.
Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. 2012. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.
Nature methods. 9:671-6750.
Seo JH, Park JH, Lee EJ, Vo TT, Choi H, Kim JY, Jang JK, Wee HJ, Lee HS, Jang SH, Park ZY, Jeong J, Lee
KJ, Seok SH, Park JY, Lee BJ, Lee MN, Oh GT, Kim KW. 2016. ARD1-mediated Hsp70 acetylation
balances stress-induced protein refolding and degradation. Nat Commun. 7:12882.
Sepsey A, Bacskay I, Felinger A. 2014. Molecular theory of size exclusion chromatography for wide
pore size distributions. J Chromatogr A. 1331:52-60.
Shen G, Adam Z, Zhang H. 2007. The E3 ligase AtCHIP ubiquitylates FtsH1, a component of the
chloroplast FtsH protease, and affects proteins degradation in chloroplasts. Plant J. 52(2):309-
21.
Shorter J. 2011. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40
to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One.
6(10):e26319.
Sievers F, Wilm A, Dineen D, Gibson TJ, Karplus K, Li W, Lopez R, McWilliam H, Remmert M, Söding J,
Thompson JD, Higgins DG. 2011. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple
sequence aligments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7:5390.
Silva KP, Borges JC. 2011. The molecular chaperone Hsp70 family members function by a
bidirectional heterotrophic allosteric mechanism. Protein Pept Lett. 18:132–142.
Silva VC e Ramos CH. 2012. The network interaction of human 90 kDa heat shock protein Hsp90: A
target for cancer therapeutics. J Proteome. 75:2790–2802.
Silva VC, Cagliari TC, Lima TB, Gozzo FC, Ramos CH. 2013. Conformational and functional studies of a
cytosolic 90 kDa heat shock protein Hsp90 from sugarcane. Plant Physiol Biochem. 68:16-22.
Skouri-Panet F, Michiel M, Férard C, Duprat E, Finet S. 2012. Structural and functional specificity of
small heat shock protein hspB1 and HspB4, two cellular partners of HspB5: role of the in vitro
hetero-complex formation in chaperone activity. Biochimie. 94(4):975-84.
160
Smilgies DM e Folta-Stogniew E. 2015. Molecular weight-gyration radius relation of globular proteins:
a comparison of light scattering, small-angle X-ray scattering and structure-based data. J Appl
Crystallogr. 48(Pt 5):1604-1606.
Smith MC, Scaglione KM, Assimon VA, Patury S, Thompson AD, Dickey CA, Southworth DR, Paulson
HL, Gestwicki JE, Zuiderweg ER. 2013. The E3 ubiquitin ligase CHIP and the molecular
chaperone Hsc70 form a dynamic, tethered complex. Biochemistry. 52(32):5354-64.
Snider J e Houry WA. 2008. AAA+ proteins: diversity in function, similarity in structure. Biochem Soc
Trans. 36:72-77.
Soss SE, Rose KL, Hill S, Jouan S, Chazin WJ. 2015. Biochemical and proteomics analysis of
ubiquitination of Hsc70 and Hsp70 by the E3 ligase CHIP. PLoS One. 10(5):e0128240.
Soss SE, Yue Y, Dhe-Paganon S, Chazin WJ. 2011. E2 conjugating enzyme selectivity and requirements
for function of the E3 ubiquitin ligase CHIP. J Biol Chem. 286(24):21277-86.
Stengel F, Baldwin AJ, Painter AJ, Jaya N, Basha E, Kay LE, Vierling E, Robinson CV, Benesch JL. 2010.
Quaternary dynamics and plasticity underlie small heat shock protein chaperone function. Proc
Natl Acad Sci.107:2007-2012.
Studier WF, Rosenberg AH, Dunn JJ, Dubendorff JW. 1990. Use of T7 RNA polymerase to direct
expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185:60-89.
Sudnitsyna MV, Mymrikov EV, Seit-Nebi AS, Gusev NB. 2012. The role of intrinsically disordered
regions in the structure and functioning of small heat shock proteins. Curr Protein Pept
Sci.13(1):76-85.
Summers DW, Douglas PM, Ramos CH, Cyr DM. 2009. Polypeptide transfer from Hsp40 to Hsp70
molecular chaperones. Trends Biochem Sci. 34:230–233.
Taipale M, Tucker G, Peng J, Krykbaeva I, Lin ZY, Larsen B, Choi H, Berger B, Gingras AC, Lindquist S.
2014. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein
homeostasis pathways. Cell. 158(2):434-448.
Tanaka K. 2009. The proteasome: overview of structure and functions. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol
Sci. 85(1):12-36.
Tipping KW, van Oosten-Hawle P, Hewitt EW, Radford SE. 2015. Amyloid fibres: inert end- stage
aggregates or key players in disease? Trends Biochem Sci 40:719–727.
Tiroli-Cepeda AO e Ramos CH. 2010. Heat causes oligomeric disassembly and increases the
chaperone activity of small heat shock proteins from sugarcane. Plant Physiol Biochem. 48:
108-116.
Tiroli-Cepeda AO e Ramos CHI. 2011. An overview of the role of molecular chaperones in protein
homeostasis. Protein Pept Lett 18:101–109.
161
Tiroli-Cepeda AO, Lima TB, Balbuena TS, Gozzo FC, Ramos CH. 2014. Structural and functional
characterization of the chaperone Hsp70 from sugarcane. Insights into conformational changes
during cycling from cross-linking/mass spectrometry assays. J Proteomics. 104:48-56.
Turnbull WB e Daranas AH. 2003. On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal
titration calorimetry? J Am Chem Soc. 125(48):14859-66.
Tzankov S, Wong MJ, Shi K, Nassif C, Young JC. 2008. Functional divergence between co-
chaperones of Hsc70. J Biol Chem. 283(40):27100-9.
Ungelenk S, Moayed F, Ho CT, Grousl T, Scharf A, Mashaghi A, Tans S, Mayer MP, Mogk A, Bukau B.
2016. Small heat shock proteins sequester misfolding proteins in near-native conformation for
cellular protection and efficient refolding. Nat Commun. 7:13673.
van Montfort RL, Basha E, Friedrich KL, Slingsby C, Vierling E. 2001. Crystal structure and assembly of
a eukaryotic small heat shock protein. Nat Struct Biol. 8(12):1025-30.
Vierling E. 1991. The roles of heat shock proteins in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol Biol.
42: 579-620.
Vijay-Kumar S, Bugg CE, Wilkinson KD, Vierstra RD, Hatfield PM, Cook WJ. 1987. Comparison of the
three-dimensional structures of human, yeast and oat ubiquitin. J Biol Chem. 262(13):6396-9.
Vincze T, Posfai J, Roberts RJ. 2003. NEBcutter: a program to cleave DNA with restriction enzymes.
Nucleic Acids Res. 31:3688-91.
Voet D e Voet J. 2011. Biochemistry. 4ª ed. Wiley, Hoboken.
Vos MJ, Hageman J, Carra S, Kampinga HH. 2008. Structural and functional diversities between
members of the human HSPB, HSPH, HSPA and DNAJ chaperone families. Biochemistry.
47(27):7001-11.
Wandinger SK, Richter K, Buchner J. 2008. The Hsp90 chaperone machinery. J Biol Chem. 283:18473–
18477.
Waters ER. 2013. The evolution, function, structure and expression of the plant sHsps. J Exp Bot.
64(2):391-403.
Wegele H, Müller L, Buchner J. 2004. Hsp70 and Hsp90 – a relay team for protein folding. Ver Physiol
Biochem Pharmacol. 151:1–44.
Wilson DN e Doudna Cate JH. 2012. The structure and function of the eukaryotic ribosome. Cold
Spring Harb Perspect Biol. 1;4(5).
Wyatt P. 1993. Light scattering and the absolute characterization of macromolecules. Analytica
Chimica Acta. 272: 1-4.
162
Xu X, Sarbeng EB, Vorvis C, Kumar DP, Zhou L, Liu Q. 2012. Unique peptide substrate binding
properties of 110-kDa heat-shock protein (Hsp110) determine its distinct chaperone activity. J
Biol Chem. 287(8):5661-72.
Xu Z, Devlin KI. Ford MG, Nix JC, Qin J, Misra S. 2006. Structure and interactions of the helical and U-
box domains of CHIP, the C-terminus of Hsp70 interacting protein. Biochemistry. 45(15):4749-
59.
Xu Z, Kohli E, Devlin KI, Bold M, Nix JC, Misra S. 2008. Interactions between the quality control
ubiquitina ligase CHIP and ubiquitina conjugating enzymes. BMC Struct Biol. 8:26.
Yan J, Wang J, Li Q, Hwang JR, Patterson C, Zhang H. 2003. AtCHIP, a U-box-containing E3 ubiquitin
ligase, plays a critical role in temperature stress tolerance in Arabidopsis. Plant Physiol.
132(2):861-9.
Young JC, Moarefi I, Hartl FU. 2001. Hsp90: a specialized but essential protein-folding tool. J Cell Biol.
154:267-273.
Young JC. 2010. Mechanisms of the Hsp70 chaperone system. Biochem Cell Biol. 88(2):291-300.
Zhang H, Amick J, Chakravarti R, Santarriaga S, Schlanger S, McGlone C, Dare M, Nix JC, Scaglione KM,
Stuehr DJ, Misra S, Page RC. 2015. A bipartite interaction between Hsp70 e CHIP regulates
ubiquitination of chaperoned client proteins. Structure. 23(3):472-82.
Zhang M, Windheim M, Roe SM, Peggie M, Cohen P, Prodromou C, Pearl LH. 2005. Chaperoned
ubiquitylation - crystal structures of the CHIP Ubox E3 ubiquitin ligase and a CHIP-Ubc13-Uev1a
complex. Mol Cell. 20(4):525-38.
Zietkiewicz S, Krzewska J, Liberek K. 2004. Successive and synergistic action of the Hsp70 and Hsp100
chaperones in protein disaggregation. J Biol Chem. 279:44376–44383
Żwirowski S, Kłosowska A, Obuchowski I, Nillegoda NB, Piróg A, Ziętkiewicz S, Bukau B, Mogk
A, Liberek K. 2017. Hsp70 displaces small heat shock proteins from aggregates to initiate
protein refolding. EMBO J. 36(6):783-796.
163
Anexos
Figura A1: Formação de possíveis cristais de SbCHIP em diferentes condições ao longo do tempo. Foram testados seis kits comerciais de cristalização, os quais consistem de placas de 96 poços contendo uma condição de tampão e de precipitante diferente em cada poço. Foi observada a formação de cristais em diversas condições, sendo algumas delas mostradas aqui: usando 210 µM de SbCHIP nas condições de (A) 100 mM NaH2PO4/K2HPO4 pH 6,2; 2,5 M de NaCl, (B) 100 mM MES pH 6,0; 1M de tartarato de sódio de potássio. E usando 470 µM de SbCHIP nos tampões (C) 240 mM de malonato de disódio; 20% de polietilenoglicol 3,35, (D) 100 mM de BIS-TRIS pH 5,5; 3 M de NaCl e (E) 100 mM de BIS-TRIS pH 5,5; 1M sulfato de amônio. A última imagem de cada condição representa o imageamento por incidência de luz UV. As imagens foram obtidas no ROBOLAB, LNBio (proposta: 23595).
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