Carina Martins de Moraes

Produção e avaliação de proteína SeM

recombinante para o controle de Adenite Eqüina

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Tese

Pelotas, 2008

1

CARINA MARTINS DE MORAES

Produção e avaliação de proteína SeM recombinante p ara o controle de Adenite Equina

Orientador: Dr. Carlos Gil Turnes

Co-orientadores: Dr. Carlos Eduardo Wayne Nogueira

Dr. Fábio Pereria leivas Leite

Dr. Fabrício Rochedo Conceição

Pelotas, 2008

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (área de conhecimento: Produção de Vacinas).

2

Banca examinadora:

Prof. Dr. Agueda Palmira Castagna de Vargas, Universidade Federal de Santa Maria

Prof. Dr. Carlos Eduardo Wayne Nogueira, Universidade Federal de Pelotas

Prof. Dr. Silvia Oliveira Hübner, Universidade Federal de Pelotas

Prof. Dr. Fábio Pereira Leivas Leite, Universidade Federal de Pelotas (Co-orientador)

Prof. Dr. Fabrício Rochedo Conceição, Universidade Federal de Pelotas (Co-orientador)

Prof. Dr. Carlos Gil Turnes, Universidade Federal de Pelotas (Orientador)

3

Dados de catalogação na fonte: Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel

M827p Moraes, Carina Martins de Produção e avaliação de proteína SeM recombinante

para o controle de adenite eqüina / Carina Martins de Moraes ; orientador Carlos Gil Turnes ; co-orientador Carlos Eduardo Wayne Nogueira, Fábio Pereira Leivas Leite, Fabrício Rochedo Conceição. – Pelotas, 2008. – 79f. : il. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Centro de Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2008.

1.Biotecnologia. 2.Adenite eqüina. 3.Streptococcus equi.

4.rSeM. 5.Vacina. 6.ELISA. I.Turnes, Carlos Gil. II.Nogueira, Carlos Eduardo Wayne. III.Leite, Fábio Pereira Leivas. IV.Conceição, Fabrício Rochedo. V.Título.

CDD: 636.100896

4

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente aos meus pais, Roni e Jacira, por sempre estarem

ao meu lado me incentivando e por terem despertado em mim o gosto pela pesquisa

e experimentação mesmo sem serem pesquisadores, estimulando minhas

indagações durante a vida. Essa conquista também é de vocês.

Ao meu orientador, Dr. Carlos Gil Turnes, por todo apoio durante o

desenvolvimento deste projeto. Professor acima de tudo, me ensinou que a única

forma de adquirir sabedoria é compartindo o conhecimento e me mostrou que a

docência é uma eterna troca de aprendizado.

Ao Dr. Fábio Pereira Leivas Leite, pela amizade e pelo exemplo de

profissional a ser seguido. Em todas as etapas deste trabalho soube orientar de

forma impecável muitos de meus passos, estimulando e tornando possível meu

crescimento pessoal e profissional. Suas atitudes sensatas e retas foram

impressindíveis para que eu sempre focasse em meus objetivos.

Ao Dr. Carlos Eduardo Wayne Nogueira pela amizade, parceria de longa data

e por ter despertado em mim, desde a graduação, o respeito pela vida animal e o

gosto pela clínica médica. Sua colaboração de grande valia nunca me permitiu

esquecer que a pesquisa científica, antes de mais nada, deve ter aplicação prática.

Ao Dr. Fabrício Rochedo Conceição, por sua contribuição científica

importantíssima para a realização desta tese.

A Dr. Agueda Vargas e ao LABAC, por toda a colaboração e parceria desde o

início deste trabalho.

Aos grandes amigos e colaboradores, Andréa e Alceu. Espero que minhas

atitudes durante estes anos de trabalho possam ter expressado minha gratidão por

tudo que o apoio de vocês significou e sempre significará para mim. Sem vocês este

trabalho não seria possível.

Aos amigos do laboratório 4 do CENBIOT (Adalgisa, Liana, Lorena, Mayara,

Mariana, Nizoli, Rodrigo, João Rodrigo, Cleonice, Luciano) e do laboratório 6 do

Instituto de Biologia (Regis e Rita), pelo companheirismo e por tornarem os dias de

trabalho mais alegres.

5

À minha amiga de todas as horas, Talita, pelas lágrimas e risadas divididas e

por me fazer enxergar que mesmo parecendo, nada é por acaso. E que é nas

situações mais difíceis que aprendemos as maiores lições.

Aos velhos amigos Fabiana, Milton e Amanda, que me conhecem como

ninguém e que me impulsionaram desde o início a buscar meus objetivos sem

esquecer quem sou.

Aos verdadeiros amigos adquiridos durante a caminhada: Éverton, Flávia,

Luana, Mariana Coutinho, Michele, Otávio e Roberta. Obrigada por compartilharem

comigo minhas alegrias e tristezas e por me possibilitarem disfrutar do convívio com

suas famílias, me abrindo as portas de seus lares e nunca me permitindo desistir

frente aos obstáculos. Vocês, com toda certeza, são os melhores resultados desta

tese.

À CAPES, CNPq e FAPERGS, pelo apoio financeiro que permitiu a realização

deste trabalho.

Muito Obrigada.

6

RESUMO

MORAES, Carina Martins. Produção e avaliação de proteína SeM recombinante para o controle de Adenite Equina. 2008. 79 f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas,Brasil. A Adenite Eqüina é uma enfermidade contagiosa do trato respiratório superior dos eqüídeos causada por Streptococcus equi subesp. equi. Animais portadores assintomáticos responsáveis pela permanência da infecção nos rebanhos só podem ser detectados por métodos microbiológicos ou sorológicos e as vacinas utilizadas no controle da doença induzem níveis de proteção geralmente não superiores a 50 %. Considerando que a proteína SeM de S. equi é o antígeno mais promissor na proteção contra a doença, este trabalho objetivou produzir a proteína SeM recombinante de S. equi, visando sua utilização como antígeno em vacinas e em ELISA. Proteína SeM recombinante (rSeM) foi produzida mediante a clonagem e expressão em Escherichia coli e purificada por cromatografia de afinidade. Para testar sua capacidade imunogênica, vacinas elaboradas com rSeM foram aplicadas a camundongos. Fêmeas Balb/c isogênicas com 4-6 semanas foram divididas aleatoriamente e inoculadas por via SC com 1/20 da dose vacinal estimada para cavalos, nos dias 0 e 21 do experimento. Um grupo foi vacinado com 250 µL (12 µg mL-1) de proteína recombinante sem adjuvante, outro com 300 µL de vacina contendo 12 µg mL-1 rSeM adicionada de 20% de hidróxido de alumínio, outros dois grupos com duas bacterinas comerciais contra Adenite Eqüina; dois grupos com as vacinas comerciais, acrescidas de 12 µg mL-1

de rSeM e o grupo restante com uma bacterina contendo cepas de campo. O grupo controle foi inoculado com o mesmo volume de solução salina estéril. Coletou-se sangue por punção do plexo venoso retro-ocular nos dias 0, 21 e 42. Os anticorpos foram titulados por ELISA utilizando a proteína rSeM como antígeno. A rSeM foi imunogênica em camundongos com índices de proteção de 100%. Para a padronização de um ELISA, utilizaram-se grupos de 20 soros equinos de animais negativos, vacinados e positivos. Utilizando um ponto de corte de média das densidades ópticas dos soros negativos acrescidos de dois desvios padrão, o teste teve 100% de sensibilidade e especificidade. Palavras chave : Adenite Eqüina, Streptococcus equi, rSeM, vacina, ELISA

7

ABSTRACT

MORAES, Carina Martins. Production and evaluation of a recombinant SeM protein for Strangles´ control. 2008. 79f. DSc Thesis - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Brazil. Strangles is a contagious disease of the upper respiratory tract of horses caused by Streptococcus equi subsp. equi. Asymptomatic carriers responsible for maintaining the infection in the herd can only be detected by serological or microbiological methods and vaccines used for the control of the disease induce levels of protection generally not exceeding 50%. Considering that S. equi SeM protein is considered the most promising antigen to protect against the disease, this research aimed to produce and evaluate as antigen for vaccines and for ELISA, a recombinant S. equi SeM protein (rSeM). rSeM was produced by cloning and expression in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. To test its immunogenicity isogenic female Balb-c mice 4-6 weeks-old were randomly divided and inoculated with 1 / 20th of the estimated dose of the vaccine for horses by the SC route, on days 0 and 21 of the experiment. One group was vaccinated with 250µL (12 µg mL-1) of rSeM without adjuvant, another with 300µL of vaccine containing 12 µg mL-1 of rSeM plus 20% of aluminiun hydroxide, two other groups were vaccinated with two commercial bacterins against Strangles, other two groups were vaccinated with the same commercial vaccines containing 12 µg mL-1 of rSeM and the remaining group was inoculated with a bacterin produced with a field strain. The control group was inoculated the same dose of sterile saline. Blood samples were collected from the retro-orbital venous plexus on days 0, 21, 42. The antibodies were titrated by ELISA using rSeM as antigen. rSeM was immunogenic for mice with a protection index of 100%. For the standardization of an ELISA, groups of 20 negative, vaccinated and positive animals were used. Using as Cut-off the mean plus two SD of the Optical Densities of the negatives, the test showed 100% sensitivity and specificity. Key words: Strangles, Streptococcus equi, rSeM, ELISA, vaccines

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LISTA DE ABREVIATURAS

Albumina sérica bovina BSA

Anticorpo monoclonal MAb

Days post inoculation dpi

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA

Escherichia coli E. coli

Escherichia coli TOP 10 (InvitrogenTM) TOP 10

Gene da Proteina M de Streptococcus equi subesp. equi SeM

Intraperitoneal IP

Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside IPTG

Kilo Dalton kDa

Luria Bertani low salt LB

Proteína M de Streptococcus equi subesp. equi SeM

Proteína M recombinante de Streptococcus equi subesp. equi rSeM

Reação em cadeia da polimerase PCR

Streptococcus equi subesp. equi S. equi

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................10

2 ARTIGO 1: Adenite Eqüina: Sua etiologia, diagnóstico e controle .........................15

Introdução .................................................................................................................18

Conclusão .................................................................................................................31

Referências bibliográficas .........................................................................................32

3 ARTIGO 2: Evaluation of the immunogenicity of a recombinant SeM protein in mice

...............................................................................................................................41

Introduction................................................................................................................43

Material and Methods...................................................Erro! Indicador não definido.

Results ......................................................................................................................48

Discussion.................................................................................................................50

References................................................................................................................51

4 ARTIGO 3: Evaluation of an ELISA using a recombinant SeM protein of

Streptococcus equi subsp. equi .............................................................................55

Introduction................................................................................................................57

Material and Methods...................................................Erro! Indicador não definido.

Results ......................................................................................................................62

Discussion.................................................................................................................64

References................................................................................................................65

5. CONCLUSÕES .....................................................................................................69

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................70

10

1. INTRODUÇÃO

O Brasil possui o terceiro maior rebanho eqüino do mundo, com um plantel de

5,9 milhões de animais, segundo números da Food and Agriculture Organization

(FAO) de 2002, ficando atrás apenas da China (8,2 milhões) e do México (6,2

milhões). No país, a eqüinocultura é responsável por 1,2 milhões de empregos,

ocupando diretamente mais de 500 mil pessoas. O setor forma hoje uma importante

cadeia do agronegócio, com forte interação dos setores ligados ao lazer, cultura e

turismo, sendo uma das cadeias produtivas que oferece mais oportunidades de

trabalho, conquistando posição de destaque na economia nacional, embora o

potencial econômico da atividade seja pouco conhecido. A capacidade dos criadores

em produzirem animais de qualidade, com visão mercadológica, incrementa a

perspectiva de crescimento desse setor da pecuária. Um exemplo é a exportação

brasileira de eqüinos puro-sangue árabe, que ocupa 2º lugar no mundo, perdendo

apenas para os Estados Unidos (CNA, 2003). Com base neste fato, todo processo

que venha prevenir ou possibilitar diagnósticos precisos para doenças infecciosas

nesses rebanhos tem crucial importância, tanto do ponto de vista de mercado quanto

de saúde animal.

As enfermidades do trato respiratório de eqüinos têm um papel importante no

que diz respeito a estas perdas. Os distúrbios deste sistema podem ocupar o

segundo lugar atrás dos distúrbios do sistema músculo esquelético na limitação do

desenvolvimento atlético dessa espécie (KOWALSKI, 2000). Ocorrem grandes

perdas econômicas quando os programas de treinamento são interrompidos em

razão de enfermidades respiratórias. Portanto, a detecção precoce de problemas

respiratórios é essencial para o rápido retorno dos animais de corrida aos treinos,

porém é ainda mais importante na prevenção de complicações secundárias que, por

11

fim, podem encerrar prematuramente a carreira do animal (AINSWORTH & BILLER,

2000).

Dentre as afecções do trato respiratório superior de cavalos, a Adenite

Eqüina, uma doença bacteriana de alta morbidade é uma das mais comumente

enfrentadas pelos animais, principalmente nas regiões mais frias do país, como o

Rio Grande do Sul. Dentre os casos de enfermidade infecciosas de eqüinos que são

notificadas ao International Collating Centre, 30% são casos de Adenite Eqüina

(CHANTER , 1997).

A Adenite Eqüina, também conhecida como “Garrotilho”, é uma enfermidade

bacteriana causada pelo Streptococcus equi subesp. equi (S. equi), bactéria β

hemolítica do grupo C de Lancefield, que atinge o trato respiratório superior de

eqüinos acometendo animais de todas as idades, preferencialmente os jovens

(SWEENEY, 1993; TIMONEY et al., 1997). Existem diferentes cepas do agente que

influem diretamente na resposta imune e na severidade dos sinais clínicos (GRANT

et al., 1993).

S. equi é fenotipicamente e geneticamente relacionado com S. equi subesp.

zooepidemicus, sendo estes considerados da mesma espécie até 1984. Entretanto,

após estudos de homologia de DNA, demonstrada sua semelhança genética e

fenotípica, as espécies forma reclassificadas como S. equi subesp. equi e S. equi

subesp. zooepidemicus (FACKLAM, 2002; EUZÉBY, 2005). A fermentação de

lactose, sorbitol e trealose utiliza-se como critério para a diferenciação dessas

espécies. S. equi não fermenta nenhum destes carboidratos entanto que S. equi

subesp. zooepidemicus fermenta lactose e sorbitol (KUWAMOTO et al., 2001). Foi

relatado, porém, que cepas atípicas de S. equi fermentam açúcares (GRANT et al.,

1993), dificultando a diferenciação fenotípica desses agentes.

A doença tem alta morbidade e baixa letalidade, o que é de relevância nos

locais com grandes concentrações de eqüinos e pode ocorrer em todas as épocas

do ano. As condições climáticas de frio e umidade facilitam a sobrevivência do

agente e sua disseminação, o que faz com que os animais que vivem nos estados

mais frios e úmidos do país, como o Rio Grande do Sul, sejam mais propícios à

infecção. Os cavalos acometidos apresentam perda de performance, gerando gastos

com tratamento e mão de obra.

O diagnóstico clínico e o tratamento são realizados sem dificuldade, mas há

carência de kits comerciais de fácil aceso para o diagnóstico de certeza. A profilaxia,

12

por sua vez, está limitada pela baixa eficácia das vacinas disponíveis no mercado,

que protegem em torno de 50% dos vacinados, apenas reduzindo a severidade da

doença e a morbidade durante os surtos (HARRINGTON et al, 2002).

S. equi sintetiza vários fatores de virulência, entre eles cápsula de ácido

hialurônico, hialuronidase, streptolisina O, streptoquinase, receptores para Fc de

IgG, peptidoglicano e proteína M. Além desses, LANNERGARD et al. (2003)

descreveram uma proteína de 657 aminoácidos denominada CNE que tem a

propriedade de ligar colágeno, e que por sua similitude com a proteína CNA de

Staphylococcus aureus poderia ser outro fator de virulência. Foram também

identificadas duas proteínas extracelulares que se ligam a fibronectina, denominadas

FNE (LINDMARK & GUSS et al., 1999; LINDMARK et al., 2001) e SFS (LINDMARK

& GUSS et al., 1999), agindo como fatores de aderência às células alvo do

hospedeiro.

ANZAI et al. (1999) comunicaram que cepas de S. equi isoladas na América

do Norte, Japão e Irlanda apresentaram uma importante atividade mitogênica e

pirogênica, e sugeriram que a diferença na virulência com S. equi subesp.

zooepidemicus poderia dever-se a sua capacidade de produzir proteínas análogas

às exotoxinas pirogênicas de S. pyogenes. ARTIUSHIN et al. (2002) caracterizaram

dois mitógenos pirogênicos, denominados SePE-H e SePE-I, e testaram a

imunogenicidade destas proteínas, confirmando que elas conferem maior virulência

ao S. equi. A cápsula é também um importante fator de patogenicidade, já que

cepas com níveis diferentes de expressão de cápsula apresentaram diferenças de

patogenicidade em vivo e de resistência à fagocitose (ANZAI et al., 1999). TIMONEY

et al. (2008) identificaram recentemente em cepas de S. equi uma IgG

endopeptidase denominada IdeE, previamente descrita somente em Streptococcus

pertencentes ao grupo A de Lancefield, que demonstrou atividade antifagocítica.

Dentre estes fatores, a proteína M (proteína SeM) de 58 kDa, codificada pelo

gene SeM, tem especial importância, por ser uma proteína de membrana com

capacidade antifagocítica e de aderência. Essa proteína vem sendo utilizada para

diagnóstico e é uma candidata promissora a antígeno vacinal.

A presença da proteína SeM em S. equi foi primeiramente sugerida por

Bazely et al. em 1949, que utilizaram extratos ácidos para induzir anticorpos

protetores em camundongos e cavalos. Esta observação foi posteriormente

confirmada por MOORE & BRYANS (1970), WOOLCOCK (1974) e ERICKSON &

13

NORCROSS (1975). Após purificação e caracterização de proteína SeM extraída

com auxílio de mutanolisina, GALAN & TIMONEY (1987) demonstraram que a

proteína SeM nativa é produzida como um dímero ou trímero, com massa molecular

variando de 54 a 58 kDa.

A SeM tem grande importância na patogenia da enfermidade, ligando-se ao

fibrinogênio e impedindo a deposição de C3b na superfície bacteriana, que resulta

em uma ação antifagocítica similar à que se pode observar na proteína M

encontrada nos estreptococos do grupo A de Lancefield (BOSCHWITZ & TIMONEY,

1994b; MEEHAN, 2000).

Aproximadamente 10% dos cavalos acometidos pela enfermidade

permanecem como portadores do agente, abrigando S. equi em condróides

localizados na bolsa gutural, sendo capazes de infectar outros animais e

disseminando desta forma a enfermidade (CHANTER, 2000). Este fato faz com que

as diferentes técnicas de diagnóstico sorológico tenham crucial importância na

identificação destes animais, possibilitando assim o controle da enfermidade nos

diferentes estabelecimentos.

Neste contexto, a técnica de ELISA pode ser utilizada no diagnóstico indireto

da enfermidade demonstrando a presença de anticorpos, servindo para a detecção

de portadores e auxiliando na identificação dos animais que apresentam resposta

vacinal ao agente. Está disponível apenas um kit comercial em nível mundial para o

diagnóstico de Garrotilho por ELISA (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine,

USA), que utiliza como antígeno proteína M específica de S. equi. O teste não

distingue entre as respostas à vacina e à infecção, mas a magnitude dos títulos de

anticorpos permite essa diferenciação. Os soros são classificados como negativo

(sem anticorpos), fraco positivo (baixo nível de anticorpos), positivo moderado (que

pode ocorrer em cavalos duas a três semanas após a exposição), positivo forte

(animais com quatro a doze semanas após a infecção, ou vacinados), e positivo

muito forte (eqüinos com púrpura hemorrágica ou Garrotilho bastardo).

Por se tratar de uma enfermidade de alta prevalência e grande importância

econômica, são necessários maiores estudos sobre o controle, prevenção e

diagnóstico da Adenite Eqüina, bem como da virulência das cepas de campo

existentes em cada região, visto que no Brasil poucas informações foram publicadas

a respeito de sua epidemiologia e caracterização.

14

No estado do Rio Grande do Sul encontram-se haras de grande importância

para a criação de eqüinos de alto padrão zootécnico, localizados principalmente no

município de Bagé, que exigem o controle de enfermidades como a Adenite Eqüina.

Um conhecimento mais aprofundado da estrutura e da virulência do agente, assim

como a detecção e o controle de animais portadores, o diagnóstico eficiente e a

produção de novas vacinas, também são objeto de pesquisa. Somente através do

conhecimento do genótipo e fenótipo das cepas existentes na região será possível a

produção de vacinas eficazes. Pesquisas envolvendo técnicas avançadas de

biologia molecular serão de utilidade para melhor compreensão dos eventos

envolvidos na patogenia da doença e o desenvolvimento de novos produtos visando

uma resposta imune mais eficiente sem as reações indesejáveis causadas pelas

vacinas atualmente em uso.

O objetivo do presente trabalho foi produzir proteína SeM recombinante de S.

equi e avaliar sua eficiencia como antígeno vacinal e para uso em diagnóstico de

Adenite Eqüina.

Hipótese

Proteína M recombinante de Streptococcus equi subesp. equi pode ser

utilizada como antígeno vacinal e para diagnóstico de Adenite Eqüina.

Objetivo Geral

Desenvolver e avaliar uma vacina de proteína M recombinante de

Streptococcus equi subesp. equi e padronizar um ELISA utilizando essa proteína.

Objetivos Específicos

1 – Clonar e expressar SeM de Streptococcus equi em Escherichia coli.

2 - Elaborar vacinas contendo rSeM

3 - Avaliar a imunogenicidade e inocuidade das vacinas em camundongos

4 – Padronizar ELISA utilizando rSeM como antígeno

15

2 ARTIGO 1

ADENITE EQÜINA: SUA ETIOLOGIA, DIAGNÓSTICO E CONTRO LE

(Revisão bibliográfica submetida à revista Ciência Rural)

16

Adenite eqüina: sua etiologia, diagnóstico e controle

Strangles: etiology, diagnosis and control

Carina Martins de Moraes1; Agueda Palmira Castagna de Vargas2; Fábio Pereira Leivas

Leite3; Carlos Eduardo Wayne Nogueira4; Carlos Gil TurnesI.

- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA -

RESUMO

A Adenite Eqüina, também conhecida como Garrotilho, é uma enfermidade bacteriana

contagiosa, causada por Streptococcus equi subesp. equi, bactéria β hemolítica do grupo C de

Lancefield, que afeta o trato respiratório anterior de eqüinos de todas as idades, com maior

prevalência entre um e cinco anos de idade. Caracteriza-se por produzir secreção

mucopurulenta das vias aéreas anteriores e linfadenite dos gânglios retrofaríngeos e

submandibulares com formação de abscessos. Fatores de virulência de S. equi subesp. equi

incluem cápsula de ácido hialurônico, hialuronidase, estreptolisina O, estreptoquinase,

receptores para Fc de IgG, peptidoglicano e proteína M. Dentre estes fatores, a proteína M

tem especial importância por ser uma proteína de membrana com propriedades

antifagocitárias e de aderência. A doença tem baixa letalidade e alta morbidade, e seus

prejuízos econômicos devem-se à perda de performance e custo do tratamento. O diagnóstico

clínico e o tratamento não apresentam dificuldades, mas a profilaxia é prejudicada pela baixa

eficiência das vacinas disponíveis, com índices de proteção de 50%. O Garrotilho pode

ocorrer em todas as épocas do ano, mas o frio e a umidade facilitam a sobrevivência do agente

e sua disseminação, pelo que animais que vivem nos estados mais frios e úmidos do país são 1 Faculdade de Veterinária e Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, CP 354, 96010900 Pelotas/RS . Autor para correspondência: Tel +55-53-3275-7350; E mail: gil@ufpel.edu.br 2 Laboratório de Doenças Infectocontagiosas, CCR/ UFSM, CEP 97119-900 Santa Maria/RS

3 Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas, CP 354, 96010900 Pelotas/RS

4 Hospital de Clínicas Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, CP 354, 96010900 Pelotas/RS

17

mais vulneráveis à infecção. Novas vacinas utilizando antígenos purificados ou de

subunidades estão sendo desenvolvidas com a finalidade de incrementar sua potencia e evitar

efietos indesejáveis. A comprovação de diferenças de antigenicidade entre cepas alerta sobre a

importância da seleção apropriada das cepas vacinais.

Palavras-chave: Garrotilho, vacina, Streptococcus equi subesp. equi

ABSTRACT

Strangles is a contagious disease of the respiratory tract of horses produced by

Streptococcus equi subsp. equi, a Lancefield´s group C β haemolytic bacterium. It produces a

mucopurulent secretion of the anterior airways, as well as lymphadenitis and abscesses. The

bacteria synthesizes several pathogenicity factors such a hyaluronic acid capsule,

hyaluronidase, streptolisin O, streptokinase, IgG Fc receptors, peptidoglican and protein M.

Among these factors, protein M deserves special importance due to its antifagocitic and

adherence properties. The disease has high morbidity and low lethality, and produces

economic losses due to low performance and treatment. Clinical diagnosis and treatment are

done easily, but prophylaxis is hampered by the low potency of the vaccines, that protect

around 50 % of vaccinated animals. Strangles may occur during all the year, but cold and

humid weather favours the survival of streptococci, making animals that live in regions with

those characteristics more prone to infection. New vaccines using purified or subunit antigens

have been developed aiming to increase their potency and to avoid undesirable side effects.

The demonstration that strains of the bacteria show differences in their antigenicity, called

attention on the selection of appropriate strains to use as antigens.

Key words: Strangles, vaccine, Streptococcus equi subsp. equi

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INTRODUÇÃO

O Brasil possui o terceiro maior rebanho eqüino do mundo, com um plantel de 5,9

milhões de animais, menor apenas que o da China (8,2 milhões) e do México (6,2 milhões). A

eqüinocultura é responsável, no país, por 1,2 milhões de postos de trabalho, ocupando

diretamente mais de 500 mil pessoas, sendo uma importante atividade do agronegócio, com

forte interação nos setores de lazer, cultura e turismo. A capacidade dos criadores em

produzirem animais de qualidade, fundamenta a perspectiva de crescimento desse setor da

pecuária, como o exemplifica a exportação brasileira de eqüinos puro-sangue árabe, que

ocupa o segundo lugar no mundo, só inferior aos Estados Unidos de América (CNA, 2003).

As doenças do aparelho respiratório ocupam o segundo lugar entre as doenças limitantes

das atividades dos eqüinos, atrás só das que afetam o sistema músculo esquelético,

produzindo importantes perdas econômicas. O diagnóstico e prevenção das doenças

infecciosas nessa espécie adquirem, portanto, especial significação. A detecção precoce de

problemas respiratórios é essencial para o rápido retorno dos animais a sua atividade, e na

prevenção de complicações secundárias que podem encerrar prematuramente a carreira do

animal (AINSWORTH e BILLER, 2000).

A Adenite Eqüina é uma bacteriose de alta morbidade, sendo uma das mais freqüentes

doenças do trato respiratório anterior de cavalos nas regiões mais frias do país. Métodos

eficientes e rápidos de diagnóstico de certeza, e produtos eficientes para seu controle, devem

ser desenvolvidos para diminuir o impacto econômico da doença.

19

1 – A enfermidade

A Adenite Eqüina, também conhecida como Garrotilho, é uma enfermidade bacteriana

causada pelo Streptococcus equi subsp. equi, bactéria β hemolítica pertencente ao grupo C de

Lancefield, que atinge o trato respiratório superior de eqüinos acometendo animais de todas as

idades, embora com maior prevalência nos jovens (SWEENEY, 1993; TIMONEY et al.,

1997. O termo Garrotilho deve-se a que cavalos afetados e não tratados parecem estar sendo

estrangulados (garroteados), devido ao aumento dos linfonodos retrofaríngeos e

subamandibulares, que obstruem a faringe. Eqüídeos de todas as idades podem padecer a

doença, embora seja mais freqüente em animais com menos de cinco anos de idade e,

especialmente, em potros (AINSWORTH e BILLER, 2000). Sua morbidade é alta e a

letalidade baixa, sendo seus prejuízos econômicos devidos a gastos com tratamento e

suspensão das atividades dos animais. Meningite em humanos causada por S. equi subsp.

zooepidemicus resultante de contato com cavalos doentes foi relatada por DOWNAR et al.

(2001), e vários autores identificaram fatores de virulência de S. equi subsp. equi em humanos

(BISNO et al., 1996; NICHOLSON et al., 2000). O agente foi isolado também de camelos

(YIGEZU et al., 1997).

A transmissão da enfermidade se dá de forma direta por cavalos que estão incubando a

doença, que apresentam sinais clínicos, que estão recuperando-se e por portadores, ou

indireta, por meio de fômites, tais como buçais e outros utensílios, e de pastagens, aguadas e

estábulos contaminados com secreções (PRESCOTT & WRIGTH, 2000). O agente

permanece na população em eqüinos portadores. Estima-se que vinte por cento dos animais

convalescentes ou aparentemente recuperados, possuem o agente na secreção nasal. Durante

os surtos de Garrotilho alguns animais se convertem em portadores assintomáticos dos que é

possível isolar S. equi subsp. equi após o desaparecimento dos sinais clínicos, sendo fontes de

infecção por muitos meses (NEWTON et al., 1997). A bactéria pode permanecer viável nas

20

descargas purulentas por semanas ou meses, e os estábulos permanecem contaminados se não

forem cuidadosamente limpos e desinfetados com iodo povidona e Clorexidine. Estresse,

transporte, excesso de trabalho, viroses e parasitoses, aumentam a suscetibilidade dos animais

e podem desencadear a enfermidade em animais com infecção latente (SCHILD, 2001).

A enfermidade ocorre quando o S. equi subsp. equi fixa-se às células epiteliais da

mucosa nasal e bucal e invade a mucosa nasofaríngea, causando faringite aguda e rinite. Caso

o hospedeiro não consiga conter o processo, o agente invade a mucosa e o tecido linfático

faríngeo. À medida que a doença progride desenvolvem-se abscessos principalmente nos

linfonodos retrofaríngeos e submandibulares, causando obstrução local por compressão. Sete

a 14 dias após fistulam, drenando na faringe, na bolsa gutural ou no exterior, liberando pus

contendo a bactéria que contamina o ambiente por semanas (KOWALSKI, 2000; PRESCOTT

& WRIGTH, 2000). Embora a patogenia da enfermidade seja conhecida, a regulação de

muitos eventos chave, tais como a aderência da bactéria, a invasão dos epitélios e a interação

com fagócitos, não são ainda adequadamente conhecidos (SLATER, 2003).

As manifestações clínicas da doença iniciam em geral após duas semanas da exposição

ao agente. Os animais mostram os sinais clínicos típicos de um processo infeccioso

generalizado (depressão, inapetência, febre), assim como secreção nasal, inicialmente serosa,

que passa a mucopurulenta e a purulenta em alguns dias, tosse produtiva, dor à palpação da

região mandibular e aumento de volume de linfonodos, principalmente submandibulares,

assim como posição de pescoço estendido devido à dor na região da garganta (SWEENEY,

1993; AINSWORTH & BILLER, 2000). Em geral, após a drenagem do abscesso, o animal se

recupera rapidamente (KOWALSKI, 2000). Embora a doença se apresente geralmente na

forma descrita, denominada clássica, alguns cavalos, em especial animais velhos, podem

formar abscessos pequenos ou não produzi-los, como conseqüência de uma resposta imune

gerada por uma infecção previa por S. equi subsp. equi ou por cepas de baixa virulência

21

(PRESCOTT & WRIGHT, 2000). Embora a letalidade da doença seja muito baixa, pode levar

à morte por complicações tais como Garrotilho bastardo, púrpura hemorrágica, empiema da

bolsa gutural e pneumonia aspirativa (SWEENEY, 1993; AINSWORTH& BILLER, 2000).

A denominação de Garrotilho bastardo, termo que gera controvérsias entre os autores,

foi originalmente aplicada a uma linfoadenopatia não supurativa dos linfonodos retrofaríngeos

e submandibulares em cavalos velhos, não relacionada à ocorrência de metástases,

caracterizada por sua baixa prevalência, mas que quando o tratamento é ineficiente, pode

levar o animal à morte (PRESCOTT & WRIGHT, 2000). Caracteriza-se pela disseminação de

S. equi subsp. equi a outros linfonodos, além dos submaxilares, submandibulares e

retrofaríngeos, provocando abscessos em qualquer parte do corpo, ainda que com maior

freqüência nos pulmões, mesentério, fígado, baço, rins e cérebro, cuja ruptura pode causar

infecção generalizada, provocando a morte. Embora as causas de esta forma da doença não

sejam bem conhecidas, alguns autores a associam a terapia antimicrobiana inadequada

durante a fase de expectoração e fistulização dos linfonodos (KOL et al., 2003).

A púrpura hemorrágica, uma vasculite aguda imuno-mediada que ocorre em geral em

animais convalescentes de Garrotilho, é devida à precipitação nos capilares de

imunocomplexos formados por anticorpos e frações do agente, provocando edema severo dos

membros, cabeça e outras partes do corpo (GALÁN & TIMONEY, 1985). Pode produzir-se,

também, após a aplicação de vacinas. PUSTERLA et al. (2003) relataram 53 casos de púrpura

hemorrágica em eqüinos, sendo 17 destes expostos ou infectados com S. equi subsp. equi e

cinco vacinados com vacinas que continham proteína M como antígeno.

O empiema das bolsas guturais pode ocorrer durante o curso clínico da enfermidade

ou no período de convalescença do Garrotilho. Os eqüinos possuem duas bolsas guturais,

sacos ou divertículos da tuba auditiva com capacidade de 300 mL, situadas entre a base do

crânio e a faringe. A infecção persistente da bolsa gutural pode levar à aspiração de pus e, em

22

alguns casos, à formação de condróides. Esses animais são portadores e constituem a maior

fonte de disseminação do agente entre animais suscetíveis (KOWALSKI, 2000).

O diagnóstico de Garrotilho pode ser confirmado por isolamento do S. equi subsp.

equi a partir de secreção nasal purulenta ou do conteúdo de abscessos, coletada com auxílio

de suabe nasal e conservado sob refrigeração até o momento da análise do material. A técnica

de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), frequentemente utilizada na atualidade, detecta o

agente vivo ou morto através da amplificação do gene da proteína SeM, permitindo, quando

associada à cultura bacteriana, a detecção de até 90% dos portadores (HARRINGTON et al.,

2002). AL-GHAMDI et al. (2000) comunicaram uma seqüência repetitiva detectada por PCR

que pode ser útil para a tipificação da bactéria. KAWATA et al. (2004), por sua vez,

desenvolveram um procedimento que consiste de duas reações de PCR, com uso de sete e oito

primers simultaneamente onde o tamanho de cada amplicon caracteriza uma espécie diferente

de Streptococcus.

A técnica de ELISA pode ser utilizada no diagnóstico indireto da enfermidade,

demonstrando a presença de anticorpos. Existe apenas um kit comercial em nível mundial

para o diagnóstico por ELISA (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine, USA), que

utiliza como antígeno proteína M específica de S. equi subsp. equi. O teste não distingue entre

resposta a vacina e à infecção, mas a magnitude dos títulos de anticorpos permite essa

diferenciação. Os soros são classificados como negativo (sem anticorpos), fraco positivo

(baixo nível de anticorpos), positivo moderado (que pode ocorrer em cavalos duas a três

semanas após a exposição), positivo forte (animais com quatro a doze semanas após a

infecção, ou vacinados), e positivo muito forte (eqüinos com púrpura hemorrágica ou

Garrotilho bastardo (WALLER & JOLLEY, 2007). Recentemente proteína M recombinante

produzida no Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, RS, foi utilizada

como antígeno em reações de ELISA com resultados promissores (MORAES et al., 2007).

23

O tratamento da enfermidade é feito de acordo com o estágio da doença. Animais que

não apresentam abscessos nos linfonodos devem ser tratados com penicilina G, na dosagem

de 18.000 a 20.000 UI/Kg ou trimetoprim associado a sulfametaxol 20mg/Kg, via

intramuscular, por 5-10 dias (PRESCOTT & WRIGHT, 2000). Quando há abscessos,

aplicam-se substâncias revulsivas, tais como iodo, que facilitam sua maduração para depois

ser puncionados. Curativo local deve ser feito posteriormente, através da irrigação do

abscesso com solução de Iodo a 2%. Animais em risco podem ser tratados preventivamente

com penicilina durante o período de exposição ao microorganismo. Segundo SWEENEY et

al. (2005) as complicações devem ser tratadas com terapia de suporte tais como fluidoterapia,

medicações expectorantes e antimicrobianos em dosagens superiores às normalmente

recomendadas (Penicilina G acima de 22.000 UI/Kg).

2 - Etiologia e características do agente

Os Streptococcus são bactérias Gram-positivas com forma de cocos, catalase

negativas, que se dividem em apenas um plano, e que por não se separarem facilmente após a

divisão tendem a formar cadeias. Constituem a principal população de microorganismos da

cavidade oral, e são os agentes etiológicos de várias doenças de animais e humanos. Entre as

formas de classificação de este gênero destacam-se aquelas baseadas nas características da

hemólise e dos antígenos de superfície (grupos sorológicos de Lancefield). A tabela 1 mostra

as características bioquímicas dos Streptococcus β hemolíticos do grupo C de Lancefield.

24

Tabela 1. Caracterização bioquímica de Streptococcus do grupo C de Lancefield β

hemolíticos isolados de animais.

Streptococcus equi subsp. equi equi subsp.

ruminatorum

equi subsp.

zooepidemicus

dysgalactiae

subsp. equisimilis

phocae

Grupo de Lancefield C C C C, G ou L

F ou C

Esculina Geralmente + - Geralmente + Geralmente - -

Hidrólise do hipurato

de sódio

- + - - -

ADH + + + + -

β-glucuronidase + + + + -

CAMP - + - - -

Glicogênio* + + + d -

Lactose* - + + Geralmente + -

Manitol* - - Geralmente - - -

Metil β -D-

glucopiranosido*

+ - + D

Ribosa * - + - + +

Sacarosa * + - + + -

Sorbitol* - d** + - -

Trealosa * - - Geralmente - + -

EUZÉBY, 2004. * : Acidificação; ** : 20 % positivas utilizando API Rapid ID 32 Strep

As espécies de estreptococos β-hemolíticos mais importantes e freqüentemente

isoladas de eqüinos são S. equi subesp. zooepidemicus, S. equi subesp. equi e S. dysgalactiae

subesp. equisimilis. Dentre estes, o S. equi subesp. zooepidemicus é o microorganismo mais

freqüentemente isolado, mas o S. equi subesp. equi é o economicamente mais importante

devido a sua elevada patogenicidade (KOWALSKI, 2000). EUZÉBY (2005) propõe

25

denominar S. equi subesp. equi como S. equi, S. equi subesp. zooepidemicus como S.

zooepidemicus e S. dysgalactiae subesp. equisimilis como S. equisimilis.

É necessário diferenciar S. equi subesp. equi de S. equi subesp. zooepidemicus para

iniciar o tratamento específico antes que se dissemine no rebanho (KOWALSKI, 2000). S.

equi subesp. zooepidemicus produz colônias mucóides com 1 a 3 mm de diâmetro após 18 a

24 horas de cultivo em Agar Sangue. A cápsula de ácido hialurônico é freqüentemente

hidrolisada pela hialuronidase produzida pelo próprio microorganismo durante o cultivo, do

que resulta uma colônia achatada, transparente e opaca. S. equi subesp. equi produz também

colônias mucóides por causa da cápsula de ácido hialurônico, mas estas apresentam uma

coloração dourada em agar sangue, e embora ambas produzam β hemólise, mutações no gene

da estreptolisina podem provocar diferenças nas características da hemólise e das colônias

(MAY et al., 2004). A diferenciação bioquímica das subespécies baseia-se na capacidade de

fermentação de lactose, sorbitol e trealose. S. equi subesp. equi não fermenta nenhum destes

carboidratos, S. equi subesp. zooepidemicus fermenta lactose e sorbitol, e S. equi subesp.

equisimilis, trealose (KUWAMOTO et al., 2001; EUZÉBY, 2005). Foram encontradas,

porém, cepas atípicas de S. equi subesp. equi fermentadoras de trealose, sorbitol e/ou lactose

(GRANT et al.,1993), o que dificulta a caracterização dos agentes. O sistema API 20 STREP,

constituído por 20 testes bioquímicos com elevado poder discriminatório, permite diferenciar

a maioria dos Streptococcus, Enterococcus e microorganismos semelhantes mais comuns

(BIO MÉRIEUX, 1997).

HARRINGTON et al. (2002) classificaram os fatores de virulência do agente em

aqueles que promovem aderência bacteriana, os que interferem na ação do sistema imune e os

envolvidos na aquisição de nutrientes, embora seja difícil enquadrar fatores em categorias

específicas, já que vários deles tem múltipla função. Fatores de virulência de S. equi subesp.

equi incluem cápsula de ácido hialurônico, hialuronidase, estreptolisina O, estreptoquinase,

26

receptores para a Fc de IgG, peptidoglicano e proteína M antifagocítica (TIMONEY &

MUKHATAR, 1993, BOSCHWITZ & TIMONEY et al., 1994). LANNERGARD et al.

(2003) descreveram uma proteína de 657 aminoácidos denominada CNE que tem a

propriedade de ligar colágeno, e que por sua similitude com a proteína CNA de

Staphylococcus aureus poderia ser outro fator de virulência. Foram também identificadas

duas proteínas extracelulares que se ligam a fibronectina, denominadas FNE (LINDMARK &

GUSS et al., 1999; LINDMARK et al., 2001) e SFS (LINDMARK & GUSS et al., 1999),

importantes fatores de aderência do agente às células alvo do hospedeiro.

ANZAI et al. (1999) comunicaram que cepas de S. equi subesp. equi da América do

Norte, Japão e Irlanda apresentaram uma importante atividade mitogênica e pirogênica, e

sugeriram que a diferença na virulência com S. equi subesp. zooepidemicus poderia dever-se a

sua capacidade de produzir proteínas análogas às exotoxinas pirogênicas de S. pyogenes.

ARTIUSHIN et al. (2002) caracterizaram dois mitógenos pirogênicos, denominados SePE-H

e SePE-I, e testaram a imunogenicidade destas proteínas, confirmando que elas conferem

maior virulência ao S. equi subesp. equi. A cápsula é também um importante fator de

patogenicidade, já que cepas com níveis diferentes de expressão de cápsula apresentaram

diferenças de patogenicidade em vivo e de resistência à fagocitose (ANZAI et al., 1999).

TIMONEY et al. (2008) identificaram recentemente em cepas de S. equi subesp. equi uma

IgG endopeptidase denominada IdeE, previamente descrita somente em Streptococcus

pertencentes ao grupo A de Lancefield, que demonstrou atividade antifagocítica.

Dentre os fatores de virulência, a proteína M tem especial importância. Ela é uma

proteína de membrana que possui atividade antifagocítica e de aderência, e está presente em

algumas cepas de Streptococcus (TIMONEY & MUKHTAR, 1993). Foi caracterizada pela

primeira vez por GALÁN & TIMONEY (1987), que clonaram seu gene estrutural e a

expressaram em Escherichia coli. GALÁN & TIMONEY (1988) compararam cepas de S.

27

equi subesp. equi isoladas durante um período de dez anos nos Estados Unidos da América e

na Europa, e concluíram que existe somente um tipo de proteína M, denominada SeM,

específica desta subespécie. KELLY et al. (2006), porém, analisaram as seqüências da região

N- terminal de SeM de 60 isolados de 27 surtos de Garrotilho e identificaram diferenças em

21 códons do DNA, que resultaram na substituição de 18 aminoácidos, caracterizando os

isolados em 15 diferentes subtipos.

O seqüenciamento do genoma de S. equi subesp. equi indicou que existem genes que

codificam dois tipos de proteína M, uma própria deste microorganismo (SeM), e outra,

designada SzPSe, homóloga à proteína M produzida por S. equi subesp. zooepidemicus (SzP).

SzP e SzpSe apresentam grande homologia (85% de identidade entre os aminoácidos que as

constituem), mas SeM e SzPSe tem uma relação distante, possuindo somente um peptídeo

sinal e a região de ancoragem à parede celular em comum (TIMONEY et al., 1997). Nesse

trabalho comprovaram que anticorpos provenientes de soros de camundongos imunizados

com a proteína SzPSe não reagiram com a proteína SeM em testes de opsonização, indicando

ausência de imunidade cruzada, o que tem relevância na resposta imune contra uma ou outra

proteína M (HARRINGTON et al., 2002). A proteína M inibe a deposição do componente

C3b do sistema complemento na superfície da bactéria, e liga-se ao fibrinogênio, impedindo a

fagocitose (HARRINGTON et al., 2002).

CHANTER et al. (2000) descreveram pela primeira vez em S. equi subesp. equi uma

proteína M truncada resultante de deleções em diferentes porções entre a seqüência sinal e a

região repetitiva do gene, equivalente a aproximadamente 20% da proteína naturalmente

expressada. Mesmo com a porção do gene deletada, a virulência da proteína é mantida.

Comprovaram que cerca de 80% dos animais portadores apresentaram agentes com esta

alteração.

28

3 - Imunidade

Desde as primeiras descrições da doença observou-se que animais recuperados eram

resistentes à reinfecção. Posteriormente, PRESCOTT & WRIGHT (2000) comunicaram que

75% dos animais infectados desenvolveram imunidade sólida e duradoura, apesar de poderem

ocorrer re-infecções tão precocemente como seis meses após o desaparecimento da doença

clínica.

A resposta imune tanto sistêmica quanto secretória induzida pela doença espontânea é

dirigida principalmente contra a SeM, sugerindo que ela deveria ser um antígeno de eleição

para o desenvolvimento de vacinas eficientes. Foi comprovado, porém, que os anticorpos de

mucosa contra a proteína M, cuja produção requer estímulo local, desaparecem mais

precocemente que os circulantes, e mesmo que eles possam evitar a aderência do

microorganismo à mucosa, seus baixos níveis fazem com que a resposta contra o agente seja

ineficiente. SHEORAN et al. (1997) concluíram que embora as vacinas induzam respostas

sorológicas qualitativa e quantitativamente similares a aquelas encontradas em animais

convalescentes, não há indução de imunidade de mucosa adequada. O leite das éguas que se

recuperam de Garrotilho contêm IgG e IgA contra a proteína M, ainda que o nível de

anticorpos dependa da imunocompetência da égua. TIMONEY et al. (2007), porém,

avaliaram a aplicação de antígenos expostos ou secretados de S. equi subesp. equi em pôneis e

concluíram que a produção de anticorpos séricos tem relevante importância no controle da

Adenite Eqüina.

Os baixos níveis de imunidade conferidos por vacinas, levaram a concluir que, já que a

SeM não mostrou variações antigênicas entre cepas, as formas de administração não seriam

adequadas para induzir imunidade de mucosa (SHEORAN et al., 1997). NALLY et al. (2001)

comunicaram que uma vacina intranasal de proteína M contendo sucrose acetato isobutirato

(SAIB) como veículo, aumentou a resposta imune. SHEORAN et al. (2002), por sua vez,

29

testaram uma vacina intranasal recombinante contendo como antígeno uma construção de

toxina colérica unida a uma seqüência de 98 aminoácidos da SeM, comprovando que ainda

que a construção induzisse uma resposta humoral similar à da infecção espontânea, os animais

não resistiram ao desafio com S. equi subesp. equi.

A informação referente à SeM tem sido gerada a partir do estudo de cepas isoladas na

América do Norte ou Europa. Visando entender os baixos índices de proteção conferidos por

vacinas utilizadas no Rio Grande do Sul, MORAES (2005) estimou o Índice de Reatividade

Cruzada (IRC) de 10 cepas de S. equi subesp. equi isoladas de 35 eqüinos com Garrotilho da

região sul do Estado, entre elas e com duas vacinas comerciais, comprovando que as cepas

apresentaram IRC indicativos de homogeneidade antigênica entre a maioria delas, mas que os

baixos IRCs com as duas vacinas poderiam explicar a baixa proteção conferida pelas vacinas

em condições de campo.

4 - Vacinas

Os programas de vacinação contra Garrotilho não permitem um controle satisfatório

em condições de campo (TIMONEY & MUKHATAR, 1993), já que não mais que 50% dos

animais vacinados ficam imunes. Os baixos índices de proteção conferidos pelas vacinas em

uso pode dever-se, em parte, à inadequada estimulação antigênica ou à curta persistência dos

anticorpos no soro, ou porque a proteção nos eqüinos não seja mediada por anticorpos séricos,

mas por imunoglobulinas secretórias da mucosa nasofaríngea produzidos localmente

(SWEENEY, 1993). Embora a vacinação não induza resistência populacional aceitável, os

animais imunizados respondem muito mais rápido e com níveis mais altos de anticorpos

séricos do que de anticorpos secretórios (SWEENEY, 1993; KOWALSKI, 2000; PRESCOTT

& WRIGTH, 2000).

30

Várias vacinas contra Garrotilho são utilizadas em diferentes partes do mundo. Entre

as diversas vacinas atualmente em uso há bacterinas e vacinas de subunidades, contendo

proteína M ou frações dela. As bacterinas utilizam geralmente cepas autóctones de S. equi

subesp. equi, e hidróxido de alumínio como adjuvante. Algumas vacinas de subunidade

utilizam proteína M obtida por extração com ácido quente ou por tratamento de células

íntegras por mutanolisina, enzima hidrolítica da parede celular. Uma empresa australiana

produz uma vacina com extrato de células de S. equi subesp. equi, apresentada também

associada a toxóide tetânico.

Em 1998 foi lançada ao mercado mundial a primeira vacina de aplicação intranasal

contra o Garrotilho contendo uma cepa replicante atenuada de S. equi subesp. equi, que teria a

vantagem de não produzir os efeitos colaterais causados pela administração de vacinas por via

intramuscular ou subcutânea. Embora fosse demonstrada a eficiência desta vacina (JACOBS

et al., 2000), os fabricantes informaram que pode produzir reações indesejáveis em 5 % dos

vacinados. Recentemente, foi lançada a primeira vacina britânica contra Garrotilho contendo

uma cepa mutante por deleção de S. equi subesp. equi aplicada na submucosa nasal, que

segundo os fabricantes protege aproximadamente 75% dos vacinados. Independentemente da

vacina, são necessárias no mínimo três aplicações para o desenvolvimento de imunidade.

Varias vacinas elaboradas a partir de novos conceitos estão sendo avaliadas por

diferentes laboratórios. CHANTER et al. (1999) vacinaram camundongos com uma proteína

associada ao hialuronato (HAP) presente em S. equi subesp. equi, S. equi subesp.

zooepidemicus e S. equi subesp. equisimilis, e comprovaram uma redução dos sinais clínicos

após desafio com S. equi subesp. equi. WALKER & TIMONEY (2002) induziram uma

mutação específica do gene da hialuronidase sintetase em uma cepa que tem sido usada como

vacina intranasal (cepa Pinnacle), para inibir a síntese de cápsula e fornecer um marcador

genético facilmente reconhecível por PCR em animais vacinados. FLOCK et al. (2004)

31

avaliaram em camundongos os antígenos extracelulares FNZ, EAG e SFS de S. equi subesp.

equi como componentes de vacina contra Garrotilho, e concluíram que esses antígenos são

candidatos promissores para uma vacina eficaz. AZEVEDO et al. (2006) avaliaram antígenos

de S. equi subesp. equi encapsulados em microesferas biodegradáveis, concluindo que as

microesferas são eficientes para carrear antígenos de S. equi, apresentando também ação

adjuvante .

Entre as vacinas contra Garrotilho disponíveis no Brasil, uma delas, que contém

antígenos de S. equi subesp. equi, S. pyogenes, Micrococcus pyogenes e Pasteurella

multocida, aplicada por via subcutânea, é indicada como curativa e preventiva da

enfermidade, de acordo com o fabricante. Outra, composta por uma suspensão de S. equi

subesp. equi em soro fisiológico inativada por calor, é administrada por via intramuscular, e

indicada apenas na prevenção do Garrotilho. A terceira é uma bacterina constituída por

cultivos totais de S. equi subesp. equi inativados por formol, administrada por via subcutânea

e indicada para imunização ativa (ANDREI, 2002).

CONCLUSÃO

O Garrotilho é uma doença de marcada importância econômica na exploração eqüina

brasileira que apresenta, porém, dificuldades em seu diagnóstico laboratorial pela presença de

cepas atípicas de S.equi subesp. equi, assim como em sua prevenção.

O controle da enfermidade requer a detecção precoce e segura de animais portadores,

para o que é necessário padronizar métodos e interpretações. No Brasil está disponível um kit

comercial de diagnóstico sorológico para identificação destes animais. Técnicas baseadas na

moderna biologia molecular, tais como PCR, clonagem e expressão de proteínas de interesse,

devem ser validadas visando aprimorar sua eficiência e rapidez.

32

O efetivo controle da doença requer o desenvolvimento de vacinas mais eficientes que

as disponíveis. Embora a proteína SeM seja o principal antígeno estudado, outras proteínas

estão sendo avaliadas para uso na produção de imunógenos. Subunidades de diferentes

toxinas e outros adjuvantes de mucosa poderão induzir imunidade secretória protetora em

condições de campo.

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41

3 ARTIGO 2

EVALUATION OF THE IMMUNOGENICITY OF A RECOMBINANT

SeM PROTEIN IN MICE

(Artigo a ser submetido á revista Vaccine)

42

Evaluation of the immunogenicity of a recombinant S eM protein in mice

Carina Martins de Moraesa, Andréa da Silva Ramos Rochaa, Alceu Gonçalves dos

Santos Junior a, Fabrício Rochedo Conceiçãoa, Agueda Palmira Castagna de

Vargasb, Carlos Eduardo Wayne Nogueirac, Fábio Pereira Leivas Leited,

Carlos Gil-Turnese*

a – Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, CP 354, 96010900, Brazil

b - Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Maria, 97119900, Brazil

c - DCV, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, CP 354, 96010900, Brazil

d – Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas, CP 354, 96010900, Brazil

e – Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, CP 354, 96010900, Brasil

*Author address: Tel +55-53-3275-7350; E mail: gil@ufpel.edu.br

Abstract

Strangles is a contagious disease of horses caused by Streptococcus equi. The

clinical signs of the disease occur after the adherence of S. equi to the epithelial cells

of the nasal and oral mucosa causing acute pharyngitis and rhinitis. The adherence

occurs by the cell wall-associated SeM protein, the most important virulence factor of

S. equi. The objective this work was to evaluate in mice the immunogenicity of

vaccines prepared with a recombinant SeM protein of S. equi subsp. equi. Groups of

mice were vaccinated with vaccines containing rSeM with or without Al(OH)3, and

challenged by the ip route with 8 LD50 of S. equi. The animals vaccinated with rSeM

had protection indices of 100 %.

Key words: Strangles, Streptococcus equi, rSeM, vaccines, horse, mice.

43

1 Introduction

Strangles is an economically important disease of horses caused by

Streptococcus equi subsp equi (S. equi), a beta-haemolytic bacteria belonging to

Lancefield group C, that affects the upper respiratory tract of horses of all ages,

although foals have higher prevalences [1] and [2]. The disease has high morbidity

and low mortality rates, and because asymptomatic carriers are responsible for

maintaining the agent in the herds, the serological and bacteriological diagnosis is of

great importance for its control [3].

The clinical signs of the disease occur after the adherence of S. equi to the

epithelial cells of the nasal and oral mucosa causing acute pharyngitis and rhinitis. If

the host is unable to restrain the process, nasopharyngeal infection spreads rapidly

to the lymph nodes of the head where bacterial multiplication proceeds unhindered

by a massive infiltration of polymorphonuclear leukocytes [4]. As the disease

progresses, abscesses can form mainly in the submandibular and retropharyngeal

lymph nodes, causing obstruction by local compression [5] and [6].

S. equi synthesizes several virulence factors, including hyaluronic acid

capsule, hyalunorate-associated protein, streptolysin, streptokinase, receptors for

IgG, and the cell wall-associated M protein (SeM). Among these, SeM, a membrane

protein of 58 kDa encoded by the SeM gene, has particular importance due to its

antiphagocytic and adherence properties. This protein was used for diagnosis and is

a promising candidate to be used as vaccinal antigen [2]; [5] and [7].

The control of Strangles by vaccination is very difficult because most of the

vaccines in use do not provide adequate protection, since no more than 50% of the

vaccinated animals become immune [8], although it may reduce the severity of the

clinical disease [5]; [6] and [9]. Several vaccines against Strangles are used around

44

world, among them, bacterins and subunit vaccines containing SeM or their fractions.

Vaccines containing SeM protein and different adjuvants proved to be immunogenic

[10] and [11].

The objective this work was to evaluate the immunogenicity in mice of

vaccines prepared with a recombinant SeM protein of S. equi subsp. equi.

45

46

47

48

3. Results

3.1 Cloning, expression, purification and of SeM

rSeM, with a molecular mass of 58 kDa, was successfully produced by transformed

E. coli. Sequencing of the SeM showed 100% of identity with the GenBankTM

sequences.

3.2 Characterization of rSeM by Western blot

rSeM was recognized by antibodies in Western blot analysis. The recombinant

protein reacted with anti-6×His alkaline phosphatase conjugated MAb and with sera

of vaccinated mice.

3.3 Antibody response

Mean seroconversions of each group of vaccinated mice are shown in Figure 3. Mice

vaccinated with vaccines containing rSeM (treatments 1, 2, 5 and 6, Table 1)

seroconverted at significantly (P<0.05) higher levels than mice vaccinated with the

same vaccine without the recombinant protein, with the exception of vaccine 4.

Among those containing rSEM, seroconversions induced by vaccine 5 on days 21

and 42 a dpi were higher (P<0.05) than the others, but on day 63 dpi the differences

disappeared (Figure 3).

rSEM increased significantly serconversions of the commercial vaccines. With

vaccine 4 they differed only on day 21, but with vaccine 5, they were 3.9, 2.4 and 1.4

times higher on days 21,42 and 63, respectively.

49

0

1

2

3

4

5

6

0 21 42 63

Day

Ser

ocon

vers

ion

Treatment 1

Treatment 2

Treatment 3

Treatment 4

Treatment 5

Treatment 6

Treatment 7

Treatment 8

Figure 3. Seroconversions induced in mice by vaccines prepared with rSeM, field

strain and commercial vaccines against Strangles. Treatments: 1- rSeM; 2-

rSeM+Al(OH); 3- Commercial vaccine A; 4- Commercial vaccine B; 5- Commercial

vaccine A+ Al(OH); 6- Commercial vaccine B+ Al(OH); 7- Field strain vaccine+

Al(OH); 8- Negative contol (Saline).

3.4 Potency test

All the non-vaccinated animals died within seven days after challenge, while all of

those vaccinated with rSeM survived, showing a protection index of 100%. In the

group vaccinated with the field strain, 3 out of 12 mice died, showing a protection

index of 75% (Table 2). S. equi was recovered from liver and spleen of dead animals.

50

Table 2. Seroconversions and Protection indices of mice

Seroconversion

Vaccine Day 0 Day 15 Day 36 PI %

rSeM 1 2,0 1,7 100

Bacterin 1 1,7 1,6 75

Control 1 1,1 1,0 0

4. Discussion

One of the main problems in Strangles prophylaxis is the low level of

protection conferred by commercial vaccines. Bacterins prepared with field or

laboratory strains still in use in Brazil and other countries, give variable results. The

difficulty in the experimental reproduction of the disease in horses, and thus to

correlate results with those obtained in experimental animals, hindered the

development of official potency tests in laboratory animals [12]. Although without

official value, mice tests were used to evaluate the protection conferred by S. equi

vaccines [15] and [16].

Even considering that SeM is strongly immunogenic, several researchers

related low levels of protection when used as vaccinal antigen [10]; [11] and [17],

suggesting that it could be inefficient to stimulate an appropriate mucosal immune

responses [4] and [18]. However, among the several antigens studied for the

immunological control of the disease it is a promising alternative.

We cloned and expressed successfully the SeM gene in E. coli. The rSeM had

a molecular mass of 58 kDa, in agreement with Galán & Timoney [19]. Furthermore,

the protein reacted with sera of infected horses and vaccinated mice, proving its

antigenicity. The rSeM induced a protective response in mice challenged with 8 LD50

of a field strain of S. equi and enhanced the antigenicity of commercial bacterins. As

51

expected, the addition of Aluminum Hydroxide enhanced the immune response in

mice.

Athough there are not official tests for licensing Strangles vaccines, it was

suggested that serum antibodies could be efficient in avoiding the dissemination of S.

equi from its port of entry [16]. The mice model used in our study showed that the

response elicited by rSeM protected mice against a parenteral challenge with S. equi,

suggesting that it could impair the dissemination of the etiological agent also in

horses. Therefore, we consider that our results encourge the use of rSeM as vaccinal

antigen against Strangles.

Acknowledgements

The authors acknowledge Cleonice Rodrigues Pereira and Rodrigo Casqueiro

Cunha for technical assistance. C.M.M. had a scholarship from CAPES (Ministry of

Education) and C.G.T. had a CNPq (National Research Council) research

productivity grant.

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55

4 ARTIGO 3

EVALUATION OF AN ELISA USING A RECOMBINANT SeM PROT EIN OF

Streptococcus equi subsp . equi

(Artigo a ser submetido à revista The Veterinary Journal)

56

Evaluation of an ELISA using a recombinant SeM prot ein of

Streptococcus equi subsp . equi

Carina Martins de Moraesa, Andréa da Silva Ramos Rochaa, Alceu Gonçalves dos

Santos Juniora, Leandro do Monte Ribasb, Fabrício Rochedo Conceiçãoa, Agueda

Palmira Castagna de Vargasc, Carlos Eduardo Wayne Nogueirab,

Fábio Pereira Leivas Leited, Carlos Gil-Turnese*

a – Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, CP 354, 96010900, Brazil

b- HCV, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, CP 354, 96010900, Brazil

c - Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Maria, 97119900, Brazil

d – Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas, CP 354, 96010900, Brazil

e* –Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, CP 354, 96010900, Brasil.

*Author address: Tel +55-53-3275-7350; E mail: gil@ufpel.edu.br

Abstract

Strangles is an economically important disease of horses caused by Streptococcus

equi subsp equi, a beta-haemolytic bacteria belonging to Lancefield group C, that

affects the upper respiratory tract of horses of all ages. Diagnosis of strangles may

be confirmed recovering S. equi from pus from the nose or abscessed lymph nodes

of clinically affected horses, although the detection of carriers requires the use of

several tests such as bacterial isolation and the polymerase chain reaction. ELISA is

an alternative method based on the detection of serum antibodies. The objective of

the research here reported was to evaluate an ELISA using a recombinant SeM

protein of Streptococcus equi subsp. equi (rSeM) as antigen. For validation of the

ELISA, groups of 20 sera from negative, vaccinated and positive animals were used.

Using as Cut-off the mean plus 2 SD of the OD of the negatives, the test showed

57

100% sensitivity and specificity, being able to discriminate among negative,

vaccinated and positive animals.

Key words: Strangles, Streptococcus equi, rSeM, ELISA.

1 Introduction

Strangles is a highly contagious and economically important infection of

horses, caused by Streptococcus equi subsp. equi (S. equi), a Gram-positive

streptococcus belonging to Lancefield´s group C (Farrow & Collins, 1984; Harrington

et al., 2002). The disease is characterized by severe inflammation of the anterior

respiratory mucosa, with extensive swelling and often fistulization of the lymph nodes

(Timoney et al, 1997; Silva & Vargas, 2006). It has very high morbidity and low

mortality, and its economic impact is due to veterinarian expenses and the necessity

to restrain the animals from their activities during several weeks. Outbreaks may last

for months or even years, principally in areas with large horse populations where

introduction of new animals is frequent (Chanter, 1997).

S. equi synthesizes several virulence factors among whose SeM, an outer

membrane protein of 58 kDa encoded by the gene SeM, is particularly important, due

to its antiphagocytic and adherence properties. This protein has been used for

diagnosis and is a promising candidate as vaccinal antigen (Timoney et al, 1997;

Anzai et al, 1999; Harrington et al, 2002).

Convalescent horses harbour the bacteria for long periods and may become

reservoirs of the infection. Approximately 10% of horses affected by the disease

remain persistent carriers of the agent, housing S. equi in condroids located in the

guttural pouches, being able to infect other animals and thus spreading the disease,

58

making their detection by serological or bacteriological techniques of great

importance for controlling the disease (Chanter et al., 2000; Waller & Jolley, 2007).

Diagnosis of strangles may be confirmed by culturing pus from the nose or

abscessed lymph nodes of clinically affected horses, although the detection of

carriers requires the combination of tests, such as bacterial isolation and the

polymerase chain reaction. ELISA is an alternative method based on the detection of

serum antibodies. An ELISA that uses the full length SeM protein and can provide

some information regarding the exposure of a horse to S. equi is commercially

available (IDEXX Laboratories, USA). It identifies high antibody titres against the

SeM protein in horses suffering from purpura haemorrhagica, although overlapping

breakpoints in normal and convalescent horses difficult the interpretation of the

results, impairing its use for the identification of sub-clinical cases (Timoney, 1997;

Waller & Jolley, 2007).

The objective of the research here reported was to evaluate an ELISA using a

recombinant SeM protein of Streptococcus equi subsp. equi (rSeM) as antigen.

59

60

61

62

3. Results

3.1 Characterization rSeM by Western blot and Dot ELISA

The recombinant protein reacted in Western blots with anti-6×His alkaline

phosphatase conjugated MAb (Figure 1) and in Dot ELISA with sera of horses with

clinical and etiological diagnosis of Strangles (Figure 2).

FIGURE 1. Western blot using recombinant S. equi protein M and anti-6Xhis MAb. 1-

Protein marker (50 KDa); 2 - 8, rSeM protein obtained during purification by affinity

chromatography with the AKTAPrime system.

Figure 2. Dot blotting using rSeM. 1: negative control; 2: positive control (anti-6×His

alkaline phosphatase conjugated MAb); 3-4: serum of horses with clinical and

etiological diagnosis of Strangles

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4

63

3.3 Standardization and evaluation of ELISA

Means and standard deviations of the absorbances of the different groups were: 0.29

+ 0.04, 0.51 + 0.08 and 1.21+ 0.14, for colostrum deprived foals, vaccinated and

horses with clinical and etiological diagnosis of Strangles, respectively (Figure 3).

Figure 3. Optical Densities (OD) determined by an ELISA using rSEM as antigen. Cut

off and means of OD of vaccinated horses and horses with clinical and etiological

diagnosis of Strangles

The test had sensitivity, specificity and discriminatory indices of 100%, giving 0

% false negative reactions for both groups. Means of the OD of the positive groups

were 1.76 and 4.17 higher in vaccinated and recovered animals than in the negatives

(p <0.05).

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

00,

20,

350,

45 0,6

0,75 0,

91,

11,

31,

45

Optical Densities (OD)

Per

cent

(%

) Negative

Vacinated

Positive

Cut off

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

00,

20,

350,

45 0,6

0,75 0,

91,

11,

31,

45

Optical Densities (OD)

Per

cent

(%

) Negative

Vacinated

Positive

Cut off

64

4. Discussion

The diagnosis of Strangles based on the recovery and identification of S. equi

subsp. equi and the differentiation among the different subspecies is traditionally

based on biochemical tests (Quinn et al., 1994; Kuwamoto et al., 2001). However,

strains with atypical patterns of fermentation of trehalose, lactose or both, hinder their

phenotypic differentiation (Grant et al, 1993). Additionally, the detection of

asymptomatic carriers through microbiological procedures is troublesome and prone

to misinterpretations.

Immunological techniques are frequently used to detect carriers due to their

simplicity and the lower risks involved in the collection of samples from animals.

ELISAs are used with increasing frequency to detect carriers and seroconversions of

a great range of infectious diseases in humans and animals. This technique is also

routinely used to monitor the immunological status of zootechnically exploited

animals.

The SeM protein of S. equi was already evaluated as antigen for vaccine

production (Chanter et al., 1999; Jacobs et al, 2000), but its use in serological

diagnosis has been scantly explored. A commercial ELISA for the detection of serum

antibodies against the SeM protein is commercially available through IDEXX

laboratories in the USA and can provide some information regarding the exposure of

horses to S. equi (Waller & Jolley, 2007). This test, however, does not distinguish

between vaccine and infection responses (Sweeney et al., 2005).

Our results showed that the recombinant SeM protein of S. equi subsp. equi

used as antigen for an ELISA discriminated vaccinated and horses with clinical and

etiological diagnosis of Strangles whose OD means were 1.76 and 4.17 times

higher, respectively, than the mean of the negatives. Using as cut-off the mean plus

65

two standard deviations of the optical densities of negative animals, the test had

specificity and sensitivity indices of 100 %, higher than those of the majority of the

ELISAs used routinely for diagnosis. Neither vaccinated nor convalescent animals

showed optical densities smaller than the cut-off, thus with 0 % of false negatives. It

was also found that the minimal OD of the horses with clinical and etiological

diagnosis of Strangles was higher than the maximal OD of the vaccinated horses,

thus discriminating both groups without overlapping absorbances, although it must be

considered that vaccines inducing higher serologic responses could give different

results.

Our results qualify the recombinant SeM protein to be used as antigen in

ELISAs for diagnosis of Strangles.

Acknowledgements

The authors acknowledge Cleonice Rodrigues Pereira and Rodrigo Casquero

Cunha for technical assistance. C.M.M. had a scholarship from CAPES (Ministry of

Education) and C.G.T. had a CNPq (National Research Council) research

productivity grant.

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5. CONCLUSÕES

- Proteina SeM de Streptococcus equi foi clonada e expressa em Escherichia coli;

- rSeM produzida foi inócua, imunogênica e protetora em camundongos;

- rSeM utilizada como antígeno em ELISA discriminou animais negativos de

vacinados e convalescentes

70

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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