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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE
PLANTAS
ANTAGONISMO ENTRE Magnaporthe oryzae E O FUNGO
MICORRÍZICO Rhizoctonia sp.
JACQUELINE CAMPOS BORBA DE CARVALHO
GOIÂNIA, GO - Brasil
2013
2
JACQUELINE CAMPOS BORBA DE CARVALHO
ANTAGONISMO ENTRE Magnaporthe oryzae E O FUNGO
MICORRÍZICO Rhizoctonia sp.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Genética e Melhoramento de Plantas, da
Universidade Federal de Goiás, como exigência para
obtenção do título de Mestre em Genética e
Melhoramento de Plantas.
Orientador(a):
Prof. Dra. Leila Garcês de Araújo
Coorientador(a):
Prof. Dra. Lucília Kato
GOIÂNIA, GO - Brasil
2013
3
JACQUELINE CAMPOS BORBA DE CARVALHO
ANTAGONISMO ENTRE Magnaporthe oryzae E O FUNGO
MICORRÍZICO Rhizoctonia sp.
Dissertação DEFENDIDA e APROVADA em ____ de _________ de _______,
pela Banca Examinadora constituída pelos membros:
_________________________________
Prof. Dra. Valácia Lemes da Silva Lobo
Membro – Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (EMBRAPA)
___________________________________
Prof. Dra. Marta Cristina da Corsi di Filippi
Membro – Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (EMBRAPA)
___________________________________
Prof. Dra. Lucília Kato
Membro – UFG
___________________________________
Prof. Dra. Leila Garcês de Araújo
Orientadora – UFG
GOIÂNIA, GO
Brasil
4
“A arte deve ser o belo criando o bom. O trabalho artístico
que trai a natureza nega a si próprio. A arte
enobrecida estende o poder do amor.”
(André Luiz)
A minha mãe Emilzabete, pelo amor e dedicação
inigualável.
Ao meu pai Fábio, por sua generosidade e
compreensão.
DEDICO
A minha avó Maria que sempre esteve ao meu lado,
torcendo e rezando durante os momentos difíceis. Ao
meu irmão Thiago pela ajuda e carinho.
OFEREÇO
5
AGRADECIMENTOS
À Deus pela proteção, carinho, amor e bondade. Pelos momentos de alegria e
conquistas que não seriam possíveis sem essa força espiritual e divina. Pelos ensinamentos,
desafios e também pelos momentos ruins, pois estes nos fazem crescer, aprender e viver
harmoniosamente.
Ao Programa de Genética e Melhoramento de Plantas pela oportunidade,
respaldo e zelo durante esse tempo. Agradeço a UFG e à CAPES pelo apoio financeiro e
concomitante ao apoio intelectual.
Agradeço com imensa alegria a Professora Leila que me recebeu de bom grado
e me confiou esse trabalho maravilhoso a qual tive a honra de desenvolver. Obrigada pelos
ensinamentos, carinho e dedicação. À professora Lucília Kato pelas valiosas dicas,
ensinamentos e pelos momentos de alegria passados em seu laboratório.
À Kellen Sousa pelas palavras de amizade, ajuda, carinho e pelos bons
momentos no Laboratório de Genética de Microrganismos. Sua alegria era minha
distração, suas palavras meu conforto nos momentos angustiantes e sua sabedoria minha
inspiração. À Aline Luzini por dividir comigo os bons e maus momentos durante o
mestrado, pelas conversas e pela ajuda em alguns experimentos. À Stella pelos momentos
de alegria, pelos sorrisos e brincadeiras. Pelas palavras sábias nos momentos importantes.
À Amanda pela valiosa ajuda em muitos experimentos, principalmente nos
desenvolvidos no final do mestrado. Obrigada pelo carinho, atenção e pelos momentos de
alegria durante a fase mais complicada do mestrado.
Sou grata a todas as pessoas que passaram pelo Laboratório de Genética de
Microrganismos, principalmente a Denise Candine, Idyla e Jéssica Estábile. Obrigada a
Isabella, Kamilla, Alini, Fernanda, Maria Lúcia, Dani Siqueira, Luana, Eurípedes, Ácassio,
Aldeíde, Ernane, Daniella, Luciano, Paulo, Talita, Elias e Lívia. Agradeço ao Carlos pela
cooperação nos trabalhos realizados em casa de vegetação. Ao Rodrigo pelo esforço na
montagem de placas de cromatografia. A vocês sou imensamente grata pelos momentos de
distração, piadas, brincadeiras e por tornar o laboratório um local mais alegre.
Ao Laboratório de Produtos Naturais, nas pessoas de Celice Novaes, Daniely,
Geralda e Gean. Obrigada pela ajuda no desenvolvimento da parte química do trabalho. Ao
Laboratório de Enzimologia pelo espaço físico e disponibilidade de utilização dos
aparelhos, na pessoa do Professor Cirano. Aos alunos desse laboratório, Amanda, Andrei,
Cristine e tantos outros. À professora Moemi por liberar a utilização de aparelhos em seu
laboratório.
À professora Cristina Filippi pela imensurável contribuição nos experimentos
de atividade biológica. Ao Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Arroz e Feijão pela
acolhida. Ao Márcio Côrtes sou grata pelos seus ensinamentos e cooperação nos
6
experimentos. As mais novas amizades conquistadas, Bárbara Estevam, Bruna Alícia,
Rafaela, Maythsulene e Lorena.
Aos meus pais pela oportunidade de vida, pelo carinho, compreensão e pelos
valiosos ensinamentos de amor e união. Ao meu irmão pela ajuda, pelas alegrias
compartilhadas, pelos medos e anseios. Ao meu avô José Muniz pelas palavras sábias. A
minha avó Maria pela lição de vida.
A todas as pessoas que tanto amo, obrigada!
7
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ 9
LISTA DE TABELAS ............................................................................................ 11
RESUMO ................................................................................................................ 12
ABSTRACT ............................................................................................................ 13
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................... 14
2 REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................ 16
2.1 BRUSONE .............................................................................................. 16
2.2 MANEJO INTEGRADO DA BRUSONE DO ARROZ ......................... 17
2.2.1 Controle biológico da brusone do arroz .............................................. 18
2.2.1.1 Antibiose ................................................................................................. 20
2.3 FUNGOS MICORRÍZICOS DE ORQUÍDEAS ..................................... 22
2.3.1 Rhizoctonia micorrízica versus Rhizoctonia patogênica ..................... 24
2.4 METABOLISMO SECUNDÁRIO DE FUNGOS .................................. 25
3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................. 32
3.1 ANTIBIOSE ............................................................................................ 32
3.2 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS ATIVOS DA CULTURA MICORRÍZICA
Rhizoctonia sp. ........................................................................................
34
3.2.1 Cultivo do isolado micorrízico de Rhizoctonia sp. em meio líquido .. 34
3.2.2 Obtenção dos extratos brutos ............................................................... 35
3.2.3 Análise dos metabólitos secundários .................................................... 36
3.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS EXTRATOS BRUTOS ...................... 37
3.3.1 Inibição micelial de M. oryzae in vitro por metabólitos secundários
extraídos do isolado micorrízico de Rhizoctonia sp. ...........................
37
3.3.2 Efeito dos extratos do isolado micorrízico de Rhizoctonia sp. na
germinação de conídios e formação de apressório de M. oryzae ..................................................................................................................
39
8
3.3.2.1 Preparo da suspensão de conídios de M. oryzae ..................................... 39
3.3.2.2 Tratamentos e avaliação .......................................................................... 40
3.4 SUPRESSÃO DE BRUSONE FOLIAR POR METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS EXTRAÍDOS DO ISOLADO MICORRÍZICO
Rhizoctonia sp. ........................................................................................
41
3.4.1 Plantio ..................................................................................................... 41
3.4.2 Obtenção da suspensão de conídios de M. oryzae ............................... 42
3.4.3 Inoculação .............................................................................................. 42
3.4.4 Avaliação ................................................................................................ 42
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................... 43
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................... 45
4.1 ANTIBIOSE ............................................................................................ 45
4.2 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS ATIVOS DO ISOLADO MICORRÍZICO
Rhizoctonia sp. ........................................................................................
50
4.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS EXTRATOS BRUTOS ...................... 54
4.3.1 Inibição do crescimento micelial de M. oryzae por metabólitos
secundários extraídos do isolado micorrízico de Rhizoctonia sp. ......
54
4.3.2 Efeito dos extratos do isolado micorrízico Rhizoctonia sp. na
germinação de conídios e formação de apressório de M. oryzae ..................................................................................................................
56
4.4 SUPRESSÃO DE BRUSONE FOLIAR POR METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS EXTRAÍDOS DO ISOLADO MICORRÍZICO DE
Rhizoctonia sp. ........................................................................................
61
5 CONCLUSÕES ..................................................................................... 65
6 REFERÊNCIAS .................................................................................... 66
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Ciclo de Magnaporthe oryzae na folha de arroz ................................. 17
Figura 2 Procedimentos para preparação dos extratos e isolamento dos
compostos bioativos a partir de fungos ............................................... 27
Figura 3 Efeitos ambientais ocasionados por associações micorrízicas ............ 28
Figura 4 Cultivo do isolado micorrízico Rhizoctonia sp. em meio líquido e o
seu processo de filtração. (...) (Fotos: J. C. B. CARVALHO, 2011)
............................................................................................................. 34
Figura 5 Processo de obtenção dos extratos – EB (extrato bruto), EL (extrato
liofilizado), EM (extrato micelial). (...) F: Frasco contendo o EB
(Fotos: J. C. B. CARVALHO, 2011) ................................................... 35
Figura 6 Ensaio de inibição do crescimento micelial de Magnaporthe oryzae
in vitro por metabólitos secundários extraídos do isolado micorrízico
de Rhizoconia sp. (...) (Fotos: J. C. B. CARVALHO, 2011)
.............................................................................................................. 39
Figura 7 A: Colônias de Magnaporthe oryzae (...) C: Contagem dos conídios
em hemacitômetro tipo Newbauer no microscópio óptico (Aumento
40 X; Foto s: J. C. B. CARVALHO, 2011)
............................................................................................................. 40
Figura 8 Ensaio de supressão de brusone foliar por metabólitos secundários
extraídos do isolado micorrízico de Rhizoctonia sp. (...) D:
Inoculação (Fotos: J. C. B. CARVALHO, 2011) ............................... 42
Figura 9 Avaliação da antibiose dos prováveis antagonistas fúngicos, após
dez dias de crescimento em BDA. (...) Médias seguidas pelas
mesmas letras não diferem entre si, pelo teste Tukey, a 5% de
significância ........................................................................................ 46
Figura 10 Correlação entre o diâmetro vertical e o horizontal do antagonismo
in vitro de 10 isolados fúngicos sobre Magnaporthe oryzae .............. 47
Figura 11 Antagonismo in vitro de isolados fúngicos sobre Magnaporthe
oryzae após 10 dias de crescimento. (...) F: Controle positivo
(Barras: 1cm) ......................................................................................
48
Figura 12 Cromatoplacas dos extratos, sistema elunte: CH2Cl2/MeOH 10%; 1 -
Reativo de Dragendorf - A - Extrato liofilizado; B - Fração
hexânica; C - Extrato bruto; D - Extrato do micélio; 2 H2SO4/MeOH
- A - Extrato liofilizado; B - Extrato do micélio; C - Fração
hexânica; D - Extrato bruto; 3 - A - Fração hexânica; B - Extrato
bruto; C - Extrato do micélio; D - Extrato liofilizado. Seta: 51
10
coloração laranja sugerindo a presença de compostos nitrogenados ..
Figura 13 Espectro de RMN 1H (330 MHz, MeOD- d4) do extrato bruto de
Rhizoctonia sp. .................................................................................... 52
Figura 14 Espectro de massas do extrato bruto do isolado de Rhizoctonia sp. ... 53
Figura 15 Inibição do crescimento micelial de Magnaporthe oryzae pelos
metabólitos do isolado Rhizoctonia sp., após 10 dias de crescimento
em BDA. (...) Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem
entre si, pelo teste Tukey, a 5% de significância
.............................................................................................................. 54
Figura 16 Efeito dos metabólitos de Rhizoctonia sp. na germinação de
conídios. A – 24 horas após a indução em superfície artificial para o
primeiro ensaio; (...) Médias seguidas das mesmas letras não
diferem estatisticamente entre si, pelo teste Tukey, a 5% de
probabilidade........................................................................................ 57
Figura 17 Ensaio de germinação de conídios e formação de apressório em
Magnaporthe oryzae pelos extratos: bruto, liofilizado e micelial. (...)
Aumento 40X ...................................................................................... 58
Figura 18 Efeito dos metabólitos de Rhizoctonia sp. na formação do apressório
de Magnaporthe oryzae. A - após 24 horas da indução em superfície
artificial para o primeiro ensaio; (...)Médias seguidas das mesmas
letras não diferem estatisticamente entre si, pelo teste Tukey, a 5%
de probabilidade .................................................................................. 59
Figura 19 Severidade de brusone foliar aos sete dias após a inoculação.
Tratamento 1 (testemunha); (...) Médias seguidas das mesmas letras
não diferem estatisticamente entre si, pelo teste Tukey, a 5% de
probabilidade........................................................................................ 61
Figura 20 Efeito dos extratos do isolado Rhizoctonia sp. na severidade da
brusone foliar, em condições de casa de vegetação. A: Água; (...) F:
Tratamento 5 (700 µg/mL e M.o3x105 - EB). .....................................
62
Figura 21 Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença (AACPD) dos
tratamentos avaliados a partir do primeiro dia de aparecimento de
sintomas. 1 (M.o 3X105); 2 (1040 µg/mL e M.o3x10
5 - EB); 3 (900
µg/mL e M.o3x105
- EL); 4 (1860 µg/mL e M.o3x105
- EM); 5 (700
µg/mL e M.o3x105 - EB) ..................................................................... 63
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Identificação, classificação e origem dos isolados utilizados no ensaio de
pareamento com Magnaporthe oryzae ....................................................... 33
Tabela 2 Tratamentos e concentrações dos três extratos - EB (extrato bruto),
EL (extrato liofilizado), EM (extrato micelial) do isolado micorrízico
de Rhizoctonia sp. seguido dos respectivos tratamentos para o ensaio
de atividade biológica in vitro para Magnaporthe oryzae
................................................................................................................ 38
Tabela 3 Concentrações para cada microplaca dos três extratos - EB (extrato
bruto), EL (extrato liofilizado), EM (extrato micelial) do isolado
micorrízico de Rhizoctonia sp. seguido dos respectivos tratamentos
para os ensaios de germinação de conídios e formação de apressório
em Magnaporthe oryzae ....................................................................... 41
Tabela 4 Tratamentos contendo as quatro concentrações dos extratos de
metabólitos secundários extraídos do isolado micorrízico Rhizoctonia
sp. mais a testemunha, (...) supressão de brusone foliar
................................................................................................................ 43
Tabela 5 Efeito da inoculação dos três extratos - EB (extrato bruto), EL
(extrato liofilizado), EM (extrato micelial) do isolado micorrízico de
Rhizoctonia sp. na severidade de brusone nas folhas (SBF%) e da
Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença (AACPD) durante a
supressão e o antagonismo in vivo, quatro, seis e oito dias após a
inoculação de Magnaporthe oryzae ....................................................... 63
12
RESUMO
CARVALHO, J. C. B. Antagonismo entre Magnaporthe oryzae e o fungo micorrízico
Rhizoctonia sp. 2013. 77 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de
Plantas) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2013. 1
A brusone ocorre em todas as áreas produtoras de arroz do mundo, e é causada pelo fungo
Magnaporthe oryzae B. Couch [anamorfo - Pyricularia oryzae Cav.]. Seu controle,
realizado pelo manejo que integra resistência genética, práticas culturais e controle
químico, requer a inserção de agentes biológicos, além de assegurar uma agricultura mais
sustentável. Os microrganismos associados às plantas são capazes de produzir metabólitos
secundários como os alcaloides que podem atuar no controle biológico. O presente
trabalho objetivou isolar os metabólitos secundários do fungo micorrízico Rhizoctonia sp.
obtido de Epidendrum nocturnum, e avaliar o antagonismo in vitro e in vivo com M.
oryzae. Todos os ensaios foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado.
Um ensaio de antagonismo foi avaliado, pareando-se, 10 isolados fúngicos e M. oryzae, e
identificou-se que o isolado En07 foi o que apresentou o maior halo de inibição e
consequentemente o melhor antagonismo in vitro sobre M. oryzae. Foram obtidos três
extratos do isolado micorrízico (bruto, micelial e liofilizado) que foram analisados por
quatro métodos diferentes e complementares. A análise por Cromatografia em Camada
Delgada dos três extratos mostrou-se positiva frente ao reativo de Dragendorf, sugerindo a
presença de compostos fenólicos. Na análise dos espectros de Ressonância Magnética
Nuclear e de massas verificou-se a presença de hidrogênios aromáticos e de compostos
fenólicos. Cinco concentrações de cada extrato foram preparadas e utilizadas nos ensaios
de inibição micelial de M. oryzae in vitro e observou-se 77,86% de redução do patógeno
pelo extrato bruto (700 µg/mL). Dois tratamentos do extrato bruto (520 µg/ml e 120
µg/ml) reduziram o crescimento radial do patógeno de forma significativa quando
comparado com a testemunha. Verificou-se que o extrato bruto apresentou os melhores
resultados para a inibição micelial do patógeno, seguido dos extratos liofilizado e do
micélio. Em dois ensaios o extrato bruto a 0,52 µg.µL-1
também reduziu o número de
apressórios formados de M. oryzae em 100%. Foram conduzidos dois ensaios de supressão
de brusone foliar em arroz, in vivo, com a cultivar Primavera em três repetições. Nos dois
ensaios destacou-se o extrato micelial (1860 µg/ml e M.o 3x105) que proporcionou maiores
reduções da severidade de brusone nas folhas em relação ao controle com 59,27% e
64,63%, respectivamente. No segundo ensaio o tratamento 2 (1040 µg/mL e M.o3x105) do
extrato bruto reduziu a AACPD em 24,93% em relação à testemunha. Os resultados
mostraram que o metabólito de Rhizoctonia sp. possui grande potencial para o controle
biológico da brusone.
Palavras-chave: Arroz; Biocontrole; Produto bioativo; Pyricularia oryzae.
_______
1Orientador: Prof. Dra. Leila Garcês de Araújo, EA-UFG.
Co-orientador: Prof. Dra. Lucília Kato, IQ-UFG.
13
ABSTRACT
CARVALHO, J. C. B. Antagonism between Magnaporthe oryzae and the micorrhizal
fungus Rhizoctonia sp. 2013. 77 f. Dissertation (Master’s in Genetics and Plant Breeding)
– Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2013. 1
Rice blast caused by the fungus Magnaporthe oryzae B. Couch [anamorfo - Pyricularia
oryzae Cav.] occurs in all rice growing regions of the world. The sustainable agriculture
requires the introduction of biological control as one of the components in the integrated
disease management. The microorganisms associated to plants are capable of producing
secondary metabolites such as alkaloids which may have a role in biological control. The
objective of the present study consists, isolation and identification of secondary
metabolites of the micorrhizal fungus Rhizoctonia sp. obtained from Epidendrum
nocturnum and evaluate in vitro and in vivo antagonism to M. oryzae. Ten fungal isolates
were used to test the antibiosis against M. oryzae. The isolate En07 of Rhizoctonia sp.
exhibited a greater halo of inhibition and consequently was considered the best in vitro
antagonist to M. oryzae. Crude, mycelial and lyophilized extracts of micorrhizal isolate
were obtained. The analysis by CCD of these three extracts showed positive results in
relation to Dragendorff, indicating the presence of phenolics. The analysis of RMN 1H and
masses showed the presence of aromatic hydrogens and phenolics. Five concentrations of
each extract were prepared and utilized in the studies on in vitro mycelial inhibition of M.
oryzae and observed 77.86% of pathogen reduction by crude extract (700 µg/mL). Two
crude extract treatments (520 µg/ml and 120 µg/ml) significantly reduced the radial growth
of the pathogen compared to control. The crude extract showed best results for mycelia
inhibition of the pathogen, followed by lyophilized and mycelial extracts. In two trials, the
crude extract at 0.52 µg.µL-1
also reduced the formation of appressoria of M. oryzae by
100%. Two greenhouse experiments were conducted on leaf blast suppression with the
cultivar Primavera, using completely randomized design with three replications. In both
these trials, the mycelial extract (1860 µg/ml and M.o 3x105) showed marked reduction of
leaf blast severity in relation to control by 59.27% and 77.58% respectively. In the second
trial, the second treatment (1040 µg/mL and M.o3x105) of crude extract reduced AUDPC
by 64.63% compared to control. The results showed that the metabolites of Rhizoctonia sp.
posses great potential for biological control of rice blast.
Palavras-chave: Rice; biocontrol; biological active products; Pyricularia oryzae.
_______
1Orientador: Prof. Dra. Leila Garcês de Araújo, EA-UFG.
Co-orientador: Prof. Dra. Lucília Kato, IQ-UFG.
14
1 INTRODUÇÃO
O arroz (Oryza sativa) é um dos cereais mais produzidos e consumidos no
mundo, destacando-se como alimento principal para mais da metade da população mundial
(Fao, 2011). Ainda é uma excelente fonte de energia, devido à alta concentração de amido,
além de fornecer proteínas, vitaminas e minerais, e possuir baixo teor de lipídios (Kennedy
et al., 2003; Naves, 2007).
A brusone, cujo agente causal é o fungo Magnaporthe oryzae B. Couch
[anamorfo - Pyricularia oryzae Cav.] é uma das doenças mais disseminadas em todas as
regiões do mundo em que o arroz é cultivado (Ebbole, 2007; Malavolta et al., 2008; Prabhu
et al., 2009; Wilson & Talbot, 2009; Fernandez & Wilson, 2012; Fisher et al., 2012). Em
condições propícias, o patógeno pode ocasionar epidemias (Ramos, 2009) e a perda da
produtividade pode chegar a aproximadamente 100% da cultura (Prabhu et al., 2009).
Para um controle eficiente da brusone se faz necessário a utilização de um
manejo integrado (Dias Neto, 2008) e inserido neste está o biocontrole, uma medida de
controle que visa assegurar uma agricultura mais sustentável (Lahlali & Hijri, 2010).
Novos caminhos para o controle da doença podem surgir dos processos moleculares e
celulares da interação planta-patógeno (Fernandez & Wilson, 2012), e esse controle requer
a interação da resistência genética das cultivares com o manejo da cultura e o uso de
produtos químicos, quando necessário (Filippi et al., 2006). As diferentes associações entre
microrganismos e hospedeiro no controle biológico, influenciam na estruturação ecológica
dos ecossistemas (Rodrigues, 2010).
Os microrganismos começaram a ser investigados como fontes de produtos
bioativos a partir de 1930 com a descoberta da penicilina (Strobel et al., 2004), e estes
proporcionam um avanço científico para a obtenção de novas estruturas e atividades
biológicas (Brizuela et al., 1998). Os fungos são fundamentais à saúde e à prosperidade de
muitos ecossistemas terrestres, assim são essenciais para a sustentabilidade e
15
biodiversidade dos ecossistemas (Gunatilaka, 2006) e são fontes potenciais de moléculas
bioativas com estrutura diferenciada e com inovações no mecanismo de ação. Os fungos de
controle biológico não atuam apenas no controle de doenças de plantas, mas também são
capazes de promover resistência a estresses abióticos melhorando a capacidade
fotossintética (Shoresh et al., 2010).
De acordo com Cafêu (2007) os fungos possuem vantagens em relação a outros
microrganismos, como a produção em larga escala de produtos bioativos a partir da
variação do meio e otimização das condições de cultura. Além disso, essa prospecção não
causa prejuízos ao ecossistema como no caso das plantas e nem problemas éticos como os
ocasionados por extrações oriundas de animais (Takahashi & Lucas, 2008).
Os fungos micorrízicos podem aumentar a produção das culturas, bem como
reduzir o uso de fertilizantes e proporcionar a recuperação de solos degradados,
contribuindo para uma agricultura mais sustentável. Além disso, estes fungos durante a
interação com plantas produzem metabólitos secundários que poderão ser usados no
controle biológico de doenças de plantas, incluindo a brusone do arroz, atuando como
antagonistas (Siqueira & Moreira, 1996; Li et al., 2000; Pinto et al., 2002; Siqueira et al.,
2002). Sabe-se que o gênero Rhizoctonia sp. é um grande produtor de metabólitos
secundários, principalmente alcaloides (Schneider et al., 1982; Harris et al., 1987) e que
estes produtos bioativos são capazes de atuar no controle biológico de doenças de plantas
(Júnior, 2003).
O metabolismo primário é o resultado de várias reações químicas catalisadas
por enzimas, enquanto o metabolismo secundário é originado a partir de intermediários do
metabolismo primário (Roussos & Perraud-Gaime, 1996). Os genes envolvidos nas vias
biossintéticas do metabolismo secundário apresentam-se agrupados em um único
cromossomo, diferente do metabolismo primário (Keller et al., 2005). Durante as
interações ecológicas pode ocorrer a produção de metabólitos secundários em resposta as
condições bióticas e/ou abióticas e, dessa forma, são de grande importância para o
funcionamento e manutenção do ecossistema terrestre (Rodrigues, 2010).
Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi isolar os metabólitos
secundários do fungo micorrízico Rhizoctonia sp. obtido de Epidendrum nocturnum, e
avaliar a eficiência como antagonista in vitro e in vivo à M. oyzae.
16
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 BRUSONE
A brusone ocorre em todas as áreas produtoras de arroz do mundo, e é causada
pelo fungo Magnaporthe oryzae B. Couch [anamorfo - Pyricularia oryzae Cav.] (Ebbole,
2007; Prabhu et al., 2009; Wilson & Talbot, 2009; Fernandez & Wilson, 2012; Fisher et al.,
2012). Foi relatada no Brasil pela primeira vez em 1912, no Estado de São Paulo (Prabhu
& Filippi, 2006). A doença provoca perdas significativas na produtividade das cultivares
suscetíveis, quando as condições ambientais são favoráveis como períodos longos de
orvalho, dias nublados e associados a chuvas leves, as quais mantêm a umidade sobre as
folhas. Os prejuízos são variáveis, sendo maiores em arroz de terras altas e as perdas
podem chegar até em 100% em cultivares suscetíveis (Prabhu et al., 1999; Malavolta et al.,
2008; Prabhu et al., 2009). Os sintomas nas folhas iniciam-se com a formação de pequenas
lesões necróticas, de coloração marrom e centro cinza ou esbranquiçado. Em condições
favoráveis, as lesões coalescem causando morte das folhas e, muitas vezes, da planta
inteira (Prabhu et al., 1989; Prabhu & Filippi, 2006).
O ciclo da doença tem início com a produção dos conídios quando a umidade
do ar é superior a 93% e, geralmente, são liberados e disseminados durante a noite (Prabhu
& Filippi, 2006). A disseminação dos conídios ocorre pela ação do vento e, logo após,
ocorre a pré-penetração (Ribeiro, 1988). Segundo Prabhu & Filippi (2006), depois de
fixados no hospedeiro, os conídios germinam e formam o tubo germinativo. Este, por sua
vez, diferencia-se em uma célula de infecção especializada, denominada apressório.
Posteriormente, a penetração ocorre na epiderme da folha do hospedeiro através do
rompimento da cutícula da planta e formação da hifa de infecção (Figura 1). O
metabolismo celular é desestruturado e tem início a formação das lesões. Em cinco dias o
ciclo torna-se completo (Ding et al., 2009).
17
Figura 1. Ciclo de Magnaporthe oryzae na folha de arroz (Ramos, 2009).
A brusone apesar de ser uma doença endêmica pode tornar-se epidêmica
quando as condições ambientais são favoráveis. O uso de cultivares resistentes é um dos
métodos mais eficientes de controle da doença, o principal componente do manejo
integrado da brusone e a necessidade básica para o melhoramento do arroz (Prabhu &
Filippi, 2001; Araújo & Prabhu, 2004; Malavolta et al., 2008). A caracterização do
patógeno pode ajudar na prevenção da doença (Ramos, 2009) e por outro lado, a
ocorrência do patógeno virulento e a intensidade do ataque podem aumentar os prejuízos
ocasionados pela brusone (Dario et al., 2005).
2.2 MANEJO INTEGRADO DA BRUSONE DO ARROZ
O Manejo Integrado de Pragas (MIP) é uma estratégia de controle múltiplo em
que os parâmetros técnicos, econômicos, ecológicos e sociológicos são utilizados de forma
equilibrada para aumentar os fatores de mortalidade natural das pragas. Segundo a FAO
18
(2010), o manejo integrado envolve a associação do ambiente e a dinâmica populacional
das espécies com o objetivo de manter os níveis da população do patógeno toleráveis. O
manejo requer a combinação da resistência genética, controle químico e práticas culturais
(Prabhu & Filippi, 2006).
O manejo da brusone não visa à obtenção de cultivares de arroz imunes de
doença, mas a redução desta em níveis toleráveis que não causem diminuição na
produtividade e na qualidade do produto. Este em diferentes sistemas envolve a seleção, a
integração, e a implementação de estratégias de controle. Para isso, requer conhecimento
sobre o potencial do patógeno em causar danos, os fatores que aumentam ou diminuem a
doença, as práticas agronômicas da cultura do arroz e os aspectos sócio econômicos
(Prabhu & Filippi, 2006). E ainda segundo Prabhu et al. (2002), os danos ocasionados
pelos métodos do manejo integrado devem ser mínimos ao ambiente e à saúde humana.
Práticas culturais como a nutrição das plantas, preparo do solo, substituição de
cultivares e irrigação adequada, diminuem o inóculo e consequentemente, o
estabelecimento da doença (Dias Neto, 2008). O tratamento do arroz com fungicida torna-
se um método essencial no controle da brusone do arroz, quando o grau de resistência da
cultivar não é eficaz (Ribeiro, 1988; Prabhu & Filippi, 2006). No entanto, o uso de
fungicidas deve ser tratado como uma alternativa conjunta, em anos epidêmicos, para
facilitar o controle da doença (Sena, 2012).
O manejo da doença visa ao estabelecimento de um balanço entre a doença e a
cultura no campo com o objetivo de prevenir ações desfavoráveis e, dessa forma, envolve
um conjunto de práticas agronômicas com práticas de controle biológico.
2.2.1 Controle biológico da brusone do arroz
A definição de controle biológico, segundo Mendéz & Mondino (1999), é o uso
de microrganismos antagônicos que, de alguma forma, interferem na vida dos patógenos
ou no desenvolvimento de atividades determinantes da doença, tornando-se uma estratégia
sustentável para a proteção de plantas (Shoda, 2000; Chan et al., 2003). O controle
biológico é uma medida de controle que pode ser somada ao controle químico,
possibilitando a diminuição do número de aplicações de fungicidas (Melo & Azevedo,
19
1998; Kupper et al., 2003), e que quando inserido no manejo integrado pode assegurar uma
agricultura sustentável resultando em uma maior viabilidade econômica (Altieri, 2004;
Lahlali & Hijri, 2010). Os seus componentes são o patógeno, o hospedeiro e os
antagonistas, sob a influência do ambiente (Melo & Azevedo, 1998).
De acordo com Grigoletti Jr. et al. (2000), o controle biológico tem o objetivo
de garantir o equilíbrio no agroecossistema não causando danos significativos ao
hospedeiro. Para garantir uma agricultura economicamente viável, o biocontrole pode ser
acompanhado por práticas culturais que favoreçam os antagonistas nativos ou através da
introdução de microrganismos selecionados (Bettiol, 1991; Pal & Gardener, 2006). O
interesse pela sociedade de conservar os recursos naturais e reduzir os distúrbios causados
pelo homem tem aumentado e, assim, o controle biológico se tornou uma área atrativa de
estudos para os fitopatologistas (Owley & Windham, 2010; Bedendo et al., 2011).
O controle biológico possui algumas vantagens e desvantagens em relação ao
controle químico. A principal vantagem é a ausência de resíduos químicos nos alimentos e
no ambiente. Já a desvantagem é a ineficiência do antagonista contra alguns patógenos
(Mizubuti & Maffia, 2009), e a reprodução dos resultados em condições de campo nem
sempre ser consistente (Bedendo et al., 2011).
No controle de doenças fúngicas de plantas, os agentes de biocontrole podem
atuar diretamente ou indiretamente (Doohan, 2005). Alguns fungos são considerados
importantes agentes de biocontrole de doenças de plantas e apresentam a capacidade de
controlar alguns agentes fitopatogênicos, assim como de atenuar o stress abiótico. Os
benefícios ocorrem devido a capacidade destes agentes de reprogramar a expressão de
genes na planta, possivelmente através da ativação de um número limitado de rotas
metabólicas no hospedeiro (Shoresh et al., 2010).
Segundo Mizubuti & Maffia (2009) existem diferentes mecanismos para que
um organismo possa exercer o controle biológico sobre os patógenos, como a antibiose,
competição, hiperparasitismo, indução de resistência, alelopatia e hipovirulência. Ainda de
acordo com Filippi et al. (2011) o uso de indutores bióticos e abióticos de resistência é uma
das principais estratégias de controle biológico da brusone do arroz para aumentar a
durabilidade da resistência e reduzir os resíduos tóxicos provocados pelos fungicidas.
20
Na presente revisão será detalhado o mecanismo de biocontrole de antibiose
por ser um dos objetos de estudo do trabalho.
2.2.1.1 Antibiose
Para Mizubuti & Maffia (2009) a antibiose é a produção, por parte de um
microrganismo, de compostos tóxicos para outros microrganismos que inibem o
crescimento ou levam a morte do patógeno. Ainda de acordo com Kupper et al. (2003), os
microrganismos que desempenham-se como antagônicos possuem um amplo espectro de
ação por inibirem o crescimento micelial pela produção de substâncias tóxicas.
Segundo Cook & Baker (1983), existe na natureza, uma ininterrupta interação
entre agentes patológicos e seus antagonistas. Essa contínua interação permite que os
agentes antagonistas contribuam para que a doença não aconteça na maioria dos casos.
Durante o processo da antibiose ocorre a interação entre organismos, em que a
produção de metabólitos, principalmente antibióticos, por um destes microrganismos tem
um efeito prejudicial sobre o outro. Essa produção pode resultar na completa lise e
dissolução da estrutura celular, e independe do contato físico entre os microrganismos
(Bettiol & Ghini, 1995). Dessa forma, os antibióticos produzidos na antibiose suprimem o
crescimento e a germinação de outros microrganismos (Owley & Windham, 2010).
A escolha do antagonista depende de vários fatores e um dos mais importantes
é a natureza do patógeno, o que pode auxiliar na seleção do mecanismo apropriado. Além
disso, a distinção entre a atividade antagônica e a capacidade de biocontrole deve ser
realizada claramente, pois um microrganismo pode ser um excelente antagonista nos
ensaios e não demonstrar atividade na natureza (Sena, 2012). Os testes de seleção de
microrganismos in vitro servem para avaliar, de forma preliminar, o antagonista e sua
capacidade de crescimento, adaptação e reprodução (Grigoletti Jr. et al., 2000). Os
principais métodos de seleção de antagonistas in vitro descritos na literatura são o de
pareamento entre culturas, papel celofane, placa sobreposta e líquido metabólico (Mariano,
1993).
Dentre os antagonistas mais estudados para os mais variados tipos de
21
patógenos, principalmente para Sclerotium rolfsii, Diaporthe phaseolorum, Pythium
aphanidermatum, Monilinia fructicola, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solani,
Fusarium solani, Alternaria spp. e Bipolaris sorokiniana estão a bactéria Bacillus sp.
(Remuska & Pria, 2007; Angonese et al., 2009) e o fungo Trichoderma (Martins-Corder &
Melo, 1998; Melo & Azevedo, 1998; Silva et al., 1999; Remuska & Pria, 2007; Carvalho et
al., 2008; Carvalho et al., 2011; Silva et al., 2012). Fungos e bactérias antagônicos e/ou
indutores de resistência à M. oryzae em arroz já foram descritos na literatura (Kawamata et
al., 2004; Araújo et al., 2010; Filippi et al., 2011; Li et al., 2011; Gonçalves et al., 2012;
Sena, 2012).
Filippi et al. (2011) estudaram 148 isolados de rizobactérias e desses, 18 foram
selecionados, pois promoveram o crescimento das plantas de arroz em casa de vegetação e
reduziram a severidade da brusone nas folhas de arroz. Nos testes de antibiose in vitro, os
18 isolados reduziram de 90,99% a 58,5% o crescimento micelial de M. oryzae. Sena
(2012) isolou 189 fungos do filoplano do arroz e identificou 17 gêneros. Desses,
Epicoccum sp. apresentou antagonismo in vitro contra M. oryzae de arroz com 36,68% de
antagonismo. Ainda no mesmo trabalho foi avaliado à supressão de brusone foliar por
conídios de Epicoccum sp. nas concentrações 5x105
e 5x101, e foi observado redução da
severidade de brusone em comparação ao controle de 3,7% e 11,3%, respectivamente.
Silva et al. (2012) ao avaliar o efeito antagônico in vitro de 13 isolados de
Trichoderma sobre Rhizoctonia solani, causadora da queima da bainha em arroz,
constataram que todos os isolados testados apresentaram antagonismo quando comparados
ao controle. Dos 13 isolados, quatro foram altamente antagônicos em relação aos demais e
o isolado T-06 foi o que apresentou a maior capacidade de inibir o crescimento in vitro do
patógeno (84%) quando comparado ao controle. Em casa de vegetação, os quatro isolados
que apresentaram os melhores resultados in vitro, reduziram a severidade da queima da
bainha em 43% e a área sob a curva de progresso da doença em 45%.
Em estudo realizado por Remuska & Pria (2007) o fungo Trichoderma sp.
mostrou-se eficiente como agente antagonista com formação do halo de inibição, porém
não foi capaz de impedir a formação de escleródios de Sclerotium rolfsii. Em estudo
realizado por Ethur et al. (2001) foi observado que 12 isolados de Trichoderma spp.
apresentaram antagonismo in vitro sobre Sclerotinia sclerotiorum. Também foi observado
halo de inibição entre os antagonistas e o patógeno. Ainda constataram diferentes graus de
22
inibição, quando comparados ao controle e a presença de uma coloração escura no meio de
cultura, provocado pela liberação de metabólitos não-voláteis por esses mesmos isolados.
Bettiol (1988) observou que a bactéria Bacillus subtilis é antagônica a M.
oryzae de arroz, o que torna o seu uso ou o emprego dos seus metabólitos bastante
promissor para os estudos de controle da brusone do arroz.
2.3 FUNGOS MICORRÍZICOS DE ORQUÍDEAS
A família Orchidaceae inclui, aproximadamente, 35.000 espécies e 800
gêneros, e é a maior dentro do grupo das angiospermas (Faria et al., 2012). No Brasil, já
foram catalogados cerca de 236 gêneros e 2437 espécies de orquídeas (Batista et al., 2005;
Dressler, 2005; Giulietti et al., 2005; Barros et al., 2012). Essa família pertence à Ordem
Asparagales, Classe Liliopsida, Divisão Magnoliophyta, ao Reino Plantae e ao Domínio
Eukarya (Pereira & Ribeiro, 2004).
Maia (2010) relata que o termo simbiotismo foi empregado primeiramente em
1877, pelo pesquisador alemão Albert Frank, para descrever qualquer relação entre
organismos. Dez anos mais tarde foi proposto o uso do termo simbiose para se referir a
qualquer forma de associação, benéfica ou não. Logo depois passou a ser utilizado em
situações em que os dois mutualistas são favorecidos, constituindo uma simbiose
mutualista.
Para Siqueira (1996) a palavra micorriza composta pelos radicais gregos,
mykes, fungos e, rhizae, raiz, significa associações simbióticas não patogênicas entre
fungos e raízes de plantas. De acordo com Miranda (2008) as micorrizas são divididas, de
forma simplificada, em ectomicorriza e endomicorriza. Aquelas que se desenvolvem na
superfície externa da raiz hospedeira são denominadas de ectomicorrizas, e as que se
estabelecem no córtex da raiz são chamadas de endomicorrizas. Ainda segundo Maia
(2010), as micorrizas são classificadas em ectomicorrizas, ectendomicorrizas, micorriza
arbutoide, micorriza monotropoide, micorriza ericoide, micorriza arbuscular e micorriza
orquidoide.
23
Segundo Raven et al. (2001) cerca de 5.000 espécies de fungos estão
envolvidas nas associações ectomicorrizas, no entanto, as endomicorrizas são as mais
comuns, ocorrendo em cerca de 80% das plantas vasculares. As associações
endomicorrizas não são específicas, enquanto as ectomicorrizas possuem alto grau de
especificidade. Existem plantas da mesma espécie que se associam com ecto e
endomicorrizas e assim, a simbiose é regulada pela planta que estabelece os limites e o tipo
de associação a ser formado (Maia, 2010).
Nas ectomicorrizas, o fungo envolve mas não penetra nas células da raiz e as
hifas crescem entre as células epidérmicas da raiz e do córtex formando a “Rede de
Hartig”, que funciona como interface entre o fungo e a planta (Raven et al., 2001; Souza et
al., 2006; Miranda, 2008). Em sua maioria, são membros das classes Basidiomycota e
Ascomycota compreendendo cerca de 20% de todas as associações micorrizas (Maia,
2010; Trigiano et al., 2010).
Nas endomicorrizas, o fungo desenvolve-se tanto entre como dentro das células
do córtex das raízes sem alteração morfológica (Miranda, 2008). Para as endomicorrizas
são citados diversos gêneros de Ascomycota, Basidiomycota e Glomeromycota (Maia,
2010).
Segundo Raven et al. (2001), nas micorrizas arbusculares, a hifa do fungo
penetra na célula cortical da raiz da planta formando os arbúsculos. Esses invaginam a
membrana plasmática aumentando a superfície e facilitando a transferência de metabólitos.
Em outras situações, formam intumescimentos terminais denominados vesículas. Segundo
Maia (2010) os fungos que compõem as micorrizas arbusculares são do filo
Glomeromycota e associam-se às Briófitas, Pteridófitas, Gimnospermas e Angiospermas.
As espécies da família Orchidaceae estabelecem associações mutualísticas com
fungos micorrízicos formando a associação micorrízica de orquídeas com o objetivo
principal de aumentar a absorção de nutrientes (Rasmussen, 1995; Rasmussen, 2002;
Petersen et al., 2004; Sequeira, 2007). Além disso, os fungos micorrízicos oferecem às
orquídeas aumento na absorção da água, de nutrientes essenciais, como fósforo, zinco,
manganês e cobre, e também as protegem contra o ataque por fungos patogênicos e
nematóides (Raven et al., 2001).
24
Nas orquídeas, os fungos micorrízicos formam um enovelamento de hifas,
denominado peloton que é utilizado na digestão de plantas jovens como fonte de energia
durante o estádio heterotrófico (protocormo) do seu ciclo de vida (Rasmussen, 1995;
Pereira et al., 2003; Petersen et al., 2004; Nogueira et al., 2005). Os principais fungos
micorrízicos isolados de orquídeas no Brasil pertencem aos gêneros Epulorhiza,
Ceratorhiza, Opadorhiza e Rhizoctonia (Pereira et al., 2003; Nogueira et al., 2005; Nunes,
2009; Valadares, 2009; Pessoa et al., 2012; Sousa, 2012; Valadares et al., 2012), e os mais
estudados são Rhizoctonia-like, ou seja, rizoctonioides (Currah & Zelmer, 1992; Andersen
& Rasmussen, 1996; Pereira et al., 2003; Taylor et al., 2003; Pereira et al., 2005;
Rasmussen & Rasmussen, 2007; Stewart & Kane, 2007; Keel et al., 2011). E também,
fungos ectomicorrízicos da família Thelephoraceae (Taylor & Bruns, 1997; Bidartondo &
Read, 2008; Roy et al., 2009).
Nesse tipo de associação, a especificidade pode ser definida como o número de
fungos a qual uma espécie particular de orquídea se associa (Thompson, 2001). De acordo
com Arditti (1992) quando ocorre incompatibilidade durante a associação, a planta induz a
formação de compostos inibitórios ao crescimento do fungo, como o acúmulo de
compostos fenólicos.
2.3.1 Rhizoctonia micorrízica versus Rhizoctonia patogênica
Segundo Ogoshi (1987) o gênero Rhizoctonia sp. foi descrito em 1815 por De
Candolle, e a espécie R. solani é a mais conhecida por ser um fitopatógeno de importância
agrícola e florestal. Rhizoctonia sp. engloba espécies micorrízicas, fitopatogênicas e
saprófitas (Agarwall, 2010). Sabe-se que o gênero Rhizoctonia sp. pode ocorrer em
associação endofítica com espécies florestais, como por exemplo Pinus spp. (Sen et al.,
2002), e também em associações micorrízicas com Epidendrum nocturnum (Sousa, 2012).
De acordo com Carling et al. (2002) a classificação e a identificação de
Rhizoctonia sp. pode ser realizada pelo método de anastomose em hifas com isolados de
grupos padrões, denominados grupos de anastomose ou AG’s. O método consiste em
parear isolados desconhecidos com isolados padrões, observar a reação de anastomose nas
hifas situadas na área de confluência e categorizar em um grupo. Os isolados
25
multinucleados de R. solani (teleomorfo - Thanatephorus cucumeris) foram agrupados em
12 AG’s e os isolados binucleados (RBN) de Ceratorhiza sp. (teleomorfo - Ceratobasidium
spp.) em 21 AG’s (Carling et al., 1999; Mosquera-Espinosa et al., 2013).
Sabe-se que as RBN protegem as plantas mais dos patógenos de solo e raiz,
com poucos trabalhos de uso das mesmas para patógenos foliares. Os resultados da
supressão de fitopatógenos com RBN e fungos rizoctonioides micorrízicos são
promissores, no entanto, são necessários estudos posteriores para se avaliar a
patogenicidade destes isolados em outras culturas (Pascual et al., 2000; Sneh et al., 2004;
Jabaji-Hare & Neate, 2005; Khan et al., 2005; Wen et al., 2005; Basseto et al., 2008).
São poucos os trabalhos encontrados na literatura sobre uso de fungos
rizoctonioides micorrízicos de orquídeas utilizados no biocontrole de fitopatógenos.
Mosquera-Espinosa et al. (2013) avaliaram a patogenicidade de isolados micorrízicos de
orquídeas de Ceratobasidium spp. em arroz e verificaram que alguns isolados produziram
sintomas de queima da bainha, mas com incidência significativamente menor que na
testemunha (R. solani). Entre os isolados de orquídeas Ceratobasidium spp. e Tulasnella
spp., não houve diferença quanto a incidência de queima da bainha. Os autores também
estudaram o biocontrole de R. solani em plantas de arroz com isolados de Ceratobasidium
spp. de orquídeas, e verificaram que quando os isolados de Ceratobasidium spp. foram
pulverizados em plântulas de arroz três dias antes da inoculação de R. solani houve
redução significativa da severidade da doença.
2.4 METABOLISMO SECUNDÁRIO DE FUNGOS
Os metabólitos de plantas e fungos são divididos em primários e secundários.
Os primários são essenciais para o crescimento vegetativo dos organismos e estão
relacionados com funções nos processos de fotossíntese, respiração, transporte de solutos,
translocação, absorção de nutrientes e diferenciação celular (Demain, 2000; Taiz & Zeiger,
2004; Magalhães, 2006).
Por outro lado, os metabólitos secundários dividem-se em três grupos
principais que são os terpenos, os compostos fenólicos e os compostos nitrogenados. Os
terpenos constituem o maior grupo de metabólitos secundários e têm funções específicas
26
na defesa da planta contra herbívoros, enquanto os compostos fenólicos constituem um
grupo heterogêneo com cerca de 10.000 compostos que defendem as plantas contra
herbívoros e patógenos, atraem polinizadores de frutos e protegem contra a radiação (Taiz
& Zeiger, 2004). Já os compostos nitrogenados incluem aminoácidos, alcaloides, aminas e
glicosídeos cianogênicos (Sepúlveda-Jiménez et al., 2004). Os alcaloides são compostos
capazes de atuar no controle biológico de pragas, principalmente a nicotina e a nor-nicotina
(Júnior, 2003), além de apresentarem atividade antimicrobiana (Schwan-Estrada et al.,
2004).
Os microrganismos associados às plantas são capazes de produzir metabólitos
que podem ser encontrados nas plantas realizando diversas funções, como algumas
micromoléculas bioativas (destruxinas e estrobilurinas) que são utilizadas como defensivos
naturais (Pinto et al., 2002).
Segundo Gunatilaka (2006), de todos os microrganismos estudados, os
actinomicetos e os fungos são os maiores produtores de metabólitos secundários. Os
fungos micorrízicos interagem com as plantas levando a produção de produtos bioativos,
um processo complexo resultando na obtenção de diversos grupos estruturais, como os
esteróides, xantonas, compostos fenólicos, isocumarinas, quinonas, terpenos, citocasalanas,
alcalóides, flavonóides e outros (Tan & Zou, 2001; Ramos, 2008).
De acordo com Chechinel Filho & Yunes (1998) são várias as metodologias
descritas na literatura para a preparação dos extratos e isolamento dos metabólitos
secundários a partir de fungos (Figura 2).
27
Figura 2. Procedimentos para preparação dos extratos e isolamento dos compostos bioativos a partir de
fungos (Adaptado de Chechinol Filho & Yunes, 1998).
Os estudos estão voltados para o isolamento de metabólitos de fungos
endofíticos, micorrízicos e, principalmente de fungos micorrízicos arbusculares (FMAs).
Para Finlay (2004) as interações simbióticas entre plantas e fungos micorrízicos podem
influenciar no ambiente de várias formas como no biocontrole de fitopatógenos,
crescimento das plantas, transporte de nutrientes, entre outros (Figura 3). No entanto, sabe-
se que a extração de metabólitos de fungos micorrízicos de orquídeas ainda é um processo
novo e que pode integrar o controle biológico de plantas.
28
Figura 3. Efeitos ambientais ocasionados por associações micorrízicas (Adaptado de Finlay, 2004)
Alguns microrganismos, como os fungos utilizados no controle biológico de
doenças de plantas, são capazes de produzir metabólitos que podem ser de natureza volátil ou
não volátil (Lobo Junior & Abreu, 2000). Os compostos voláteis podem ser formados a partir
de diferentes vias metabólicas de lipídios e podem levar a planta ao “estado de indução”
(Sena, 2012).
Ainda são escassos os estudos descritos na literatura referentes ao uso dos
metabólitos produzidos por microrganismos no controle de M. oryzae. Bettiol & Kimati
(1990) ao verificarem os metabólitos produzidos por Bacillus subtilis sobre M. oryzae após
um dia de incubação, perceberam que esses são produzidos em concentrações suficientes
para inibir o crescimento micelial do patógeno.
Cryptosporiopsis quercina é o estágio imperfeito de Pezicula cinnamomea, um
fungo endofítico comumente associado com espécies arbóreas da Europa. Esse foi isolado
como um endófito de Tripterigeum wilfordii, uma planta medicinal nativa da Eurásia
(Strobel et al., 1999). Em ensaios in vitro, C. quercina, demonstrou uma excelente
29
atividade antifúngica sobre Candida albicans e sobre vários fungos fitopatogênicos,
incluindo Sclerotinia sclerotiorum e Botrytis cinerea. Além disso, C. quercina também
produz, criptocina, um ácido tetrâmico único, com potente atividade sobre M. oryzae, além
de outros fungos fitopatogênicos (Li et al., 2000).
Côrtes et al. (2012) ao avaliarem a ação do metabólito extracelular produzido
por Sarocladium oryzae sobre o desenvolvimento de M. oryzae, observaram a inibição do
desenvolvimento micelial decorrente da atividade antifúngica do metabólito.
Silva et al. (2012) ao avaliarem a capacidade de 13 isolados de Trichoderma na
produção de compostos voláteis durante o processo de antagonismo in vitro à Rhizoctonia
solani, observaram que o isolado T-52 foi o melhor na ação e produção desses compostos.
Os compostos voláteis tóxicos produzidos pelos isolados T-52, T-12 e T-09 reduziram o
crescimento micélial do patógeno em 83%, 35% e 33%, respectivamente, e após 15 dias de
incubação a germinação de escleródios reduziu em 57%.
Alguns exemplos de metabólitos secundários de endófitos com atividade sobre
outros fungos fitopatogênicos são citados a seguir. Um grupo de metabólitos de fungos
endofíticos que induzem defesas em plantas são os peptaibols, uma classe de peptídeos
lineares de cadeia curta, produzidos por uma peptídeo-sintase não ribossomal. O papel
biológico destes peptídeos foi demonstrado em poucos sistemas, mas produziu atividade
antimicrobiana contra Bacillus stearothermophilus e Botrytis cinerea (Schirmböck et al.,
1994; Szekeres et al., 2005; Chutrakul et al., 2008). No entanto, um número crescente de
artigos indica que peptaibols elicitam respostas de defesa contra Trichoderma viride e
Arabidopsis thaliana (Engerberth et al., 2001; Chen et al., 2003; Viterbo et al., 2007). É
sugerido que alguns destes metabólitos modulem canais de Ca2+
e H+, que são
considerados os primeiros passos na interação entre plantas e fungos endofíticos nas
respostas de defesa do hospedeiro (Navazio et al., 2007; Felle et al., 2009; Vadassery et al.,
2009).
Segundo Schuhmacher et al. (2007), os peptaibols foram isolados de vários
gêneros de Trichoderma spp., e são muito utilizados no biocontrole contra Botrytis cinerea
e Fusarium spp. Observaram também que este composto induz a resistência através da
sinalização produzida por etileno e compostos voláteis.
30
Samuels et al. (2006) isolaram os fungos endofíticos Trichoderma
theobromicola e T. paucisporum de folhas de cacau (Theobroma cacao) originárias da
Amazônia peruana e do Equador, respectivamente. Foi observado que ambas as espécies
produziram antibióticos voláteis que inibiram o crescimento de Moniliophthora roreri in
vitro e no campo, após a inoculação das plantas com esporos destes fungos endofíticos.
Nithya & Muthumary (2011), encontraram terpenos isolados de fungos endofíticos de
Allamanda cathartica que apresentaram atividade antibacteriana.
Souza et al. (2004) isolaram metabólitos de 79 linhagens de endófitos e os
testaram em experimentos de antagonismo in vitro sobre alguns patógenos. Observaram
que 19 linhagens apresentaram antagonismo contra um ou mais microrganismos-testes
usados no experimento. Ainda verificaram que o fungo Trichoderma não sofreu inibição
pelos metabólitos dos endófitos.
Cafêu et al. (2005), avaliando os efeitos de um fungo endofítico Xylaria sp.
isolado de Palicourea marcgravii (Rubiaceae), observaram a produção de duas substâncias
(2-hexilideno-3-metilbutanodióico e citocalasina D) com atividade antifúngica contra os
fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum. Estes
resultados indicam uma simbiose entre os endófitos e Palicourea marcgravii, produzindo
substâncias antifúngicas contra possíveis fungos fitopatogênicos.
Onofre et al. (1999) avaliaram a atividade de metabólitos produzidos pelo
fungo Nomuraea rileye frente a cepas de Saccharomyces cerevisae e de bactérias
patogênicas, observando 40% de inibição. Também foi observado a formação de halo de
inibição ocasionado pelos metabólitos. Ao avaliar o efeito do filtrado de bactérias com
potencial biocontrolador sobre Colletotrichum, Silva et al. (2006) verificaram inibição do
crescimento micelial do patógeno com formação do halo de inibição.
O fungo Epicoccum sp. é capaz de produzir vários metabólitos secundários,
tais como epicorazinas A e B (Baute et al., 1978), epicoccinas A-D (Zhang et al., 2007),
epicoccarinas A-B e epipiridona (Wangun & Hertweck, 2007) e flavipina (Bamford et al.,
1961). Destes compostos destaca-se a flavipina com atividade antifúngica para Monilinia
laxa, Pythium spp. e Phythophthora spp. (Brown et al., 1987; Madrigal et al., 1991). Além
disso, alguns destes compostos possuem outras atividades biológicas como antioxidante
(Abdel-Lateff et al., 2003) e anti HIV (Guo et al., 2009).
31
Madrigal et al. (1991) avaliaram o efeito do filtrado puro de E. nigrum
contendo flavipina sobre a germinação dos conídios de Monilia laxa in vitro e observaram
uma redução de 30% na germinação. Lahlali & Hijri (2010) testaram a produção de
compostos voláteis por E. nigrum e constataram que a produção não foi significativa
quando comparado com Phomopsis sp. e Trichoderma atroviride. As culturas dos filtrados
dos três fungos antagonistas inibiram o crescimento de R. solani, e a sua maior inibição foi
devido ao filtrado de T. atroviride, em seguida para E. nigrum.
A planta aquática Rhyncholacis penicillata foi coletada de um sistema de rios
no sul da Venezuela, um ambiente inóspito, onde a planta está sujeita a injúrias mecânicas
causadas pelas águas intempestivas, por debris, rochas e seixos em movimento, e este
ambiente cria portas de entrada de oomicetos patogênicos. No entanto, a população desta
espécie vegetal apresenta aspecto saudável, possivelmente pela proteção conferida pelos
endófitos. Estudos da comunidade endofítica desta planta levaram à descoberta de uma
cepa de Serratia marcescens e após investigação de extratos do fungo, isolou-se um novo
composto antifúngico, a oocidina A, com propriedades de uma lactona macrocíclica
(Strobel et al., 1999).
Zhou et al. (2010) relatam que um produto químico conhecido como taxol e
obtido naturalmente da casca de Taxus brevifolia é muito utilizado no controle do câncer de
mama, uterino e outros. Seu método de extração é ineficiente e caro e, por esta razão é
importante buscar novas formas de obtenção de taxol visando à conservação de Taxus
brevifolia. A produção de taxol pode ser obtida por fungos endofíticos e este é um exemplo
da utilização destes fungos na conservação de plantas, pois o taxol é extraído do caule, o
que provoca o extrativismo de uma planta que demora anos para atingir sua fase adulta.
Sabe-se que os resultados das pesquisas nas áreas de uso de fungos
rizoctonioides e micorrízicos na conservação de orquídeas, e no biocontrole de
fitopatógenos são promissores necessitando de mais estudos dessas interações nos campos
da bioquímica, fisiologia vegetal, biologia molecular e fitopatologia.
32
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Campus II da Universidade Federal de
Goiás – UFG, em Goiânia, GO. Parte da pesquisa foi desenvolvida no Instituto de Ciências
Biológicas (ICB) nos Laboratórios de Genética de Microrganismos e de Enzimologia, e
outra parte no Instituto de Química (IQ) no Laboratório de Produtos Naturais. No
Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Arroz e Feijão foram conduzidos os ensaios para
avaliação da atividade biológica dos extratos.
3.1 ANTIBIOSE
Foram utilizados dez isolados fúngicos obtidos por Sousa (2012), cinco de
Cyrtopodium saintlegerianum e cinco de Epidendrum nocturnum, um de Epicoccum sp.
(isolado da cultivar de arroz cateto) obtido por Sena (2013) e o isolado Py 461 de M.
oryzae pertencente à coleção de microrganismos funcionais do Laboratório de
Fitopatologia da Embrapa Arroz e Feijão (Tabela 1). Os isolados foram multiplicados em
placas de Petri contendo meio de cultura BDA (Batata - Dextrose – Ágar: 20 g de ágar, 20
g de dextrose, 1 L de água e 200 g de batata). Adicionou-se 200 µL de Tetraciclina (5
mg/mL em álcool 95%) para cada litro de BDA. As placas foram incubadas em câmara
climatizada a 27ºC por 11 dias, em presença de luz contínua até o micélio ocupar toda a
superfície da placa.
Utilizou-se o método da cultura pareada descrito por (Romeiro, 2007). Discos
de micélio de 5 mm do patógeno e dos 10 isolados fúngicos foram transferidos para o
centro de placas de Petri contendo BDA, em lados opostos, distanciados aproximadamente
de 3 cm, em delineamento experimental inteiramente casualizado, com oito repetições para
cada isolado. Foram utilizadas oito placas do isolado de M. oryzae para crescimento na
ausência do provável antagonista, como controle positivo. Também foram montadas oito
placas do patógeno na presença do Epicoccum sp., como controle negativo. Avaliou-se o
33
tamanho dos diâmetros horizontal e vertical de cada tratamento, em intervalos de dias, até
que o controle positivo alcançasse a borda da placa, totalizando cinco medições. Também
mediu-se o halo de inibição, e comparou-se com o controle negativo. As medições foram
feitas em câmara de fluxo laminar, em luz branca constante, com o auxílio de uma régua
milimetrada.
Tabela 1. Identificação, classificação e origem dos isolados utilizados no ensaio de
pareamento com Magnaporthe oryzae.
Identificação Classificação Origem
Cs02 Epulorhiza sp. Cyrtopodium saintlegerianum
Cs10 Epulorhiza sp. C. saintlegerianum
Cs16 Xylaria sp. C. saintlegerianum
Cs18 Xylaria sp. C. saintlegerianum
Cs21 Epulorhiza sp. C. saintlegerianum
En02 Epulorhiza sp. Epidendrum nocturnum
En03 Epulorhiza sp. E. nocturnum
En05 Epulorhiza sp. E. nocturnum
En07 Rhizoctonia sp. E. nocturnum
En24 Rhizoctonia sp. E. nocturnum
Ep06 Epicoccum sp. Oryza sativa
Py 461 Magnaporthe oryzae Oryza sativa
Calculou-se a redução do diâmetro da colônia (Filippi et al., 2011) através da
fórmula: Diâmetro de M. oryzae na presença do provável antagonista x 100 / Diâmetro de
34
M. oryzae sozinha (controle), e o resultado foi diminuído de 100. O isolado que apresentou
o maior grau de antibiose in vitro para M. oryzae foi selecionado para o isolamento e
identificação dos metabólitos secundários.
3.2 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS ATIVOS DA CULTURA MICORRÍZICA Rhizoctonia sp.
3.2.1 Cultivo do isolado micorrízico Rhizoctonia sp. em meio líquido
O isolado de Rhizoctonia sp. foi crescido em meio de cultura BDA, por 11 dias
a 27°C, na presença de luz e, com a cultura crescida, 20 discos de micélio de 5 mm foram
transferidos para 1 L de BD (Batata - Dextrose). Os frascos foram mantidos sob agitação,
em aparelho rotativo por 15 dias a 28°C e 120 r.p.m (Figura 4). Em seguida, o micélio foi
separado do meio (líquido), por filtração, com papel Whatman, nº 4, sob vácuo (Adaptado
de Gunatilaka, 2006).
Figura 4. Cultivo do isolado micorrízico Rhizoctonia sp., em meio líquido, e o seu processo de
filtração. A: Frascos contendo a cultura de Rhizoctonia sp. crescido em BD (Batata –
Dextrose); B: Frascos contendo a cultura de Rhizoctonia sp. crescido em BD, em aparelho
rotativo; C: Separação do micélio e meio líquido, com o auxílio de um funil, papel de filtro e
bomba de vácuo (Fotos: J. C. B. CARVALHO, 2011).
35
3.2.2 Obtenção dos extratos
A massa micelial obtida do processo de filtração foi liofilizada, macerada e, em
seguida, submetida à extração a frio com acetato de etila. Após 48 h, o solvente foi
eliminado por evaporação, com pressão reduzida em evaporador rotativo, para a obtenção
do extrato micelial (EM). O filtrado (líquido) da cultura foi submetido à partição líquido-
líquido, com acetato de etila (300 mL, 3x). As fases orgânicas foram reunidas e secas com
sulfato de sódio anidro e filtradas. O solvente foi eliminado, em evaporador rotativo, para a
obtenção do extrato bruto (EB). A fração aquosa foi seca, através do processo de
liofilização e, logo após submetida à extração a frio, em acetato de etila, para eliminar o
solvente, em evaporador rotativo seguida da obtenção do extrato liofilizado (EL; Figura 5).
Figura 5. Processo de obtenção dos extratos – EB (extrato bruto), EL (extrato liofilizado), EM (extrato
micelial). A: Partição líquido-líquido; B: Béquer contendo a massa micelial seca e macerada;
C: Secagem da massa micelial e fração aquosa em liofilizador; D: Secagem da massa
micelial em estufa; E: Concentração em rotaevaporador; F: Frasco contendo o EB (Fotos: J.
C. B. CARVALHO, 2011).
36
3.2.3 Análise dos metabólitos secundários
Os extratos micelial (EM), bruto (EB) e liofilizado (EL) obtidos foram
analisados por Cromatografia em Camada Delgada (CCD), com sílica gel 60 como fase
estacionária, e CH2Cl2/MeOH como fase eluente. A detecção dos compostos foi feita
utilizando-se luz ultravioleta como revelador universal e pela pulverização dos reveladores
químicos anisaldeído, reativo de Dragendorf (específico para compostos nitrogenados) e
ácido sulfúrico/metanol.
O espectro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1H) foi obtido utilizando-
se solvente deuterado MeOD-d4 e TMS (tetrametilsilano) como padrão interno. A análise
foi realizada em espectrômetro Bruker Avance III 500 (11, 7 T), operando em frequência
de 500 MHz.
Para a análise através de cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE/HPLC) utilizou-se um cromatógrafo da Marca Shimadzu® e modelo LC8A,
equipado com detector de UV-Vis (SPD-M20A). Foi utilizada a coluna analítica Shim-
pack PRESP-ODS (H) 5 µm, 250 x 4,6 mm. A análise foi feita utilizando ACN:H2O (8:2)
por 40 minutos com alternância do fluxo de 0,6 mL/min a 0,4 mL/min e nos comprimentos
de onda (λ) de 210, 254 e 320 nm.
Na análise em (CLAE) gradiente utilizou-se o aparelho ICS-500 com detector
DAD e coluna Dionex Acclaim 120, C-18, 5 µm, 120Ǻ, 100 x 4,6 mm. Sistema eluente:
fase móvel A: CHCl3/MeOH 20%; fase móvel B: H2O; fluxo de 1 mL/min, com gradiente
inicial de 30% de fase A e 70% de fase B por 60 minutos e nos comprimentos de onda (λ)
de 210, 254, 290 e 320 nm.
As amostras analisadas por CLAE foram solubilizadas em metanol em uma
concentração de 1 mg/mL de extrato e o volume injetado foi de 10 µL. Estas foram
filtradas em uma seringa adaptada com uma membrana de politetrafluoretileno (PTFE),
diâmetro de poro de 20 µm, da marca Macherey-Nagel. As análises realizadas por CLAE
foram feitas apenas para o extrato bruto, pois a quantidade de amostras dos outros dois
extratos não foram suficientes para todas as análises. Utilizou-se também o espectrômetro
de massas com o intuito de se encontrar a massa molecular dos compostos presentes no
extrato bruto.
37
3.3 ATIVIDADE BIÓLOGICA DOS EXTRATOS BRUTOS
3.3.1 Inibição do crescimento micelial de M. oryzae, in vitro, por
metabólitos secundários extraídos do isolado micorrízico Rhizoctonia sp.
Para este experimento preparou-se cinco diluições de cada extrato (EB, EM,
EL) conforme tabela 2. Inicialmente, as amostras foram pesadas e diluídas em 40 gotas de
C2H6O e, logo após, acrescentado água Milli-Q para a obtenção da concentração final. Em
seguida, as amostras foram filtradas em uma seringa adaptada com uma membrana de
politetrafluoretileno (PTFE), diâmetro de poro de 20 µm, da marca Macherey-Nagel.
38
Tabela 2. Tratamentos e concentrações dos extratos - EB (extrato bruto), EL (extrato
liofilizado), EM (extrato micelial) do isolado micorrízico Rhizoctonia sp. seguido
dos respectivos tratamentos para o ensaio de atividade biológica in vitro para
Magnaporthe oryzae.
Tratamentos Concentração [µg da
amostra /mL de água
Milli-Q]
Extratos
1 (Controle) 401
-
2 1040 EB
3 700 EB
4 520 EB
5 120 EB
6 12 EB
7 900 EL
8 800 EL
9 450 EL
10 130 EL
11 13 EL
12 1860 EM
13 930 EM
14 860 EM
15 280 EM
16 28 EM
1Para o controle foi colocado 40 gotas de etanol para cada 15 mL de BDA (Batata – Dextrose – Ágar).
O isolado Py 461 de M. oryzae foi crescido em placas de Petri contendo BDA,
por 11 dias a 25°C. Utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado, com
15 tratamentos e o controle, em três repetições. Adicionou-se em cada placa de Petri 1 mL
da concentração dos extratos e 15 mL de BDA (Figura 6), e depois agitado para que o
metabólito se difundisse pelo meio de cultura. Após a solidificação, foi transferido um
disco de 5 mm do patógeno para o centro da placa de Petri. O experimento foi incubado em
sala de crescimento, a 25°C por 10 dias, ou seja, até que o tratamento controle ocupasse
39
toda a superfície da placa de Petri. Mediu-se o diâmetro horizontal das colônias com o
auxílio de um paquímetro digital (Côrtes et al., 2012).
Figura 6. Ensaio de inibição do crescimento micelial de Magnaporthe oryzae in vitro por metabólitos
secundários, extraídos do isolado micorrízico Rhizoconia sp. A: Diluição e montagem das
repetições; B: Incubação do experimento (Fotos: J. C. B. CARVALHO, 2011).
3.3.2 Efeito dos extratos do isolado micorrízico Rhizoctonia sp. na
germinação de conídios e formação de apressórios de M. oryzae
3.3.2.1 Preparo da suspensão de conídios de M. oryzae
O isolado Py 461 de M. oryzae foi cultivado em meio de cultura BDA por sete
dias e, posteriormente transferido para placas de Petri contendo o meio de cultura Aveia
Ágar (AA: 50 g de aveia em flocos, 15 g de ágar, 20 g de dextrose e 1 L de água) e
mantido sob luz branca contínua para crescimento da colônia. Em seguida, o isolado foi
submetido ao estresse físico, através da remoção do micélio aéreo, com o auxílio de um
bastão de vidro estéril. As placas de Petri, contendo a colônia sem micélio aéreo foram
mantidas sob luz branca contínua por um período de dois dias e temperatura variando de
25° a 27° C e umidade alta. A remoção dos conídios foi realizada com o auxílio de um
pincel. A suspensão contendo conídios de M. oryzae foi filtrada, com tecido estéril tipo
crepe realizada em hemacitômetro tipo Newbauer no microscópio óptico e a concentração
ajustada para 1x105 conídios/mL (Filippi & Prabhu, 2001; Figura 7).
A B
40
Figura 7. A: Colônias de Magnaporthe oryzae em conidiogênese; B: Suspensão de conídios de
Magnaporthe oryzae filtrada; C: Contagem dos conídios em hemacitômetro tipo Newbauer
no microscópio óptico (Aumento 40 X; Fotos: J. C. B. CARVALHO, 2011).
3.3.2.2 Tratamentos e avaliação
Foram conduzidos dois ensaios, em superfície artificial hidrofóbica, para
induzir a germinação dos conídios e a formação de apressórios de M. oryzae. A superfície
artificial foi previamente tratada com solução de hipoclorito de sódio e álcool 70%, e
organizadas em lâminas microscópicas, dentro de placas de Petri, forradas previamente
com papel toalha umedecido com água estéril, para proporcionar um ambiente de alta
umidade.
Utilizou-se uma concentração de cada extrato (1040 µg/mL – EB; 900 µg/mL –
EL; 1860 µg/mL – EM). Colocou-se 10 µL da concentração na superfície artificial e
misturou-se com 10 µL da suspensão de conídios na concentração final 1x105 de M. oryzae
(Tabela 3). As avaliações foram feitas após 3, 6 e 24 horas de indução da formação do
apressório em microscópio óptico. O controle de 20 µL da suspensão de conídios. Os testes
A
B
C
41
foram realizados em triplicata e o delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado
com quatro tratamentos (Adaptado de Sena, 2012).
Tabela 3. Concentrações para cada microplaca dos três extratos - EB (extrato bruto), EL
(extrato liofilizado), EM (extrato micelial) do isolado micorrízico de Rhizoctonia
sp. seguido dos respectivos tratamentos para os ensaios de germinação de conídios
e formação de apressório em Magnaporthe oryzae.
Microplaca
(superfície
artificial)
Quantidade de
extrato na
microplaca (µg)
Concentração de
cada extrato
(µg/mL)
Concentração
final na
microplaca
(µg.µL-1
)
Extrato
T1 18,6 1860 0,93 EM
T2 9 900 0,45 EL
T3 10,4 1040 0,52 EB
T4 0 0 0 -
3.4 SUPRESSÃO DE BRUSONE FOLIAR POR METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS EXTRAÍDOS DO ISOLADO MICORRÍZICO Rhizoctonia
sp.
Foram realizados dois ensaios em condições de inoculação artificial em casa de
vegetação.
3.4.1 Plantio
Foram utilizadas sementes da cultivar Primavera, previamente esterelizadas em
álcool 70%, hipoclorito de sódio e água destilada. As sementes foram secas em
temperatura ambiente e semeadas em bandejas plásticas, contendo oito sulcos de 4 cm de
comprimento, adubadas com NPK (5 g de 5-30-15 + 1 g de Zn e 3 g de sulfato de amônio).
Aos 20 dias após a semeadura foi realizada a adubação de cobertura com 2 g de sulfato de
amônio (Figura 8A-B).
42
Figura 8. Ensaio de supressão de brusone foliar por metabólitos secundários extraídos do isolado
micorrízico Rhizoctonia sp. A: Sulcos contendo sementes da cultivar Primavera; B: Bandejas
plásticas com as sementes em casa de vegetação; C: Bandejas plásticas com plantas de 21
dias de idade; D: Inoculação (Fotos: J. C. B. CARVALHO, 2011).
3.4.2 Obtenção da suspensão de conídios de M. oryzae
A obtenção da suspensão de conídios de M. oryzae foi realizada conforme
citado no item 3.3.2.1, e a concentração final foi ajustada para 3x105
conídios/mL.
3.4.3 Inoculação
No primeiro ensaio conduzido em casa de vegetação com a cultivar Primavera,
realizou-se a pulverização de quatro concentrações diferentes dos extratos do isolado
micorrízico Rhizoctonia sp., para depois ser pulverizada a suspensão de conídios de M.
oryzae (3x105 conídios/mL), em plantas com 21 dias de idade (Figura 8C-D). A inoculação
foi realizada de acordo com a metodologia de Filippi & Prabhu (2001). Para o segundo
ensaio, foram utilizadas plantas com 25 dias de idade e as quatro concentrações diferentes
43
dos extratos do isolado micorrízico Rhizoctonia sp. foram pulverizadas simultaneamente
com à suspensão de conídios de M. oryzae (3x105 conídios/mL). Para os dois ensaios, o
delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com cinco tratamentos
e três repetições, conforme tabela 4.
Tabela 4. Tratamentos contendo as quatro concentrações dos extratos de metabólitos
secundários extraídos do isolado micorrízico Rhizoctonia sp. mais a testemunha,
com a concentração de M. oryzae (M.o) de 3x105 nos ensaios de supressão de
brusone foliar.
Tratamentos Concentração Final Extratos
1 (Controle) M.o 3x105
-
2 1040 µg/mL e
M.o 3x105
EB
3 900 µg/mL e
M.o 3x105
EL
4 1860 µg/mL e
M.o 3x105
EM
5 700 µg/mL e
M.o 3x105
EB
Após a inoculação, as plantas foram incubadas em câmara úmida por 24 horas
a uma temperatura de 24 a 26 ºC. Depois, até o período de avaliação da doença, as plantas
inoculadas foram submetidas a temperaturas variando de 27 a 30ºC, e alta umidade em
casa de vegetação.
3.4.4 Avaliação
As avaliações de brusone nas folhas (SBF %) foram realizadas utilizando-se
uma escala de notas de dez graus, de acordo com Notteghem (1981), aos oito dias após a
inoculação de M. oryzae, para o ensaio 1. No ensaio 2, avaliou-se a área abaixo da curva de
progresso da doença (AACPD), aos dois, quatro, seis e oito dias após a inoculação de M.
oryzae, nas mesmas plantas previamente marcadas com velcro. Também foi calculada a
44
redução da severidade de brusone foliar em relação ao controle para os dois ensaios e para
a AACPD, através da fórmula: Severidade do melhor tratamento x 100 / Severidade do
controle, e o resultado foi diminuído de 100.
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos na antibiose, da atividade biológica in vitro e de
supressão in vivo foram submetidos à análise de variância e a comparação das médias pelo
teste Tukey a 5% de probabilidade através do Software R, versão 2.11.0. Os dados de
supressão foram transformados utilizando-se √x+0.5.
45
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 ANTIBIOSE
Entre os 10 isolados avaliados, todos diferiram do controle positivo (M.
oryzae) no crescimento vertical e três isolados de Epulorhiza sp. (En02, Cs02, Cs21) no
crescimento horizontal. Os isolados Cs02 e Cs21 apresentaram significativamente menores
diâmetros do que o controle negativo (Ep06), isolado cujo antagonismo já foi comprovado
por Sena (2013; Figura 9A). Observou-se correlação entre os diâmetros vertical e
horizontal (r = 0,895; P≤0.01; Figura 10) indicando coerência e uniformidade dos dados.
46
Figura 9. Avaliação da antibiose dos prováveis antagonistas fúngicos, após dez dias de crescimento
em BDA. (A) Antibiose in vitro de 10 isolados fúngicos sobre Magnaporthe oryzae; (B)
Halo dos isolados fúngicos na vertical e horizontal; (C) Redução do diâmetro de
Magnaporthe oryzae na vertical e horizontal em relação ao controle; Tratamentos: En02,
En03, En05, En07, En24 – Isolados de Epidendrum nocturnum; Cs02, Cs10, Cs16, Cs18,
Cs21 – Isolados de Cyrtopodium saintlegeriannum; Ep06 – Epicoccum sp.; Py461 –
Magnaporthe oryzae. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem entre si, pelo
teste Tukey, a 5% de significância.
0
1
2
3
4
Py 461 En07 En24 Cs10 En03 Cs16 Cs18 En05 Ep06 En02 Cs21 Cs02
Diâ
met
ro (
cm)
Tratamentos
Vertical
Horizontala
a a a a a a a ab
b b
c c
b bc bc bc bcd
cde de e
e
f f
0
1
2
3
4
5
En07 En03 Ep06 Cs10 Cs16 Cs18 En24 En05 En02 Cs21 Cs02
Diâ
met
ro (
cm)
Tratamentos
Vertical
Horizontala
ab
b
b b
ab b
b b b b b b b b
0
20
40
60
80
100
Cs21 Cs02 Ep06 En02 En05 En03 Cs16 En24 Cs18 En07 Cs10
Red
uçã
o d
o c
resc
imen
to
(%)
Tratamentos
Vertical
Horizontala a a a
b bc
b
b
bc
bc c
de de de
c c
c
cd
c
ef
c
de
A
B
C
47
Figura 10. Correlação entre o diâmetro vertical e o horizontal do antagonismo in vitro de 10 isolados
fúngicos sobre Magnaporthe oryzae.
A maior redução do diâmetro de M. oryzae observada, na vertical e na
horizontal, foi de 85,86% e de 82,14% (Epulorhiza sp. - Cs02 e Cs21), respectivamente. O
isolado En02 de Epulorhiza sp. proporcionou 63,95% de redução do diâmetro na vertical e
40,62% na horizontal diferindo significativamente do controle positivo. O isolado En05 de
Epulorhiza sp. também apresentou uma redução significativa, com 54,06% na vertical e
26,33% na horizontal. A redução observada com os isolados Cs02 e Cs21 foi maior que a
observada quando M. oryzae pareou-se com o Epicoccum (Ep06), tanto na vertical quanto
na horizontal. Por outro lado, o tratamento pareando En02 e M. oryzae, apesar do
crescimento horizontal ter sido estatisticamente igual ao controle positivo, a redução do
crescimento vertical foi maior que a observada por Ep06 (Figura 9C).
Entre os três melhores tratamentos, Cs02 e Cs21 diferiram do controle negativo
e En02 mostrou-se estatisticamente igual ao controle negativo e diferente do controle
positivo. Cs02 e Cs21 foram mais eficientes que o controle negativo (Figura 9C).
Na horizontal, os isolados En03 e Cs10 de Epulorhiza sp.; En24 de Rhizoctonia
sp. e Cs16 de Xylaria sp. não diferiram entre si na redução do crescimento de M. oryzae
(Figura 9C).
Quanto a formação do halo de inibição destacaram-se dois isolados,
Rhizoctonia sp. (En07) e Epulorhiza sp. (En03), de Epidendrum nocturnum. O isolado
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
Diâ
met
ro v
erti
cal
Diâmetro horizontal
r = 0,895**
48
En07 de Rhizoctonia sp. foi o que apresentou o maior halo de inibição e consequentemente
o melhor antagonismo in vitro sobre M. oryzae. Por outro lado, o isolado Cs10 de
Epulorhiza sp. iniciou a formação do halo de inibição, enquanto que para os outros
isolados não observou-se a formação desta zona de inibição. Os isolados En24 de
Rhizoctonia sp. e Cs16 de Xylaria sp. não formaram halo de inibição, no entanto, acredita-
se que os mesmos isolados competiram com o patógeno pela busca de nutrientes. O isolado
de Epidendrum nocturnum (Rhizoctonia sp. – En07) apresentou um halo de inibição maior
que o Epicoccum sp. (Ep06) na vertical (Figura 9B; Figura 11).
Figura 11. Antagonismo in vitro de isolados fúngicos sobre Magnaporthe oryzae após 10 dias de
crescimento. A: Isolado En07 e Magnaporthe oryzae; B: En03 e Magnaporthe oryzae; C:
Isolado Cs10 de Epulorhiza sp. de Cyrtopodium saintlegeriannum começando a formar
um halo de inibição; D: Competição de Xylaria sp. (Cs16) de Cyrtopodium
saintlegeriannum sobre Magnaporthe oryzae; E: Competição de Rhizoctonia sp. (En24) de
Epidendrum nocturnum sobre Magnaporthe oryzae; F: Controle positivo (Barras: 1cm).
No presente estudo a presença do halo de inibição produzido pelo isolado En07
de Rhizoctonia sp. provavelmente pode ser devido à presença de metabólitos liberados pelo
fungo.
Segundo Remuska & Pria (2007), a medida do halo de inibição é o parâmetro
mais adequado de ocorrência de antibiose, pois a redução do crescimento micelial também
49
pode acontecer devido a competição por nutrientes do meio de cultura. Dessa forma, por
apresentar o maior halo de inibição, o isolado En07 de Rhizoctonia sp. foi escolhido e
utilizado posteriormente para a detecção de metabólitos secundários. Durante a antibiose,
um microrganismo produz metabólitos que pode levar a dissolução da estrutura celular
(Bettiol & Ghini, 1995), supressão do crescimento e da germinação de um segundo
microrganismo (Owley & Windham, 2010) formando o halo de inibição entre os dois
organismos. Angonese et al. (2009) também observaram a formação de uma zona clara e
transparente em torno das colônias de Bacillus spp. Os mesmos sugeriram que nesta área
eram produzidos metabólitos liberados pelo Bacillus spp., inibindo o crescimento de
Alternaria spp., Botrytis spp., Fusarium oxysporum e Colletotrichum spp.
A seleção e a identificação por fungos considerados agentes biológicos para
controle de M. oryzae vem sendo realizado. Um exemplo é o estudo desenvolvido por
Sena (2012) que isolou 189 fungos do filoplano de lavouras comerciais de arroz e
identificou 17 gêneros, ente eles o Epicoccum sp. foi o que apresentou o maior halo de
inibição na vertical quando pareado com M. oryzae. Ainda verificou que um isolado
distinto de Rhizoctonia sp. foi o mais eficiente na redução do diâmetro de M. oryzae na
horizontal, diferindo estatisticamente dos demais produzindo um halo, estatisticamente
maior, que os oito demais isolados. Araújo et al. (2010) identificaram 15 fungos do
filoplano da cultivar de arroz Aimoré, cultivado em sistema orgânico, implantado em
plantio direto e convencional. Os autores verificaram a formação do halo de inibição
quando dois isolados, Epicoccum sp. e Sporobolomyces sp., foram pareados com M.
oryzae. Gonçalves et al. (2012) avaliaram quatro fungos do filoplano do arroz, e apenas o
Epicoccum sp. apresentou halo de inibição in vitro quando pareado com M. oryzae.
Kawamata et al. (2004) observaram que cinco isolados de Phaeosphaeria oryzae foram
antagônicos à M. oryzae.
Entre os microrganismos, também as bactérias podem ser consideradas agentes
biológicos. Bactérias antagonistas à M. oryzae, selecionadas in vitro, foram obtidas e
registradas por alguns autores. Filippi et al. (2011) selecionaram 18 isolados de
rizobactérias, de um total de 148, que promoveram o crescimento das plantas de arroz, em
casa de vegetação, e reduziram a severidade da brusone nas folhas. No ensaio de antibiose,
os 18 isolados reduziram de 90,99% a 58,5% o crescimento micelial in vitro de M. oryzae.
Dois isolados de rizobactérias (Bulkorderia sp. e Pseudomonas fluorescens) foram capazes
50
de induzir a resposta de defesa da planta, aumentando a atividade enzimática de proteínas
relacionadas à patogênese. Li et al. (2011) observaram que o isolado JK-1 de Streptomyces
globisporus reduziu o crescimento micelial in vitro de vários fitopatógenos, entre eles M.
oryzae. Nascimento (2009), verificou que 15 isolados de Bacillus sp. formaram zonas de
inibição em relação à M. oryzae, aos 14 dias após a instalação do experimento. Ao avaliar
o efeito de duas cepas (Bacillus thuringiensis thuringiensis e B. thuringiensis kurstaki),
Knaak et al. (2007) observou que o crescimento micelial de M. oryzae foi reduzido
significativamente, aos sete dias da incubação. No entanto, quando os mesmos autores
avaliaram a ação das proteínas Cry1Ab e Cry1Ac sintetizadas pelas cepas, perceberam que
não havia a formação do halo de inibição. Bettiol (1988), ao selecionar microrganismos
antagônicos à M. oryzae concluiu que Bacillus subtilis foi o mais eficiente em inibir o
crescimento micelial do patógeno.
4.2 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS ATIVOS DO ISOLADO MICORRÍZICO Rhizoctonia sp.
A partir de 20 litros de BD, após o crescimento do fungo rhizoctonioide por 11
dias, obteve-se 20 mg de cada um dos três extratos (Extrato bruto - EB; Extrato liofilizado
– EL; Extrato do micélio – EM). Estes extratos foram utilizados para o isolamento e
identificação de metabólitos secundários, além dos ensaios de atividade biológica. A
análise por CCD do EB mostrou a presença de compostos que reagiram positivamente
(coloração laranja) ao reativo de Dragendorf, sugerindo a presença de compostos
nitrogenados (Figura 12.1). Os outros dois extratos (EL e EM) também apresentaram
reação positiva frente ao reagente de Dragendorf, no entanto, em concentração menor que
o EB.
A comparação dos três extratos (EB, EL e EM) do isolado de Rhizoctonia sp.
com o extrato obtido do meio de cultura sem a presença do fungo (controle) confirmou que
os compostos observados não são oriundos do meio de cultura e sim produzidos durante o
crescimento do isolado fúngico.
51
Figura 12. Cromatoplacas dos extratos, sistema elunte: CH2Cl2/MeOH 10%; 1 - Reativo de
Dragendorf - A - Extrato liofilizado; B - Fração hexânica; C - Extrato bruto; D - Extrato
do micélio; 2 H2SO4/MeOH - A - Extrato liofilizado; B - Extrato do micélio; C - Fração
hexânica; D - Extrato bruto; 3 - A - Fração hexânica; B - Extrato bruto; C - Extrato do
micélio; D - Extrato liofilizado. Seta: coloração laranja sugerindo a presença de compostos
nitrogenados.
Na Figura 12.3 observou-se também spots com características de flavonóides
(coloração amarelo-esverdeada, após a revelação com o reagente cromogênico anisaldeído.
Na Figura 12.2 (revelação com ácido sulfúrico/metanol) observou-se que o EB apresentou
mais compostos que quando revelado apenas com reativo de Draguendorf (Figura 12.1). O
extrato liofilizado não apresentou nenhum padrão de manchas característico para as três
revelações.
A partição com hexano do EB (10 mg) resultou em 5 mg de extrato hexânico.
Essa fração quando revelada com anisaldeído mostrou um padrão de manchas similar as do
EB. Nenhum dos outros dois extratos (micelial e liofilizado) apresentaram padrões de
manchas similares aos do extrato bruto hexânico.
A análise do EB por RMN 1H mostrou em seu espectro de RMN
1H a presença
de sinais (multipletos) na região δ=7,5-6,0 ppm, característicos de hidrogênios aromáticos
e sinais na região de 5,5-3,5 ppm característicos de hidrogênios ligados à hidroxila,
indicando a possível presença de uma porção glicosídica (Figura 13).
52
Figura 13. Espectro de RMN 1H (330 MHz, MeOD- d4) do extrato bruto de Rhizoctonia sp.
A análise por CLAE do EB (ACN:H2O – 8:2; 0,6 a 0,4 mL/min) mostrou a
presença majoritária de um composto com tempo de retenção em 25 minutos quando
analisado por UV (λ=210, 254 e 320 nm). Outros compostos minoritários foram
observados com tempo de retenção (na faixa de 2, 22, 31, 35 e 45 minutos).
Na análise em (CLAE) gradiente (30% de fase CHCl3/MeOH 20% e 70% de
fase H2O) também foi observado um pico principal em todos os comprimentos de onda
analisados (λ=210, 254, 290 e 320 nm). As análises feitas em CLAE isocrático e gradiente
mostram a presença de um composto majoritário presente no isolado fúngico, mas não
identifica. Não foi possível o isolamento desse composto, mas realizamos a análise por
espectrometria de massas do extrato bruto. A massa molecular observada, comparada ao
banco de dados nos indica a presença de compostos fenólicos. No entanto, uma análise
detalhada só é possível com o composto isolado. A presença de fenólicos corrobora a
presença de hidrogênios aromáticos observados por RMN anteriormente (Figura 14).
L-JD01.001.esp
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
Chemical Shift (ppm)
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
Norm
alize
d Int
ensit
y
53
Figura 14. Espectro de massas do extrato bruto do isolado de Rhizoctonia sp.
Os resultados encontrados no presente estudo mostram a presença de fenóis e
hidrogênios aromáticos. Estes são capazes de atuar no controle biológico de pragas (Júnior,
2003), na herbivoria (Monteiro et al., 2005) e possuem atividade antimicrobiana (Schwan-
Estrada et al., 2004).
Harris et al. (1987) ao avaliarem os metabólitos secundários produzidos por
Rhizoctonia leguminicola verificaram a presença de dois alcalóides indolizidínicos, que
são Slaframine e Swainsonine. Além disso, também observaram a presença de (1S,2R
,8aS) -1,2-Dihydroxyindolizidin. Estes mesmos resultados também foram observados por
Schneider et al. (1982) durante a biossíntese deste fungo.
54
4.3 ATIVIDADE BIÓLOGICA DOS EXTRATOS BRUTOS
4.3.1 Inibição do crescimento micelial de M. oryzae por metabólitos
secundários extraídos do isolado micorrízico Rhizoctonia sp.
Observou-se a inibição do crescimento micelial de M. oryzae pelo metabólito
produzido por Rhizoctonia sp., corroborando o resultado obtido no ensaio de antibiose
(Figura 15A).
Figura 15. Inibição do crescimento micelial de Magnaporthe oryzae pelos metabólitos do isolado de
Rhizoctonia sp., após 10 dias de crescimento em BDA. A: Diâmetro da colônia de
Magnaporthe oryzae na horizontal e radial; B: Redução do crescimento de Magnaporthe
oryzae. Tratamento 1 – Controle; Tratamento 2 – 1040 µg/mL de Extrato bruto;
Tratamento 3 – 700 µg/mL de Extrato bruto; Tratamento 4 – 520 µg/mL de Extrato bruto;
Tratamento 5 – 120 µg/mL de Extrato bruto; Tratamento 6 – 12 µg/mL de Extrato bruto;
Tratamento 7 – 900 µg/mL de Extrato liofilizado; Tratamento 8 – 800 µg/mL de Extrato
liofilizado; Tratamento 9 – 450 µg/mL de Extrato liofilizado; Tratamento 10 – 130 µg/mL
de Extrato liofilizado; Tratamento 11 – 13 µg/mL de Extrato liofilizado; Tratamento 12 –
1860 µg/mL de Extrato micelial; Tratamento 13 – 930 µg/mL de Extrato micelial;
Tratamento 14 – 860 µg/mL de Extrato micelial; Tratamento 15 – 280 µg/mL de Extrato
micelial; Tratamento 16 – 28 µg/mL de Extrato micelial. Médias seguidas pelas mesmas
letras não diferem entre si, pelo teste Tukey, a 5% de significância.
55
Durante a condução e avaliação do ensaio observou-se que o micélio de M.
oryzae crescia uniformemente pela placa, mas não se observou diferenças entre o
crescimento horizontal e vertical do patógeno. Por isso, foi realizada apenas a análise
horizontal.
Alguns tratamentos diminuíram o crescimento micelial de M. oryzae na
horizontal e radial quando comparados com o controle (M. oryzae). Na horizontal, os
tratamentos que se destacaram foram: tratamento 2 (1040 µg/mL - EB), 3 (700 µg/mL -
EB), 6 (12 µg/mL - EB), 4 (520 µg/mL - EB), 5 (120 µg/mL - EB), 7 (900 µg/mL - EL) e
12 (1860 µg/mL - EM). Os tratamentos 2 (1040 µg/mL - EB), 3 (700 µg/mL - EB), 6 (12
µg/mL - EB), 4 (520 µg/mL - EB) e 5 (120 µg/mL - EB) também apresentaram uma
diminuição do diâmetro radial de M. oryzae significativa quando comparado com o
controle (Figura 15A).
O tratamento 3 (700 µg/mL - EB) foi o que apresentou significativamente
maior ação inibitória sobre o crescimento micelial na horizontal (77,86%) e radial
(72,61%) de M. oryzae. O tratamento 6 (12 µg/mL - EB) foi o que apresentou o segundo
melhor resultado com 59,14% e 37,37% de redução do diâmetro horizontal e radial de M.
oryzae, respectivamente. O tratamento 4 (520 µg/mL - EB) também diferiu de forma
significativa do controle com 55,37% na horizontal e 40,03% na análise radial. Verificou-
se que o tratamento 5 (120 µg/mL - EB) reduziu o diâmetro horizontal e radial do patógeno
em 55,37% e 41,73%, respectivamente (Figura 15B).
Verificou-se que o EB mostrou os melhores resultados para a inibição do
crescimento micelial do patógeno tanto na horizontal quanto no crescimento radial,
seguido dos extratos liofilizado e do micélio. Esses resultados mostram que os metabólitos
presentes no extrato bruto atuam em um sinergismo, ou seja, as ações combinadas das
moléculas presentes no extrato cooperam para a redução do crescimento do patógeno.
Além disso, pode-se perceber que o extrato bruto pode conter moléculas bioativas que não
estão presentes nos outros extratos (liofilizado e micélio) e, por isso, deve-se estudar e
purificar com mais profundidade estes extratos até se obter as moléculas. Esses resultados
corroboram o estudo químico do isolado de Rhizoctonia sp., pois os fenóis presentes no
extrato bruto podem ser os responsáveis por essa inibição do crescimento micelial de M.
oryzae.
56
Na literatura são encontrados alguns exemplos de metabólitos antagônicos, in
vitro, à M. oryzae. Côrtes et al. (2012) ao avaliarem a ação do metabólito extracelular
produzido por Sarocladium oryzae sobre o desenvolvimento micelial de M. oryzae,
observaram resultados semelhantes aos encontrados no presente trabalho. Constataram
ainda, uma relação linear inversa entre o metabólito e o crescimento micelial do patógeno.
O tratamento que mais inibiu o diâmetro do isolado patogênico foi o que continha a maior
concentração do extrato, reduzindo em até 80% o crescimento da colônia. Kawamata et al.
(2004) verificaram que os extratos metanólicos de cinco isolados de P. oryzae inibiram o
crescimento micelial de M. oryzae.
Li et al. (2011) observaram que o filtrado do isolado JK-1 de Streptomyces
globisporus inibiu o crescimento micelial de M. oryzae de 6,7% a 90,9%. Ainda
observaram que as maiores concentrações de 5, 10 e 20% foram as que proporcionaram as
maiores reduções do micélio de M. oryzae. Bettiol (1988) avaliou a termoestabilidade dos
metabólitos produzidos por B. subtilis capazes de controlar M. oryzae, e constatou
atividade antagônica dos mesmos através da aplicação em sementes e parte aérea.
4.3.2 Efeito dos extratos do isolado micorrízico Rhizoctonia sp. na
germinação de conídios e formação de apressórios de M. oryzae
Nos dois ensaios, o início da germinação de conídios ocorreu 6 horas após a
indução em superfície artificial. Com relação à porcentagem de conídios germinados, no
primeiro ensaio não houve diferença estatística dos três extratos em comparação ao
controle, 24 horas após a condução do experimento (Figura 16A). Por outro lado, no
segundo ensaio, seis e 24 horas após a indução verificou-se diferença estatística dos três
extratos em relação ao controle (Figura 16B-C).
57
Figura 16. Efeito dos metabólitos de Rhizoctonia sp. na germinação de conídios. A – 24 horas após a
indução em superfície artificial para o primeiro ensaio; B – 6 horas após a indução em
superfície artificial para o segundo ensaio; C – 24 horas após a indução em superfície
artificial para o segundo ensaio. Extrato do micélio – 0,93 µg.µL-1
; Extrato bruto – 0,52
µg.µL-1
; Extrato liofilizado – 0,45 µg.µL-1
. Controle (M. oryzae) sem extrato – 0. Médias
seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si, pelo teste Tukey, a 5%
de probabilidade.
58
Para a formação do apressório, no primeiro e segundo ensaios, o extrato bruto
(0,52 µg.µL-1) se destacou diferindo estatisticamente do controle inibindo a formação do
apressório em 100% (Figuras 17; 18).
Figura 17. Ensaio de germinação de conídios e formação de apressório em Magnaporthe oryzae pelos
extratos: bruto, liofilizado e micelial. A: Magnaporthe oryzae mostrando os conídios,
conídios germinados e apressório (seta); B: Presença do extrato bruto – conídio
germinando com uma pequena deformação e sem apressório. Aumento 40X.
59
Figura 18. Efeito dos metabólitos de Rhizoctonia sp. na formação de apressório de Magnaporthe
oryzae. A - após 24 horas da indução em superfície artificial para o primeiro ensaio; B –
após 6 horas da indução em superfície artificial para o segundo ensaio; C - após 24 horas
da indução em superfície artificial para o segundo ensaio. Extrato do micélio – 0,93
µg.µL-1
; Extrato bruto – 0,52 µg.µL-1
; Extrato liofilizado – 0,45 µg.µL-1
. Testemunha (M.
oryzae) sem extrato – 0. Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente
entre si, pelo teste Tukey, a 5% de probabilidade.
60
Sena (2012) ao avaliar o efeito do filtrado de Epicoccum sp. na germinação dos
conídios e na formação do apressório de M. oryzae, verificou que todas as concentrações
testadas diferiram do controle, em todos os períodos avaliados. Observou que as
concentrações de 6 e 8 mg.ml-1
do filtrado aplicado às 12 e 20 horas após a indução
reduziram a formação de apressórios em 97,7% e 95,68%, respectivamente. Kawamata et
al. (2004) verificaram que cinco isolados de P. oryzae inibiram completamente a
germinação de conídios de M. oryzae. Madrigal et al. (1991) isolaram um composto
bioativo de Epicoccum nigrum conhecido como flavipina e o testaram em experimentos in
vitro de germinação de conídios. Os autores verificaram que a flavipina na concentração de
200 μg.ml-1
reduziram a germinação de conídios de Monilia laxa em 30%.
Shan et al. (2013) ao estudar o efeito do filtrado do isolado BC79 de Bacillus
methylotrophicus no processo de germinação de conídios, verificaram que o filtrado
causou má formação do tubo germinativo e uma intumescência que impedia a extensão do
micélio e, consequentemente levou a perda da infectividade quando comparado ao
controle. Li et al. (2011) ao estudarem o efeito do filtrado do isolado JK-1 de Streptomyces
globisporus observaram que o mesmo inibiu a germinação de conídios e a formação do
apressório de M. oryzae.
Sabe-se que a formação do apressório em M. oryzae envolve processos
morfogênicos influenciados por sinais químicos (cutícula foliar) ou físicos
(hidrofobicidade da superfície foliar). Além disso, as rotas metabólicas envolvidas na
formação do apressório participam do crescimento e desenvolvimento dos patógenos (Lee
et al., 2003). Assim, para impedir que o patógeno se fixe na planta de arroz é necessário
inibir a formação do apressório. No presente trabalho, o extrato bruto foi o que apresentou
o melhor resultado quanto a inibição da formação do apressório, corroborando o ensaio de
inibição micelial em que o extrato bruto foi o que mais reduziu o crescimento do micélio
de M. oryzae. Por isso, as concentrações desse ensaio foram selecionadas para o estudo de
supressão de brusone foliar in vivo.
61
4.4 SUPRESSÃO DE BRUSONE FOLIAR POR METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS EXTRAÍDOS DO ISOLADO MICORRÍZICO Rhizoctonia
sp.
Foram conduzidos dois ensaios para avaliar a supressão de brusone foliar.
Ensaio 1: Observou-se que todos os tratamentos diferiram significativamente do controle.
No entanto, não houve diferença estatística entre os extratos (Figura 19).
Figura 19. Severidade de brusone foliar aos sete dias após a inoculação. Tratamento 1 (testemunha);
Tratamento 2 (1040 µg/mL e M.o3x105
- EB); Tratamento 3 (900 µg/mL e M.o3x105
-
EL); Tratamento 4 (1860 µg/mL e M.o3x105
- EM); Tratamento 5 (700 µg/mL e M.o3x105
- EB); Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente entre si, pelo teste
Tukey, a 5% de probabilidade.
No entanto, verificou-se visualmente que os tratamentos 4 (1860 µg/mL +
M.o3x105
- EM) e 2 (1040 µg/mL + M.o3x105
- EB) apresentaram menores severidades
que os outros tratamentos. Isso foi evidenciado pela morfologia das lesões, ou seja, as
folhas do tratamento 2 (1040 µg/mL + M.o3x105
- EB) apresentaram lesões menores, com
as bordas maiores e mais escuras. Além disso, observou-se pontos escuros (lesões de
hipersensibilidade) nas folhas o que caracteriza que esse extrato foi eficiente, pois impediu
a extensão da doença (Figura 20). Na supressão da brusone destacou-se o tratamento 4
(1860 µg/mL + M.o3x105
- EM) com eficiência de controle de 59,27%, embora não tenha
diferenciado estatisticamente dos demais.
0
2
4
6
8
10
12
1 2 5 3 4
Sev
erid
ad
e d
e b
ruso
ne
foli
ar
(%)
Tratamentos
a
b b
b
b
62
Figura 20. Efeito dos extratos do isolado de Rhizoctonia sp. na severidade da brusone foliar, em
condições de casa de vegetação. A: Água; B: Tratamento 1 (M.o 3X105); C: Tratamento 2
(1040 µg/mL + M.o3x105
- EB); D: Tratamento 3 (900 µg/mL + M.o3x105
- EL); E:
Tratamento 4 (1860 µg/mL + M.o3x105
- EM); F: Tratamento 5 (700 µg/mL + M.o3x105
-
EB).
Ensaio 2: foi observado que aos quatro dias após a inoculação, o tratamento 4
(1860 µg/mL + M.o3x105
- EM) foi o único que apresentou menor severidade de brusone
em relação ao controle, com supressão de 38,75%. Além disso, verificou-se também
diferença significativa entre os tratamento 4 (1860 µg/mL + M.o3x105
- EM) e 3 (900
µg/mL + M.o3x105
- EL). Aos seis dias após a inoculação, não se observou diferença
estatística entre os tratamentos. Para a avaliação realizada aos oito dias após a inoculação,
observou-se que todos os tratamentos diferiram estatisticamente do controle, destacando-se
os tratamentos 2 (1040 µg/mL + M.o3x105
- EB) e 4 (1860 µg/mL + M.o3x105
- EM) que
proporcionaram 77,64% e 64,63% de supressão, respectivamente (Tabela 5). Para a
AACPD destacou-se o tratamento 2 (1040 µg/mL + M.o3x105
- EB) com a menor AACPD
de 5,6 enquanto o controle alcançou 7,46. Essa diferença representou 24,94% de supressão
da doença em relação ao controle (Tabela 5; Figura 21).
63
Tabela 5. Efeito da inoculação dos três extratos - EB (extrato bruto), EL (extrato liofilizado),
EM (extrato micelial) do isolado micorrízico de Rhizoctonia sp. na severidade de
brusone nas folhas (SBF%) e da Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença
(AACPD) durante a supressão e o antagonismo in vivo, quatro, seis e oito dias
após a inoculação de Magnaporthe oryzae.
Tratamentos SBF(%) aos 4
dias após M.
oryzae
SBF(%) aos 6
dias após M.
oryzae
SBF(%) aos 8
dias após M.
oryzae
AACPD
T1 M.o 3x105
0.49a 3.42a 14.56a 7.46b
T3 900 µg/mL e
M.o 3x105 (EL)
0.46a 2.56a 6.79b 7.47b
T5 700 µg/mL e
M.o 3x105 (EB)
0.44ab 3.74a 6.37b 9.20a
T2 1040 µg/mL e
M.o 3x105 (EB)
0.43ab 1.41a 3.25b 5.60c
T4 1860 µg/mL e
M.o 3x105 (EM)
0.30b 2.70a 5.15b 7.96ab
Figura 21. Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença (AACPD) dos tratamentos avaliados a
partir do primeiro dia de aparecimento de sintomas. 1 (M.o 3X105); 2 (1040 µg/mL e
M.o3x105
- EB); 3 (900 µg/mL e M.o3x105
- EL); 4 (1860 µg/mL e M.o3x105
- EM); 5
(700 µg/mL e M.o3x105 - EB).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
2 4 6 8
Sev
erid
ad
e d
e b
ruso
ne
foli
ar
(%)
Dias após inoculação com M. oryzae
5
4
3
2
1
64
O tratamento 2 (1040 µg/mL + M.o3x105 - EB) se destacou aos oito dias após a
inoculação com M. oryzae e também para a AACPD corroborando mais uma vez os
experimentos de isolamento dos metabólitos. Os fenóis presentes no extrato bruto do
isolado de Rhizoctonia sp. possivelmente são os responsáveis pela supressão da brusone
foliar em M. oryzae.
Sena (2012) ao testar o filtrado de Epicoccum sp. na supressão de brusone
foliar observou que o tratamento 4 mg.ml-1
representou 27,06% de eficiência na supressão
da doença em relação a testemunha e a menor AACPD de 10.
Experimentos conduzidos em estufa, com o filtrado do isolado BC79 de
Bacillus methylotrophicus, no controle de M. oryzae mostraram 89,87% de eficiência
quando o filtrado foi inoculado 24 horas antes de M. oryzae. No entanto, quando
pulverizou-se o fungicida tricyclazol (20%) observou-se uma eficiência de controle de
70,8% que foi menor do que quando usado o filtrado da cultura (Shan et al., 2013). Li et al.
(2011) ao avaliar o efeito do filtrado do isolado JK-1 de S. globisporus na supressão da
brusone foliar em condições controladas, verificaram que a redução da supressão da
doença foi de 89,1% quando o filtrado foi aplicado 24 horas antes do patógeno diferindo
do tratamento com tricyclazol a 750 μg/ml que obteve 87,6% de supressão.
Sousa (2012) classificou o isolado En07 do presente estudo como Rhizoctonia
multinucleada e sabe-se que as RBN são capazes de exercer indução de resistência ou
competição por nutrientes sobre os mais variados patógenos foliares, de solo e raiz, e que
as mesmas são supressoras de fitopatógenos (Pascual et al., 2000; Sneh et al., 2004; Jabaji-
Hare & Neate, 2005; Khan et al., 2005; Wen et al., 2005; Basseto et al., 2008).
A caracterização do antagonismo in vitro e in vivo, por um produto bioativo de
fungo micorrízico do cerrado contribuíra como mais um agente de controle biológico a ser
inserido no manejo integrado da brusone do arroz. São necessários estudos posteriores das
moléculas responsáveis pelo antagonismo para se saber se estas também são elicitoras de
indução de resistência.
65
5 CONCLUSÕES
O isolado micorrízico Rhizoctonia sp. foi o que apresentou o melhor antagonismo in
vitro sobre M. oryzae;
Possivelmente, as classes de metabólitos presentes nos três extratos são as mesmas e do
tipo fenol;
O extrato bruto inibiu a formação do apressório de M. oryzae;
O extrato bruto diminuiu a severidade da brusone nas folhas;
Os metabólitos produzidos pelo fungo Rhizoctonia sp. mostraram antagonismo in vitro
e in vivo à M. oryzae;
São necessários estudos posteriores com esses extratos para se identificar as moléculas
elicitoras durante os estágios iniciais da interação arroz – M. oryzae. Também se faz
necessário estudos de indução de resistência para se saber se além de antagônicos são
indutores.
66
6 REFERÊNCIA
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