UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA … · os meus sonhos são seus sonhos. Meus eternos agradecimentos. Aos meus irmãos Andrei e Maria e cunhados Cesar e Elizabete

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS

CÂMPUS DE BOTUCATU

INFLUÊNCIA DO GLYPHOSATE NO PERFIL BIOQUÍMICO E

FISIOLÓGICO DE POPULAÇÕES DE AZEVÉM (Lolium multiflorum)

SUSCETÍVEIS E RESISTENTES AO HERBICIDA

GILMAR JOSÉ PICOLI JUNIOR

Tese apresentada à Faculdade de Ciências

Agronômicas da UNESP – Campus de

Botucatu para obtenção do título de

Doutor em Agronomia (Agricultura)

BOTUCATU – SP

Janeiro – 2016

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS

CÂMPUS DE BOTUCATU

INFLUÊNCIA DO GLYPHOSATE NO PERFIL BIOQUÍMICO E

FISIOLÓGICO DE POPULAÇÕES DE AZEVÉM (Lolium multiflorum)

SUSCETÍVEIS E RESISTENTES AO HERBICIDA

GILMAR JOSÉ PICOLI JUNIOR

Orientador: Prof. Dr. Caio Antonio Carbonari

Co-Orientador: Prof. Dr. Edivaldo Domingues Velini

Tese apresentada à Faculdade de Ciências

Agronômicas da UNESP – Campus de

Botucatu para obtenção do título de

Doutor em Agronomia (Agricultura)

BOTUCATU – SP

Janeiro - 2016

III

“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas

pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que

todo mundo vê.” (Arthur Schopenhauer)

Aos meus queridos pais Giomar e Dayse, pelo o

AMOR incondicional e que apesar da distância,

sempre estiveram ao meu lado.

Ofereço e dedico.

IV

AGRADECIMENTOS

A Deus, por estar sempre ao meu lado nessa importante caminhada.

Aos meus pais, pela dedicação incondicional à minha educação e por acreditarem que

os meus sonhos são seus sonhos. Meus eternos agradecimentos.

Aos meus irmãos Andrei e Maria e cunhados Cesar e Elizabete pelo carinho, apoio e

incentivo.

Aos meus sobrinhos Yurik, Kalel, Davi e Arthur, por lembrarem que dentro de mim

mora uma criança com sorriso puro e olhar inocente quando estou com eles.

Ao meu orientador Prof. Dr. Caio Antonio Carbonari, por ter me aceitado como

orientado, pela paciência, amizade, pelo exemplo de profissionalismo e pelos conhecimentos

transmitidos. Muito obrigado!

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Edivaldo Domingues Velini pela generosidade em

dividir sua sabedoria.

Aos meus indispensáveis e eternos “irmãos” da pós-graduação Ana Karollyna Alves

de Matos, Plínio Saulo Simões, Giovanna Larissa Gimenes Cotrick Gomes, Diego Belapart,

Leandro Tropaldi, Gabrielle de Castro Macedo, Edicarlos Batista de Castro, Renan Fonseca

Nascentes, Ronei Ben, Débora Latorre e Bruna Marchesi pela valiosa ajuda durante o período

dos experimentos e pelos bons momentos vividos.

Aos colegas de laboratório Rosilaine Araldi, Marcelo Girotto, Natália Corniani, Ilca

Puertas Freitas e Silva e Samir Paulo Jasper pelos bons momentos de convívio durante o curso

de pós-graduação.

Aos amigos e funcionários do Núcleo de Pesquisas Avançadas em Matologia José

Guilherme Cordeiro, José Roberto Marques Silva e Marcelo L. Siono pelas preciosas

colaborações durante a realização dos experimentos.

Á Prof. Dra. Giuseppina Pace Pereira Lima pela disponibilidade de seu laboratório e

pelos alegres momentos vividos em todos os dias de trabalho.

Aos colegas do Laboratório de Análises Bioquímicas Vegetais do Departamento de

Química e Bioquímica do Instituto de Biociências da UNESP de Botucatu pelas valiosas

contribuições.

Aos colegas Cleber Junior Jadoski e Luan Ormond pela ajuda com as análises do

IRGA e interpretação dos dados.

V

Aos meus queridos amigos Rosalvo Pires, Ivete Teixeira, Flaviane Lazarini, Carolina

Junqueira, Daiana Bampi e Ronaldo Araújo, que nesta caminhada, foram extremamente

importantes para que eu chegasse até aqui.

Ao Dr. Stephen B. Powles, pelo exemplo de pessoa, Dra. Qin Yu e Dr. Heping Han,

pela orientação, cuidado, e excelentes contribuições não só na área acadêmica como na vida

pessoal durante o período de doutorado sanduíche na Australia Herbicide Resistance

Iniciative (AHRI), University of Western Australia, Austrália.

Á Arysta LifeScience através de Angelo Stasievski pelo fornecimento das sementes.

Á Embrapa Trigo através do Prof. Dr. Leandro Vargas pelo fornecimento das

sementes.

Ao programa de pós-graduação em Agronomia/Agricultura e a Faculdade de Ciências

Agronômicas pela oportunidade e formação.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES), pela

bolsa de estudos concedida.

A todos que de alguma forma contribuíram para que esse sonho se tornasse realidade.

Muito obrigado!

VI

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS...........................................................................................................VIII

LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................IX

1. RESUMO ............................................................................................................................... 1

2. SUMMARY ........................................................................................................................... 3

3. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 5

4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 8

4.1 Azevém: morfologia, biologia e distribuição. ................................................................... 8

4.2 Azevém como planta daninha. .......................................................................................... 9

4.3 Glyphosate: importância, características químicas e modo de ação. .............................. 10

4.4 Efeitos do glyphosate na fotossíntese. ............................................................................ 18

4.5 Fenilalanina amônio liase (PAL)..................................................................................... 20

4.6 Resistência de plantas daninhas aos herbicidas............................................................... 22

4.7 Resistencia de plantas daninhas ao glyphosate. .............................................................. 26

4.8 Azevém (Lolium multiflorum) resistente ao glyphosate. ................................................ 30

5. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 32

5.1 Curvas de dose-resposta das diferentes populações de azevém. ..................................... 32

5.2 Efeitos do glyphosate na enzima fenilalanina amônia liase nas diferentes populações...34

5.3 Efeitos do glyphosate na fotossíntese das diferentes populações. .................................. 37

5.4 Avaliação dos teores de glyphosate, AMPA e compostos da rota do ácido chiquímico

nas diferentes populações. ............................................................................................... 39

5.5 Análise dos dados ............................................................................................................ 42

5.5.1 Curvas de dose-resposta das diferentes populações de azevém ............................... 42

5.5.2 Efeitos do glyphosate na enzima fenilalanina amônia liase nas diferentes

populações................................................................................................................43

5.5.3 Efeitos do glyphosate sobre a fisiologia das diferentes populações ......................... 43

5.5.4 Avaliação dos teores de glyphosate, AMPA e compostos da rota do ácido

chiquímico nas diferentes populações ..................................................................... 43

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 44

6.1 Curvas de dose-resposta das diferentes populações de azevém. ..................................... 44

6.2 Efeitos do glyphosate na enzima fenilalanina amônia liase nas diferentes populações...48

6.3 Efeitos do glyphosate na fotossíntese das diferentes populações. .................................. 54

6.3.1 Suscetível (S) x Resistente (R2) ............................................................................... 54

6.3.2 Suscetível (S) x Resistente (R1) ............................................................................... 66

6.4 Avaliação dos teores de glyphosate, AMPA e compostos da rota do ácido chiquímico

nas diferentes populações. ............................................................................................... 73

VII

7. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 97

8. REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 98

VIII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Doses de glyphosate utilizados no experimento. Botucatu - SP, 2014.. ................... 33

Tabela 2. Estimativas dos parâmetros a, b, c e o coeficiente de determinação (r²) do modelo

log-logístico para as populações de Lolium multiflorum em relação à porcentagem de controle

aos 21 DAA. Botucatu – SP... .................................................................................................. 47


log-logístico para as populações de Lolium multiflorum em relação à porcentagem de massa

seca aos 28 DAA. Botucatu – SP. ............................................................................................ 48

Tabela 4. Atividade da enzima fenilalanina amônia liase (PAL) em plantas de azevém

suscetível (S) e com suspeita de resistente (R1) coletadas as 12, 24 e 72 horas após a

aplicação do herbicida glyphosate. Botucatu - SP... ................................................................. 49


suscetível (S) e Resistente (R1) coletadas as 12, 24, 48 e 72 horas após a aplicação do

herbicida glyphosate. Botucatu - SP... ...................................................................................... 51

Tabela 6. Análise de variância e valores de diferença mínima significativa (DMS) para os

compostos analisados. Botucatu – SP................ ...................................................................... 73

IX

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Rotas de decomposição microbiológica do glyphosate. Fonte: Amarante Jr. et al.,

2002. ......................................................................................................................................... 11

Figura 2. Rota do ácido chiquímico. Fonte: Maeda e Dudareva, 2012. ................................... 14

Figura 3. Corismato em negrito como precursor do (1) prefenato, (2) antranilato, (3)

aminodeoxicorismato, (4) p-hidroxibenzoato, (5) isocorismato. As enzimas envolvidas são:

(1) corismato mutase, (2) antranilato sintase, (3) aminodeoxicorismato sintase, (4), corismato

piruvato liase, (5) isocorismato sintase. Fonte: Dosselaere e Vanderleyden,

2001...........................................................................................................................................15

5

Figura 4. Aminoácidos aromáticos e alguns compostos fenólicos. Fonte: Velini et al., 2012..16

Figura 5. Via biossintética fenilpropanóide. Fonte: Du et al., 2009. ........................................ 20

Figura 6. Estádio das plantas de azevém no momento da aplicação dos tratamentos Botucatu -

SP, 2014. ................................................................................................................................... 33

Figura 7. Pulverizador estacionário com as unidades experimentais. Botucatu - SP, 2014. .... 34

Figura 8. Procedimento de preparo de amostra para PAL. Botucatu - SP, 2014. .................... 36

Figura 9. Procedimento de extração e quantificação da PAL. Botucatu - SP, 2014. ............... 37

Figura 10. IRGA modelo LI-6400. Botucatu - SP, 2014. ......................................................... 38

Figura 11. Procedimentos da coleta das folhas. Botucatu - SP, 2014. ..................................... 40

Figura 12. Procedimentos para extração dos compostos. Botucatu - SP, 2014. ....................... 41

Figura 13. Cromatógrafo Líquido (Prominence UFLC) acoplado ao espectrômetro de massas

(3200 Q TRAP) – LC-MS/MS. ................................................................................................ 42

Figura 14. Intoxicação das plantas de azevém suscetível (S) e resistente (R1 e R2) após a

aplicação de diferentes doses do herbicida glyphosate aos 21 DAA. O gráfico se encontra em

escala logarítma. Botucatu – SP. .............................................................................................. 46

Figura 15. Massa seca da parte aérea das plantas de azevém suscetível (S) e resistente (R1 e

R2) após a aplicação de diferentes doses do herbicida glyphosate aos 28 DAA. O gráfico se

encontra em escala logarítma. Botucatu – SP. .......................................................................... 47

Figura 16. Taxa de assimilação de CO2 (μmolCO2 m-2

s-1

) em plantas de azevém suscetível e

resistente após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 3, 7 e 28 DAA. Testemunha

suscetível (TS), testemunha resistente (TR), população suscetível submetida a 720 g e.a. ha-1

(S2), população suscetível submetida a 1080 g e.a. ha-1

(S3), população resistente

X

submetida a 720 g e.a. ha-1

(R2), população resistente submetida a 1080 g e.a. ha-1

(R3). As

barras verticais indicam o intervalo de confiança. Botucatu – SP. ........................................... 56

Figura 17. Condutância estomática (mmolH2O m-2

s-1





(S3), população resistente submetida a

720 g e.a. ha-1


(R3). As barras

verticais indicam o intervalo de confiança. Botucatu – SP. ..................................................... 58

Figura 18. Concentração interna de CO2 na câmara subestomática (μmol(CO2) mol-1

ar) em

plantas de azevém suscetível e resistente após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 3, 7 e

28 DAA. Testemunha suscetível (TS), testemunha resistente (TR), população suscetível



(S3),

população resistente submetida a 720 g e.a. ha-1

(R2), população resistente submetida a 1080

g e.a. ha-1

(R3). As barras verticais indicam o intervalo de confiança. Botucatu – SP. ........... 59

Figura 19. Taxa de transpiração (μmol(H2O) m-2

s-1





(S3), população resistente submetida a

720 g e.a. ha-1


(R3). As barras

verticais indicam o intervalo de confiança. Botucatu – SP. ..................................................... 61

Figura 20. Eficiência do uso da água (μmol CO₂ mmol H₂O-1) em plantas de azevém

suscetível e resistente após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 3, 7 e 28 DAA.

Testemunha suscetível (TS), testemunha resistente (TR), população suscetível submetida a

720 g e.a. ha-1


(S3), população

resistente submetida a 720 g e.a. ha-1


(R3). As barras verticais indicam o intervalo de confiança. Botucatu – SP. ............................ 62

Figura 21. Eficiência de carboxilação (A/Ci) em plantas de azevém suscetível e resistente

após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 3, 7 e 28 DAA. Testemunha suscetível (TS),

testemunha resistente (TR), população suscetível submetida a 720 g e.a. ha-1

(S2), população

suscetível submetida a 1080 g e.a. ha-1

(S3), população resistente submetida a 720 g e.a. ha-1


(R3). As barras verticais indicam o

intervalo de confiança. Botucatu – SP. ..................................................................................... 64


s-1


resistente após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 7 e 28 DAA. Testemunha suscetível

(TS), testemunha resistente (TR), população suscetível submetida a 720 g e.a. ha-1

(S2),

população suscetível submetida a 1080 g e.a. ha-1

(S3), população resistente submetida a 720

g e.a. ha-1


(R3). As barras verticais

indicam o intervalo de confiança. Botucatu – SP. .................................................................... 66


s-1




(S2),


(S3), população resistente

XI



(R3). As

barras verticais indicam o intervalo de confiança. Botucatu – SP. ........................................... 67


ar) em

plantas de azevém suscetível e resistente após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 7 e 28

DAA. Testemunha suscetível (TS), testemunha resistente (TR), população suscetível



(S3),



g e.a. ha-1

(R3). As barras verticais indicam o intervalo de confiança. Botucatu – SP. ........... 68

Figura 25. Taxa de transpiração (mmolH2O m-2

s-1




(S2),


(S3), população resistente submetida a 720

g e.a. ha-1



indicam o intervalo de confiança. Botucatu – SP. .................................................................... 69


suscetível e resistente após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 7 e 28 DAA.

Testemunha suscetível (TS), testemunha resistente (TR), população suscetível submetida a

720 g e.a. ha-1


(S3), população



(R3). As barras verticais indicam o intervalo de confiança. Botucatu – SP. ............................ 70


após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 7 e 28 DAA. Testemunha suscetível (TS),

testemunha resistente (TR), população suscetível submetida a 720 g e.a. ha-1

(S2), população





intervalo de confiança. Botucatu – SP. ..................................................................................... 71

Figura 28. Níveis de glyphosate (μg g-1

) em plantas de azevém S, R1 e R2 aos 5, 11 e 28

DAA. Botucatu – SP. ................................................................................................................ 75

Figura 29. Níveis de Ampa (μg g-1

) em plantas de azevém S, R1 e R2 aos 5, 11 e 28 DAA.

Botucatu – SP... ........................................................................................................................ 77

Figura 30. Níveis de ácido chiquímico (μg g-1

) em plantas de azevém S, R1 e R2 aos 5, 11 e

28 DAA. Botucatu – SP. ........................................................................................................... 79

Figura 31. Níveis de ácido quínico (μg g-1


DAA. Botucatu – SP. ................................................................................................................ 81

Figura 32. Níveis de shiquimato-3-fosfato (μg g-1

) em plantas de azevém S, R1 e R2 aos 5, 11

e 28 DAA. Botucatu – SP. ........................................................................................................ 83

Figura 33. Níveis de Fenilalanina (μg g-1


DAA. Botucatu – SP. ................................................................................................................ 85

XII

Figura 34. Níveis de Tirosina (μg g-1


Botucatu – SP..... ...................................................................................................................... 87

Figura 35. Níveis de Triptofano (μg g-1


DAA. Botucatu – SP. ................................................................................................................ 89

Figura 36. Níveis de Ácido Ferúlico (μg g-1


DAA. Botucatu – SP. ................................................................................................................ 91

Figura 37. Níveis de Ácido Coumárico (μg g-1


28 DAA. Botucatu – SP. ........................................................................................................... 92

Figura 38. Níveis de Ácido Cafeico (μg g-1


DAA. Botucatu – SP. ................................................................................................................ 95

1

1. RESUMO

No Brasil, o azevém (Lolium multiflorum) foi identificado como

resistente ao glyphosate se tornando um grande problema em determinadas lavouras. Dessa

forma, entender o comportamento a nível bioquímico e fisiológico desta planta daninha são

ferramentas que auxiliam num manejo eficiente. Com isso, o objetivo deste trabalho foi

comparar o perfil bioquímico e fisiológico de populações de azevém suscetíveis e resistentes

ao herbicida glyphosate aplicação do mesmo. Foram realizados quatro estudos em casa-de-

vegetação com delineamento experimental inteiramente casualizados com quatro repetições

sendo semeadas três populações de azevém (Lolium multiflorum) consideradas como

suscetível (S), com suspeita de resistência (R1) e resistente (R2) ao herbicida glyphosate. No

primeiro estudo foi obtido o controle aos 21 dias após a aplicação (DAA) e quantificada a

massa seca aos 28 DAA das três populações. Os tratamentos foram constituídos da aplicação

do herbicida glyphosate composto pelas doses: 0, 135, 270, 540, 1080, 2160, 4320, 8640 g

e.a. ha-1

. O segundo estudo teve como objetivo determinar a atividade da enzima fenilalanina

amônia liase (PAL) nas diferentes populações as 12, 24, 48 e 72 horas após a aplicação

(HAA). Os tratamentos foram compostos de duas doses (720 g e.a. ha-1

e 1080 g e.a. ha-1

)

mais uma testemunha sem aplicação. No terceiro estudo foram realizadas avaliações da

fotossíntese nas três populações ao 1, 3, 7 e 28 DAA. As variáveis analisadas foram: taxa de

assimilação líquida de CO2, condutância estomática, concentração interna de CO2,

transpiração, eficiência do uso da água e eficiência instantânea de carboxilação. Os

tratamentos foram compostos de duas doses (720 g e.a. ha-1

e 1080 g e.a. ha-1

) mais uma

testemunha sem aplicação. O quarto estudo teve o objetivo de quantificar compostos alterados

da rota do ácido chiquímico. Para isso, foram utilizados os mesmos tratamentos do primeiro

estudo e realizadas coletas das folhas aos 5, 11 e 28 DAA. Os compostos analisados foram:

glyphosate, AMPA (ácido aminometilfosfônico), ácido chiquímico, ácido quínico,

shiquimato-3-fosfato, os aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina e triptofano, ácido

ferúlico, ácido coumárico e ácido cafeico. Na população considerada resistente, a atividade da

enzima fenilalanina amônia liase manteve-se alta após a aplicação do glyphosate. Todas as

variáveis fisiológicas foram afetadas após a aplicação do glyphosate nas três populações,

porém, R2 foi capaz de se recuperar apresentando valores semelhantes à testemunha. Os

níveis de ácido chiquímico e quínico apresentaram padrões semelhantes onde houve aumento

para as populações suscetíveis com o aumento da dose do herbicida enquanto que para a

2

resistente os valores se mantiveram semelhantes. Ocorreu aumento dos níveis de shiquimato-

3-fosfato para a população R2 se mantendo constante para as suscetíveis. Houve redução dos

aminoácidos aromáticos com a aplicação do glyphosate para as populações suscetíveis.

Palavras-chave: Resistência a herbicidas, ácido chiquímico, aminoácidos aromáticos,

fotossíntese, fenilalanina amônia liase, ácidos fenólicos, metabolismo secundário.

3

GLYPHOSATE INFLUENCE IN THE BIOCHEMICAL AND PHYSIOLOGICAL

PROFILE OF SUSCEPTIBLE AND RESISTANT RYEGRASS (Lolium multiflorum)

POPULATIONS TO HERBICIDE. Botucatu, 2016, 117p. Tese (Doutorado em

Agronomia/Agricultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual

Paulista.

Author: Gilmar José Picoli Junior

Adviser: Caio Antonio Carbonari

Co-adviser: Edivaldo Domingues Velini

2. SUMMARY

In Brazil, ryegrass (Lolium multiflorum) was identified as resistant to

glyphosate becoming a major problem in certain crops. Thus, understanding the behavior of

the biochemical and physiological level of this weed are tools that help in efficient

management. Thus, the aim of this study was to compare the biochemical and physiological

profile of ryegrass populations susceptible and resistant to glyphosate after spray it. Four

studies were carried out in greenhouse with experimental design completely randomized with

four replications being seeded three populations of ryegrass (Lolium multiflorum) considered

as susceptible (S), suspected of having resistance (R1) and resistant (R2) to the herbicide

glyphosate. In the first study was measured the control at 21 days after application (DAA) and

at 28 DAA, the dry mass the three populations. The treatments consisted of application of the

glyphosate composed of doses: 0, 135, 270, 540, 1080, 2160, 4320, 8640 g a.i. ha-1

. The

second study aimed to determine the phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity in different

populations at 12, 24, 48 and 72 hours after application (HAA). The treatments consisted of

two doses (720 g a.i. ha-1

and 1080 g a.i. ha-1

) plus a control without application. In the third

study were carried out photosynthesis assessments at three populations at 1, 3, 7 and 28 DAA.

The variables analyzed were: CO2 net assimilation rate, stomatal conductance, CO2 internal

concentration, transpiration, water use efficiency and instantaneous carboxylation efficiency.

The treatments consisted of two doses (720 g a.i. ha-1

and 1080 g a.i. ha-1

) plus a control

without application. The fourth study aimed to quantify altered compounds of the shikimic

acid pathway. For this, the same treatments of the first experiment were used and made

collections of leaves at 5, 11, 28 DAA. The compounds analyzed were: glyphosate, AMPA

(aminomethylphosphonic acid), shikimic acid, quinic acid, shikimate 3-phosphate, the

4

aromatic amino acids phenylalanine, tyrosine and tryptophan, ferulic acid, coumaric acid and

caffeic acid. The phenylalanine ammonia lyase enzyme was not influenced by glyphosate in

resitant population. All physiological variables were affected after the application of

glyphosate at the three populations, but R2 was able to recover with values similar to the

control. The shikimic and quinic acid levels showed similar patterns where, there was an

increase for susceptible populations with increasing doses of the herbicide while in resistant,

the values remained similar. There was increase in levels of shikimate-3-phosphate to the R2

population, remaining constant for susceptible. There was a reduction of the aromatic amino

acids with the application of glyphosate for the susceptible populations.

Key-words: Herbicide resistance, shikimic acid, aromatic amino acids, photosynthesis,

phenylalanine ammonia lyase, phenolic acids, secondary metabolism.

5

3. INTRODUÇÃO

Pode-se dizer que existe uma relação direta entre o aumento da

produtividade das culturas e o aumento no uso de herbicidas, porém mesmo com o controle

químico, a infestação das plantas daninhas não tem diminuído. Na atualidade, os agricultores

depositam confiança excessiva no controle químico das plantas daninhas o que se deve,

principalmente, ao fato de que o controle químico tem sido muito eficiente e possui custo

atrativo, estando prontamente disponível e profissionalmente desenvolvido. Porém o uso

excessivo e indiscriminado dos mesmos ao longo dos anos propiciou a seleção de plantas

daninhas resistentes.

A resistência de plantas daninhas a herbicidas pode ser definida como a

capacidade adquirida de uma planta em sobreviver à dose de registro do herbicida que sob

condições normais, controlam os demais indivíduos da população (CHRISTOFFOLETI;

LÓPES-OVEJERO, 2008). Já uma planta suscetível sofre alterações em seu crescimento e

desenvolvimento levando-a a morte após a exposição do produto, ou seja, há variações no

perfil metabólico dessas plantas quando as mesmas são tratadas com herbicidas como o

glyphosate.

O glyphosate tem como mecanismo de ação a inibição da enzima

EPSPs, bloqueando a via do ácido chiquímico que produz aminoácidos aromáticos dos quais

não são somente utilizados para a produção de proteínas em plantas, mas também como

precursores de um grande número de metabólitos secundários (pigmentos, flavonóides,

auxinas, fitoalexinas, lignina e taninos) (VELINI et al., 2009a). Além disso, rotas

intermediárias podem servir como substrato para outras vias metabólicas, incluindo a

6

biossíntese de ácido quínico e produtos derivados, como o ácido clorogênico (HERMAN;

WEAVER, 1999). Sendo assim, as plantas submetidas ao glyphosate podem ter a síntese

desses compostos também alterada.

Herbicidas como o glyphosate pode afetar indiretamente a fotossíntese

através da inibição da biossíntese de carotenoides, clorofila, ácidos graxos (OLESEN;

CEDERGREEN, 2010; GOMES et al., 2014). Como um inibidor competitivo, o glyphosate

bloqueia a via do ácido chiquímico inibindo a biossíntese de metabólitos secundários nas

plantas, incluindo compostos relacionados com a fotossíntese como as quinonas (DEWICK,

1998).

Dentre as espécies em que foi registrada a resistência ao herbicida

glyphosate, tem-se o azevém (Lolium multiflorum), uma planta daninha utilizada como

forrageira e também no fornecimento de palha para o sistema de plantio direto, mas que se

constitui um grande problema para culturas como o trigo e pomares especialmente nos locais

de clima temperado como o Rio Grande do Sul e Santa Catarina. O aumento da presença desta

espécie nas lavouras comerciais associado à baixa perspectiva de lançamento de novas

moléculas herbicidas especificamente para o controle do azevém representa um grande

impacto econômico e técnico na agricultura brasileira (DIONISIO et al., 2013).

Diversos trabalhos têm sido feitos com o intuito de entender o

metabolismo das plantas após a aplicação de herbicidas. O conhecimento a nível bioquímico e

fisiológico das plantas daninhas, neste caso o azevém, é importante para um manejo eficiente,

pois pode ajudar na compreensão dos mecanismos de resistência ao glyphosate, assim como

compreender a intensidade dos efeitos nos biótipos suscetíveis e resistentes. Há poucas

explanações sobre os efeitos metabólicos e fisiológicos de plantas sensíveis e resistentes após

a inibição da EPSPs pela aplicação do herbicida glyphosate, sendo que a morte das plantas

não está apenas relacionada com o bloqueio da rota de biossíntese dos aminoácidos

aromáticos, mas também à falha na produção de um grande número de compostos

secundários, ao desregulamento no fluxo de carbono na planta e a redução da síntese de

proteínas.

Com isso, o objetivo geral do trabalho, foi comparar o perfil bioquímico

e fisiológico de populações de azevém suscetíveis e resistentes ao herbicida glyphosate após a

aplicação do mesmo. Como objetivos específicos: quantificar compostos alterados nas plantas

suscetíveis e resistentes; avaliar os níveis de intoxicação, alterações na fotossíntese e acúmulo

7

de matéria seca e investigar a influência do herbicida glyphosate sobre a enzima fenilalanina

amônia liase (PAL) em plantas resistentes.

8

4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4.1 Azevém: morfologia, biologia e distribuição

O gênero Lolium pertence a família Poaceae sendo composto por oito

espécies: L. temulentum L., L. persicum Boiss e Hohen, L. remotum Schrank, L. loliaceum

Bory e Chaubard (autógamas), L. canariense Steud (reprodução intermediária), L. perenne L.,

L. rigidum Gaundin e L. multiflorum Lam. (alógamas). Estas espécies podem ser pequenas

com 10 cm de altura, mas também grandes podendo chegar a 150 cm. São nativas da Europa,

Ásia e norte da África sendo introduzidas nos mais diversos países em todo o mundo,

inclusive no Brasil. Uma forma simples de verificar se uma planta pertence a este gênero é a

presença de duas glumas (POLOK, 2007).

Dentre essas espécies, L. multiflorum destaca-se por ser uma espécie

importante como forrageira e também para fornecimento de palha para o sistema de plantio

direto sendo cultivada em diversas regiões de clima temperado (LUBBERSTEDT;

SCHEJBEL; BACH, 2003). Pertence a subfamília Pooideae e tribo Poeae (WHEELER;

JACOBS; WHALLEY, 2002). Tem sua origem no mediterrâneo e provavelmente chegou ao

Brasil em 1985 trazida por imigrantes italianos. Ao passar dos anos, esta espécie sofreu

efeitos da seleção natural formando uma população bem adaptada às condições ecológicas do

sul do Brasil, onde no estado do Rio Grande do Sul é umas das gramíneas hibernais mais

cultivadas devido à boa capacidade de rebrote, perenização por ressemeadura natural,

resistência ao pisoteio, pastoreio e excesso de umidade, além da facilidade de implantação

(GONÇALVES, 1979; FREITAS; OLIVEIRA; CARVALHO, 2003; CARVALHO, 2004;

CASSOL et al., 2011).

9

É uma planta de ciclo anual ou bianual, morfologicamente muito

variável podendo atingir até 1,20 m de altura. Ereta, densamente perfilhada, glabra, de

inverno e herbácea. Suas folhas são finas e laminadas e sua inflorescência é em forma de

espiga do tipo dística com 15 a 20 cm de comprimento possuindo espiguetas onde as flores

estão inseridas. Cada flor possui duas glumas, uma pálea e um lema que envolve a cariopse.

Apresenta fácil dispersão propagando-se apenas por sementes, possui fecundação cruzada,

sistema radicular altamente ramificado e denso com muitas raízes adventícias e fibrosas

(POLOK, 2007; LORENZI, 2008; AGOSTINETTO; VARGAS, 2009).

O azevém é pouco exigente quanto ao tipo de solo, persistindo em uma

ampla gama de textura. Além disso, é tolerante a solos ácidos e alcalinos (pH 5,0 a 7,8) se

desenvolvendo melhor na faixa de pH entre 5,5 e 7,5. Possui metabolismo do tipo C3 e a

temperatura ótima para o seu desenvolvimento está entre 20 a 25°C sendo adaptado a climas

frios e úmidos (CARAMBULA, 1998; HANNAWAY et al., 1999).

4.2 Azevém como planta daninha

Planta daninha se enquadra como “toda e qualquer planta que ocorre

onde não é desejada” (OLIVEIRA JR; CONSTANTIN; INOUE, 2011). Porém Blanco (1972)

define como “toda e qualquer planta que germine espontaneamente em áreas de interesse

humano e que, de alguma forma, interfira prejudicialmente nas atividades agropecuárias do

homem”. Segundo Oerke (2006), o potencial de perda de produtividade devido à presença das

plantas daninhas é mais elevado do que outras pragas e doenças. Em média, 30 a 40% das

perdas em produtividade deve-se a interferência das infestantes (LORENZI, 2008).

Embora o azevém possa ser utilizado com uma espécie forrageira e

também para fornecimento de palha para o sistema de plantio direto, ele também pode se

constituir em uma planta daninha em culturas como o milho ou o trigo principalmente

(ROMAN et al., 2004), além de pomares especialmente no Rio Grande do Sul (VARGAS et

al., 2005). Dessa forma, o mesmo atua competindo com as culturas pelos recursos do meio

prejudicando assim suas produtividades. No caso do trigo, o grau de competição com o

azevém é intenso devido ambas as espécies serem morfologicamente e fisiologicamente

semelhantes e segundo Silva e Durigan (2006), quanto mais próximos forem essas

características, maior a competição pelos recursos do meio. Ainda, estudos demonstraram que

10

uma planta de azevém por metro quadrado, pode diminuir a produtividade da cultura do trigo

em 7,5 kg ha-1

(KISSMAN, 2007).

O florescimento e a frutificação das plantas de azevém ocorre no final

da primavera e segundo Piana et al. (1986), após a maturação fisiológica ocorre a abscisão das

sementes que, quando não colhidas, caem no solo permanecendo dormentes até o final do

verão quando iniciam a germinação. Esta característica de ressemeadura natural é útil para os

pecuaristas, porém pode ser ruim para os agricultores, pois ocasiona dificuldades no controle

desta espécie devido à mesma estar em diferentes estádios de desenvolvimento. Além disso,

são fontes de permanência em infestações futuras quando da utilização destas na prática de

rotação de cultura com cereais de inverno como cevada, centeio, trigo e triticale (ROMAN et

al., 2004).

O azevém é uma infestante da região sul do Brasil onde a época de

maior incidência ocorre entre as estações de outono-inverno não se constituindo em grande

problema nas culturas de verão. A dessecação ou o controle dessa espécie no sistema de

semeadura direta ou em pomares é feito de um modo geral com herbicidas não seletivos em

diferentes estádios de desenvolvimento e o herbicida glyphosate é o mais usado para este fim

sendo ele utilizado há longo tempo e repetidamente (CHRISTOFFOLETI; LÓPEZ-

OVEJERO, 2003).

4.3 Glyphosate: importância, características químicas e modo de ação

O glyphosate é o herbicida mais utilizado em todo o mundo e o seu

mercado tem crescido continuamente graças ao controle eficaz que exerce sobre as plantas

daninhas, aliado às características positivas quanto a aspectos toxicológicos, ecotoxicológicos,

facilidade de manuseio, custo relativamente baixo, aumento de produtividade, dentre outros

(GALLI, 2009; VELINI et al., 2009b). É um herbicida sistêmico, aplicado em pós-

emergência das plantas daninhas apresentando um amplo espectro de ação podendo controlar

76 das 78 infestantes mais agressivas (FRANZ, 1985; QUINN, 1993) e sendo registrado para

mais de vinte culturas (RODRIGUES; ALMEIDA, 2011).

Este herbicida é sintetizado a partir de um hidrogênio amínico do

aminoácido glicina por um radical éster fosfônico, o N-(fosfonometil) glicina. É muito pouco

solúvel em solventes orgânicos comuns e bastante solúvel em água. Além disso, possui um

coeficiente de adsorção elevado no solo e um coeficiente de partição octanol/água muito

11

baixo sugerindo que o glyphosate tem baixa mobilidade com pouca tendência para lixiviação

no solo (LINDERS et al., 1994; AMARANTE JR. et al., 2002). Apesar de ser bastante solúvel

em água (contribui em termos toxicológicos sendo rapidamente excretados pela urina e de

difícil acumulação em organismos vivos), há poucos riscos de contaminação de águas

subterrâneas devido à forte adsorção e rápida dissociação nos solos (AMARANTE JR. et al.,

2002; GIMSING; BORGGAARD; BANG, 2004; VELINI et al., 2012).

A degradação do glyphosate no solo pode ocorrer através de duas rotas

(Figura 1). A primeira consiste na transformação do glyphosate em sarcosina pela ação da

bactéria Agrobacterium radiobacter ou da Enterobacter aerogenes (enzima C-P liase). A

sarcosina entra no metabolismo destes microorganismos e em outros, degradando-se (DICK;

QUINN, 1995; FRANZ; MAO; SIKORSKI, 1997). Esta rota é pouco citada na literatura. A

segunda rota consiste na transformação do glyphosate em ácido aminometilfosfônico

(AMPA) sendo este mais persistente no solo do que o glyphosate, pois sua degradação é mais

lenta (COX, 1998).

Figura 1. Rotas de decomposição microbiológica do glyphosate. Fonte: Amarante Jr. et al.,

2002.

12

O glyphosate apresenta pouca volatilidade devido à sua baixa pressão

de vapor (7.5x10-8

mmHg) tendo como ponto de fusão 189,9°C. Devido ao grupamento ácido

fosfônico com uma ligação C-P bastante estável, este herbicida é muito resistente à hidrólise

química e também à fotodegradação em pH 5, 7 e 9. Sua meia-vida gira em torno de 35 dias

apresentando bastante estável na presença de luz, inclusive a temperaturas superiores a 60°C

(FRANZ; MAO; SIKORSKI, 1997).

Segundo Silva et al. (2005), a absorção de herbicidas envolve uma

rápida penetração inicial sobre a cutícula e em seguida ocorre absorção simplástica no qual

esse processo depende de diversos fatores tais como: idade da planta, condições ambientais,

entre outros. Logo que o herbicida é absorvido, deve ser translocado e atingir o sítio de ação

para que o mesmo atue prejudicando assim, o desenvolvimento da planta, ou seja, a

translocação é um processo vital para a eficácia do produto (WANAMARTA; PENNER,

1989; SATICHIVI et al., 2000). O glyphosate é lentamente absorvido pela cutícula onde há a

necessidade de um período de aproximadamente 6 horas sem chuva dependendo da

formulação utilizada para haver um controle satisfatório nas plantas suscetíveis

(RODRIGUES; ALMEIDA, 2011).

A penetração do glyphosate é mediada por proteínas de transporte de

fosfato presente na membrana (MERVOSH; BALKE, 1991). Proteínas transportadoras de

fosfato facilitaram a absorção de glyphosate nas membranas de Vicia faba (DENIS;

DELROT, 1993). Este herbicida se movimenta no floema seguindo a rota dos produtos

fotossintéticos partindo das folhas fotossinteticamente ativas para as partes em crescimento

(dreno), para a manutenção do metabolismo ou na formação de produtos de reserva como os

tubérculos (HETHERINGTON et al., 1999).

O mecanismo de ação do glyphosate é bastante singular porque ele é o

único herbicida capaz de inibir especificamente a enzima 5-enolpiruvilchiquimato 3-fosfato

sintase (EPSPs), que catalisa a reação de ligação do chiquimato-3-fosfato (S3P) com o

fosfoenolpiruvato (PEP), para formar 5-enolpiruvilchiquimato 3-fosfato (JAWORSKI, 1972;

ZABLOTOWICZ; REDDY, 2004). O glyphosate bloqueia então a via do ácido chiquímico,

que é a principal rota de produção dos aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina e

triptofano), afetando também o fluxo de carbono na planta, sendo que sob condições normais,

20% do carbono fixado pelas plantas são direcionados para esta rota (HASLAM, 1993). Com

a inibição da enzima EPSPs pelo glyphosate, é observado um grande acúmulo de ácido

13

chiquímico nas plantas, representando um forte dreno de carbono, desta forma, reduzindo a

fotossíntese (GOMES, 2011).

A via do ácido chiquímico está presente em bactérias, fungos, plantas e

parasitas do filo Apycomplexa e sintetiza metabólicos importantes para a vida desses

organismos (ARCURI et al., 2004). Consiste de sete enzimas que catalisam a conversão

sequencial de eritrose-4-fosfato (E4P) e fosfoenolpiruvato (PEP) em corismato, um precursor

dos aminoácidos aromáticos (CAMPBELL et al., 2004). Todos os intermediários da via

também podem ser considerados compostos com pontos de ramificações que podem servir

como substratos para outras vias metabólicas, além disso, a organização molecular e estrutural

das enzimas desta rota varia consideravelmente entre os grupos de microrganismos

(BENTLEY; HASLAM, 1990). A importância destas enzimas no metabolismo de organismos

mais simples e a sua ausência em mamíferos faz esta via um alvo potencial para o

desenvolvimento de herbicidas, neste caso o glyphosate (HERMAN; WEAVER, 1999).

A rota de formação do corismato (via do ácido chiquímico) está

representada na Figura 2. Inicialmente, ocorre uma condensação de dois metabólitos

fosforilados: fosfoenolpiruvato (PEP) e eritrose-4-fosfato (E4P). Através da enzima 3-deoxi-

d-arabino-heptulosonato 7-fosfato sintase (DAHPs), ocorre a formação do composto 3-deoxi-

d-arabino-heptulosonato 7-fosfato. A atividade de várias enzimas da via do chiquimato pode

mudar durante o crescimento e desenvolvimento normal das plantas. Os níveis de DAHPs

variaram durante o ciclo de desenvolvimento de células de cenoura aumentando durante a

formação de brotos bem como na germinação e formação de plântulas (WEAVER;

HERRMANN, 1997).

No segundo passo, ocorre a ação da enzima 3-desidroquinato sintase

(DHQs) formando o composto 3-desidroquinato (DHQ), resultando desta reação, a eliminação

do fosfato. Logo após, a desidroquinase desidratase catalisa a reação formando o metabólito

3-desidrochiquimato (DHS) e em seguida, a enzima chiquimato desidrogenase age formando

o chiquimato. No quinto passo, a chiquimato quinase catalisa a fosforilação do chiquimato

produzindo chiquimato-3-fosfato (S3P). Na próxima etapa, uma segunda PEP entra na rota, é

condensada com o S3P produzindo o composto 5-enolpiruvilchimato 3-fosfato (EPSP) e

fosfato inorgânico. Esta reação reversível é catalisada pela enzima EPSP sintase no qual o

glyphosate atua impedindo sua ação. Na última reação, ocorre a formação do corismato pela

ação da enzima corismato sintase onde a mesma elimina o fosfato da EPSP (ANDERSON;

JOHNSON, 1990; DEWICK, 1998; HERMAN; WEAVER, 1999).

14

Figura 2. Rota do ácido chiquímico. Fonte: Maeda e Dudareva, 2012.

A enzima que o glyphosate bloqueia é codificada no núcleo

desempenhando sua função no cloroplasto (WEAVER; HERRMANN, 1997; STAUFFER et

al., 2001), onde catalisa a ligação da reação dos compostos chiquimato-3-fosfato e o

fosfoenolpiruvato produzindo o enolpiruvilchiquimato-3-fosfato e fosfato inorgânico

(PETERSON et al., 1996). A mesma reage inicialmente com o S3P e depois com o PEP. O

glyphosate atua exatamente nesse ponto impedindo a ação da EPSPs prejudicando a formação

do corismato, além disso, a afinidade deste herbicida pelo complexo EPSPs-S3P, é setenta e

cinco vezes maior que a do PEP e sua velocidade de dissociação do sítio de ação é duas mil

vezes menor que a do PEP, ou seja, este herbicida é mais eficiente em se ligar e continuar

preso na reação (REAM et al., 1992). Outro fato que deve ser levado em consideração é que

as enzimas EPSPs podem diferir quanto à afinidade com o glyphosate de acordo com a

espécie envolvida. Fedtke e Duke (2004) encontraram valores diferentes em Pisium sativum e

em microorganismos.

O corismato, produto final da via do ácido chiquímico, é convertido por

cinco enzimas em prefenato, antranilato, aminodeoxicorismato, isocorismato e p-

hidroxibenzoato. Estes metabólitos compreendem os primeiros intermediários na biossíntese

de fenilalanina, tirosina, triptofano, folato, menaquinona, ubiquinona (Figura 3)

(DOSSELAERE; VANDERLEYDEN, 2001).

15

Figura 3. Corismato em destaque como precursor do (1) prefenato, (2) antranilato, (3)

aminodeoxicorismato, (4) p-hidroxibenzoato, (5) isocorismato. As enzimas

envolvidas são: (1) corismato mutase, (2) antranilato sintase, (3)

aminodeoxicorismato sintase, (4), corismato piruvato liase, (5) isocorismato

sintase. Fonte: Dosselaere e Vanderleyden, 2001.

De cada um dos aminoácidos aromáticos, são obtidos diversas

famílias de compostos envolvidos na regulação do crescimento ou na defesa da planta (Figura

4) tais como os taninos, antocianinas, ácido indol acético (AIA), lignina, entre outros que são

importantes para o desenvolvimento das mesmas, sendo assim, com a aplicação do

glyphosate, a formação desses produtos pode ser prejudicada (AMRHEIN et al., 1980;

ANDERSON; JOHNSON, 1990; HERMAN, 1995, VELINI et al., 2009a).

16

Figura 4. Aminoácidos aromáticos e alguns compostos fenólicos. Fonte: Velini et al., 2012.

Os taninos são compostos fenólicos que podem afetar o crescimento de

insetos, animais herbívoros e microrganismos através da precipitação de enzimas e proteínas e

são classificados em hidrolisáveis e condensados (BRYCE et al., 1993; SALMINEN et al.,

2001). Os taninos hidrolisáveis são formados a partir do chiquimato, já os condensados são

formados pela polimerização de unidade de flavonoides (OSSIPOV et al., 2003; MONTEIRO

et al., 2005; GARCÍA; CARRIL, 2009). Com o bloqueio da EPSPs causada pelo herbicida

glyphosate, ocorre um acúmulo de ácido chiquímico, um precursor dos taninos hidrolisáveis e

17

reduz a disponibilidade de fenilalanina, precursor dos taninos condensados. Nesse sentido,

não há como tirar conclusões gerais sobre o efeito do glyphosate sobre os taninos, os mesmos

devem ser analisados separadamente (VELINI, et al., 2009a).

A rota do ácido chiquímico é responsável pela maioria dos compostos

fenólicos nas plantas e a maioria desses compostos derivam do aminoácido aromático

fenilalanina. As antocianinas são flavonoides pigmentados responsáveis pela maioria das

cores das flores e frutos. Por isso são importantes na polinização e na dispersão de sementes

(GARCÍA; CARRIL, 2009).

O AIA é um importante regulador de crescimento e tem como um dos

seus precursores o aminoácido triptofano. Dentre suas várias funções, tem-se a elongação

celular, crescimento de caules e coleóptilos, dominância apical, formação de raízes laterais e

adventícias e produção de xilema (TAIZ; ZEIGER, 2006). A interferência de glyphosate na

síntese de AIA se dá quando se realiza a aplicação do glyphosate como maturador em cana-

de-açúcar, com quebra da dominância apical (morte ou não da gema apical) e brotação das

gemas laterais (VELINI et al., 2009a).

A lignina é um polímero altamente ramificado de fenilpropanóides.

Depois da celulose, é a substância orgânica mais abundante nas plantas. Encontra-se

covalentemente unida à celulose e a outros polissacarídeos da parece celular. É insolúvel em

água e na maioria dos solventes orgânicos sendo muito difícil de remover sem degradar.

Desempenha um papel estrutural fundamental, pois sua natureza química é a base da dureza

mecânica e rigidez que se manifesta nos troncos das árvores e caules lignificados. Ocorre na

parede celular de vários tecidos de suporte e de transporte, traqueídes e nos vasos do xilema.

Deposita-se principalmente na parede secundária, fortalece os caules e tecidos vasculares

permitindo o crescimento vertical e a condução de água e minerais através do xilema

(CABANÉ et al., 2004; GARCÍA; CARRIL, 2009).

Foram citados alguns exemplos de compostos que fazem parte da via do

ácido chiquímico no qual o herbicida glyphosate atua com o intuito de evidenciar a

importância da mesma. Segundo Velini et al. (2009a), os eventos pós inibição da EPSPs não

estão claramente estabelecidos e a morte das plantas pode não estar relacionados apenas com

o bloqueio dos aminoácidos aromáticos, pois a suplementação com esses aminoácidos não é

suficiente para reverter o processo. A morte das plantas pode estar relacionada à falha na

produção de vários compostos que derivam da rota; redução da síntese proteica e à

desregulação do fluxo de carbono.

18

4.4 Efeitos do glyphosate na fotossíntese

A fotossíntese é o principal processo bioquímico que ocorre em

organismos autotróficos e é conhecida por ser afetada por diversos fatores bióticos e

abióticos. Dentre os fatores bióticos pode-se citar os herbicidas. Alguns herbicidas afetam

diretamente a fotossíntese interrompendo o transporte de elétrons como o paraquat, um

inibidor do fotossistema I. Outros herbicidas como o glyphosate, afetam indiretamente através

da inibição da biossíntese de carotenoides, clorofila, ácidos graxos, etc. (OLESEN;

CEDERGREEN, 2010; GOMES et al., 2014). Como um inibidor competitivo, o glyphosate

bloqueia a via do ácido chiquímico inibindo a biossíntese de metabólitos secundários nas

plantas, incluindo compostos relacionados com a fotossíntese como as quinonas (DEWICK,

1998). No entanto, não está claro como o glyphosate leva às plantas a morte e hipóteses tais

como o esgotamento dos estoques de proteínas e drenagem de carbono a partir de outras vias

podem ser colocadas em questão (DUKE; POWLES, 2008). Vários trabalhos têm

demonstrado redução na taxa fotossintética após a aplicação do herbicida glyphosate

(MATEOS-NARANJO et al., 2009; YANNICCARU, et al., 2012; ZOBIOLE et al., 2012).

A clorofila e os carotenoides são os principais pigmentos relacionados à

eficiência fotossintética sendo responsáveis em absorver luz, fornecendo energia. O primeiro

passo da fotossíntese ocorre entre as membranas dos tilacóides através da excitação da luz

pelos pigmentos fotossintéticos. A partir daí, inicia o transporte de elétrons (TAIZ; ZEIGER,

2006). Alguns estudos têm demonstrado uma redução no teor de clorofila nas plantas após a

aplicação do glyphosate (ZOBIOLE et al., 2011; HUANG et al., 2012; KASPARY et al.,

2014). De acordo com Cakmak et al. (2009), o herbicida glyphosate pode impedir a

biossíntese de clorofila através da diminuição das concentrações de magnésio, que é

constituinte da mesma nas folhas reduzindo assim o teor de clorofila e a taxa fotossintética

(ZOBIOLE et al., 2012).

Reddy, Rimando e Duke, (2004) reportaram que os efeitos negativos do

herbicida glyphosate na biossíntese de clorofila depende da taxa de degradação do glyphosate

em AMPA, sendo ele, o responsável pelos efeitos negativos na biossíntese de clorofila,

porém, é um mecanismo pouco conhecido. No caso de plantas sem o contato com AMPA e

desprovida da glyphosate oxido-redutase (GOX) (enzima responsável pela degradação do

glyphosate em AMPA), o teor de clorofila pode ser reduzido pela ação do glyphosate pela

privação da assimilação de N que irá levar uma redução da produção de glutamato afetando a

19

biossíntese de clorofila e ALA (ácido aminolevulínico) (ZOBIOLE et al., 2011; SERRA et al.,

2013).

O glyphosate e o AMPA podem também afetar a fotossíntese

modificando o metabolismo do carbono nas plantas, assim, após a aplicação dos mesmos, a

capacidade de assimilação de CO2 é reduzida levando a um aumento da concentração

intracelular de CO2 reduzindo também a condutância estomática (MATEOS-NARANJO et

al., 2009; DING et al., 2011). Adicionalmente, a atividade da enzima Ribulose 1,5-bifosfato

carboxilase oxigenase (Rubisco) além dos níveis de Ribulose 1,5 bifosfato (RuBP) e do ácido

3-fosfoglicerato (PGA) podem ser reduzidos após a exposição ao glyphosate (SERVAITES;

TUCCI; GEIGER, 1987). De acordo com De María et al. (2006), houve redução de

aproximadamente 26% da atividade da rubisco em folhas de Lupinus albus sete dias após a

aplicação de 10mM de glyphosate.

O glyphosate também pode prejudicar o metabolismo do carbono

interferindo na translocação e metabolismo dos açúcares. Orcaray et al. (2012), encontraram

acúmulo de carboidratos em folhas e raízes de Pisum sativum tratadas com o herbicida

glyphosate. Como o crescimento foi interrompido, o acúmulo de carboidratos nas raízes foi

atribuído à falta de utilização dos açúcares disponíveis o que também causou acúmulo de

carboidratos solúveis nas folhas. Embora poucos estudos tem sido feitos sobre o efeito do

AMPA no metabolismo do carbono, mostrou-se uma redução no teor de açúcares solúveis em

plantas tratadas com este metabólito (SERRA et al., 2013).

Muitos estudos têm demonstrado uma relação do glyphosate com a

nutrição de N afetando a fixação ou assimilação do mesmo (ZABLOTOWICZ; REDDY,

2007; BELLALOULI et al., 2008; ZOBIOLE et al., 2012). Os efeitos do glyphosate no

metabolismo do nitrogênio têm sido estudados principalmente em soja, no qual a fixação

simbiótica de N representa de 40 a 70% da necessidade total de N pela planta

(ZABLOTOWICZ; REDDY, 2007). Este herbicida pode afetar através dos efeitos diretos nos

rizóbios simbiontes ou indiretamente afetando a fisiologia da planta hospedeira (ZOBIOLE et

al., 2010a).

Além das plantas, os microrganismos também possuem a enzima EPSPs

sendo assim, suscetíveis ao glyphosate (FISCHER et al., 1986). A inibição dessa enzima

desregula a rota o que resulta em um fluxo descontrolado de carbono e subsequentemente a

acumulação maciça de chiquimato e dos ácidos hidroxibenzóicos como o protocatecuico ou

gálico nas fontes como folhas e nódulos de leguminosas (SINGH; SHANER, 1998). O

20

acúmulo do ácido protocatecuico em nódulos de plantas afetadas pelo herbicida glyphosate

sugere uma possível translocação do herbicida para os nódulos. Esta hipótese foi reforçada

pela redução da atividade da enzima nitrogenase mostrada em Bradyrhizobium japonicum

(HERNANDEZ; GARCIA-PLAZAOLA; BECERRIL, 1999).

Os efeitos de AMPA na nodulação, fixação e assimilação de nitrogênio

ainda precisa ser mais estudado. Ding et al. (2011), não observaram qualquer efeito sobre os

parâmetros de nodulação como número de nódulos e peso seco ou na fixação de N. Isto

sugere que mesmo o AMPA sendo translocado para os nódulos, não causa toxidez aos

simbiontes envolvidos na fixação.

4.5 Fenilalanina amônia liase (PAL)

A Fenilalanina amônia liase (PAL) é uma das enzimas mais estudadas

em relação ao metabolismo secundário em plantas e um dos motivos, é que em um

determinado tecido, os níveis desta enzima podem variar significativamente em intervalos

relativamente curtos de tempo em resposta a uma grande variedade de estímulos (CAMM;

TOWERS, 1973). A primeira observação registrada do isolamento e reações da PAL foi

realizada por Koukol e Conn em 1961, demonstrando que a mesma catalisa uma reação que

converte a L-fenilalanina em ácido trans-cinâmico mais amônia:

L-fenilalanina ácido trans-cinâmico + NH3

Este processo é o primeiro passo da via do fenilpropanóide (Figura 5).

Figura 5. Via biossintética fenilpropanóide. Fonte: Du et al., 2009.

21

Os fenilpropanóides possuem como características um grupo fenol

sendo produzido pelo metabolismo secundário dos vegetais desempenhando várias funções

(TAIZ; ZAIGER, 2004). Dentre estas funções pode-se citar: suporte mecânico (lignina)

(WHETTEN; SEDEROFF, 1992), proteção contra estresses bióticos e abióticos

(antioxidantes) (DIXON; PAIVA, 1995), pigmentos como as antocianinas (HOLTON;

CORNISH, 1995), taninos (JONES, 1984), etc. Tem sido proposto que a PAL é uma enzima

chave na regulação da via biossintética que conduz a estes produtos finais (MACDONALD;

D’CUNHA, 2007). Estes compostos podem ser produzidos através de duas rotas

biogenéticas: a via do mevalonato, onde se inicia através da acetil-coenzima A e malonil-

coenzima ou pela via do ácido chiquímico (TAIZ; ZAIGER, 2004) no qual o glyphosate atua.

A PAL pode ser encontrada em plantas assim como em fungos e

leveduras e sua atividade é sensivelmente modificada em resposta a estímulos tais como

ferimentos, ataque de patógenos, irradiação ultravioleta, baixa temperatura, baixos níveis de

nitrogênio, fosfato, ferro, aplicação de herbicidas, etc (HAHLBROCK; GRISEBACH, 1979;

DUKE; HOAGLAND; ELMORE, 1980; DIXON; PAIVA, 1995).

Vários estudos têm demonstrado que o glyphosate afeta negativamente

o metabolismo secundário (HOAGLAND, 1980; LYDON; DUKE, 1989; ZOBIOLE et al.,

2010b) no qual a PAL tem função essencial. Como demonstrado na Figura 4, o glyphosate

inibe a enzima EPSPs prejudicando assim a formação dos compostos que virão

posteriormente na rota. Dentre estes compostos, estão os aminoácidos aromáticos no qual a

fenilalanina serve de substrato para a PAL. De acordo com as informações disponíveis, não

está totalmente definido como a regulação da via do ácido chiquímico ocorre e nem se os

sistemas são similares para todas as espécies de plantas.

Com a aplicação de glyphosate, ocorre a redução dos aminoácidos

aromáticos onde a fenilalanina serve de substrato para a PAL, consequentemente deveria

diminuir as concentrações desta enzima. Porém, Duke et al. (1980) observaram que a

aplicação de glyphosate reduziu as concentrações de tirosina e fenilalanina, mas elevou as

concentrações desta enzima. No mesmo experimento, a aplicação de inibidores da PAL

provocou redução dos níveis de trans-cinamato, porém aumentou os níveis de fenilalanina e

tirosina. Mobin et al. (2015), testando a atividade da PAL após a aplicação de glyphosate,

também concluíram o aumento da enzima. De acordo com estes autores, a indução da

atividade desta enzima em resposta a aplicação do glyphosate, pode ser vista como uma

tentativa para aumentar o fluxo de carbono nesta rota. Além disso, o excesso de amônia

22

observado em plantas tratadas com glyphosate pode ser devido ao aumento da atividade desta

enzima (HOWLES et al., 1996).

Esses resultados indicam que esta enzima é regulada não só pela

fenilalanina, mas também pelo produto da reação (ácido transcinâmico). De acordo com

Velini et al. (2009b), isto pode sugerir que nem sempre os produtos distantes do sítio de ação,

neste caso a enzima EPSPs, terão a sua produção bloqueada ou reduzida pelo glyphosate

devido a presença de sistemas de controle, que podem em parte, compensar a redução da

síntese de determinados compostos intermediários. Quanto menor o número de reações e

enzimas, no caso dos herbicidas, que separam um composto até o sítio de ação, maior a

possibilidade que os níveis deste produto sejam reduzidos devido à ação do produto.

Poucos autores atualmente tem demonstrado o efeito do glyphosate

nesta enzima tão importante na produção de compostos fenólicos e até o momento nenhum

deles comparou estes efeitos em plantas daninhas resistentes ao mesmo.

4.6 Resistência de plantas daninhas aos herbicidas

A utilização de herbicidas para o controle de plantas daninhas é um

método comum na agricultura possibilitando a obtenção de elevadas produtividades por

reduzir a interferência das infestantes nas culturas de interesse econômico. Atualmente, os

agricultores depositam muita confiança no controle químico das plantas daninhas, e essa

confiança deve-se, principalmente, ao fato de que este método tem sido muito eficiente

possuindo custo atrativo, estando prontamente disponível e profissionalmente desenvolvido

(AGOSTINETTO; VARGAS, 2009). Porém, o uso indiscriminado desses herbicidas

propiciou a seleção de muitos casos de resistência a tais compostos por diversas espécies

daninhas (BURNSIDE, 1992).

O fenômeno da resistência de plantas daninhas a herbicidas é conhecido

há vários anos e nos últimos tem gerado muitos interesses, pois houve introdução no mercado

de novos grupos químicos altamente eficientes, controlando as infestantes em baixas doses e

específicos quanto ao sítio de ação. Os principais efeitos deste fato são: restrição ou

inviabilização da utilização desses produtos, perdas de áreas de plantio, perdas de

rendimentos e qualidade dos produtos agrícolas, reaplicação de herbicidas, aumento de doses,

e com isso aumento nos custos e também um maior impacto ambiental (CHRISTOFFOLETI,

2008).

23

O primeiro relato de resistência de plantas daninhas aos herbicidas

ocorreu em 1957, quando foram identificados biótipos de Commelina difusa infestante na

cultura da cana-de-açúcar no Havaí resistente ao herbicida 2,4-D (HEAP, 2015). A partir daí,

os casos registrados vêm aumentando a cada ano. Atualmente existem 462 casos registrados

em todo o mundo composto por 248 espécies onde 144 são dicotiledôneas e 104

monocotiledôneas. Estes casos têm sido reportados em 86 culturas e em 66 países tendo a

cultura do trigo a maior quantidade de casos registrados (HEAP, 2015). Estima-se que, no

mundo, haja mais de cinco milhões de hectares de culturas com invasoras apresentando

alguma resistência (KISSMANN, 1996).

Segundo Maxwell e Mortimer (1994), o aparecimento das plantas

daninhas resistentes a herbicidas é um exemplo de evolução como consequência das

mudanças no ambiente provocada pelo homem e geralmente pode ser identificada quando

pelo menos 30% das plantas que se encontram, são resistentes. A teoria mais aceita para

explicar o desenvolvimento da resistência é a da seleção natural no qual diz que, em toda

população de planta daninha há biótipos resistentes preexistentes e devido a pressão de

seleção imposta pelo herbicida, os biótipos suscetíveis morrem permanecendo aqueles

resistentes que se reproduzem aumentando assim sua população (CHRISTOFFOLETI;

LÓPEZ-OVEJERO, 2004). O tempo para o surgimento de plantas resistentes varia de um

local para o outro, do herbicida utilizado e também da frequência de uso do mesmo

(MAXWELL; MORTIMER, 1994).

Uma planta é sensível a um herbicida quando o seu crescimento e

desenvolvimento são alterados como resultado da sua incapacidade em suportar a ação do

produto levando a mesma à morte. Já a resistência é a capacidade que um biótipo tem dentro

de uma determinada população em sobreviver a dose de registro do herbicida, onde em

condições normais controlaria os demais integrantes de uma população (CHRISTOFFOLETI,

2008; AGOSTINETTO; VARGAS, 2009). Sendo assim, há variações no perfil bioquímico e

fisiológico das plantas quando as mesmas são tratadas com herbicidas, neste caso o

glyphosate.

De acordo com Powles e Yu (2010), os fatores que afetam a evolução

da resistência podem ser divididos em genéticos (frequência do gene resistente, número de

genes resistentes e dominância do gene resistente); biológicos (tipo de fecundação,

capacidade de produção de sementes, longevidade do banco de sementes no solo e a

capacidade de movimentação da semente ou do pólen); herbicida (estrutura química, sítio de

24

ação e atividade residual) e operacional (dose do herbicida, habilidade do operador, fatores do

agroecossistemas). Porém, os três fatores principais que influenciam a resistência são: pressão

de seleção causada pelo herbicida, frequência inicial do gene resistente e a densidade da

planta daninha (CHRISTOFFOLETI; LÓPEZ-OVEJERO, 2008). Dentre os fatores, os

genéticos e os bioecológicos são de difícil manipulação pelo homem, porém de grande

importância na avalição do potencial de risco de resistência. Já os fatores agronômicos são

aqueles os quais podem ser manipulados pelo homem na implementação de estratégias de

manejo da resistência (CHRISTOFFOLETI; LÓPEZ-OVEJERO, 2008).

Dentro do conceito de resistência existem dois tipos: cruzada e

múltipla. A resistência cruzada se dá quando um biótipo é resistente a dois ou mais herbicidas

pertencentes a um mecanismo de ação enquanto que a resistência múltipla ocorre quando o

indivíduo é resistente a dois ou mais mecanismos de ação distintos. No caso da resistência

cruzada, dentro de um mecanismo de ação, um biótipo não necessariamente é resistente a

todos os grupos químicos pertencentes a este mecanismo podendo haver variação. Ainda,

pode haver variações no nível de resistência dentro de um mesmo grupo químico

(CHRISTOFFOLETI, 2008; AGOSTINETTO; VARGAS, 2009). Foram encontrados níveis

de resistência cruzada diferentes em Euphorbia heterophylla aos diferentes herbicidas

pertencentes ao grupo químico das imidazolinonas e sulfoniluréias, os quais fazem parte dos

herbicidas inibidores da ALS (XAVIER, 2014). Em relação a resistência múltipla existem

muitos trabalhos relatando a ocorrência deste fato sendo que o mesmo tem aumentado a cada

ano (HEAP, 2015). Neste caso, as alternativas de manejo são mais limitadas.

O surgimento de plantas daninhas resistentes é devido aos diferentes

mecanismos que conferem a resistência, sendo estes, relacionados a alteração ou não do local

de ação no qual o herbicida atua (POWLES; PRESTON, 2006). O mecanismo de resistência

causado pela alteração do local de ação pode ocorrer pela troca de um ou mais aminoácidos

na enzima alvo o que impede, o acoplamento adequado do herbicida, ou ainda, pode estar

relacionado com a super expressão da enzima alvo (POWLES; YU, 2010). Vários trabalhos

têm relatado este tipo de mecanismo (VILA-AIUB; NEVE; POWLES, 2005; TARDIF;

RACJAN; COSTEA, 2006; HOCHBERG; SIBONY; RUBIN, 2009; THIEL; KLUTH;

VARRELMANN, 2010). Quando o mecanismo não está relacionado a alteração do local de

ação, há uma dificuldade do herbicida em chegar em quantidades letais no ponto de inibição

impedindo sua ação completa. Neste caso, pode estar relacionados mecanismos como a

diminuição da absorção ou translocação, aumento da taxa de metabolismo ou sequestro do

25

herbicida (FENG et al., 2004; PEREZ-JONES et al., 2007; DINELLI et al., 2008; POWLES;

YU, 2010).

As espécies Lolium rigidum, Echinochloa crus-galli var. crus-galli e

Poa annua são as que apresentam o maior número de casos de resistência aos diferentes

herbicidas e seus sítios de ação com respectivamente 11, 10 e 9 casos registrados. Dentre os

sítios de ação, os inibidores da ALS, inibidores do PSII (triazinas) e inibidores da ACCase são

aqueles que apresentam o maior número de espécies de plantas daninhas resistentes com 151,

73 e 47 casos respectivamente. Os Estados Unidos da América é o país que mais apresenta

casos de plantas daninhas resistentes a herbicidas totalizando 154 (HEAP, 2015). O primeiro

caso de resistência de planta daninha a herbicida no Brasil foi registrado em 1993 no qual a

espécie Bidens pilosa mostrou-se resistente aos herbicidas inibidores da ALS e o primeiro

caso de resistência múltipla ocorreu em 2004 com a planta Euphorbia heterophylla resistente

aos inibidores da ALS e PPO. A partir daí, os casos registrados vêm aumentando sendo o

mais recente ocorrido em 2015 com a espécie Amaranthus palmeri resistente ao herbicida

glyphosate. Atualmente há no Brasil 35 biótipos com alguma resistência a herbicidas, dentre

estes, oito apresentam resistência múltipla a dois ou mais mecanismos de ação distintos.

Os principais custos da resistência de plantas daninhas a herbicidas

estão relacionados ao uso de herbicidas com mecanismos de ação diferentes e as perdas de

produtividade nas culturas de interesse econômico. A utilização de herbicidas alternativos

ocorre de acordo com o produtor variando assim seu preço, pois na maioria dos casos, existe

mais de uma opção de produto para o manejo das infestantes resistentes. De um modo geral, o

custo de controle em casos de resistência simples, pode variar entre US$ 1,56 a US$ 59,76 e

no caso de resistência múltipla US$ 7,81 a US$ 56,25 (VARGAS et al., 2013). Citando como

exemplo o estado do Rio Grande do Sul com uma área de aproximadamente 4 milhões de

hectares cultivados com soja e que 50% apresenta problemas com buva e azevém, os

prejuízos devido à resistência com a necessidade de utilizar herbicidas alternativos, estão

entre US$ 3,1 milhões e US$ 119,53 milhões por ano, sem contar o impacto ambiental

causado pela maior utilização de herbicidas (VARGAS et al., 2013).

Devido a não existir ou existir poucos herbicidas com mecanismos de

ação diferentes para o uso no controle de biótipos resistentes, o evento da resistência assume

grande importância a nível mundial. A ocorrência de resistência múltipla agrava ainda mais o

problema, pois são dois ou mais mecanismos que precisam ser substituídos. Dessa forma, o

26

controle de plantas resistentes fica seriamente comprometido, restringindo esta prática e

outros métodos menos eficientes (SILVA et al., 2007).

4.7 Resistência de plantas daninhas ao glyphosate

A biotecnologia moderna vem se mostrando primordial para assegurar a

competitividade dos países exportadores de alimentos em todo o mundo. O rápido

desenvolvimento de culturas geneticamente modificadas permitiu aos agricultores reduzir

seus custos elevando também os índices de produtividades. Antes da introdução dessa

tecnologia o herbicida glyphosate era aplicado uma vez ao ano aproximadamente na época de

pré-semeadura. A partir de 1996 com a introdução de culturas tolerantes ao glyphosate, o

mesmo, passou a ser utilizado mais vezes como no caso da cultura da soja sendo aplicado de

duas a três vezes por ciclo (VARGAS et al., 2007a). Isto leva a uma maior pressão de seleção

exercida pelo herbicida sobre as plantas daninhas favorecendo assim a ocorrência da

resistência. Este fato aliado à adoção de sistemas conservacionistas do solo além da

possiblidade de usar este herbicida em qualquer estádio fenológico das culturas contribui para

um elevado risco de aparecimento de espécies resistentes a este produto (CHRISTOFFOLETI

et al., 2009).

Os casos de plantas daninhas resistentes ao herbicida glyphosate podem

ser considerados recentes, pois até 1995 não existia registros no mundo sobre este fato

(HEAP, 2015). A partir de 1996 com o primeiro caso registrado por Jim Pratley e Christopher

Preston com Lolium rigidum resistente nas culturas de canola e cereais na Austrália, a

quantidade de espécies não controladas pelo mesmo vem aumentando. Atualmente no mundo,

existem 32 espécies resistentes ao herbicida glyphosate onde os EUA lideram com 15 casos

registrados (HEAP, 2015). No Brasil, o primeiro registro ocorreu em 2003 com Lolium

multiflorum resistente ao glyphosate em pomares e culturas anuais no estado do Rio Grande

do Sul (ROMAN et al., 2004), após isso, mais seis espécies foram registradas onde a última

foi o Amaranthus palmeri registrado em 2015 (HEAP, 2015).

Dentre os mecanismos básicos de resistência ao herbicida glyphosate

até o momento tem-se a alteração do local de ação. Este caso é tipicamente representado pela

substituição de um aminoácido afetando a interação do herbicida com a enzima alvo. O

primeiro caso reportado desse tipo de mecanismo ocorreu em biótipos de Eleusine indica na

Malásia devido à substituição do aminoácido prolina por uma serina na Pro-106 (Pro-106-Ser)

27

em uma região altamente conservada do gene EPSPs (LEE; NGIM, 2000). Baerson et al.

(2002), verificaram que a aplicação do glyphosate não induziu as plantas resistentes a

produzirem mais EPSPs pressupondo que o mecanismo de resistência relacionado fosse a

menor sensibilidade da enzima nessas populações. Posteriormente foram relatados

substituição pelos aminoácidos alanina e treonina na Pro-106 em biótipos de L. rigidum e E.

indica (NG et al., 2003; YU; CAIRNS; POWLES, 2007).

Estas substituições na Pro-106 conferem um modesto nível de

resistência ao herbicida glyphosate (POWLES; YU, 2010). Porém, substituições na Gly-96 ou

Thr-97, conferem alto nível de resistência reduzindo significativamente a afinidade da PEP

(ESCHENBURG et al., 2002; FRUNK et al., 2009).

A influência das mutações gênicas que conferem a resistência ao

glyphosate na adaptabilidade ecológica das plantas não está totalmente esclarecida. Existem

diversos estudos que evidenciam algumas diferenças (ISMAIL et al., 2002; PEDERSEN et

al., 2007; PRESTON et al., 2009) porém, nada evidente que comprove uma diminuição da

adaptabilidade ecológica dos biótipos resistentes.

Outro tipo de mecanismo que tem sido recentemente documentado está

relacionado à amplificação do gene. Este evento proporciona alta resistência ao herbicida

glyphosate e foi constatado em plantas de Amaranthus palmeri (GAINES et al., 2010). Neste

caso há um aumento no número de cópias da enzima EPSPs. Gaines et al. (2012),

demonstraram que pode haver hibridação interespecífica entre espécies do gênero

Amaranthus. Isto pode ter um grande impacto no manejo de plantas daninhas devido à

facilidade de dispersão do gene que codifica este tipo de resistência, podendo ser transferido

para várias espécies deste gênero dificultando assim o controle das mesmas.

Plantas com maior amplificação do gene EPSPs (53 vezes) mostraram

elevados níveis de resistência ao glyphosate enquanto àquelas que apresentaram menor

amplificação do gene EPSPs (21 vezes), dotaram de um nível mais baixo de resistência ao

glyphosate (VILA-AIUB et al., 2014).. Neste mesmo experimento, sem aplicação do

herbicida glyphosate, mas em condições competitivas, plantas exibindo até 76 vezes o gene

EPSPs amplificado, apresentaram altura e alocação da biomassa para os órgãos vegetativos e

reprodutivos semelhantes em comparação às plantas de A. palmeri sensíveis ao glyphosate

sem amplificação do gene (VILA-AIUB et al., 2014). Este fato denota uma semelhança na

adaptabilidade ecológica entre os biótipos resistentes e suscetíveis de A. palmeri. Esta é uma

28

informação muito valiosa no planejamento do manejo integrado de plantas daninhas

resistentes.

A translocação diferenciada do herbicida em determinadas plantas

também pode ser considerado um mecanismo de resistência. Em algumas espécies resistentes,

o glyphosate possui translocação restrita não permitindo assim, que o mesmo alcance o local

de sua ação. Desde o primeiro caso registrado de resistência ao herbicida glyphosate em

plantas de Lolium, a translocação restrita por toda a planta e raiz tem sido confirmada em

várias espécies de Lolium, Conyza, Sorghum halepense, etc. (WAKELIN; LORRAINE-

COLWILL; PRESTON, 2004; POWLES; PRESTON, 2006; YU et al., 2009; SHANER,

2009; GE et al., 2011; BOSTAMAM et al., 2012; VILA-AIUB et al., 2013; ADU-YEBOAH

et al., 2014; CARDINALI et al., 2015). Em experimento realizado na Austrália com

população de Lolium rigidum, a planta resistente mostrou padrão de translocação diferente da

suscetível. Neste caso, o glyphosate translocou-se mais para as raízes na população suscetível

enquanto que na resistente houve pouca translocação (LORRAINE-COLWILL et al., 2002).

Este tipo de mecanismo é mais comum em plantas do que a mutação na Pro-106 citada

anteriormente (POWLES; YU, 2010).

Experimentos usando ressonância nuclear magnética com o objetivo de

observar o glyphosate em células in vivo e compartimentos celulares identificaram pelo

menos dois tipos de mecanismos que resultaram em translocação restrita (GE et al., 2014). O

primeiro está relacionado ao sequestro do glyphosate acumulando-se no vacúolo, além disso,

o glyphosate não sai do vacúolo para o citoplasma pressupondo que o transporte através da

membrana seja unidirecional em todas as espécies estudadas até o momento (GE et al., 2013).

Neste mesmo experimento foi observado um acúmulo de 10 vezes mais glyphosate nos

vacúolos de biótipos resistentes de Conyza canadensis em relação ao biótipo suscetível.

Foi demonstrado que biótipos de C. canadensis resistentes após a

aplicação do glyphosate e em baixas temperaturas (8°C) tiveram o sequestro de glyphosate no

vacúolo inibido tornando-se suscetíveis ao mesmo (GE et al., 2011). Isto proporcionou uma

evidência inequívoca de que a resistência seria unicamente devido ao processo de sequestro

mostrando que as propriedades fisiológicas do mecanismo de resistência podem inverter a

resistência ao herbicida. Estudo realizado na Itália com L. multiflorum resistente em clima frio

e com aplicação de glyphosate, demonstrou que a maior parte da população resistente no qual

possuía também uma mutação na Pro-106, não se tornou sensível em baixa temperatura

(COLLAVO; SATTIN, 2012). Isto pressupõe que múltiplos mecanismos de resistência

29

podem contribuir para a magnitude global da resistência e nem todos os mecanismos são

sensíveis à temperatura (SAMMONS; GAINES, 2014).

Algumas espécies que apresentam translocação diferenciada como

mecanismo de resistência ao glyphosate possuem diferenças na adaptabilidade ecológica.

Biótipos de azevém sensíveis ao glyphosate acumularam maior quantidade de matéria seca,

maior quantidade de perfilhos por planta, maior número de inflorescências produzindo assim

maior quantidade de sementes. Outra questão interessante avaliada no mesmo experimento é

que o biótipo suscetível floresceu 19 dias antes do resistente completando o ciclo em média

25 dias antes (FERREIRA et al., 2009). Outros trabalhos também evidenciaram diferenças no

crescimento e desenvolvimento entre biótipos resistentes e suscetíveis de Lolium (PRESTON;

WAKELIN, 2008; PRESTON et al., 2009). Porém outros estudos não evidenciaram

diferenças ou apenas pequenas diferenças na adaptabilidade entre os biótipos resistentes e

suscetíveis (PEDERSEN et al., 2007; DAVIS et al., 2009; SHRESTHA et al., 2010).

De acordo com Michitte et al. (2007), há outros genes que podem

contribuir para uma menor penetração do herbicida na folha. Em biótipos de azevém

resistentes houve uma redução na penetração da folha após aplicação do glyphosate em torno

de 39% em relação aos biótipos suscetíveis (MICHITTE et al., 2007. Em experimento

realizado por Nandula et al. (2008), foi encontrado diferença de até 43% na redução da

penetração pelos biótipos resistentes.

Outro tipo de mecanismo envolvido está na diferença de metabolismo.

No solo e nas plantas, o principal metabólito do glyphosate é o ácido aminometilfosfônico

(AMPA) (REDDY et al., 2004). Em algumas plantas naturalmente tolerantes ao glyphosate

como Agropyron repens e Equisetum arvense este metabólito pode ser detectado

(COUPLAND, 1985; DYER, 1994). Na planta a metabolização do glyphosate em AMPA

pode ocorrer pela enzima GOX (glyphosate oxiredutase) onde o produto da reação pode ser

tóxico para aquelas que possuem EPSPs insensível a este herbicida (NANDULA et al., 2007).

O ácido aminometilfosfônico é considerado tóxico, mas menos ativo que o glyphosate

(REDDY; RIMANDO; DUKE, 2004). O mesmo foi encontrado em diversas culturas como

trigo, canola, ervilha, cevada, linho e soja tolerante ao glyphosate após a aplicação do mesmo

(CESSNA et al., 1994; 2000; 2002; DUKE et al., 2003). Arregui et al. (2003), detectaram

níveis de AMPA em folhas e sementes de soja tolerante ao glyphosate após a aplicação do

mesmo indicando a metabolização em seu produto.

30

Plantas resistentes ao glyphosate da espécie Ambrosia trifida tem

mostrado uma resposta diferente em relação aos mecanismos anteriormente citados. Folhas

maduras desta espécie, 12 horas após receber tratamento com o herbicida glyphosate,

apresentaram rápida necrose e morte das células (ROBERTSON, 2010). Neste caso a

translocação é bastante reduzida provavelmente devido a rápida necrose e a incapacidade do

glyphosate ser transportado a partir das folhas maduras. Ainda não se conhece geneticamente

e molecularmente o que exatamente causa este fenômeno e pesquisas futuras serão

importantes para elucidar tal fato.

Deve-se ressaltar que apesar dos mecanismos terem sido didaticamente

separados e esclarecidos, uma espécie pode possuir mais de um, e dentro desse contexto o

manejo se torna mais complexo pela dificuldade de alternativas no controle.

4.8 Azevém (Lolium multiflorum) resistente ao glyphosate.

O controle de azevém para formação de palha no plantio direto e em

pomares é comumente realizado com glyphosate. O número de aplicações em uma safra varia

de acordo com a cultura podendo ocorrer mais de cinco durante o ciclo produtivo no caso da

fruticultura (FERREIRA et al., 2009). Para culturas anuais existe maior número de herbicidas

com mecanismos de ação diferentes onde em geral os graminicidas pertencentes aos grupos

ariloxifenoxipropionatos e ciclohexanodionas controlam com eficiência o azevém, porém,

mesmo utilizando estes herbicidas para a dessecação, pode haver a necessidade de aplicar

glyphosate para o controle das dicotiledôneas.

A primeira constatação de azevém (Lolium multiflorum) resistente ao

herbicida glyphosate ocorreu em 2002 sendo identificado em pomares no Chile que recebiam

em média três aplicações por ciclo durante os últimos 10 anos (PERES; KOGAN, 2003).

Após isso, os casos vêm aumentando ao longo dos anos. Em relação ao Brasil, o primeiro

caso foi relatado por Roman et al. (2004), que identificaram biótipos de azevém resistente ao

glyphosate em lavouras de culturas anuais e em pomares.

O controle de azevém resistente ao glyphosate tem sido realizado com o

uso de graminicidas dependendo da cultura instalada sendo possível observar diferenças na

evolução dos sintomas e no período de controle tanto para os biótipos suscetíveis quanto para

os resistentes entre os diversos herbicidas utilizados sugerindo que o mecanismo que confere

a resistência ao glyphosate possa estar interferindo na atividade destes graminicidas

31

(VARGAS et al., 2005). Isto pode implicar em uma maior ou menor eficiência no controle de

acordo com o herbicida testado (HARKER; DEKKER, 1988). Powles et al. (1998), avaliaram

biótipos de Lolium rigidum resistente ao glyphosate e demonstraram que o mesmo apresentou

resistência cruzada ao herbicida diclofop (inibidor da ACCase) mostrando-se sensível ao

fluazifop e ao setoxydim (inibidores da ACCase).

Dentre os mecanismos de resistência identificados para Lolium

multiflorum podem-se citar a translocação diferenciada (FERREIRA et al., 2006a;

FERREIRA et al., 2008; GONZÁLES-TORRALVA et al., 2012a), mutações genéticas

(PEREZ-JONES et al., 2007; JASIENUIK et al., 2008; NANDULA et al., 2008) e

recentemente identificado, a amplificação do gene da EPSPs (SALAS et al., 2012; SALAS et

al., 2015).

Um fator que deve ser levado em consideração é que o azevém não só

adquiriu resistência ao glyphosate, mas também a outros herbicidas. Foram identificados

azevém com resistência múltipla ao glyphosate e aos inibidores da ACCase e ALS

(MARIANI et al., 2014). Este fato restringe o controle desta espécie pelo número reduzido de

herbicidas com mecanismos de ação distintos que podem ser menos eficientes e possuírem um

custo maior e ainda por cima serem mais fitotóxicos para as culturas. Os biótipos de azevém

resistentes ao herbicida glyphosate estão presentes em mais de 80% das lavouras de soja do

estado do Rio Grande do Sul e os que possuem resistência múltipla estão em mais de 30%. O

aumento da presença desta espécie nas lavouras comerciais associado à baixa perspectiva de

lançamento de novas moléculas herbicidas especificamente para o controle do azevém

representa um grande impacto econômico e técnico na agricultura brasileira (DIONISIO et al.,

2013).

32

5. MATERIAL E MÉTODOS

Foram realizados quatro estudos no Núcleo de Pesquisas Avançadas em

Matologia (NUPAM), pertencente ao Departamento de Produção e Melhoramento Vegetal da

Faculdade de Ciências Agronômicas (FCA) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de

Mesquita Filho” (UNESP) – Campus de Botucatu - SP. Foram semeados 3 populações de

azevém (Lolium multiflorum) sendo consideradas como suscetível (S), com suspeita de

resistência (R1) e resistente (R2) ao herbicida glyphosate.

5.1 Curvas de dose-resposta das diferentes populações de azevém

Esse estudo teve como objetivo quantificar a massa seca e analisar a

fitointoxicação das três populações S, R1 e R2. A população suscetível foi adquirida da

empresa Agrocosmos situada na cidade de Engenheiro Coelho - SP, a população com suspeita

de resistência foi colhida no campo experimental da empresa Arysta LifeScience situada na

cidade de Pereiras-SP e a população resistente foi obtida da Embrapa Trigo situada na cidade

de Passo Fundo - RS. Para tal, foram semeados as três populações citadas anteriormente em

vasos com capacidade de 0,5 L em substrato Carolina (Turfa de Sphagno, vermiculita

expandida, resíduo orgânico casca de arroz torrefada, calcário dolomítico, gesso agrícola e

fertilizante NPK) com pH 5,5. A semeadura foi realizada no dia 10 de setembro de 2014 e

duas semanas após foi feito desbaste das mesmas deixando duas plantas por vaso. O herbicida

foi aplicado no dia 17 de outubro de 2014 aos 37 dias após a semeadura quando as plantas se

encontravam com aproximadamente seis perfilhos (Figura 6).

33

Figura 6. Estádio das plantas de azevém no momento da aplicação dos tratamentos Botucatu -

SP, 2014.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualisado

(DIC) com oito tratamentos e quatro repetições. O produto comercial utilizado foi o Roundup

Original (360g e.a. L-1

). Os tratamentos testados estão apresentados na Tabela 1. Foram

realizadas avaliações visuais de controle das plantas aos 21 dias após a aplicação (DAA),

segundo escala percentual de notas, onde “0” corresponde a nenhum controle e “100”

significa a morte das plantas, conforme Sociedade Brasileira da Ciência das Plantas Daninhas

(1995). Aos 28 DAA foi coletada a parte aérea das plantas e colocadas em sacos de papel e

levadas para estufa de circulação forçada de ar a 60°C por três dias até que o material

atingisse peso constante para então a massa seca ser pesada em balança de precisão (0,0001g).

Tabela 1: Doses de glyphosate utilizados no experimento. Botucatu - SP, 2014.

Tratamentos Doses de glyphosate

4

(g e.a. ha-1

)1

Doses de glyphosate

(%)2

1 0 0

2 135 12,5

3 270 25

4 540 50

5 10803

100

6 2160 200

7 4320 400

8 8640 800 1 gramas de equivalente ácido por hectare

2 dados em porcentagem da dose recomendada

3 dose recomendada (3 litros por hectare)

4 Roundup Ready (360 g e.a. L

-1)

34

Para a pulverização dos tratamentos descritos na Tabela 1 foi utilizado

um pulverizador estacionário (Figura 7), instalado no NUPAM, constituído por estrutura

metálica que suporta a barra de pulverização, com 1,5 metros de largura, que se desloca por

uma área útil de 6,0 m2 no sentido do seu comprimento. A barra é tracionada por um conjunto

de motor elétrico e modulador de frequência, tornando possível o controle da velocidade de

trabalho da barra. A barra foi equipada com quatro pontas XR 11002 VS, espaçadas em 0,5 m

entre si, e dispostas a 0,5 m de altura em relação às plantas. A pressão de trabalho utilizada

pelo equipamento foi de 2,0 kgf cm-2

, com velocidade de 3,6 km h-1

e consumo de calda de

200 L ha-1

. No momento da aplicação a temperatura estava em 34,1°C com umidade relativa

de 36.

Figura 7. Pulverizador estacionário com as unidades experimentais. Botucatu - SP, 2014.

5.2 Efeitos do glyphosate na enzima fenilalanina amônia liase nas diferentes

populações

O objetivo dessa etapa do trabalho foi determinar a atividade da enzima

fenilalanina amônia liase (PAL) nas diferentes populações após a aplicação do glyphosate.

Neste estudo, foram instalados dois experimentos em épocas diferentes contendo populações

diferentes, porém da mesma espécie. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente

casualisado (DIC) com dois tratamentos (720 g e.a. ha-1

e 1080 g e.a. ha-1

) e quatro repetições

35

mais uma testemunha sem aplicação de cada população. O produto comercial utilizado foi o

Roundup Original (360 g e.a. L-1

).

No primeiro experimento utilizou-se sementes de populações

suscetíveis (S) e com suspeita de resistência ao herbicida glyphosate (R1). A semeadura foi

realizada no dia 05 de março de 2014 em vasos com capacidade de 1 litro contendo o mesmo

substrato descrito anteriormente. A aplicação do herbicida foi realizada no dia 17 de abril de

2014 com temperatura de 27,5°C e umidade relativa de 62%. O segundo experimento utilizou

sementes de populações suscetíveis (S) e com resistência ao herbicida glyphosate (R2). A

semeadura foi realizada no dia 9 de setembro de 2014 e a aplicação do herbicida foi feita no

dia 15 de outubro de 2014 com temperatura de 26,8°C e umidade relativa de 56%. Para ambos

os experimentos, duas semanas após a semeadura, foi realizado desbaste das plantas deixando

apenas quatro plantas por vaso. Após a aplicação dos tratamentos foram feitas coletas de todas

as folhas de cada unidade experimental as 12, 24, 48 e 72 horas após a aplicação (HAA).

Em cada coleta, as folhas foram lavadas com água destilada, após esse

processo foi retirado o excesso de água secando com papel toalha tomando o cuidado para não

romper as células ou danificar as folhas. Posteriormente, as folhas foram colocadas em sacos

plásticos, enroladas em papel alumínio, congeladas no nitrogênio líquido e armazenadas em

freezer -80°C para posterior análise da PAL (Figura 8).

36

Figura 8. Procedimento de preparo de amostra para PAL. Botucatu - SP, 2014.

Para a determinação da atividade da enzima PAL, foi utilizado o

método adaptado por Peixoto et al. (1999). Este trabalho foi realizado no Laboratório de

Análises Bioquímicas Vegetais do Departamento de Química e Bioquímica do Instituto de

Biociências, UNESP de Botucatu - SP. As amostras foram maceradas com nitrogênio líquido

no escuro e foram pesados 100 mg de cada unidade experimental. Posteriormente foram

adicionados 10 mL de tampão borato de sódio 0,1 M, pH 8,8 contendo 1,2 mL de β-

mercaptoetanol para cada 1000 mL de tampão borato e centrifugados a 18.836 g durante 25

minutos à 4°C. O processo de extração foi feito em triplicata, ou seja, para cada repetição

foram repetidos mais 3 vezes por amostra, totalizando 12 repetições por tratamento, sendo

37

assim, para cada amostra foram retirados 4 mL sendo colocado 1 mL por tubo de ensaio além

do branco da amostra. Foi acrescentado 1 mL de tampão borato 0,2 M, pH 8,8 e colocados em

banho-maria a 36°C por cinco minutos e acrescentado 1 mL de fenilalanina na concentração

de 1,652 gramas para cada 100 mL de água destilada. Ao final de 60 minutos, 100 μL de HCL

6N foram adicionados em cada tubo de ensaio com o objetivo de paralisar a reação e logo

após, feita a leitura de absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 290 nm

(Figura 9).

Figura 9. Procedimento de extração e quantificação da PAL. Botucatu - SP, 2014.

5.3 Efeitos do glyphosate na fotossíntese das diferentes populações

O objetivo desse estudo foi caracterizar alguns aspectos fisiológicos de

populações de azevém (Lolium multiflorum) suscetíveis e resistentes ao herbicida glyphosate

após a aplicação do mesmo. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente

casualisado (DIC) com dois tratamentos (720 g e.a. ha-1

e 1080 g e.a. ha-1

) e quatro repetições

38

mais uma testemunha sem aplicação de cada população. O produto comercial utilizado foi o


).

Foram instalados dois experimentos em épocas diferentes contendo

populações diferentes, porém da mesma espécie. No primeiro experimento foi utilizado

sementes da população que se mostrou suscetível e população resistente ao herbicida

glyphosate. A semeadura foi realizada no dia 9 de setembro de 2014 em vasos com

capacidade de 1 litro contendo o mesmo substrato descrito anteriormente. Duas semanas após

a semeadura, foi realizado desbaste das plantas deixando apenas quatro plantas por vaso. A

aplicação do herbicida foi realizada no dia 15 de outubro de 2014 com temperatura a 26,8°C e

umidade relativa de 56%. Após a aplicação foram realizadas avaliações ao 1, 3, 7, e 28 DAA.

O segundo experimento foi instalado no dia 4 de dezembro de 2014 onde foram semeadas

sementes de azevém suscetíveis (S) e com suspeita de resistência (R1). Duas semanas após a

semeadura, foi realizado desbaste das plantas deixando apenas quatro plantas por vaso. A

aplicação do herbicida foi realizada no dia 9 de janeiro de 2015 com temperatura a 26,5°C e

umidade relativa de 74,1%. As avaliações foram realizadas ao 1, 7 e 28 DAA. Aos 3 DAA

não foi realizada avaliação devido ao tempo estar totalmente nublado impossibilitando este

tipo de avaliação.

Para as determinações fisiológicas foi utilizado um medidor portátil

IRGA, modelo LI-6400 xt (LI-COR) (Figura 10). As variáveis analisadas foram: taxa de

assimilação líquida de CO2 (fotossíntese), condutância estomática, concentração interna de

CO2 e transpiração. Com essas variáveis pôde-se calcular a eficiência do uso da água (taxa de

assimilação líquida de CO2/transpiração), eficiência instantânea de carboxilação (rubisco)

calculada pela taxa de assimilação líquida de CO2/concentração interna de CO2.

Figura 10. IRGA modelo LI-6400. Botucatu - SP, 2014.

39

5.4 Avaliação dos teores de glyphosate, AMPA e compostos da rota do ácido

chiquímico nas diferentes populações

O objetivo desse estudo foi quantificar compostos alterados em

populações de azevém (Lolium multiflorum) suscetíveis e resistentes ao herbicida glyphosate

após a aplicação do mesmo. Os compostos analisados foram: glyphosate, AMPA (ácido

aminometilfosfônico), ácido chiquímico, ácido quínico, shiquimato-3-fosfato, os aminoácidos

aromáticos fenilalanina, tirosina e triptofano, ácido ferúlico, ácido coumárico e ácido cafeico.

Nessa etapa foram instalados dois experimentos em épocas diferentes contendo populações

diferentes, porém da mesma espécie. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente

casualisado (DIC) com oito tratamentos e quatro repetições. O produto utilizado foi o


). Os tratamentos testados estão apresentados na Tabela 1.

No primeiro experimento utilizou sementes das plantas suscetíveis (S) e

com suspeita de resistência ao herbicida glyphosate (R1). A semeadura foi realizada no dia 28

de novembro de 2013 em vasos com capacidade de 1 litro contendo o mesmo substrato citado

anteriormente. Duas semanas após a semeadura, foi realizado desbaste das plantas deixando

apenas quatro plantas por vaso. O herbicida foi aplicado no dia 9 de janeiro de 2014, quando

as plantas estavam no início do florescimento. No momento da aplicação a temperatura estava

em 26,4°C com umidade relativa de 69%. No segundo ensaio foi utilizado sementes da

população suscetível (S) e com resistência ao herbicida glyphosate (R2). A semeadura foi

realizada no dia 8 de setembro de 2014 e o herbicida foi aplicado no dia 29 de outubro de

2014, quando as plantas estavam no início do florescimento. No momento da aplicação a

temperatura estava em 24,8°C com umidade relativa de 52%.

Após a aplicação, foram realizadas coletas de todas as folhas

consideradas vivas (folhas verdes) de cada unidade experimental (vaso) aos 5, 11 e 28 dias

após a aplicação (Figura 11). As mesmas foram colocadas em sacos plásticos sendo lavadas

com 100 mL de água destilada por três vezes totalizando 300 mL com o intuito de remover o

glyphosate que permaneceu sobre a folha para analisar apenas o que foi absorvido e

metabolizado pela planta. Após a lavagem as folhas foram acondicionadas em sacos de papel

e colocadas em estufa de circulação forçada de ar, a 40°C, para que não ocorresse a

degradação dos compostos, por um período de 72 horas até que o material estivesse

totalmente seco.

40

Figura 11. Procedimentos da coleta das folhas. Botucatu - SP, 2014.

Após a secagem, as folhas foram maceradas com nitrogênio líquido e

colocadas em sacos de papel. A metodologia utilizada para extração dos compostos foi

proposta por Gomes et al. (2015). Após as amostras passarem pelos processos de secagem e

maceração, foi pesado 100 mg de cada amostra e colocadas em tubo “falcon” com capacidade

de 15 mL e adicionado10 mL de água acidificada a pH 2,5. Os tubos foram agitados para que

as amostras fossem misturadas com a água. Após esse processo, os tubos foram submetidos a

banho ultrassom durante 30 minutos a 45°C. Na sequência foram centrifugados a 10.595 g

durante 5 minutos a uma temperatura de 20°C e o sobrenadante coletado e filtrado em filtro

Millex HV (Millipore) 0,45 μm, com membrana durapore de 13 mm e acondicionados em vial

âmbar 9 mm (Flow Supply) com capacidade de 2 mL (Figura 12).

41

Figura 12. Procedimentos para extração dos compostos. Botucatu - SP, 2014.

Para a quantificação dos compostos foi utilizado um sistema LC-

MS/MS (Figura 13), composto por um Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (HPLC),

Shimadzu, modelo Proeminence UFLC, que combina análise ultra-rápida e excelente

performance de separação, com alta confiabilidade de resultados. Os métodos de análise para

todos os compostos foi realizado de acordo com Gomes et al. (2015).

42

Figura 13. Cromatógrafo Líquido (Prominence UFLC) acoplado ao espectrômetro de

massas (3200 Q TRAP) – LC-MS/MS.

5.5 Análise dos dados.

5.5.1 Curvas de dose-resposta das diferentes populações de azevém

Os dados de massa seca e controle foram submetidos a análise de

variância e aplicação do teste F a 5% de probabilidade. Sendo os efeitos significativos, os

dados foram ajustados ao modelo de regressão não linear do tipo log-logístico proposto por

Streibig et al. (1988):

𝑦 =𝑎

[1 + (𝑥𝑏)𝑐

]

Onde: y = porcentagem de controle ou massa; x = dose do herbicida (g

e.a. ha-1

); a, b e c são parâmetros da equação, sendo que a = assíntota entre o ponto máximo e

mínimo da variável, b = dose que proporciona 50% da assíntota (corresponde ao C50 ou GR50)

e c = declividade da curva. Baseado na equação logística, as curvas foram elaboradas com

auxílio do software estatístico Sigmaplot 12.0.

43

5.5.2 Efeitos do glyphosate na enzima fenilalanina amônia liase nas diferentes

populações

Os dados obtidos foram avaliados estatisticamente pela análise de

variância. A magnitude do efeito dos tratamentos frente ao erro experimental foi testada

através do teste F. Os valores de F foram considerados significativos ao nível de significância

de 5% (p<0,05). Quando alcançada a significância estatística, as médias de cada nível dos

fatores foram comparadas entre si através do teste t (LSD), ao nível de significância de 5%.

5.5.3 Efeitos do glyphosate na fotossíntese das diferentes populações

Para os resultados das variáveis fisiológicas foi estabelecido o intervalo

de confiança pelo teste t a 10% de probabilidade. Para determinar o intervalo de confiança, foi

utilizada a seguinte equação:

IC = (t x desvpad) / raiz nr, onde:

IC = intervalo de confiança;

t = valor de t tabelado, ao nível de 10% de probabilidade;

desvpad = desvio padrão;

raiz nr = raiz quadrada do número de repetições.

5.5.4 Avaliação dos teores de glyphosate, AMPA e compostos da rota do ácido


Para os dados referentes aos níveis dos compostos nos tecidos foliares

foi realizada a análise de variância dos dados pelo teste F e as médias foram comparadas pelo

teste t a 5% de probabilidade. Foi calculado o erro padrão das médias de quatro repetições e

plotados nos gráficos como barras verticais.

44

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Curvas de dose-resposta das diferentes populações de azevém

Os dados de porcentagem de controle bem como de massa seca da parte

aérea podem ser visualizados nas Figuras 14 e 15, respectivamente. De acordo com o

coeficiente de determinação (r2), os resultados mostraram ajustes próximos de 1 pelo modelo

proposto por Streibig et al. (1988). Observa-se que 25% da dose recomendada (270 g e.a. ha-1

)

foi suficiente para obter um controle acima de 80% na população S demonstrando assim, uma

grande suscetibilidade da mesma em relação ao herbicida glyphosate. Já para a população R1,

metade da dose recomendada (540 g e.a. ha-1

) foi capaz de proporcionar um controle acima de

80%. Apesar de estatisticamente as populações S e R1 serem diferentes, os valores tanto de

controle como de massa seca na dose recomendada (1080 g e.a. ha-1

) foram semelhantes, ou

seja, o glyphosate controlou ambas as populações eficientemente podendo as duas serem

consideradas suscetíveis ao mesmo.

Ao se obter o valor de C50 ou GR50, tem-se o fator de resistência

(F=R/S) no qual corresponde à quantidade de vezes em que a dose necessária para controlar

50% da população resistente é superior a que controla 50% da população suscetível

(CHRISTOFFOLETI; LÓPEZ-OVEJERO, 2008). De acordo com Saari et al. (1994), a

resistência pode ser confirmada quando o fator R/S for significativamente maior que 1,0.

Porém, a confirmação de um nível baixo de resistência é mais complexa. Quando ocorre um

caso deste tipo, é necessário fornecer um número maior de evidências. Este experimento foi

realizado em casa-de-vegetação e apesar de ter sido utilizado uma quantidade de doses

45

considerada ideal para obter resultados confiáveis, há a necessidade de fazer mais

experimentos principalmente no que se refere à condução em campo. Resultados semelhantes,

com herbicidas inibidores da ALS, foram encontrados por López-Ovejero et al. (2005), que

apesar do biótipo testado possuir um fator de resistência de 16,15, o mesmo foi

satisfatoriamente controlado na dose recomendada.

Quando uma população demonstra um elevado fator de resistência, ou

seja, doses dez vezes superiores à recomendada, não existem dúvidas de que a mesma é

resistente (CARVALHO; CHRISTOFFOLETI; LÓPEZ-OVEJERO, 2009). Porém, este caso

deve ser analisado de acordo com o herbicida em questão, pois o que pode ser considerado um

nível elevado de resistência para um, pode ser considerado baixo para outro. Os herbicidas

inibidores da ALS, ACCase e inibidores do fotossistema II, resultam de níveis extremamente

elevados de resistência, frequentemente maiores que 100 (GRESSEL, 2000), ou seja, são

considerados altos em relação ao herbicida glyphosate que possui fator de resistência

geralmente baixo apesar de YU et al. (2015), terem encontrado fator R/S de 182 em Eleusine

indica. Sendo assim, a população R2 pode ser considerada resistente ao herbicida glyphosate,

pois apresentou um elevado nível de resistência (Tabela 2).

Os resultados aqui mostrados corroboram com diversos autores

(ROMAN et al., 2004; VARGAS et al., 2005; FERREIRA et al., 2006b; SALAS et al., 2012).

As diferenças dos resultados entre os autores podem estar relacionadas com as condições

ambientais, diferentes formulações de glyphosate, condições de aplicação assim como o

crescimento das populações. O alto grau de resistência evidenciado na população R2 pode

indicar que o mecanismo de resistência envolvido pode ser resultante da ação de dois ou mais

mecanismos. Vários trabalhos têm reportado que a alteração na Pro106 juntamente com

translocação diferenciada ou outro mecanismo desconhecido, proporciona alto grau de

resistência que um mecanismo sozinho (KANDUM et al., 2011; BOSTAMAN et al., 2012;

NANDULA et al., 2013). Em outros casos, a duplicação de gene ou alteração no sítio de ação

foram detectados, mas não parece explicar totalmente os níveis mais elevados de resistência

(COLLAVO; SATTIN, 2012; BELL et al., 2013). A ocorrência de múltiplos mecanismos de

ação é comum, especialmente em espécies de polinização cruzada como a azevém,

produzindo maior nível de resistência em resposta à pressão de seleção imposta pela aplicação

constante do herbicida (SAMMONS; GAINES, 2014).

O manejo desta planta daninha deve ser fundamentado em herbicidas

com mecanismos de ação distintos, pois aumentar a dose de glyphosate não é

46

economicamente viável baseando-se na curva de dose-resposta, pois a aplicação de duas vezes

a dose recomendada, não foi suficiente para controlar esta população eficientemente.

A variável massa seca está em concordância com o que foi discutido

anteriormente. As populações S e R1 tiveram seus valores semelhantes na dose recomendada

sendo aproximadamente zero (Figura 15). Já a população R2 diferiu das mesmas provando

assim, seu grau de resistência (Tabela 3). Além disso, o dobro da dose não foi suficiente para

reduzir a massa seca desta população à zero. Apesar das populações S e R1 serem

consideradas suscetíveis, com o aumento da pressão de seleção ocasionado pelo uso constante

do herbicida glyphosate, a probabilidade de ocorrência da resistência é maior na população

R1 de acordo com os dados mostrados.

Doses de glyphosate (%)

10 100 1000

Cont

role

(%

)

0

20

40

60

80

100

120

R1

R2

S

Figura 14. Intoxicação das plantas de azevém suscetível (S) e resistente (R1 e R2) após a

aplicação de diferentes doses do herbicida glyphosate aos 21 DAA. O gráfico se

encontra em escala logarítma. Botucatu – SP.

Con

trole

(%

)

47


log-logístico para as populações de Lolium multiflorum em relação à porcentagem

de controle aos 21 DAA. Botucatu – SP.

Variável População a b (C50) c r² FR*

Controle (%)

R1 101,11 18,13

-2,04 0,99 1,99

R2 97,25 158,76 -3,74 0,99 17,39

S 100,01 9,13 -1,83 0,99

Equação do modelo: y=a/(1+((x/b)^c)) *Fator de Resistência=C50R/C50S


10 100 1000

Mas

sa s

eca

(%)

0

20

40

60

80

100

120

140

R1

R2

S

Figura 15. Massa seca da parte aérea das plantas de azevém suscetível (S) e resistente (R1 e

R2) após a aplicação de diferentes doses do herbicida glyphosate aos 28 DAA. O

gráfico se encontra em escala logarítma. Botucatu – SP.

48


log-logístico para as populações de Lolium multiflorum em relação à porcentagem

de massa seca aos 28 DAA. Botucatu – SP.

Variável População a b (GR50) c r² FR*

Massa seca

(%)

R1 6,29 18,34 2,23 0,99 1,76

R2 6,05 150,42 2,84 0,96 14,46

S 6,55 10,40 2,88 0,99 Equação do modelo: y=a/(1+((x/b)^c))

*Fator de Resistência=GR50R/GR50S

6.2 Efeitos do glyphosate na enzima fenilalanina amônia liase nas diferentes

populações

No primeiro experimento, a atividade da enzima fenilalanina amônia

liase (PAL) apresentou interação significativa as 12, 24 e 72 HAA não sendo observado efeito

significativo as 48 HAA (Tabela 4). Doze horas após a aplicação houve redução da atividade

da PAL com o aumento da dose para a população S, porém o mesmo não foi identificado para

a população R1, pois na dose mais elevada (1080 g e.a. ha-1

), apresentou atividade

significativamente maior. Ao comparar as populações dentro de cada dose, nas doses zero e

720 g e.a. ha-1

a população S apresentou valores superiores em relação à população R1,

porém, na maior dose, houve efeito contrário. Vinte e quatro horas após a aplicação houve

aumento da atividade da enzima fenilalanina amônia liase na dose de 720 g e.a. ha-1

em

relação à testemunha para a população R1 seguida de uma redução na maior dose sendo que

para S, não foi observado o mesmo efeito. Apesar de ambas as populações serem

consideradas suscetíveis de acordo com a curva de dose-resposta, nas duas maiores doses

testadas, a atividade da enzima PAL foi mais elevada para R1 em relação à S. Já as 72 HAA

não houve alteração significativa com o aumento da dose para R1 enquanto que para S a

aplicação de 720 g e.a. ha-1

proporcionou aumento da atividade da enzima PAL em relação à

testemunha seguido de uma redução na maior dose.

49


suscetível (S) e com suspeita de resistente (R1) coletadas as 12, 24 e 72 horas

após a aplicação do herbicida glyphosate. Botucatu - SP.

PAL (Absorbância min-1

g-1

)

Doses (g e.a. ha-1

)

População

S R1

12 horas

0 0,0648 Aa 0,0254 Bb

720 0,0528 Ba 0,0256 Bb

1080 0,0031 Cb 0,0365 Aa

F 155,4

CV% 12,72

DMS 0,006

Doses (g e.a. ha-1

) 24 horas

S R1

0 0,0321 Aa 0,0309 Ba

720 0,0367 Ab 0,0478 Aa

1080 0,0064 Bb 0,0345 Ba

F 29,00

CV% 12,27

DMS 0,005

Doses (g e.a. ha-1

) 72 horas

S R1

0 0,0343 Ba 0,0389 Aa

720 0,0583 Aa 0,0358 Ab

1080 0,0308 Ba 0,0308 Aa

F 6,45

CV% 21,18

DMS 0,012

*Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem estatisticamente pelo

teste t a 5% de probabilidade.

A atividade da enzima fenilalanina amônia liase apresentou interação

significativa as 12, 48 e 72 HAA e efeito simples de dose e população as 24 HAA no segundo

experimento (Tabela 5). Às doze horas após a aplicação não houve alteração significativa com

o aumento da dose para a população S enquanto que para R2 a aplicação de 720 g e.a. ha-1

proporcionou aumento da atividade da enzima PAL em relação à testemunha seguido de uma

redução na maior dose testada, porém semelhante à testemunha. Ao comparar as populações

dentro de cada dose, R2 demonstrou atividade mais elevada da enzima PAL em relação à

suscetível. Às vinte e quatro horas após a aplicação houve efeito simples de dose e população

50

sendo que a suscetível apresentou menor atividade da enzima fenilalanina amônia liase em

relação à resistente e as doses de zero e 720 g e.a. ha-1

foram estatisticamente semelhantes e

superiores à maior dose testada. 48 HAA foi observado aumento da atividade da PAL para

ambas as populações principalmente na dose de 1080 g e.a. ha-1

e novamente como às 12

HAA, à 720 g e.a. ha-1

a resistente apresentou valor superior em relação à suscetível. Já as 72

horas após a aplicação, R2 reduziu a atividade da PAL nas duas maiores doses enquanto que

para a população suscetível, apenas na dose de 1080 g e.a. ha-1

este efeito foi observado. Ao

comparar as populações em cada dose, nota-se que S demonstrou valor superior à 720 g e.a.

ha-1

.

51


suscetível (S) e Resistente (R1) coletadas as 12, 24, 48 e 72 horas após a

aplicação do herbicida glyphosate. Botucatu - SP.

PAL (Absorbância min-1

g-1

)

Doses (g e.a. ha-1

)

População

S R2

12 horas

0 0,0749 Aa 0,0727 Ba

720 0,0723 Ab 0,0809 Aa

1080 0,0790 Aa 0,0734 Ba F 4,71

CV% 6,41

DMS 0,007

População 24 horas

S 0,0676 B

R2 0,0751 A F 4,74

CV% 11,76

DMS 0,007

Doses (g e.a. ha-1

) 24 horas

0 0,0696 AB

720 0,0778 A

1080 0,0666 B F 3,85

CV% 11,76

DMS 0,008

Doses (g e.a. ha-1

) 48 horas

S R2

0 0,0596 Ba 0,0650 Ba

720 0,0641 Bb 0,0854 Aa

1080 0,0813 Aa 0,0849 Aa F 8,5

CV% 6,46

DMS 0,007

Doses (g e.a. ha-1

) 72 horas

S R2

0 0,0802 Aa 0,0834 Aa

720 0,0807 Aa 0,0612 Bb

1080 0,0626 Ba 0,0578 Ba F 11,31

CV% 6,83

DMS 0,007

*Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem estatisticamente pelo

teste t a 5% de probabilidade.

Apesar dos sintomas nas plantas tratadas com o herbicida glyphosate

aparecerem alguns dias após a aplicação, o mesmo não é válido quando se trata de enzimas.

Como pode ser observado nas Tabelas 4 e 5, doze horas após a aplicação, o herbicida

52

promoveu mudanças na atividade da enzima PAL. Apesar de ter sido utilizada a mesma

população considerada suscetível (S) para ambos os experimentos, as plantas não

apresentaram o mesmo comportamento após a aplicação do herbicida glyphosate, pois no

primeiro experimento houve redução da atividade da enzima fenilalanina amônia liase com o

aumento da dose, enquanto que no segundo, não foi observado diferenças entre as doses

aplicadas. Este fato pode ser considerado aceitável, pois, apesar de ser a mesma população, o

herbicida foi aplicado em épocas diferentes, ou seja, as plantas não estavam exatamente no

mesmo estádio fenológico. Além disso, como dito anteriormente, num determinado tecido, os

níveis da enzima PAL podem variar significativamente em intervalos relativamente curtos de

tempo em resposta a uma grande variedade de estímulos (CAMM; TOWERS, 1973).

Hoagland (1980), estudando a atividade desta enzima após a aplicação

de glyphosate em soja, demonstrou aumento da atividade entre 12 e 72 horas, porém, foi

utilizado apenas uma dose do herbicida e a soja não era tolerante ao glyphosate. Este

comportamento foi observado em outros trabalhos (DUKE; HOAGLAND, 1978; DUKE;

HOAGLAND; ELMORE, 1979; HOAGLAND; DUKE, 1982). O mesmo não ocorreu neste

experimento, pois ao longo do tempo, houve variação entre os valores de acordo com a dose

aplicada, época avaliada e população envolvida.

Em outro experimento, Hoagland, Duke e Elmore (1978), observaram

redução na atividade da enzima PAL 48 horas após a aplicação de glyphosate sendo esta

acompanhada pela redução das proteínas solúveis bem como os aminoácidos aromáticos

fenilalanina e tirosina em plântulas de milho. Porém quando se aplicou glyphosate em

Hemidesmus indicus, com o aumento da atividade da PAL, houve um amento no teor de

proteína (KUNDU; JAWALI; MITRA, 2012).

Em raízes de soja suscetíveis ao glyphosate, a atividade da PAL foi

significativamente diferente da testemunha com um aumento de aproximadamente 26%,

porém o mesmo não foi observado para a soja tolerante, neste caso, não houve diferença

significativa entre a testemunha e o tratamento (MARSHIOSI et al., 2009). Ainda neste

experimento, em associação com o aumento da atividade da PAL, ocorreu um acúmulo de

ácido chiquímico devido à inibição da EPSPs, resultando numa provável redução dos

aminoácidos aromáticos. De acordo com os autores, este aumento pode ser interpretado como

um efeito provavelmente relacionado com um distúrbio metabólico estressante causado pelo

herbicida ou pela depleção nos níveis dos produtos finais.

53

O aumento da atividade da enzima fenilalanina amônia liase tem sido

observado como um resultado do tratamento com glyphosate em soja (HOAGLAND; DUKE,

1983; HOAGLAND, 1990), porém com plantas consideradas suscetíveis ao herbicida. Tem

sido sugerido que este aumento é uma consequência secundária da redução da síntese de

certos compostos fenólicos que regulam esta enzima (HOLLANDER; AMRHEIN, 1980).

Estes resultados não se repetem para todas as espécies como reportado por outros autores

(HOAGLAND; DUKE; ELMORE, 1978; ISHIKURA; TAKESHIMA, 1984) nos quais

observaram inibição da PAL após exposição a este herbicida, resultados estes diferentes aos

aqui encontrado, pois tanto a população resistente como a suscetível, apresentaram variações

de acordo com a época avaliada e dose aplicada.

O excesso de amônia observado em plantas tratadas com o herbicida

glyphosate pode ser devido ao aumento da atividade da enzima PAL que catalisa a reação que

converte fenilalanina em ácido trans-cinâmico, liberando amônia (HOWLES et al., 1996). Em

experimentos com tabaco transgênico foi comprovado que a redução da quantidade de

aminoácidos aromáticos (efeito direto da ação do glyphosate) resultou num aumento do fluxo

através da via metabólica do chiquimato, o que levou um aumento na atividade da PAL bem

como uma duplicação dos níveis de ácido clorogênico, um composto polifenólico (GUILLET

et al., 2000). A interrupção do crescimento da planta pode ser causada não só pela redução

dos aminoácidos aromáticos, mas também pela toxicidade dos compostos fenólicos derivados

da rota ou pela toxicidade direta ocasionada pelo excesso de amônia (MICHALOWICZ;

DUDA, 2007).

Em experimento realizado por Mobin et al. (2015), foi observado que

com a aplicação de glyphosate, a atividade da PAL foi maior em relação à aplicação apenas

do aminoácido triptofano e em menor escala a fenilalanina, ou seja, o aumento do substrato

desta enzima (fenilalanina) não serviu para aumentar a atividade da mesma; o herbicida teve

uma capacidade maior em estimular tal efeito, fato este observado para a população R2. De

acordo com os autores, este resultado pode ser visto como uma tentativa para aumentar o

fluxo de carbono nesta via. Porém ainda há a necessidade de maiores estudos para tal

confirmação.

A indução de estresses em organismos vegetais promovidos por fatores

bióticos e abióticos resultam em resposta de defesa. A produção dos compostos de defesa é

desencadeada por enzimas no qual a PAL é a primeira e mais importante envolvida neste

processo (PASTÍROVÁ; REPCK; ELIASOVÁ, 2004; YAO; TIAN, 2005). Com a aplicação

54

de glyphosate a planta se encontra em estado de estresse, podendo este, estimular o aumento

da atividade desta enzima com o intuito de acionar os mecanismos de defesa da planta

protegendo assim a mesma. Este comportamento foi evidenciado principalmente para a

população R2. Além do glyphosate, o ataque de vírus em leguminosas promoveu uma rápida

elevação na atividade da PAL, estando esta atividade intimamente ligada ao estádio

fisiológico da planta (NUGROHO; VERBERNE; VERPOORTE, 2002).

Nota-se diferenças entre os valores encontrados por diversos autores no

comportamento da enzima PAL. Nem sempre ocorre um aumento linear da enzima após a

aplicação do glyphosate. Isto pode ser explicado pelas diferentes espécies utilizadas, estádio

fisiológico, momento de aplicação e quantidade do herbicida utilizado. Outro fator que pode

ainda contribuir nessa indefinição é a planta ser resistente ao herbicida. Foi demonstrado neste

experimento que mesmo a população sendo considerada resistente ao herbicida glyphosate,

pode ocorrer alterações significativas na atividade da enzima PAL podendo ser maior ou

menor em relação à testemunha de acordo com a dose aplicada e época avaliada. Porém, não

se pode afirmar se esse comportamento será o mesmo para as outras espécies consideradas

resistentes. Há a necessidade de maiores estudos.

6.3 Efeitos do glyphosate na fotossíntese das diferentes populações

6.3.1 Suscetível (S) x Resistente (R2)

No primeiro dia após a aplicação do herbicida glyphosate, a taxa de

assimilação de CO2 (A) (Figura 16) foi positiva para todos os tratamentos. Isto significa que

um dia não foi suficiente para que o glyphosate afetasse a fotossíntese independentemente da

planta ser sensível ou resistente ao mesmo. Este resultado é aceitável, pois este herbicida

possui uma ação lenta na planta apresentando sintomas dias após a aplicação. Imediatamente

após a sua absorção, o glyphosate é translocado juntamente com os fotoassimilados a partir do

local de aplicação (folhas) para os drenos (RODRIGUES; ALMEIDA, 2011), porém o tempo

necessário para que o mesmo comece a fazer efeitos significativos nas plantas depende de

diversos fatores como a retenção na folha, penetração e translocação para o sítio de ação

(KIRKWOOD; MACKAY, 1994).

Aos 3 DAA apenas as testemunhas (sem aplicação) permaneceram com

valores positivos, ou seja, além das plantas suscetíveis, as resistentes também apresentaram

valores negativos. Neste período, o glyphosate já começou a fazer efeito nas plantas. Este

55

caso indica que especificamente neste momento, as duas populações estavam respirando mais

do que fazendo fotossíntese reduzindo assim a capacidade em acumular massa. O glyphosate

pode afetar a fotossíntese reduzindo a atividade da rubisco e a síntese do ácido 3-

fosfoglicérico diminuindo a síntese de clorofila e também aumentar a taxa de respiração

celular (FLEXAS et al., 2005; AHSAN et al., 2008). A respiração é um processo importante

para as plantas, pois é partir desta reação que se produz energia na forma de ATP utilizando

os carboidratos produzidos na fotossíntese onde o mesmo pode ser utilizado na manutenção e

no desenvolvimento da planta (TAIZ; ZEIGER, 2006). O balanço entre a fotossíntese e a

respiração determina a quantidade de fotoassimilados necessários para o crescimento normal

da planta (GOMIDE; GOMIDE, 1999). Por isso, se algo prejudicar este balanço, pode haver

consequências negativas podendo levar à sua morte. De acordo com Yanniccari et al. (2012),

a redução na assimilação de CO2 é um bioindicador rápido e sensível ao efeito do glyphosate

comparado com outros como a fluorescência da clorofila.

Apesar de aos 3 DAA a população resistente estar respirando mais do

que fazendo a fotossíntese, aos 7 DAA a mesma se recuperou apresentando valores positivos.

Fato este não observado para a população considerada suscetível. Neste caso, a mesma

continuou a apresentar valores negativos. Em plantas suscetíveis, o glyphosate pode inibir a

síntese de clorofila e carotenoides considerados unidade básica fotossintética (ADRIANO et

al., 2013; KASPARY et al., 2014), reduz a assimilação de CO2 (DING et al., 2011) entre

outros. A consequência desses efeitos pode ser notada aos 28 DAA onde a população

suscetível foi completamente controlada pelo herbicida independentemente da dose aplicada

não sendo possível fazer medições. Já a população resistente permaneceu com valores

positivos semelhantes à testemunha resistente.

Resultados semelhantes foram encontrados por Santos et al. (2014), ao

avaliarem os efeitos do glyphosate na fotossíntese em buva resistente e suscetível a este

herbicida. Neste experimento, aos 3 DAA ambos os biótipos apresentaram redução na

assimilação de CO2 em relação à testemunha, resultado este que se estendeu até os 10 DAA,

porém aos 14 DAA apenas o resistente se recuperou. Um fato interessante é que neste

trabalho tanto os biótipos suscetíveis como os resistentes, não apresentaram valores negativos

independentemente da época de avaliação, diferentemente dos resultados aqui verificados.

A redução da assimilação de CO2 na população R2 mesmo que seja em

pouco tempo, pode ser considerada vantajosa em termos práticos, pois além de apresentar

uma redução na produção de carboidratos, ao se encontrar em competição com uma cultura, a

56

planta daninha pode ter seu crescimento reduzido. Dessa forma, a cultura poderá ter um maior

desenvolvimento sombreando assim a infestante dificultando seu crescimento. Silva et al.

(2014), constatou que houve redução na fotossíntese, condutância estomática e transpiração

em soja resistente ao glyphosate devido a interferência de buva resistente ao mesmo. Sendo

assim, qualquer manejo que possa dificultar o desenvolvimento da planta daninha, pode ser

benéfico para a cultura.


s-1


resistente após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 3, 7 e 28 DAA.

Testemunha suscetível (TS), testemunha resistente (TR), população suscetível


(S2), população suscetível submetida a 1080 g e.a.

ha-1


(R2), população



intervalo de confiança. Botucatu – SP.

*nd: não detectável.

Assim como na assimilação de CO2, a condutância estomática não sofreu

alterações significativas 1 DAA (Figura 17). Porém aos 3 DAA houve uma redução significativa

tanto para a população suscetível como a resistente se estendendo até 7 DAA. Yanniccari et al.

0

2

4

6

8

10

12

TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

ass

imila

ção

de

CO

₂ (μ

mo

lCO

₂.m

ˉ².s

ˉ¹)

Doses de glyphosate (L haˉ¹)

1 DAA

-20

-15

-10

-5

0

5

10

TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

ass

imila

ção

de

CO

₂ (μ

mo

lCO

₂.m

ˉ².s

ˉ¹)


3 DAA

-5

0

5

10

15

TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

ass

imila

ção

de

CO

₂ (μ

mo

lCO

₂.m

ˉ².s

ˉ¹)

Doses de glypgosate (L haˉ¹)

7 DAA

0

2

4

6

8

10

TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

ass

imila

ção

de

CO

₂ (μ

mo

lCO

₂.m

ˉ².s

ˉ¹)


28 DAA

nd* nd

57

(2012), notaram uma redução maior na condutância estomática em biótipos de L. rigidum

suscetíveis ao glyphosate em relação aos resistentes 7 dias após a aplicação do mesmo. A

fotossíntese e a respiração dependem do fluxo constante de CO2 e O2 entrando e saindo na

planta. Este fenômeno acontece através de estruturas denominadas estômatos no qual a abertura

e fechamento são essenciais para o balanço deste fluxo (MESSINGER; BUCKLEY; MOTT,

2006). Quando a planta se encontra em situação de estresse tende a fechar os estômatos como um

mecanismo de defesa contra a perda de água, aumentando assim a resistência, reduzindo a

condutância estomática (TAIZ; ZEIGER, 2006). Este fenômeno pode ser observado após a

aplicação de herbicidas. Alguns trabalhos têm evidenciado este efeito após a aplicação do

glyphosate (ZOBIOLE et al., 2010b; SILVA et al., 2014). Além disso, a condutância estomática

parece ser um biomarcador sensível para a resposta das plantas ao glyphosate (YANNICCARI et

al., 2012).

Zobiole et al. (2009), observaram que o fechamento estomático é um

fator importante que contribui para a assimilação de CO2, fato este observado neste

experimento. A redução da fotossíntese foi acompanhada pela redução na condutância

estomática. O CO2 é uma molécula essencial para que a fotossíntese aconteça, pois juntamente

com a água forma-se carboidratos que serão utilizados pela planta durante sua vida (TAIZ;

ZEIGER, 2006); qualquer fator que contribua para o decréscimo do mesmo afeta diretamente

a fotossíntese. A redução simultânea na condutância estomática e na assimilação de CO2 tem

sido observado por outros autores como Geiger et al. (1986), e Olesen e Cedergreen (2010).

Aos 28 DAA a população resistente apresentou condutância semelhante às testemunhas

demonstrando seu poder de recuperação.

A inibição da fotossíntese e a condutância estomática podem ser

causadas pela acumulação dos produtos finais da fotossíntese (YANNICCARI et al., 2012).

Orcaray et al. (2012), detectou acúmulo de glicose em folhas e raízes de Pisium sativum com

uma resposta rápida ao tratamento do glyphosate antes do declínio da fotossíntese.

58


s-1







(R2), população resistente


(R3). As barras verticais indicam o intervalo de

confiança. Botucatu – SP.


Observou-se 3 dias após a aplicação de glyphosate que houve um

aumento da concentração interna de CO2 (Ci) nas duas populações onde na suscetível a 1080

g e.a. ha-1

apresentou o maior valor (Figura 18). Este resultado foi semelhante ao encontrado

aos 7 DAA. Os resultados aqui mostrados corroboram com os encontrados por Mateos-

Naranjo et al. (2009) e Ding et al. (2011), nos quais observaram redução da assimilação de

CO2 acompanhado ao aumento da concentração interna de CO2 após a aplicação do herbicida

glyphosate.

Em Abutilon theophrasti medikus, Fuchs et al. (2002), evidenciaram

que a redução da condutância estomática foi acompanhada da redução da Ci após a aplicação

0

0,05

0,1

0,15

0,2

TS TR S2 S3 R2 R3

Co

nd

utâ

nci

a e

sto

mát

ica

(mm

ol(

H2

O).

mˉ²

.sˉ¹

)


1 DAA

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

TS TR S2 S3 R2 R3

Co

nd

utâ

nci

a e

sto

mát

ica

(mm

ol(

H2

O).

mˉ²

.sˉ¹

)


3 DAA

0

0,1

0,2

0,3

0,4

TS TR S2 S3 R2 R3Co

nd

utâ

nci

a e

sto

mát

ica

(mm

ol(

H2

O).

mˉ²

.sˉ¹

)


7 DAA

0

0,05

0,1

0,15

0,2

TS TR S2 S3 R2 R3Co

nd

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nci

a e

sto

mát

ica

(mm

ol(

H2

O).

mˉ²

.sˉ¹

)


28 DAA

nd* nd

59

de glyphosate onde aos 5 DAA chegou a zero, resultados contrários aos aqui observados. Em

plantas de feijão sob estresse hídrico, Jadoski (2012), mostrou uma correlação negativa entre

condutância estomática e concentração interna de CO2, ou seja, o comportamento dessas

variáveis depende do tipo de estresse no qual a planta sofre e também a espécie envolvida. A

concentração interna de CO2 na folha reflete a disponibilidade de substrato para a fotossíntese

onde durante as trocas gasosas os estômatos regulam essa concentração mantendo-a constante

(FARQUHAR; SHARKEY, 1982). Após sofrer estresse, a planta pode modificar o seu padrão

constante reduzindo ou amentando a Ci. Novamente aos 28 DAA, a população R2 apresentou

valores semelhantes à testemunha.


ar) em

plantas de azevém suscetível e resistente após a aplicação do herbicida glyphosate

ao 1, 3, 7 e 28 DAA. Testemunha suscetível (TS), testemunha resistente (TR),


(S2), população suscetível





indicam o intervalo de confiança. Botucatu – SP.


0

100

200

300

400

TS TR S2 S3 R2 R3Co

nce

ntr

ação

inte

rna

de

C

O₂

(μm

ol(

CO

₂).m

olˉ

¹ar)


1 DAA

0

200

400

600

800

TS TR S2 S3 R2 R3Co

nce

ntr

ação

inte

rna

de

C

O₂

(μm

ol(

CO

₂).m

olˉ

¹ar)


3 DAA

0

200

400

600

TS TR S2 S3 R2 R3Co

nce

ntr

ação

inte

rna

de

C

O₂

(μm

ol(

CO

₂).m

olˉ

¹ar)


7 DAA

0

100

200

300

400

TS TR S2 S3 R2 R3Co

nce

ntr

ação

inte

rna

de

C

O₂

(μm

ol(

CO

₂).m

olˉ

¹ar)


28 DAA

nd* nd

60

O glyphosate reduziu drasticamente a taxa de transpiração na população

suscetível aos 3 DAA em relação à testemunha (Figura 19). Porém o mesmo não foi observado

para a população resistente. Este comportamento se manteve até os 7 DAA onde aos 28 DAA a

população R2 apresentou valores semelhantes à testemunha. A transpiração é o processo de

perda de água pelo vegetal na forma de vapor através dos poros estomáticos onde ao mesmo

tempo permitem a entrada de CO2 (VAVASSEUR; RAGHAVENDRA, 2005). Dependendo do

tipo de estresse, a planta fecha os estômatos com o intuito de evitar a perda de água. Como foi

observado na Figura 17, após a aplicação do glyphosate ocorreu redução da condutância

estomática, com isso, os estômatos fecharam, dificultando a saída de água reduzindo assim a

transpiração.

Resultados encontrados por Zobiole et al. (2010b), também mostraram

uma redução na taxa de transpiração juntamente com a redução na condutância estomática em

soja resistente ao glyphosate após a aplicação do mesmo. Santos et al. (2014) mostraram que a

buva resistente ao glyphosate apresentou redução na taxa de transpiração porém apresentou

maiores valores que a suscetível em todos os períodos avaliados. A redução na taxa de

transpiração após a aplicação de glyphosate também foi observada por outros autores

(SHANER, 1978; SHANER; LYON, 1980; VARGAS et al, 2014).

61

Figura 19. Taxa de transpiração (μmol(H2O) m-2

s-1












A eficiência do uso da água (EUA) teve um padrão semelhante à

assimilação de CO2 (A) após a aplicação de glyphosate para as duas populações e em todas as

épocas avaliadas (Figura 20). A EUA é a quantidade de carbono fixado no processo

fotossintético pela quantidade de água perdida no processo de transpiração, ou seja, matéria

seca produzida por grama de água transpirada. Este fato explica o porquê desta variável

apresentar valores negativos. Sob condições normais, a planta abre seus estômatos permitindo

a saída de água na forma de vapor e ao mesmo tempo ocorre a entrada de CO2 no qual será

utilizado para a formação de carboidratos. Porém foi mostrado anteriormente que após a

aplicação do glyphosate houve uma redução na assimilação de CO2 e transpiração para ambas

0

2

4

6

8

TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

tra

nsp

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ão

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ol(

H₂0

).m

ˉ².s

ˉ¹)


1 DAA

0

2

4

6

8

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TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

tra

nsp

iraç

ão

(mm

ol(

H₂O

).m

ˉ².s

ˉ¹)


3 DAA

0

1

2

3

4

5

6

TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

tra

nsp

iraç

ão

(mm

ol(

H₂O

).m

ˉ².s

ˉ¹)


7 DAA

00,5

11,5

22,5

33,5

4

TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

tra

nsp

iraç

ão

(mm

ol(

H₂O

).m

ˉ².s

ˉ¹)


28 DAA

nd* nd

62

as populações, mas a resistente demonstrou seu poder de recuperação. Assim como o

esperado, as plantas consideradas suscetíveis foram mortas sendo que aos 3 DAA já

apresentaram valores negativos especialmente à 1080 g e.a. ha-1

. Já a população resistente

apesar de exibirem valores negativos aos 3 DAA, aos 7 DAA se recuperaram.

Vargas et al. (2014), não encontraram diferenças na EUA três dias após

a aplicação de glyphosate entre os biótipos de buva suscetíveis e resistentes ao mesmo. Porém

sete dias após houve uma grande diferença sendo que o biótipo resistente demonstrou maior

EUA mantendo valores significativamente iguais à testemunha até 14 dias após a aplicação.

Zobiole et al. (2010b), concluíram que soja resistente ao glyphosate reduziu a eficiência do

uso da água após a aplicação deste herbicida. Apesar de demonstrar redução da EUA, aos 28

DAA o azevém resistente apresentou valores semelhantes à testemunha. O uso eficiente da

água está diretamente relacionado ao tempo de abertura estomática, pois enquanto a planta

absorve CO2 a água é perdida por transpiração com intensidade variável seguindo uma

corrente de potenciais hídricos entre a folha e a atmosfera (PEREIRA-NETO, 2002). Ao

longo das avaliações, a população resistente assimilou CO2 e transpirou mais que a população

suscetível apresentando assim uma maior EUA.

Os dados apresentados neste experimento foram negativos para esta

variável apesar dos valores encontrados por outros autores terem sido positivos.

Provavelmente, este fato se deve ao grau de suscetibilidade e o tipo de espécie envolvida.

63


suscetível e resistente após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 3, 7 e 28

DAA. Testemunha suscetível (TS), testemunha resistente (TR), população


(S2), população suscetível submetida a 1080

g e.a. ha-1


(R2), população





Assim como a EUA, a eficiência de carboxilação teve um padrão

semelhante à assimilação de CO2 (Figura 21). Esta variável representa indiretamente a

atividade da rubisco (ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxygenase). Esta enzima é

responsável por incorporar o CO2 absorvido pelos estômatos na ribulose-1,5-bifosfato (RuBP)

no ciclo de Calvin (TAIZ; ZEIGER, 2006). Servaites et al. (1987), propuseram que o

glyphosate induz a depleção de carbono ou fosfato ou ambos do ciclo de redução do carbono

reduzindo a regeneração da RuBP e consequentemente a fotossíntese. Aos 3 DAA os

resultados mostraram que a regeneração da RuBP limitou a fotossíntese induzida pelo

glyphosate nas duas populações. Sob condições limitantes de regeneração da RuBP, a enzima

rubisco usa a RuBP mais rápida do que é sintetizada, dessa forma, a assimilação de CO2 não

0

0,5

1

1,5

2

TS TR S2 S3 R2 R3

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2

4

TS TR S2 S3 R2 R3

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do

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7 DAA

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TS TR S2 S3 R2 R3Efic

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l CO

₂ m

mo

lH₂O

ˉ¹

mˉ²

.sˉ¹

)


28 DAA

nd* nd

64

responde ao aumento da Ci (CAEMMERER; FARQUHAR, 1981). Este fato pode ser

observado neste experimento, pois, após a aplicação do herbicida glyphosate, houve um

amento da concentração interna de CO2 (Figura 18), porém a planta não aproveitou este

acontecimento sendo que A reduziu após a aplicação do mesmo (Figura 16).

Aos 7 DAA a população resistente voltou a ter valores positivos porém

bem menores que a testemunha especialmente a 1080 g e.a. ha-1

. Mesmo a população sendo

resistente, o glyphosate reduziu a eficiência de carboxilação. Resultados encontrados por De

Maria et al. (2006) em folhas de Lupinus Albus, mostraram uma redução de 26% na atividade

da rubisco cinco dias após a aplicação de glyphosate. Zobiole et al. (2010a), também

encontrou redução da atividade da rubisco em soja resistente ao glyphosate após a aplicação

do mesmo, com isso, houve redução da biomassa, pois a difusão do CO2 para o cloroplasto é

essencial para a fotossíntese. Aos 28 DAA novamente a população resistente mostrou

recuperação apresentando valores próximos à testemunha.

Uma das hipóteses que tem avançado para explicar o efeito do

glyphosate no metabolismo do carbono está relacionada ao fluxo de carbono para a via do

ácido chiquímico devido a desregulação da mesma. O efeito causado pelo glyphosate nesta

via conduz a uma acumulação de ácido chiquímico se tornando um dreno de carbono (DUKE;

POWLES, 2008). O arogenato é subproduto do corismato e inibidor da DAHP sintase,

primeira enzima da via do chiquimato (SIEHL, 1997). Segundo este autor, a inibição da

síntese de DAHP sintase pelo arogenato é a chave na regulação da via do chiquimato. Com a

inibição da enzima EPSPs causada pelo glyphosate há uma interferência na entrada do

carbono na via do chiquimato devido ao aumento da atividade da DAHP sintase (DEVINE;

BANDEEN; MCKERSIE, 1983). O aumento desta enzima se deve aos baixos níveis de

arogenato, pois a produção do seu precursor foi reduzida, assim a enzima continua atuando

provocando altos níveis de ácido chiquímico. A quantidade de ácido chiquímico acumulado

pela desregulação da rota representa um forte dreno de carbono devido ao desvio da eritrose-

4-fosfato que seria empregado na regeneração da ribulose-1,5-bifosfato reduzindo

drasticamente a fotossíntese (GEIGER et a., 1986; SERVAITES et al., 1987; SIEHL, 1997).

65


após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 3, 7 e 28 DAA. Testemunha

suscetível (TS), testemunha resistente (TR), população suscetível submetida a

720 g e.a. ha-1


(S3),







Como esperado, o herbicida glyphosate causou danos irreversíveis à

população suscetível onde aos 28 DAA em todas as variáveis analisadas a mesma já se

encontrava morta impossibilitando assim sua análise, porém foi mostrado que os efeitos deste

herbicida foram intensificados a partir do terceiro dia após a aplicação. No caso da população

resistente, aos 3 DAA nas variáveis analisadas, sofreu efeitos significativos em relação à

testemunha mostrando que mesmo apresentando um elevado grau de resistência, o herbicida é

capaz de afetar seu metabolismo. Porém, a partir dos 7 DAA a mesma evidenciou seu poder

de recuperação onde aos 28 DAA apresentou valores semelhantes à testemunha, ou seja,

00,005

0,010,015

0,020,025

0,030,035

0,04

TS TR S2 S3 R2 R3

Efic

iên

cia

de

car

bo

xila

ção

(

A/C

i)


1 DAA

-0,03

-0,02

-0,01

0

0,01

0,02

0,03

TS TR S2 S3 R2 R3

Efic

iên

cia

de

car

bo

xila

ção

(A

/Ci)


3 DAA

-0,02

-0,01

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

TS TR S2 S3 R2 R3

Efic

iên

cia

de

car

bo

xila

ção

(A

/Ci)


7 DAA

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

TS TR S2 S3 R2 R3

Efic

iên

cia

de

car

bo

xila

ção

(A

/Ci)


28 DAA

nd* nd

66

mesmo após a aplicação do glyphosate, estas plantas foram capazes de retornar a um estado

fisiológico semelhante àquelas que não receberam o produto.

Os resultados aqui encontrados dependendo da variável corroboraram

com alguns autores, porém diferiram de outros. Fatores como espécie envolvida, momento de

aplicação, grau de suscetibilidade das plantas, quantidade do herbicida aplicado entre outros,

podem explicar tal fato.

6.3.2 Suscetível (S) x Resistente (R1)

Como foi observado no experimento de curva de dose-resposta, essas

duas populações foram consideradas suscetíveis ao herbicida glyphosate. Em todas as

variáveis fisiológicas analisadas, ambas apresentaram o mesmo comportamento comprovando

assim o seu grau de suscetibilidade sendo que aos 28 DAA todas as plantas estavam mortas

impossibilitando assim a sua análise (Figuras 22, 23, 24, 25, 26 e 27). Apesar das populações

S e R1 serem consideradas suscetíveis, com o aumento da pressão de seleção ocasionado pelo

uso constante do herbicida glyphosate, a probabilidade de ocorrência da resistência é maior na

população R1 de acordo com os dados mostrados no experimento de curva de dose-resposta.

67


s-1


resistente após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 7 e 28 DAA.



(S2), população suscetível submetida a 1080 g e.a.

ha-1


(R2), população





0

5

10

15

20

TS TR S2 S3 R2 R3Taxa

de

ass

imila

ção

de

CO

₂ (μ

mo

lCO

₂ m

ˉ² s

ˉ¹)


1 DAA

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

ass

imila

ção

de

CO

₂ (μ

mo

lCO

₂ m

ˉ² s

ˉ¹)


7 DAA

0

2

4

6

8

TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

ass

imila

ção

de

CO

₂ (μ

mo

lCO

₂ m

ˉ² s

ˉ¹)


28 DAA

nd* nd nd nd

68


s-1


resistente após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 7 e 28 DAA. Testemunha

suscetível (TS), testemunha resistente (TR), população suscetível submetida a 720

g e.a. ha-1


(S3), população



g e.a. ha-1

(R3). As barras verticais indicam o intervalo de confiança. Botucatu –

SP.


0

0,1

0,2

0,3

0,4

TS TR S2 S3 R2 R3

Co

nd

utâ

nci

a e

sto

mát

ica

(mm

ol(

H2

O)

mˉ²

.sˉ¹

)


1 DAA

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

TS TR S2 S3 R2 R3

Co

nd

utâ

nci

a e

sto

mát

ica

(mm

ol(

H2

O)

mˉ²

.sˉ¹

)


7 DAA

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

TS TR S2 S3 R2 R3

Co

nd

utâ

nci

a e

sto

mát

ica

(mm

ol(

H2

O)

mˉ²

.sˉ¹

)


28 DAA

nd* nd nd nd

69


ar) em

plantas de azevém suscetível e resistente após a aplicação do herbicida glyphosate

ao 1, 7 e 28 DAA. Testemunha suscetível (TS), testemunha resistente (TR),


(S2), população suscetível





indicam o intervalo de confiança. Botucatu – SP.


0

100

200

300

400

TS TR S2 S3 R2 R3Co

nce

ntr

ação

inte

rna

de

CO

₂ (μ

mo

l(C

O₂)

.mo

lˉ¹a

r)


1 DAA

0

100

200

300

400

500

600

700

TS TR S2 S3 R2 R3

Co

nce

ntr

ação

inte

rna

de

CO

₂ (μ

mo

l(C

O₂)

.mo

lˉ¹a

r)


7 DAA

0

100

200

300

400

500

TS TR S2 S3 R2 R3

Co

nce

ntr

ação

inte

rna

de

CO

₂ (μ

mo

l(C

O₂)

.mo

lˉ¹a

r)


28 DAA

nd* nd nd nd

70

Figura 25. Taxa de transpiração (mmolH2O m-2

s-1


resistente após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 7 e 28 DAA. Testemunha

suscetível (TS), testemunha resistente (TR), população suscetível submetida a 720

g e.a. ha-1


(S3), população



g e.a. ha-1

(R3). As barras verticais indicam o intervalo de confiança. Botucatu –

SP.


0

2

4

6

8

10

TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

tra

nsp

iraç

ão

(mm

ol(

H₂0

).m

ˉ².s

ˉ¹)


1 DAA

0

2

4

6

8

10

TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

tra

nsp

iraç

ão

(mm

ol(

H₂0

).m

ˉ².s

ˉ¹)


7 DAA

0

2

4

6

TS TR S2 S3 R2 R3

Taxa

de

tra

nsp

iraç

ão

(mm

ol(

H₂0

).m

ˉ².s

ˉ¹)


28 DAA

nd* nd nd nd

71


suscetível e resistente após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 7 e 28 DAA.










0

2

4

6

8

TS TR S2 S3 R2 R3Efic

iên

cia

do

uso

da

águ

a (μ

mo

l C

O₂

mm

olH

₂Oˉ¹

mˉ²

.sˉ¹

)


1 DAA

-8

-6

-4

-2

0

2

4

TS TR S2 S3 R2 R3

Efic

iên

cia

do

uso

da

águ

a (μ

mo

l C

O₂

mm

olH

₂Oˉ¹

mˉ²

.sˉ¹

)


7 DAA

0

1

2

3

TS TR S2 S3 R2 R3

Efic

iên

cia

do

uso

da

águ

a

(μm

ol C

O₂

mm

olH

₂Oˉ¹

mˉ²

.sˉ¹

)


28 DAA

nd* nd nd nd

72


após a aplicação do herbicida glyphosate ao 1, 7 e 28 DAA. Testemunha

suscetível (TS), testemunha resistente (TR), população suscetível submetida a

720 g e.a. ha-1


(S3),







0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

TS TR S2 S3 R2 R3

Efic

iên

cia

de

car

bo

xila

ção

(A

/Ci)


1 DAA

-0,04

-0,02

0

0,02

0,04

0,06

TS TR S2 S3 R2 R3

Efic

iên

cia

de

car

bo

xila

ção

(A

/Ci)


7 DAA

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

TS TR S2 S3 R2 R3

Efic

iên

cia

de

car

bo

xila

ção

(

A/C

i)


28 DAA

nd* nd nd nd

73

6.4 Avaliação dos teores de glyphosate, AMPA e compostos da rota do ácido


Na Tabela 6 encontra-se a análise de variância dos dados e a diferença

mínima significativa entre as médias de cada um dos compostos analisados.

Tabela 6. Análise de variância e valores de diferença mínima significativa (DMS) para os

compostos analisados. Botucatu – SP.

5

DAA

11

DAA

28

DAA

5

DAA

11

DAA

28

DAA

5

DAA

11

DAA

28

DAA

Fenilalanina Tirosina Triptofano

CV (%) 18,72 10,08 15,91 14,95 14,24 14,72 14,57 12,44 16,17

F 9,84* 120,31* 74,18* 7,77* 36,63* 38,43* 4,00* 72,67* 43,85*

DMS 0,95 0,38 0,53 0,67 0,46 0,43 0,84 0,47 0,53

Glyphosate AMPA Ác. Chiquímico

CV (%) 34 133,38 55,53 50,18 203,30 134,44 10,33 21,78 16,37

F 3,12* 8,16* 37,49* 7,79* 9,12* 27.43* 8,34* 78,81* 168,7*

DMS 0,61 1,13 0,24 0,31 0,07 0,02 1,95 1,84 0,85

Ác. Quínico Ác. Ferúlico Ác. Cafeico

CV (%) 8,99 12,36 15,81 15,17 14,48 15,98 22,95 15,77 16,85

F 10,24* 209,73* 146,90* 11,30* 147,19* 187,95* 2,98* 30,57* 59,98*

DMS 1,65 1,05 0,89 0,52 0,46 0,41 0,28 0,10 0,11

Ác. Cumárico Shiquimato-3-fosfato Ác. Desidroshiquímico

CV (%) 20,27 43,26 63,31 28,36 40,42 27,35 41,91 13,93 16,26

F 2,86* 4,84* 2,50* 13,32* 12,14* 19,79* 3,43* 70,93* 68,96*

DMS 0,10 0,12 0,14 0,79 0,74 0,31 0,69 0,11 0,10

*Interação significativa.

Os níveis de glyphosate nas folhas apresentaram comportamento

semelhante nas três populações até a dose recomendada (100%) aos 5 DAA (Figura 28).

Observou-se um aumento dos teores de glyphosate entre as populações onde a R2 apresentou

maiores valores em relação à S e R1 nas doses subsequentes à recomendada. A absorção de

glyphosate nas plantas tem sido reportada em diversas espécies no qual geralmente é rápida

variando de 40% a 80% do total de herbicida aplicado dependendo da espécie envolvida

(LORRAINE-COLWILL et al., 2002). Hetherington et al. (1999), observaram que o milho

74

tolerante ao glyphosate absorveu 10% mais herbicida que o suscetível na maior dose testada.

Porém não houve diferença na absorção de glyphosate entre plantas de Beta vulgaris resistentes

e suscetíveis ao mesmo (GEIGER; SHIEH; FUCHS, 1999). Gomes (2014), testando várias

populações de Conyza spp., observou que a população considerada suscetível apresentou maiores

teores de glyphosate nas menores doses. Em Lolium rigidum Feng et al. (1999), não encontraram

diferenças na absorção entre os biótipos resistentes e suscetíveis ao glyphosate.

Aos 11 DAA na dose recomendada, a população S já estava morta não

sendo possível mensurar tal variável. Novamente, nesta dose não houve diferença entre as

populações R1 e R2, sendo que nas doses subsequentes devido ao seu grau de resistência,

xapenas na R2 foi possível medir os níveis de glyphosate. Observou-se que aos 28 DAA

somente para R2 foi possível detecta-lo nas folhas. Sob condições de temperatura mais altas,

no biótipo de buva resistente ao glyphosate, foi detectado 85% do total aplicado no vacúolo

enquanto que no suscetível foi de 15%, ou seja, o resistente foi mais eficiente em transportar o

herbicida através da membrana do tonoplasto, porém em temperaturas mais frias, houve

redução na eficiência do transporte para a população resistente (GE et al., 2011).

Ressalta-se que os valores de glyphosate mensurados aos 28 DAA

foram menores em relação às avaliações anteriores para a população R2. Possivelmente, a

planta já utilizou do seu mecanismo de resistência reduzindo assim a concentração de

glyphosate nas folhas.

75

5 DAA


100 1000

Gly

pho

sa

te (

g g

-1)

0

50

100

150

200

250

300

S

R1

R2

11 DAA


100 1000

Gly

pho

sa

te (

g g

-1)

0

100

200

300

400

500

S

R1

R2

28 DAA


100 1000

Gly

pho

sa

te (

g g

-1)

0

10

20

30

40

50

S

R1

R2

Figura 28. Níveis de glyphosate (μg g-1


DAA. Botucatu – SP.

Os níveis de AMPA tiveram comportamento semelhante aos de

glyphosate até a dose recomendada aos 5 DAA (Figura 29). O ácido aminometilfosfônico é o

76

principal metabólito do herbicida glyphosate sendo detectado naturalmente em plantas

tolerantes ao mesmo como Agropyron repens e Equisetum arvense (MONQUERO et al.,

2004). A reação que gera este produto, neste caso em folhas, pode ser catalisada pela enzima

glyphosate oxiredutase (GOX) podendo o mesmo ser tóxico inclusive para plantas que

possuem EPSPs insensível ao glyphosate (NANDULA et al., 2007).

Nas doses acima da recomendada a população R2 apresentou os

menores valores sendo próximos a zero. Este fato ajuda a explicar a resistência desta

população. O AMPA é um produto tóxico para a planta embora seja considerado menos ativo

que o glyphosate, quanto maior a sua quantidade, mais prejudicial é para a planta (REDDY et

al., 2004). A população R2, mesmo sendo considerada resistente, não metabolizou o

glyphosate em AMPA, ou seja, neste caso o mesmo permaneceu como molécula intacta,

porém, não houve morte das plantas. Provavelmente, o mecanismo de resistência envolvido,

não está relacionado à diferença no metabolismo, pois mesmo apresentando maior quantidade

de glyphosate em relação às populações suscetíveis, a população resistente não metabolizou

no seu produto.

Reddy et al. (2008) sete dias após a aplicação do herbicida glyphosate

observaram diferenças nos níveis de AMPA em soja tolerante ao glyphosate em relação à

suscetível onde esta apresentou os maiores valores. Porém, teve espécies no qual não foi

detectado este metabólito como o caso de Lolium multiflorum e também em milho tolerante e

suscetível ao glyphosate. Gonzales-Torralva et al. (2012b), observaram diferenças no

metabolismo do glyphosate entre biótipos de C. canadensis no qual detectaram AMPA 72

horas após a aplicação nos biótipos resistentes enquanto que nos suscetíveis não foi detectado,

ou seja, o resistente possuiu um metabolismo mais rápido reduzindo assim a quantidade de

glyphosate que alcançaria o sítio de ação.

Aos 11 e 28 DAA na dose recomendada, os níveis de AMPA

encontrados foi zero para as populações R1 e R2 sendo possível detectar o composto apenas

nas doses subsequentes a 100% para a população considerada resistente, porém em

quantidade muito inferior às visualizadas aos 5 DAA. Em algumas espécies o glyphosate é

metabolizado sendo em outras, encontrado como uma molécula intacta. A inabilidade em

detectar metabólitos nas plantas não significa que não houve metabolismo. A perda do

glyphosate não significa degradação, pois este herbicida é conhecido por ser exsudado das

raízes e folhas tratadas na forma de molécula intacta (RODRIGUES et al., 1982;

MONQUERO et al., 2004). As diferenças nos resultados descobertos por diversos autores

77

variam por diversas razões tais como espécie envolvida, época de avaliação, dose aplicada,

tipo de mecanismo de resistência envolvido, etc.

5 DAA


100 1000

Am

pa

(g

g-1

)

0

5

10

15

20

25

30

S

R1

R2

11 DAA


100 1000

Am

pa

(g

g-1

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

S

R1

R2

28 DAA


10 100 1000

Am

pa

(g

g-1

)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

S

R1

R2

Figura 29. Níveis de Ampa (μg g-1


Botucatu – SP.

78

Os níveis de ácido chiquímico estão representados na Figura 30. Aos 5

DAA nas populações consideradas suscetíveis, houve aumento deste composto de acordo com

o aumento da dose. Já para a população resistente os valores permaneceram constantes. Esses

resultados foram semelhantes nas 3 épocas de avalição. Aos 11 e 28 DAA as plantas

suscetíveis não apresentaram o mesmo comportamento. Este resultado é esperado já que

neste momento as plantas suscetíveis já estavam com sintomas avançados do efeito do

herbicida onde a população S já havia morrido na dose recomendada. Talvez estas duas

épocas de avaliação não seja o momento ideal para medir tal variável. Santos et al. (2014),

avaliando o efeito do glyphosate sobre o acúmulo de ácido chiquímico em plantas de C.

sumatrensis observaram que até aos sete dias após o tratamento foi observado acúmulo deste

composto sendo que a partir deste momento houve redução dos valores até 14 DAA. O

acúmulo de ácido chiquímico em tecidos ocorre pela inibição competitiva da EPSPs pelo

glyphosate (BRESNAHAN et al., 2003).

Diversas literaturas citam o aumento da concentração de ácido

chiquímico após a aplicação do herbicida glyphosate em plantas suscetíveis, porém o mesmo

não é observado para as resistentes. Zelaya et al. (2011), observou acúmulo de ácido

chiquímico após a aplicação de glyphosate em soja suscetível ao mesmo. Conforme aumentou

a dose deste herbicida, houve um grande acúmulo deste ácido em Corydalis sempervirens

(AMRHEIN et al., 1983). Pline et al. (2002), observaram que as variedades suscetíveis de

algodão acumularam ácido chiquímico após a aplicação de glyphosate, porém nas variedades

resistentes o mesmo não foi verificado onde os níveis não se alteraram. Estes resultados

corroboram com os aqui encontrados reforçando a hipótese de que as populações S e R1 são

suscetíveis e R2 resistente. Resultados semelhantes foram encontrados por outros autores

(NANDULA at al., 2007; REDDY et al., 2008; CARVALHO; ALVES, 2012).

O acúmulo de ácido chiquímico em resposta ao glyphosate tem sido

utilizado como um biomarcador rápido e preciso na suscetibilidade das plantas ao mesmo

(MULLER et al., 2003; GONZALES-TORRALVA et al., 2010). Sendo assim, numa espécie

com reduzido acúmulo deste ácido, provavelmente haverá a necessidade de uma grande

quantidade deste herbicida para ser letal (GOMES, 2014). Novamente este fato reforça a

hipótese de R2 ser resistente, pois, oito vezes a dose recomendada de glyphosate não foi

suficiente para matar 100% desta população.

79

5 DAA


100 1000

Ácid

o c

hiq

uím

ico

(g

g-1

)

0

1000

2000

3000

4000

5000

S

R1

R2

11 DAA


100 1000

Ácid

o c

hiq

uím

ico

(g

g-1

)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

S

R1

R2

28 DAA


100 1000

Ácid

o c

hiq

uím

ico

(g

g-1

)

0

200

400

600

800

1000

S

R1

R2

Figura 30. Níveis de ácido chiquímico (μg g

-1) em plantas de azevém S, R1 e R2 aos 5, 11

e 28 DAA. Botucatu – SP.

80

Os níveis de ácido quínico tiveram um padrão semelhante aos do ácido

chiquímico. Aos 5 DAA foi registrado um aumento nos valores deste composto com o

aumento das doses do herbicida para as populações S e R1 enquanto que para R2 foi

observado constância nos valores demonstrando um leve aumento nas doses subsequentes à

recomendada (Figura 31). Aos 11 DAA novamente foi notado aumento dos níveis de acordo

com o acréscimo das doses para as populações consideradas suscetíveis sendo observado um

leve aumento nas maiores doses para a população resistente onde aos 28 DAA este aumento

foi mais pronunciado.

Em experimento realizado por Gomes (2011), foi observado acúmulo

de ácido quínico após a aplicação de glyphosate em plantas de milho na maior dose testada.

Este aumento ocorreu até seis dias após a aplicação sendo notado decréscimo a partir dos 10

dias. No mesmo experimento, o autor encontrou alta correlação com o ácido chiquímico

sendo a concentração deste, quatro vezes superior à do ácido quínico, resultados diferente dos

aqui encontrados, pois os valores das variáveis em questão foram semelhantes.

O ácido quínico possui estrutura semelhante ao ácido chiquímico sendo

precursor dos hidroxibenzóicos. O acúmulo de ácido quínico após a aplicação de glyphosate

pode ser devido ao acúmulo de compostos acima da EPSPs na rota, como ocorre para os

ácidos chiquímicos, protocatecúico e gálico (ORCARAY et al., 2010). Como dito

anteriormente, o acúmulo de ácido chiquímico pode ser utilizado como biomarcador preciso e

rápido na suscetibilidade das plantas ao glyphosate, sendo assim, o ácido quínico também

pode ser considerado com a mesma função.

81

5 DAA


100 1000

Ácid

o q

uín

ico

(g

g-1

)

0

1000

2000

3000

4000

5000

S

R1

R2

11 DAA


100 1000

Ácid

o q

uín

ico

(g

g-1

)

0

500

1000

1500

2000

2500

S

R1

R2

28 DAA


100 1000

Ácid

o q

uín

ico

(g

g-1

)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

S

R1

R2

Figura 31. Níveis de ácido quínico (μg g-1



82

A concentração de shiquimato-3-fostato se manteve constante em todas

as doses aplicadas para as populações consideradas suscetíveis enquanto que para a resistente

foi observado aumento nas doses subsequentes à recomendada aos 5 DAA (Figura 32). O

mesmo comportamento ocorreu nas outras épocas de avaliação. Estes resultados são

interessantes devido ao fato de que para a população suscetível este composto deveria

aumentar com a aplicação de glyphosate, pois com a inibição da enzima EPSPs ocorre

acúmulo dos compostos acima da rota como o ácido chiquímico e shiquimato-3-fostato. Os

efeitos fitotóxicos causados por este herbicida é um resultado principalmente da acumulação

destes metabólitos (JENSEN, 1985; LORRAINE-COLWILL et al., 2002; ZABLOTOWICZ;

REDDY, 2004).

83

5 DAA


100 1000

Chiq

uim

ato

3 fo

sfa

to (

g g

-1)

0

100

200

300

400

500

600

700

S

R1

R2

11 DAA


100 1000

Chiq

uim

ato

3 fo

sfa

to (

g g

-1)

0

50

100

150

200

250

300

S

R1

R2

28 DAA


100 1000

Chiq

uim

ato

3 fo

sfa

to (

g g

-1)

0

20

40

60

80

100

S

R1

R2

Figura 32. Níveis de chiquimato-3-fosfato (μg g-1

) em plantas de azevém S, R1 e R2 aos 5,

11 e 28 DAA. Botucatu – SP.

84

Na Figura 33, são encontrados os níveis de fenilalanina nas diferentes

populações. Nota-se que aos 5 DAA houve redução deste aminoácido conforme aumentou-se

as doses para S e R1. Porém, o mesmo não foi observado para a população considerada

resistente onde os níveis permaneceram constantes. A enzima EPSPs catalisa a condensação

do ácido chiquímico com o piruvato para formar o corismato, na síntese dos aminoácidos

aromáticos no qual a fenilalanina faz parte (VARGAS et al., 2007b). O glyphosate atua

especificamente nesta enzima prejudicando a produção deste composto que neste caso, foi

reduzido para as populações suscetíveis.

Resultados contrários foram encontrados por Gomes (2014a), no qual

observou um aumento deste aminoácido em populações de Conyza spp. conforme se

aumentou a dose para as populações resistentes onde na suscetível houve oscilações nos

resultados, porém, a mesma não apresentou redução significativa. Em Arabidopsis thaliana

foi observado um aumento de fenilalanina após a aplicação do herbicida glyphosate

(TRENKAMP et al., 2009). Este comportamento foi verificado em Brassica napus L., porém,

nas menores doses deste herbicida, pois nas maiores ocorreu redução deste composto

(PETERSEN et al., 2007).

Aos 11 DAA houve um pequeno aumento nos níveis deste composto na

população R2 até duas vezes a dose recomendada, porém, na maior dose testada os valores

foram semelhantes às menores doses. Observou redução do aminoácido com o aumento da

dose para as populações suscetíveis. Já aos 28 DAA o comportamento da população R2 foi

semelhante aos 5 DAA inclusive nos valores, ou seja, mesmo após a aplicação de 8 vezes a

dose recomendada, o glyphosate não foi capaz de causar efeito neste aminoácido.

85

5 DAA


100 1000

Fe

nila

lanin

a (

g g

-1)

0

100

200

300

400

500

S

R1

R2

11 DAA


100 1000

Fe

nila

lanin

a (

g g

-1)

40

60

80

100

120

140

S

R1

R2

28 DAA


100 1000

Fe

nila

lanin

a (

g g

-1)

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

S

R1

R2

Figura 33. Níveis de Fenilalanina (μg g-1



86

Em relação aos níveis de tirosina, semelhante à fenilalanina aos 5 DAA,

foi observado redução dos valores de acordo com o aumento das doses de glyphosate para as

populações suscetíveis (Figura 34). Entretanto, a população R2 apresentou oscilações nos

resultados conforme se aumentou a dose do herbicida. Este comportamento também foi

verificado aos 11 e 28 DAA. Um fato que deve ser levado em consideração é que mesmo

tendo sido observado variações de acordo com o aumento das doses, R2 apresentou os

maiores valores em todas as épocas avaliadas e em todas as doses aplicadas com relação à S e

R1. Mesmo nas maiores doses, a população resistente apresentou maiores valores em relação

às menores doses nas plantas suscetíveis.

Gomes (2011) observou forte correlação entre os níveis de tirosina e

fenilalanina em milho após a aplicação do herbicida glyphosate. Esta mesma autora, em

trabalho realizado em 2014, demonstrou que os níveis de ambos os aminoácidos tiveram um

padrão semelhante após a aplicação do glyphosate para as plantas suscetíveis e resistentes.

Estes resultados são contrários aos aqui analisados, pois enquanto que os níveis de

fenilalanina se mantiveram constantes nas plantas resistentes, os de tirosina apresentou

variações. Petersen et al. (2007), encontrou reduções nos valores de tirosina nas maiores doses

do herbicida glyphosate em planta de B. napus.

87

5 DAA


100 1000

Tir

osin

a (

g g

-1)

0

100

200

300

400

500

S

R1

R2

11 DAA


100 1000

Tir

osin

a (

g g

-1)

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

S

R1

R2

28 DAA


100 1000

Tir

osin

a (

g g

-1)

20

40

60

80

100

120

140

S

R1

R2

Figura 34. Níveis de Tirosina (μg g-1


Botucatu – SP.

88

Na população S houve redução dos níveis de triptofano de acordo com

o aumento da dose de glyphosate aos 5 DAA (Figura 35). Comportamento semelhante foi

observado para a população R1, porém na maior dose foi observado um aumento em relação à

S. Novamente em R2 foi notado uma variação nos valores de acordo com o aumento da dose,

no entanto, essa oscilação foi menor em relação à tirosina. Aos 11 DAA foi observada uma

grande variação nos valores para as três populações. Porém, aos 28 DAA os níveis de

triptofano em R2 retornaram a um padrão mais constante, semelhante aos 5 DAA e para R1

foi observado redução de acordo com o aumento da dose.

Peterson et al. (2007) analisando o efeito do herbicida glyphosate sobre

Brassica napus L. não observou grandes variações nos níveis de triptofano com o aumento da

dose o que de acordo com o autor deveria reduzir. A fenilalanina e a tirosina possuem o

mesmo precursor diferentemente do triptofano. Dentre os aminoácidos aromáticos, ele é o

menos sensível ao efeito do glyphosate explicando em parte tal efeito (AMRHEIN et al.,

1980). Foi observado no presente experimento que para a população suscetível de um modo

geral houve redução deste aminoácido com o aumento da dose, efeito este, esperado após a

aplicação do herbicida. Porém o mesmo não foi verificado população considerada resistente.

Efeitos contrários foram observados por Gomes (2014), onde na população suscetível de

Conyza spp. houve grandes oscilações nos valores de triptofano com o aumento da dose de

glyphosate sendo que para duas populações consideradas resistentes os valores foram

constantes.

89

5 DAA


100 1000

Tri

pto

fano

(g

g-1

)

0

50

100

150

200

250

300

350

S

R1

R2

11 DAA


100 1000

Tri

pto

fano

(g

g-1

)

60

80

100

120

140

160

180

S

R1

R2

28 DAA


100 1000

Tri

pto

fano

(g

g-1

)

40

60

80

100

120

140

160

180

S

R1

R2

Figura 35. Níveis de Triptofano (μg g

-1) em plantas de azevém S, R1 e R2 aos 5, 11 e 28


90

De acordo com a literatura, há um aumento geral dos aminoácidos após

a aplicação do glyphosate (COOLEY; FOY, 1992; PETERSEN et al., 2007; MOLDES et al.,

2008; GRAVENA et al., 2009). Essa alteração pode ser devido às regulações metabólicas na

biossíntese dos aminoácidos e hidrólise de proteínas. De acordo com Jaworski (1972), o

glyphosate causa uma desaceleração na síntese de proteínas e como consequência, a procura

por aminoácidos para a síntese proteica diminui, aumentando assim, os aminoácidos livres.

Essa pode ser uma explicação em determinadas situações em que há um aumento dos

aminoácidos aromáticos após exposição ao glyphosate.

Apesar da redução dos aminoácidos aromáticos ter sido reportada como

o primeiro passo da inibição causado pelo glyphosate na via do ácido chiquímico (COLE,

1985), foi demonstrado que esse comportamento não ocorre em todos os casos, ou seja, em

algumas espécies, tem aumentado ao invés de ser inibido, inclusive em plantas consideradas

suscetíveis ao herbicida. De acordo com os dados aqui analisados e de outros autores, não há

como tirar conclusões sobre o comportamento destes aminoácidos após a aplicação do

herbicida glyphosate para as espécies de um modo geral. Cada uma deve ser analisada

separadamente especialmente quando a resistência está envolvida.

Na figura 36 são observados os níveis de ácido ferúlico nas diferentes

populações. R2 demonstrou perfil constante nos valores de acordo com o aumento da dose em

todas as épocas de avaliação inclusive demonstrando números semelhantes nos três períodos

avaliados, ou seja, o herbicida não foi capaz de causar efeito significativo nesta variável ao

longo do experimento. Já para as populações consideradas suscetíveis, notou-se uma redução

até a dose recomendada aos 5 DAA se mantendo constante nas doses subsequentes. Aos 11 e

28 DAA conforme se aumentou a dose do herbicida houve redução dos níveis deste ácido.

Um fato a ser observado é que em todas as doses e épocas avaliadas, essas populações

demonstraram valores superiores à resistente.

O ácido ferúlico tem como seu precursor o aminoácido fenilalanina

(DU et al., 2009). Como demonstrado na figura 3, a população R2 apresentou padrão

constante ao longo das avaliações e doses do herbicida para este aminoácido. Isto pode

explicar em parte o comportamento semelhante do seu produto, neste caso, o ácido ferúlico. A

mesma conclusão pode ser estendida para S e R1, ou seja, ambas apresentaram padrão

semelhante ao seu precursor.

91

5 DAA


100 1000

Ácid

o fe

rúlic

o (

g g

-1)

0

50

100

150

200

250

S

R1

R2

11 DAA


100 1000

Ácid

o fe

rúlic

o (

g g

-1)

0

50

100

150

200

250

300

350

S

R1

R2

28 DAA


100 1000

Ácid

o fe

rúlic

o (

g g

-1)

0

50

100

150

200

250

S

R1

R2

Figura 36. Níveis de Ácido Ferúlico (μg g



92

Os níveis de ácido coumárico mostraram oscilações de acordo com o

aumento das doses nas populações S e R2 aos 5 DAA, apesar de na suscetível haver uma

tendência de aumento (Figura 37). Aos 11 e 28 DAA a população resistente novamente

demonstrou variações em seus valores. Já para a R1 em todas as épocas avaliadas houve

constância nos resultados. Assim como o ácido ferúlico, o acido coumárico possui como

precursor a fenilalanina, porém não apresentou comportamento semelhante à mesma.

93

5 DAA


100 1000

Acid

o c

oum

ári

co

(g

g-1

)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

S

R1

R2

11 DAA


100 1000

Ácid

o c

oum

ári

co

(g

g-1

)

0

1

2

3

4

5

S

R1

R2

28 DAA


100 1000

Ácid

o c

oum

ári

co

(g

g-1

)

0

1

2

3

4

5

S

R1

R2

Figura 37. Níveis de Ácido Coumárico (μg g-1


28 DAA. Botucatu – SP.

94

Aos 5 DAA os níveis de ácido cafeico permaneceram constantes até a

dose recomendada para a população considerada resistente ocorrendo uma leve redução nas

doses subsequentes (Figura 38). Em S observou um aumento nos valores até 2 vezes a dose

recomendada havendo queda nas doses posteriores. A população R1 apresentou padrão

semelhante à S, porém a redução nos valores ocorreu a partir da dose recomendada

apresentando os menores resultados na maior dose testada. Aos 11 DAA R2 apresentou

comportamento diferente em relação aos 5 DAA havendo redução dos valores com o aumento

das doses até duas vezes a dose recomendada. Aos 28 DAA a mesma população demonstrou

comportamento semelhante à primeira avaliação.

O nível de ácido cafeico reduziu 1 dia após a aplicação de glyphosate

em células de Perilla, porém, se manteve constante até os cinco dias de avaliação sendo que

para a testemunha foi observado aumento deste composto nos mesmo períodos (ISHIKURA;

TAKESHIMA, 1984). Resultados semelhantes foram encontrado por Mobin et al. (2015),

onde com o aumento da dose do herbicida glyphosate, observou redução dos níveis de ácido

cafeico em Echinacea purpúrea (L.).

95

5 DAA


100 1000

Ácid

o c

afe

ico

(g

g-1

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

S

R1

R2

11 DAA


100 1000

Ácid

o c

afe

ico

(g

g-1

)

1

2

3

4

5

6

S

R1

R2

28 DAA


100 1000

Ácid

o c

afe

ico

(g

g-1

)

2

3

4

5

6

7

8

9

10

S

R1

R2

Figura 38. Níveis de Ácido Cafeico (μg g


DAA. Botucatu – SP

96

Como pôde ser observado, o comportamento das variáveis analisadas

nem sempre seguiram aquilo que se esperava de acordo com pesquisas anteriormente feitas.

Há variações de acordo com a espécie envolvida, época de avaliação, dose do herbicida

aplicado, etc. Após a aplicação do glyphosate, os compostos que fazem parte da rota do qual o

mesmo atua não necessariamente vão sofrer seus efeitos. De acordo com Velini et al. (2009a),

isto pode sugerir que nem sempre os produtos distantes do sítio de ação, neste caso a enzima

EPSPs, terão a sua produção bloqueada ou reduzida pelo glyphosate devido a presença de

sistemas de controle, que podem em parte, compensar a redução da síntese de determinados

compostos intermediários. Quanto menor o número de reações e enzimas, no caso dos

herbicidas, que separam um composto até o sítio de ação, maior a possibilidade que os níveis

deste produto sejam reduzidos devido à ação do produto.

97

7. CONCLUSÕES

Na população considerada resistente, a atividade da enzima fenilalanina

amônia liase manteve-se alta após a aplicação do glyphosate;

Todas as variáveis fisiológicas foram afetadas após a aplicação do

glyphosate nas três populações, porém, R2 foi capaz de se recuperar apresentando valores

semelhantes à testemunha;

Os níveis de ácido chiquímico e quínico apresentaram padrões

semelhantes onde houve aumento para as populações suscetíveis com o aumento da dose do

herbicida enquanto que para a resistente os valores se mantiveram semelhantes;

Ocorreu aumento dos níveis de shiquimato-3-fosfato para a população

R2 se mantendo constante para as suscetíveis;

Houve redução dos aminoácidos aromáticos com a aplicação do

glyphosate para as populações suscetíveis.

98

8. REFERÊNCIAS

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA … · os meus sonhos são seus sonhos. Meus eternos agradecimentos. Aos meus irmãos Andrei e Maria e cunhados Cesar e Elizabete