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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
CÂMPUS UNIVERSITARIO DE SINOP
INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS
Diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio presentes em solos e plantas
de Brachiaria brizantha cv. Marandu cultivadas em sistemas integrados
Bruce Raphael Alves Rodrigues
Engenheiro Agrônomo
2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
CÂMPUS UNIVERSITARIO DE SINOP
INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS
Diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio presentes em solos e plantas
de Brachiaria brizantha cv. Marandu cultivadas em sistemas integrados
Bruce Raphael Alves Rodrigues
Orientador: Prof. Dr. Anderson Ferreira
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Agronomia, como parte das
exigências para a obtenção do título de Mestre em
Agronomia. Área de concentração: Ecologia e
Genética Microbiana.
Junho de 2018
Folha de aprovação
Ficha Catalográfica
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
Bruce Raphael Alves Rodrigues – Filho de Valdevino Rodrigues Cabral
e Ramony Alves nasceu em 12 de abril de 1986, na cidade de Cacoal, estado de
Rondônia. Em 2007, ingressou no curso de Agronomia pela Universidade
Federal de Mato Grosso (UFMT), campus universitário de Sinop- MT, obtendo o
título de Engenheiro Agrônomo em 2015. Em Fevereiro de 2016 ingressou no
curso de Mestrado em Agronomia pelo Programa de Pós-Graduação em
Agronomia pela mesma instituição, obtendo o título de Mestre em Agronomia em
2018.
"Nas grandes batalhas da vida, o primeiro
passo para a vitória é o desejo de vencer”.
Mahatma Gandhi
DEDICATÓRIA
Dedico o presente trabalho aos meus pais, Valdevino Rodrigues Cabral e
Ramony Alves, pelo incentivo e confiança depositados em mim ao longo desses
anos, minha irmã, Bruna Vanessa Alves Rodrigues e minha namorada, Estela
Kamila Lorenzetti Lemke, por sempre me incentivar. Muito obrigado a todos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por me dar saúde, sabedoria e fé para a concretização
dos meus objetivos.
Aos meus pais, Valdevino e Ramony pela educação, incentivo, por
participarem de mais uma etapa concluída.
À Minha irmã Bruna, por estar presente nessa etapa.
A Universidade Federal de Mato Grosso- Campus de Sinop e ao
Programa de Pós Graduação em Agronomia pela oportunidade de estudo desde
a graduação ate a realização deste Mestrado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior –
CAPES e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso –
FAPEMAT, pela concessão da bolsa de estudo.
Aos professores do curso de Pós-Graduação em Agronomia, por todo o
conhecimento transmitido.
Ao meu orientador, Dr. Anderson Ferreira, pela orientação, incentivo,
confiança, amizade, e pela contribuição na minha formação profissional. Muito
Obrigado.
Obrigado a todos da Embrapa pela contribuição para realização deste
projeto.
Aos técnicos do laboratório de Biologia Molecular, Joyce e Ana, sem a
participação de vocês não seria possível a realização deste projeto.
Agradeço aos meus amigos que a Embrapa proporcionou e que
participaram intensamente para a conclusão desta etapa, Lucilene, Camila
Medeiros, Eliza de Lara, Betânia. Ao Grupo “Escritório do Tereré”.
Ao meu amigo Antonio Okada, que desde a graduação se faz presente
sem sua insistência não teria nem começado, Claudemir Buck Jr, Lucas Alves
pelas longas conversas.
Ao meu amigo Juliano Martins Coelho, e à sua Família, Dalzira (Mãe),
Paulo (Pai) e Júnior (irmão), (In Memorian), que sempre me abraçaram como um
membro da família e se conclui esta etapa vocês também têm parte nesta
conquista. Meus Sinceros Agradecimentos!!!
SUMÁRIO
Páginas
SUMÁRIO.................................................................................................................... x
RESUMO .................................................................................................................. xii
ABSTRACT . ............................................................................................................ xiii
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS ............................................................ 13
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 13
2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 15
2.1 Brachiaria brizantha cv. Marandu .................................................................... 15
2.2 Nitrogênio ........................................................................................................ 16
2.3 Fixação Biológica de Nitrogênio - FBN ............................................................ 17
2.4 Microrganismos Endofíticos ............................................................................. 19
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 21
CAPÍTULO 2 - DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS FIXADORAS DE NITROGÊNIO
PRESENTES NA RIZOSFERA, RAIZ, PARTE AÉREA E SEMENTES DE Brachiaria
brizantha cv. Marandu ............................................................................................... 26
RESUMO .................................................................................................................. 26
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 27
2. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 29
2.1 Descrição do Estudo ........................................................................................ 29
2.2 Área da Coleta ................................................................................................. 29
2.3 Material Vegetal ............................................................................................... 29
2.4 Isolamento de Bactérias Endofíticas cultivadas ............................................... 30
2.5 Quantificação de bactérias cultivadas ............................................................. 30
2.6 Bactérias Fixadoras de Nitrogênio ................................................................... 30
2.7 Identificação molecular dos isolados bacterianos ............................................ 31
2.8 Análises Estatísticas ........................................................................................ 32
3.0 RESULTADO E DISCUSSÃO ............................................................................. 33
3.1 Isolamento de bactérias cultivadas .................................................................. 33
3.2 Fixação Biológica de Nitrogênio ...................................................................... 35
4. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 41
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 42
Capítulo 3 - Diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio presentes no solo sob
três sistemas de cultivo de Brachiaria brizantha cv. Marandu ................................... 47
RESUMO................................................................................................................... 47
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 48
2. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 50
2.2 Isolamento ....................................................................................................... 51
2.3 Quantificação de Bactérias Cultivadas ............................................................ 51
2.4 Caracterização para o isolamento ................................................................... 52
2.5 Caracterização quanto a Fixação Biológica de Nitrogênio ............................... 52
2.6 Análises Estatísticas ........................................................................................ 53
3. RESULTADOS ................................................................................................... 54
4. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 56
5. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 58
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 59
7. AGRADECIMENTOS .......................................................................................... 62
RESUMO – A pecuária brasileira é uma das mais produtivas no mundo
contribuindo na economia do país nos últimos anos. O setor atualmente concentra-
se em grandes propriedades que pauta-se na produção de carne, haja vista que
esse produto é o mais valorizado e voltado para a exportação. A pecuária está
dividas em dois tipos, pecuária intensiva, que consiste no cultivo de animais em
confinamento, e extensiva, que consiste na criação de animais soltos com a base da
alimentação de pastagens. A adoção de capins selecionados alavancou a
capacidade de suporte e também o desenvolvimento animal entre as cultivares
utilizadas temos a Brachiaria brizantha cv. Marandu, que se destaca por apresentar
qualidades de interesse, associado a pastagens podemos encontrar a diversidade
microbiológica junto ao solo e as plantas, onde diversas pesquisas no setor
atualmente são desenvolvidas na busca por novos isolados que possam
proporcionar benefícios no desenvolvimento das plantas como nas raízes, a melhora
na absorção de nutrientes do solo e também a fixação biológica de nitrogênio.
Assim, o objetivo desta pesquisa foi avaliar a quantidade e a diversidade de
bactérias fixadoras de nitrogênio presentes no solo e associada a plantas de
Brachiaria brizantha cv. Marandu, em Sinop - Mato Grosso, Brasil. Os isolamentos
foram realizados em solo, rizosfera, raiz, parte aérea e semente. O teste de fixação
biológica de nitrogênio foi realizado utilizando meio de cultura NFb semissólido. Dos
360 isolados testados 30 isolados da raiz, 29 da rizosfera, 20 isolados da parte
aérea e 14 isolados da semente apresentaram capacidade de fixar nitrogênio.
ABSTRACT - Brazilian cattle ranching is one of the most productive in the world
contributing to the country's economy in recent years. The sector currently
concentrates on large properties that are focused on meat production, since this
product is the most valued and export-oriented. Livestock is divided into two types,
intensive livestock, which consists of the cultivation of animals in confinement, and
extensive, which consists of the breeding of loose animals with the grassland feeding
base. The adoption of selected grasses leveraged the support capacity and also the
animal development among the cultivars used have the Brachiaria brizantha cv.
Marandu, which stands out for presenting qualities of interest, associated with
pasture we can find the microbiological diversity near the soil and plants, where
several researches in the sector are currently developed in the search for new
isolates that can provide benefits in the development of plants as in the roots ,
improved soil nutrient uptake and biological nitrogen fixation. Thus, the objective of
this research was to evaluate the amount and diversity of nitrogen fixing bacteria
present in the soil and associated with Brachiaria brizantha cv. Marandu, in Sinop -
Mato Grosso, Brazil. Isolations were performed on soil, rhizosphere, root, shoot and
seed. The biological nitrogen fixation test was performed using semi-solid NFb
culture medium. Of the 360 isolates tested 30 isolates of the root, 29 of the
rhizosphere, 20 isolates of the aerial part and 14 isolates of the seed showed the
capacity to fix nitrogen.
13
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1. INTRODUÇÃO
A produção agrícola brasileira pela sua excelência na produtividade de grãos
e cereais, e, apesar deste cenário otimista nos últimos anos tem se observado nas
áreas produtoras um desequilíbrio ambiental esse desequilíbrio normalmente é
ocasionado pela intensa exploração das áreas e aliado com a falta de planejamento
e estudo dos ecossistemas provoca sérias perdas na biodiversidade do solo e de
recursos não renováveis essenciais para o desenvolvimento das plantas (ZILLI et al.,
2003).
Essa biodiversidade do solo tem como componente diversos microrganismos
que desempenham funções significativas no equilíbrio dos sistemas produtivos,
como a ciclagem de nutrientes, a transformação da matéria orgânica e a fixação
biológica de nitrogênio (ANDREOTE; CARDOSO, 2016).
O processo de fixação biológica do nitrogênio (FBN) é realizado por bactérias
denominadas diazotróficas presentes no solo ou associadas às plantas de maneira
endofítica (EMBRAPA, 2018). A contribuição mais conhecida da FBN acontece de
forma simbiótica com as plantas da família Leguminosae formando estruturas nas
raízes chamadas de nódulos que possuem a capacidade de fixar o nitrogênio
atmosférico em compostos orgânicos que são utilizados pelas plantas (HUNGRIA et
al., 2007).
Esse recurso de fixar o N nas raízes por meio de nódulos é realizado somente
em plantas como a soja. Em gramíneas esse processo de nodulação não acontece e
a fixação de N é muito baixa assim o desenvolvimento da cultura acaba dependendo
da complementação de adubação nitrogenada (EMBRAPA a 2018).
Dentre as baquiárias existentes uma das mais cultivadas no país é o Capim
Marandu que é uma espécie resistente a ação das pragas da cultura tornado assim
opção para sistemas de consorciação com leguminosas, recomendada para a
14
formação de pastagens em áreas declivosas, pois controla bem a erosão, além de
ser uma espécie indicada para sistemas silvipastoril (ALVIM et al., 2002).
Recentemente a Embrapa passou a indicar e recomendar o uso de estirpes
do gênero Azospirillum em pastagens de Brachiaria brizantha, devido às condições
climáticas favoráveis no país as pastagens podem agregar grande potencial
produtivo no setor pecuário brasileiro áreas com cultivo de pastagem no país
(HUNGRIA & NOGUEIRA, 2017).
Durante o desenvolvimento o Capim Marandu pode se associar com
microrganismos que estão presentes no solo, na rizosfera, nas raízes, nas folhas e
sementes e essas interações possibilitam novas perspectivas para o estudo do
sistema solo – planta – microrganismo com o capim Marandu.
Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi avaliar a diversidade de bactérias
fixadoras de nitrogênio presentes no solo e associada a plantas de Brachiaria
brizantha cv. Marandu, cultivado com pastagens sob sistemas integrados.
15
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Brachiaria brizantha cv. Marandu
Os capins do gênero Brachiaria englobam cerca de 90 espécies, têm
distribuição tropical tendo seu centro de origem primário a África Equatorial (GHISI,
1991; CRISPIM; BRANCO, 2002). No Brasil, como forrageira é conhecida desde a
década de 1950 (ALCÂNTARA, 1986), conta-se que as braquiárias entraram no
Brasil juntamente com os escravos, pois serviam como colchão nos navios
negreiros. As gramíneas do gênero Brachiaria são utilizadas como pastagens sendo
amplamente empregadas nas fases de cria, recria e engorda dos animais (GHISI,
1991; CRISPIM; BRANCO, 2002; PACIULLO, et al. 2016).
Dentre as espécies do gênero e de maior impacto econômico encontra-se a
B. brizantha, sendo uma forrageira cosmopolita, originária de regiões vulcânica onde
os solos geralmente apresentam bons níveis de fertilidade. (NUNES et al., 1985). É
uma espécie indicada como alternativa para os solos dos cerrados com média e boa
fertilidade, devido à sua alta produção de forragem, persistência, boa capacidade de
rebrota tolerância ao fogo, frio, seca e resistência ao ataque das cigarrinhas – das –
pastagens (RIOS, 2015).
A Brachiaria brizantha cv. Marandu comumente chamado de Capim Marandu
ou Braquiarão é o mais utilizado na formação de pastagens no Brasil, lançado pela
Embrapa Gado de Corte e Embrapa Cerrados no ano de 1984, esse capim
representa uma excelente opção para a alimentação de bovinos, especialmente nas
fases de cria, recria e engorda (PEREIRA; COSTA, 2016). No Brasil a área dedicada
à pastagem corresponde 115 milhões de hectares da quais aproximadamente 51,4
milhões são estabelecidos com o cultivar B. brizantha cv. Marandu, que
correspondem a 50% das pastagens plantada e 38% do mercado de exportação de
sementes forrageiras (PEREIRA; COSTA, 2016).
Indica-se o plantio do capim Marandu em linhas de 50 cm de distância ou na
técnica de lanço com profundidade de 2 cm, seu crescimento é característico em
forma de touceira, o melhor período para a cultura é durante as estações das
chuvas, podendo ser consorciado a outras culturas como Arachis, soja perene e
calopogônio, quando estabelecido plantio permite os primeiros pastejos aos 90 dias,
16
com produção de massa seca em torno de 18 ton./ha/ano (CRISPIM; BRANCO,
2002).
O capim Marandu é uma cultura de ciclo curto e perene, cespitoso, com 1,5 a
2,5 m com colmos iniciais prostrados, produzindo perfilhos eretos. Possui rizomas
curtos e encurvados e suas sementes são ligeiramente maiores que as das outras
espécies (NUNES et al., 1984).
O capim Marandu proporciona boa cobertura do solo, com alta capacidade
competitiva com plantas invasoras, de estabelecimento rápido, e responsivo à
adubação nitrogenada (FEITOSA, 2017; ALVIM et. al., 1990), em Brachiaria spp., as
fixadoras fornecem parte do N responsável pelo desenvolvimento vegetal, suprindo
até 40 kg N ha-1 (BODDEY; VICTORIA, 1986; BRAZ et al., 2013; DIAS, 2015).
2.2 Nitrogênio
O nitrogênio é um constituinte básico das proteínas, vitaminas e sais minerais,
fundamental na nutrição animal e sintetizado pelas plantas a partir de carboidratos
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Considerado um elemento versátil devido tanto à sua
variação nos estados de oxidação, - 3 (NH3) a + 5 (NO3), quanto à sua variação nas
suas formas, orgânica ou inorgânica (ALVIM, 2017). A principal fonte desse
elemento é a atmosfera (78% de sua composição), de todos os elementos que
circulam o sistema solo – planta - atmosfera, o que sofre maior número de
transformações bioquímicas no solo é o nitrogênio (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
O destino final do nitrogênio aplicado no solo é imprevisível podendo ser
absorvido pela cultura, imobilizado no solo ou perdido por meio da lixiviação e
desnitrificação. Estima-se que apenas 40% do N - mineralizado, é absorvido pelas
plantas, indicando constantes perdas de N por lixiviação no solo ou por emissão da
atmosfera, o processo de desnitrificação e lixiviação são os principais processos de
perdas do N no solo contribuindo com 72% total de N perdido verifica – se que a
principal via de adição de N no sistema solo – planta se dá através da fixação
contribuindo com mais do dobro do que é aplicado via fertilizante mineral
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Aproximadamente 73% do N que é consumido no Brasil é derivado de
importação (HUNGRIA, 2011). No ano de 2010 o Brasil consumiu aproximadamente
2,9 milhões de toneladas de fertilizantes a base de nitrogênio, 3,4 milhões de
17
toneladas de P2O5 fertilizantes com base em fósforo e 3,9 milhões de toneladas de
K2O com base em fertilizantes potássico, a produção brasileira de fertilizantes
corresponde apenas a 27% do N, 55% dos adubos fosfatados e 10% dos adubos
potássicos assim o mercado brasileiro é dependente de importações de fertilizantes
para suprir a necessidade das culturas durante o período de safra (ANDA, 2011).
A utilização de fertilizantes nitrogenados é um dos fatores que mais oneram
os custos de produção (MAPA, 2016). Em sistemas de médio nível tecnológico são
recomendadas doses de nitrogênio entre 100 a 150 kg/ha/ano aplicadas em
cobertura na época chuvosa do ano. Para os sistemas intensivos de produção
animal as doses recomendadas de N são de 200 a 300 kg/ha/ano de N e
fracionadas em doses de 50 kg/ha. (PACIULLO et al., 2016).
O desenvolvimento de tecnologias que buscam minimizar os impactos na
cadeia produtiva agrícola, faz da Fixação Biológica de Nitrogênio - FBN uma
alternativa que possibilita melhorar a capacidade agrícola, diminuindo assim a
necessidade do país na utilização de adubação nitrogenada (MAPA, 2016).
2.3 Fixação Biológica de Nitrogênio - FBN
A FBN é um processo natural catalizado pela enzima nitrogenase mediado
por microrganismos denominados de diazotróficos conseguem reduzir o nitrogênio
atmosférico (N2) a compostos amoniacais que podem ser utilizados pelas plantas
(JUNIOR; REIS, 2007; MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Estima-se que cerca de 15 milhões de toneladas de N2 são fixadas por ano
nos ecossistemas terrestres através dos microrganismos fixadores de nitrogênio
(MARCHETTI; BARP, 2015; MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). O processo de
identificação deste fenômeno surgiu a partir da pesquisa para adaptação de
espécies cultivadas em condições tropicais.
A fixação biológica é uma alternativa sustentável para a substituição do uso
na adubação nitrogenada (MAPA, 2016). A alta eficiência no processo permite o
aumento na produção agrícola, sem causar impacto ambiental (MARCHETTI; BARP,
2016).
No Brasil esse processo é responsável pela substituição total do uso de
adubos nitrogenados nas lavouras de soja com baixo custo de investimento em
18
torno do R$ 8,00 por hectare apesar do alto investimento em pesquisa e tecnologia
(EMBRAPA b, 2018).
A fixação biológica do N envolve processos que começam com a adaptação
da bactéria à planta e terminam na fixação do N2 atmosférico esses microrganismos
apresentam uma alta diversidade morfológica, fisiológica, genética e filogenética
(FAGAN et al., 2007).
Os fixadores podem ser encontrados em sistemas aeróbios como os
(Rhizobium, Bradyrizobium, Azospirillum, Burkholderia), anaeróbios (Clostridium etc.)
e anaeróbios facultativos (Klebsiella spp.), sendo a maioria dos fixadores de N2 de
vida livre podendo ocorrer em todos os tipos de solo, rizosfera e interna e
externamente nas plantas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
No processo biológico, a energia utilizada é o ATP, produzido através da
energia solar e convertido a energia química. A nitrogenase é composta por duas
unidades básicas: uma de ferro - proteína que coleta a força redutora e energia, e
outra ferro - molibdênio, que coleta e reduz o substrato (MOREIRA; SIQUEIRA,
2006). A FBN é representada pela seguinte equação nas condições normais de
temperatura e pressão (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006):
N2 + 8H+ + 16 ATP + 8 e- Nitrogenase 2NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi
No Brasil a FBN quando utilizada na soja reduziu totalmente o uso de
fertilizantes nitrogenados a partir de inoculantes com linhagens de Rhizobium, onde
até 94% do N requerido pode ser disponibilizado por meio da FBN (ASSUMPÇÃO,
2008).
Diversos estudos mostram a eficiência da FBN e promoção de crescimento
vegetal em culturas de interesse, Mundim (2016), demonstrou que a utilização de
Azospirillum brasilense em diferentes doses de nitrogênio proporcionou efeitos na
produção de massa seca e massa verde em Brachiaria Marandu.
Santos (2015), observou, a presença de Burkholderia, Enterobacter,
Klebisiella e Pantoea no estudo de promoção de crescimento vegetal em cana de
açúcar, para Dos Santos (2010), demonstrou que o genótipo de sorgo granífero
19
apresentou incrementos de 10% na produtividade de grãos com a utilização de
bactérias fixadoras.
As fixadoras de nitrogênio podem ser encontradas no solo e quando
associadas às plantas, em tecidos como raízes, nas folhas ou em sementes são
caracterizados como microrganismos endofíticos podendo possuir grande potencial
biotecnológico.
2.4 Microrganismos Endofíticos
Os Microrganismos endofíticos são microrganismos que colonizam os tecidos
de plantas vivas sem causar doenças durante o seu ciclo de vida (AZEVEDO, 1998).
Os endofítos são relatados em diversos tecidos vegetais como nas raízes, nas
folhas e sementes (SILVA et al., 2006, HALLMANN et al., 1997). Provavelmente
desenvolveram uma íntima relação com a planta hospedeira podendo assim
influenciar a fisiologia da planta (EMBRAPA c, 2018).
A instalação dos endofíticos no hospedeiro pode ocorrer por meio da
produção de enzimas ou estruturas que facilitem a sua penetração no tecido ou
também por aberturas naturais como estômatos, hidatódios, ferimentos via raiz e
semente (DÖBEREINER et al., 1993; ASSUMPÇÃO, 2008), colonizando assim a
planta de maneira sistêmica. Os microrganismos endofíticos demonstram
habilidades de se adaptarem a nichos ecológicos específicos (HALLMANN et al.,
1997; ASSUMPÇÃO, 2008).
A colonização das plantas por organismos endofíticos parece é uma
alternativa viável, pois os endofíticos podem explorar os recursos nutricionais sem a
forte competição com microrganismos do meio externo das plantas (BERG, 2009). A
diversidade metabólica dos endofíticos faz destes uma fonte com grande potencial
na produção de bioprodutos onde essa diversidade ainda é pouco estudada
(STROBEL; DAISY, 2003).
Atualmente produtos oriundos dos endofíticos têm sido descritos por
apresentar moléculas de ação herbicida, antifúngicas e antibióticas, encontrando
variadas aplicações na indústria de fármacos e no setor agroquímico (STROBEL;
DAISY, 2003).
Com uma grande diversidade microbiológica embora tenham sido
identificados diversos grupos em espécies vegetais, os grupos mais frequentes
20
relatados em plantas estão os Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Erwinia,
Pseudomonas e Xanthomonas (HALLMANN, 1997).
Espécies de microrganismos como dos gêneros Azoarcus spp., Acetobacter
spp., Herbaspirillum sp., e Klebesiella sp., são consideradas obrigatoriamente
endofíticas uma vez que sua ocorrência é praticamente restrita aos tecidos internos
dos vegetais (DIAS, 2015).
Estudos relatam a capacidade das bactérias endofíticas em inibir o
crescimento de fitopatógenos (Agrobacterium sp., Bacillus sp.), promover o
crescimento da planta através da produção hormônios de crescimento vegetal como
auxina, giberilina e citocininas (Azospirillum brasiliense, Bradyrhizobium sp, Bacillus
sp), e presente no processo da Fixação Biológica de Nitrogênio - FBN (Azospirillum
brasiliense, Bradyrhizobium spp., Rhizobium spp.) (GRAÇAS, et al., 2015).
Dentre os estudos já realizados com microrganismos endofíticos Shimizu et
al. (2000), relataram a capacidade de inibir o crescimento de Sclerotinia
homoeocarpa, Rhizoctonia solani, Phytophthora cinnamomi e Pythiumaphani
dermatum por um actinomiceto endofítico.
Wurdig Roesch (2007), em estudos com milho evidenciou a presença de
bactérias endofíticas dos gêneros Rhodobacter, Herbaspirillum, Burkholderia,
Xanthobacter, Klebsiella entre outras que apresentaram a capacidade de fixar
nitrogênio, apresentando assim uma ampla biodiversidade que hoje em dia é
largamente inexplorada.
Elbeltagy et al. (2001), em estudos com arroz, relataram maior presença de
endofíticos fixadores de N nas hastes das plantas que nas raízes, sugerindo que as
hastes podem proporcionar um nicho mais adequado para o desenvolvimento dos
microrganismos. Além de, apresentar vantagens em relação aos associados às
raízes uma vez que eles se encontram mais bem localizados para explorar as fontes
de C que são disponibilizadas pelas plantas (WURDIG; ROESCH, 2007).
O processo da FBN é muito difundido no cultivo de leguminosas de uso
agrícola, como a soja, feijão, ocorrendo a formação de nódulos radiculares ou
caulinares (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Diferente do processo em leguminosas, nas gramíneas como as forrageiras
(Brachiaria spp.), não ocorrem à formação de nódulos e as bactérias se estabelecem
21
na rizosfera das plantas formando associações ou ainda podendo ser encontradas
no interior dos tecidos (DIAS, 2015).
A participação dos endofíticos é de grande importância pois além do
fornecimento de N para a planta, diversos estudos indicam que essas bactérias
podem contribuir para a promoção do crescimento vegetal por meio da produção de
hormônios, como o (AIA) ácido-3-indolacético (CAVALLET et al., 2000; REIS;
JÚNIOR et al., 2004).
Em diversas partes do mundo foi observado nos pastos de forrageiras do
gênero Brachiaria tem se mantido com níveis razoáveis de produtividade sem
adubação nitrogenada. Isto se dá muito provavelmente pela contribuição da FBN
(SILVA, 2010).
A maioria dos experimentos que envolvem isolamento e identificação de
bactérias fixadoras de nitrogênio em forrageiras foi realizada nas décadas de 60 a
80 (MAGALHÃES, NEYRA; DÖBEREINER, 1978).
A ampla diversidade da microbiota existente no capim Marandu aliado ao seu
potencial biotecnológico faz do estudo da FBN e da diversidade de microrganismos
em gramíneas deste gênero relevante já que são escassos.
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
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22
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26
CAPÍTULO 2 - DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS FIXADORAS DE NITROGÊNIO
PRESENTES NA RIZOSFERA, RAIZ, PARTE AÉREA E SEMENTES DE
Brachiaria brizantha cv. Marandu
RESUMO – A ampla diversidade microbiana de bactérias existentes no solo e
associadas às plantas pode apresentar diversos benefícios no desenvolvimento das
plantas. Dentre esses benefícios associados as bactérias estão a promoção do
crescimento vegetal, efeito antagônico contra fitopatógenos e a fixação biológica de
nitrogênio. A fixação biológica de nitrogênio (FBN) se constitui a principal via de
incorporação do nitrogênio à biosfera e depois da fotossíntese é o processo
biológico mais importante para as plantas. O nitrogênio por sua vez é um dos
elementos de maior importância para os seres vivos presente em diversos processos
fisiológicos da planta. O presente trabalho teve como objetivo estudar a diversidade
e quantidade de bactérias fixadoras de nitrogênio presente no sistema com a cultivar
Brachiaria brizantha cv. Marandu. Dos 360 isolados testados para a fixação biológica
de nitrogênio, foram positivos, 30 amostras da raiz, 29 da rizosfera, 20 da semente e
14 da parte aérea. A maior quantidade de bactérias fixadoras de nitrogênio foi
encontrada na raiz, seguida da rizosfera, semente e parte aérea.
Palavras – chave: Brachiaria brizantha cv. Marandu, diversidade microbiana, isolamento, fixação biológica de nitrogênio, PCR.
27
1. INTRODUÇÃO
Sistemas integrados de produção surgiram como alternativas como práticas
viável para a sustentabilidade do uso do solo sistemas que resultam no incremento
nos teores da matéria orgânica.
Na agricultura, conhecer a microbiota pode ser uma opção para melhorar a
sustentabilidade do sistema de produção o conhecimento destes microrganismos em
práticas culturais pode melhorar o desenvolvimento das plantas.
Esses sistemas produtivos são assinalados como sustentáveis, sendo a
manutenção dos resíduos agrícolas em cobertura e o não revolvimento do solo
fatores importantes para a melhoria da qualidade.
Sistemas como a integração Lavoura – Pecuária – Floresta (ILPF) tem se
tornado cada vez mais visado pelos produtores podem melhorar os rendimentos da
área e assim melhorar a capacidade do solo com outras culturas.
A manutenção do solo com a adição freqüente de material orgânico vindo
através dos componentes florestais auxilia no desenvolvimento e equilíbrio do local.
Por se altamente complexo o ambiente do solo é caracterizado por ancorar uma
grande variedade de processos químicos, físicos e biológicos.
Entre os componentes utilizados na implantação de sistemas integrados como
o ILPF temos o fator pastagem utilizado muitas vezes como cobertura do solo ou
junto com outras culturas como o milho. A biodiversidade presente na pastagem
pode auxiliar no desenvolvimento da cultura podendo ser utilizada como fator
altamente tecnológico.
O estudo deste ambiente que liga o solo-planta é amplamente estudado, pois
os principais instrumentos disponíveis para o desenvolvimento de produtos
biotecnológicos são os organismos e sua diversidade metabólica.
As pesquisas e as descobertas relacionadas a biotecnologia, normalmente se
iniciam com a utilização de material biológico apropriado, seguindo por uma triagem
dos atributos desejáveis e identificação dos melhores candidatos, o que pode
culminar com o desenvolvimento de um produto ou processo.
A ampla biodiversidade do solo tem importância primordial para a produção
de diversas substâncias que são utilizadas para o crescimento vegetal, no controle
28
de pragas e doenças, em biofertilizantes e na fixação biológica de nitrogênio (MELO,
2018).
Uma das contribuições de algumas bactérias é a Fixação Biológica de
Nitrogênio - FBN (MELO, 2018). A FBN é um processo essencial para a manutenção
da vida na Terra, sendo que apenas algumas espécies de bactérias têm a
capacidade de realizar este processo, somente as bactérias que possuem a enzima
nitrogenase podem reduzir o N2 a NH4 e incorporar o nitrogênio nas plantas na forma
de nitrato ou amônio (DÖBEREINER et al.,1995).
Dentre as interações presentes no solo-planta podemos destacar os
microrganismos endofíticos que vivem em tecidos vegetais como nas folhas, nos
ramos e nas raízes sem causar prejuízo a seu hospedeiro (AZEVEDO, 1998). A
descoberta das bactérias que possuem a capacidade de fixação de N pode explicar
as contribuições em nutrição das plantas (BALDANI et al., 1996).
Atualmente, tem havido um crescente interesse no potencial tecnológico dos
endofíticos. Principalmente em gramíneas, após o lançamento em 2009 do primeiro
inoculante recomendado para as culturas do milho e arroz promovem potencial de
economia de até 50% na utilização de fertilizantes nitrogenados com a utilização de
bactérias fixadoras de N (MENDES et al., 2010).
Em espécies como o capim Marandu a utilização de microrganismos fixadores
buscam reduzir os impactos da adubação no custo de produção, além de explorar
novas bactérias com potencial de FBN (REIS JUNIOR, 2002). Em pastagem como a
Brachiaria brizantha a utilizando de bactérias fixadoras podem fixar entre 5 a 10
kg.ha-1 de N ao mês (DÖBEREINER, 1992).
Essa interação entre bactérias fixadoras de N e gramíneas como milho cana-
de-açúcar e pastagens é tema de pesquisa em diversas partes do mundo, devido à
possibilidade de aumento da produtividade, na redução dos custos de produção,
contribuindo assim para a conservação dos recursos ambientais (MOREIRA et al.,
2010).
Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi avaliar a quantidade e a
diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio endofíticas e do solo presentes na
rizosfera, raízes, parte aérea e sementes de capim Marandu no ecótono Cerrado
Amazônia.
29
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Descrição do Estudo
2.2 Área da Coleta
O trabalho foi realizado na área experimental da Embrapa Agrossilvipastoril,
em região de transição entre Cerrado e Floresta Amazônica (ARAUJO et al., 2009),
em Sinop, MT (11°51'S, 55°35'W, a 384 m de altitude). Segundo a classificação de
Köppen a região é do tipo Aw (clima tropical, com inverno seco), com temperaturas
médias anuais de 25.0 °C, com precipitações anuais entre 1200 – 2000 mm
(SOUZA, 2013).
O solo do local foi classificado como Latossolo Vermelho‑Amarelo distrófico
de relevo plano, com as seguintes características químicas antes da instalação do
experimento, na camada de 0–20 cm: pH em H2O de 5,7; 8,7 mg dm‑3 de P
(Mehlich‑1); 74 mg dm‑3 de K (Mehlich‑1); 2,5 cmolc dm‑3 de Ca; 0,81 cmolc dm‑3 de
Mg; 0,02 cmolc dm‑3 de Al; e 16 g kg‑1 de matéria orgânica (MO). A textura do solo
é argilosa, com 322 g kg‑1 de areia, 118 g kg‑1 de silte e 560 g kg‑1 de argila (DIEL et
al., 2014).
2.3 Material Vegetal
O solo da rizosfera assim como o material vegetal de raiz e parte aérea da
Brachiaria brizantha cv. Marandu utilizado no experimento foram coletadas em áreas
de pastagem exclusiva. As amostras foram transportadas em caixa térmica e
armazenadas em câmara fria a 7ºC até posterior analises. As sementes utilizadas
para o isolamento de endofíticos foram adquiridas no laboratório de Sementes da
Embrapa Agrossilvipastoril e também foram armazenadas em câmara fria a 7ºC.
30
2.4 Isolamento de Bactérias Endofíticas cultiváveis
Para o isolamento a partir de raízes e parte aérea e sementes foi pesado 1,0
grama de tecido vegetal, em seguida submetidos a um processo de assepsia de 1
minuto álcool 70%, 2 minutos em hipoclorito de sódio 2%, 1 minuto em álcool 70%, 2
enxágues de 2 minutos em água destilada e autoclavada, as partes foram triturada
com auxilio de cadinho e adicionados na proporção de 9 ml solução tampão de
fosfato salino – PBS (0,20 KCl, 0,24 KH2PO4, 1,44 Na2HPO4, 8 NaCl, g/L) para cada
grama de tecido (FERREIRA, 2008). No caso de amostras de solo da rizosfera,
utilizou-se um grama de desse solo para preparo do inoculo a ser diluído.
Após a trituração do tecido vegetal a suspensão concentrada foi diluída pela
diluição seriada utilizando 100 µL em solução PBS na ordem de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5; O solo da rizosfera foi diluído sem triturar. Após isso as diluições foram
aplicadas 100 µL em placas de petri contendo meio de cultura TSA (trypticase soy
agar) 10%, pH 7,3 (FERREIRA, 2008).
2.5 Quantificação de bactérias cultiváveis
As placas foram colocados em câmara de crescimento do tipo B O D
(Biochemical Oxygen Demand), no período de 7 dias à 28 ºC . Após o período de
crescimento, foram quantificadas as Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) de
bactérias endofíticas por grama de massa seca. Todos os isolados utilizados nos
experimentos de pertencem à coleção do Laboratório de Microbiologia e Biologia
Molecular da Embrapa Agrossilvipastoril em Sinop/MT.
2.6 Bactérias Fixadoras de Nitrogênio
Após a quantificação das bactérias presentes na rizosfera, raiz, parte aérea e
semente foram purificadas e selecionadas de acordo com a sua morfologia, cor e
tamanho, no total 90 isolados da rizosfera, 90 isolados da raiz, 90 isolados da parte
aérea e 90 isolados da semente, totalizando 360 isolados.
Os isolados selecionados foram testados quanto a capacidade de fixação
biológica de nitrogênio em meio de cultura especifico NFb semi-sólido (5,0 C4H6O5,
0,5 K2HPO4, 0,2 MgSO47H2O, 0,1 NaCl, 0,02 CaCl g/L, 2 mL solução de
31
micronutrientes, 2 mL Azul de Bromotimol, 4 mL de FeDTA (solução 1,64%), 1 mL
solução de vitaminas, 4,5 g KOH), pH 6,8 proposto por (DÖBEREINER, 1995).
Foram adicionados 10 mL de meio de cultura semissólidos NFb em tubo de
50 mL e inoculada as bactérias selecionadas colocadas em câmara de crescimento
B.O.D no período de 10 dias para avaliação. E classificadas como positivas as
bactérias que apresentaram alteração no meio de cultura de acordo com a
metodologia (DÖBEREINER, 1995). Como controle positivo constitui de tubos
inoculados com a bactéria Azospirillum spp de um inoculante comercial seguidos de
incubação nas mesmas condições para as linhagens avaliadas. As bactérias
selecionadas como positivas foram submetidas a identificação molecular.
2.7 Identificação molecular dos isolados bacterianos
As bactérias selecionadas que apresentaram alteração no meio de cultura,
foram submetidas à identificação molecular utilizando o sequenciamento parcial da
região 16S. Para o sequenciamento molecular as colônias bacterianas foram
transferidas para microtubos 1,5 mL contendo 200 µL de água autoclavada, segundo
protocolo de Ferreira et al. (2008). Essa solução foi usada como fonte de DNA para
PCR. Os primers utilizados foram 1378R (5’CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-
3’) e PO27F (5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’).
As reações foram realizadas em volume final de 50 µL contendo 1µL da
suspensão bacteriana, 39,30 µL de água Milli-Q autoclavada, 10x de buffer, 0,5 µM
de cada deoxirribonucleotídeos trifosfato, 0,2 µL de cada primer e 2,5 U de Taq DNA
polimerase (SIGMA®). Um controle negativo, reação de PCR sem material
bacteriano, foi incluído em todas as reações. A Reação em Cadeia Polimierase –
PCR – foi realizada em termociclador T100 ThermalCycler (BIO-RAD), programado
para realizar uma desnaturação inicial a 94°C por 4 minutos, 35 ciclos de 94°C por
30 segundos, 62,5°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto e extensão final a 72°C por 7
minutos. A confirmação da amplificação do fragmento de DNA alvo foi realizada por
eletroforese em gel de agarose 1,5% (p/v), coloração com e observação do
fragmento de tamanho esperado (1000 pb) sob luz ultravioleta.
Os produtos de PCR foram purificados com isopropanol gelado a 100% e
centrifugação a 9.000 rpm por 15 minutos, após descarte do sobrenadante, 200µl de
álcool à 70% e centrifugação à 9.000 por 5 minutos, seguida de novo descarte de
32
sobrenadante e evaporação em banho seco a 35°C. Após a evaporação as
amostras foram resuspensas em 20µl de água Milli-Q autoclavada e incubadas em
geladeira por 24 horas. Novamente, as amostras foram submetidas à eletroforese
em gel de agarose 2,0%, com marcador de baixo peso molecular para a
quantificação de DNA. Após quantificação as amostras foram diluídas para 50 ng/µL
e alíquotas de 9,5 µL foram enviadas para o Laboratório Myleus Biotecnologia para
sequenciamento parcial do gene 16S do rDNA. As sequências obtidas foram
comparadas por BLASTn contra base de dados do NCBI. Foram considerados
somente os nucleotídeos com valor de qualidade de sequenciamento maior ou igual
a 500.
2.8 Análises Estatísticas
Os dados de UFC foram submetidos ao teste de normalidade de Liliefors.
Atendidos os pressupostos os dados foram submetidos à análise de variância e
teste entre as médias dos tratamentos Scott -Knott a 5% de significância. As
analises estatísticas foram realizadas utilizando os recursos computacionais do
programa GENES (Cruz, 2006).
33
3.0 RESULTADO E DISCUSSÃO
3.1 Isolamento de bactérias cultiváveis
As amostras com maior quantidade Unidade Formadoras de Colônias (UFCs)
foram as da rizosfera, seguidas de raiz, semente e parte aérea (Tabela 1). A
quantidade de bactérias no solo pode ser influenciada pela presença da planta, a
liberação de exsudatos no solo faz com que no em torno da planta apresente uma
seleção de microrganismos, podendo assim, a planta selecionar microrganismos
benéficos e interferindo no desenvolvimento de outros.
Quando os endofíticos adentram as plantas a competição com outros
microrganismos é menor criando melhores condições para o desenvolvimento
(GRAÇAS et al., 2015).
No presente trabalho pode se observar uma dinâmica entre a rizosfera com
as raízes a parte aérea demonstrando uma provável capacidade na seleção de
microrganismos benéficos para a planta que possam adentrar nas plantas de capim
Marandu.
A contribuição dos sistemas integrados como lavoura – pecuária - floresta é
perceptível através da melhoria dos atributos químicos do solo, melhorando os
índices de fertilidade. Essas melhorias ocorrem em função da mineralização da
matéria orgânica depositada pelos resíduos das árvores e das lavouras e pastagens,
e pela fixação de nitrogênio.
Sistemas integrados de produção agrícola assim como outras práticas
conservacionistas são alternativas viáveis para a sustentabilidade do uso do solo.
Em estudos realizados por Colman et al., (2013), com indicadores microbiológicos
em sistemas de integração lavoura – pecuária - floresta, observaram que sistema
integrado proporcionaram maior condições para o crescimento microbiano se
comparados com sistema de preparo convencional ou em sistema de monocultivo
com pastagens.
Vale destacar que em sistemas integrados a quantidade de resíduos na
superfície do solo afeta positivamente a microbiota o que favorece o seu
desenvolvimento (MERCANTE et al., 2008).
34
Tabela 1. Número de Unidade Formadora de Colônias (UFCs) isoladas de rizosfera e tecidos de capim Marandu. Médias seguidas das mesmas letras não diferem entre si no teste Scott Knott a 5% de significância. As médias foram obtidas de 3 isolamentos independentes.
O solo é um ambiente altamente complexo e o ambiente rizosférico está sob
imediata influência do metabolismo radicular acumulando assim uma grande
quantidade de compostos orgânicos. Influenciando diretamente na seleção de
microrganismos específicos em resposta ao metabolismo vegetal.
No estudo é possível observar a influência direta da quantidade de bactérias
se apresentando maior na rizosfera, seguida da raiz e da parte aérea, por influência
direta das raízes com a liberação de metabólitos a quantidade de microrganismos
presentes na rizosfera é maior já que as quantidades de exsudatos estão mais
disponíveis no solo assim a planta seleciona microrganismos que possam atuar em
beneficio da planta (OLIVEIRA et al., 2014).
No estudo foi observado que nas raízes e na parte aérea da planta a
quantidade de bactérias mostrou-se menor com relação a quantidade encontrada na
rizosfera.
Acredita-se que essa relação para a seleção de microrganismos que possam
adentrar a planta não ocorra de forma aleatória e que a planta consiga modular a
quantidade/qualidade de material excretado pelas raízes de forma a selecionar os
microrganismos que atuam de forma benéfica ao sistema da planta (OLIVEIRA et
al., 2014).
Em relação ao sistema de colonização dos microrganismos encontrados na
planta estudos realizados por da Silva et al., (2011) com bactérias diazotróficas em
sementes de arroz observaram que o processo de infecção da planta tem inicio a
partir da colonização do solo (rizoplano) seguindo pelo interior da raiz, passando
pelo caule e até atingir os tecidos aéreos.
Em relação aos microrganismos endofíticos encontrados nas sementes do
capim Marandu podemos constatar a presença de uma quantidade maior aos
encontrados em outros tecidos vegetais da planta demonstrando a capacidade dos
Tratamentos Médias
Rizosfera 4,27 x 106 a Raiz 1,85 x 106 b Semente 1,69 x 106 b Parte aérea 1,51 x 106 b
35
microrganismos de penetrarem os locais do sistema da planta e que possam
transportar microrganismos relacionados aos benefícios para o desenvolvimento da
planta.
3.2 Fixação Biológica de Nitrogênio
Foram selecionados 90 isolados bacterianos de cada tratamento para
realização dos testes em meio de cultura semissólido NFb e foram capazes de fixar
nitrogênio 29 isolados da rizosfera, correspondendo a (32%), 30 isolados da raiz,
(33%), 14 isolados da parte aérea, (15%) e 20 isolados da semente, (22%) (Figura
1).
O meio de cultura NFb semissólido tem sido amplamente utilizado para
isolamentos e seleção de bactérias fixadoras de nitrogênio que colonizam o solo e
espécies de gramíneas, como a Brachiaria sp., (BODDEY; DÖBEREINER, 1988;
REIS JÚNIOR et al., 2004). No presente trabalho foi possível utilizar o meio de
cultura como testador da capacidade de fixar nitrogênio.
Figura 1. Gráfico de bactérias fixadoras de N isoladas de solo, da rizosfera, e dos tecidos vegetais de capim Marandu.
Após a seleção de isolados para testes de fixação de N procedeu-se a
identificação molecular. Para a similaridade dos isolados quando o resultado obtém
0
5
10
15
20
25
30
35
% b
acté
rias f
ixad
ora
s d
e N
raiz
rizosfera
semente
parte aérea
36
valor maior ou igual a 80% a aproximação se dá para filo, identidade maior ou igual
a 95%, identifica – se como uma aproximação de gênero e similaridades maiores ou
iguais a 97% com alinhamento de fragmentos do gene 16S rRNA geralmente é
usado como uma aproximação para espécies (CASTRO, 2015). Após a
identificação os Filos observados com maior freqüência foram Proteobacteria,
Firmicutes, Bacteroidetes e Actinobacteria.
Tabela 2. Bactérias fixadoras de nitrogênio da rizosfera do capim Marandu.
Tratamento Classe Espécie % Nº de Acesso
Rizosfera
Bacteroidetes
Sphingobacterium canadense 78 NR_043196.1
Sphingobacterium siyangense 80 NR_044391.1
Sphingobacterium ginsenosidimutans 97 NR_108689.1
Sphingobacterium multivorum 98 NR_040953.1
Chryseobacterium gleum 83 NR_113722.1
Chryseobacterium artocarpi 96 NR_134001.1
Chryseobacterium bernardetii 99 NR_126254.1
Flavobacterium anhuiense 87 NR_044388.1
Flavobacterium tistrianum 98 NR_149282.1
Proteobacteria
Pseudomonas putida 93 NR_043424.1
Pseudomonas lini 98 NR_029042.2
Pseudomonas monteilii 99 NR_024910.1
Pseudomonas alkylphenolica 100 NR_145644.1
Enterobacter asburiae 96 NR_024640.1
A rizosfera é um local com maior diversidade de bactérias devido à alta
disponibilidade de compostos fornecidos pelas raízes. Essa relação com a planta
proporciona uma alta densidade de microrganismos ao redor da raiz (GRAÇAS et
al., 2015). Entre as baterias encontradas na rizosfera do capim Marandu, temos
Sphingobacterium, Chryseobacterium, Flavobacterium, Pseudomonas, Enterobacter.
A presença de bactérias deste gênero já foi descritas em ambiente de
rizosfera de guaranazeiro (CARVALHO, 2015). Também é relatada a presença de
microrganismos em tecidos de café (FERREIRA, 2017). Vários benefícios a planta
são associados a essas bactérias como a promoção do crescimento vegetal,
desenvolvimento e estabelecimento das plantas em condições adversas, resistência
contra fitopatógenos. Em estudos realizados por Da Silva (2010), quanto a fixação
de nitrogênio e promoção do crescimento em Brachiaria brizantha relatou a
presença de diversos microrganismos endofíticos associados a diversas partes
vegetais da pastagem.
37
O gênero Sphingobacterium e Chryseobacterium são largamente
relacionadas em solos agrícolas e a abundância destes gêneros pode estar
relacionada provavelmente ao ciclo do N (TSAI et al., 2009). O Chryseobacterium
sp., possui relação entre a abundância e o aumento das taxas de mineralização de
carbono disponível no solo (Souza, 2015; FIERER et al., 2007).
A biodiversidade do solo ou de qualquer outro ambiente vegetal pode esta
relacionada a fatores abióticos e bióticos do sistema entre eles a comunidade nativa
da microbiota do solo, a quantidade e qualidade de exsudatos radiculares liberados
pela raiz, características edafoclimáticas e fatores antrópicos, definindo o
desenvolvimento e a produtividade agrícola (OLIVEIRA et al., 2014).
Tabela 3. Bactérias fixadoras de nitrogênio da raiz de capim Marandu
Tratamento Classe Espécie % Nº de Acesso
Raiz
Firmicutes
Bacillus xiamenensis 99 NR_114041.1
Bacillus safensis 84 NR_113945.1
Paenibacillus tyrfis 93 NR_137255.1
Brevibacillus gelatini 99 NR_148616.1
Brevibacillus parabrevis 87 NR_040981.1
Bacillus paraflexus 92 NR_135732.1
Bacillus australimaris 81 NR_148787.1
Paenibacillus aquistagni 98 NR_152638.1
Paenibacillus dongdonensis 89 NR_134112.1
Proteobacteria
Enterobacter cancerogenus 92 NR_116756.1
Enterobacter muelleri 89 NR_145647.1
Pseudomonas donghuensis 99 NR_136501.2
Bordetella tumulicola 94 NR_145922.1
Sphingobium fontiphilum 92 NR_109304.1
Pantoea beijingensis 90 NR_148578.1
Achromobacter agilis 86 NR_152013.1
Ralstonia solanacearum 95 NR_118984.1
Achromobacter animicus 93 NR_145922.1
Pseudomonas oryzihabitans 100 NR_136501.2
Kosakonia cowanii 98 NR_025566.1
Kosakonia sacchari 95 NR_118333.1
Variovorax boronicumulans 98 NR_114214.1
Cesiribacter roseus 93 NR_109022.1
Bacteroidetes Chryseobacterium rigui 81 NR_109537.1
Chryseobacterium sediminis 78 NR_145660.1
Com uma relação direta entre o solo da rizosfera a raiz da planta se
destaca pela liberação de exsudatos diretamente no solo ajudando assim a
colonização de maneira seletiva com bactérias que possam auxiliar no
desenvolvimento da planta de alguma forma. As raízes são sistemas desempenham
38
importantes funções como fixar a planta nos substratos, absorver a água, os
nutrientes entre outras substâncias minerais encontradas no solo.
Algumas bactérias encontradas nas rizosfera das plantas podem ser
relacionadas no interior da planta relacionando a sua importância para os sistemas
de desenvolvimento da planta. Sarwar e Kremer (1995) que avaliaram alguns
isolados de origem rizosférica de diferentes plantas, e verificaram que isolados
associados à raiz são mais eficientes na síntese de AIA.
Dentre os gêneros observados no capim Marandu estão os Bacillus sp. e
Paenibacillus sp., e Brevibacillus sp., que são frequentemente relatados como
microrganismos endofíticos de planta (DAHMER, 2014).
Os Bacillus são descritos com alto potencial biotecnológico e frequentemente
são relatados como promotores de crescimento vegetal por meio do hormônio
auxina, giberilina e citocininas (GRAÇAS et al., 2015).
Os Paenibacillus sp., sido isoladas de diversas fontes como no solo na água,
na rizosfera e raízes (Berg et al. 2002). Possuem a capacidade de fixar nitrogênio
além de solubilizar o fósforo no solo, produzir antibióticos, produz compostos
promotores de crescimento em plantas ácido indol-ácetico (AIA), aumentam a
captação de nutrientes pela planta e age como biocontrolador de microrganismos
patógenos nativos (CHANWAY, 1995). Atuando também no controle biológico contra
Fusarium e Pythium (GUENOURI-ATHMANI et al., 2000).
Tabela 4. Bactérias fixadoras de nitrogênio da semente de capim Marandu.
Semente
Classe Identificação do isolado % Nº de Acesso
Firmicutes Paenibacillus salinicaeni 99 NR_146674.1
Bacillus safensis 99 NR_113945.1
Proteobacteria
Escherichia hermannii 99 NR_104940.1
Enterobacter xiangfangensis 98 NR_126208.1
Enterobacter cancerogenus 97 NR_116756.1
Pseudomonas donghuensis 99 NR_136501.2
Kosakonia cowanii 99 NR_025566.1
Kosakonia cowanii 97 NR_025566.1
Kosakonia sacchari 94 NR_118333.1
Actinobacteria Microbacterium neimengense 97 NR_118272.1
A semente é um órgão responsável pela dispersão e perpetuação das
espécies. As funções das sementes relacionam-se com a dispersão e sobrevivência
da planta em condições favoráveis como também em desfavoráveis (DAMIÃO
FILHO; MÔRO, 2001). Microrganismos endofíticos possuem a capacidade de se
39
associarem a diversas partes das plantas podendo ser encontrado nas sementes
como forma de auxiliar na sobrevivência da planta em local pouco propício ao
desenvolvimento da espécie.
Um dos gêneros relatado em semente de capim Marandu foi a Kosakonia que
a partir do ano de 2013 o gênero foi separado em dois gêneros distintos
anteriormente pertencia ao gênero Enterobacter. Espécies destes gêneros já foram
relatadas em fontes ambientais, incluindo solo e vegetais ou em amostras clínicas.
Espécies do gênero Kosakonia são descritas por promover o crescimento das
plantas, através da fixação biológica de nitrogênio (TEIXEIRA, 2014; BRADY et al.,
2013).
Tabela 5. Bactérias fixadoras de nitrogênio da parte aérea de capim Marandu.
Tratamento Classe Identificação dos Isolados % Nº de Acesso
Parte Aérea
Firmicutes Paenibacillus salinicaeni 91 NR_146674.1
Bacillus toyonensis 89 NR_121761.1
Proteobacteria
Sphingomonas hengshuiensis 91 NR_145962.1
Marispirillum indicum 88 NR_044545.1
Ochrobactrum rhizosphaerae 92 NR_042600.1
Rhizobium ipomoeae 93 NR_148841.1
Methylobacterium tarhaniae 99 NR_109649.1
Methylobacterium organophilum
99 NR_041027.1
Actinobacteria Curtobacterium albidum 100 NR_036885.1
Quando relatados a quantidade de microrganismos endofíticos presentes na
planta a colonização destes microrganismos seguem a partir do solo no rizoplano da
planta, seguindo pelo interior da raiz, passando pelo caule até atingir os tecidos
aéreos (SILVA et al., 2011). A utilização de inóculos de Azospirillum sp., em mudas
de cana de açúcar influenciou o desenvolvimento da parte aérea da planta
aumentando a sua altura e massa seca radicular (MOUTIA, et al., 2010). A utilização
de inóculos a partir da parte aérea da planta pode representar melhores condições
para absorção de nutrientes e fixação de nitrogênio para o desenvolvimento da
planta.
Dentre os microrganismos relatados na parte aérea do capim Marandu
incluímos o Methylobacterium que já foi relatado pela capacidade de fixar nitrogênio
(ESPOSITO-POLESI, 2011). O gênero Curtobacterium sp., são relatados a
40
capacidade no controle biológico, e auxilia na absorção de Níquel (Ni), que atua no
metabolismo do nitrogênio (PAULISTA, 2015).
41
3. CONCLUSÃO
Na rizosfera está a maior quantidade de Unidades Formadoras de Colônia
associado à capim Marandu, seguido da raiz, semente e parte aérea.
A maior diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio na raiz. O maior
número de bactérias fixadoras de nitrogênio foi observado na raiz, rizosfera,
semente e parte aérea respectivamente.
42
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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47
Capítulo 3 - Diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio presentes no solo
sob três sistemas de cultivo de Brachiaria brizantha cv. Marandu
Bruce Raphael Alves Rodrigues1; Anderson Ferreira2
1 Engenheiro Agrônomo, Pós-Graduando em Agronomia, Bolsista
CAPES/FAPEMAT, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Sinop, MT,
2 Biólogo, doutor em Genética de Microrganismo, Pesquisador - Ecologia e Genética
Microbiana - Sistemas de Produção Sustentáveis, Embrapa Agrossilvipastoril –
Sinop, MT, [email protected]
RESUMO
A utilização de sistemas integrados de produção é uma estratégia que
associa atividade agrícola e de pecuária dentro da propriedade rural de maneira que
haja benefícios para ambas a integração Lavoura – Pecuária – Floresta (iLPF). A
diversificação do sistema proporciona a exploração econômica do solo durante o
ano todo contemplando a produção de alimentos, além melhorar as propriedades
químicas, físicas e biológicas do solo.
Em propriedade que adotam essa estratégia apresenta estabilidade na
produção de forragens em virtude da fertilidade do solo utilizada pela lavoura. Aliado
ao desenvolvimento agrícola, atualmente tem se introduzido as pastagens como
alternativas na rotação de culturas na área, um dos gêneros mais utilizados é a
Brachiaria, que devido boa adaptação em solos ácidos e de baixa fertilidade. Essas
qualidades se dão também devido ao aporte de resíduos vegetais que proporcionam
o desenvolvimento diversidade de microrganismos no solo.
Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi avaliar a diversidade microbiana de
fixadores de nitrogênio presente em três sistemas de cultivo de Brachiaria brizantha
cv. Marandu. O isolamento das bactérias fixadoras de nitrogênio foi realizado em
solos dos três sistemas de cultivo de B. brizantha utilizando meio de cultura TSA,
nos testes de Fixação Biológica de Nitrogênio utilizou se o meio de cultura semi-
sólido NFb. Sendo que 34 isolados possuíram alteração no meio de cultura. Com
base neste trabalho podemos concluir que a diversidade em áreas cm cultivo de B.
48
brizantha compreendem os gêneros: Bacillus sp., Burkholderia sp., Pseudomonas
sp., Rhodanobacter sp., Chryseobacterium sp., e Corynebacterium sp.
Palavras – chave: Pastagem, fixação biológica de nitrogênio, Brachiaria brizantha
1. INTRODUÇÃO
A agricultura moderna é caracterizada pela busca do aumento na
produtividade das culturas agrícolas, setores primários como a agricultura e a
pecuária no país atualmente são responsáveis por 23% Produto Interno Bruto (PIB)
fazendo do Brasil o segundo maior produtor de soja, o terceiro maior produtor de
milho e o segundo maior rebanho bovino do mundo.
Apesar deste cenário otimista o impacto ambiental causado pela exploração
agrícola nem sempre recebeu a atenção necessária a ausência de conhecimento
sobre os ecossistemas o planejamento inadequado na utilização destas áreas levou
a uma intensa degradação ambiental com sérias perdas de recursos não renováveis
e da biodiversidade do solo (Zilli et al., 2003).
A preservação desta biodiversidade do solo é de grande importância, pois os
microrganismos do solo atuam de forma significativa em diversos processos
responsáveis pelo equilíbrio do sistema como, pedogênese, a ciclagem do nitrogênio
e a transformação da matéria orgânica e funções especificas realizadas por
microrganismos como a absorção de nutrientes pelas plantas e a fixação biológica
de nitrogênio (Andreote & Cardoso, 2016).
Funções específicas como a Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN), é
processo biológico mais importante para as plantas e fundamental para a vida na
Terra, realizado por diversas espécies de bactérias que habitam o solo (Embrapa,
2018). O nitrogênio é um elemento essencial para os organismos vivos é constituinte
de moléculas como aminoácidos, ácidos nucléicos, bases nitrogenadas e clorofila
(da Silva, 2010; Moreira & Siqueira, 2006).
As bactérias que realizam esse processo biológico são denominadas
diazotróficas e possuem a enzima nitrogenase que é capaz de romper a tripla
ligação do nitrogênio atmosférico (Moreira & Siqueira, 2006).
49
As bactérias podem se associar em diferentes graus de especificidade nas
plantas (Hungria, 2001). Uma das maiores contribuições da FBN ocorre pela
associação simbiótica de bactérias com as plantas da família Leguminosae que é
realizado por bactérias dos gêneros Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium,
Burkholderia, Methylobacterium (Hungria et al., 2007). Essa associação simbiótica
forma estruturas especializadas nas raízes chamadas de nódulos, onde ocorre o
processo de fixação biológica, nos nódulos à amônia sintetizada é rapidamente
incorporada íons de hidrogênio (H+) e transformado em íons de amônio (NH4) que
serão distribuídos para as plantas hospedeiras (Hungria, 2001).
Por meio da FBN as leguminosas conseguem obter a maioria do nitrogênio
necessário para crescer, o mesmo não acontece nas culturas das gramíneas e a
cultura ficando dependente da adubação nitrogenada para desenvolvimento
completo. Em gramíneas como a cana de açúcar a utilização de inoculantes a base
de fixadores de N contribuíram para ganhos na produção de colmo próximos aos
obtidos com a aplicação de 120 quilos por hectares de fertilizantes nitrogenados
(Embrapa a 2018).
Nas lavouras de milho a utilização da técnica de inoculação com fixadoras de
nitrogênio apresentaram maior eficiência na absorção de fertilizantes nitrogenados
contribuindo de 24% da absorção para 50 a 58% possibilitando assim a redução da
dose de fertilizantes em até 50%. O conhecimento do potencial da FBN em
gramíneas é capaz de contribuir na economia de fertilizantes nitrogenados já que
culturas como o milho e a cana de açúcar são responsáveis por cerca de 70% do
fertilizante utilizado no país (Embrapa,_A 2018).
Recentemente a Embrapa passou a indicar e recomendar o uso de estirpes
do gênero Azospirillum em pastagens de Brachiaria brizantha. Atualmente a
utilização dessas estirpes é amplamente utilizada em culturas como o milho e o
trigo. Devido às condições climáticas favoráveis no país as pastagens podem
agregar grande potencial produtivo no setor pecuário brasileiro áreas com cultivo de
pastagem no país gira em torno de 180 milhões de hectares, a maioria dessas
propriedades têm a braquiárias como principal fonte de alimento para o gado
(Hungria & Nogueira, 2017).
50
A utilização de bactérias do gênero Azospirillum brasilense têm como seu
principal mecanismo a produção de fitohormônio, proporcionando efeitos benéficos
para as plantas entre eles, o aumento da densidade e comprimento do pelos
radiculares, aumento da absorção de nutrientes, proporcionando um aumento da
biomassa da planta melhorando a qualidade proteica na alimentação do gado,
reduzindo assim custos para o produtor rural (Hungria & Nogueira, 2017).
Embora espécies de bactérias diazotróficas possam ser encontradas em
diversas espécies estudos mostram a ocorrência em gramíneas e outras
monocotiledôneas, as espécies mais relacionadas com as gramíneas encontradas
são Azospirillum spp. (A. lipoferum, A. brasilense, A. amazonense, A.
halopraeferans, A. irakense), Bacillus polimixa, B. azotofixans, Burkholderia spp.,
entre outras (Dias, 2015). Experimentos conduzidos por Vinhal - Freitas (2010)
conduzidos pelo método de incorporação do 15N2 confirmaram que várias gramíneas
tropicais se beneficiam de nitrogênio fixado biologicamente.
Nesse sentido o objetivo desse trabalho foi avaliar a quantidade e a
diversidade de bactérias fixadoras de nitrogênio presentes no solo cultivado com
pastagens sob três sistemas (exclusivo, integrado pastagem – lavoura e integrado
lavoura – pastagem – floresta) no ecótono Cerrado Amazônia.
2. MATERIAL E MÉTODO
2.1 Coleta de Solo
O trabalho foi realizado na área experimental da Embrapa Agrossilvipastoril,
em região de transição entre Cerrado e Floresta Amazônica (Araujo et al., 2009), em
Sinop, MT (11°51'S, 55°35'W, a 384 m de altitude). O clima da região segundo a
classificação de Köppen é do tipo Aw, tropical com inverno seco, com médias anuais
de temperatura de 25ºC, umidade relativa de 82,5% e precipitação de 2.550 mm
(Instituto Nacional de Meteorologia, 2013). O solo foi classificado como Latossolo
Vermelho ‑ Amarelo distrófico (Oliveira et al., 1982), de relevo plano, com as
seguintes características químicas antes da instalação do experimento, na camada
de 0–20 cm: pH em H2O de 5,7; 8,7 mg dm‑3 de P (Mehlich‑1); 74 mg dm‑3 de K
51
(Mehlich‑1); 2,5 cmolc dm‑3 de Ca; 0,81 cmolc dm‑3 de Mg; 0,02 cmolc dm‑3 de Al;
e 16 g kg‑1 de matéria orgânica (MO). A textura do solo é argilosa, com 322 g kg‑1
de areia, 118 g kg‑1 de silte e 560 g kg‑1 de argila.
As coletas de solo foram realizadas com auxílio de trado holandês na camada
0-10 cm, foram realizadas quatro paradas para coletas dentro da área experimental
com 5 amostragem totalizando 20 subamostras de solo em cada repetição para
formar uma amostra composta. As coletas foram realizadas na seguinte ordem, a
primeira coleta do solo foi realizada na linha da cultura, a segunda foi realizada do
lado direito a 10 cm linha principal, terceira coleta foi realizada do lado esquerdo a
10 cm linha principal, quarta coleta foi realizada do lado direito a 25 cm da linha
principal e quinta coleta a 25 cm do lado esquerdo da linha principal. Com
delineamento em Blocos ao acaso com 3 repetições. O solo da área foi cultivado
com Brachiaria brizantha cv. Marandu nas seguintes formas: exclusiva de pastagem,
pastagem integrado com lavoura e lavoura – pecuária – floresta. As amostras foram
transportadas em caixa térmica até o laboratório e armazenadas a qual foram
acondicionadas a 7ºC até o momento das análises.
2.2 Isolamento
As bactérias foram isoladas em meio de cultura utilizando 10 gramas de solo
para 90 ml de tampão de fosfato salino – PBS (0,20 KCl, 0,24 KH2PO4, 1,44
Na2HPO4, 8 NaCl, g/L-1) com posterior agitação em mesa orbital por 1
hora/150rpm.
2.3 Quantificação de Bactérias Cultivadas
Após agitação em mesa orbital a suspensão foi diluída pela técnica de forma
seriada na ordem de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, as quais foram aplicadas o volume de
100µl apenas as diluições 10-3, 10-4, 10-5 em placas de petri contendo meio de
cultura sólido TSA (trypticase soy agar) 10%, pH 7,3. Após o período de 5 dias de
crescimento em câmara de B O D (Biochemical Oxygen Demand), foram
quantificadas as Unidades Formadoras de Colônias (UFC) e calculada a UFC por
grama de solo seco.
52
2.4 Caracterização para o isolamento
Em seguida as bactérias presentes nos 3 solos analisados foram purificadas e
selecionadas de acordo com a sua morfologia, cor e tamanho, no total 90 isolados
para cada tipo de solo em estudos, totalizando 270 isolados.
2.5 Caracterização quanto a Fixação Biológica de Nitrogênio
O teste para bactérias fixadoras de nitrogênio foi realizado com meio de
cultura especifico NFb semi-sólido (5,0 C4H6O5, 0,5 K2HPO4, 0,2 MgSO47H2O, 0,1
NaCl, 0,02 CaCl, g/L-1 2 ml solução de micronutrientes, 2 ml Azul de Bromotimol, 4
ml de FeDTA (solução 1,64%), 1 ml solução de vitaminas, 4,5g KOH), pH 6,8
proposto por (DÖBEREINER, 1995).
O meio semi-sólido foi colocado na quantidade de 10ml em tubos de vidro e
inoculado com as bactérias a 2 cm de profundidade incubadas em câmara de
crescimento B O D com ausência de fotoperíodo no período de 10 dias para
avaliação. Foram classificadas como positivas as bactérias que apresentaram
alterações no meio de cultura e negativa para aquelas que não apresentaram
alterações, de acordo com a metodologia (DÖBEREINER, 1995). Como controle
positivo constitui de tubos inoculados com a bactéria Azospirillum brasilense de um
inoculante comercial seguidos de incubação nas mesmas condições para as
linhagens avaliadas.
Identificação Molecular
As bactérias selecionadas como positivas, foram submetidas à identificação
molecular utilizando o sequenciamento parcial da região 16S. Para sequenciamento
molecular as colônias bacterianas puras foram transferidas para microtubos de 1,5
mL contendo 200µl de água autoclavada, segundo protocolo de Ferreira et al.
(2008). Essa solução foi usada como fonte de DNA para PCR. Os primers utilizados
foram 1378R (5’CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’) e PO27F
(5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’). As reações foram realizadas em volume final
de 50µl contendo 1µl da suspensão bacteriana, 39,30µl de água Milli-Q autoclavada,
10x de buffer, 0,5 µM de cada deoxirribonucleotídeos trifosfato, 0,2 µM de cada
53
primer e 2,5 U de Taq DNA polimerase (SIGMA®). Um controle negativo, reação de
PCR sem material bacteriano, foi incluído em todas as reações. A Reação em
Cadeia Polimierase – PCR – foi realizada em termociclador T100 ThermalCycler
(BIO-RAD), programado para realizar uma desnaturação inicial a 94°C por 4
minutos, 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 62,5°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto
e extensão final a 72°C por 7 minutos. A confirmação da amplificação do fragmento
de DNA alvo foi realizada por eletroforese em gel de agarose 1,5% (p/v), e
observação do fragmento de tamanho esperado (1000 pb) sob luz ultravioleta.
Os produtos de PCR foram purificados com isopropanol gelado à 100% e
centrifugação à 9.000 rpm por 15 minutos, após descarte do sobrenadante, 200µl de
álcool à 70% e centrifugação à 9.000 por 5 minutos, seguida de novo descarte de
sobrenadante e evaporação em banho seco à 35°C. Após a evaporação as
amostras foram resuspensas em 20µl de água Milli-Q autoclavada e incubadas em
geladeira por 24 horas. Após quantificação as amostras foram diluídas para 50ng/µl
e enviadas para o laboratório Myleus Biotecnologia para sequenciamento parcial do
gene 16S do rDNA. As sequências obtidas foram comparadas por BLASTn contra
base de dados do NCBI.
2.6 Análises Estatísticas
Os dados de UFC foram submetidos à análise de variância e realizados o
teste de normalidade de Liliefors. Atendidos os pressupostos os dados foram
submetidos a análise de variância e teste entre as médias dos tratamentos Tukey a
5% de significância. As analises estatísticas foram realizadas utilizando os recursos
computacionais do programa GENES (CRUZ, 2006).
54
3. RESULTADOS
Foi avaliada a densidade de bactérias presentes nos três sistemas de cultivo.
A quantidade de bactérias nos três tratamentos estudados (exclusivo Pecuária,
Lavoura – Pecuária e iLPF) variou de 2,75 a 4,99 x 107 UFC/grama de solo seco
(Tabela 1). A análise de variância (ANOVA) não mostrou diferenças significativas
entre as médias (P>0.001). A metodologia utilizada possibilitou o isolamento de
diferentes grupos bacterianos no solo sob o cultivo de Brachiaria brizantha cv.
Marandu.
Tabela 1. Unidade Formadora de Colônia de bactérias por grama de solo provenientes dos sistemas exclusivo, integrado pastagem - lavoura e integrado lavoura – pastagem – floresta, médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância
*Amostras de 10 g de solo dos tratamentos sistemas exclusivo, integrado pastagem - lavoura e integrado lavoura – pastagem – floresta **Média de isolamentos independente.
Dos 270 isolados testados em meio NFb semi-sólido específico para fixadores
de nitrogênio 34 ou (12,5%) isolados apresentaram alteração no meio de cultura e
identificado por meio do sequenciamento parcial do 16S rDNA. A distribuição dentro
de cada tratamento dos isolados considerados positivos foi de 18 isolados
pertencentes ao sistema Lavoura – Pecuária, 12 do sistema de iLPF e 04 na área de
cultivo exclusivo.
Essa identificação permitiu acessar a diversidade de bactérias cultiváveis do
solo em diferentes tipos de sistema de cultivo sob Brachiaria brizantha cv. Marandu.
Os isolados com maior freqüência nos três tratamentos foram identificados como
pertencentes ao Filo Firmicutes e Filo Proteobacteria. Os demais foram identificados
pertencentes aos Filos Bacterioidetes e Filo Actinobacteria.
Foi possível observar comunidades bacterianas cultiváveis sob cultivo de
Brachiaria brizantha cv. Marandu é constituída por Bacillus australimaris, Bacillus
aryabhattai Bacillus xiamenensis, Bacillus safensis, Burkholderia
contaminans, Corynebacterium ilicis, Chryseobacterium echinoideorum,
Tratamento* UFC/grama de solo**
Braquiária - Pecuária 4.99x107 a
Braquiária - iLPF 2.75x107 a
Braquiária - Lavoura - Pecuária 4.88x107 a
55
Chryseobacterium geocarposphaerae, Pseudomonas plecoglossicida,
Pseudomonas asturiensis, Pseudomonas taiwanensis, Pseudomonas nitroreducens,
Pseudomonas batumici e Rhodanobacter xiangquanii.
Tabela 2. Distribuição e freqüência da diversidade bacteriana encontrada no solo os tratamentos Lavoura – Pecuária, integração Lavoura – Pecuária – Floresta - iLPF e exclusivo Pecuária sob cultivo de Brachiaria brizantha cv. Marandu.
Tratamento Classe Espécie % Nº de Acesso
Lavoura - Pecuária
Firmicutes
Bacillus australimaris 91 NR_148787.1
Bacillus xiamenensis 99 NR_114041.1
Bacillus aryabhattai 98 NR_118442.1
Proteobacteria Rhodanobacter xiangquanii 99 NR_132710.1
Bacteroidetes Chryseobacterium echinoideorum 90 NR_145657.1
ILPF
Firmicutes
Bacillus safensis 94 NR_113945.1
Bacillus xiamenensis 95 NR_114041.1
Proteobacteria
Burkholderia contaminans 90 NR_104978.1
Pseudomonas plecoglossicida 98 NR_114226.1
Pseudomonas asturiensis 93 NR_108461.1
Pseudomonas taiwanensis 98 NR_116172.1
Pseudomonas donghuensis 90 NR_136501.2
Pseudomonas nitroreducens 85 NR_113601.1
Pseudomonas batumici 99 NR_118125.1
Bacteroidetes Chryseobacterium geocarposphaerae
93 NR_133727.1
Pecuária
Firmicutes Bacillus xiamenensis 100 NR_114041.1
Actinobacteria Corynebacterium ilicis 99 NR_104950.1
56
4. DISCUSSÃO
O filo é fenotipicamente diverso apresentam alto potencial biotecnológico, os
Bacillus são relatados como portadores de características benéficas para as plantas
como a promoção de (AIA), responsável pelo desenvolvimento da planta (Graças,
2015). Por sua variabilidade de adaptação nos sistemas algumas espécies de
Bacillus sp, já foram detectadas a presença da enzima nitrogenase nessas espécies
(Xie et al. 1998). Em experimentos realizados por Assumpção (2008), com sementes
de soja, indicam a capacidade de fixação de N utilizando meio de cultura NFb in
vitro, semelhantes aos encontrados no estudo.
As proteobacterias constituem o mais diverso filo são gram-negativas que
essas bactérias são diversas em reação com o oxigênio, sendo conhecidas
espécies. As Pseudomonas sp., são relatadas por apresentar a capacidade de
promover o crescimento vegetal. O gênero Burkholderia é constituído de espécies
que possuem grande diversidade metabólica e propriedades patogênicas, são
encontradas em diferentes tipos de solo atuando como promotoras de crescimento
vegetal (AIA).
A diversidade encontrada no ambiente isolado do solo é relatada como
fixadoras de nitrogênio Pseudomonas, Burkholderia (Feldmann, 2007). Quando
isoladas doe solo são capazes de fixar nitrogênio e possuem atividade antagônica
contra vários fungos fitopatogênicos (Graça et al., 2015; Baldani et al., 1997).
No presente estudo foi possível relatar a capacidade de fixar nitrogênio in vitro
dessas bactérias quando presente em sistema de cultivo integrado.
Os bacteroidetes é um filo heterotróficos e gram-negativos, O
Chryseobacterium sp., destaca se a relação entre a abundância do microrganismo
deste filo e o conteúdo de carbono disponível no solo, onde a presença destes estão
associada a um aumento das taxas de mineralização deste elemento (Souza, 2015;
Fierer et al., 2007). Não foram encontrada na literatura relatos da capacidade de
fixação de nitrogênio Chryseobacterium sp.,
As actinobactérias possuem grande potencial como agente de controle
biológico de fitopatógenos, além de favorecer o crescimento da planta na produção
de fitohormônio (OLIVEIRA et al., 2014; MERZAEVA & SHIROKIKH 2006). De
57
modo geral a diversidade microbiana do solo poderia ser usada para avaliar o
impacto das práticas agrícolas (HUNGRIA & NOGUEIRA 2013)
Em estudos realizados por Hungria & Nogueira (2013) evidenciaram que em
sistemas conservacionistas a biodiversidade se apresentou maior do que o
visualizado em outros sistemas, mostrando assim que o preparo intensivo do solo
pode eliminar grupos importantes de bactérias o que pode resultar na perda da
funcionalidade de ciclos, como na ciclagem de nutrientes e na decomposição de
resíduos.
58
5. CONCLUSÃO
O número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) em solos cultivados
com capim marandu em diferentes sistemas não difere. As comunidades bacterianas
cultivadas encontradas nos sistemas de Lavoura – Pecuária, iLPF e exclusivo de
Pecuária sob o cultivo de Brachiaria brizantha cv. Marandu são diferentes entre si.
O sistema iLPF mostrou uma maior diversidade de bactérias a biodiversidade
aumentando a sustentabilidade do sistema. As bactérias isoladas no solo sob o
cultivo de Brachiaria brizantha cv. Marandu possuem a capacidade de fixação
biológica de nitrogênio.
59
6. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
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62
7. AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato
Grosso (FAPEMAT), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), a Universidade Federal de Mato Grosso e ao programa de pós-
graduação em Agronomia da UFMT pelo apoio no desenvolvimento deste
trabalho e a Embrapa Agrossilvipastoril pelo incentivo e amparo na execução desta
pesquisa.
