Upload
phamdung
View
218
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
MARIANGELA VIEIRA LOPES
DESENVOLVIMENTO DE PROCEDIMENTOS E SISTEMAS AUTOMATIZADOS
PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE CARNES E PRODUTOS CÁRNEOS
Salvador 2005
MARIANGELA VIEIRA LOPES
DESENVOLVIMENTO DE PROCEDIMENTOS E SISTEMAS AUTOMATIZADOS
PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE CARNES E PRODUTOS CÁRNEOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química, Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutora em Química.
Orientador: Prof. Dr. Mauro Korn
Salvador 2005
Lopes Mariangela Vieira.
L864 Desenvolvimento de procedimentos e sistemas automatizados para controle de qualidade de carnes e produtos cárneos. / Mariangela Vieira Lopes. - Salvador 2005.
173 f.
Orientador: Prof. Dr. Mauro Korn Tese (Doutorado em Química) Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, 2005. 1. Carne - Controle de Qualidade. 2. FIA - Método de Análise. 3. Nitrato, Nitrito, Sulfito - Análise de Substância. I. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Química. II. Korn, Mauro. III. Título. CDU: 543.6: 664.91
CDD: 664.907
Dedico A Carlos Roberto Aos meus pais, Antônio e Lira
AGRADECIMENTOS
São tantos e tão significativos... Ao Professor Dr. Mauro Korn, pela orientação no desenvolvimento desta tese e por ter me ensinado que para se trabalhar em pesquisa não é necessário grandes recursos financeiros, contudo é fundamental ter boas idéias, criatividade e muita, mas muita dedicação. A Profa. Maria das Graças A. Korn (Gal), pelo incentivo nos primeiros passos a caminho deste doutorado. Aos colegas de doutorado Sivanildo Borges, Fábio Oliveira e Josué Carinhanha, pela colaboração nos momentos de dúvida e por tantas idéias compartilhadas. Aos alunos de iniciação científica, Rommel Borges, Semirames Motta, Luciana Higino, Eliziane Pedra e Andréa Cordeiro pela colaboração direta no desenvolvimento desta tese e com eles compartilho o mérito deste trabalho. A Madson Pereira pela contribuição nas discussões no decorrer deste trabalho. Aos colegas do laboratório GPQA (Grupo de pesquisa em química analítica), especialmente a Márcia Bispo pelo apoio na realização das análises no ICP. Aos colegas do Laboratório SonoFia, Soledad, Denílson, Lílian, Vitória, Manoel, Daniel, Daniela, Márcia, Bruno, Sapé, Eduardo, pelo convívio alegre e bem humorado e pela companhia, muitas vezes, até altas horas. Ao Departamento de Ciências da Vida da Universidade do Estado da Bahia pelo apoio e incentivo. Aos colegas do Laboratório Central de Saúde Pública Professor Gonçalo Moniz (LACEN), pela amizade e apoio no decorrer deste trabalho. Ao grupo de Instrumentação Analítica do Instituto de Química da Universidade de Campinas, pelo apoio nas atividades com o NIR. Aos meus alunos, que sempre foram incentivadores na escalada por novos conhecimentos. A Carlos Roberto, meu grande companheiro, pelo seu apoio e incentivo ao longo desta jornada. O seu amor foi o bálsamo nos momentos de desânimo. A minha família, irmãos, sobrinhos, cunhados e sogra, pelo incentivo e em especial aos meus pais Antônio e Lira pelo exemplo de vida que sempre foram para mim. Agradeço com o coração.
O valor das coisas não está no tempo que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso, existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis.
Fernando Pessoa
RESUMO
Neste trabalho, foram desenvolvidos procedimentos e sistemas automatizados para o controle de qualidade de carnes e produtos cárneos quanto à presença de aditivos (NO2
- e NO3-), degradação (evolução de H2S), presença de adulterante (SO3
-) e riscos de contaminação pela capacidade sortiva de metais. O desenvolvimento destes procedimentos vem contrapor as metodologias clássicas recomendadas pelos órgãos oficiais brasileiros. Os métodos e procedimentos aqui desenvolvidos obedecem às recomendações da Química Analítica moderna, as quais priorizam precisão, exatidão, sensibilidade, custos operacionais, versatilidade, robustez, rastreabilidade, minimização de resíduos e produtividade analítica. O sistema de analise por injeção em fluxo (FIA), para análise seletora e discriminatória de H2S evoluído pela carne, foi desenvolvido baseado no método do azul de metileno. O emprego da multicomutação, associado à câmara de pervaporação, conferiu versatilidade ao sistema com produtividade analítica de 30 determinações h-1. Paralelo a isto, foi realizada uma avaliação da degradação de carnes empregando a espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) para averiguação das condições de conservação de carnes. Os resultados foram concordantes para as duas metodologias (NIR e FIA), sendo possível detectar indícios de deterioração após 30 min de exposição da carne à atmosfera em temperatura ambiente. O desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de NO2
- e NO3-, em
produtos cárneos, utilizando câmara de tubos concêntricos (CTC) foi baseado no método de Greiss. A CTC proporcionou a divisão da zona da amostra, facilitando as determinações seqüenciais de NO2
- e NO3-. A subzona da amostra que passava pelo
tubo central da CTC resultava apenas na determinação do NO2-. A amostra que
passava pelo tubo externo (coroa) da CTC, percolava grãos de cádmio coperizado, resultando na redução do NO3
- existente à NO2-. Este sistema ofereceu boa
sensibilidade para a quantificação dos analitos, apresentando limites de detecção de 0,018 e 0,036 mg L-1 para NO2
- e NO3-, respectivamente. O procedimento proposto
atingiu produtividade analítica de 120 determinações h-1. O desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito em carnes foi baseado no método da p-rosanilina. Foi empregado câmara de permeação gasosa, onde o SO3
- presente na amostra, permeava através de membrana de PTFE para a reação com o reagente cromogênico. O sistema foi satisfatório para screening analysis, com produtividade analítica de 12 determinações h-1. A capacidade sortiva de metais pela carne bovina foi também avaliada. Foi avaliado o contato estático da carne com soluções de referência de Cd e Pb, preparadas com água de torneira, a pH 6. Foi empregada válvula multiportas, com oito canais para execução dos experimentos, enquanto que metais foram determinados por ICP OES. Os resultados indicaram um elevado poder sortivo, cerca de 80% para ambos os metais, evidenciando risco potencial de contaminação para as carnes submetidas a práticas inadequadas de abate e comercialização.
Palavras – chave: Carnes; FIA, sulfeto, nitrito e nitrato, sulfito, sorção de metais.
ABSTRACT
In the present work automated systems and procedures to control the quality of meats and meat products had been developed, in concern to the additive presence (NO2
- and NO3-), degradation (H2S evolution) and presence of adulterating species
(SO32-). Also the metal sorption capacity on meat was evaluated. The development of
these methods comes to oppose classical methods recommended by brazilian official agencies. The developed procedures follow the recommendations of the modern Analytical Chemical, which prioritizes the precision, exactness, sensitivity, traceability, robustness, reduced operational costs, lesser production of residue and raised analytical productivity. The flow analysis (FIA) procedure to discriminate H2S in meat sample was developed based on methylene blue method. Multicommutation, associated to gas permeation conferred versatility to the system with analytical throughput of 30 determinations h-1. Parallel to this, the spectroscopy in the near infrared region (NIR) was carried out to evaluate meat degradation. A flow system for sequential NO2
- and NO3- analysis in meat products, using concentric tubes chamber
(CTC) was based on the Greiss method. The CTC provides the division of sample zone, permitting the sequential analysis. The sample sub zone that passed for the central pipe of the CTC resulted in the determination of the NO2
-. The sample that passed through external CCP pipe, percolated the cadmium column, allowing the reduction of the NO3
- to NO2-. This system offers sensitivity in the quantification of
anilities with detection limits of 0.036 for NO3- and 0.018 mg L-1 for NO2
-, reaching 120 determinations h-1. The flow system for the screening analysis of SO3
2- in meat sample was based on p-rosanilne method. Chamber for gas permeation was employed. The system revealed efficient for screening analysis with analytical throughput of 12 determination h-1. The metal sorption capacity on meat was evaluated. The investigated species comprised Cd and Pb from solutions prepared with tap water at pH 6. In the experimental set, it was employed an eight channels multiport valve in order to prepare part of the samples, while the metal determinations was carried out by using ICP OES technique. The results obtained demonstrated an expressive retention capacity of meat for Cd2+ and Pb2+ ions with percentages ca. 80% (m/m) for both metals, indicating the potential risks related to the consumption of meat submitted to inappropriate conditions of abattoir, handling, storage and commercialization. Keywords: Meat, FIA, sulphide, nitrite, nitrate, sulphite, metal sorption.
i
LISTA DE FIGURAS
Número Figuras
Página
2.1 Reação de formação do azul de metileno
35
2.2 Diagrama do sistema de análise em fluxo empregado para detecção de H2S
40
2.3 Diagrama eletrônico para o acionamento das válvulas solenóides
41
2.4 Câmara de pervaporação/degradação para detecção de H2S em carnes
42
2.5 Amostras de carne para análise no NIR
46
2.6 Variação do sinal analítico em função da vazão do sistema proposto para uma solução de referência de sulfeto de 1 mg L-1
47
2.7 Variação do sinal analítico em função do percurso analítico B1 para mistura dos reagentes DMPD e Fe3+
48
2.8 Variação do sinal analítico em função do percurso analítico B2 para formação do azul de metileno
49
2.9 Variação do sinal analítico em função do número de pulsos para abertura das válvulas (V1 e V2) dos reagentes DMPD e Fe3+
50
2.10 Variação do sinal analítico em função do tempo de interrupção do fluxo
52
2.11 Fiagrama mostrando o perfil do sinal analítico obtido no sistema com o fluxo parado
53
2.12 Fiagrama de 11 replicatasde solução de sulfeto 1 mg L-1
54
2.13 Registro do sinal analítico referente à detecção de H2S
56
2.14 Registro da avaliação da degradação de carnes pelo motitoramento da liberação de gás sulfídrico
56
2.15 Coleção de espectros NIR das amostras de carne
57
2.16 Análise dos componentes principais de 26 amostras de carne
58
2.17 PCA para as amostras dos grupos A e B
58
ii
Número Figuras
Página
2.18 PCA para as amostras dos grupos B e C 59
2.19 PCA para as amostras dos grupos C e D 59
2.20 PCA para as amostras dos grupos A e D 60
2.21 PCA para uma única amostra de carne fresca em função do tempo
61
3.1 Reação de Greiss 73
3.2 Visão frontal (a) e lateral (b) do aparato câmara de tubos concêntricos
77
3.3 Diagrama de fluxo para análise de nitrato e nitrito 78
3.4 Fluxograma da determinação de NO2- e NO3
- segundo normas do Ministério da Agricultura
83
3.5 Fiagrama obtido pela injeção de solução mista de referência de NO2
- e NO3 1 mg L-1 no sistema proposto acoplado a câmara de tubos concêntricos
84
3.6 Efeito da vazão nos perfis dos sinais transientes
85
3.7 Variações dos sinais transientes do primeiro e segundo picos obtidos para alças de amostragem de 20 cm (a) e 40 cm (b) em função da vazão
86
3.8 Variação dos sinais analíticos (pico 1 e pico 2) em função da variação do percurso analítico
88
3.9 Variação dos sinais analíticos em função da variação da alça de amostragem
89
3.10 Variação dos sinais analíticos para soluções simples de NO2- e
NO3- após passagem na coroa da CTC contendo deferentes
massas de Cd
93
3.11 Porcentual de NO3- reduzido a NO2
- pela passagem de solução de referência na coroa do tubo concêntrico, em função do tempo de utilização do sistema
95
3.12 Sinais analíticos para soluções mistas de NO2- e NO3
- obtidos pelo sistema em fluxo acoplado a CTC nas condições otimizadas
97
iii
Número Figuras
Página
4.1 Ação inibitória do sulfito nas reações de escurecimento não enzimático
107
4.2 Reação de descoloração da antocianinas pela ação do sulfito 108
4.3 Reações de dissociação de SO2 e sulfitos 110
4.4 Inativação da tiamina na presença de sulfito 111
4.5 Reações de oxidação da mioglobina 113
4.6 Reações da p-rosanilina com o sulfito 118
4.7 Sistemas para aplicação do método de Monnier-Williams 119
4.8 Diagrama de fluxo para análise de sulfito 121
4.9 Esquema simplificado da câmara de permeação 122
4.10 Esquema da válvula rotatória indicando os canais e a alça na posição de amostragem e injeção
122
4.11 Efeito da razão (R) entre a vazão do carregador e a vazão da solução do coquetel de reagentes sobre o sinal
125
4.12 Variação do sinal analítico em relação ao comprimento da alça de amostragem
126
4.13 Efeito da concentração do HCl no sinal analítico para solução de referência de SO3
- igual a 32 mg L-1 127
4.14 Variação do sinal analítico com o percurso analítico para a parte inferior do sistema de análise em fluxo (B1)
130
4.15 Variação do sinal analítico com o percurso analítico para a parte superior do sistema de análise em fluxo (B2)
131
5.1 Abate clandestino de bovino no sertão baiano 143
5.2 Comercialização de carne fresca e de miúdo de bovinos, em feiras-livres do interior baianao
144
5.3 Comercialização da carne bovina em mercado municipal do interior baiano
145
iv
Número Figuras
Página
5.4 Esquema do módulo SIA empregado para os testes de contaminação das amostras de carne
153
5.5 Perfil da variação da retenção de cádmio e chumbo em carne fresca (A) e carne deteriorada (B) com mudança da solução mista 10 mg L-1 em Cd e Pb a cada hora.
157
5.6 Perfil da variação da retenção de cádmio e chumbo em carne fresca (A) e carne deteriorada (B) sem substituição da solução mista 10 mg L-1 em Cd e Pb a cada hora
159
5.7 Esquema simplificado da desnaturação protéica 162
5.8 Representação esquemática do provável mecanismo de ligação do chumbo e do cádmio com os grupos sulfidrila e amino da proteína
163
5.9 Influência da acidez na dessorção (A) e retenção (B) de Cd2+ e Pb2+ em amostras de carne bovina
168
v
LISTA DE TABELAS
Número Tabelas
Página
1.1 Composição centesimal de carnes bovina magra e gorda 3
1.2 Panorama evolucionário das metodologias empregadas para controle de qualidade de carnes e produtos cárneos comparadas com as metodologias recomendadas pelo MAPA
19
2.1 Parâmetro da rotina de trabalho do programa controlador do sistema em fluxo.
42
2.2 Configuração do sistema em fluxo após otimização para determinação de sulfeto
51
2.3 Resultados para H2S nas amostras de carnes 55
3.1 Sinais referentes às diferentes concentrações de soluções mistas de nitrito e nitrato de sódio
90
3.2 Absorbâncias obtidas pelas soluções simples de NO2- e NO3- após a passagem na coroa da CTC com diferentes massas de cádmio
93
3.3 Parâmetros referentes à otimização do sistema em fluxo 96
3.4 Figuras de mérito para o procedimento em fluxo proposto 96
3.5 Concentrações de NO2- e NO3
-(mg kg-1) em amostras de salsichas (S) e jerked beef (JB) obtidos pelo método oficial (MO) e pelo sistema proposto (FIA)
98
3.6 Concentração de NO2- e NO3- em, amsotras de água mineral
99
4.1 Relação massa/massa entre os agentes de sulfitação e SO2 disponível
109
4.2 Agentes de sulfitação permitidos pela legislação brasileira
111
4.3 Grupos de alimentos nos quais é permitido o uso de
agentes de sulfitação 112
vi
Número Tabelas
Página
4.4 Presença de sulfito livre em amostras de carnes frescas 133
5.1 Parâmetros operacionais utilizados na determinação de Cd e Pb
149
5.2 Passos envolvidos no experimento de retenção de Cd e Pb no sistema SIA proposto
153
5.3 Efeito da esterilização na % de retenção de Cd e Pb em carnes frescas e deterioradas
160
5.4 Efeito da esterilização na retenção de cádmio e chumbo (%) em carnes moídas frescas e deterioradas
164
5.5 Perfil do deslocamento dos íons metálicos Cd2+ e Pb2+ para amostras de carne frescas e deterioradas
165
vii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC – Association of Official Analytical Chemists
CODECON – Coordenadoria do consumidor
CTC – Câmara de tubos concêntricos
DENA – Dietilnitrosamina
DMNA – Dimetilnitrosamina
DMPD – N, N – dimetilfenil – 1 – 4 diamina
DOU – Diário Oficial da União
EDTA – ácido etilenodiaminotetracético
FDA – Food and Drug administration
FIA – Flow injection analisys
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
ICP OES – Inductudy coupled plasma optcal emission spectroscopy
IN – Instrução Normativa
LACEN – Laboratório Central
LD – Limite de detecção
MAPA – Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
MO – Método oficial
MS – Ministério da Saúde
NED – Naftil etilenodiamina
NIR –Near infrared
NIRS – Near infrared spectroscopy
OTMA – Óxido de trimetilamina
PCA – Principal component analysis
PCRC – Programa de controle de resíduos em carnes
PLS – Partial least square
PROCON – Procuradoria do consumidor
PTFE – politetrafluoretileno
viii
PVC – Cloreto Polivinil
RDC – Resolução da diretoria colegiada
RMN – Ressonância magnética nuclear
RSD – Relative standard deviation
SI – Sistemas inteligentes
SIA – Sequencial injection analysis
SIMCA – Soft independent modelling of class analogy
VIS – Visível
ix
SUMÁRIO
Lista de Figuras
i
Lista de Tabelas
v
Lista de Abreviaturas
vii
Capítulo 1 – Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos aplicados no controle de qualidade de produtos cárneos
1
1.1. Introdução
1
1.2. Processos envolvidos na transformação do músculo em carne
6
1.3. Deterioração da carne
9
1.4. Metodologias inovadoras 10
1.4.1. Automação e inteligência artificial 10
1.4.2. Automação em sistemas em fluxo 13
1.4.3. Espectroscopia na região do infravermelho próximo – NIRS 15
1.5. Considerações complementares 18
1.6. Objetivos
20
1.7. Referências bibliográficas 20
Capítulo 2 – Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico em carnes integrado a uma câmara de pervaporação
31
2.1. Introdução 31
2.2. Metas 39
2.3. Materiais e métodos 39
2.3.1. Equipamentos 39
2.3.2.Reagentes e soluções 43
2.3.3. Procedimentos 44
x
2.4. Resultados e discussão
47
2.4.1. Otimização do sistema 47
2.4.2. Influência da interrupção do fluxo no sistema 52
2.4.3. Figuras de mérito 53
2.4.4. Aplicação do sistema na análise de carnes 54
2.5. Aplicação do NIR para avaliação da degradação da carne 57
2.6. Conclusões 63
2.7. Referências bibliográficas 64
Capítulo 3 – Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato em produtos cárneos, utilizando câmara de tubos concêntricos
69
3.1. Introdução 69
3.2. Metas 75
3.3. Materiais e métodos 76
3.3.1. Equipamentos 76
3.3.2. Reagentes e soluções 79
3.3.3. Procedimentos 80
3.4. Resultados e discussão 84
3.4.1. Perfis dos sinais analíticos empregando a CTC 84
3.4.2. Efeito da vazão 85
3.4.3. Otimização do sistema 86
3.4.3.1. Efeito do volume amostrado e da vazão 86
3.4.3.2. Percurso analítico 88
3.4.3.3. Avaliação da capacidade de conversão de nitrato a nitrito 89
3.4.3.4. Estudo da massa de cádmio 92
xi
3.4.3.5. Avaliação do tempo de vida útil da coluna de Cd.
94
3.4.3.6. Figuras de mérito 96
3.4.4. Aplicação do sistema para a determinação de NO2- e NO3
- em amostras de produtos cárneos
97
3.5. Conclusões 100
3.6. Referências bibliográficas 101
Capítulo 4 – Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito em carnes empregando o método da p-rosanilina por difusão gasosa.
106
4.1. Introdução 106
4.2. Metas 120
4.3. Material e métodos 120
4.3.1. Equipamentos 120
4.3.2. Reagentes e soluções 123
4.3.3. Procedimentos 123
4.4. Resultados e discussão 124
4.4.1.Otimização do sistema 124
4.4.1.1. Efeito da vazão 125
4.4.1.2. Alça de amostragem 126
4.4.1.3. Concentração do HCl 127
4.4.1.4. Percurso analítico 129
4.4.2. Figuras de mérito 131
4.4.3. Aplicação do sistema em amostras de carne expostas ao consumo 132
4.5. Conclusões 133
4.6. Referências bibliográficas 134
xii
Capítulo 5 – Avaliação da capacidade sortiva da carne bovina por íons metálicos
141
5.1. Introdução 141
5.2. Metas 148
5.3. Materiais e métodos 148
5.3.1. Equipamentos 148
5.3.2. Reagentes, soluções e amostras 150
5.3.3. Procedimento 151
5.3.3.1. Automação do experimento de retenção de metais pela carne empregando válvula multiportas de oito vias
151
5.3.3.2. Retenção em batelada dos metais pela carne 154
5.4. Resultados e discussão 155
5.4.1. Retenção dos metais em sistema automatizado 155
5.4.2. Retenção de metais pela carne pelo método em batelada 160
5.4.2.1. Experimento com a carne fresca e deteriorada, submetida a esterilização ou não
160
5.4.2.2. Experimento com a carne moída fresca e deteriorada, submetida a esterilização ou não
163
5.4.2.3. Avaliação do deslocamento dos metais retidos 165
5.4.2.4. Avaliação da acidez na sorção dos metais 167
5.5. Conclusões 169
5.6. Referências bibliográficas 169
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
1
CAPÍTULO 1
Panorama atual e novas tendências dos processos
analíticos aplicados no controle de qualidade de produtos
cárneos.
1.1 – Introdução
O consumo de carnes pelo homem acompanha a raça humana desde seu
início. Os primeiros grupamentos nômades caçavam e os alimentos eram
abundantes. Não havia tecnologia disponível para a produção em massa, e nem era
necessário, pois a oferta era maior que a procura. A busca pelo alimento era
primariamente instintiva e não estava atrelada ao conhecimento da necessidade de
ingestão de nutrientes, muito menos à ingestão de alimentos com qualidade
garantida. Hoje, vive-se o paradoxo de que a raça humana (pequenos grupos)
detém conhecimento e tecnologia para produção, melhoramento e controle de
alimentos, mas não apresenta poder aquisitivo (a grande maioria) para adquiri-los.
A produção de carnes no Brasil, somente no primeiro semestre de 2004, foi
de aproximadamente 3x109 kg de carne bovina, 3,5x109 kg de frango e 9,5x108 kg
de carne de porco (IBGE, 2004), considerando-se apenas os estabelecimentos sob
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
2
inspeção sanitária. Sabe-se que grande parte desta produção se destina ao
consumo externo. O Brasil tem aproximadamente 172 milhões de habitantes (IBGE,
2004), e se considerássemos que toda a produção de carnes fosse consumida
internamente, seria possível atender as recomendações diárias de proteína.
(BRASIL, 1998).
Evidentemente, estas considerações são utópicas, pois estão além das
condições de consumo da população brasileira. Contudo, estes dados demonstram
o potencial produtivo do país e permitem observar nossa auto-suficiência.
Entende-se por carne todo o tecido muscular de animais utilizado como
alimento (PARDI, 2001). Em termos gerais, as carnes podem ser classificadas em
vermelhas e brancas. Carnes vermelhas são aquelas que possuem maior teor de
mioglobina, entre 0,4 e 2% (m/m), e são provenientes de bovinos, bubalinos, suínos,
ovinos, caprinos, coelhos e avestruzes. Por sua vez, carnes provenientes de aves
domésticas são denominadas de carnes brancas, devido à baixa concentração de
mioglobina (ca 0,1%, m/m) (SGARBIERI, 1996).
Pela composição da carne, mostrada na Tabela 1.1, pode ser observada a
riqueza nutricional deste alimento (PHILIPPI, 2001). De maneira geral, as carnes
disponibilizam nutrientes essenciais à vida. A carne é, por excelência, um alimento
protéico e, por conter todos os aminoácidos essenciais, deve ser considerada uma
importante fonte de proteínas de elevada qualidade biológica. Ademais apresenta
alta digestibilidade e biodisponibilidade de seus nutrientes (CHEFTEL et al., 1989).
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
3
Tabela 1.1: Composição centesimal de carnes bovina magra e gorda.
Nutriente Carne bovina magra 100g
Carne bovina gorda 100g
LipídiosTotais (g) 5,72 18,42
Gordura Polins.(g) 0,18 0,73
Gordura Monos.(g) 2,43 8,26
Gordura Saturada (g) 2,08 7,69
Proteínas (g) 29,03 27,42
Colesterol (mg) 69,07 90,08
Na (mg) 62,060 62,060
Ca (mg) 5,010 11,010
Mg (mg) 27,030 28,020
Zn (mg) 4,75 5,74
Mn(mg) 0,020 0,020
K (mg) 395,4 395,31
P (mg) 226,23 218,19
Fe (mg) 1,96 3,010
Cu (mg) 0,1 0,14
Se( g) 27,13 21,82
Vit. B1 (mg) 0,09 0,11
Vit. B2 (mg) 0,170 0,260
Vit. B6 (mg) 0,380 0,400
Vit. B12( g) 2,18 2,67
Niacina (mg) 3,750 3,860
Folato (g) 7,01 9,010
Pantotenato (mg 0,460 0,350
Vit.D ( g) 0,300 0,300
Vit.E (mg) 0,200 0,480
Programa Virtual Nutri (PHILIPPI, 2001)
As metodologias oficiais indicadas para o controle de qualidade de produtos
cárneos pelos órgãos governamentais brasileiros são fundamentalmente baseadas
na aplicação de métodos gravimétricos, volumétricos e espectrofotométricos. Em
sua maioria, estas metodologias de controle são divulgadas nos compêndios da
AOAC (Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical
Chemists), da FDA (Food and Drug Administration) e no Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater, enquanto que os procedimentos aplicados no
Brasil são divulgados pelos órgãos oficiais de imprensa, como Ministério da Saúde
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
4
(MS) ou Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) através do
Diário Oficial da União (DOU).
Entre as determinações físico-químicas para o controle de qualidade de
produtos cárneos, preconizadas pelo Ministério da Agricultura, tem-se a pesquisa de
espécies conservantes (ácidos benzóico, salicílico e bórico, formaldeído), corantes,
gás sulfídrico; pH, acidez, nitratos, nitritos, sulfitos e bases voláteis totais, entre
outras.
As instruções normativas 20 e 42 do MAPA (BRASIL,1999), indicam
procedimentos para as análises físico-químicas que devem ser empregados no
controle de qualidade de produtos cárneos e traça o Plano de Controle de Resíduos
(medicamentos, metais e agrotóxicos) em carnes, respectivamente, sendo que
nessa última (IN 42/99) são apresentados os quatro laboratórios oficiais e o
laboratório de referência para receberem e executarem essas análises demandadas
pelos serviços de inspeção de todo o território nacional. Deve ser ressaltado que no
Brasil, para as análises físico-químicas gerais, foram habilitados 26 laboratórios
centrais de saúde pública (LACEN), além dos laboratórios subordinados ao MAPA.
Considerando a produção nacional, deve ser questionada a capacidade dos
cinco laboratórios oficiais em assumirem e responderem às demandas de controle
de resíduos em amostras de carne, mesmo sendo esta realizada por rígidos critérios
estatísticos de amostragem. Tendo em vista a relevância desse controle para a
saúde da população, há que se esperar uma atuação mais enérgica e sistemática
por parte dos órgãos fiscalizadores e, para tanto, a estrutura laboratorial é peça
chave para fornecer as informações químicas necessárias.
Pelo texto da Instrução Normativa 20/1999 ficou estabelecido que “as
metodologias analíticas seriam atualizadas, sempre que a inovação tecnológica
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
5
assim recomendasse”. Contudo, as normas oficiais de controle de produtos
alimentícios para o território nacional, não foram e nem estão em fase de
atualização, como se não existissem inovações, nem pudessem ser observadas
tendências de modernização dos procedimentos e técnicas de análise, seguindo os
rumos apontados pela Química Analítica. Desta forma, pode ser, mais uma vez,
constatado o distanciamento entre a produtiva Química Analítica brasileira e as
necessidades e demandas da sociedade.
Como anteriormente mencionado, a predominância de métodos clássicos de
análise no controle de qualidade de carnes pode ser explorada para demonstrar a
dualidade da situação atual. Assim, há que se admitir que os métodos clássicos
podem ser instalados em laboratórios de pequeno porte, visto que se baseiam em
técnicas que utilizam equipamentos simples e de fácil manuseio, salvo raras
exceções. Porém, os procedimentos “indicados” para o controle de qualidade
apresentam baixa produtividade analítica, a qual deve ser associada, neste cenário
sombrio, tanto à escassez de recursos humanos minimamente qualificados para
executar as análises, como à elevada demanda existente. Nesta abordagem, a
qualificação profissional é uma meta a ser atingida, embora seja morosa, quando
são aplicados modelos profissionalizantes convencionais. Por outro lado, mesmo
que o contingente de recursos humanos fosse qualificado e numericamente
suficiente, as estruturas laboratoriais não estão projetadas para suportarem um
grande número de técnicos. Desta forma, independentemente das políticas
estaduais e nacionais para qualificação profissional, os procedimentos oficiais de
análise qualitativa e quantitativa de parâmetros de qualidade em amostras de carne
precisam ser revistos.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
6
Neste cenário, faz-se necessário o desenvolvimento de metodologias
alternativas, discriminatórias, de resposta rápida e de simples manipulação que
possam ser aplicados nas rotinas laboratoriais, o que poderia favorecer o aumento
do número de laboratórios prestadores destes serviços. No Brasil, a exportação é
um grande motivador para o incremento e a modernização dos processos de
controle de qualidade de carnes.
Dentro deste contexto, o presente capítulo apresenta uma revisão sobre a
química e bioquímica da carne e traça um panorama quanto aos métodos oficiais
para o controle de qualidade de produtos cárneos, estabelecendo um paralelo entre
estes e os recentes avanços da Química Analítica, quanto a tendência de
implantação e implementação de sistemas automatizados para o controle de
qualidade na indústria da carne. Exibindo assim, um paradoxo entre as metodologias
oficiais e a versatilidade deste cenário futurista.
1.2 - Processos envolvidos na transformação do músculo em carne
A indústria da carne enfrenta a necessidade permanente do desenvolvimento
de novas metodologias para avaliação da qualidade do produto. A expectativa do
consumidor em adquirir um produto de qualidade cresce continuamente, o que induz
à necessidade do controle e garantia, principalmente da qualidade desde a criação
do animal até a chegada do produto à mesa do consumidor.
Após o abate, o músculo sofre transformações bioquímicas e biofísicas,
sendo considerado carne (PARDI, 2001). No processamento da carne para
consumo, esta é submetido a etapas de limpeza, desossa, armazenamento e
distribuição. Além do mais há a possibilidade da adição à carne de substâncias
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
7
químicas, as quais podem conservar ou fraudar um produto exposto à
comercialização, podendo induzir a aquisição de produto de boa aparência, mas de
qualidade duvidosa. Deve ser ressaltado que a adição de qualquer substância à
carne fresca resfriada, ou congelada, é proibida pelo MAPA. Portanto, é necessário
desenvolver e aplicar processos de análise para a monitoração da qualidade
também nestas etapas.
As primeiras mudanças ocorridas no processo de transformação do músculo
em carne se dão na etapa do rigor mortis, o qual é caracterizado pelo enrijecimento
do músculo do animal, pela interrupção da circulação sanguínea. Assim, o músculo,
privado de oxigênio, sofre glicólise anaeróbia. Nestas condições, o glicogênio
transforma-se em ácido láctico, o que inibe progressivamente a atividade de enzimas
glicolíticas. Por fim, a glicólise é interrompida e, a actina e a miosina (proteínas
miofibrilares) são irreversivelmente combinadas, levando a produção de actomiosina,
a qual confere rigidez à carne (CHEFTEL e CHEFTEL, 1986).
O ácido láctico produzido no rigor mortis cria um ambiente favorável para a
ação de enzimas proteolíticas e bactérias, que decompõem as proteínas em
peptídeos e aminoácidos. A fragmentação das proteínas miofibrilares torna a carne
macia e o odor agradável, pela liberação de substâncias voláteis (nucleotídeos, NH3,
acetaldeído, H2S, diacetilo e acetona), até que esta maturação evolua para um
processo predominantemente microbiano que é a deterioração (RIEDEL, 1992).
O processo de maturação da carne ocorre quando a dureza é atenuada.
Nesta fase ocorre um processo autolítico, com produção de substâncias
nitrogenadas solúveis, aumento de suculência e pequeno grau de lipólise, a qual
leva à rancificação de ácidos graxos. Todos esses fenômenos contribuem para o
sabor e aroma da carne maturada (SALINAS, 2002).
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
8
Para sua conservação após o abate, a carne deve ser submetida a baixas
temperaturas até atingir ao consumidor final pela manutenção da cadeia do frio
(JAMES, 1996). As baixas temperaturas necessárias para conservação de carnes
atuam, diminuindo ou paralisando o crescimento e a atividade microbiana, além de
retardar as reações enzimáticas e químicas.
Os atributos sensoriais da carne mais estudados são a cor, relacionada à
quantidade de mioglobina presente; a textura, relacionada com o frescor da carne ou
capacidade de retenção da água (CRA); e a dureza (COSTA, 2002).
Em 1996, Gerrard e colaboradores sugeriram o emprego de um sensor para
avaliação da cor de bifes de carne. O processador de imagem foi adequado para
acompanhar a descoloração da carne durante a exposição ao consumo no varejo.
As vantagens deste processador residem no fato de ser um processo não invasivo,
não ser necessário qualquer contato entre o equipamento e a amostra sob
investigação, além de poder utilizar amostras empacotadas, e poder aplicar a lotes
inteiros de carne, assegurando que nenhum defeito potencial ou visível para o
consumidor seja negligenciado. Tan (2004) apresentou uma avaliação dos atributos
de qualidade sensorial da carne, como cor do músculo, marmorização, maturidade e
textura, empregando o método de análise de imagem.
Villarroel et al. (2003) realizaram estudo sobre o efeito do tempo de transporte
de animais sobre os aspectos das qualidades sensoriais de carnes. Concluíram que
o tempo de transporte afeta significantemente a dureza e sabor da carne. Este efeito
é explicado devido ao estresse sofrido pelo animal. Animais sensíveis ao estresse
apresentam temperaturas elevadas e queda rápida do pH, devido ao acúmulo de
ácido láctico e a instalação precoce do rigor mortis (Pardi et al., 2001).
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
9
1.3. – Deterioração da carne
A deterioração da carne segue imediatamente à maturação, sem que possa
ser observado um limite nítido entre elas. A facilidade com que os diferentes tecidos
são degradados varia com uma série de fatores, como teor de água e de sangue. A
deterioração da carne caracteriza-se pela ação indesejável de microrganismos com
formação e evolução de gases que apresentam odores desagradáveis e, segundo
Reidel (1992), apresenta as seguintes fases:
a) Destruição por hidrólise das substâncias colágenas, do tecido conjuntivo,
caracterizando-se por superfície pegajosa, muita umidade, coloração cinza ou
esverdeada.
b) Destruição das proteínas por hidrólise; intervenção de enzimas bacterianas;
formação de polipeptídeos, reação alcalina.
c) Destruição dos aminoácidos com produção de NH3, H2S, indol, escatol e de
aminas como a cadaverina e a putrescina.
As práticas inadequadas de transporte, armazenamento e comercialização de
carnes, interrompendo ou até mesmo, não cumprindo a obrigatoriedade da cadeia
do frio, altera a qualidade da carne causando sua inevitável deterioração. A evolução
de H2S é um indicador do estado de decomposição da carne. O teste de Eber é
recomendado pelo MAPA para a pesquisa de H2S e se baseia na reação com
acetato de chumbo.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
10
1.4 – Metodologias inovadoras
1.4.1 – Automação e inteligência artificial
A inteligência artificial e, em particular, sistemas inteligentes estão
representando papel importante em estabelecer inteligência à maioria dos
equipamentos analíticos, nos quais a maioria dos métodos empregados em análises
de alimentos é baseada (PERIS, 2002).
A primeira vez que o paradigma “inteligência artificial” foi introduzido no meio
cientifico trouxe consigo o conceito de processamento de dados que poderia
mimetizar o raciocínio para a solução de problemas (McCarthy apud LINKO,1998). A
aplicação no controle da qualidade de alimentos como controle de processos
fermentativos, controle de produtos extrusados e diagnósticos de defeituosos, são
alguns exemplos de aplicação da inteligência artificial na indústria de alimentos.
Segundo Peris (2002), a substituição do homem por sistemas automatizados
em laboratórios de controle de qualidade na indústria de alimentos apresenta
algumas vantagens: (a) muitas cópias de um sistema inteligente (SI) podem ser
facilmente feitas; (b) os SI nunca esquecem; (c) os SI, sendo manipulado da mesma
maneira, fazem recomendações comparáveis para situações similares, enquanto
que o homem é influenciado pelos primeiros efeitos e respostas (as informações
novas dominam o julgamento); (d) fraudes ou erros podem ser prevenidos, pois as
informações são logo processadas para as tomadas de decisão; e, finalmente (e) as
múltiplas experiências do homem podem ser combinadas nos SI.
Apesar das vantagens citadas, Peris (2002), ponderou que os SI ainda não
substituem o analista pela criatividade, experiência sensorial e aprendizagem. O
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
11
homem se adapta automaticamente às mudanças ambientais, enquanto que o SI
deve ser atualizado. A base do aprendizado e a rede neural são métodos que
podem incorporar aprendizado.
O emprego de algoritmos para análise multivariada e os modelos
matemáticos são ferramentas poderosas para a classificação de alimentos de
acordo com a variedade, origem geográfica, composição, identificação de fraudes,
características sensoriais entre outros atributos (SCHALLER, et al.,1998; FERREIRA
et al., 2002; ARVANITOYANNIS et al., 2003; HATEM et al., 2003; DU e SUN, 2004;
BROSNAN e SUN, 2004).
O emprego de “nariz eletrônico” para a avaliação dos compostos voláteis
constituintes do flavor da carne foi proposto por Haugen e Kvaal (1998). O sistema
utiliza tecnologia com sensor do estado gasoso, combinado com processamento de
análise multivariada (rede neural), para análise não destrutiva de compostos voláteis
constituintes do flavor em carnes. O sistema pode ser utilizado para o controle da
qualidade da carne crua ou na produção de produtos cárneos. Contudo, esta técnica
não pode substituir completamente os métodos de referência os quais utilizam
materiais certificados para validação. O emprego do nariz eletrônico no controle de
qualidade de alimentos também foi elucidado por Winquist e colaboradores (1993),
Eklov e outros (1998), Schaller e outros (1998), Blixt e Broch (1999), Boothe e
Arnold, (2002) e Haugen (2001).
Há poucos anos, os primeiros trabalhos sobre língua eletrônica foram
publicados (VLASOV et al., 1996 e 1997; SANGODKAR et al., 1996; DI NATALE et
al., 1996; WINQUIST et al., 1997; LEGIN et al., 1997). Este sistema constitui-se de
uma rede de sensores, geralmente potenciométricos, voltamétricos, condutimétricos
ou amperométricas, associados algoritmos de análise multivariada, classificam e
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
12
diferenciam grupos, bem como permitem a determinação de espécies de interesse
em amostras de alimentos líquidos. Atualmente, a língua eletrônica está sendo
empregada para diversas finalidades, como para a caracterização e classificação de
vinhos (BURATTI et al., 2004; LEGIN et al., 2003), monitoração de processos
fermentativos (LEGIN et al., 2004; TURNER et al., 2003); classificação de bebidas
não alcoólicas (CIOSEK et al., 2004); determinação de nitrato na presença de cloreto
(GALLARDO et al., 2004); classificação de leites (SIM et al., 2003).
São escassas, até o momento, pesquisas que fazem uso de língua eletrônica
para o controle da qualidade de carnes. Kaneki e colaboradores (2004) utilizaram
sensores potenciométricos de Pt, CuS e Ag2S para detectar compostos orgânicos
sulfurados (putrescina e dimetilsulfeto – DMS).
Arjona e colaboradores (1998) propuseram um método completamente
automatizado para determinar os parâmetros mais comuns em produtos cárneos
curados como concentração de NO2-, NO3
- e NaCl. A proposta para a completa
automação foi baseada no acoplamento de uma estação robotizada para as
operações preliminares (medida da massa de amostra, homogeneização, lixiviação,
filtração e transporte para a zona de aspiração), associada a sistema em fluxo
contínuo para a monitoração espectrofotométrica dos produtos das reações. A
implementação desta proposta eliminaria o congestionamento nos laboratórios de
controle de qualidade de produtos cárneos. No entanto, nos laboratórios oficiais,
onde a demanda para análise destes produtos cárneos depende de programas e
ações de inspeção sanitária, a instalação de sistema robotizado, altamente
especializado, apesar de toda a sua modernidade, seria pouco utilizado.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
13
1.4.2 – Automação em sistemas em fluxo
A automação de procedimentos analíticos envolve o emprego de sistemas
onde não haja interferência humana, ou seja, há a combinação de aparatos
eletromecânicos para substituir, aprimorar e/ou suplementar o desempenho e a
inteligência humana (VALCARCEL e LUQUE DE CASTRO, 1987). Logo, a
automação permite a obtenção de um grande número de informações químicas pela
análise de um elevado número de amostras.
A automação de procedimentos analíticos tem incrementado parâmetros de
qualidade como, exatidão, precisão, sensibilidade, seletividade, estabilidade e custo
de análise destes métodos (PINTO, 2002).
Os sistemas de análises por injeção em fluxo (FIA) foram primeiramente
descritos por Ruzicka e Hansen (1975, 1980). A analise em sistema FIA, baseia-se
na inserção de uma alíquota da amostra, na forma líquida, cujo volume é definido em
função das dimensões da alça de amostragem, no percurso analítico onde poderá
ser combinada com outros reagentes enquanto é transportada por uma solução
carregadora para o sistema de detecção. A inserção da amostra no percurso
analítico pode ser feita empregando injetor comutador proporcional, válvula rotativa
ou válvula solenóide. Hipoteticamente, a amostra desloca-se no percurso analítico
em regime de fluxo laminar, dispersando-se fisicamente de forma reprodutível e
produzindo uma zona de amostra bem definida capaz de ser detectada sob a forma
de um sinal transiente (RUZICKA e HANSEN, 1989).
Segundo Valcarcel e Luque de Castro (1987), as principais características dos
sistemas em fluxo (FIA) são: (a) o fluxo não deverá ser segmentado por bolhas de
ar; (b) a amostra deve ser inserida diretamente no fluxo; (c) a alíquota da amostra
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
14
injetada é transportada no sistema, podendo sofrer processos físico-químicos como
diálise, extração líquido-líquido e reações químicas durante o transporte; (d) a
dispersão ou diluição parcial do analito no transporte até o detector pode ser
manipulada, variando a geometria e as condições hidrodinâmicas do sistema; (e) a
detecção deve ser realizada por sistema de detecção contínua, o qual deve produzir
sinal transiente correspondente a uma das propriedades da espécie química sob
investigação; os sinais transientes devem ser apropriadamente registrados; (f) nem o
equilíbrio físico (o qual envolveria a homogeneização), nem o equilíbrio químico
(onde haveria a reação completa) têm sido alcançado quando do registro do sinal; e,
(g) os intervalos de tempo das operações envolvidas no sistema em fluxo deverão
ser reprodutíveis, visto que as medidas são feitas sob condições de não-estabilidade
e pequenas variações poderão acarretar em alterações no resultado.
Nos últimos anos foi intensificado o emprego de sistemas de análise em fluxo
no campo da análise de alimentos, como demonstrado nos trabalhos de Agater e
Jewsbury (1997). Neste trabalho, era descrito um sistema FIA para a determinação
de vitamina C em amostras de sucos de frutas e suplementos alimentares por
quimioluminescência. Martelli e colaboradores (2001), descreveram um sistema para
determinação de ácido láctico em iogurte. Nogueira e colaboradores (1998)
empregaram sistema de análise em fluxo para a determinação de iodo em amostras
de leite, baseado na ação catalítica do iodo na diminuição da cor do complexo
FeSCN2+. A determinação de NO2- e NO3
- em amostras de produtos cárneos foi
demonstrada no trabalho de Kazemzadeh e Ensafi (2001), no qual o sistema FIA
proposto era baseado na reação do nitrito e nitrato com safranina-O.
Sistemas engenhosos para análises discriminatórias foram propostos por
Gonzalez e outros (2002) e Mannino e outros (1999) para a caracterização de
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
15
corantes naturais e artificiais em amostras de alimentos e de antioxidantes em
amostras de azeite de oliva, respectivamente. Lima e colaboradores (1999)
apresentaram um sistema de análise por injeção em fluxo, com detecção
potenciométrica equipado com eletrodo tubular seletivo à amônia e unidade difusora
de gás para determinação de nitrogênio total e conseqüentemente proteínas em
amostras de leite e derivados. Uma excelente revisão sobre sistemas de análise
discriminatória em sistema de análise em fluxo foi reportada por Valcárcel e
colaboradores (2002).
Na grande maioria das vezes, as análises em sistema de fluxo apresentam
inúmeras vantagens quando comparada com aquelas em batelada, empregadas
pelos laboratórios oficiais. O baixo consumo de reagentes e amostras, diminuição da
produção de resíduos químicos, o aumento da produtividade analítica, o emprego de
aparatos de pequenas dimensões e, em geral, desenvolvidos nos próprios
laboratórios, foram algumas das muitas vantagens apresentadas (CHRISTIAN e
RUZICA, 1987; RUZICKA e HANSEN, 1987; 1989). Outra vantagem que deve ser
ressaltada nos sistemas em fluxo é a substituição das vidrarias comumente
utilizadas em laboratórios (béqueres, pipetas, buretas, etc) por tubos, bombas e
válvulas, os quais refletem no contato mínimo entre o operador e reagentes tóxicos
além de protegê-los dos gases da atmosfera e de possíveis contaminações
(VALCARCEL e LUQUE DE CASTRO, 1987).
1.4.3 – Espectroscopia na região do infravermelho próximo – NIRS
A indústria de alimentos ocupa o segundo lugar, perdendo para a agricultura,
na qualidade de usuária da espectroscopia na região do infravermelho próximo –
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
16
NIRS, como técnica aplicada ao controle de qualidade dos alimentos. Isto porque,
segundo McClure (1994), a NIRS apresenta vantagens sobre as outras técnicas
espectroscópicas como:
a) Rapidez, os espectros podem ser tirados em torno de 30 s, sem contar que a
amostra não necessita sofrer pré–tratamentos, economizando tempo e
reagentes, sendo considerada uma técnica limpa. A amostra poderá ser
analisada e devolvida ao conjunto de amostras ou ser analisada em linha.
b) É uma técnica não destrutiva. A mesma amostra poderá ser utilizada para
outros procedimentos analíticos ou retornar à população.
c) Mais de um analito poderá ser determinado a partir de um único espectro.
d) O instrumento é de fácil operação, não sendo necessário pessoal altamente
qualificado.
Apesar de tantas qualidades, o trabalhoso processo de calibração, ainda é um
fator limitante na espectroscopia NIR. Para tanto, é necessário que um grande
número de amostras sejam analisadas pelo método de referência e pelo NIR. Tempo
e esforço consideráveis têm que ser gastos para se determinar os comprimentos de
onda ótimos a serem selecionados na análise. A partir desse estudo são
desenvolvidas e testadas equações que relacionam as reflectâncias e/ou
absorbâncias medidas com o valor do analito em questão (SKOOG et al., 2002).
A espectroscopia no infravermelho próximo é uma das técnicas mais
promissoras para avaliação da qualidade da carne em larga escala. Técnicas
rápidas de screening para determinar a qualidade da carne são de grande interesse
para a indústria e os consumidores (GEESINK et al.; 2003).
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
17
A espectroscopia NIR tem sido utilizada como uma ferramenta versátil para a
análise de alimentos, ainda mais quando associada à análise multivariada, como
descrito nos trabalhos de Naes et al. (1996) e Dstefanis et al. (2000).
Para o grupo de carnes e produtos cárneos, a espectroscopia NIR tem sido
explorada para avaliação de parâmetros de qualidade como coloração, maciez, teor
de gordura, teor de proteínas, umidade e flavor, tanto em processos na linha de
produção, quanto em análises discretas (TOGERSEN et al., 1999; BRONDUM et al.;
2000; LIU et al., 2003, GEESINK et al., 2003).
Isaksson e colaboradores (1996) determinaram a concentração de gordura,
umidade e proteína por espectroscopia NIR diretamente em carnes moída saídas de
um moinho e concluíram que a utilização do NIR on line forneceu resultados
compatíveis para a proteína, umidade e gordura. Estudo semelhante foi realizado
por Togersen e outros (2003), que determinaram o teor de umidade, proteína e
gordura em lotes de carnes congeladas durante a moagem, utilizando NIR on line.
Este trabalho focava o desenvolvimento e implementação de um sistema NIR on line
sem contato com a amostra. A carne crua semicongelada, depois de moída, passava
pelos furos do moedor, onde eram registrados os espectros.
Byrne e colaboradores (1998) propuseram a aplicação da espectroscopia de
reflectância NIR entre 750 e 1098 nm, para avaliar os atributos sensoriais da carne
como a maciez, textura, flavor e aceitabilidade. A identificação de fraudes, como, por
exemplo, mistura de carnes de diferentes espécies, também pôde ser avaliada por
NIRS, como demonstrado no trabalho de Cozzolino e Murray (2004), no qual, carnes
de frango, boi, porco e cordeiro foram homogeneizadas e seus espectros foram
tirados na região de 400 – 2500 nm (VIS/NIR). O modelo criado classificou mais de
80% das amostras de carnes de acordo as respectivas espécies.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
18
Alomar e colaboradores (2003) utilizaram o NIR para diferenciar tipos de
músculos e as categorias de cruzamento das raças FRIESIAN e HEREFORD de
acordo com os padrões chilenos para carcaças bovinas, além da realização da
composição centesimal das carnes. A composição foi feita pela determinação do
extrato seco, gordura, proteínas, cinzas e colágeno. As análises discriminatórias por
regressão parcial dos mínimos quadrados (PLS) identificaram corretamente as raças
e os três tipos de músculos estudados. As concentrações de cinzas e colágeno, não
foram realizadas com sucesso pelo NIR.
1.5 – Considerações Complementares
A Tabela 1.1 mostra um panorama das metodologias recomendadas pelo
MAPA e as metodologias alternativas disponibilizadas na literatura para os diversos
analitos investigados em carnes e produtos cárneos.
Enfim, considerando as tendências da Química Analítica moderna, há que se
admitir que as metodologias oficiais empregadas para o controle da qualidade de
carnes e derivados se constituem, em sua maioria, em técnicas morosas e
dispendiosas. Os sistemas automatizados, dotados ou não de inteligência artificial,
muitas vezes montados na própria linha da indústria, apresentam-se como sistemas
alternativos e verifica-se que a tendência é de que estes sistemas sejam divulgados,
multiplicados e utilizados tanto nos laboratórios de controle de qualidade quanto nos
laboratórios oficias e credenciados do sistema de fiscalização.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
19
Tabela 1.2: Panorama evolucionário das metodologias empregadas para controle de qualidade de carnes e produtos cárneos comparadas com as metodologias recomendadas pelo MAPA
Analíto Técnica/método
analítico MAPA
Técnica analítica alternativa Referência
Acidez Volumetria (neutralização)
FIA / biossensores Bergann et al .,1999
Amido Volumetria (Método de Lane-Eynon)
Método enzimático (amilase e amiloglicosidase)
Skrede, G. 1983
Nitrito e nitrato
Espectrofotometria FIA / espectrofotometria Cromatografia líquida
Ahmed et. al., 1996; Ferreira et. al. 1996; Arjona et al., 1998; Kazemzadeh e Ensafi, 2001 Siu e Henshall, 1998 Tanaka et al.; 1982 Dennis et al, 1990
pH Potenciometria (eletrodo de vidro combinado)
Sondas Espectrofotometria no infra vermelho próximo NIR RMN - ressonância magnética do P
Monin ,1998 Andersen,1999 Monin, 1998
Lipídios Extração por Soxhlet, e hidrólise ácida
Extração com fluídos supercríticos Espectrofotometria no infra vermelho próximo (NIR)
Giuseppe et al., 2004 Togersen et al., 1999; Brondum et al.; 2000; Liu et al., 2003, Geesink et al., 2003. Isaksson et.al.,1996.
Cloreto Calcinação seguida de titulação
FIA / sistema robotizado FIA / potenciometria FIA / espectrofotometria
Arjona et al., 1998 Ferreira et al., 1994
Ferreira et al., 1996
N total -Proteínas
Digestão ácida seguida de destilação e posterior titulação (Kjeldahl)
Espectroscopia no infravermelho próximo (NIR)
Togersen et al., 1999; Brondum et al.; 2000; Liu et al., 2003, Geesink et al., 2003. Isaksson et.al.,1996.
Umidade Gravimetria
Espectroscopia no infravermelho próximo (NIR)
Togersen et al., 1999; Brondum et al.; 2000; Liu et al., 2003, Geesink et al., 2003. Isaksson et.al.,1996.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
20
Apesar do avanço no desenvolvimento de novas metodologias, ainda há
muito que fazer nesta área, pois a cada dia surgem tecnologias inovadoras e limpas.
Enfim, um cenário futurista onde fosse priorizado o desenvolvimento de
procedimentos precisos, exatos, sensíveis, robustos, confiáveis, com custos
operacionais reduzidos, menor produção de resíduo e com elevada produtividade
analítica.
1.6 – Objetivos
Os objetivos desta tese são:
Desenvolvimento de sistema automatizado para avaliação da degradação e
produção de gás sulfídrico em carnes empregando câmara de pervaporação;
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitritos e
nitratos em produtos cárneos, utilizando câmara de tubos concêntricos;
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória
de sulfito em carnes empregando o método da p-rosanilina por difusão gasosa;
Avaliação da capacidade sortiva da carne bovina por íons metálicos.
1.7 – Referências Bibliográficas
AGATER, I. B.; JEWSBURY, R. A. Direct chemiluminescence determination as
ascorbic acid using flow injection analysis. Anal. Chim. Acta. v.356, p. 289-294.
1997.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
21
AHMED, M. J.; STALIKAS, C. D.; TZOUWARAKARAYANNI, S. M.; et al.
Simultaneous spectrophotometric determination of nitrite and nitrate by flow-
injection analysis. Talanta. v. 43, n. 7, p. 1009 – 1018. 1996.
ALOMAR, D.; GALLO, C.; CASTAÑEDA, M.; et al. Chemical and discriminant
analysis of bovine meat by near infrared reflectance spectroscopy (NIRS). Meat
Science. v. 63, p. 441-450. 2003.
ANDERSEN, J. R.; BORGGAARD, C.; RASMUSSEN. A. J.; et al. Optical
measurements of pH in meat. Meat Science. v. 53, p. 135-141. 1999.
ARJONA, A. V.; GARRIDO, J. A. G.; ZAFRA, R. Q.; et al. Full automated robotic
method for the determination of chloride, nitrite and nitrate in cured meat
products. Talanta. v. 46, p. 969-976. 1998.
ARVANITOYANNIS, I. S.; VAN HOUWELINGEN – KOUKALIAROGLOU, M.
Implementation of chemometrics for quality control and authentication of meat
and meat products. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. v. 42, n. 2, p.
173 – 218. 2003.
BERGANN, T.; GIFFEY, K.; ABEL, P. Concentration of lactic acid in carcasses and
fresh meat – estimation with an enzymatic – biosensor measurement system.
Fleischwirtschaft. v. 79, n. 11, p. 84 – 87. 1999.
BLIXT, Y.; BORCH, E. Using an electronic nose for determining the spoilage of
vacuum-packaged beef. International Journal of Food Microbiology. v. 46, n. 2,
p. 123-134. 1999.
BOOTHE, D. D. H.; ARNOLD, J. W. Electronic nose analysis of volatile compounds
from poultry meat samples, fresh and after refrigerated storage. Journal of The
Science of Food and Agriculture. v. 82, n. 3, p. 315-322. 2002.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
22
BRASIL, Ministério da Agricultura. Instrução Normativa nº 20. Métodos Analíticos
Físico-Químicos para Controle de Produtos Cárneos e seus Ingredientes. Diário
Oficial da União de 21 de julho de 1999.
BRASIL, Ministério da Agricultura. Instrução Normativa nº 42 de 20 de dezembro de
1999. Plano Nacional de Controle de Resíduos em Produtos de Origem Animal.
Diário Oficial da União de 21 de dezembro de 1999.
BRASIL, Ministério da Saúde. Portaria nº 33, de 13 de janeiro de 1998. Adota
valores como níveis de IDR para as vitaminas, minerais e proteínas. Diário Oficial
da União de 16 de janeiro de 1998.
BRONDUM, J.; MUNCK, L.; HENCKEL, P.; et al. Prediction of water-holding capacity
and composition of porcine meat by comparative spectroscopy. Meat Science.
v. 55, p. 177 – 185. 2000.
BROSNAN, T.; SUN, D. W. Improving quality inspection of food products by
computer vision – a review. Journal of Food Engineering. v. 61, n.1, p. 3 – 16.
2004.
BURATTI, S.; BENEDETTI, S.; SCAMPICCHIO, M.; PANGEROD, E. C.
Characterization and classification of Italian Barbera wines by using an
electronic nose and an amperometric electronic tongue. Analytica Chimica Acta.
v. 525, n.1, p. 133-139. 2004.
BYRNE, C. E.; DOWNEY, G. TROY, D.J.; et al. Non-destructive prediction of
selected quality attributes of beef by near-infrared reflectance spectroscopy
between 750 and 1089 nm. Meat Science. v. 49, n. 4, p. 399 – 409. 1998.
CHEFTEL, J. C.; CHEFTEL, H. Introdution a la Bioquímica y Tecnologia de los
Alimentos. V. 1. Zaragoza: Acribia, 1986.
CHEFTEL, J. C.; et al. Proteinas Alimentarias. Zaragoza: Acribia.1989.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
23
CHRISTIAN, G. D.; RUZICKA, J. Flow injection analysis: a novel tool for plasma
spectroscopy. Spectrochimica Acta. v. 42-B, Nos ½, p. 157 – 167. 1987.
CIOSEK, P.; BRZOZKA, Z.; WROBLEWSKI, W. Classification of beverages using a
reduced sensor array. Sensors And Actuators B-Chemical. v.103, n.1-2, p. 76 –
83. 2004.
COSTA, E. C.; RASTLE, J.; BRONDANI, L. I.; et al. Composição física da carcaça,
qualidade da carne e conteúdo de colesterol no músculo Longissimus dorsi de
novilho Red Angus superprecoces, terminados em confinamento e abatido com
diferentes pesos. R. Bras. Zootec. v.31, n 1, p. 417-428. 2002.
COZZOLINO, D.; MURRAY, I. Identification of animal meat muscles by visible and
near infrared reflectance spectroscopy. Lebensmittel – Wissenschaft und –
technologie. v. 37, n. 4, p. 447 – 452. 2004.
DENNIS, M. J.; KEY, P.; PAPWORTH, T.; POINTER, M,; MASSEY, R. C. The
determination of nitrate and nitrite in cured meat by HPLC/UV. Food Addit
Contam. v. 7, n. 4. p. 455 – 461.
DESTEFAINS, G.; BARGE, M. T.; BRUGIAPAGLIA, A. et al. The use of principal
component analysis (PCA) to caracterize beef. Meat Science. v. 56, p. 255-259.
2000.
DI NATALE, C.; MACAGNANO, A.; DAVIDE, F.; et al. Multicomponent analysis on
polluted waters by means of an electronic tongue. Sensors And Actuators B-
Chemical. v. 44, n. 1-3, p. 423-428. 1997.
DU, C. J.; SUN, D. W. Recent developments in the applications of image processing
techniques for food quality evaluation. Trends in Food Science & Technology.
v.15, n. 5, p. 230 – 249. 2004
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
24
EKLOV, T.; JOHANSSON, G.; WINQUIST, F.; et al. Monitoring sausage fermentation
using an electronic nose. Journal of Food Science and Agriculture. v. 76, n.4, p.
525 – 532. 1998.
FERREIRA, E. C.; RODRIGUES, S. H. B. G.; FERREIRA, M. M. C.; et al. Análise
exploratória dos teores de constituintes inorgânicos em sucos e refrigerantes de
uva. Eclet. Quim. v. 27, n. especial, p. 77 – 90. 2002.
FERREIRA, I. M. P. V. O.; LIMA, J. L. F. C.; MONTENEGRO, M. C. B., S., M.; et al.
Simultaneous assay of nitrite, nitrate and chloride in meat products by flow
injection. Analyst. v. 121, p. 1393 – 1396. 1996.
FERREIRA, I. M. P. V. O.; LIMA, J. L. F. C.; RANGEL, A. O. S. S. Flow- injection
titration of chloride in food-products with a silver tubular electrode based on na
homogeneous crystalline membrane. Food Chemistry. v. 50, n. 4, p. 423 – 428.
1994.
GALLARDO, J.; ALEGRET, S.; DEL VALLE, M. A flow-injection electronic tongue
based on potentiometric sensors for the determination of nitrate in the presence
of chloride. Sensors And Actuators B-Chemical. v.101, n.1-2, p. 72-80. 2004.
GEESINK, G, H.; SCHREUTELKAMP, F. H.; FRANKHUIZEN, R.; et al. Prediction of
pork quality attributes from near infrared reflectance spectra. Meat Science. v.
65, n. 1, p. 661 – 668. 2003.
GERRARD, D. E.; GAO, X.; TAN, J. Beef marbling and color score determination by
image processing. Journal of Food Science. v. 61, n. 1, p. 145-148. 1996.
GIUSEPPE, P.; OMBRETTA, M.; LUIGI, M.; et al. Rapid determination of total fats
and fat-soluble vitamins in Parmigiano cheese and salami by SFE. Lebensm –
Wiss – technol. v. 37, p. 87 – 92. 2004.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
25
GONZÁLEZ, M. I.; GALLEGO, M e VALCÁRCEL, M. Automatic screening method
for the rapid and simple discrimination between synthetic and natural colorants
in foods. Analítica Chimica Acta. v. 464, p. 237-247. 2002.
HATEM, I; TAN, J; GERRARD, D. E. Determination of animal skeletal maturity by
image processing. Meat science. v. 65, n. 3, p. 999 – 1004. 2003.
HAUGEN, J. E. Electronic nose in food analysis. Headspace Analysis of Food and
Flavors Advances in experimental Medicine and Biology. v. 488, p. 43 – 57. 2001.
HAUGEN, J. E.; KVAAL, K. Electronic nose and artificial neural network. Meat
Science. v.49, n.suppl. 1, p. S273-286. 1998.
IBGE. População residente. Pesquisa da população residente. Consultado em
03/02/2005. Disponível em: www.ibge.gov.br/home/estatistica/populacao/
trabalhoerendimento/pnad2003/sintese. 2004.
IBGE/DPE/COAGRO. Pesquisa Trimestral do Abate de Animais. Consultado em
03/02/2005. Disponível em www.ibge.gov.br/home/estatistica/economia/
agropecuaria/censoagro. 2004
ISAKSSON, T.; NILSEN, B. N.; TOGERSEN, G.; et al. On-line, proximate analysis of
ground beef directly at a meat grinder outlet. Meat Science. v. 43, n. 3 e 4, p.
245-253. 1996.
JAMES, S. The chill chain “from carcass to consumer”. Meat Science, v. 43, p.
S203-S216. 1996.
KANEKI, N.; MIURA, T.; SHIMADA, K.; et al. Measurement of pork freshness using
potentiometric sensor. Talanta. v. 62, n.1, p. 217-221. 2004.
KAZEMZADEH, A.; ENSAFI, A. A. Sequential flow injection spectrophotometric
determination of nitrite and nitrate in various samples. Analytica Chimica Acta.
v. 422, p. 319-326. 2001.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
26
LEGIN, A.; KIRSANOV, D.; RUDNITSKAYA, A.; et al. Multicomponent analysis of
fermentation growth media using the electronic tongue (ET). Talanta. v. 64, p. 3,
n. 766-772. 2004.
LEGIN, A.; RUDNITSKAYA, A.; LVOVA, L.; et al. Evaluation of Italian wine by the
electronic tongue: recognition, quantitative analysis and correlation with human
sensory perception. Analytica Chimica Acta. v. 484, n.1, p. 33-44. 2003.
LEGIN, A.; RUDNITSKAYA, A.; VLASOV, Y.; et al. A Tasting of beverages using an
electronic tongue. Sensors And Actuators B-Chemical. v. 44, n. 1-3, p. 291-296.
1997.
LIMA, J. F. C. C.; MATOS, C. D.; VAZ. M. C. Flow injection analysis of Kjeldahl
nitrogen in milk and dairy products by potenciometric detection. Analytica Chimica
Acta. v. 385. p. 437- 441. 1999.
LINKO, S. Expert systems – what can they do for the food industry? Trends in Food
Science & technology. v. 9, p. 3 -12. 1998.
LIU,Y.; LYON, B. G.; R. WINDHAM, W. R.; REALINI, C. E.; et al. Prediction of color,
texture, and sensory characteristics of beef steaks by visible and near infrared
reflectance spectroscopy. A feasibility study. Meat Science. v. 65, n. 3, p. 1107 –
1115. 2003.
MANNINO, S.; BURATTI, S.; COSIO, M. S.; et al. Evaluation of the “antioxidant
power” of olive oils based on a FIA system with amperometric detection. The
analyst. v. 124, p. 1115 – 1118. 1999.
MARTELLI, P. B.; REIS, B. F.; ARAUJO, A. N.; et al. A flow system with a
conventional spectrophotometer for the chimiluminescent determination of lactic
acid in yoghurt. Talanta . v. 54, p. 879 – 885. 2001.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
27
McCLURE, W. F. In Spectroscopic techniques for food analysis. New York: VCH
publishers. 1994. p. 13 – 57.
MONIN, G. Recent methods for predicting quality of whole meat. Meat Science, v.
49, p. S231 – S243. 1998.
NAES, T.; BAARDSETH, P.; HELGESEN, H.; et al. Multivariate techniques in the
analysis of meat quality. Meat Science. v. 43, p. S 135-S 149. 1996.
NOGUEIRA, A. R. A.; MOCKIUTI, F.; SOUZA, G. B.; PRIMAVESI, O. Flow injection
spectrophotometric catalytic determination of iodine in milk. Analytical Sciences.
v. 14, p. 559 – 564. 1998.
PARDI, M. C.; SANTOS, I. F.; SOUZA, E. R.; PARDI, H. S. Ciência, Higiene e
Tecnologia da Carne. 2ª ed. Goiás: UFG. 2001. V.1, 623p.
PERIS, M. Present and future of expert systems in food analysis. Analytica Chimica
Acta. v. 454, p.1-11. 2002.
PHILIPPI, S. T. Tabela de Composição de Alimentos: suporte para a decisão
nutricional. Brasília: Finacet/UnB, 2001.107p.
PINTO, I. V. O. S. Desenvolvimento de sistemas automáticos baseados em técnicas
de fluxo contínuo para monitorização de parâmetros ambientais e industriais.
2002. 250 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) Faculdade de
Farmácia da Universidade do Porto, Portugal. 2002.
RIEDEL, G. Controle Sanitario dos Alimentos. 2ª ed. São Paulo: Atheneu. 1992.
320p.
RUZICKA, J.; HANSEN, E. H. Flow injection analyses: Part I. A new concept of fast
continuous flow analysis. Analytica Chimica Acta, v.78, n.1, p. 145 – 157. 1975.
RUZICKA, J.; HANSEN, E. H. Flow Injection Análysis, 2nd. New York: Wiley. 1989.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
28
RUZICKA, J.; HANSEN, E. H. Flow injection analysis, principles, applications and
trends. Analytica Chimica Acta. v. 114, p. 19 – 44. 1980.
SALINAS, R. D. Alimentos e Nutrição. Introdução à Bromatologia. 3ª ed. Porto
Alegre: Artmed. 2002. 278 p.
SANGODKAR, H.; SUKEERTHI, S.; SRINIVASA, R. S.; et al. A biosensor array
based on polyaniline. Analytical Chemistry. v. 68, n. 5, p. 779 –783. 1996.
SCHALLER, E.; BOSSET, J. O.; ESCHER, F. Electronic nose and their application to
food. Food Science and Technology – Lebensmittel – Wissenschaft &
Technology. v. 31, n. 4, p. 305 – 316, 1998.
SGARBIERI, V. C. Proteínas em alimentos protéicos. Propriedades – Degradação
– Modificações. São Paulo: Livraria Varela, 1996. 517 p.
SIM, M. Y. M.; SHYA, T. J.; AHMAD, M. N. Monitoring of milk quality with disposable
taste sensor. Sensors. v. 3, n. 9, p. 340-349. 2003.
SIU, D. C.; HENSHALL, A. Ion chromatographic determination of nitrate and nitrite in
meat products. J. Chromatogr. A. v. 804, n. 1-2, p. 157-60.1998.
SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípio de Análise Instrumental. 5ª
edição. Rio Grande do Sul: Bookman. 2002. p. 380.
SKREDE, G. An enzymatic method for the determination of starch in meat products.
Food Chemistry. v. 11, n. 3, p. 175 – 185. 1983.
TAN, J. Meat quality evaluation by computer vision. Journal of Food Engineering.
v. 61, p. 27 – 35. 2004.
TANAKA, A.; NOSE, N.;IWASAKI, H. Determination of nitrate in meat products and
cheese by gas-liquid chromatography with electron-capture detection. J.
Chromatogr. A. v. 235, n. 1, p. 173-185.1982.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
29
TOGERSEN, G.; ARNESEN, J. F.; NILSEN, B. N.; et al. On-line prediction of
chemical composition of semi-frozen ground beef by non-invasive NIR
spectroscopy. Meat Science. v. 63, p. 515-523. 2003.
TOGERSEN, G.; ISAKSSON, T.; NILSEN, B, N.; et al. On-line NIR analysis of fat,
water and protein in industrial ground meat batches. Meat Science. v. 51, p. 97-
102. 1999.
TURNER, C.; RUDNITSKAYA, A.; LEGIN, A. Monitoring batch fermentations with an
electronic tongue. Journal of Biotechnology. v. 103, n.1, p. 87 – 91. 2003.
VALCÁRCEL, M.; CÁRDENAS, S.; GALLEGO, M. Continuous flow systems for rapid
sample screening. Trends in analytical Chemistry. v. 21, n. 4, p. 251 – 258
2002.
VALCÁRCEL, M.; LUQUE DE CASTRO, M. D. Flow injection analysis. Principles and
applications. New York: Ellis Horwood Limited. 1987.399 p.
VILLARROEL, M.; MARIA, G. A.; SANUDO, C.; et al. Effect of transport time on
sensorial aspects of beef meat quality. Meat science. v. 63, p. 353-357. 2003.
VLASOV, Y. G.; LEGIN, A. V., RUDNITSKAYA, A. M.; et al. Chemical analysis of
multicomponent aqueous solutions using a system of nonselective sensors and
artificial neural networks. Journal of Analytical Chemistry. v. 52, n.11, p. 1087-
1092. 1997.
VLASOV, Y.; LEGIN, A.; RUDNITSKAYA, A. Cross-sensitivity evaluation of chemical
sensors for electronic tongue: determination of heavy metal ions. Sensors and
Actuators B-Chemical. v. 44, n.1-3, p, 532-537. 1997
WINQUIST, F.; HORNSTEN, E. G.; SUNDGREN, H.; et al. Performance of an
electronic nose for quality estimation of ground meat. Measurement Science &
Technology. v. 4, n. 12, p. 1439 – 1500. 1993.
Panorama atual e novas tendências dos processos analíticos
30
WINQUIST, F.; WIDE, P.; LUNDSTROM, I. An electronic tongue based on
voltammetry. Analytica Chimica Acta. v. 357, n.1-2, p. 21-31. 1997.
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
31
CAPÍTULO 2
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás
sulfídrico em carnes integrado a uma câmara de
pervaporação
2.1 – Introdução
A carne e os produtos cárneos, quando em processo de deterioração, liberam
H2S, oriundo do enxofre desprendido das pontes dissulfídicas das estruturas
protéícas (cisteína, metionina), ou proveniente do metabolismo de bactérias
contaminantes da carne. O H2S confere à carne um odor característico de
putrefação, o qual torna-se um indicador do processo de degradação. Estas
modificações ocorrem, pois a carne está sujeita a alterações ocasionadas pelas
próprias enzimas tissulares e pela atividade microbiana, devido à natureza perecível
de sua matéria (PARDI et al.; 2001).
Entre as bactérias que colonizam a carne, as que causam danos às
propriedades organolépticas, são encontradas no grupo das não patogênicas, como
as Pseudomonas, Acinetobacter, Aeromonas, Aeromonas putrefaciens e
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
32
Lactobacillus. Já no grupo considerado de elevada patogenicidade para o homem
podem ser citadas a Escherichia coli O157:H7, Salmonela sp, Listeria
monocitogenes, Compilobacter, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens,
Stafilococcus aureus, Aeromonas hydrofila e Bacillus cereus (HUFFMAN, 2002).
Nicol e colaboradores (1970) isolaram grupos de bactérias produtoras de H2S
em amostras de carnes resfriadas e entre estes, as Pseudomonas se apresentaram
em maior número. McMeekin e outros (1978), em trabalho semelhante, identificaram
grupos de bactérias formadoras de H2S em carcaças de frangos resfriados e entre
os grupos isolados as Pseudomonas também, foram encontradas em maior número.
A produção de H2S em carnes, além de conferir odor desagradável, pode levar a
produção da sulfomioglobina, pigmento esverdeado que descaracteriza a coloração
vermelha de carnes e é formado, durante o armazenamento, pela ligação de sulfetos
com a mioglobina (pigmento que confere coloração vermelha à carne). Geralmente,
para que isso ocorra é necessário uma atmosfera com baixa pressão de oxigênio (~
1%, v/v) e que o pH seja superior a 6,0 (NICOL et al., 1970).
Lapin e Koburger (1974) avaliaram a produção de H2S por Pseudomonas
putrefaciens em camarões embalados em atmosfera modificada com N2. Esses
camarões desenvolveram odor fétido, diferentemente daqueles que foram
armazenados em atmosfera oxigenada, pois a população microbiana desenvolvida
em atmosfera de N2 produziu maior concentração de H2S do que aqueles
desenvolvidos em atmosfera aeróbia. Observaram também que, a bactéria
Pseudomonas putrefaciens esteve presente nas amostras de camarões frescos, em
pequeno número, quando armazenado em atmosfera aeróbia e em grande número
nos camarões em N2. Por outro lado, este estudo revelou que, os aminoácidos
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
33
cistina e cisteína foram os prováveis substratos, utilizados pelos microrganismos,
para a produção de H2S.
Além do H2S, outros compostos sulfurados podem ser desenvolvidos durante o
processo de deterioração de alimentos protéicos. Chinivasagam e colaboradores
(1998) monitoraram a formação de compostos voláteis em lagostas, associados à
deterioração microbiana e ao período de armazenamento. Observaram a presença
de metildissulfeto e metilssulfeto nas amostras de lagosta após um dia de
armazenamento. Acima de oito dias de armazenamento o número de compostos
voláteis aumentou e, além dos compostos citados anteriormente, detectaram a
presença de CS2 e de outros sulfetos orgânicos.
Como já elucidado, a causa do odor não característico em produtos cárneos
e/ou protéicos deve-se principalmente à formação de compostos voláteis que podem
ser produzidos por bactérias ou pela hidrólise de aminoácidos, especialmente a
cistina, cisteína e metionina. Contudo, processos tecnológicos empregados na
conservação destes produtos também podem levar à produção de compostos
voláteis indesejados. A irradiação tem sido considerada um processo tecnológico
efetivo na inativação de microrganismos patogênicos em carnes cruas e cozidas. No
entanto, a irradiação poderá levar à formação de compostos voláteis oriundos tanto
da fração lipídica, quanto da protéica. Esta fração protéica é a principal responsável
pela produção de compostos voláteis sulfurados nestes produtos (FAN et al., 2002).
Várias técnicas analíticas empregadas para determinação de H2S e compostos
voláteis sulfurados em produtos cárneos têm sido reportadas na literatura. Entre
estas, podem ser citadas a cromatografia (CHINIVASAGAM et al., 1998; FAN et al.,
2002) e a espectrofotometria, pela reação do H2S com acetato de zinco (LAPIN e
KOBURGER, 1974).
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
34
Segundo Grassi e outros (2002), a pervaporação pode ser caracterizada
como a integração da evaporação com a difusão gasosa em um único módulo,
sendo uma alternativa viável à difusão gasosa. A separação por pervaporação pode
ser utilizada em amostras líquidas ou em suspensões.
A pervaporação comparada a outros modelos baseados em separação por
membranas (difusão gasosa, diálise, permeação) apresenta vantagens relacionadas
ao poder coligativo da membrana, o qual facilita a aderência de componentes de
elevada massa molar na superfície da membrana; e a deterioração da membrana,
com conseqüente diminuição de sua vida útil, pelo contato direto com a amostra. A
maior vantagem citada quando se compara pervaporação com difusão gasosa, por
exemplo, é o fato da amostra não entrar em contato direto com a membrana,
possibilitando o uso de matrizes complexas (VALLEJO et al., 2001).
A determinação de sulfeto por pervaporação em amostras líquidas e sólidas,
empregando sistema em fluxo foi otimizada por Vallejo e outros, (2001). Grassi e
outros (2002) empregaram pervaporação para determinar carbonato em amostras de
solo em sistema de análise em fluxo. Neste contexto, a pervaporação aponta como
um protocolo viável e exeqüível para determinação de sulfeto em amostras de carne.
No Brasil, o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento – MAPA,
oficializa métodos físico-químicos para o controle de qualidade de produtos cárneos
pela Instrução Normativa 20/99 (BRASIL, 1999). Para a determinação do H2S, o
Ministério recomenda o método fundamentado na liberação do H2S da carne para
impregnação deste em papel embebido com acetato de chumbo, formando uma
mancha escura, característica do PbS. Júnior e Paneta (1992), contestaram a
eficiência deste método e apontaram interferentes e limitações como presença de
temperos e especiarias, além do rígido controle da temperatura que se deve ter. Em
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
35
geral, as metodologias recomendadas pelos órgãos oficiais brasileiros apresentam
baixa produtividade analítica e consumo excessivo de reagentes.
Lawrence e outros (2000) apresentaram uma revisão sobre estratégias analíticas
para determinação de sulfeto, apontando vantagens e desvantagens de cada
método descrito. A determinação de sulfeto pelo método do azul de metileno foi
citada como a mais usual, e esta envolve a reação, em meio ácido, do sulfeto com o
N,N-dimetilfenil-1-4-diamina (DMPD) que, na presença de Fe3+, resulta na formação
do corante tiazol heterocíclico – azul de metileno. O azul de metileno formado pode
ser facilmente determinado por espectrofotometria no visível, alcançando limite de
detecção da ordem de 0,01 mg L-1.
Emil Fischer em 1886 foi quem primeiro descreveu a reação de produção do
azul de metileno (Figura 2.1) e este teste guarda até hoje, significante valor analítico
em termos de simplicidade, seletividade e sensibilidade (FISCHER apud
LAWRENCE et al., 2000).
Figura 2.1: Reação de formação do azul de metileno
O método do azul de metileno associado à análise em fluxo tem sido empregado
em procedimentos analíticos para determinação de sulfeto em amostras de água e
efluentes, como reportado por Leggett e outros (1981), Cassella e outros (2000) e
Lei e Dasgupta (1989). Contudo, são raras as referências deste método para análise
de sulfeto em alimentos.
N(CH3)2
NH2
H3O+
S
N
(CH3)2N N(CH
3)22S2- +
Fe3+
+
sulfeto DMPD Azul de Metileno
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
36
Neste contexto, desenvolveu-se um sistema automatizado em fluxo para análise
discriminatória de H2S oriundo de produtos cárneos, para avaliar o grau de
conservação e/ou deterioração destes produtos expostos ao consumo. O sistema foi
baseado na multicomutação. O conceito da multicomutação tem sido bastante
discutido e empregado em sistema de análise em fluxo, incrementando a
versatilidade e o potencial do sistema para automação (MARTELLI et al., 1995;
VIEIRA et al., 1998; ROCHA et al., 2002; ICARDO et al., 2002).
A multicomutação pode ser entendida como um mecanismo de introdução de
amostras e reagentes no percurso analítico de sistemas em fluxo. Estes reagentes e
amostras podem ser submetidos a diversas operações, como: fracionamento,
fatiamento, mistura seqüencial e aprisionamento sob diferentes condições. Um
número de alíquotas, de diferentes soluções miscíveis, pode ser introduzido no
sistema pelo emprego de um comutador, neste caso, válvulas solenóides
controladas por computador. Este fluxo singular pode ser visto como alíquotas
discretas de soluções que rapidamente se misturam enquanto são transportadas no
percurso analítico em direção ao detector. A mistura das alíquotas de amostra e
reagente é mais eficaz com a diminuição do volume das alíquotas das soluções.
Logo, a inserção de n pares de alíquotas da amostra/reagente resultará em 2n – 1
interfaces, onde a mistura irá ocorrer por dispersão axial (ROCHA et al., 2002).
Icardo e colaboradores (2002) descreveram algumas vantagens da
multicomutação, que são abaixo descritas:
(i) Miniaturização da montagem dos sistemas em fluxo devido ao pequeno
tamanho das válvulas solenóides e das interfaces eletrônicas, permitindo
o desenvolvimento de sistemas integrados compactos e equipamentos
portáteis, inclusive para emprego de análises in situ;
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
37
(ii) Consumo reduzido de reagentes e amostras devido a pequenos volumes
dispensados, podendo alcançar níveis de microlítros;
(iii) Aumento de reprodutibilidade, pois as válvulas solenóides requerem o
mínimo de intervenção do operador. A inserção de comandos liga /
desliga para cada válvula solenóide pode ser controlado por computador,
neste caso a multicomutação facilita o desenvolvimento de métodos
analíticos completamente automatizados;
(iv) Economia e simplicidade. As válvulas solenóides podem ser acionadas
por um simples pulso elétrico, geralmente 12 V e 100 mA, não
necessitando de suprimento adicional de energia. Ademais, esta
operação pode ser controlada por um software desenvolvido numa
linguagem comum de programação como o QuickBasic;
(v) Flexibilidade. A multicomutação permite a inserção de reatores com
diferentes comprimentos, variação no volume de amostras e reagentes.
Mudanças podem ser feitas, simplesmente, trocando a duração dos
pulsos elétricos que ligam as válvulas solenóides ou alterando a
seqüência de comutação.
As aplicações analíticas da multicomutação são bastante diversificadas,
podendo ser empregada para detecção do ponto final de titulações (KORN et al.,
1995), análise espectrofotométrica de ferro e sulfato em digeridos de plantas (REIS
et al., 1994; VIEIRA et al., 1998), determinação espectrofotométrica de níquel, ferro
e cromo em ligas metálicas (MARTELLI et al., 1995), determinação
espectrofotométrica de amônio e fosfato em digeridos de plantas (KRONKA et al.,
1996), especiação de nitrogênio inorgânico em água (ROCHA e REIS, 2000) e
determinação de nitrito, nitrato, cloreto e fosfato (ROCHA et al., 2001).
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
38
Apesar do sistema proposto nesta etapa, poder quantificar a concentração de
H2S, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um processo de análise qualitativa
para gás sulfídrico em amostras de produtos cárneos, uma vez que, a liberação de
H2S pela carne, já é indicador do processo de degradação da mesma.
Outrossim, na tentativa de traçar um paralelo entre o monitoramento da
deterioração de carnes, pela detecção de gás sulfídrico, em sistema de fluxo e o
perfil de espectros na região do infravermelho próximo (NIR) é que, também foram
realizados, experimentos empregando espectroscopia na região do infravermelho
próximo.
Fraudes em carne bovina, por adição de carnes de outras espécies, como
carneiro e canguru, também já foram estudadas por espectroscopia NIR, e está
documentada nos trabalhos de Ding e Xu (1999) e McElhinney e colaboradores
(1999).
Downey e outros (1997) tentaram diferenciar por espectroscopia NIR carnes
congeladas e descongeladas sucessivas vezes, utilizando o algoritmo SIMCA para
classificação. Liu e Chen (2001) diferenciaram amostras de carnes oriundas de
frangos saudáveis e doentes pela análise dos espectros obtidos de 400 a 2500 nm.
A avaliação do processo de deterioração de carnes por espectroscopia NIR, tem
sido discutida na literatura e está reportada nos trabalhos de Ellis e colaboradores
(2004) e Lin e outros (2004), os quais abordaram o emprego do NIR, em paralelo ao
monitoramento do desenvolvimento microbiano, em frango e carne,
respectivamente. Considerando as vantagens que a espectroscopia NIR apresenta e
o longo tempo gasto na aplicação dos métodos microbiológicos clássicos, faz-se
necessário o desenvolvimento de calibração para este tipo de avaliação. Neste
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
39
contexto foi realizado um estudo preliminar de monitoramento da deterioração de
carnes pelo emprego da espectroscopia de reflectância no infravermelho próximo.
2.2 – Metas
De acordo com os objetivos desta tese, as principais metas desta etapa do
trabalho são:
Desenvolvimento de sistema em fluxo para determinação de sulfeto, pelo
método do azul de metileno, em amostras de carnes.
Otimização do sistema considerando a faixa de concentração do analito na
matriz de estudo.
Monitoramento do processo de degradação de carnes pela liberação do gás
sulfídrico empregando o sistema em fluxo proposto.
Monitoramento do processo de degradação de carnes pelo emprego da
espectroscopia de reflectância no infravermelho próximo.
2.3 – Materiais e métodos
2.3.1 – Equipamentos
Para as determinações de sulfeto pelo método do azul de metileno em
sistema FIA foi empregado espectrofotômetro Femto 432 (Brasil) equipado com
cubeta de vidro com 10 mm de caminho óptico e volume interno de 200 L, acoplado
a um registrador Ross 101- A 1898 (EUA); bomba peristáltica de oito vias Gilson
MiniPlus 3 (França), para a propulsão dos líquidos; válvulas solenóides de três vias
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
40
161T031 NResearch; linhas de transmissão em polietileno (diâmetro interno 0,8
mm); tubos peristálticos de Tygon e agitador magnético Fisaton (Brasil).
Microcomputador equipado com interface PCL 711S (Advantech) foi empregado
para aquisição dos dados a uma freqüência de 20 Hz. Um software desenvolvido em
linguagem QuickBasic 4.5 foi empregado para controle de todas as etapas do
processo de análise. O diagrama de tempo e do sistema FIA são apresentados na
Figura 2.2.
Figura 2.2: Diagrama do sistema de análise em fluxo empregado para detecção de H2S: A.
câmara de pervaporação com amostra, D. detector ( = 665 nm), W. descarte. Rc: reciclo, V1 a V6.
válvulas solenóides, C. carregador (H2O), Fe(III). solução de Fe3+, DMPD. Solução de DMPD, S2-.
solução de referência de sulfeto, NaOH. solução receptora, B1. bobina para mistura binária de DMPD
e Fe+3 (50 cm), B2. bobina para a reação de formação do azul de metileno (150 cm), x, y e z.
confluências. Vazão do sistema: 3,0 mL min-1
Diagrama de tempo: LS. Lavagem do sistema, DMPD + Fe(III). Amostragem binária de DMPD
e Fe+3. B1. mistura de DMPD e Fe+3 em B1. AMB SReferência. amostragem binária da solução de
referência. B2. mistura de DMPD e Fe+3 e a solução de referência em B2, D. detector 665 nm, AMB
SReceptora. amostragem binária da solução receptora da amostra. LSR. Lavagem da linha da
solução receptora.
V6
D
C
Fe(III)
DMPD
S-2 referência
NaOH
A
W
V5
V4
V2
V1
V3
x y z
B1 B2
Rc
RcRc
Rc
Rc
V6
D
C
Fe(III)
DMPD
S-2 referência
NaOH
A
W
V5
V4
V2
V1
V3
x y z
B1 B2
Rc
RcRc
Rc
Rc
AMB
SReferência
B1DMPD +
Fe(III)
D
V2
V3
V1
V4
V5
LS
V6
B2 AMB
SReceptora
B1DMPD +
Fe(III)D
LS
B2
LSR
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
41
As válvulas solenóides foram fixadas em suporte de polietileno. O
acionamento das válvulas foi monitorado por dispositivo eletrônico construído no
laboratório, seguindo as recomendações de Reis e colaboradores (1994). A figura
2.3 mostra o circuito eletrônico para acionamento das válvulas solenóides.
Figura 2.3: Diagrama eletrônico para o acionamento das válvulas solenóides. V0 a V3:
válvulas solenóides. T0 a T3: transistores (BC547). D0 a D3: diodo (1N4002). Od0 a Od3:
saída digital para a interface PCL 711. (Adaptado de Reis et al, 1994)
A seqüência para a inserção das alíquotas da amostra e reagentes no
sistema foi controlada, segundo os parâmetros descritos na Tabela 2.1.
A câmara de degradação/pervaporação foi construída pelo acoplamento de
dois blocos de acrílico: (i) bloco com câmara central nas seguintes dimensões: 2,0 x
2,0 x 3,0 cm e (ii) tampa com sulco, de capacidade de 100 L. Estes dois blocos
foram separados por uma membrana de PTFE. Foi colocada uma tira de borracha
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
42
de 1 mm de espessura entre a tampa e o bloco central, para melhor aderir à
membrana de PTFE. A tampa foi fixada com parafusos ao corpo. O esquema e as
dimensões da câmara de degração/pervaporação são apresentados na Figura 2.4.
Tabela 2.1: Parâmetros da rotina de trabalho do programa controlador do sistema em fluxo.
Parâmetro
Tempo de abertura da válvula (V3) Carregador (s)
Tempo de abertura da válvula (V1) sol. reagente cloreto de ferro (*0,1s)
Tempo de abertura da válvula (V2) sol. reagente DMPD (*0,1s)
Tempo de espera: aciona a válvula da amostra (s)
Tempo de abertura da válvula (V5) amostra (0,1s)
Tempo de abertura da válvula (V4) solução de referência (0,1s)
Número de pulsos das válvulas (V1 a V5)
Tempo para iniciar o stop flow (s)
Tempo em stop flow (s)
Número de leituras
Número de replicatas
Figura 2.4: Câmara de pervaporação/degradação para detecção de H2S em
carnes. A: corpo central da câmara, B: tampa, vista frontal. C tampa vista lateral
Saída para limpeza
da câmara
AB
Entrada para
limpeza da câmara
Entrada de solução
de NaOH
Micro-bagueta
magnética
2 cm
2 cm
3 cm
2 cm
2 cm
1 cm C
NaOH
Membra PTFE
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
43
O monitoramento da deterioração da carne empregando espectroscopia de
reflectância no infravermelho próximo foi realizado pela medida dos espectros no
espectrofotômetro infravermelho, ABB Bomem – MB série NIR-MID (Alemanha). Os
parâmetros do equipamento foram: comprimento de onda de 4000 a 14000 cm-1;
alinhamento com ganho de 74%. O equipamento foi calibrado com padrão de
referência de 99% de refletância. Os ensaios com o espectrômetro no NIR foram
realizados no Laboratório de Instrumentação e Automação em Química Analítica do
Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
Para a realização do ensaio analítico de referência foi empregada balança
analítica Mettler (Alemanha); banho térmico Quimis - Q334 (Brasil).
2.3.2 - Reagentes e soluções
Todas os reagentes utilizados foram de grau analítico de pureza e suas
soluções preparadas com água recentemente destilada.
A solução reagente de DMPD na concentração de 1 g L-1 foi preparada,
tomando-se 25 mg de N,N’ - dimethyl-p-fenilenodiamina (Merck) em água contendo
2,8 mL de H2SO4 concentrado (Reagen) até 25 mL. A solução de Fe3+ 3,2 g L-1 foi
preparada, dissolvendo 81 mg de FeCl3 (ECIBRA), em água contendo 2,8 mL de
H2SO4 até 25 mL, seguindo as recomendações de Cassella e outros (2000).
As soluções de referência eram diariamente preparadas, a partir de Na2S.9H2O
(Merck). A solução de 100 mg L-1 de S2- foi preparada, tomando 0,0749 g do sal e
dissolvendo em solução de NaOH 2,5 mmol L-1 até 100 mL. A partir desta solução
foram preparadas as soluções de referência por diluição. As soluções de referência
de sulfeto foram determinadas por iodimetria.
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
44
Para a realização do ensaio de referência (Teste de Eber) foi preparada uma
solução de acetato de chumbo (VETEC) a 5 % (m/v), tomando 5 g de acetato de
chumbo em solução 1% (v/v) em ácido acético.
As amostras de carne bovina, para os ensaios em sistema FIA, foram adquiridas
em mercados e açougues de Salvador. As amostras de carne adquiridas para os
ensaios empregando espectroscopia NIR, foram oriundas de açougues de
Campinas.
2.3.3 – Procedimento
O sistema FIA para análise discriminatória de sulfeto em carnes (Figura 2.2)
foi baseado no método do azul de metileno (MARKZENKO,1976). A propulsão dos
fluídos no sistema foi feita por aspiração à vazão de 3 mL min-1.
Para a análise discriminatória de H2S em carnes, 100 mg de amostra de
carne, previamente homogeneizada em multiprocessador, e 300 L de água eram
inseridos na câmara de pervaporação, e mantidas sob agitação. Inicialmente as
válvulas V1 e V2 eram acionadas (4 pulsos de 0,1 s - 5L) para inserção de Fe3+ e
DMPD, respectivamente. De forma que 20 L de cada reagente fossem introduzidos
no percurso analítico. A mistura destes reagentes ocorria na bobina (B1, 50 cm).
O H2S liberado pela amostra, saturava a câmara e permeava através da
membrana de PTFE, onde era recolhido em 100 L de solução 2,5 mmol L-1 em
NaOH. Alíquotas da solução receptora, contendo o sulfeto permeado, eram inseridas
no percurso analítico, por amostragem binária, acionando a válvula V5 (10 pulsos de
0,1 s), misturando com os reagentes DMPD e Fe3+ na confluência Y. Em seguida, a
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
45
zona de amostra era endereçada à bobina de reação (B2, 150 cm), para a produção
do azul de metileno. A mistura seguia para o detector (665 nm).
A válvula V6 foi disposta para possibilitar alteração do fluxo, permitindo o
aprisionamento da string (amostra + DMPD + Fe3+) dentro da cubeta de fluxo,
possibilitando leituras em stopped flow. A válvula V6 também foi empregada para a
limpeza da linha da solução receptora da câmara de permeação, a qual era
acionada por 20 s (1 mL), e o fluxo era enviado para o descarte sem passar pelo
detector. Quando o objetivo era o preparo da curva analítica, o processo era similar,
porém substituindo o acionamento da válvula V5 pela V4.
Para o monitoramento da degradação da carne em função do tempo, cerca de
100 mg de amostra era colocada na câmara de pervaporação. Em intervalos de
tempos previamente estabecidos (1 h), a válvula V5 era acionada (10 pulsos de
0,1s) e alíquotas da solução receptora eram injetadas no sistema. As alíquotas eram
tomadas a cada hora até o aparecimento do primeiro sinal analítico.
Para a tomada dos espectros NIR, 1,5 kg de carne (patinho) foram fatiados
em 26 pedaços, medindo 1 cm de espessura. Os pedaços de carne foram
envolvidos em filme de PVC, então levados ao espectrofotômetro para a medida dos
espectros de varredura. O preparo das amostras está ilustrado na figura 2.5. Os
espectros foram tirados nas primeiras horas e nas horas finais da jornada de
trabalho em 2 dias consecutivos, correspondendo, aos intervalos de tempo de 0, 8,
24 e 32 h. As amostras foram identificadas de acordo o intervalo de tempo em t 0 =
grupo A, t 8 = grupo B, t 24 = grupo C e t 32 = grupo D. As amostras foram
armazenadas à temperatura ambiente. No primeiro dia, as amostras apresentavam
características organolépticas normais. Já no segundo dia, apresentavam aspecto
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
46
de carne em decomposição. Para cada pedaço da carne foi considerada a média de
três espectros.
Figura 2.5: Amostras de carne para análise no NIR
Em um segundo experimento, os pedaços de carne foram monitorados em
intervalos de tempo, variando de 0 a 6 h. Os espectros foram registrados a cada 30
min (T1 a T12). Os dados obtidos foram submetidos à análise multivariada,
empregando análise e componentes principais (PCA). Um tratamento preliminar dos
dados foi realizado calculando as médias móveis a cada cinco pontos.
O método de referência foi o Teste de Eber, recomendado pelo MAPA
(BRASIL, 1999). Assim, 20 g da amostra previamente homogeneizada foi inserida
em erlenmeyer de 250 mL e adicionado 25 mL de água. O erlernmeyer foi coberto
com papel de filtro embebido na solução de acetato de chumbo e vedado com fita
adesiva. Em seguida, o erlenmeyer foi aquecido em banho-maria (70ºC) por 15 min.
A mancha produzida pela amostra indicava a presença de H2S.
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
47
2.4 - Resultados e discussão
2.4.1 - Otimização do sistema
Para otimização do sistema FIA foram avaliadas a vazão, dimensão do
percurso analítico, número de pulsos e intervalo de tempo de abertura das válvulas
de amostra e reagentes. A solução de referência de sulfeto na concentração de 1
mg L-1 foi utilizada nos testes para otimização univariada do sistema.
O estudo da vazão levou em consideração a vazão total do sistema, uma vez
que os fluidos eram aspirados. Foram testadas vazões entre 3 e 10 mL min-1. Os
sinais transientes gerados podem ser visualizados na figura 2.6.
Figura 2.6: Variação do sinal analítico em função da vazão do sistema proposto para uma
solução de referência de sulfeto de 1 mg L-1.
Observou-se que para menores vazões havia aumento do sinal analítico. Com
a diminuição da vazão, a tendência é a diminuição do efeito de dispersão da
amostra (REIS et al., 1989). Deve-se levar em consideração que para os sistemas
em fluxo que utilizam permeação e/ou pervaporação, o máximo do analito deverá
2 4 6 8 10
0,030
0,035
0,040
0,045
0,050
0,055
0,060
A,
66
5n
m
Vazão, mL min-1
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
48
estar em condições de ser separado da matriz. Neste caso, implica numa saturação
da câmara de pervaporação pelo H2S e, conseqüente, aumento de permeação
através da membrana. Também, deve-se considerar que, a cinética da reação de
produção do azul de metileno pode ser favorecida para baixas vazões. Portanto,
adotou-se vazão de 3 mL min-1.
O grau de dispersão da zona da amostra e mistura da mesma com reagentes no
sistema FIA é influenciado diretamente pela variação do comprimento percurso
analítico, existindo uma estreita relação deste parâmetro com a freqüência analítica
e sensibilidade. Desta forma, procurou-se otimizar a dimensão dos percursos
analíticos, levando em consideração: (i) a mistura efetiva dos reagentes DMPD e
Fe3+; e, (ii) o tempo de reação necessário para produção do azul de metileno.
O efeito do comprimento da bobina (B1) no sinal analítico foi avaliado para B1
entre 20 e 100 cm. Neste estudo fixou-se B2 em 100 cm. A variação dos sinais
obtidos com a dimensão de B1 pode ser observada na Figura 2.7.
Figura 2.7: Variação do sinal analítico em função do percurso analítico B1 para mistura
dos reagentes DMPD e Fe3+. Vazão 3 mL min-1.Solução de referência de sulfeto de 1 mg L-1.
20 40 60 80 100
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Altu
ra d
e p
ico
, cm
percurso analítico, cm
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
49
Com o aumento do comprimento de B1 de 20 até 50 cm, foi observado
aumento do sinal analítico (~ 50%). Já, para as bobinas de reação maiores que 70
cm, foi observada diminuição da magnitude do sinal analítico, possivelmente devido
à oxidação do DMPD pelo O2 dissolvido, na presença de Fe3+. Assim, o
comprimento de 50 cm para B1 foi selecionado para os testes posteriores.
Para avaliação do comprimento de B2, onde ocorria a mistura de DMPD, Fe3+ e
amostra, para a produção de azul de metileno, foram utilizadas bobinas de 20 a 200
cm. Os sinais analíticos correspondentes a estas avaliações são apresentados na
Figura 2.8.
Figura 2.8: Variação do sinal analítico em função do percurso analítico B2 para formação do
azul de metileno. Vazão 3 mL min-1, bobina de reação B1: 50 cm. Solução de referência de
sulfeto de 1 mg L-1.
Pela Figura 2.8 pôde ser observada discreta variação do sinal com o aumento
da bobina B2 de 0,2 a 1,5 m. Já para B2 maior que 1,5 m, houve queda do sinal. A
provável causa deste comportamento poderia estar relacionada ao aumento da
dispersão do azul de metileno produzido para percursos mais longos. O
comprimento de 1,5 m para B2 foi selecionado para os testes futuros.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
Altu
ra d
e p
ico
, cm
Percurso analítico, m
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
50
A influência do número de pulsos correspondentes ao acionamento das
válvulas V1 e V2, referentes à inserção das alíquotas dos reagentes DMPD e Fe3+
no sinal analítico foi analisada. Para tanto, foram realizados testes com número de
pulsos variando de 1 a 10, mantendo o intervalo de tempo de abertura das válvulas
em cada pulso em 0,1 s. Os sinais analíticos obtidos são mostrados na Figura 2.9.
Figura 2.9: Variação do sinal analítico em função nº de pulsos para abertura das válvulas
(V1 e V2) dos reagentes DMPD e Fe3+. Vazão 3 mL min-1, bobinas de reação. B1: 50 cm e
B2: 150 cm. Sol. de referência de sulfeto de 1 mg L-1.
Para avaliação do número de pulsos de abertura das válvulas levou-se em
consideração que cada válvula solenóide atuaria como um comutador independente.
Na introdução dos reagentes por amostragem binária as frações de alíquotas são
transportadas até o detector, ocorrendo dispersão mútua entre as interfaces desses
líquidos e a tendência é que a mistura se torne homogênea rapidamente durante o
transporte por B1.
Logo, de acordo com os dados da Figura 2.9, observou-se que à medida que o
número de pulsos aumentava, o sinal analítico também aumentava, alcançando um
0 2 4 6 8 10
5,6
6,0
6,4
6,8
7,2
altura
do p
ico,
cm
nº de pulsos (*0,1 s)
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
51
valor máximo entre 2 e 4 pulsos. A explicação para isto reside no fato do diminuto
tamanho das alíquotas dos reagentes DMPD e Fe3+, favorecer a homogeneização
efetiva e levar a um aumento do sinal analítico. Portanto, para acionamento das
válvulas V1 e V2, foram escolhidos 4 pulsos, correspondendo a 20 L de cada
reagente.
Considerando vazão de 3 mL min-1, adotou-se o número de pulsos de
abertura das válvulas V4 e V5 referentes a soluções de referência e solução
receptora da amostra, igual a 10. Logo a alíquota da solução de referência e da
amostra a ser introduzida no sistema correspondeu a 50 L. Apesar do volume da
solução receptora (volume armazenado na tampa da câmara de pervaporação) ser
de ca. 100 L, os 50 L iniciais injetados no percurso analítico foram suficientes para
produzir os sinais transientes referentes às amostras sob investigação.
As condições otimizadas para o sistema FIA são descritas na Tabela 2.2.
Tabela 2.2: Configuração do sistema em fluxo após a otimização para determinação de
sulfeto.
Parâmetros Valor
Vazão (mL min-1) 3
Bobina de reação B1 (cm) 50
Bobina de reação B2 (cm) 150
Nº de pulsos das válvulas V1 e V2 (DMPD e
Fe3+): (* 0,1 s)
4
Nº de pulsos das válvulas V4 e V5 da amostra e
da solução de referência: (* 0,1 s)
10
Tempo de acionamento da válvula V6 para
limpeza da linha da solução receptora (s)
20
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
52
2.4.2- Influência da interrupção do fluxo no sistema.
Foi avaliada a influência do modo de interrupção de fluxo sobre a cinética da
reação de formação do azul de metileno. Para isto, foram testados intervalos de
tempos de interrupção de fluxo que variaram de 0 a 180 s. Os resultados são
mostrados na Figura 2.10.
Figura 2.10: Variação do sinal analítico em função do tempo de interrupção do fluxo
O intervalo de tempo zero correspondia ao sinal no momento inicial da parada
do fluxo. Observou-se discreta variação do sinal analítico em função do tempo de
interrupção de fluxo. Com um tempo de 180 s houve um aumento do sinal de 0,06
unidades de absorbância. A Figura 2.11 ilustra o perfil do sinal analítico obtido no
sistema em stopped flow, para 12 replicatas do branco e da solução de sulfeto de 1
mg L-1, referente a 180 s.
0 30 60 90 120 150 180
0,20
0,21
0,22
0,23
0,24
0,25
0,26
A (
665 n
m)
t (s)
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
53
Figura 2.11: Fiagrama mostrando o perfil do sinal analítico obtido no sistema com o fluxo
parado por 180 s. B. branco, solução de S2- 1 mg L-1.
Portanto, considerando que houve discreta variação do sinal analítico e o
comprometimento da produtividade analítica, optou-se por não utilizar o modo de
interrupção de fluxo para as análises discriminatórias de sulfeto em amostras de
carne.
2.4.3 - Figuras de mérito
Apesar da proposta deste trabalho ser pautada no desenvolvimento de
sistema para análise discriminatória e avaliação da degradação de carnes, foram
realizados ensaios quantitativos e o sistema poderá ser empregado para a
determinação da concentração de H2S.
Para a faixa de S2- entre 0,2 e 0,6 mg L-1 foi obtida a equação A = 0,33 + 4,4C
(0,997). O limite de detecção estimado foi de 0,016 mg L-1 e desvio padrão relativo
de 0,96% (n=11), para a concentração de 0,4 mg L-1. Nestas condições, o sistema
desenvolvido apresentou freqüência analítica de ca. 30 determinações por hora.
Para testar a precisão do sistema foram injetadas 11 replicatas de solução de
referência de sulfeto na concentração de 1 mg L-1, representada na Figura 2.12.
t
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
54
Figura 2.12: Fiagrama de 11 replicatas de solução de sulfeto 1 mg L-1.
2.4.4 - Aplicação do sistema na análise de carnes
Confirmada a capacidade do sistema FIA para detecção de sulfeto, foram
realizados dois tipos de análises: (i) análise discriminatória de H2S em amostras de
carnes frescas e (ii) avaliação da degradação de carnes em função do tempo pela
monitoração da liberação de H2S.
Cinco amostras de carne bovina in natura, adquiridas em mercados e açougues
locais, foram submetidas à análise e os resultados do estágio e do período de
degradação são apresentados na Tabela 2.3. Para validação dos resultados foi
realizado o teste de Eber, segundo normas do MAPA.
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
55
Tabela 2.3: Resultados para H2S nas amostras de carne.
Amostras de
carne
Presença de
H2S (FIA)
t0
Presença de H2S
segundo o teste
de Eber
Produção de H2S
(FIA)
(t, min)
1 + + <30
2 - - 280 - 300
3 - - 460 - 480
4 + + <30
5 + + <30
De acordo a Tabela 2.3, observou-se que três amostras de carne
apresentaram evolução de gás sulfídrico em menos de 30 min. Duas amostras não
apresentaram evolução de H2S. Os resultados obtidos pelo sistema proposto foram
concordantes com o teste de Eber.
Vale a pena ressaltar, a relevância deste tipo de controle, pois das 5 amostras
analisadas 3 indicaram presença de H2S. Este fato deve ser visto como um forte
indicador das condições inadequadas de armazenamento e comercialização que a
carne está exposta, favorecendo a proliferação de microrganismos produtores de
gás sulfídrico e/ou o aparecimento de reações enzimáticas que conduzam à hidrólise
de aminoácidos sulfurados e conseqüentemente formação de H2S.
A Figura 2.13 apresenta o registro de amostra de carnes pelo sistema de
detecção de gás sulfídrico. Observa-se que após o sinal do branco, pelo
acionamento da válvula da amostra V5, foi obtido um pico referente ao gás sulfídrico
liberado pela carne.
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
56
Figura 2.13: Registro do sinal analítico referente à detecção de H2S. B. branco, A. amostra.
Para o acompanhamento da degradação da carne, cerca de 0,1 g da amostra
homogeneizada foi inserida da câmara de pervaporação. Em intervalos de tempo
regulares, uma alíquota da solução receptora era injetada no sistema para detecção
de H2S. A Figura 2.14 ilustra os resultados obtidos.
Figura 2.14: Registro da avaliação da degradação de carnes através do monitoramento da
liberação de gás sulfídrico. A: amostra; B: branco.
30 0 t (min)
t (h)
0 4 5 6 9 8
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
57
Foi observado que o primeiro pico pôde ser registrado para intervalo de 4 h.
Notou-se também, que a partir de 5 h houve saturação da câmara de pervaporação
e o sinal registrado ultrapassou a escala do registrador. Após injeções sucessivas da
amostra o sinal começou a cair, provavelmente devido à diminuição da pressão do
H2S na câmara de pervaporação. Assim, para o acompanhamento da degradação
da carne em função do tempo, observou-se, para esta amostra, que a partir de 4 h
houve evolução de H2S. Contudo, não se pode afirmar a origem do H2S.
2.5 – Aplicação do NIR para avaliação da degradação da carne
A coleção de espectros das 26 amostras de carne analisadas é apresentada
na Figura 2.15. Estes espectros referem-se às amostras de carne frescas.
Figura 2.15: Coleção de espectros NIR das amostras de carnes
Assim as amostras (n = 26) do grupo A (t =0), grupo B (t = 8 h), grupo C (t =
24 h) e grupo D (t = 32h), foram levadas ao NIRS para registro dos espectros.
Submetendo os dados à análise dos componentes principais (PCA), observou-se
que com apenas dois componentes principais foi possível classificar corretamente
4000 6000 8000 10000 12000 14000
0
4
8
12
16
20
A
Número de onda cm-1
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
58
88% das amostras do grupo D dentro dos limites selecionados. O resultado está
ilustrado na Figura 2.16.
Figura 2.16: Análise dos componentes principais de 26 amostras de carne.
Para melhor visualização dos resultados, os dados foram combinados a cada
dois grupos AB, BC, CD e AD, correspondendo ao intervalo de tempo de 0-8 h, 8-24
h, 24-32 h e 0-32h, respectivamente. Os grupos foram submetidos à análise dos
componentes principais e são mostradas a nas Figuras 2.17 a 2.20.
Figura 2.17: PCA para as amostras dos grupos A e B
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
59
Figura 2.18: PCA para as amostras dos grupos B e C
Figura 2.19: PCA para as amostras dos grupos C e D
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
60
Figura 2.20: PCA para as amostras dos grupos A e D
A análise dos componentes principais dos grupos AB (Fig. 2.17), não
apresentou separação nítida entre os grupos, ou seja, as amostras de carne
analisadas no tempo 0 (A) e após 8 h (B), não apresentaram diferenças espectrais
ao NIR, embora as amostras tenham sido mantidas à temperatura ambiente e já
eram perceptíveis mudanças em seus caracteres organolépticos. As amostras dos
grupos BC (Figura 2.18) referente aos espectros obtidos com 8 h e 24 h,
apresentaram comportamento semelhante, não sendo possível separar os grupos.
O gráfico obtido por PCA do grupo CD (Fig. 2.19), referente aos espectros
registrados com 24 e 32 h, apresentou separação mais definida. Com dois
componentes principais foi possível classificar corretamente 84% das amostras dos
grupos C e D. Estas amostras apresentavam os caracteres de carne em processo de
deterioração.
Dentre a análise dos componentes principais, o grupo que apresentou melhor
separação foi AD (Fig. 2.20), referentes a amostras de carne fresca (A, t0) e as
amostras de carne visivelmente deterioradas (D, t32). Os dois componentes
principais conseguiram descrever corretamente, 92% das amostras do grupo D e
100% das amostras do grupo A. De fato, as características destes dois grupos de
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
61
amostras são bastante diferentes. A amostra de carne fresca, apresentava-se hígida,
vermelha, sem presença de exsudato, odor próprio de carne fresca. Já a carne
deteriorada, apresentava-se com coloração esverdeada, presença de exsudato e
odor forte de carne podre.
Diante dos resultados apresentados pode-se inferir que pela análise por
espectroscopia NIR, não foi possível monitorar o momento em que começaram a
aparecer os primeiros sinais de deterioração nas amostras de carne. A análise da
carne por NIR não apresentou diferenças espectrais capazes de indicar o início do
processo de deterioração da carne. Foi possível discriminar, claramente, os grupos
de amostras de carne fresca (A) e o grupo de carnes deterioradas (D), bem como os
grupos (C) e (D), ambos de amostras deterioradas.
No segundo experimento foram registrados espectros de uma única amostra
de carne fresca no intervalo de tempo de 6 horas. Os espectros foram registrados a
cada 30 min, a partir de t=0 até t=6 h (13 espectros).Durante o intervalo de tempo do
experimento a amostra foi mantida em temperatura ambiente.Os resultados do PCA
estão mostrados na Figura 2.21.
Figura 2.21: PCA para uma única amostra de carne fresca em função do tempo.
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
62
O gráfico obtido por PCA mostrou que com dois componentes principais foi
possível classificar dois grupos. O grupo 1 e 2 (correspondendo a carne fresca, t=0 e
30 min) e os grupos 11, 12 e 13 (correspondendo a carne no t= 5, t= 5,5 e t= 6 h).
Ao final do intervalo de tempo de 6 h, à temperatura ambiente, a amostra de carne
apresentava mudanças discretas no odor e na coloração da carne originalmente
fresca. Portanto, os grupos foram diferenciados em carne fresca até 30 min (1 e 2)
em temperatura ambiente e carne com caracteres organolépticos comprometidas, ao
final de 6 h (11,12,13). Para o intervalo de tempo compreendido entre 1 e 4,5 h
(correspondendo aos grupos 3 a 10), não foi possível a separação em grupos.
Os resultados obtidos no experimento em fluxo para monitoração da
degradação da carne (Tabela 2.3) foram comparados com os resultados obtidos por
espectroscopia NIR. Foram observados resultados concordantes, porque nas duas
metodologias foi possível detectar indícios de deterioração somente após 30 min de
exposição da carne à temperatura ambiente.
Apesar da correlação entre liberação de H2S e mudanças no espectro NIR, os
experimentos até aqui realizados não são suficientes para concluir qual a forma mais
eficiente para monitorar o processo de degradação da carne. Contudo, pelos
resultados apresentados, pode-se inferir que 30 min foi o intervalo de tempo mínimo
para uma amostra de carne fresca, mantida à temperatura ambiente, apresentar
modificações espectrais no infravermelho próximo. Esta modificação espectral
resultou na separação de grupos, quando realizada a análise dos componentes
principais. As primeiras modificações químicas, caracterizadas pela liberação de H2S
pôde ser observada num intervalo de tempo compreendido entre 30 min.
Quanto ao método oficial (Reação de Eber para H2S), pôde ser observado
que o mesmo apresenta desvantagens em relação ao método proposto e ao NIR. A
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
63
geração de resíduos tóxicos para o meio ambiente, além da exposição ocupacional
pelo uso de solução de acetato de chumbo. A reação de Eber é feita em batelada,
apresentando baixa produtividade analítica, como pode ser visto pelo intervalo de
tempo de 15 min recomendado só para evolução do H2S da amostra.
2.6 – Conclusões
Os resultados obtidos na determinação seletora e discriminatória de sulfeto
em amostras de carnes, baseado na formação do azul de metileno, por análise em
fluxo empregando amostragem binária, confirmaram suas potencialidades. A
exatidão, por comparação dos resultados com os obtidos na metodologia de
referência e a precisão dos resultados foram satisfatórias.
A robustez e versatilidade foram observadas de forma a conseguir um
sistema confiável e preciso para monitoração do estado de conservação de carnes,
a um ritmo de amostragem razoável.
Embora o sistema tenha sido idealizado para análise seletora e
discriminatória de sulfeto em carnes, com ênfase no aspecto qualitativo, o mesmo
oferece versatilidade na quantificação do analito, com limite de detecção de 0,0158
mg L-1, apresentando, desta forma, sensibilidade aceitável.
O sistema desenvolvido se mostrou adequado para a avaliação do estado de
conservação e degradação de carnes. A versatilidade do sistema foi caracterizada
uma vez que a mesma câmara de reação pode ser empregada para outras matrizes.
Na análise por espectroscopia de reflectância na região do infravermelho
próximo, de amostras de carnes observou-se que houve diferenças espectrais claras
para a carne fresca e a carne visivelmente deteriorada, porém esta diferença é tão
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
64
obvia que não seria admissível utilizar uma ferramenta analítica como o NIR para
diferenciar carnes frescas de carnes deterioradas.
Contudo, a análise por espectroscopia de reflectância na região do
infravermelho próximo, de amostras de carne, em função do tempo, para a
monitoração do processo de deterioração, apresentou diferenças espectrais,
podendo-se inferir que a partir de 30 min a carne bovina, mantida a temperatura
ambiente, começa a apresentar os primeiros sinais de deterioração.
2.7 – Referências Bibliográficas
BRASIL, MINISTÉRIO DA AGRICULTURA. Instrução Normativa nº 20. Métodos
Analíticos Físico-Químicos para Controle de Produtos Cárneos e seus
Ingredientes. Diário Oficial da União de 21 de julho de 1999.
BYRNE, C. E.; DOWNEY, G. TROY, D.J.; et al. Non-destructive prediction of
selected quality attributes of beef by near-infrared reflectance spectroscopy
between 750 and 1089nm. Meat Science. v. 49, n. 4, p. 399 – 409. 1998.
CASSELLA, R. J.; TEIXEIRA, L. S. G.; GARRIGUES, S.; et al. Determination of
sulfide in waters by flow-injection solid phase spectrphotometry. Analyst. v.
125, p. 1835 – 1838. 2000.
CHINIVASAGAM, H. N.; BREMNER, H. A.; WOOD, A. F.; NOTTINGAM, S. M.
Volatile components associated with bacterial spoilage of tropical prawns.
International Journal of Microbiology. v. 42, p. 45 – 55. 1998.
DESTEFAINS, G.; BARGE, M. T.; BRUGIAPAGLIA, A. et al. The use of principal
component analysis (PCA) to caracterize beef. Meat Science. v. 56, p. 255-259.
2000.
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
65
DING, H. B.; XU, R. J. Differentiation of beef and kangaroo meat by visible/near-
infrared reflectance spectroscopy. Food Chemistry and Toxicology. v.64, n.5, p.
814-817. 1999.
DOWNEY, G.; BEAUCHÊNE, D. Discrimination between fresh and frozen-then-
thawed beef m..Longissimus dorsi by combined visible-near infrared reflectance
spectroscopy: a feasibility study. Meat Science. v.45, n.3, p. 353 -363. 1997.
ELLIS, D. I.; BROADHURST, D.; GOODACRE, R. Rapid and quantitative detection
of the microbial spoilage of beef by Fourrier transform infrared spectroscopy and
machine learning. Analytica Chimica Acta. v. 514, n. 2, p. 139 – 201, 2004.
FAN, X.; SOMMERS, C. H.; THAYER, D.W.; LEHOTAY, S. J. Volatile sulfur
compounds in irradiated precooked turkey brest analysed with pulsed flame
photometric detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 50. p.
4257 – 4261. 2002.
GRASSI, V.; MIYAZAWA, M.; PAVAN, M. A.; et al. Determinação em fluxo do
carbonato residual do solo empregando pervaporação. Química Nova. v. 25,
n.1, p. 149 – 152. 2002.
HILDRUM, K. I.; NILSEN, B. N. Near infrared reflectance spectroscopy for the
assessment of meat tenderness. Anais do I Congresso Internacional
Infravermelho Próximo. NIR. p. 855 – 857. 1996.
HUFFMAN, R.D. Current and future technologies for the decontamination of
carcasses and fresh meat. Meat Science. v. 62, p. 285 – 294. 2002.
ICARDO, M. C.; MATEO, J. V. G.; CALATAYUD, J. M. Multicommutation as a
powerful new analytical tool. Trends in Analytical Chemistry. v. 21, n. 5, p. 366 -
378. 2002.
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
66
JÚNIOR, E. A. S; PANETA, C.J. Deterioração das Carnes: Eficiência e limitação das
provas de gás sulfídrico e amônia. Revista Higiene Alimentar, v.6, n. 21, p. 5 –
7. 1992.
KORN, M.; GOUVEIA, L. F. B. P.; OLIVEIRA, E.; REIS, B.F. Binary search in flow
titration employing photometric end-point detection. Analytica Chimica Acta.
v.313, p. 177 – 184. 1995.
KRONKA, E. A. M.; REIS, B. F.; KORN, M.; BERGAMIN F, H. Multicommutation in
flow analysis. Part5: Binary sampling for sequencial spectrofotometric
determination of ammonium and phosphate in plant digests. Analytica Chim.
Acta. v.334, p. 287 – 293. 1996.
LAPIN, R. M.; KOBURGER, J. A. Hydrogen sulfide production by Pseudomonas
putrefaciens in shrimp experimentally packed in nitrogen. Applied Microbiology.
v.27, n. 4, p. 666 – 670. 1974.
LAWRENCE, N. S.; DAVIS, J e COMPTON, R. G. Analytical strategies for the
detection of sulfide: a review. Talanta. v. 52, p. 771 – 784. 2000.
LEGGETT, D. J.; CHEN, N. H.; MAHADEVAPPA, D. S. Flow Injection Method for
Sulfide Determination by the Methylene Blue Method. Analytica Chimica Acta,
v.128, p.163-168. 1981.
LEI, W.; DASGUPTA, P.K. Determination of sulfide and mercaptans in caustic
scrubbing liquor. Analytica Chimica Acta. v. 226, p. 165 – 170.1989
LIN, M.; AL – HOLY, M.; MOUSAVI – HESARY, M.; et al. Rapid and quantitative
detection of the microbial spoilage in chicken meat by diffuse reflectance
spectroscopy (600 – 110 nm). Letters in Applied Microbiology. v.39, n. 2, p. 148
– 155, 2004.
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
67
LIU, Y.; CHEN, Y. Analysis of visible reflectance spectra of stored, cooked and
diseased chicken meats. Meat Science. v. 58, p. 395-401. 2001.
MARCZENKO, Z., Spectrophotometric determination of elements. N. York: Ellis
Horwood Limited, 1976.
MARTELLI, P. B.; REIS, B. F.; KRONKA, E. A. M.; et al. Multicommutation in flow
analysis. Part 2. Binary sampling for spectrophotometric determination of nickel,
iron and chromium in steel alloys. Analytica Chimica Acta. v. 308, p. 397 - 405.
1995.
McELHINNEY, J.; DOWNEY, G.; O’DONNELL. Quantitation of lamb content in
mixture with raw minced beef using visible, near and mid infrared spectroscopy.
Anais do I Congresso Internacional Infravermelho Próximo. NIR. p. 801- 804.
1996.
McMEEKIN, T. A.; GIBBS, P.A.; PATTERSON, J. T. Detection of volatile sulfide –
producing bacteria isolated from poultry – processing plants. Applied and
Environmental Microbiology. v. 35, n. 6, p. 1216 – 1218. 1978.
NAES, T.; BAARDSETH, P.; HELGESEN, H.; et al. Multivariate techniques in the
analysis of meat quality. Meat Science. v. 43, p. S135 – S149. 1996.
NICOL, D. J.; SHAW, M. K.; LEDWARD, D. A. hydrogen sulfide production by
bacteria and sulfomioglobin formation in prepacked chilled beef. Applied
Microbiology. v. 19, n.6, p. 937 – 939. 1970.
PARDI, M. C.; SANTOS, I, F.; SOUZA, E.R.; PARDI, H. S. Ciência, Higiene e
Tecnologia da Carne. v. I, 2ª ed. Goiás: Ed UFG. 2001. 623p.
REIS, B. F.; GUINÉ, M. F.; KRONKA, E. A. M. A análise química por injeção em
fluxo contínuo. Química Nova. v.12, n.1, p. 82 - 91. 1989.
Sistema automatizado para avaliação da produção de gás sulfídrico
68
REIS, F. R.; GUINÉ, M. F.; ZAGATTO, E. A. G.; et al. Multicommutation in flow
analysis. Part 1. Binary sampling: concepts, instrumentation and spectrometric
determination of iron in plant digests. Analytica Chimica Acta. v.293, p. 129 –
138. 1994.
ROCHA, F. R. P.; MARTELLI, P. B.; REIS, B. F. An improved system for
spectrophotometric determination of anions exploting multicommutation and
multidetection. Analytica Chimica Acta. v. 438, p. 11 - 19. 2001.
ROCHA, F. R. P.; REIS, B. F. A flow system exploiting multicommutation for
speciation of inorganic nitrogen in waters. Analytica Chimica Acta. v. 409, p. 227
- 235. 2000.
ROCHA, F. R. P.; REIS, B. F.; ZAGATO, E. A. G.; et al. Multicomutation in flow
analysis: concepts, applications and trends. Analytica Chimica Acta. v. 468, p.
119 - 131. 2002.
TOGERSEN, G.; ISAKSSON, T.; NILSEN, B. N.; et al. On-line NIR analysis of fat,
water and protein in industrial scale ground meat batches. Meat science. v. 51.
p. 97 – 102. 1999.
VALLEJO, B.; RICHTER, P.; TORAL, I.; et al. Determination of sulphide in liquid and
solid samples by integrate pervaporation – potenciometric detection. Analytica
Chimica Acta. v. 436, p. 301 – 307. 2001.
VIEIRA, J. A.; REIS, B. F.; KRONKA, E. A. M.; et al. Multicommutation in flow
analysis. Part 6. Binary sampling for wide concentration range turbidimetric
determination of sulfate in plant digest. Analytica Chimica Acta. v. 366, p. 251 -
255. 1998.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
69
CAPÍTULO 3
Desenvolvimento de Sistema em Fluxo para Análise
Seqüencial de Nitrito e Nitrato em Produtos Cárneos,
Utilizando Câmara de Tubos Concêntricos.
3.1 – Introdução
Há séculos que nitrato, nitrito e cloreto de sódio vêm sendo usados no
processo de cura para a conservação de carnes e pescados (EVANGELISTA, 2001),
visando preservar o produto, desenvolver e fixar a coloração, sabor e aroma (FARIA
et al., 2001). A ação conservadora nos produtos cárneos deve-se ao nitrito, que em
condições anaeróbias, é produzido pela ação de microrganismos associada a nitrato
redutase. Na dieta, o nitrato pode ser reduzido a nitrito por bactérias presentes no
muco salivar e às vezes no estômago.
No alimento, o nitrito desempenha basicamente três funções: (i) contribui com
o desenvolvimento do flavor em produtos curados; provavelmente pela inibição do
surgimento de odores rançosos não desejáveis; (ii) reage com a mioglobina
produzindo o nitrosoemocromo, característico das carnes curadas (FARIA et al.,
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
70
2001); e, (iii) inibe o crescimento de bactérias patogênicas, principalmente o
Clostridium botulinum, o qual produz neurotoxina (CAMMACK et al., 1999).
Vale ressaltar que o nitrato e o nitrito ocorrem naturalmente em diferentes
vegetais como fontes de nitrogênio. Entre os vegetais que podem apresentar
elevado teor de nitrato (≥ 1000 mg kg-1) destacam-se a alface, o espinafre, a
beterraba, o rabanete, a berinjela, o aipo, o nabo e a couve (CAMMACK et al., 1999;
JAWORSKA, 2005; RATH et al., 1994).
O consumo de produtos alimentícios contendo conservantes químicos é
motivo de preocupação para a população. A utilização de nitritos e nitratos, em
produtos cárneos, deve obedecer a limites preconizados pelo Ministério da Saúde,
pelo qual os limites máximos para nitrato e nitrito são de 300 e 150 mg kg-1,
respectivamente (BRASIL, 1998). No entanto, ao consumir alguns dos vegetais
acima citados, pode-se estar ingerindo concentrações de nitrato superiores aos
limites preconizados pelo órgão regulador brasileiro.
Contudo, estes conservantes, quando adicionados aos produtos cárneos,
devem cumprir funções específicas, e obedecerem, rigorosamente aos limites
estabelecidos pela Legislação. Daí, a relevância da verificação da concentração
destes aditivos, em produtos cárneos, pelos órgãos de vigilância sanitária,
objetivando monitorar a qualidade dos alimentos expostos ao consumo. Ademais, a
fiscalização é necessária para coibir o uso indiscriminado destes aditivos, bem como
a adição de concentrações superiores ao limite máximo permitido.
O nitrito apresenta maior toxicidade que o nitrato. O nitrito causa
metaemoglobinemia e pode até mesmo, levar à morte quando consumido em doses
relativamente altas (Weekly, 2002). Peixes expostos a concentrações de 150 mg kg-1
de NO2- apresentaram metaemoglobinemia (SCARANO e SAROGLIA, 1984). Além
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
71
disso, o nitrito pode reagir com aminas presentes nas carnes, levando a produção de
nitrosaminas, as quais são responsáveis por efeitos neuro e nefrotóxicos, além de
serem agentes mutagênicos e carcinogênicos (BINSTOK et al., 1996; RYWOTYCKI,
2003). A presença de aminas biogênicas e poliaminas em carnes e produtos cárneos
foi investigada por Jover e outros (1997) e Rywotycki (1997).
As nitrosaminas podem ser formadas pela reação, denominada de nitrosação,
a qual ocorre na presença de ácido mineral diluído a frio, como no estômago (MIDIO,
2000), gerando o ácido nitroso que uma vez protonado leva ao íon nitrosônio (NO+),
após perda de água (ALLINGER et al., 1978).
HNO2 H+
+ H2NO2
+ H2O NO++
As aminas secundárias alifáticas e aromáticas reagem com ácido nitroso,
levando à produção de compostos amarelos e neutros – as nitrosaminas.
HNO2R1-NH-R2 + R1-N-R2
NO
Compostos nitrosos apresentam papel relevante na carcinogênese em
humanos e animais. Certas condições geofísicas e ambientais, podem atuar como
catalizadores na formação destes compostos. Práticas inadequadas na agricultura,
como uso exagerado de fertilizantes e agrotóxicos e acidificação do ecossistema,
são fatores que favorecem a formação de nitrosaminas no meio ambiente (solo e
plantas). Assim, as nitrosaminas formadas no meio ambiente, estarão disponíveis
para entrar na cadeia trófica (RYWOTYCKI, 2003).
O teor de nitrosaminas (dimetilnitrosamina – DMNA e dietilnitrosamina –
DENA) foi determinado em carnes frescas de diferentes espécies (porco, boi, búfalo,
cabra, cavalo e carneiro), em função das práticas ecológicas e antiecológicas de
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
72
produção/criação. Os resultados mostraram teores significativamente maiores de
aminas para as amostras oriundas de animais submetidos à condição
antiecológicas. Dentre as espécies estudadas, os bovinos e porcinos apresentaram
maiores níveis para DMNA e DENA (RYWOTYCKI, 2003).
Sofos e Busta (1980) apresentaram alternativas para o uso do NO2- em
produtos cárneos, a exemplo de NaCl, agentes acidificantes, ascorbato e
isoascorbato, açúcares e xaropes, parabens e sorbato. Apesar de alguns destes
compostos apresentarem características redutoras, estas alternativas não são
eficazes na substituição do NO2- como agente antibotulínico.
O método clássico para determinação espectrofotométrica de NO2- deve-se a
Greiss que avaliou a reação deste íon com ácido sulfanílico e -naftilamina em meio
sulfúrico. Posteriormente Ilosvay, propôs modificação ao método original,
substituindo o ácido sulfúrico por ácido acético. Porém, já no século XX, Rider e
Mellon concluíram que a reação deveria ser realizada em meio fortemente ácido
(VOGUEL, 1960). Reagentes como -naftol e -naftilamina, por serem
carcinogênicos, têm sido substituídos por outros reagentes principalmente por
dicloridrato de N-(1-naftil) etilenodiamina – NED (DUARTE, 1997).
O método de Greiss é seletivo para NO2-, não apresentando resposta para
nitrato. Para que o NO3- possa ser determinado pela mesma reação, é necessário
que este seja reduzido a nitrito para, em seguida, sofrer diazotação com ácido
sulfanílico e complexação com NED em meio ácido, produzindo o ácido -
naftilamino-p-azobenzeno-p-sulfônico. O produto formado de coloração rósea pode
ser determinado espectrofotometricamente a 540 nm (MARCZENKO 1976;
BRASIL,1999). As reações envolvidas no método de Greiss são ilustradas na Figura
3.1.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
73
Figura 3.1: Reações do método de Greiss
Teores de NO2- e NO3
- têm sido determinados em alimentos pelo emprego de
diversas técnicas analíticas. Entre estas, as mais citadas são a espectrofotometria
(FERREIRA et al., 1996; WANG, 1998; AHMED, 1996; ARJONA et al., 1998;
ZATAR, 1999), cromatografia iônica (MATTEO e ESPOSITO, 1997; SIU, 1998;
BILAL BUTT et al., 2001; BOSCH et al., 1994) e potenciometria com eletrodo íon
seletivo (BADEA et al., 2001). Ademais, muitas dessas técnicas de detecção estão
associadas a sistemas de análise por injeção em fluxo (FIA) ou de análise por
injeção seqüencial (SIA) (FERREIRA et al., 1996; ARJONA et al., 1998; ROCHA e
REIS, 2000; PETSUL et al., 2001; HAGHIGHI e TAVASSOLI, 2002).
Deve-se levar em consideração que, para as determinações de NO2- e NO3
-
em produtos cárneos, o tratamento da amostra é considerado como a etapa crítica.
As metodologias descritas na literatura apresentam divergências quanto à forma de
extração do NO2- e NO3
-. Algumas referências recomendam apenas extração
aquosa, à quente (temperatura de ~80°C) (AOAC, 2003), enquanto que outras,
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
74
recomendam a desproteinização prévia da amostra (INSTITUTO ADOLFO LUTZ,
1985).
Binstok e colaboradores (1996) compararam oito diferentes procedimentos
para determinação de NO2- em produtos cárneos. Os autores desenvolveram
protocolo de análise baseado na melhoria da desintegração e dispersão de resíduos
da matriz (gordura), adicionando previamente areia à amostra. Os resultados
evidenciaram recuperação de 93% do NO2-, além de boa precisão (RSD = 8%).
Ferreira e outros (1996), realizaram ensaios simultâneos para NO2-, NO3
- e
NaCl em produtos cárneos, empregando sistema FIA. O cloreto foi determinado,
empregando detecção potenciométrica (eletrodo tubular íon seletivo a cloreto, com
uma membrana cristalina homogênea de Ag2S/AgCl). Após a passagem pelo
eletrodo, a zona da amostra era dividida em dois percursos analíticos para prevenir
mudanças no fracionamento, uma vez que cada percurso pôde ser adequado para
responder às concentrações médias de nitrito e nitrato nas amostras de carne
analisadas. Em uma das linhas, era acoplada coluna contendo cádmio, para a
redução do nitrato. Como o tempo de residência em cada canal era diferente, eram
obtidos dois sinais transientes característicos do NO2- e do NO3
- + NO2-.
Sistema em fluxo regido pela estratégia de multicomutação foi proposto para
determinação de NO3-, NO2
- e NH4+ (ROCHA e REIS, 2000). A determinação de
NO3- e NO2
- foi baseada na reação de Greiss e a determinação de NH4+ na reação
de Berthelot. O sistema desenvolvido pelos autores apresentou elevada
produtividade analítica (60 determinações por hora) e reduzido consumo de
reagentes.
Dentro deste cenário, a presente etapa do trabalho objetivou o
desenvolvimento de um sistema analítico em fluxo para determinação de nitrato e
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
75
nitrito em amostras de produtos cárneos, baseado no método de Greiss,
empregando um dispositivo denominado câmara de tubos concêntricos, com o qual
foi possível desenvolver um sistema FIA de linha única.
3.2 – Metas
De acordo com os objetivos desta tese, as principais metas desta etapa
foram:
Desenvolver um sistema em fluxo, acoplado a uma câmara de tubos
concêntricos para determinação seqüencial de nitrito e nitrato em amostras de
produtos cárneos.
Otimizar o sistema considerando as faixas de concentração do analito na
matriz de estudo.
Determinar a concentração de NO3- e NO2
- em diferentes amostras de
produtos cárneos.
Validar o procedimento pela comparação com método de referência.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
76
3.3 – Material e métodos
3.3.1 – Equipamentos
Para as determinações seqüenciais de nitrito e nitrato pelo método de Greiss
em sistema de fluxo acoplado à câmara de tubos concêntricos (CTC) foi empregado
espectrofotômetro FEMTO 432 (Brasil), equipado com cela de fluxo com caminho
ótico de 10 mm e volume de 200 L; registrador Cole-Parmer, modelo Ross 101–A
1898 (EUA); bomba peristáltica de quatro vias Gilson MiniPlus 3 (França); linhas de
transmissão em polietileno (diâmetro interno 0,8 mm); tubos peristálticos de Tygon
para a propulsão dos líquidos; e, injetor comutador proporcional 2:3:2.
Para obtenção de água purificada foi empregado o purificador de água
EASYpure RF (Barnstead, USA).
Para as medidas de pH foi empregado o milivoltímetro Digimed DM 21
(Brasil). Também foi empregado banho-maria Quimis Q-334 (Brasil); agitador
magnético Quimis 221 (Brasil) e agitador horizontal para erlenmeyer da Ética
(Brasil).
A descrição completa da câmara de tubos concêntricos (CTC), foi
apresentada por Borges (2005). O dispositivo foi construído pela associação de três
blocos de Perspex; um para a entrada do fluxo, um corpo central e outro para a
saída do fluxo. O corpo central apresentava dimensões de 85 x 21 x 12 mm e um
orifício central de 6 mm de diâmetro feito a partir de uma das faces menores (21 x 12
mm). Este orifício correspondeu ao tudo externo (coroa) da CTC, cuja capacidade
era de 2,2 mL. O tubo interno da CTC foi feito pela conexão de um segmento de
tubo de polietileno de 1,5 mm de diâmetro externo, 0,8 mm de diâmetro interno e 88
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
77
mm de comprimento com capacidade para 44 L. Este tubo, tubo central da CTC, foi
inserido, de forma concêntrica, no orifício de 6 mm feito no bloco de Perspex,
previamente usinado, e fixado em duas máscaras, removíveis, de borracha com
dimensões de 22 x 13 x 1 mm. As máscaras foram projetadas para, além de suportar
o tubo interno da CTC, permitir o acesso e a divisão da zona da amostra pelos
compartimentos da CTC (tubo interno e coroa). Finalmente, dois blocos em Perspex,
de mesmas dimensões, foram acoplados ao corpo central da CTC, para fixação do
dispositivo. Em cada um destes blocos foi feita uma cavidade para evitar a obstrução
dos acessos à coroa e ao tubo interno da CTC e, a partir da cavidade foi perfurado
um orifício com 0,8 mm de diâmetro para permitir o acesso das soluções pelos tubos
(tubo interno + coroa) que compunham a CTC. As tampas foram fixadas com
parafusos de aço inoxidável de 3 mm de diâmetro por 30 mm de comprimento ao
corpo central da CTC, como mostrado na Figura 3.2a a 3.2e.
Figura. 3.2: Visão frontal (a e b) do aparato câmara de tubos concêntricos – CTC. C. vista frontal da tampa. d = Vista frontal da CTC sem a tampa; e = Vista frontal de máscara de borracha com 4 orifícios (entrada 4 furos, saída 8 furos). FONTE: adaptado de Borges (2005).
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
78
O diagrama do sistema de análise em fluxo empregado para as determinações
de nitrito e nitrato está representado na Figura 3.3.
Figura 3.3: Diagrama de fluxo para análise de nitrato e nitrito. A. amostra, C. transportador
(tampão borato pH 7,25),BP. Bomba peristáltica, IC. Injetor comutador (posição de injeção),
L. Alça de amostragem (200 l), CTC. câmara de tubos concêntricos com coroa preenchida
com Cd coperizado, R. coquetel de reagentes (sulfanilamida e NED), B. bobina de reação
(150 cm), D. detector (540 nm), W. descarte.
O sistema em fluxo (Fig. 3.3) foi construído de forma que as operações e
reagentes utilizados no procedimento de análise em fluxo fossem os mesmos do
procedimento em batelada, seguindo as etapas envolvidas no método de Griess
(MARCZENKO 1976). Para evitar a obstrução dos orifícios e a perda do Cd, foram
adaptados dois discos de tela de aço inoxidável com diâmetro de 6 mm e orifício
central de 1,5 mm, visando a passagem do tubo interno da CTC pela tela.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
79
3.3.2 – Reagentes e soluções
Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico de pureza. As soluções
foram preparadas com água purificada e fresca, com condutância sempre inferior a
18,2 S cm-1.
As soluções de referência foram preparadas a partir de NaNO3 e NaNO2
(Merck). A solução estoque de 100 mg L-1 em nitrato foi preparada tomando-se
0,0137 g do sal e diluindo com água até 100 mL. A solução de nitrito, com
concentração 100 mg L-1, era diariamente preparada, pela dissolução de 0,015 g de
NaNO2 em 100 mL de água. As soluções de nitrito eram preparadas diariamente
para evitar perdas de nitrito pela oxidação. As soluções de trabalho eram soluções
mistas (nitrato + nitrito), preparadas diariamente em tampão tetraborato (pH 7,25).
Uma solução contendo o coquetel de reagentes foi preparada em 0,5 mol L-1 de
H3PO4 (Merck) de forma a responder as concentrações de 2,0% (m/v) em
sulfanilamida (Reagen) e 0,1% (m/v) em NED – bicloridrato de n-naftilamina
(Reagen). A solução do coquetel de reagentes foi armazenada em frasco âmbar, sob
refrigeração, por até 30 dias.
A solução transportadora foi preparada nas seguintes proporções: 2% (m/v)
de tetraborato de sódio (Vetec), 0,1% (m/v) de EDTA (Reagen) e 10% (m/v) em
NH4Cl (Merck), seguindo as recomendações de Giné e outros (1980). O pH da
solução transportadora foi ajustado para 7,25 com solução 1,0 mol L-1 em HCl
(Merck).
Utilizou-se cádmio metálico granulado (Isofar) e solução 5% (m/v) em CuSO4
(Reagen) para o preparo do cádmio coperizado.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
80
Soluções de tetraborato de sódio a 5 % (m/v), solução de ferrocianeto de
potássio (Ecibra) a 15 % (m/v) e solução 30 % (m/v) em acetato de zinco (Vetec)
foram empregadas para o tratamento das amostras.
As soluções reagentes preparadas para uso no ensaio do método de
referência preconizado pelo MAPA (BRASIL, 1999), foram: solução tampão
(estoque) de NH4OH em HCl (pH 9,6) e solução tampão diluída (1:9); solução de
sulfanilamida a 0,5 % (m/v) em HCl (1:1); e, solução aquosa de cloreto de -
naftiletilenodiamina a 0,5 % (m/v). A solução contendo os reagentes cromogênicos
foi estocada em frasco âmbar sob refrigeração.
3.3.3 – Procedimentos
O tratamento das amostras seguiu as recomendações da Instrução Normativa
nº 20, de 21 de julho de 1999 do Ministério da Agricultura (Brasil, 1999).
As amostras de produtos cárneos foram homogeneizadas em liquidificador
doméstico. Às alíquotas de 10 g de amostra homogeneizada foram adicionadas 100
mL de H2O aquecida 80oC e 5 mL de solução 0,5 % (m/v) em tetraborato de sódio. A
mistura era aquecida em banho maria (100 ºC) por 15 min, sob agitação. Após
resfriar até temperatura ambiente, o conteúdo do béquer era quantitativamente
transferido para balão volumétrico de 250 mL. A seguir eram adicionados 5 mL de
solução 15% (m/v) em ferrocianeto de potássio e 5 mL de solução de acetato de
zinco a 30% (m/v). A mistura era submetida à agitação e o volume completado com
água. Por fim, a mistura era filtrada e o filtrado utilizado para as dosagens de NO2- e
NO3-.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
81
No processo para determinação seqüencial em sistema de análise em fluxo
de NO2- e NO3
-, 200 L do filtrado era inserido no percurso analítico e transportado
pela solução carregadora (tampão borato - pH 7,25) até a câmara de tubos
concêntricos – CTC, a vazão de 4,5 mL min-1. A câmara de tubos concêntricos foi
posicionada verticalmente em relação à bancada e, a propulsão dos fluidos na CTC
foi conduzida no sentido ascendente, pelo bombeamento da solução transportadora.
Após atravessar a CTC, as zonas de amostra misturavam-se com o coquetel de
reagentes, quando eram endereçadas ao detector ( = 540 nm). A subzona da
amostra que passava pelo tubo central da CTC, ao reagir com a sulfanilamida e o
NED, resultava apenas na reação do NO2- presente. A sub-zona da amostra que
passava pela coroa da CTC, percolava a coluna de cádmio coperizado, resultando
na redução do NO3- existente a NO2
- mais o NO2- presente na amostra (nitrito +
nitrato). O diazocomposto formado, de coloração rósea, era encaminhado até o
detector, gerando dois sinais transientes, correspondendo as duas sub-zonas de
amostra. O primeiro pico estava relacionado à concentração de NO2- e o segundo à
concentração de NO2- + NO3
-.
Soluções mistas de referência de nitrito e nitrato, nas faixas de concentração
de 0,5 a 5 mg L-1, foram preparadas em tampão de tetraborato (pH 7,2). Quando
submetidas à análise no módulo de análise em fluxo (Fig. 3.5) eram originadas duas
curvas de trabalho. Uma primeira referente à variação do máximo do sinal transiente,
expresso em absorbância, com a concentração de NO2- e a segunda referente à
soma das concentrações de nitrito e nitrato. As faixas de concentração estudadas
para nitrito e para a soma das concentrações de nitrito e nitrato foram de 0,5 a 2,5
mg L-1 e de 1 a 5 mg L-1, respectivamente. A concentração do nitrato na amostra foi
obtida pela diferença entre as concentrações calculadas de nitrito referente ao
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
82
segundo sinal transiente, ou seja, aquele que migrou para o detector pela coroa da
CTC (nitrato + nitrito), e de nitrito originalmente presente na alíquota da amostra
inserida no percurso analítico e que migrou pelo tubo interno da CTC
(correspondente ao primeiro pico). Finalmente, foi aplicado um fator de correção, de
1,348, para conversão da diferença entre as concentrações de nitrito calculadas nos
dois picos para determinar a concentração (mg L-1) de nitrato na amostra original.
Este fator de correção (1,348) foi obtido pela razão entre as massas molares de
nitrato e nitrito (62/46).
Para a determinação de NO2-, seguindo metodologia estabelecida pelo MAPA
(BRASIL, 1999), 10 mL do filtrado, resultante do tratamento da amostra, era
transferido para balão volumétrico de 50 mL e adicionados 5 mL de solução 0,5%
(m/v) de sulfanilamida. Após agitação a solução era mantida 3 min em repouso, para
então adicionar 3 mL da solução 0,5% (m/v) em NED. A absorbância era medida
após 30 min a 540 nm e registrado o valor. A curva analítica foi preparada de forma
semelhante, com faixa de concentração variando de 0,05 a 0,5 mg L-1.
Nas condições do método oficial para a determinação de NO3-, 20 mL do
filtrado desproteinizado (resultante da amostra tratada), eram transferidos para
erlenmeyer de 125 mL e adicionados 5 mL da solução tampão (diluída) pH 9,7 e ca.
20 g do cádmio coperizado. Em seguida a mistura era submetida à agitação por 15
min, deixando em repouso para decantação. Por fim, a solução sobrenadante era
filtrada e recolhida diretamente em balão volumétrico de 100 mL. O Cd restante no
erlenmeyer, era lavado com H2O e agitado por 2 min, quando era feita a filtração
para balão de 100 mL. Desta solução final, era, então, retirada alíquota de 10 mL
para um balão volumétrico de 50 mL e adicionados 5 mL da solução tampão pH 9,7.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
83
Os passos seguintes seguiram da mesma maneira anteriormente descrita para
determinação de nitrito.
Soluções de referência foram preparadas para a construção de curva analítica
na faixa de concentração de 0,05 a 0,5 mg L-1. O resultado obtido referia-se ao teor
de nitrato + nitrito. A concentração de NO3-, era obtida por diferença.
A Figura 3.4 ilustra o esquema do procedimento acima descrito.
Figura 3.4: Fluxograma da determinação de NO2- e NO3
- segundo normas do Ministério da
Agricultura.
Sol. Tampão
Cádmio esponjoso
Avolumar
5ml tetraborato de sódio
5ml ferrocianeto de potássio
5ml de acetato de zinco
Amostra tratada
10 g
amostra
Banho maria 15’
Det. NO2-
Det. NO3-
20 ml da amostra
Agitador 15’
10ml da amostra tratada
5ml tampão
5ml sulfanilamida
3 ml NED
Detector
540nm
Balão
25 mL
Balão
250 mL
Balão
25 mL
Balão
100 mL
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
84
3.4 - Resultados e discussão
3.4.1 – Perfis dos sinais analíticos empregando a CTC
Foram realizados estudos preliminares para confirmação das expectativas
quanto ao comportamento dos sinais transientes no sistema em fluxo equipado com
a CTC. Para tanto, alíquota de solução mista de NO2- e NO3
- na concentração de 1
mg L-1 foi injetada no sistema em fluxo proposto. O perfil dos sinais analíticos é
ilustrado na Figura 3.5.
Figura 3.5: Fiagrama obtido pela injeção de solução mista de referência de NO2- e NO3
- 1
mg L-1 no sistema proposto acoplado à câmara de tubos concêntricos.
Dada às características da câmara e o tempo de permanência da solução
mista na CTC, pode-se deduzir que as subzonas da amostra apresentavam
dispersões diferenciadas, a depender do caminho que passavam pela CTC (interno
ou externo). Desde que a capacidade do tubo externo da CTC (2,2 ml) era 50 vezes
maior que a capacidade do tubo interno (44 l), o primeiro sinal transiente, referente
à subzona da amostra que passava pelo tubo interno, revelava menor efeito de
t t
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
85
dispersão, como pode ser observado pelas larguras dos picos FIA na Figura 3.5. Por
outro lado, o segundo pico apresentavam-se mais largos, devido à alta dispersão da
zona da amostra na coroa da CTC.
3.4.2 – Efeito da vazão
O efeito da vazão sobre o perfil dos picos foi testado, pela inserção de um
corante (azul de metileno) no sistema proposto. Para este estudo preliminar foram
avaliadas vazões entre 0,75 a 4,5 mL min-1. Os registros dos perfis dos sinais
transientes são apresentados na Figura 3.6.
Figura 3.6: Efeito da vazão nos perfis dos sinais transientes. = 665 nm. (n=2)
Além do esperado aumento no intervalo de tempo entre os máximos dos
sinais transientes (pico 1 e pico 2) com a diminuição da vazão, pôde ser observado
que, para vazões menores a interpenetração das frações era mais evidente, o que
em certas circunstâncias poderia levar a total perda da capacidade de monitoração
de ambos os picos.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
86
3.4.3 - Otimização do sistema
Para otimização do sistema em fluxo proposto foram realizados testes de
volume amostrado e vazão, percurso analítico e massa de cádmio coperizado. A
capacidade redutora e a vida útil do cádmio também foram avaliadas. A solução
mista de referência contendo NO2- e NO3
- na concentração de 1 mg L-1 foi utilizada,
na maioria dos testes, para otimização do sistema.
3.4.3.1– Efeito do volume amostrado e da vazão
Foram testadas alças de amostragem de 20 (100 l) e 40 cm (200 l) e
vazões entre 0,5 e 7 mL min-1. Na Figura 3.7 são apresentadas as variações dos
valores máximos dos sinais transientes do primeiro e segundo picos obtidos para
alças de amostragem de 20 cm (Fig. 3.7a) e 40 cm (Fig. 3.7b) em função da vazão.
Figura 3.7: Variações dos sinais transientes do primeiro e segundo picos obtidos para alças
de amostragem de 20 cm (a) e 40 cm (b) em função da vazão. Solução mista de NO2- e NO3
-
1 mg L-1 = 540nm.
PICO 1
PICO 2
PICO 2
PICO 1
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
87
Em relação ao volume amostrado, pôde-se constatar que, o pico 1 apresentou
aumento do sinal analítico na ordem de 50%, para 200 L de amostra injetada. Já,
para o pico 2, não foram verificadas diferenças significativas de sinais com a
variação do volume amostrado. Contudo, aumentando o comprimento da alça de
amostragem foi possível obter sinais mais elevados, permitindo determinar
concentrações menores, fornecendo ao método a sensibilidade necessária. Desta
forma, para os estudos que se seguiram foi escolhida a alça de amostragem de 40
cm.
Para o estudo da vazão, foi observado que a partir de 2 mL min-1, não houve
variação do sinal transiente para o pico 1. Já para o pico 2, observou-se um aumento
do sinal analítico proporcional à vazão. Este fato pode ser explicado, pois maiores
vazões implicaria na menor dispersão da zona da amostra na coroa do CTC, com
conseqüente aumento de sinal.
A vazão otimizada foi a da solução transportadora, uma vez que o coquetel de
reagentes foi injetado no percurso analítico, após a passagem pela câmara de tubos
concêntricos (Fig 3.3). A vazão do coquetel de reagentes foi estabelecida de forma
que não houvesse um consumo exagerado de reagentes. Vazão de 1,5 ml min-1 foi
selecionada para a solução do coquetel de reagentes.
Logo, pelos dados apresentados na figura 3.7 e levando-se em consideração
a produtividade analítica sem perda da qualidade dos resultados, optou-se por uma
vazão do transportador de 4,5 mL min-1.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
88
3.4.3.2 - Percurso analítico
Para os ensaios realizados na otimização do percurso analíticos da bobina de
reação – B (Fig 3.3), foram avaliados percursos que variaram de 50 a 200 cm. A
Figura 3.8 mostra o comportamento dos sinais analíticos dos picos 1 e 2 em função
da variação do comprimento do percurso analítico.
Figura 3.8: Variação dos sinais analíticos (pico 1 e pico 2) em função da variação do
percurso analítico. Vazão 4,5 mL min-1 Solução mista de NO2- e NO3
- 1 mg L-1, =540nm,
(n=3).
Pelos resultados mostrados na Figura 3.8, pode-se observar que com o
aumento do percurso analítico não houve aumento significativo no sinal,
notadamente para o pico 2, pois a zona da amostra era bastante diluída na coroa da
CTC. Contudo, para o pico 1 houve discreto ganho de sinal para o percurso de 150
cm. Portanto optou-se pelo percurso analítico de 150 cm.
Para avaliar o aumento de sensibilidade do sistema, foi observado o perfil dos
sinais analíticos, fixando o percurso analítico em 150 cm e variando a alça de
50 100 150 200
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Pico 2
Pico 1
A
Percurso analítico, cm
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
89
amostragem. Para tanto foi considerada a alça de amostragem variando de 10 a 100
cm. Na Figura 3.9, são observados os sinais analíticos registrados.
Figura 3.9: Variação dos sinais analíticos em função da variação da alça de amostragem.
PA. 150 cm. Vazão 4,5 mL min-1 Solução mista de NO2- e NO3
- 1 mg L-1, =540nm (n=3)
Como esperado, os dados apresentados na Figura 3.9 permitiram observar
que o aumento do tamanho da alça de amostragem pode ser utilizado como recurso
para aumento da sensibilidade.
3.4.3.3 - Avaliação da capacidade de conversão de nitrato a nitrito
Para avaliar a capacidade de conversão de nitrato a nitrito pelo cádmio
coperizado inserido na coroa externa da CTC, foi realizado um planejamento fatorial
com ponto central (2n + 1), variando-se as concentrações de nitrato e nitrito de 0,5 a
5 mg L-1. Esse teste permitiu também verificar possíveis interações (sinergismos)
entre os ânions, visto que conhecendo o comportamento de ambos quando em
misturas, equivaleria ao comportamento dessas espécies em soluções separadas.
0 20 40 60 80 100
0,00
0,15
0,30
0,45
0,60
Pico 2
Pico 1
A
Alça de amostragem, cm
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
90
Em outras palavras, este estudo visava observar possíveis efeitos proporcionados
pela coexistência das espécies aniônicas no sistema proposto, como ocorre nas
amostras de produtos cárneos. Os dados obtidos estão listados na Tabela 3.1.
Tabela 3.1: Sinais referentes às diferentes concentrações de soluções mistas de nitrito e
nitrato de sódio.
Solução mista
de referência [NO2
-], mg L-¹ [NO3-], mg L-¹ SINAL 1 SINAL 2
P1 5,0 5,0 0,640 0,290
P2 5,0 0,5 0,640 0,160
P3 0,5 5,0 0,060 0,140
P4 0,5 0,5 0,050 0,020
P5 2,75 2,75 0,350 0,160
Com o auxílio do software (STATISTICA), pôde-se encontrar duas equações
relacionadas aos sinais. Foi preciso converter as concentrações de mg L-1 para mol
L-1, pelo fato do nitrito e nitrato possuírem massas molares distintas (49 e 64 g mol-¹,
respectivamente). As equações encontradas foram:
A1 = 59,80 [NO2-] + 0,69 [NO3
-] - 0,12 (pico 1)
A2 = 14,82 [NO2-] + 17,22 [NO3
-] - 0,11 (pico 2)
Os valores encontrados para as equações acima se referem aos coeficientes
relacionados com o NO2- e o NO3
-. Nota-se que a inclinação da curva referente ao
NO2- (pico 1) é maior que para o pico 2 devido a dispersão da zona da amostra. E
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
91
que, para o pico 2, onde houve redução do NO3- a NO2
-, o coeficiente para nitrato
não tende a zero, neste caso assumindo o valor igual a 17,22.
Ao colocarmos estas duas equações na forma genérica, temos:
A = a [NO2-] + b [NO3
-] + c
Onde:
A = absorbância
a = coeficiente relacionado à sensibilidade (só diz respeito a fração de amostra que
passa pelo tubo interno)
b = coeficiente relacionado à sensibilidade, ao fator de dispersão e à taxa de
conversão de nitrato em nitrito (só diz respeito à fração que passa pelo tubo externo)
c = sinal do branco.
Sendo assim teremos:
A1 = a1 [NO2-] + b1 [NO3
-] + c1, onde b1 0* (I)
A2 = a2 [NO2-] + b2 [NO3
-] - c2 (II)
Neste caso, b1 tende a zero, pois esta equação diz respeito a subzona da
amostra que passa pelo tubo interno da CTC. Logo só o nitrito presente participará
da reação de Greiss. A resposta para o nitrato presente tenderá a zero.
Pela equação II, se a taxa de conversão de NO3- a NO2
- fosse 100%, b2 seria
igual ao coeficiente a2. Logo, para se determinar à taxa de conversão do NO3- a NO2
-
foi obtida a seguinte equação:
* Lembrando que a reação de Griess só é positiva para nitrito e a1 corresponde ao sinal do analito que transita pelo tubo interno, no qual não ocorrerá a conversão de nitrato a nitrito.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
92
% conversão = b2 . 100 / a2
De acordo com os dados da equação correspondente (17,22x100/14,82) ao
máximo do segundo sinal transiente, obtivemos conversão (de NO3- para NO2
-) de
até 116%. Deste modo, foi observado que, para o sistema proposto, a presença do
NO2- não interferiria na redução do NO3
-.
3.4.3.4 - Estudo da massa de cádmio
Para o estudo da massa de cádmio, utilizada na coroa da CTC, para a
redução de NO3- a NO2
-, foram tomadas massas de cádmio granulado coperizado
que variaram de 0,4 a 2,5 g. Foram usadas soluções simples de NO2- e NO3
-, na
concentração de 2 mg L-1.
Os valores de absorbância obtidos pelas soluções simples de NO3- e NO2
-
foram registrados. Foi possível avaliar a eficiência da conversão de NO3- a NO2
-
fazendo a correção da equivalência destes ânions (NO3- = 0,7419 NO2). Para vazão
do transportador de 4,5 mL min-1, percurso analítico de 150 cm, alça da amostra de
40 cm, os resultados dos sinais analíticos obtidos estão apresentados na Figura
3.10.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
93
Figura 3.10: Variação do sinal analítico para soluções simples de NO2- e NO3
- após
passagem na coroa do CTC, contendo diferentes massas de Cd.
Observou-se que para a massa de Cd de ca. 2 g houve a equivalência dos
sinais analíticos para ambas as soluções de NO3- e NO2
-.
Na tabela 3.2 são apresentados os porcentuais de conversão de nitrato a
nitrito para diferentes massas de Cd adicionadas na coroa da CTC.
Tabela 3.2 : Absorbâncias obtidas pelas soluções simples de NO2- e NO3
- após a passagem
pela coroa da CTC com diferentes massas de cádmio.
Massa de Cd (g)
NO2-
A
NO3-
A
Fator de conversão de NO3
- para NO2-
(0,7419)
NO2- produzido
(%)
0,4304 0,154 0,046 0,062 40
0,8599 0,176 0,082 0,110 62
1,3149 0,159 0,107 0,144 90
1,8584 0,137 0,106 0,143 102
2,3895 0,136 0,110 0,148 109
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
NO3
-
NO2
-
A
m Cd, g
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
94
Observou-se que à medida que aumentava a massa de cádmio na coroa da
CTC, o porcentual de redução também aumentava, alcançando 100% para massa
de Cd igual a 1,85 g. Esta massa de cádmio era suficiente para ocupar o quarto
inferior da coroa externa do tubo. Não seria adequada a utilização de uma massa de
cádmio superior a 2 g, pois haveria probabilidade de impedimento espacial do fluxo
na coroa externa. Isto poderia elevar o tempo de residência da zona da amostra na
coroa externa da CTC, retardando o aparecimento do segundo pico.
Logo, de acordo com o estudo realizado, adotou-se 2 g de cádmio coperizado
na coroa externa da CTC, por esta massa proporcionar 100% de redução do nitrato
a nitrito.
3.4.3.5 – Avaliação do tempo de vida útil da coluna de cádmio
A fim de avaliar quanto tempo poderia se utilizar o sistema sem a reposição
de nova massa de cádmio na CTC, foi observada a capacidade redutora da coluna
de cádmio em função do tempo de operação. Para tanto, foi considerada a utilização
do sistema por 8 horas diárias, durante sete dias. A vazão do transportador foi de 4,5
mL min-1, o percurso analítico foi de 150 cm, a alça da amostra foi de 40 cm e a
coroa externa do CTC foi preenchida com 2 g de cádmio coperizado.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
95
A Figura 3.11 mostra o perfil da redução do NO3- a NO2
- pelo cádmio em
função do tempo.
Figura 3.11: Porcentual de NO3
- reduzido a NO2- pela passagem de solução de referência
na coroa do tubo concêntrico, em função do tempo de utilização do sistema.
Observou-se que ao longo de sete dias houve diminuição da eficácia redutora
do cádmio, tendo como referência, a utilização do sistema para determinação de
NO2- e NO3
- em amostras de alimentos, numa jornada de trabalho de 8 horas diárias.
Considerando que a regeneração do cádmio é um procedimento relativamente
simples, necessitando de uma lavagem em meio ácido e posterior contato com
solução de CuSO4 para haver a coperização, e tendo em vista os dados da Fig 3.11,
optou-se por regenerar a coluna de cádmio a cada 4 dias de uso.
Após a otimização destes parâmetros o sistema apresentou a configuração
apresentada na Tabela 3.3.
1 2 3 4 5 6 7
80
85
90
95
100
%
t, dias
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
96
Tabela 3.3: Parâmetros referentes à otimização do sistema em fluxo.
Parâmetro Valor
Vazão transportador (mL min-1) 4,5
Vazão reagentes cromogênicos (mL min-1) 1,5
Alça de amostragem (cm) 40
Percurso analítico (cm) 150
Massa de cádmio (g) 2
Vida útil da carga de Cd na CTC (dias) 4 (93%)
3.4.3.6 – Figuras de mérito
Após a otimização do sistema de análise em fluxo para determinação
seqüencial de NO2- e NO3
-, foram avaliadas as figuras de mérito para o
procedimento analítico proposto. Os resultados estão apresentados na Tabela 3.4.
Tabela 3.4: Figuras de mérito para o procedimento em fluxo proposto
Analito Faixa (mg L-1) Equação (r) LD (3), mg L-1 RSD (%) (n=10)
NO2- 0,5 – 2,5 A = 0,00144+0,11814C
(0,99934)
0,018 0,54
NO3- 1 – 5 A = -0,0026 + 0,05842C
(0,99934)
0,036 0,55
A produtividade analítica do sistema foi de aproximadamente 120
determinações por hora (60 de NO2- e 60 de NO2
- + NO3-). Uma vez estabelecidas
as figuras de mérito do sistema e visando a determinação de nitrito e nitrato foram
realizadas análises em amostras de salsichas e jerked beef (carne bovina salgada,
curada e dessecada).
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
97
3.4.4 - Aplicação do sistema para a determinação de NO2- e NO3
- em amostras
de produtos cárneos.
Como já mencionado anteriormente o perfil dos sinais analíticos obtidos no
sistema em fluxo se configura em dois picos distintos. A Figura 3.12 ilustra o perfil
dos sinais analíticos obtidos na curva de calibração para NO2- e NO3
-.
Figura 3.12: Sinais analíticos para soluções mistas de NO2
- e NO3- obtidos pelo sistema em
fluxo acoplado a CTC nas condições otimizadas (n=3).
Sete amostras de salsicha e dez de jerked beef foram adquiridas em mercados
locais e analisadas empregando o sistema em fluxo proposto e o método oficial
recomendado pelo Ministério da Agricultura (Brasil, 1999) para validação dos
resultados. Os resultados obtidos por ambos os procedimentos estão apresentados
na Tabela 3.5.
0 500 1000 1500 2000
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
c, mgL-1
2,5
2,0
1,5
1,0
0,7
0,5
B
A,
540nm
t,s
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
98
Tabela 3.5: Concentrações de NO2- e NO3
- (mg kg-1) em amostras de salsichas (S) e
jerked beef (JB) obtidas pelo Método Oficial (MO) e pelo sistema proposto (FIA).
Amostras [NO2-] (FIA) [NO2
-] (MO) [NO3-](FIA) [NO3
-] (MO)
S1 4,67 0,02 4,330,03 4,420,03 3,20,3
S2 4,8 0,2 4,850,09 51 4,00,4
S3 4,470,01 4,350,02 4,20,2 3,50,4
S4 2,30,1 2,30,1 3,30,1 2,50,2
S5 0,900,01 1,000,01 5,80,2 4,20,4
S6 2,050,02 2,110,03 4,00,4 3,50,4
S7 0,910,01 1,020,01 4,60,4 3,10,3
JB1 0,360,01 0,300,02 3,40,2 2,160,03
JB 2 1,80,1 1,810,04 10,700,01 4,10,1
JB 3 0,390,01 0,360,03 5,70,3 4,40,1
JB 4 0,370,03 0,370,01 4,270,07 1,860,05
JB 5 0,610,06 0,560,01 0,6040,002 0,4820,004
JB 6 0,490,04 0,500,01 10,40,1 7,70,9
JB 7 0,540,06 0,530,002 1,050,3 0,50,6
JB 8 1,450,09 1,590,06 2,80,2 1,80,1
JB 9 0,480,07 0,470,05 8,50,3 5,00,7
JB 10 0,650,03 0,640,02 3,90,2 3,30,3
Os teores de NO2- medidos por ambos os procedimentos foram concordantes
de acordo o teste t-pareado. Contudo, isto não ocorreu para o NO3-. Os teores de
NO3- determinados pelo método oficial foram sempre menores do que aqueles
obtidos pelo sistema em fluxo. Este fato, deve-se provavelmente, à ineficiência da
agitação da solução da amostra com o cádmio metálico, o que pode ter levado a
pouca interação entre o cádmio e o NO3-, existente na solução da amostra,
dificultando a redução. Além disso, a excessiva manipulação da amostra, a qual
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
99
sofre três diluições e duas filtrações antes da etapa de determinação, pode ser outro
fator promotor de perdas do analito em questão.
Adicionalmente, é importante frisar que o método oficial do Ministério da
Agricultura é aquele seguido pelos Laboratórios Oficiais de controle de alimentos em
todo o pais, mesmo que os fatores aqui descritos contribuam para maiores erros nos
resultados obtidos.
Ademais o método oficial apresenta elevado consumo de reagentes. A massa
de sulfanilamida usada (25 g) por determinação no MO é ca. do dobro daquela
empregada pelo sistema proposto (15 g) . Já a massa de NED empregada no MO
(25 g )é cerca de 30 vezes maior que no sistema em fluxo (0,75 g). O elevado
consumo de reagentes pelo MO resulta na geração de grandes quantidades de
resíduos.
Segundo a Portaria 1004/98 da ANVISA – MS (BRASIL, 1998), o limite
máximo permitido para produtos cárneos curados é de 150 mg kg-1 pra NO2- e 300
mg kg-1para NO3-, sendo que a soma das concentrações das duas espécies no
alimento não deve ultrapassar o limite máximo de nenhum deles, ou seja, 300 mg kg-
1. Todas as amostras analisadas estavam de acordo com a legislação vigente
quanto à concentração de NO2- e NO3
-.
Tendo em vista que os ensaios pelo método oficial não foram concordantes
para NO3-, adicionalmente foram feitas determinações de NO3
- e NO2- em amostras
de água mineral, nas quais é declarada a concentração de nitrato presente. Os
resultados das análises, para três marcas distintas de água mineral encontram-se na
Tabela 3.6.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
100
Tabela 3.6: Concentração de NO2- e NO3
- em amostras de água mineral
Amostras
H2O
Conc. no rótulo, mg L-1 Conc. encontrada, mg L-1
NO3- NO2
- NO3- NO2
-
A 1 Não declarado 1,035 0,009 < 0,018 mg L-1
B 1 Não declarado 1,008 0,007 < 0,018 mg L-1
C 1 Não declarado 0,923 0,009 < 0,018 mg L-1
Os resultados encontrados para nitrato foram concordantes com os valores
declarados nos rótulos, indicando a exatidão do procedimento em fluxo proposto nas
condições otimizadas.
3.5 – Conclusões
Os resultados obtidos na determinação de NO2- e NO3
- em amostras de
produtos cárneos, baseados na reação de Greiss, empregando a análise em fluxo
acoplada à câmara de tubos concêntricos confirmaram suas potencialidades. A
exatidão e precisão, por comparação dos resultados com os obtidos na metodologia
de referência, para NO2- em produtos cárneos foram satisfatórias. Contudo, as
concentrações de NO3- apresentaram um desvio sistemático quando comparado
com o método oficial.
A robustez e versatilidade do sistema foram observadas de forma a conseguir
um sistema confiável e preciso para determinação de NO2- e NO3
- em produtos
cárneos, com elevada produtividade analítica.
O sistema oferece sensibilidade na quantificação do analito, com limite de
detecção de 0,018 e 0,036 mg L-1 para NO2- e NO3
-, respectivamente.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
101
A versatilidade do sistema foi caracterizada uma vez que o mesmo sistema
pôde ser empregado para outras matrizes.
A automação de métodos de análise é um campo amplo e relevante de
investigação, devido à grande demanda por análises e a redução dos custos
operacionais. A análise de NO2- e NO3
- em produtos cárneos empregando sistema
em fluxo com câmara de tubos concêntricos acoplada apresentou elevada
produtividade (120 determinações h-1) com redução no gasto de reagentes e na
geração de resíduos, sem perda na qualidade dos resultados.
3.6 - Referências bibliográficas
_______ Weekly.Methemoglobinemia following unintentional ingestion of sodium
nitrite--New York, 2002. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2002 Jul 26;51(29):639-
42. Disponível em www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5129a2.htm.
Consultado em 31 de janeiro de 2005.
AHMED, M. J.; STALIKAS, C. D. TZOUWARA-KARAYANNI, S. M.; KARAYANNIS,
M. I. Silmultaneous spectrophotometric determination of nitrite and nitrate by
flow-injection analysis. Talanta. v. 43, p. 1009 – 1018, 1996.
ALLINGER, N. L.; CAVA, M. P.; DE JONGH, D. C.; et al. Química Orgânica. 2ª ed.
Rio de Janeiro: Guanabara Dois.1978.
AOAC – Official Methods of Analysis of AOAC International, 17th Edition current
through 2nd Revision, 2003.
ARJONA, V. A.; GARRIDO, G. J. A.; ZAFRA, Q. R.; LUQUE de CASTRO, M. D. Full
automated robotic method for the determination of cloride, nitrite and nitrate in
cured meat products. Talanta, v. 46, p. 996 – 976. 1998.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
102
BADEA, M.; AMINE, A.; PALLESCHI, G.; et al. New electrochemical sensors for
detection of nitrites and nitrates. Journal of Electroanalytical Chemistry, v. 509,
n. 1, p. 66 – 72, 2001.
BILAL BUTT, S.; RIAZ, M.; IQBAL, Z. M. Simultaneous determination of nitrite and
nitrate by normal phase ion-pair liquid chromatography. Talanta. v. 55. n. 4, p.
789 – 797, 2001.
BINSTOK, G.; CAMPOS, C. A.; GERSCHENSON, L. N. Determination of nitrites in
meat systems: an improved procedure. Meat Science. v. 42, n. 4, p. 401 – 405,
1996.
BORGES, S. S. Contribuições nas Estratégias de Análise Química para Aumento da
Seletividade em Diferentes Etapas da Seqüência Analítica. Tese (Doutorado
em Química) Instituto de Química da Universidade Federal da Bahia. Salvador.
2005.
BOSCH, B. N.; MATA, M. G, M.; PEÑUELA, J.; et al. Determination of nitrite levels in
refrigerated and frozen spinach by ion chromatography. Journal of
Chromatography A. v. 706, n. 1-2, p. 221 – 228, 1994.
BRASIL, MINISTÉRIO DA AGRICULTURA. Instrução Normativa nº 20. Métodos
Analíticos Físico-Químicos para Controle de Produtos Cárneos e seus
Ingredientes. Diário Oficial da União de 21 de julho de 1999.
BRASIL. Ministério da Saúde. ANVISA. Portaria do n° 1004, de 11 de dezembro de
1998. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, 22 de março de
1998.
CAMMACK, R.; JOANNOU, C. L.; CUI, X-P.; et al. Nitrite and nitrosyl compounds in
food preservation. Biochimica et Biophysica Acta. v.1411, p. 475 – 488. 1999.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
103
DUARTE, M; RIBEIRO, A.; MIDIO, A. F. Padronização de um método
espectrofotométrico para determinação de nitratos e nitritos em leite e em
mistura com soro. Rev. Farm. Bioquim. Univ. S. Paulo. v. 33, n. 1, p 37 – 45,
1997.
EVANGELISTA, J. Tecnologia de Alimentos. 2ª ed. São Paulo: Atheneu, 2001. 652p.
FARIA, J. A. F; FELÍCIO, P. E.; NEVES, M. A.; ROMANO, M. A. Formação e
estabilidade da cor de produtos cárneos curados. Revisão. Revista TeC Carne.
v. 3, n. 2, p. 16-22. 2001.
FERREIRA, I. M. P. L. V. O.; LIMA, J. L. F. C.; MONTENEGRO, M.C. B. S. M.
Simultaneous Assay of Nitrite, Nitrate and Chloride in Meat products by Flow
Injection. Analyst. v.121, p.1393 – 1396, out.1996.
GINÉ, M. F.; BERGAMIN FILHO, H.; ZAGATTO, E. A. G.; REIS, B. F. Simultaneous
determination of nitrate and nitrite by flow injection analysis. Analytica Chimica
Acta. v.114, p.191-197,1980.
HAGHIGHI, B.; TAVASSOLI, A. Flow injection analysis of nitrite by gas phase
molecular absorption UV spectrometry. Talanta. v. 56, p. 137 – 144, 2002.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. Métodos
químicos e físicos para análise de alimentos. 3ª ed. São Paulo: O Instituto. v.1,
533p, 1985.
JAWORSKA, G. Content of nitrates, nitrites and oxalates in New Zeland spinach.
Food Chemistry. v. 89, n. 2, fev 2005.
JOVER, T. H.; PULIDO, M. I.; NOGUÉS, M. T. V.; FONT, A. M.; CAROU, M. C. V.
Biogenic amines and polyamine contents in meat and meat products. J. Agric.
Food Chem. v. 45, p. 2098 – 2102, 1997.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
104
MARCZENKO, Zygmunt. Spectrophotometric determination of elements. Chichester
(UK): Ellis Horwood limited. 1976.
MATTEO, V. D. I.; ESPOSITO, E. Methods for the determination of nitrite by high –
performance liquid chromatography with eletrochemical detection. Journal of
Chromatography A. v. 789, p. 213 – 219, 1997.
MIDIO, A. F.; MARTINS, D. I. Toxicologia de Alimentos. São Paulo: Varela, 2000.
PETSUL, P. H.; GREENWAY, G. M.; HSWELL, S. J.; The development of an on –
chip micro – flow injection analysis of nitrate with a cadmium reductor. Analytica
Chimica Acta. v. 428, p. 155 – 161, 2001.
RATH, S; XIMENES, M. I. N.; REYES, F. G. R. Teor de nitrato e nitrito em vegetais
cultivados no Distrito Federal: um estudo preliminar. Rev. Inst. Adolfo Lutz. v.
54 n.2, p126 – 130, 1994.
ROCHA, F. R. P.; REIS, B. F. A flow system exploiting multicomutation for speciation
of inorganic nitrogen in waters. Analytica Chimica Acta. v. 409, p. 227-235,
2000.
RYWOTYCKI, R. Meat nitrosamine contamination level depending on animal
breeding factors. Meat Science. v. 65, p. 669 – 679, 2003.
RYWOTYCKI, R. The occurrence of nitrosamines in meat. Medycyna weterynaryjna.
v. 53, n. 12, p. 726 – 729, 1997.
SCARANO, G.; SAROGLIA, M. G. Recovery os fish from funcional and haemolytic
anaemia after brief exposure to a lethal concentration of nitrite. Aquaculture. v.
43, n. 4, p. 421 – 426, 1984.
SIU, D. C.; HENSHALL, A. Ion chromatographic determination of nitrate and nitrite in
meat products. Journal of Chromatography A. v. 804, p. 157 – 160, 1998.
Desenvolvimento de sistema em fluxo para análise seqüencial de nitrito e nitrato
105
SOFOS, J. N.; BUSTA, F. F. Alternatives to use nitrite as an antibotulinal agent. Food
Technology, may, p. 244 – 251, 1980.
VOGUEL, A. I. Química Analítica Cuantitativa. Buenos Aires: Kapelusz. 1960. v. 2. p.
698 – 699.
WANG, G. F.; SATEKE, M.; HORITA, K. Spectrophotometric determination of nitrate
and nitrite in water and some fruit samples using column preconcentration.
Talanta. v. 46, p. 671 – 678, 1998.
ZATAR, N. A.; ABU – EID, M. A.; EID, A. F. Spectrophotometric determination of
nitrite and nitrate using phodpomolybdenum blue complex. Talanta, v. 50, p.
819 – 826, 1999.
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
106
CAPÍTULO 4
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para
análise discriminatória de sulfito em carnes empregando o
método da p-rosanilina por difusão gasosa.
4.1– Introdução
O dióxido de enxofre, sulfitos, bissulfito, metabissulfito de sódio e de potássio,
são empregados como agentes inibidores de bolores, leveduras e bactérias numa
infinidade de produtos alimentícios, tais como, frutos e vegetais desidratados, vinhos
e pescados (SIMÃO, 1985). Além de inibidores de microrganismos, os sulfitos
apresentam ação antioxidante, anti-fermentativa e inibidora do escurecimento
enzimático e não-enzimático; ação redutora e clarificante (BRAGAGNOLO et al.,
2001; ARAÚJO, 1995). O mecanismo da ação inibitória de reações de
escurecimento não-enzimático, provavelmente envolve a interação do sulfito com
grupos carbonílicos ativos, impedindo a formação de pigmentos escuros, as
melanoidinas, como apresentado na Figura 4.1 (ARAÚJO, 1995). Segundo
Pizzoferrato e outros (1998), estas reações ocorrem devido a nucleofilicidade do
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
107
sulfito, levando-o a participar de reações de adição com compostos insaturados,
quinonas e compostos nitrogenados heterocíclicos.
C
OH
S
ONa
OH
OC
OH
H S
ONa
OO
H O SONa
O
C
OH
+
+
+ +
Glicose Sulfito Hidroxissulfonato
Figura 4.1: Ação inibitória do sulfito nas reações de escurecimento não enzimático.
As espécies de sulfito presentes nos alimentos podem estar na forma livre ou
associada. Desta forma o teor de sulfito total corresponde à soma das
concentrações de sulfito na forma livre e associada. (PIZZOFERRATO et al., 1998)
Os sulfitos são largamente empregados na industrialização de frutas, tanto na
produção de sucos, como no armazenamento de frutas antes da esterilização. Por
exemplo, para a produção de frutas em calda, e no processo de desidratação. Neste
caso, o sulfito evita o escurecimento enzimático, o desenvolvimento de odores
desagradáveis, bem como a perda de vitamina C e de carotenóides
(HOLDSWORTH, 1988).
Depois de adicionados aos alimentos, podem ocorrer perdas de sulfito
durante o processamento, armazenamento e na preparação doméstica. O cozimento
reduz a quantidade de sulfito, porém não o elimina do alimento (BRAGAGNOLO et
al., 2001).
Pina e outros (2003) estudaram a conservação de manga em pedaços, por
métodos combinados (tratamento térmico, osmótico e adição de conservantes), por
120 dias à temperatura ambiente. Realizaram dois experimentos, utilizando
respectivamente, 600 e 900 ppm (v/v) de SO2. Observaram que para ambos os
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
108
experimentos, houve uma acentuada perda de SO2 ao longo do período investigado
(ca. 60%), demonstrando a influência do tempo de armazenamento na perda de
SO2.
A análise do resíduo de sulfito em alimentos é delicada pelo fato de ocorrerem
rápidas interações entre o sulfito e os vários componentes do alimento. O sulfito
reage prontamente com açúcares redutores, aldeídos, cetonas, antocianinas (Figura
4.2), além de proteínas, levando a uma grande variedade de sulfitos orgânicos
combinados. A extensão da reação é dependente do pH, temperatura, concentração
de S(IV) e dos compostos reativos presentes no produto. Em face da rápida reação
do sulfito com os constituintes do alimento, baixas concentrações de sulfito livre no
produto devem estar presentes no momento do consumo (ARAÚJO, 1995).
Figura 4. 2: Reação de descoloração da antocianina pela ação do sulfito
O sulfito utilizado a bordo de navios para a prevenção de melanose (manchas
pretas) em crustáceos, quando usado em excesso, proporciona a decomposição do
óxido de trimetilamina (OTMA) em dimetilamina (DMA) e formaldeído,
comprometendo, desta forma, a qualidade do pescado, principalmente no que se
refere ao endurecimento da carne após o cozimento. Neste contexto é que Cintra e
outros (1999) realizaram um estudo e verificaram um acentuado aumento dos níveis
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
109
de DMA e formaldeído após o uso de metabissulfito de sódio a 2%, por 10 min, em
camarões brancos.
Na qualidade de fortes agentes redutores, as espécies de S(IV) podem ser
incorporadas aos alimentos na forma de gás (SO2) ou de sais de sulfito, bissulfito ou
metabissulfito, os quais liberam o sulfito nas condições de uso. O dióxido de enxofre
é utilizado na preservação de frutas e hortaliças desidratadas, enquanto as soluções
de sulfito são utilizadas em alimentos líquidos (ARAÚJO, 1995). A Tabela 4.1
apresenta a relação mássica entre os agentes de sulfitação e a liberação de SO2.
Ademais, os sulfitos podem ser encontrados nos alimentos, em virtude da redução
microbiológica do SO42- para SO3
2-. Podem ocorrer perdas por exposição ao ar,
oxidação para SO42- e por cozimento (ARAÚJO, 1995).
Tabela 4.1: Relação massa/massa entre os agentes de sulfitação e SO2 disponível.
Agentes de sulfitação SO2 (%)
Dióxido de enxofre (SO2) 100
Sulfito de sódio anidro (Na2SO3) 50,82
Sulfito de sódio heptahidratado (Na2SO37 H2O) 25,41
Bissulfito de sódio (NaHSO3) 61,56
Metabissulfito de sódio (Na2S2O5) 67,39
Metabissulfito de potássio (K2S2O5) 57,6
Bissulfito de potássio (KHSO3) 57,32
Adaptado de ARAÚJO, 1995.
Os vários sais, assim como o dióxido de enxofre, quando dissolvidos em
água, resultam em uma mistura de íons sulfito e bissulfito, sendo a proporção
relativa de cada forma dependente do pH do meio, da força iônica e da
concentração (Figura 4.3). Desta maneira, a escolha do sal, ou do gás, para ser
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
110
adicionado aos alimentos é uma questão de conveniência, já que todas as formas
são quimicamente equivalentes. Na faixa normal de pH dos alimentos, a forma
predominante será HSO3-. (ARAÚJO, 1995).
SO2 + H2O SO2 . H2O (solução)
SO2 . H2O H+ + HSO3- pKa = 1,81
HSO3- H+ + SO3
2- pKa = 7,18
Figura 4.3: Reações de dissociação de SO2 e sulfitos.
A adição de espécies S(IV) não é recomendada em alimentos considerados
como fontes de vitamina B1 – tiamina, pois aquelas causam a sua destruição (Figura
4.4), resultando perda da atividade biológica, com formação de tiazol e pirimidina
substituídos (BOBBIO e BOBBIO, 1992; BELITZ, 1997). Pizzoferrato e outros (1998)
citam a possibilidade de interação com a piridoxina, nicotinamida e ácido fólico,
levando a diminuição do valor nutricional do alimento tratado com S(IV).
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
111
Tiamina Pirimidina Tiazol
Figura 4.4: Inativação da Tiamina na presença de sulfito.
A legislação brasileira permite o uso de sulfitos em diversos grupos de
alimentos. A Tabela 4.2 traz os agentes de sulfitação permitidos e seus respectivos
códigos. A Tabela 4.3 apresenta os grupos de alimentos, o limite máximo, e a
legislação referente ao uso destes agentes.
Tabela 4.2 : Agentes de sulfitação permitidos pela legislação brasileira
Aditivo INS
Dióxido de enxofre 220
Sulfito de sódio 221
Bissulfito de sódio 222
Metabissulfito de sódio 223
Metabissulfito de potássio 224
Sulfito de potássio 225
Sulfito de cálcio 226
Bissulfito de cálcio 227
Bissulfito de potássio 228
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
112
Tabela 4.3: Grupos de alimentos nos quais é permitido o uso de agentes de sulfitação.
Grupos de alimentos Limite máximo (como SO2) g % (m/m)
Legislação
Bebidas não alcoólicas prontas para o consumo à base de soja
0,004 RDC 25/2005 . ANVISA
Preparações culinárias industriais prontas para consumo (congeladas ou não)
0,02 RDC 34/2001 ANVISA
Xarope de glicose
0,004 RDC 27/2000 ANVISA
Bebidas não alcoólicas gaseificadas e não gaseificadas
0,004 Resolução 389/99 ANVISA
Cereais e Produtos de ou a base de Cereais:.farinha com adição de aditivos para uso industrial:
0,002 Resolução 385/99 ANVISA
Produtos de panificação: pães, biscoitos, bolos, tortas, doces e massas de confeitaria,
0,005
Resolução 383/99 ANVISA
Molhos e condimentos (vinagre)
0,02 Resolução 382/99 ANVISA
Vinho
250* IN 2/2005 MAPA
Suco de caju
33,3* (no produto a ser consumido)
RDC 12/2002 ANVISA
Suco de caju concentrado (dil1:9) 300* (no produto concentrado)
RDC 12/2002 ANVISA
Nota: * mg L-1
A presença de sulfito em carnes in natura desrespeita a legislação (BRASIL,
1952), pois não é permitida a adição de quaisquer compostos em carnes desta
natureza. A exemplo de práticas fraudulentas, o sulfito, quando adicionado à carne
fresca, mascara o início do processo de deterioração, pois realça a coloração
vermelha da carne. O potencial redutor do sulfito mantém os íons ferro da
mioglobina no estado Fe2+, conferindo a coloração vermelha viva, característica de
carnes frescas.
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
113
A transição de Fe2+ para Fe3+ está relacionada à mudança da coloração da
mioglobina (Fig. 4.5) de vermelho para parda (metamioglobina), a qual ocorre
quando a carne está deteriorada (BELITZ e GROSCH, 1997).
Figura 4.5: Reações de oxidação da mioglobina
Quando adicionado à carne, diretamente, na forma de sal, ou pulverizado, em
solução, o sal não fica aparente aos consumidores, não sendo possível sua
visualização. Por ser um sal inodoro, também não é possível perceber sua presença
pelo olfato. Assim, somente a análise química pode ser empregada para a
caracterização da presença, ou ausência, de sulfitos na carne. Portanto, faz-se
necessário, que os órgãos fiscalizadores (Vigilância Sanitária, PROCON,
CODECON), executem inspeções nos mercados varejistas, associadas à coleta de
amostras, a fim de monitorar a presença de sulfito, como um indicador de fraude e
de práticas inadequadas de higiene.
Fe
N
N
N
NH2O
globina Fe
N
N
N
NO
globina
Fe
N
N
N
NH2O
globina
OMioglobina
(vermelho púrpura)
Oxigenação
Oximioglobina
(vermelho brilhante)Oxidação
Fe
N
N
N
NH2O
globina Fe
N
N
N
NH2O
2+globina Fe
N
N
N
NO
globina Fe
N
N
N
NO
globina
Fe
N
N
N
NH2O
globina Fe
N
N
N
NH2O
globina
OMioglobina
(vermelho púrpura)
Oxigenação
Oximioglobina
(vermelho brilhante)Oxidação
2+
3+
Redução
Mioglobina
Vermelho púrpura
Oximioglobina
Vermelho vivo
Metamioglobina
Parda
Fe
N
N
N
NH2O
globina Fe
N
N
N
NH2O
globina Fe
N
N
N
NO
globina Fe
N
N
N
NO
globina
Fe
N
N
N
NH2O
globina Fe
N
N
N
NH2O
globina
OMioglobina
(vermelho púrpura)
Oxigenação
Oximioglobina
(vermelho brilhante)Oxidação
Fe
N
N
N
NH2O
globina Fe
N
N
N
NH2O
2+globina Fe
N
N
N
NO
globina Fe
N
N
N
NO
globina
Fe
N
N
N
NH2O
globina Fe
N
N
N
NH2O
globina
OMioglobina
(vermelho púrpura)
Oxigenação
Oximioglobina
(vermelho brilhante)Oxidação
Fe
N
N
N
NH2O
globina Fe
N
N
N
NH2O
globina
OMioglobina
(vermelho púrpura)
Oxigenação
Oximioglobina
(vermelho brilhante)Oxidação
2+
3+
Redução
Mioglobina
Vermelho púrpura
Oximioglobina
Vermelho vivo
Metamioglobina
Parda
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
114
Uma das dificuldades encontradas pelos órgãos fiscalizadores é a
morosidade na resposta do diagnóstico, quanto às análises solicitadas aos
laboratórios da rede oficial, referentes às amostras coletadas, fruto da prática de
vigilância à saúde. Neste sentido, a análise discriminatória apresenta-se como uma
alternativa viável e de resposta rápida para pesquisa de analitos indicadores de
fraudes. Uma vez que não é permitida a presença destes sais em carnes, pode ser
assumido que basta a execução de um teste indicador da presença do referido
analito, para verificar se este está ou não ausente da amostra sob investigação. Vale
a pena ressaltar que, nem todos os métodos discriminatórios necessariamente têm
elevada produtividade analítica, haja vista que, a característica da maioria dos
métodos oficiais não condiz com aquelas previamente citadas para análises
discriminatórias. Outros aspectos relacionados aos métodos oficiais já foram
discutidos no primeiro capítulo desta tese.
O sulfito associado a outras espécies no alimento pode ser recuperado in vitro
pela acidificação e aquecimento da solução da amostra, enquanto que in vivo, esta
espécie é liberada no trato digestivo. Deve ser considerado que o sulfito liberado no
trato digestivo pode causar irritações gástricas, intoxicação para pessoas com
reduzida atividade de sulfito oxidase, além de ser um dos precursores de asma
brônquica (LECLERCQ et al., 2000). Bragagnolo e outros (2001), descreveram
sintomas ou reações relacionadas com a ingestão de sulfitos, a exemplo de
vermelhidão, urticária, pressão sanguínea baixa, problemas respiratórios, distúrbios
gastrintestinais, dermatite, náusea, diarréia, choque anafilático, ataque asmático
agudo e perda de consciência.
Segundo Pizzoferrato e outros (1998), desde 1959 os agentes de sulfitação
foram classificados pelo CFR (Code of Federal Regulations – EEUU) como agentes
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
115
GRAS, do inglês: generally recognised as safe – geralmente reconhecido como
seguros, quando usados em obediência às boas práticas de fabricação. No entanto
o FDA (Food and Drug Administration) registrou algumas mortes (27 até abril de
1988) atribuídas ao consumo de alimentos contendo sulfito e estabeleceu que
alimentos contendo mais de 10 mg L-1 de agentes sulfitantes tenham seus teores
declarados no rótulo. A ingestão diária aceitável de dióxido de enxofre, para o
homem é de 0,7 mg Kg-1 de massa corpórea (LECLERCQ et al., 2000).
No Brasil, é estabelecido o limite máximo de agentes sulfitantes para os
diversos grupos de alimentos, como ilustrado na Tabela 4.3. Portanto, é necessário
conhecer a distribuição nos alimentos das espécies de S(IV) associado e livre. Esta
necessidade levou ao desenvolvimento de processos analíticos capazes de
identificar e quantificar sulfito em matrizes complexas (FAZIO e WARNER, 1990).
Os métodos para a determinação de sulfitos em alimentos variam desde
análises muito simples até alguns métodos indiretos complexos. As técnicas
empregadas são baseadas, entre outras, em espectrofotometria visível,
espectrofluorimetria e quimioluminescência (BRAGAGNOLO et al., 2001; MANA e
SPOHN, 2001; YANG et al., 2002; YAMADA, et al., 1983), eletroforese capilar
(JANKOVSKIENE et al., 2001) e métodos eletroanalíticos (AZEVEDO et al., 1999;
WEEVER e KRAAK, 1997). Outrossim, estas técnicas podem associar sistemas,
como a sistemas de análise em fluxo (LINARES et al., 1989; SEGUNDO e RANGEL,
2001; MELO et al., 2003), biorreatores (FATIBELLO-FILHO e VIEIRA, 1997),
sistemas de microdestilação (MAQUIEIRA et al., 1993), a microcomputadores para
aplicação de algoritmo de redes neurais (SAFAVI et al., 2004), além de sistema de
difusão gasosa (SEGUNDO e RANGEL, 2001; AZEVEDO et al., 1999; MELO et al.,
2003; MANA e SPOHN, 2001; LINARES et al., 1989).
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
116
Em geral, as principais limitações para os métodos, visando a detecção ou
determinação do teor de sulfito, estão relacionadas às etapas de preparo da amostra
e à pureza dos reagentes, principalmente se o procedimento for baseado em método
enzimático. Estes fatores corroboram com o fato da determinação de sulfito
geralmente estar associada a uma etapa de separação (extração, difusão ou
destilação). Neste sentido, é interessante que os métodos propostos possam
simplificar esta etapa, visando incrementar o ritmo de análise, sem comprometer o
nível da confiabilidade dos resultados. Este efetivamente é um dos motivos que
tornam atraentes o emprego de sistemas de análise por injeção em fluxo (FIA) para
o desenvolvimento de procedimentos analíticos (SANTOS, 2004).
Dentre os mais variados protocolos de análise apresentados na literatura para
a determinação de sulfito em alimentos, aqueles baseados em analise por injeção
em fluxo (FIA) associado a dispositivo de permeação gasosa através de membrana
semi-permeável, encontram-se em maior proporção, pois atendem ao desejável
quesito de simplicidade no tratamento da amostra. Vale a pena ressaltar que a
grande maioria dos trabalhos é direcionada para a determinação de sulfito livre e
associado em amostras de vinhos.
A utilização do recurso da permeação gasosa em sistemas FIA pode ser
efetivada pela incorporação ao módulo de análise em fluxo de um dispositivo que
permita a permeação de gases e que duas correntes (uma da amostra e uma da
solução receptora) fluam independente e separadamente pelo seu interior. A
inserção em uma das correntes de fluxo da amostra líquida ocorre em condição tal
que permita a conversão do analito em uma espécie volátil capaz de se difundir
através da membrana. A solução receptora deverá fluir em linha independente da
primeira, sendo capaz de converter a espécie derivada do analito original em uma
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
117
forma estável no meio líquido. Este, por sua vez, poderá ser separado da matriz e,
se necessário, pré-concentrado (SANTOS, 2004).
Em muitos casos, as soluções são separadas por membrana hidrofóbica
semipermeável e a transferência do analito para o percurso analítico ocorre
geralmente em um único módulo (RUZICKA e HANSEN, 1988). Esta característica
possibilita a criação e fabricação de protótipos de sistemas e aparatos criativos que
podem ser associados a módulos FIA para a determinação de diferentes analitos.
O método da p-rosanilina é empregado para determinação de sulfitos, tendo
sido exaustivamente reportado na literatura (KASS e IVASAKA, 2001;LINARES et
al., 1989; MARCZENKO, 1976; MATAIX e LUQUE DE CASTRO, 1998; RICHTER et
al., 1993; SEGUNDO e RANGEL, 2001). A determinação de sulfito pelo método da
p-rosanilina fundamenta-se no princípio de que em meio ácido a p-rosanilina sofre a
perda da conjugação entre os anéis, tornando-se incolor. Na presença de sulfito, o
formaldeído presente no reagente origina o ácido hidroxisulfônico que reestrutura a
conjugação máxima da molécula, e é responsável pela coloração rósea original da p-
rosanilina . Este conjunto de reações pode ser observado na Figura 4.6.
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
118
NH2
NH2
NH2
Cl
Cl
NH3
NH3
NH3
Cl
Cl
Cl
HCOH SO3
2 -HOCH
2SO
3H
Cl
NH3
NH3
NH3
Cl
Cl
Cl HOCH2SO
3H
NH2
NH2
NHCH2SO
3H
Cl
+
Rosa
+ 3HCl+ +
Incolor
+
+
+
+
+
Rosa
+
Figura 4.6: Reações da p-rosanilina com o sulfito.
Pela legislação brasileira, o método oficial para monitorar sulfito em amostras
de alimentos é o método Monnier-Williams (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 1985).
Muitos dos métodos empregados são, essencialmente, oriundos de modificações do
primeiro procedimento de Monnier-Williams, desenvolvido em 1927 e revisado em
1986 para obtenção de níveis 10 mg Kg-1 de alimento (WANER et al., 1986 apud
BRAGAGNOLO, 2001). Este método se baseia na destilação em meio ácido do
S(IV), como SO2, o qual é transportado por um gás de arraste inerte, normalmente
N2, para uma solução oxidante, onde o SO2 é convertido a SO42-. O sulfato
produzido é, então, determinado por método volumétrico ou gravimétrico. Assim,
para cada 1 mol de S(IV) presente na amostra sob destilação, será produzido 1 mol
de SO2 que, por sua vez, será convertido na presença de oxidante em 1 mol de
sulfato. Apesar deste método ser adequado para a maioria das amostras de
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
119
alimentos, foram reportados resultados falso-positivos para amostras de vegetais do
gênero Allium e Brassica, bem como para proteína isolada de soja (SU e TAYLOR,
1995). Deve ser salientado que este método envolve muitas etapas e manipulação
da amostra, acarretando em baixa produtividade analítica, além do uso de aparatos
de vidros específicos para a sua execução.
Na Figura 4.7 tem-se o sistema empregado para análise de sulfito pelo
método de Monnier-Williams, o qual é descrito nos manuais nacionais de análise de
alimentos (BRASIL, 1987).
Figura 4.7: Sistema para a aplicação do método de Monnier-Williams, (adaptado de Brasil,
1987).
Neste contexto, o objetivo desta etapa do trabalho foi desenvolver um sistema
FIA para análise discriminatória de sulfito livre em carnes, utilizando uma câmara de
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
120
permeação, empregando o método da p-rosanilina (MARKZENKO,1976). Tendo em
vista que a presença de sulfito na carne é proibida, optou-se pela análise
discriminatória, objetivando a construção de um sistema que apresentasse resposta
rápida, produtividade analítica elevada e baixo custo.
4.2 – Metas
De acordo com os objetivos desta tese, as principais metas envolvidas nesta
etapa foram:
Desenvolvimento de módulo de análise em fluxo equipado com câmara de
permeação para análises discriminatórias de sulfito livre em amostras de
carnes.
Otimização do sistema de análise prévia de sulfito, considerando as faixas de
concentração do analito na matriz.
Validação do procedimento pela comparação com método de referência.
4.3 – Material e métodos
4.3.1 – Equipamentos
Para as determinações de sulfito pelo método da p-rosanilina no sistema FIA
equipado com câmara de permeação foi empregado espectrofotômetro Femto 700
plus (Brasil), equipado com cubeta de vidro com 10 mm de caminho óptico e volume
interno de 200 L e bomba peristáltica Gilson MiniPuls 3 (França) de quatro 4 vias,
para a propulsão dos líquidos. Microcomputador equipado com interface PCL 711S
(Advantech) foi empregado para a aquisição de dados a freqüência de 20 Hz; linhas
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
121
de transmissão em polietileno (diâmetro interno de 0,8 mm) e tubos peristálticos de
Tygon® foram também empregados no módulo de análise em fluxo. O diagrama do
sistema FIA é apresentado na Figura 4.8.
Figura 4.8: Diagrama de fluxo para análise de sulfito. A. amostra, C. carregador (H2O), R.
solução de reagentes (p-rosanilina e formaldeído), PP. bomba peristáltica, Y1 e Y2.
confluências, B1: bobina de mistura da amostra com HCl (1,0 m), B2. bobina de reação (2,5
m), D. detector (580 nm), CP. câmara de permeação, W. descarte.
A câmara de permeação foi construída pelo acoplamento de dois blocos de
acrílico, os quais foram usinados para a confecção de sulcos, de forma que as vias
de passagem dos líquidos fossem separadas por uma membrana de PTFE. Os dois
blocos em acrílico foram unidos por parafusos, de forma a não permitirem
vazamentos. O esquema e as dimensões da câmara de permeação estão descritos
na Figura 4.9.
DW
C
A
HCl
CPR
B2
PP
B1
W
y1
y2
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
122
Figura 4.9: Esquema simplificado da câmara de permeação. A. visão lateral, B. Visão
frontal, C. (carregador + amostra + HCl), R. coquetel de reagentes, D. detector, W. descarte.
A amostra foi inserida no percurso analítico por válvula rotatória de seis vias
(Rheodine) e seu funcionamento nas etapas de amostragem e injeção está
esquematizado na Figura 4.10.
Figura 4.10: Esquema da válvula rotatória, indicando os canais e a alça nas posições de
amostragem e injeção.
Amostra Amostra
C
D R
W
Teflon
Parafusos
2 cm
1 mm
13,5 cm
2 cm
10 cm
3 mm
A. Visão Lateral
B. Visão Frontal
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
123
4.3.2 – Reagentes e Soluções
Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico de pureza. A água
utilizada para o preparo das soluções era purificada e fresca, com condutância
sempre <18,2 S cm-1.
As soluções de referência eram diariamente preparadas, a partir de NaSO3
(Merck,). A solução de 100 mg L-1 de SO3- foi preparada, tomando 0,0157 g do sal e
diluindo com solução de EDTA (Reagen) (sal sódico) 0,1 mmol L-1 até 100 mL. A
partir desta solução foram preparadas as soluções de referência por diluição.
O coquetel de reagentes foi preparado, pela mistura de 10 mL de solução
alcoólica (2:10) de p-rosanilina (Merck) 0,1% (m/v), 16 mL de HCl (Merck)
concentrado e 250 L de formaldeído (Merck) a 37% (m/m) e completando o volume
para 500 mL, seguindo as recomendações de Segundo e Rangel (2001). A solução
do coquetel de reagente foi armazenada em frasco âmbar sob refrigeração por até 5
dias.
4.3.3 – Procedimentos
O sistema FIA para análises discriminatórias de sulfito foi baseado no método
da p-rosanilina (MARKZENKO,1976). Como apresentado na Figura 4.8, a alíquota
de amostra injetada (250 µL) no percurso analítico era transportada até a
confluência Y1, por onde era inserida solução de HCl 0,2 mol L-1. A mistura da
amostra à solução de HCl ocorria na bobina de mistura (B1) para, então, ser
transportada pela solução carregadora (H2O) em direção à câmara de permeação a
vazão de 1 mL min-1, onde o SO2 produzido pela reação permeava através da
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
124
membrana de PTFE para reagir com a p-rosanilina (B2) presente na solução de
coquetel de reagentes (p-rosanilina e formaldeído), sendo, em seguida, endereçada
ao detector (D). A informação do sinal gerado pelo detector a 580 nm era transmitido
pela interface PCL711S para um programa desenvolvido no laboratório.
Para a aplicação da análise discriminatória de sulfito em carnes empregando
o módulo de análise proposto, primeiramente 50 g de amostra de carne eram
fatiadas em pequenos cubos. O volume de 50 mL de solução de EDTA dissódico 0,1
mmol L-1 era, então, adicionado à amostra para extração do sulfito, sendo mantido
em contato, sob agitação, por 3 min. Após este período a mistura era mantida em
repouso e a solução do sobrenadante era levada para o módulo FIA de análise.
Para a comparação do desempenho do procedimento FIA proposto foi
empregado o método iodométrico, segundo Mataix e Luque de Castro (1998),
visando à validação dos resultados obtidos.
4.4 – Resultados e Discussão
4.4.1 – Otimização do sistema
As vazões do carregador e da solução de reagentes, tamanho da alça de
amostragem, a concentração de HCl e percurso analítico (dimensões de B1 e B2),
foram as variáveis do sistema FIA selecionadas para otimização. Para realização
destes testes foram preparadas soluções de referência de sulfito em EDTA dissódico
0,1 mmol L-1 nas concentrações entre 10 e 32 mg L-1.
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
125
4.4.1.1 – Efeito da vazão
Para o estudo das vazões foram avaliadas as seguintes vazões do carregador
e da solução reagente: (i) vazão do carregador igual a vazão da solução reagente –
razão entre as vazões igual a 1; (ii) vazão do carregador duas vezes maior que a da
solução do reagente – razão entre as vazões igual a 2; e, (iii) vazão da solução
reagente duas vezes maior que a do carregador – razão entre as vazões igual a 0,5.
Os sinais transientes gerados podem ser observados na Figura 4.11.
Figura 4.11: Efeito da razão (R) entre a vazão do carregador e a vazão da solução do
coquetel de reagentes sobre o sinal. Solução de SO32- 16 mg L-1 (250 L); HCl 0,5 mol.L-1.
Pela Figura 4.11 pôde ser observado que com a diminuição da vazão da
solução do reagente ocorria aumento do sinal analítico (razão entre as vazões igual
a 2). Não foram observadas variações significativas de sinais nos casos em que as
razões entre as vazões foram 0,5 e 1. Provavelmente, com a diminuição da vazão da
solução reagente, a reação de formação da p-rosanilina era favorecida pelo tempo,
levando, desta forma, a um aumento de sinal analítico.
0,5 1,0 1,5 2,0
0,024
0,028
0,032
0,036
A (
580 n
m)
R
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
126
Para os ensaios subseqüentes optou-se pelas respectivas vazões, carregador
igual a 1 mL min-1 e solução de reagentes igual a 0,5 mL min-1, visando minimizar as
perdas de SO2 após a mistura com o ácido e ao mesmo tempo favorecer a reação
com a p-rosanilina.
4.4.1.2 – Alça de amostragem
O comprimento da alça de amostragem define a alíquota da amostra a ser
injetada no percurso analítico. Usualmente, o aumento da alça de amostragem
apresenta certo grau de linearidade com o sinal gerado. A curva apresentada na
Figura 4.12 mostra a variação do sinal analítico com o aumento do comprimento da
alça de amostragem de 0,2 a 1 m (volume injetado de 100 a 500 µL).
Figura 4.12: Variação do sinal analítico em relação ao comprimento da alça de
amostragem. Solução de SO3- 32 mg L-1, HCl 0,5 mol L-1, vazão do carregador: 1mL min-1,
vazão da solução reagente: 0,5 mL min-1.
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,02
0,04
0,06
0,08
A (
580 n
m)
Alça de amostragem (m)
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
127
Para os ensaios subseqüentes optou-se por alça de amostragem de 0,5 m, o
que corresponde a 250 µL de volume injetado da solução amostra no percurso
analítico.
4.4.1.3 – Concentração do HCl
O HCl foi inserido por confluência para a conversão do S(IV) à sua forma
gasosa – SO2. O processo foi avaliado para solução de referência de sulfito com
concentração de 32 mg L-1 e para concentrações de HCl entre 0,05 e 0,5 mol L-1. A
variação do sinal analítico com a concentração de HCl é apresentada na Figura
4.13.
Figura 4.13: Efeito da concentração do HCl no sinal analítico para solução de referência de
SO32- igual a 32 mg L-1.
Pela Figura 4.13 pôde ser observado que para solução de referência de SO32-
32 mg L-1 (0,4 mmol L-1) ocorria aumento do sinal analítico com o aumento da
concentração de HCl até concentração do ácido igual a 0,2 mol L-1. Para
concentrações mais elevadas de HCl não foram observadas variações significativas
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
0,036
0,042
0,048
0,054
0,060
A (
58
0 n
m)
C, mol L-1
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
128
nos sinais analíticos gerados. Assim, foi selecionada a concentração de HCl igual a
0,2 mol L-1.
Pela relação estequiométrica, para a conversão de 1 mol de SO32- a 1 mol de
SO2 seriam necessários 2 moles de H3O+. Pelos testes de otimização univariada da
concentração de HCl visando a determinação de S(IV) pelo módulo FIA foi
encontrada proporção 250 vezes maior que a necessária para atender a relação
estequiométrica. Deve ser ressaltado que na literatura são reportadas concentrações
de HCl para produção de SO2 muito superiores a 0,2 mol L-1, para aplicação do
mesmo método da p-rosanilina (SEGUNDO e RANGEL, 2001; RICHTER et al.,
1993).
Contudo, uma vez selecionada a concentração de HCl em 0,2 mol L-1, a qual
mostrou ser adequada para a garantir a produção e permeação do SO2 a partir de
solução de referência de sulfito 32 mg L-1, ao mesmo tempo pode ter sido
estabelecida a concentração máxima de sulfito nas soluções amostra capaz de ser
convertida a SO2, visto que possivelmente para a produção de SO2 com o mesmo
rendimento a partir de soluções mais concentradas em sulfito seja necessário o
emprego de soluções mais concentradas do ácido. Desta forma, assumindo para
sulfito concentração máxima igual a 32 mg L-1 e, como descrito anteriormente que a
amostra de carne submetida a análise foi tratada com 50 mL de solução de EDTA, a
quantidade máxima de sulfito que o procedimento terá capacidade de quantificar
será de 1600 µg. Apesar desta restrição, é necessário ressaltar que o procedimento
foi desenvolvido para análises discriminatórias da presença de sulfito em amostras
de carne e, portanto, o limite máximo de concentração de sulfito na amostra não
deve ser entendido com um fator de restrição ao procedimento, visto que pela sua
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
129
característica este é necessária e forçosamente relacionado ao limite mínimo de
sulfito que o processo é capaz de discriminar para caracterização de fraude.
4.4.1.4 – Percurso analítico
Para todos os sistemas FIA a variação no comprimento do percurso analítico
influencia diretamente na dispersão da zona de amostra. Outrossim, podem ser
estabelecidas relações estreitas deste parâmetro com a freqüência analítica e a
sensibilidade. Desta forma, procurou-se otimizar o comprimento do percurso
analítico, levando-se em consideração: (i) a mistura efetiva do ácido com amostra
(B1 – Fig. 4.8) e (ii) o tempo de reação necessário para produção da p-rosanilina (B2
– Fig. 4.8).
Para avaliação do percurso analítico na parte inferior do sistema, variou-se o
comprimento da bobina de mistura da amostra com a solução de HCl 0,2 mol L-1
entre 0,3 e 1,0 m. Os resultados para esta avaliação são apresentados na Figura
4.14.
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
130
Figura 4.14: Variação do sinal analítico com o percurso analítico para a parte inferior do
sistema de análise em fluxo (B1). Vazão do coquetel de reagentes de 0,5 mL min-1. Vazão do
carregador 1,0 mL min –1. Solução SO32- 16 mg L-1.
Observou-se uma variação pouco significativa do sinal analítico com o
aumento do percurso analítico da bobina de mistura (B1). Esta informação indicava
que, apesar da maior dispersão da zona de amostra com o aumento do percurso
analítico – dispersão esta que levaria à diminuição do sinal analítico – a produção de
SO2 a partir do sulfito não ocorria imediatamente após a mistura com a solução de
HCl. Apesar da pequena variação, optou-se por um percurso analítico de 1,0 m para
B1.
Para a avaliação do efeito da variação do percurso analítico na bobina (B2),
foram testados percursos analíticos que variaram de 0,8 a 2,5 m e os resultados
podem ser observados na Figura 4.15. Pôde ser observado que, para a injeção de
uma solução de referência de 16 mg L-1 em sulfito houve aumento do sinal analítico
com o aumento do percurso analítico. Desta forma, pode ser assumido que para o
percurso analítico de 2,5 m a reação entre o SO2 permeado e a p-rosanilina não é
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,01
0,02
0,03
0,04
A (
580 n
m)
Percurso analítico (m)
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
131
imediata. Logo, este foi o percurso analítico adotado para o sistema. Este dado foi
concordante com o apresentado por Linares e outros (1989).
Figura 4.15: Variação do sinal analítico com o percurso analítico para parte superior do
sistema de analise em fluxo (B2). Vazão do coquetel de reagentes de 0,5 ml min-1. Vazão do
carregador 1,0 mL min –1. Solução SO32- 16 mg L-1.
4.4.2 – Figuras de mérito
Apesar da proposta deste trabalho ser pautada no desenvolvimento de
sistema para análise discriminatória, foram realizados ensaios quantitativos e o
sistema poderá ser empregado para a determinação da concentração de SO32.
Então, após a otimização do sistema de análise em fluxo para análise
discriminatória de sulfito, foram avaliadas as figuras de mérito para o procedimento
analítico proposto.
Para a faixa analítica de trabalho de 4 a 32 mg L-1 de SO32- foi obtida a
seguinte linearidade entre a absorbância e a concentração: A = 0,000320 +
0,00271C (R = 0,9992). O limite de detecção estimado foi de 0,455 mg L-1 e desvio
0,8 1,2 1,6 2,0 2,4
0,021
0,028
0,035
0,042
A (
540 n
m)
Percurso analítico (m)
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
132
padrão relativo de 2,8% (n=10), para a concentração de 16 mg L-1. Nestas
condições, o sistema desenvolvido alcançou freqüência analítica de ca. 12 amostras
por hora.
Apesar do limite de detecção calculado ter sido de 0,455 mg L-1, foi admitido
para confirmação da presença de sulfito pelo procedimento em fluxo de análise
discriminatória o limite mínimo de concentração da faixa analítica de trabalho, o qual
correspondeu a 4 mg L-1. A opção por este critério, não fundamentado em regras da
probabilidade e/ou estatística, foi selecionada, visto que, embora os ruídos
apresentados nas medidas tenham sido imperceptíveis, os sinais analíticos obtidos,
mesmo para a concentração de sulfito igual a 4 mg L-1, foram muito baixos (da
ordem de 0,009 unidades de absorbância).
4.4.3 – Aplicação do sistema em amostras de carnes expostas ao consumo
Confirmada a capacidade do sistema de análise em fluxo para análise
discriminatória de sulfito livre, por permeação gasosa do SO2, foram determinados
os teores de sulfito livre em amostra de carnes frescas adquiridas em mercados de
Salvador. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 4.4.
Apesar do método de Monnier – Willians, ser preconizado pelos órgãos
oficiais nacionais como referencial para as determinações de sulfito em amostras de
alimentos, optou-se por realizar a titulação iodométrica para avaliar a presença de
sulfito livre nas amostras de carne. Assim, a uma alíquota de 50 mL da água de
lavagem das amostras de carne foram adicionados 2,5 mL de solução de amido 1%
(m/v), 30 mg de EDTA e 3 mL de H2SO4 (1+9). Esta mistura foi imediatamente
titulada com solução de triiodeto 0,05 mol L-1, previamente padronizado com
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
133
tiossulfato de sódio. Para os cálculos foi assumido que o iodo consumido era
proporcional à quantidade de SO2 livre na amostra.
Aleatoriamente, uma das amostras de carne foi propositadamente fraudada
pela adição de 1 mg de SO32- em 10 g da amostra de carne, para a realização dos
testes. Somente após as análises é que se identificou qual das amostras estava
fraudada (amostra 5).
Tabela 4.4: Presença de sulfito livre em amostras de carnes frescas
Amostra de carne fresca
Sistema proposto
Método controle
1 Não detectado Não detectado
2 Não detectado Não detectado
3 Não detectado Não detectado
4 Não detectado Não detectado
5 * Presença
(19,6 0,5 mg L-1)
Presença
(19,62 0,2 mg L-1)
Nota: *amostra fraudada propositalmente
4.5 – Conclusões
Os resultados obtidos na análise discriminatória de sulfito em amostras de
carnes, baseado no método da p-rosanilina, em sistema FIA por permeação,
confirmou sua potencialidade. A robustez e versatilidade do sistema foram
observadas de forma a conseguir um sistema confiável e preciso para monitorização
de fraudes em carnes pela adição de agentes de sulfitação, a um ritmo de
amostragem razoável.
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
134
Embora o sistema tenha sido idealizado para análise discriminatória de sulfito
em carnes, o mesmo oferece versatilidade da quantificação do analito, com limite de
detecção de 0,455 mg L-1.
A versatilidade do sistema foi caracterizada, pois com o uso da câmara de
permeação, não são necessárias as longas e complicadas etapas no tratamento de
amostra. Além do mais, o mesmo sistema pode ser empregado para a determinação
de sulfito em outras matrizes.
A automação e miniaturização de métodos analíticos levam à redução dos
custos operacionais, e eleva a produtividade analítica. A análise discriminatória de
sulfito livre em amostras de carnes frescas apresentou relativa produtividade
analítica (12 determinações por hora) com redução no gasto de reagentes e na
geração de resíduos, sem perda na qualidade dos resultados.
4.6 – Referências Bibliográficas
ARAÚJO, J. M. A. Química de Alimentos Teoria e Prática. Viçosa: Imprensa
Universitária. 1995. 335p.
AZEVEDO, C. M. N.; ARAKI, K.; TOMA, H.E.; ANGNES, L. Determination of sulfur
dioxide in wines by gas – diffusion flow injection analysis utilizing modified
electrodes with electrostatically assembled films of tetraruthenated porphyrin.
Anal. Chim. Acta. v. 387, p. 175 – 180. 1999.
BELITZ, H. D.; GROSCH, W. Química de los alimentos. Zaragoza. Acribia.1997.
1087p.
BOBBIO, F. O.; BOBBIO, P. A. Introdução à química de alimentos. 2ª ed. São Paulo:
Varela.1992. 223 p.
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
135
BRAGAGNOLO, N.; SILVA, C. A.; TANIWAKI, M. H. Avaliação dos teores de dióxido
de enxofree da qualidade microbiológica de cogumelos em conserva. Rev. Inst.
Adolfo Lutz. v. 60, n. 2, p. 103 – 107. 2001.
BRASIL. Ministério da Agricultura. Portaria nº 01 de 29 de janeiro de 1987. Dispõe
sobre método analítico de bebidas e vinagre. Diário Oficial da República
Federativa do Brasil, Brasília, 04 de fevereiro de 1987.
BRASIL. Ministério da Saúde. ANVISA. Resolução nº 382, de 05 de agosto de 1999.
Aprova o "Regulamento técnico que aprova o uso de Aditivos Alimentares,
estabelecendo sua funções e seus limites máximos para a categoria de
alimentos 13- molhos e condimentos". Diário Oficial da República Federativa do
Brasil, Brasília, 09 de agosto de 1999.
BRASIL. Ministério da Saúde. ANVISA. Resolução nº 383, de 05 de agosto de 1999.
Aprova o "Regulamento técnico que aprova o uso de Aditivos Alimentares,
estabelecendo sua Funções e seus Limites Máximos para a Categoria de
Alimentos 7- Produtos de Panificação e Biscoitos". Diário Oficial da República
Federativa do Brasil, Brasília, 09 de agosto de 1999.
BRASIL. Ministério da Saúde. ANVISA. Resolução nº 385, de 05 de agosto de 1999.
Aprova o "Regulamento técnico que aprova o uso de Aditivos Alimentares,
estabelecendo suas Funções e seus Limites Máximos para a Categoria de
Alimentos 6 - Cereais e Produtos de ou a Base de Cereais". Diário Oficial da
República Federativa do Brasil, Brasília, 09 de agosto de 1999.
BRASIL. Ministério da Saúde. ANVISA. Resolução nº 389, de 05 de agosto de 1999.
Aprova o "Regulamento técnico que aprova o uso de Aditivos Alimentares,
estabelecendo suas Funções e seus Limites Máximos para a Categoria de
Alimentos 16: Bebidas - subcategoria 16.2.2 - Bebidas não Alcoólicas
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
136
Gaseificadas e não Gaseificadas". Diário Oficial da República Federativa do
Brasil, Brasília, 09 de agosto de 1999.
BRASIL. Ministério da Saúde. ANVISA. Resolução RDC nº 12, de 10 de janeiro de
2002. Aprova a extensão de uso do aditivo INS 220 dióxido de enxofre na função
de conservador para suco de caju. Diário Oficial da República Federativa do
Brasil, Brasília, 14 de janeiro de 2002.
BRASIL. Ministério da Saúde. ANVISA. Resolução RDC nº 25, de 15 de fevereiro
de. Aprova o “regulamento técnico que aprova o uso dos aditivos alimentares,
estabelecendo suas funções e limites máximos para a categoria de alimentos:
produtos protéicos - subcategoria Dispõe sobre método analítico de bebidas e
vinagre”. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, 16 de
fevereiro de 2005.
BRASIL. Ministério da Saúde. ANVISA. Resolução RDC nº 27, de 28 de março de
2000. Aprova a extensão de uso dos aditivos dióxido de enxofre e seus sais de
cálcio, sódio e potássio, na função de conservador para xarope de glicose. Diário
Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, 30 de março de 2000.
BRASIL. Ministério da Saúde. ANVISA. Resolução RDC nº 34, de 09 de março de
2001. Aprova o "Regulamento Técnico que aprova o uso de Aditivos
Alimentares, estabelecendo suas funções e seus limites máximos para a
Categoria de Alimentos 21: Preparações culinárias industriais". Diário Oficial da
República Federativa do Brasil, Brasília, 12 de março de 2001.
BRASIL. Ministério da Agricultura. Instrução Normativa nº 2, de 27 de janeiro de
2005. Aprovar o regulamento técnico para fixação dos padrões de identidade e
qualidade para coquetel de vinho ou bebida alcoólica mista de vinho. Diário
Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, 28 de fevereiro de 2005.
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
137
BRASIL. Presidência da República. Decreto nº 30691, de 29 de março de 1952.
Aprova o novo Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de
Origem Animal. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, 07 de
julho de 1952.
CINTRA, I. H. A.; OGAWA, N. B. P.; SOUZA, M. R.; et al. Decomposition of
trimethylamine oxide related to the use of sulfites in shrimp. Ciênc. Tecnol.
Aliment. v.19, n.3, p. 314 – 317. 1999.
FATIBELLO – FILHO, O.; VIEIRA, I. C. Flow injection spectrophotometric
determination of sulfite using a crude extract of sweet potato root (Ipomoea
batatas (L) Lam.) as a source of polyphenol oxidase. Anal. Chim. Acta. v. 354,
p. 51 – 57, 1997.
FAZIO, T.; WARNER, C. R. A review of sulfides in foods: analytical methodology and
reported findings. Food additives and contaminants. v. 7, n. 4, p. 433 – 454.
1990.
HOLDSWORTH, S. D. Conservación de frutas y hortalizas. Zaragoza: Acribia, 1988.
186p.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. Vol.1. São
Paulo: O Instituto, 1985.
JANCOVSKIENE, G.; DAUNORAVICIUS, Z.; PADARAUASKAS, A. Capillary
electrophoretic determination of sulfite using the zone passing technique of in –
capillary derivatization. Journal of Chromatography A. v. 934, p. 67 – 73, 2001.
KASS, M.; IVASAKA, A. Spectrophotometric determination of sulfur dioxide and
hydrogen sulphide in gas phase by sequential injection analysis technique.
Anal. Chim. Acta. v. 449, p.189 – 197. 2001.
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
138
LECLERCQ, C.; MOLINARO, M. G.; PICCINELLI, R.; et al. Dietary intake exposure
to sulphites in Italy – analytical determination of sulphites – containing foods and
their combination into standard meals for adults and children, Food additives and
contaminants. v.17, n.12, p. 979 – 989. 2000.
LINARES, L.; LUQUE DE CASTRO, M. D.; VALCÁRCEL, M. Simultaneous
determination of carbon dioxide and sulfur dioxide in wine by gas– diffusion/flow
– injection analysis. Anal. Chim. Acta. v. 225, p. 443 – 448, 1989.
MANA, H.; SPOHN, U. Sensitive and selective flow injection analysis of hydrogen
sulfite/sulfur dioxide by fluorescence detection with and without membrane
separation by gas diffusion. Anal. Chem. v. 73, n. 3187 – 3192, 2001.
MAQUIEIRA, A.; CASAMAYOR, F.; PUCHADES, R. Determination of total and free
sulphur dioxide in wine with a continuous – flow microdidtillation system. Anal.
Chim. Acta. v. 283, p. 401 – 407, 1993.
MARCZENKO, Z. Spectrophotometric determination of elements. N. York: Ellis
Horwood Limited, 1976.
MATAIX, E.; LUQUE DE CASTRO, M. D. Determination of total and free sulfur
dioxide in wine by pervaporation-flow injection, Analyst, v.123, p.1547 – 1549.
1998.
MELO, D.; ZAGATTO, E. A. G.; MATTOS, I. L.; MANIASSO, N. Spectrophotometric
flow- injection determination of sulfite in White wines involving gas diffusion
through a concentric tubular membrane. Journal of the Brazilian Chemical
Society. v. 14, n. 3, p. 375, 2003.
PINA, M. G. M.; MAIA, G. A.; FILHO, M. S. M. S.; et al. Processamento e
conservação de manga por métodos combinados. Rev. Bras. Frutic. v. 25, n. 1,
p. 63 – 66. 2003.
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
139
PIZZOFERRATO, L.; LULLO, G.; QUATTUCCI, E. Determination of free, bound and
total sulphites in foods by indirect photometry-HPLC, Food Chemistry. v.43, n.2,
p.275 – 279. 1998.
RICHTER, P.; LUQUE DE CASTRO, M. D.; VALCÁRCEL, M. Spectrophotometric
flow – through sensor for the determination of sulphur dioxide. Anal. Chim. Acta.
v. 283, p. 408 – 413. 1993.
RUZICKA, J.; HANSEN, E. H. Flow Injection Analysis, 2ª edition, New York: John
Wiley & Sons, 1988.
SAFAVI, A.; MORADLOU, O.; MAESUM, S. Simultaneous kinetic determination of
sulfite and sulfide using artificial neural networks. Talanta. v. 62, p. 51 – 56,
2004.
SANTOS, J. C. C. Avaliação e Síntese de Corantes Fenotiazínicos Para
Determinação Espectrofotométrica de Sulfeto e Sulfito Empregando Sistemas
de Análise em Fluxo. Salvador. 2004.Tese de Doutorado. Instituto de Química.
Universidade Federal da Bahia.
SEGUNDO, M. A.; RANGEL, A. O. S. S. A gas diffusion injection system for the
determination of sulfur dioxide in wines. Analytica Chimica Acta. v. 427, p. 279 –
286. 2001.
SIMÃO, A. M. Aditivos para alimentos sob o aspecto toxicológico. São Paulo: Nobel,
1985.
SU, Y. C.; TAYLOR, S. L. Sulphite analysis of food ingredients: false positive
responses with butter flavourings in the optimized Monier-Williams method,
Food additives and contaminants, v.12, n.2, p.153 – 160. 1995.
Desenvolvimento de sistema automatizado em fluxo para análise discriminatória de sulfito
140
WEEVER, D. L. G.; KRAAK, J. C. Determination of sulfite in wines by gas – diffusion
flow injection analysis utilizing spectrophotometric pH- detection. Anal. Chim.
Acta. v. 337, p. 125 – 131, 1997.
YAMADA, M.; NAKADA, T.; SUZUKI, S. The determination of sulfite in a flow
injection system with chemiluminescence detection. Anal. Chim. Acta. v. 147, p.
401 – 404, 1983.
YANG, X. F.; GUO, X. Q.; ZHAO, Y. B. Novel spectrofluorimetric method for the
determination of sulfite with rhodamine B hydrazide in a micellar médium. Anal.
Chim. Acta. v. 456, p. 121 – 128, 2002.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
141
CAPÍTULO 5
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons
metálicos.
5.1 – Introdução
A carne e os produtos cárneos contém elementos, os quais, em certas
circunstâncias e em proporções inadequadas apresentam efeitos negativos à saúde
humana. Alguns destes são constituintes naturais ou presentes no tecido vivo, por
exemplo, gorduras como o colesterol, resíduos de contaminantes ambientais e de
drogas veterinárias. Outros são adicionados ao produto durante o processamento
tecnológico (sal, nitrito, nitrato, fosfato, etc.). Há um terceiro grupo de elementos que
são produzidos durante o tratamento tecnológico, incluindo contaminantes de
detergentes e desinfetantes, compostos tóxicos produzidos durante a cocção, etc. E
finalmente, existem aqueles que são desenvolvidos durante as fases de
armazenamento e comercialização, notadamente como o desenvolvimento de
bactérias patogênicas, formação de produtos oriundos das reações de oxidação
lipídica, e migração de compostos originários de embalagens (COLMENERO et al.,
2001).
O Ministério da Agricultura divulgou, recentemente, o resultado das atividades
do Programa de Controle de Resíduos em Carnes – PCRC (BRASIL, 2004). No que
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
142
diz respeito à contaminação por metais, o PCRC monitora a concentração de
chumbo, cádmio e arsênio em aves, suínos, eqüídeos e bovinos. Os resultados
apontaram duas amostras de bovino e duas amostras de aves com concentração de
cádmio acima do limite máximo estabelecido. Apesar deste monitoramento ser feito
por amostragem, o quantitativo investigado de 319 carcaças é muito pequeno diante
da produção pecuária no Brasil (seis milhões de toneladas/ano), o que torna este
fato ainda mais preocupante, haja vista a elevada toxicidade de muitos dos
contaminantes metálicos.
Ademais a estes efeitos nocivos, pode-se mencionar a retenção de metais
pesados durante as etapas de abate e limpeza de carcaças. Esse tipo de situação
pode ocorrer em abates clandestinos e na comercialização de carnes em feiras
livres, onde águas não tratadas podem ser utilizadas para remoção de resíduos de
sangue das carcaças expostas para o consumo, tudo ocorrendo longe dos olhos da
fiscalização sanitária.
No Brasil, principalmente nas cidades do interior e nas áreas rurais, a prática
do abate clandestino é uma triste realidade. Os animais são abatidos em condições
sanitárias inadequadas. Usualmente o animal é abatido no solo, com pancadas na
cabeça, pelo uso de marretas e, a carcaça é dividida e levada para feiras-livres de
vilas circunvizinhas, para comercialização. Geralmente o abate é feito próximo a um
manancial (rio, fonte, lago, açude), onde a carcaça e os miúdos são lavados, para
retirada de sangue e de rejeitos.
Na Figura 5.1 pode ser observada a prática do abate clandestino no sertão
baiano, na qual pode-se perceber a presença de aves, rondando a área em busca
de alimento - restos do abate.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
143
Figura 5.1: Abate clandestino de bovino no sertão baiano.
O abate clandestino é uma prática condenável e representa um dos mais
graves fatores de risco, pela exposição coletiva a agentes infecciosos, como aqueles
que são transmitidos ao homem pelo contato com animais, pela ingestão de
alimentos de qualidade sanitária suspeita e pela contaminação do meio ambiente
(FREITAS et al., 2001). Além disso, acarreta em prejuízos aos produtores e em
sonegação fiscal. Práticas desta natureza ocorrem freqüentemente nos países em
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
144
desenvolvimento e estão amplamente documentadas no trabalho de Joshi e
colaboradores (2003).
Na Figura 5.2 são apresentados registros da comercialização de carne bovina
e miúdos em feiras-livres de municípios do interior da Bahia. Percebe-se que não há
o mínimo cuidado com práticas higiênicas, bem como com as condições adequadas
de armazenamento durante a comercialização. Na Figura 5.3, tem-se o registro de
uma área, num mercado municipal, onde pode ser observada a existência de pia e
bancada de mármore. Porém, também é possível notar a inexistência de balcão
frigorífico para o armazenamento da carne, a qual fica geralmente exposta durante
todo o dia, numa jornada de aproximadamente oito horas.
Figura 5.2: Comercialização de carne fresca (A) e de miúdos de bovinos (B), em feiras-
livres do interior baiano.
A
B
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
145
Figura 5.3: Comercialização da carne bovina em mercado municipal do interior baiano.
É prática comum em alguns países da América Latina, África e Ásia a reunião
de famílias para abater animais e compartilhamento de suas carcaças (JOSHI et al.,
2003).
Outrossim, o abate clandestino é um crime contra o meio ambiente, pois para
que a carne seja destinada para consumo, é necessária a obediência às normas de
aspecto sanitário e humanitário, as quais são regulamentadas, no Brasil, pelo
Ministério da Agricultura (BRASIL, 1952). Consumir carne clandestina pode significar
o risco de contrair tuberculose, brucelose, erisipela, cisticercose, teníase,
leptospirose e raiva, dentre outras doenças (PARDI, 2001).
No conjunto destas práticas impróprias à vida humana, destaca-se a
possibilidade de contaminação por metais. Ao lavar a carcaça do animal abatido com
água de mananciais, além de elevar o nível de matéria orgânica lançado neste
manancial, é possível a contaminação da carcaça por espécies orgânicas e
inorgânicas, entre estas pelos íons metálicos.
Diante da possível contaminação da carne por metais, o cádmio e o chumbo
merecem atenção especial, devido as suas reconhecidas toxicidades. Entre as
conseqüências dos efeitos tóxicos de ambas espécies para a saúde humana pode-
se citar: anemia, osteomalácia, colapso renal, infertilidade e vários tipos de câncer,
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
146
além de desordens neurológicas. (MENA et al., 1996; LIU e JAN, 2000; JONHSON,
1998; GURER; ERCAL, 2000; SOLÉ et al., 1998).
A literatura apresenta uma variedade de trabalhos que abordam a
contaminação e presença de metais pesados em alimentos. O nível de Cd e Pb em
leite de vaca foi analisado por Okada e outros (1997), com o objetivo de avaliar o
grau de contaminação do leite produzido na região do vale do Paraíba - SP, devido à
possível ingestão, pelo gado, de gramíneas e águas contaminadas, encontrando, em
43 amostras, teores de Pb acima de 0,05 mg Kg-1, o qual é o limite estabelecido pela
Legislação brasileira. Diversos alimentos (carnes, cereais, laticínios, frutas e
verduras, ovos e leguminosas) consumidos pela população brasileira foram
avaliados quanto ao teor de Cu e está documentado no trabalho de Ferreira e
colaboradores (2005), onde foram encontrados elevados níveis em feijões, frutas,
hortaliças e cereais. A contaminação por mercúrio, cádmio e chumbo em pescados
foi relatada por Endo e outros (2004), bem como por Joyeux e colaboradores (2004).
A contaminação dos alimentos por metais tem sido motivo de preocupação
por parte da comunidade científica internacional. Assim, a monitoração do nível de
Cd, Pb e Hg em bezerros em algumas áreas da República Tcheca foi realizado por
Cibulka e outros (1989), enquanto Alonso e colaboradores (2001), realizaram estudo
similar na Espanha. A concentração de Cd, Pb e Zn em músculo de ovinos e bovinos
produzidos no centro e no oeste do Kazaquistão, foi avaliada por Farmer e Farmer
(2000).
No Rio de Janeiro, a ingestão diária de metais, pela população adulta, foi
monitorada, analisando Al, Cd, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, U e Zn em grupos de alimentos
que compõem a dieta rotineira desta população (SANTOS et al., 2004).
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
147
Outros trabalhos que também visavam monitorar a contaminação por metais
foram realizados em amostras de café solúvel, onde a maioria das amostras
analisada encontrava-se dentro dos níveis aceitáveis para o consumo humano
(SANTOS e OLIVEIRA, 2001), hortaliças e vegetais cultivados próximo a mananciais
urbanos da Tanzânia, apresentaram elevados níveis de Pb, Cd, Cu e Zn
(BAHEMUKA e MUBOFU, 1999). Trabalhos semelhantes foram realizados em
cogumelos (DEMIRBAS, 2001).
Por outro lado, a característica sortiva dos metais em diferentes materiais tem
sido estudada, apresentada e debatida na literatura. Estudos a respeito da adsorção
e dessorção de Cd, Cu e Pb em amostras de solo foi discutido por Pierangeli e
outros, (2004). Na mesma linha, o emprego do resíduo da carbonização de ossos e
carne para remoção de Pb de efluentes foi elucidado por Deydier e outros (2003).
Algas, fungos e a biomassa de microorganismos, em geral, têm sido
apresentada como alternativa para sorção de metais, devido as suas elevadas
capacidades sortivas. Devido à habilidade de adsorção ou absorção de metais de
transição, a biomassa de microrganismos pode ser potencialmente utilizada como
bio-sorvente para o tratamento de resíduos. Esta característica, geralmente está
relacionada aos polipeptídeos produzidos por estes microrganismos que promovem
um verdadeiro “clean up” dos metais pesados, sem produzir poluentes secundários
(HUANG, et al., 2003). O emprego de microrganismos como bio-sorvente foi
satisfatoriamente elucidado na literatura (CHANG e HUANG, 1998; CHANG et
al.,1997; MEJARE e BULOW, 2001; KURODA et al., 2001)
Tendo em vista que a carne, na qualidade de um alimento protéico, pode se
apresentar como um poderoso bio-sorvente e, considerando a possibilidade da
contaminação desta por práticas inadequadas de higiene e limpeza durante o abate,
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
148
armazenamento e comercialização é que nesta etapa do trabalho foi avaliada a
capacidade de retenção de Cd e Pb pela carne bovina. Desta forma as amostras de
carne foram submetidas ao contato estático com soluções de Cd e Pb em diferentes
procedimentos experimentais para simulação das condições de comercialização e
de consumo de carnes em feiras livres, bem como de carnes oriundas de abate
clandestino.
5.2 – Metas
De acordo com os objetivos desta tese, as principais metas desta etapa
foram:
Avaliar a capacidade de sorção de Cd e Pb pela carne bovina;
Identificar as variáveis (estado de conservação da carne, acidez, superfície de
contato e temperatura) que influenciam na capacidade sortiva da carne;
Avaliar os teores de Cd e Pb sorvidos na carne por espectroscopia de
emissão ótica com plasma de argônio indutivamente acoplado (ICP OES);
Sugerir possíveis mecanismos de sorção de Cd e Pb nas amostras de carne.
5.3 – Materiais e Métodos
5.3.1 – Equipamentos
O espectrômetro de emissão ótica (ICP OES), ARL 3410 (USA), seqüencial,
equipado com minitocha e leitura radial foi empregado para determinação de Cd e
Pb. As linhas de emissão de 214,439 e 220,353 nm foram selecionadas para as
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
149
determinações, respectivamente, de Cd e Pb no sobrenadante. Na Tabela 5.1 são
apresentados os parâmetros operacionais utilizados na determinação de Cd e Pb.
Tabela 5.1: Parâmetros operacionais utilizados na determinação de Cd e Pb.
Parâmetros Operacionais
Potência incidente 650 W
Potência refletida < 10 W
Nebulizador Vidro tipo Meinhard
Vazão do gás refrigerante 7,5 L min –1
Vazão do gás auxiliar 0,8 L min –1
Vazão de gás arraste 0,8 L min –1
Vazão da amostra 2,5 mL min –1
Tempo de Integração 5 s
Nº de integrações 3
Purificador de água EasyPure RF (Barnstead, USA) foi utilizado para
obtenção de água desionizada de alta pureza (18,2 M cm).
As medidas de pH foram realizadas empregando o milivoltímetro DM 21
(Digimed, Brasil). Autoclave Fabbe (Brasil) foi empregada para a esterilização das
amostras de carne.
Válvula multiportas de oito vias (VICI USA), controlada por computador, foi
empregada em algumas etapas do experimento, para automatização do sistema,
pela aspiração e bombeamento das soluções em módulo SIA. Bomba peristáltica de
quatro vias Minipuls 3 (Gilson França) foi empregada para propulsão das soluções.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
150
5.3.2 – Reagentes, soluções e amostras
Todas as soluções foram preparadas com reagentes de grau analítico de
pureza (Merck, Alemanha, ou similar) e água desionizada de alta pureza.
Todas as vidrarias eram previamente descontaminadas com HNO3 10% (v/v)
por 24 horas e, posteriormente, enxaguadas com água desionizada.
Soluções de referência de Cd e Pb, utilizadas para a construção das curvas
de trabalho e para a simulação dos testes de sorção, foram preparadas na faixa de
concentração entre 1,0 e 10,0 mg L-1, a partir de solução estoque 1000 mg L-1 em
Cd e Pb, a qual, por sua vez, foi preparada pela dissolução de Pb(NO3)2 e cádmio
metálico em ácido nítrico 0,16 e 16 mol L-1, respectivamente. As soluções mistas
com concentração 10 mg L-1, empregadas nos experimentos de sorção de metais,
foram obtidas, diluindo a solução estoque com água da rede de abastecimento
(água da torneira). O pH dessas soluções de referência foi ajustado para 6,0, com a
adição de gotas de solução de NaOH ou HNO3 0,1 mol L-1.
As amostras de carne bovina (fresca e moída) foram adquiridas no comércio
de Salvador, enquanto que, as carnes deterioradas foram obtidas pela estocagem
da carne fresca, à temperatura ambiente (25 a 30C) por 12 h. Amostras de carne
também foram esterilizadas em autoclaves, a 121°C por 30 min.
Todo o planejamento experimental foi realizado com o objetivo de simular as
condições praticadas em feiras livres e no comércio clandestino de carnes.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
151
5.3.3 – Procedimentos
Os experimentos realizados para avaliação do poder sortivo da carne por
metais foram baseados no contato estático das amostras de carne com a solução de
cádmio e chumbo em função do tempo.
O procedimento foi dividido em duas etapas: (i) empregando automação com
um sistema de injeção seqüencial e (ii) desenvolvendo experimentos em batelada.
Então, foi observada a influência do estado de conservação da carne no
poder sortivo. Neste caso, as amostras se constituíram em carne fresca e
deteriorada. A superfície de contato também foi avaliada e os testes foram
realizados com amostras fatiadas e moídas de carne. A autoclavação consistiu num
procedimento para observar, não só a influência da carga microbiana sobre a sorção
dos metais como a influência da desnaturação protéica na capacidade sortiva. Por
fim, a influência da acidez no poder sortivo da carne também foi avaliada, utilizando-
se soluções de ácido acético. A massa de carne utilizada, em todos os
experimentos, foi padronizada em 1g. Todos os experimentos foram feitos em
triplicata. Cada um destes procedimentos está descrito a seguir.
5.3.3.1. Automação do experimento de retenção de metais pela carne
empregando válvula multiportas de oito vias
Para realização deste experimento, o mesmo protocolo foi aplicado à carne
fresca e deteriorada. As massas de 1,0 g de seis amostras de carne foram medidas
diretamente em béqueres de 10 mL, os quais foram conectados a seis canais
(números 3 – 8) da válvula multicanal, como apresentado na Figura 5.4. Numa
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
152
segunda etapa, 2,5 mL da solução mista 10 g mL-1 de Cd e Pb foram aspirados
pelo canal 2, em direção à bobina de amostragem, seguida da transferência, das
alíquotas das solução mista para cada um dos seis béqueres. As amostras de carne
foram mantidas em contato com a solução dos íons metálicos por diferentes
intervalos de tempos (1, 2, 4 e 8) horas. Para o intervalo de tempo de 8 h, dois
procedimentos foram executados: (i) substituição das alíquotas da solução mista a
cada hora até completarem as 8 h produzindo um total de 8 soluções sobrenadantes
e (ii) a tomada do sobrenadante após 8 h.
Após os intervalos de tempo de contato estabelecidos, alíquotas dos
sobrenadantes foram aspiradas pelo canal 1 da válvula SIA. Em seguida, as
alíquotas foram submetidas à digestão ácida para eliminação de resíduos orgânicos.
O sobrenadante foi digerido a 70 °C com 2 mL de HNO3 16 mol L-1 e 1 mL de
H2O2 30% (v/v) e evaporado próximo à secura. Este processo foi repetido por três
vezes e a solução final foi diluída com água desionizada para balão volumétrico de 5
mL, para posterior determinação dos metais por ICP – OES. Na Tabela 5.2 estão
descritos os passos envolvidos no sistema SIA, empregando a válvula multicanal.
A massa de metal adsorvida pela carne foi calculada, pela diferença entre a
massa do metal contida na solução mista sobrenadante, adicionada à carne, e a
massa do metal remanescente na solução de equilíbrio.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
153
Figura 5.4: Esquema do módulo SIA empregado para os testes de contaminação das
amostras de carne. FA1 a FA3 (solução de Cd e Pb em contato com a amostra submetida à
renovação da alíquota a cada 1 h durante 8 h); FA4 a FA6 (solução do metal em contato com
1 g da amostra de carne durante 8 h); BP (bomba peristáltica); C (Carregador – água
desionizada); B1 (bobina) e FC (frasco coletor), F (filtro).
Tabela 5.2: Passos envolvidos no experimento de retenção de Cd e Pb no sistema SIA
proposto.
Passo Canal da
válvula
Vazão / mL
min-1 *
Tempo / s
Tomada da alíquota 2 -4.0 37,5
Enviando para frasco 4 6 +4,2 37,5
Parada de fluxo 6 0 90
a...
b... ... ...
Tomada de alíquota da solução
sobrenadante do frasco 1 após 1 hora de
contato
3 -4,2 37,5
Envio para o frasco de coleta 1 +4,3 37,5
c...
Reposição da solução de Cd/Pb ao frasco 1 2 -4 37,5
Envio para o frasco 1 3 + 4,2 37,5
d...
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
154
Vazões positivas indicam bombeamento e negativas indicam aspiração. a o procedimento foi
repetido enviando uma alíquota para os canais 7, 8, 3, 4, e 5. b início da contagem do tempo
de contato entre a solução mista e a amostra de carne no respectivo frasco. c o
procedimento foi repetido para os canais 4 e 5. d estes passos foram repetidos para os
frascos 2 e 3 a cada hora.
5.3.3.2 – Retenção em batelada dos metais pela carne
Os experimentos realizados em batelada incluíram a etapa de esterilização da
amostra, bem como o uso de amostras de carne moída. Para as amostras de carne
moída os teste de contaminação não foram realizados com a válvula SIA, devido aos
pequenos fragmentos da carne que interrompiam o fluxo pelas linhas de transmissão
do módulo de injeção seqüencial.
Para estes ensaios as amostras foram mantidas em contato com solução
mista de Cd e Pb e com soluções individuais 10 mg L-1 de Cd e 10 mg L-1 em Pb por
2 e 4 h. Ao final de cada período, o sobrenadante era submetido à digestão ácida,
filtrado e diluído para 5 mL em balão volumétrico com água desionizada. Este
procedimento foi realizado tanto para amostras de carne fresca como de carne
deteriorada, considerando as variáveis: carne fatiada ou moída; submetidas, ou não,
a esterilização.
Num outro experimento, a massa de carne (fatiada e moída, fresca e
deteriorada, autoclavada ou não) permanecia em contato por 8 h com 2,5 mL de
solução 10 mg L-1 de Cd ou Pb.
Em um novo ensaio, as amostras de carne previamente contaminadas por 8 h
em solução 10 mg L-1 de Cd, foram separadas, enxaguadas com água desionizada e
inseridas em 2,5 mL de solução 10 mg L-1 em Pb por 1 h. Também, amostras de
carne primeiramente imersas em solução 10 mg L-1 de Pb, foram separadas e
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
155
lavadas com 50 mL de água desionizada para posterior exposição por 1 h em
solução 10 mg L-1 em Cd. Estes ensaios foram realizados para avaliar possíveis
efeitos de deslocamento das espécies metálicas no processo de sorção e dessorção
de íons metálicos de amostras de carne.
Os efeitos da acidez do meio nos processos de sorção e dessorção de Cd e
Pb também foram avaliados. Para esta série de ensaios foram utilizadas amostras
de carne fresca e fatiada.
Nos ensaios para avaliação da dessorção dos íons metálicos em meio de
ácido acético, as amostras de carne foram primeiramente imersas, por 4 h, em 2,5
mL da solução mista 10 mg L-1 de Cd e Pb. Após este intervalo, a amostra de carne
contaminada era lavada com 50 mL de água desionizada. Em seguida, a amostra
era imersa em solução de ácido acético com concentração até 4% (v/v) e aquecida a
60oC. Para avaliação do efeito da acidez no processo de sorção de metais, as
amostras de carne foram imersas por 5 min em solução de ácido acético, em
concentração até 4% (v/v); seguida da lavagem da amostra com água desionizada e
posterior contato com 2,5 mL de solução mista de Cd e Pb. Antes da determinação
dos teores de Cd e Pb na solução do sobrenadante, estas foram submetidas à
digestão, como descrito anteriormente.
5.4 – Resultados e Discussão
5.4.1 – Retenção de metais em sistema automatizado
Os perfis de retenção de Cd e Pb em amostras de carne fresca e deteriorada
obtidos pela mudança da alíquota de solução mista a cada hora, durante 8 horas,
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
156
são apresentados nas Figuras 5.5A e 5.5B, respectivamente. Uma vez que, mesmo
substituindo a cada hora a solução sobrenadante por uma nova alíquota da solução
mista 10 mg L-1 de Cd e Pb, a mesma fatia de carne estava sendo exposta à
contaminação, pôde ser observado um aumento contínuo da sorção de Pb,
principalmente para as amostras de carne fresca (Fig. 5.5A), após sucessivas
adições das alíquotas de 2,5 mL de solução mista, correspondendo a 25 g de Cd e
de Pb.
Para o Cd, pôde ser observado comportamento inverso na retenção nas
amostras de carne (Fig. 5.5A e 5.5B), ou seja, diminuição da quantidade de Cd
retido na mesma amostra de carne com as sucessivas substituições do
sobrenadante pelas alíquotas da solução mista de Cd e Pb. Este perfil de retenção
sugeriu que os processos ou sítios relacionados com as retenções de Cd2+ e Pb2+
não eram os mesmos. Uma das hipóteses levantadas foi da retenção do Pb2+ na
superfície da carne e a retenção preferencial do Cd2+ ocorrer no interior das
amostras. Desta forma, a explicação para o fenômeno seria a obstrução dos poros
da carne causada pela retenção dos íons Pb na superfície da mesma, o que
perturbaria a migração dos íons Cd para a porção interna do músculo bovino.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
157
Figura 5.5: Perfil da variação da retenção de cádmio e chumbo em carne fresca (A) e carne
deteriorada (B) com mudança da solução mista 10 mg L-1 em Cd e Pb a cada hora. (n=3)
Pôde ser observada, para as amostras de carne deteriorada (Figura 5.5B), a
partir da terceira troca da solução do sobrenadante por uma nova alíquota da
solução dos contaminantes, uma tendência para saturação dos sítios responsáveis
pela retenção do Cd. Já para o Pb, não foram observadas variações significativas na
quantidade retida de metal nas amostras para as trocas seguintes do sobrenadante.
Neste caso a carne deteriorada apresentou elevada afinidade pelo Pb.
Uma hipótese que pode ser lançada para a explicação dos fenômenos
observados está relacionada com o fato da adsorção de Pb na carne ser
dependente do oxigênio, enxofre ou nitrogênio derivados da clivagem de grupos
carboxila, hidroxila, amina e sufidrilas por processo oxidativo e clivagem da proteína
durante o processo de putrefação da carne; enquanto que os grupos amina podem
ser considerados os sítios responsáveis pela sorção do cádmio. Esta última
consideração está fundamentada no comportamento de ambos os metais em
diferentes matrizes, tais como, solos, sedimentos e resinas (GANJALI et al., 2003),
0 2 4 6 8
9
12
15
18
21
24
0 2 4 6 8
9
12
15
18
21
24
BA
Carne fresca
Cd
Pb
C, (g
g-1)
t (h)
Carne deteriorada
Pb
Cd
C,
g g
-1
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
158
bem como na grandeza das constantes dos equilíbrios relacionadas à formação de
complexos e de precipitados destes íons (HARRIS, 2003).
Os resultados obtidos sem a substituição da solução mista de Cd e Pb, a
cada hora, para as amostras de carnes frescas e deterioradas, podem ser
observados nas Figuras 5.6A e 5.6B, respectivamente.
Para ambos os íons na carne deteriorada (Figura 5.6A e 5.6B) a condição de
saturação foi obtida após a primeira hora de contato, enquanto que para a carne
fresca a saturação somente pôde ser observada após as primeiras 4 h de contato
(Figura 5.6A). O efeito de saturação mostrado nas Figuras 5.6A e 5.6B não podem
ser comparados com aqueles ilustrados nas Figuras 5.5A e 5.5B, onde a solução
mista de Cd e Pb eram substituídas a cada hora. Neste experimento, a mesma
alíquota da solução mista foi mantida em contato com a amostra da carne durante os
intervalos de tempo pré-estabelecidos, ou seja, 1, 2, 4, e 8 h.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
159
Figura 5.6: Perfil da variação da retenção de cádmio e chumbo em carne fresca (A) e carne
deteriorada (B) sem substituição da solução mista 10 mg L-1 em Cd e Pb a cada hora. (n=3).
A quantidade de íons Pb retidos na carne deteriorada (Figura 5.6B) foi maior
do que aquela observada para a carne fresca (Figura 5.6A). Este comportamento
poderia ser explicado pelo elevado número de grupos sulfidrila (–SH) encontrados
na estrutura de carnes deterioradas de bovinos. Contudo, os resultados até agora
apresentados não são suficientes para um completo entendimento sobre os sítios
responsáveis pela sorção do cádmio e do chumbo, bem como quanto ao efeito
relacionado com a presença da população microbiana na amostra. Todavia, há que
se considerar o elevado número de microrganismos produtores de gás sulfídrico na
carne deteriorada, o que seria mais uma fonte produtora de gás sulfídrico, como já
elucidado no capítulo 2 desta tese.
0 2 4 6 8
10
15
20
25
0 2 4 6 8
10
15
20
25Carne fresca
BA
Cd
Pb
C, (
g g-1
)
t (h)
Carne deteriorada
Pb
Cd
C,
g g
-1
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
160
5.4.2. – Retenção de metais pela carne pelo método em batelada
5.4.2.1 – Experimentos com a carne fatiada fresca e deteriorada, submetidas à
esterilização ou não
Para elucidar se a carga microbiana elevaria o potencial de retenção de
chumbo, uma porção da amostra de carne fresca e deteriorada foi previamente
esterilizada e submetida ao teste de sorção, enquanto que outra porção permaneceu
sem esterilizar. Os resultados obtidos destas novas amostras, em triplicata,
expressos em %Pb e %Cd sorvido nas amostras de carne, com e sem esterilização
podem ser observado na Tabela 5.3.
Tabela 5.3: Efeito da esterilização na % de retenção de Cd e Pb em carnes frescas e
deterioradas (n=3).
Tempo
de
contato
(h)
Cd (%) Pb (%)
Carne fresca Carne deteriorada Carne fresca Carne deteriorada
S NS S NS S NS S NS
2 75 1 81 2 84.0 0.4 72 8 55 4 53 4 71.2 0.4 72 8
4 86 2 53 4 95 1 69 4 76 3 72 4 84 1 72 6
S = Esterilizada. SN = Não esterilizada.
Desde que a população microbiana presente na amostra de carne foi
destruída com a esterilização, a sorção ocorreu na ausência dos grupos sulfidrilas de
origem bacteriana. Observou-se que, para ambos os metais, houve uma sorção
crescente no intervalo de tempo considerado (2 e 4 h), independente da variável
analisada.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
161
Comparando-se a sorção do cádmio no tempo de 4 h, observou-se que a
proporção do metal sorvido na carne submetida à esterilização foi maior (86% e
95%) do que na carne não esterilizada (53% e 69%) para as carnes frescas e
deterioradas, respectivamente.
Para o chumbo, houve um aumento da sorção apenas para a carne
previamente deteriorada e esterilizada (84%), quando comparada com a carne
fresca (76%). Para as amostras não esterilizadas, não houve variação na proporção
do Pb sorvido.
Após o tratamento térmico, o qual é responsável pela paralisação da geração
dos grupos tióis de origem bacteriana, a sorção do Pb se deu em menor proporção
que a do Cd (76 e 86% - carne fresca; 84 e 95%- carne deteriorada,
respectivamente). Outra característica interessante da sorção do Pb compreende
sua independência com o aumento da área superficial da carne após esterilização,
reforçando, desta forma, a predominância de sítios externos no mecanismo de
adsorção de Pb. Por outro lado, o aumento efetivo da retenção de Cd na carne
esterilizada (principalmente pelo contato de 4 h), confirmou, como anteriormente
comentado, a adsorção preferencial deste metal por grupos internos (provavelmente,
grupos amina da proteína) mais expostos após o tratamento térmico.
Sabe-se que a desnaturação de proteínas da carne aumenta a sua
digestibilidade, devido à exposição da estrutura primária, às enzimas digestivas
(SGARBIERI, 1996). O aquecimento é apontado como um dos principais fatores de
desnaturação das proteínas da carne. De maneira análoga, a exposição da estrutura
primária também pode ser considerado um fator facilitador na interação com os íons
metálicos.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
162
A Figura 5.7 mostra um esquema simplificado do mecanismo de ação da
desnaturação protéica. Neste fenômeno, há um desdobramento e rearranjo das
estruturas quaternárias, terciárias e secundárias sem o rompimento das ligações
peptídicas (SACKHEIM e LEHMAN, 2001). Percebe-se que a estrutura da proteína
se desdobra, deixando a estrutura primária vulnerável a interações químicas e
enzimáticas diversas, como sugerido por Belitz e Grosch (1997).
Figura 5.7: Esquema simplificado da desnaturação protéica (Adaptado de Belitz e Grosch,
1997).
A Figura 5.8 ilustra a representação esquemática do possível mecanismo de
ligação do Pb e do Cd aos radicais sulfidrila, hidroxila e amino da proteína,
considerando a desnaturação protéica como fator facilitador destas ligações.
Desnaturação
protéica
= H2O
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
163
Figura 5.8: Representação esquemática do provável mecanismo de ligação do chumbo e do
cádmio com os grupos sulfidrila e amino da proteína
5.4.2.2 – Experimentos com a carne moída fresca e deteriorada, submetida a
esterilização ou não
A exposição das amostras de carne moída à solução de Cd e Pb por 2 e 4
h demonstrou a tendência à saturação para períodos próximos a 2 h, como
ilustrado na tabela 5.4. O aumento da superfície de contato pode ter abreviado o
período de saturação para as amostras de carnes frescas, pois para as amostras
de carnes deterioradas intervalos de 2 h eram suficientes para alcançar a
saturação, como discutido anteriormente (Figura 5.6A).
A Tabela 5.4 mostra o efeito da esterilização na sorção do Cd e Pb em
amostras de carne moída. A pequena quantidade retida de Pb foi inesperada, 47 e
42% para as carnes frescas e deterioradas, respectivamente. Uma possível razão
S
S
S
S
S S
SH
SH SH
Desnaturação
(autoclavação)
Pb2+Pb2+
Pb 2+
NH2
NH2
NH2
NH2
OH
OH
OH
NH2NH2NH2
NH2
NH2
OH OH
OH
Cd2+
Cd2+
Cd2+
Cd2+
HOOC
H2N
HOOC
Pb2+
Pb2+
Pb2+
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
164
para este fato é a elevada quantidade de água existente nas amostras de carne
moída, resultando, em massas de carnes menores que as obtidas para as carnes
em pedaços. Outra possibilidade para explicar este fato, é a elevada exposição da
gordura, a qual prejudica o processo de retenção dos íons Pb2+ na superfície da
amostra.
Tabela 5.4: Efeito da esterilização na retenção de cádmio e chumbo (%) em carnes
moídas frescas e deterioradas (n=3)
Tempo
de
contato
(h)
Cd (%) Pb (%)
Carne fresca Carne deteriorada Carne fresca Carne deteriorada
S* NS** S NS S NS S NS
2 76 5 78 3 74 5 80 2 48 5 41 1 52 3 38 6
4 74 1 84 1 73 7 85 0.3 47 5 48 5 42 5 54 2
S = Esterilizada. SN = Não esterilizada.
Quanto ao Cd, a esterilização não influenciou significativamente na
sorção, 74 e 73% para as carnes frescas e deterioradas, respectivamente.
Diferentes comportamentos da sorção do Cd foram observados quando
comparadas as Tabelas 5.3 e 5.4. Com as amostras de carne moída, a
esterilização foi menos efetiva na sorção de Cd. Há que se considerar, outra vez,
que a umidade da carne moída seja uma possível responsável por esta
discrepância.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
165
5.4.2.3 – Avaliação do deslocamento dos metais retidos
Com o objetivo de caracterizar possíveis efeitos de deslocamento, bem como
indicar sítios específicos para o Cd e o Pb, fez-se a imersão das amostras de carne
por 8 h em 2,5 mL de solução 10 mg L-1 de Cd, equivalente a massa de 25 g Cd. A
amostra de carne foi separada, enxaguada com água desionizada e imersa por 1 h.
em 2,5 mL de solução de Pb 10 mg L-1 Repetiu-se o experimento invertendo a
ordem das soluções. A Tabelas 5.5 mostra a massa de Cd (g) deslocado pelo Pb e
vice-versa, em amostras de carnes frescas e deterioradas.
Tabela 5.5: Perfil do deslocamento dos íons metálicos Cd2+ e Pb2+ para amostras de carne
frescas e deterioradas (n=3)
Carne
(variável)
Carne fresca Carne deteriorada
Cd deslocado
pelo Pb (g)
Pb deslocado
pelo Cd (g)
Cd deslocado
pelo Pb (g)
Pb deslocado
pelo Cd (g)
Fatiadas 0,19 0,054 0,77 0,0 0,41 0,16 1,0 0,008
Moída 1,34 0,35 1,1 0,13 1,29 0,58 0,85 0,33
Moída e
autoclavada
3,26 0,77
1,6 0,12
3,05 0,98
1,51 0,39
Os resultados obtidos indicaram que, nas amostras fatiadas, a massa de Pb
deslocada pelo Cd foi bastante acentuada, cerca de 4 e 2,5 vezes maior para as
carnes frescas e deterioradas, respectivamente, quando comparada com a massa
de Cd deslocada pelo Pb, sugerindo que sítios diferentes (ou específicos) podem
estar relacionados com a retenção de Cd e Pb, de acordo o mecanismo sugerido na
Figura 5.8.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
166
Por sua vez, para as amostras de carne moída, não foram observadas
variações significativas na massa de Cd deslocado pelo Pb, ou vice-versa, apesar de
poder ser constatado um leve aumento na massa de Cd deslocado pelo Pb.
Entretanto, para as amostras de carnes moídas e autoclavadas, a quantidade de Cd
deslocada pelo Pb foi aproximadamente o dobro, quando comparada com a massa
de Pb deslocada pelo Cd. Este mecanismo, provavelmente foi favorecido pela
desnaturação protéica ocorrida durante a esterilização da carne, expondo os sítios
ativos preferencialmente para o Pb, de acordo o modelo apresentado na Figura 5.8.
Resultados semelhantes foram apresentados por Huang e colaboradores (2003), em
testes realizados com misturas binárias de Pb, Cd e Cu, para avaliação da
competitividade por sítios existentes em biossorventes (peptídeos). Neste estudo de
Huang e outros, os resultados indicaram que na presença de Pb e Cu a adsorção do
Cd era fortemente inibida.
Todavia, observou-se que a proporção do deslocamento do Cd pelo Pb
ocorrida na carne moída, quando comparada com as amostras de carne fatiada, foi
muito mais acentuada, cerca de 700 e 300% para as amostras frescas e
deterioradas, respectivamente. Em analogia, quanto à proporção de deslocamento
do Cd pelo Pb ocorrido nas amostras de carne moída autoclavadas, quando
comparadas com as amostras fatiadas, houve um aumento da ordem de 1700%
para a carne fresca e de 700% para a carne deteriorada.
Em relação ao Pb deslocado pelo Cd, a proporção não foi tão acentuada.
Cerca de 140% e 85%, para as carnes moídas frescas e deterioradas,
respectivamente, quando comparadas com as amostras fatiadas. Já para as carnes
moídas e autoclavadas, a proporção de deslocamento foi de 200 e 150%, para as
amostras frescas e deterioradas, respectivamente. Por estes resultados, pode-se
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
167
inferir que o aumento da superfície de contato da carne moída não garantiu um
aumento proporcional do deslocamento dos íons. Porém, para as amostras de carne
moídas autoclavadas (fresca e deteriorada), o aumento no deslocamento, de ambos
os íons foi bastante significativo. Neste caso, a desnaturação protéica ocorrida pelo
aquecimento, expôs ainda mais os sítios, favorecendo as trocas entre Cd2+ e Pb2+.
Outrossim, estes dados reiteram que a retenção do Pb se dá preferencialmente na
superfície das amostras de carne.
5.4.2.4 – Avaliação da acidez na sorção dos metais
Para avaliação da dessorção, dos íons metálicos em meio de ácido acético,
as amostras de carne em fatias foram primeiramente imersas, por 4 h, em 2,5 mL da
solução mista de Cd e Pb 10 mg L-1. Após este intervalo, a amostra de carne
contaminada era lavada com 50 mL de água desionizada. Em seguida, a amostra
era imersa em solução de ácido acético com concentração até 4% (v/v) e aquecida a
60oC. Para avaliação do efeito da acidez no processo de sorção de metais, as
amostras de carne foram imersas por 5 min em solução de ácido acético, em
concentração até 4% (v/v); seguida da lavagem da amostra com 50 mL de água
desionizada e posterior contato com 2,5 mL de solução mista de Cd e Pb. Antes da
determinação dos teores de Cd e Pb na solução do sobrenadante, estas foram
submetidas à digestão, como descrito anteriormente.
Os resultados dos testes referentes ao efeito da acidez na retenção e
dessorção dos metais estão ilustrados na Figura 5.9A e 5.9B. Foi observado que,
apesar do aumento da acidez, não houve mudança expressiva no perfil adsortivo
dos metais na carne, para Cd2+ a partir da concentração de 0,5 % (v/v) em ácido
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
168
acético. Já, para a adsorção do Pb2+, o ácido acético não apresentou influência para
quaisquer valores de concentração, de acordo a figura 5.9B.
Figura 5.9: Influência da acidez na dessorção (A) e retenção (B) de Cd2+ e Pb2+ em
amostras de carne bovina.
Quanto à avaliação da acidez na dessorção dos metais, observou-se que,
com o aumento da concentração de ácido acético, os metais foram deslocados da
carne para a solução sobrenadante. Este efeito foi mais evidente para Cd2+. Estes
resultados estão ilustrados na Figura 5.9A. Pela análise dos resultados pode-se
caracterizar a ocorrência de mecanismo de troca do Cd2+ pelo próton. Efeito de
deslocamento desta magnitude não foi observado para Pb2+. Estes resultados são
preocupantes, frente à possibilidade de contaminação alimentar favorecida pelas
práticas culinárias, usuais no preparo de carnes, previamente contaminadas com Cd.
0 1 2 3 4
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4
0
5
10
15
20
25
Pb
Cd
mass
a (g
)
BA
Dessorção Retenção
Pb
Cd
% Ácido acético (V/V)
C,
g g
-1
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
169
5.5 – Conclusões
Pela avaliação dos resultados pode-se demonstrar o risco potencial associado
com contaminação da carne pela sorção de metais, pela elevada massa de Cd e Pb
retida na carne fresca e deteriorada. Mais de 20 g de cada metal foram retidos em
1 g de carne após poucos minutos de contato com soluções de referência.
O aquecimento da carne e a conseqüente desnaturação da proteína
favoreceram a interação entre os metais e os sítios ativos da proteína, notadamente
para o Pb.
A carne deteriorada apresentou maior afinidade para retenção do Pb, ao
passo que a elevação da acidez favoreceu a dessorção do Cd.
O possível mecanismo de interação entre a carne e os metais se baseia na
existência de diferentes sítios (internos e externos) responsáveis pela sorção do Cd
e do Pb.
É preciso que os órgãos fiscalizadores sejam rígidos na cobrança das normas
higiênicas e das boas práticas, desde o abate até o consumo da carne, a fim de
coibir o abate clandestino e conseqüentemente diminuir o risco potencial da
população em consumir carnes contaminadas.
5.6 – Referências Bibliográficas
ALONSO, M. L.; BENEDITO, J. L.; MIRANDA M.; et al. Arsenic, cadmium, lead,
copper, and zinc in cattle from Galicia, NW Spain. Science of the total
Enviromental. v. 246, n. 2 – 3, p. 237 – 248. 2000.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
170
BAHEMUKA, T. E.; MUBOFU, E. B. Heavy metals in edible green vegetables grown
along the sites of the Sinza and Msimbazi rivers in Dar es Salaam, Tanzania.
Food chemistry. v. 66, n. 1, p. 63 – 66.1999.
BELITZ, H. D.; GROSCH, W. Química de los alimentos. 2ª ed. Zaragoza: Acribia.
1997. 1087p.
BRASIL. Ministério da Agricultura. Portaria 21, de 5 de abril de 2004. Divulgar o
sumário das atividades do Programa de Controle de Resíduos em Carne e o
Programa Piloto de Pescado executados em 2003, em conformidade com os
ANEXOS da presente Portaria. Diário Oficial da República Federativa do Brasil,
Brasília, 07 de abril de 2004.
BRASIL. Presidência da república. Decreto nº 30691, de 29 de março de 1952.
Aprova o novo Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de
Origem Animal. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, 07 de
julho de 1952.
CHANG, J. S.; HUANG, J. C. Selective adsorption/recovery of Pb, Cu and Cd with
multiple fixed beds containing immobilized bacterial biomass. Biotechnol. Prog. v.
14, p. 735 – 741. 1998.
CHANG, J.S.; LO, R.; CHANG, C. C. Biossorption of lead, copper and cadmium by
biomass of Pseudomonas aeruginosa PU21. Water Res. v. 31, p.1651 – 1658.
1997.
CIBULKA, J.; MIHOLOVÁ, D.; PISA, J.; et al. Natural levels of lead, cadmium and
mercury in tisues and hair of newborn calves from different areas of
Czechoslovakia. Science of the total Enviromental. v. 84, p. 101 – 112. 1989.
DEMIRBAS, A. Concentrations of 21 metals in 18 species of mushrooms growing in
the east black sea region. Food Chemistry. v. 75, n. 4, p. 453 – 457. 2004.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
171
DEYDIER, E.; GUILET, R.; SHARROCK, P. Beneficial use of meat and bone meal
combustion residue: “an efficient low cost material to remove lead from aqueous
effluent”. Journal of Hazardous Materials. v. B101, p. 55 – 64. 2003.
ENDO, T.; HARAGUCHI, K.; CIPRIANO, F.; et al. Contamination by mercury and
cadmium in the cetacean products from Japanese market. Chemosphere. v. 54,
p. 1653 – 1662. 2004.
FARMER, A. A.; FARMER, A. M. Concentrations of cadmium, lead, and zinc in
livestock feed and organs around a metal production centre in eastern
Kazakhstan. The Science of the Total Enviroment. v. 257. p, 53 – 60. 2000.
FERREIRA, K. S.; GOMES, J. C.; CHAVES, J. B. P. Copper content of commonly
consumed food in Brazil. Food Chemistry. v. 92, p. 29 – 32. 2005.
FREITAS, J. A.; GALINDO, G. A. R.; SANTOS, E. J. C.; et al. Risco de brucelose
zoonótica associado a suínos de abate clandestino. Revista de Saúde Pública. v.
35, n. 1, p. 101 – 102. 2001.
GANJALI, M. R.; BASIRIPOUR, F.; SHAMSIPUR, M.; et al. Ultratrace determination
of lead, cadmium and copper in environmental and biological samples by atomic
absorption spectrometry after their separation and preconcentration using
octadecyl silica membrane disks modified with a new n-s schiff base. International
Journal of the Environmental Analytical Chemistry. v. 83, n. 12, p. 997 – 1008.
2000.
GURER, H.; ERCAL, N. Can antioxidants be beneficial in the treatment of lead
poisoning? Free Radical Biology e Medicine. v. 29, n. 10, p. 927 – 945. 2000.
HARRIS, D. C. Análise Química Quantitativa. 5ª ed. Rio de Janeiro: LTC.1999. 862p.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
172
HUANG, C. C.; SU, C. C.; HSIEH, J. L.; et al. Polypeptides for heavy – metal
biosorption: capacity and specificity of two heterogeneous MerP proteins. Enzyme
and Microbial Technology. v. 33, p. 379 – 385. 2003.
COLMENERO, J. F.; CARBALLO, J.; COFRADES, S. Healthier meat and meat
products: their role as functional foods. Meat Science. v. 59, p. 5 – 13. 2001.
JONHSON, F. M. The genetic effects of environment lead. Mutation
research/Reviews in Mutation Research. v. 410, n. 2, p. 123 – 140. 1998
JOSHI, D. D.; MAHARJAN, M.; JOHANSEN, M. V.; et al. Improving meta inspection
and control in resource – poor communities: The Nepal example. Acta Tropica. v.
87, p. 119 – 127. 2003.
JOYEUX, J. C.; FILHO, E. A. C.; JESUS, H. C. Trace metal contamination in
estuarine fishes from Vitória bay, ES, Brazil. Brazilian Archives of Biology and
Technology. v. 47, n. 5, p. 765 – 774. 2004.
KURODA, K.; SHIBASAKI, S.; UEDA, M.; TANAKA . A. Cell surface – engineered
yeast displaying a histidine oligopeptide (hexa – His) has enhanced adsorption of
and tolerance to heavy metal ions. Appl. Microbiol Biotechnol. v. 57, p. 697 – 701.
2001.
LIU, F.; JAN, K. Y. DNA damage in arsenite and cadmium treated bovine aortic
endothelial cells. Free radical Biology and Medicine. v. 28, n. 1, p. 55 – 63. 2000.
MEJARE, M.; BULOW, L. Metal-binding proteins and peptides in bioremediation and
phytoremediation of heavy metals. Trends Biotechnol. v. 19, p. 67 – 73. 2001.
MENA, C.; CABRERA, C.; LORENZO, M. L. Cadmium levels in wine, beer and other
alcoholic beverages: possible sources of contamination. Science of the Total
Enviroment. v. 181, n. 3, p.201 – 208. 1996.
Avaliação da capacidade sortiva de carne bovina por íons metálicos
173
OKADA, I. A.; SAKUMA, A. M.; MAIO, F. D.; et al. Avaliação dos níveis de chumbo e
cádmio em leite em decorrência de contaminação ambiental na região do vale do
Paraíba, Sudeste do Brasil. Rev. Saúde Publica. v.31, n. 2, p. 140 – 143. 1997.
PARDI, M. C.; SANTOS, I. F.; SOUZA, E. R.; PARDI, H. S. Ciência, Higiene e
Tecnologia da Carne. 2ª ed. Goiás: UFG. 2001. V.1, 623p.
PIERANGELI, M. A. P.; GUILHERME, L. R. G.; CURI, N.; et al. Adsorção e
dessorção de cádmio, cobre e chumbo por amostras de latossolos pré-tratadas
com fósforo. Revista Brasileira de Ciência do Solo. v. 28, p. 377 – 384. 2004.
SACKHEIM, G. I.; LEHMAN, D. D. Química e Bioquímica para Ciências Biomédicas.
8ª ed. São Paulo: Manole. 2001.644p.
SANTOS, E. J.; OLIVEIRA, E. Determination of mineral nutrients and toxic elements
in brazilian soluble coffee by ICP – AES. Journal of Food Composition and
Analysis. v. 14, p 523 – 531. 2001.
SANTOS, E. E.; LAURIA, D. C.; PORTO DA SILVEIRA, C. L. Assessment of daily
intake of trace elements due to consumption of foodstuffs by adult inhabitants of
Rio de Janeiro city. Science of the total Environmental. v. 327, n. 1 – 3, p. 69 –
79. 2004
SGARBIERI, V. C. Proteínas em Alimentos Protéicos. Propriedades – Degradações
– Modificações. São Paulo: Varela, 1996. 517p.
SOLÉ, E.; BALLABRIGA, A.; DOMINGUEZ, C. Lead exposure in the general
population of the metropolitan area of Barcelona: blood levels and related factors.
Science of the Total Environmental. v. 224, n. 1 – 3, p. 19 – 27. 1998.