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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
Campus de Sobral
PROGRAMA DE PÓS - GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
RAFAEL CARNEIRO BASTOS
PROSPECÇÃO BIOTECNOLÓGICA DE UM NOVO DITERPENO ISOLADO
DE FOLHAS DE Croton argyrophylloides SOBRE RATOS
HEMIPARKINSONIANOS
SOBRAL
2018
1
RAFAEL CARNEIRO BASTOS
PROSPECÇÃO BIOTECNOLÓGICA DE UM NOVO DITERPENO ISOLADO DE
FOLHAS DE Croton argyrophylloides SOBRE RATOS HEMIPARKINSONIANOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia, da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Ceará –
Campus de Sobral, como requisito parcial para
obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia .
Área de Concentração: Macromoléculas.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Maranguape Silva
da Cunha
Co-orientadora: Profa. Dra. Lissiana Magna
Vasconcelos Aguiar
SOBRAL
2018
2
3
RAFAEL CARNEIRO BASTOS
PROSPECÇÃO BIOTECNOLÓGICA DE UM NOVO DITERPENO ISOLADO DE
FOLHAS DE Croton argyrophylloides SOBRE RATOS HEMIPARKINSONIANOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia, da Faculdade de Medicina da Universidade
Federal do Ceará – Campus de Sobral, como requisito parcial
para obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia.
Área de Concentração: Macromoléculas.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Maranguape Silva da Cunha
Aprovada em: __/__/2018
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Maranguape Silva da Cunha (Orientador)
Universidade Estadual Vale do Acaraú – UVA
Prof. Dr. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar (Co-orientadora)
Universidade Federal do Ceará – Campus Sobral/UFC
Prof. Dr. Tiago Sousa de Melo (Examinador)
Centro Universitário Instituto Superior de Teologia Aplicada (UNINTA)
4
“A encarnação é o sono da alma, as peripécias da vida
são os seus sonhos.”
BALZAC
5
AGRADECIMENTOS
.
A Deus pelo milagre da vida e da evolução, pelas possibilidades, pelo o
maravilhamento da existência, pelos erros, aprendizados e acertos, pela força e luz que
me guia nas batalhas diárias desta encarnação, pelo cosmos e todo o seu esplendor.
À minha avó Maria da Conceição Loiola Carneiro por todos os ensinamentos, amor e
apoio incondicional desde os meus primeiros dias de vida até o presente. Sem você boa
parte dos meus progressos não teriam sido possíveis. Gratidão por tudo !
Aos meus pais Eduardo Mol Marques Lima e Karla Maria Loiola Carneiro pelos
ensinamentos tão valiosos, pelo apoio e influência aos estudos desde criança. Ao meu
irmão Hariel Mol Carneiro Lima pelas palavras de conforto, apoio e pelos felizes
momentos de descontração. Pelo o amor que sempre manteve e mantém esta família
unida.
Ao meu orientador, Prof Dr. Rodrigo Maranguape Silva da Cunha, pelos ensinamentos
durante a graduação e pela oportunidade de ingressar no Laboratório de Biologia
Molecular há 6 anos, pelo apoio científico desde a inciação científica até o presente. Sou
grato também pela oportunidade de ter atuado neste projeto de pesquisa, que favoreceu
enormemente ao meu desenvolvimento científico, profissional e pessoal, foi um grande
amadurecimento! Gratidão pelos ensinamentos que levarei por toda a vida. Que Deus
abençõe você e sua família, cobrindo-lhe de toda saúde para que possa nos contagiar
com sua inteligência e humanidade por muitas primaveras.
À profa. Dra. Lissiana Magna Vasconcelos, do Laboratório de Neurociências da
Faculdade de Medicina – UFC. Obrigado pelo acolhimento caloroso no laboratório
durante a execução dos experimentos, e também pelos esclarecimentos prestados
durante a realização das metas presentes nesta pesquisa. Muita gratidão pelos
ensinamentos transmitidos durante o curso de Pós-Graduação em Biotecnologia,
trabalhar sob sua co-orientação foi muito engrandecedor!
Ao prof. Dr. Hélcio Silva dos Santos pela disponibilidade de ir conosco até local de
coleta do espécime vegetal e por nos ceder o referido composto estudado nesta pesquisa.
Agradeço também a sua equipe pelos procedimentos de extração e purificação do
bioativo.
6
Ao Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear
(CENAUREMN) pela disponibilidade da infraestrutura e equipamentos utilizados na
determinação da estrutura química da substância estudada.
À profa Dra. Betânea Andrade, por ceder os reagentes utilizados no teste de atividade
antioxidante, pelos esclarecimentos prestados durante a execução do experimento e,
claro, por todos os ensinamentos transmitidos durante a graduação nas saudosas aulas
do curso de biologia da UVA.
Ao prof. Dr. Igor Iuco Castro da Silva, coordenador do curso de Pós-Graduação em
Biotecnologia, pelos esforços na concessão da bolsa de estudos em tempos tão críticos
para a pesquisa deste país, por todas as dúvidas e esclarecimentos prestados, pelos
ensinamentos durante as disciplinas do curso de Pós-Graduação e por tudo que tem
realizado em prol da melhoria e desenvolvimento da pesquisa do Núcleo de
Biotecnologia de Sobral (NUBIS). Muito obrigado!
Aos meus mentores científicos Ricardo Basto Souza e Annyta Fernandes Frota, que me
instruíram e apoiaram desde a iniciação científica no ingresso e execução das tarefas
refente a esta linha de pesquisa, a qual desensvolvi bastante afinidade, e que ainda o
fazem mesmo de longe. Tabalhar com vocês foi uma grande honra, além de um imenso
aprendizado. Gratidão!
Ao meu colega Thomas Dominik pela paciência e ensino da técnica das exaustivas
cirurgias esteriotáxicas. O meu muito obrigado!
À Marcela Paiva, pela dedicação e paciência no auxílio da execução dos experimentos
comportamentais e demais análises, você foi essencial para a conclusão deste trabalho.
Obrigado por ter tornado a jornada deste grande desafio mais leve e divertida. Obrigado
pelas palavras de apoio, pelos risos e momentos de descontração. Você não tem ideia do
bem que me fez! Desejo a você toda felicidade dessse mundo.
Aos meus amigos da vida e colegas de Laboratório: Carlos Franciney, Pedro Paulo,
Erivan Ferreira Alves, Marcela Paiva, Nayanne, Nívea Maria, Dauanna, Deysen, Bruno,
Jedson, Daniel de Brito, João Garcia, e toda a equipe velha guarda do NUBIS. Muito
obrigado pela grande ajuda prestada e por todos os ensinamentos compartilhados!
7
A minha amiga Vitória Inna Mary Muniz por todo o carinho e experiências vividas no
tempo em que convivemos, por tudo que aprendemos juntos e pelo o amor da nossa
amizade. Sou grato pela sua existência!
Ao Francisco Gomes técnico do laboratório de Neurociências por dúvidas esclarecidas e
sempre por está disposto em ajudar. Grato!
À Gadi e as meninas da cantina, Riviane e Thyara, pelas comidas saborosas que
saciaram nossa fome nos intervalos de trabalho, pelos bons momentos de risos e
descontração no momento do lanche. Agradeço especialmente a Gadi pela paciência e
confiança por criar uma conta, ajudando-nos com as nossas economias. Gratidão!
Às meninas do comitê de ética Alana Godinho e Jordânia Marques pela solicitude e
dedicação em manter a organização e os parâmetros do Biotério Setorial deste campus.
Agradecido também pelo trabalho prestado na entrega dos animais.
Aos vigilantes Sr. Antônio, Sr. Almino e os demais pela entrega das chaves e por
manter a segurança e ordem no ambiente desta universidade.
A toda a equipe de servidores, técnicos, secretaria e professores por manter a excelência
e o funcionamento do sistema desta instituição.
Aos pobres animais que tiveram suas vidas sacrificadas, em prol da pesquisa e do
desenvolvimento científico. Respeito máximo!
A todos que contribuíram de alguma forma para a execução e finalização deste trabalho.
A Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico –
FUNCAP, pela bolsa concedida.
8
“...Meu bem, talvez você possa compreender a minha solidão
O meu som, e a minha fúria e essa pressa de viver
E esse jeito de deixar sempre de lado a certeza
E arriscar tudo de novo com paixão
Andar caminho errado pela simples alegria de ser...”
CORAÇÃO SELVAGEM – BELCHIOR
9
RESUMO
A doença de Parkinson é uma enfermidade crônica degenerativa de etiologia
desconhecida, causada pela perda progressiva de neurônios dopaminérgicos, alterações
neuroquímicas e neurocomportamentais que se refletem na desregulação do controle
motor, causando incapacidade severa em longo prazo. Croton argyrophylloides é um
pequeno arbusto do nordeste brasileiro amplamente utilizado pela medicina popular
tradicional para o tratamento de diversas enfermidades. Diversos estudos apontam que o
estresse oxidativo e eventos pró-inflamatórios estão relacionados com o processo
apoptótico que acomete a perda de neurônios dopaminérgicos na DP. Nesse contexto o
presente estudo analisou o efeito antioxidante e neuroprotetor de um novo diterpeno
(MP-1) isolado das folhas de C. argyrophylloides, sobre o teste de inibição de DPPH e
em ratos submetidos ao modelo de doença de Parkinson induzido por 6-OHDA,
respectivamente. Para avaliação da atividade redutora, foi realizado o teste de captura
do radical DPPH, no qual foram testadas 6 concentrações (10-2000 µg/mL) diferentes
de MP-1 dissolvido em DMSO1%. Ácido ascórbico foi utilizado como controle
positivo. Para avaliação do potencial neuroprotetor do MP-1, foram utilizados ratos
machos Wistar (250-300g), os quais foram submetidos ao modelo de doença de DP
através da injeção intraestriatal de 6-OHDA (21 µg/animal) e, após 10 minutos, tratados
com referido bioativo (MP-1) por via intracraniana apenas uma vez. No 14° dia de
tratamento os animais foram submetidos aos ensaios comportamentais específicos
(Campo Aberto, Rotarod e Teste Rotacional induzido por apomorfina) e, após eutanásia
e dissecação das áreas cerebrais (corpo estriado ipsi e contralateral, Hipocampo e
Córtex Pré-Frontal), foram realizadas as análises neuroquímicas (determinação dos
níveis de nitrito/nitrato, MDA e GSH). Os resultados demonstram que o diterpeno MP-1
apresentou efeito redutor sendo capaz de neutralizar mais de 50% dos radicais DPPH,
apresentando eficiência antiradicalar muito alta e um curto tempo de reação. Além
disso, pode-se observar um efeito neuroprotetor in vivo na recuperação dos danos
motores, com aumento da atividade exploratória espontânea e ganho de massa corpórea
pelos animais. O composto também foi capaz de prevenir as alterações neuroquímicas
induzidas pela neurotoxina reduzindo os níveis de nitrito/nitrato e MDA. Contudo o
MP-1 não foi capaz de induzir a resposta citoprotetora via GSH. Estes achados
demonstram um efeito antioxidante e neuroprotetor de MP-1, que possivelmente atua na
captura de radicais livres, atenuando injúrias neurotóxicas causadas por moléculas
10
reativas, com importantes implicações para estudos futuros e sua aplicação para
desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a DP.
Palavras-Chave: Neuroproteção, 6-hidroxidopamina, Diterpeno, Efeito antioxidante.
11
ABSTRACT
Parkinson's disease is a chronic degenerative disease of unknown etiology, caused by
progressive loss of dopaminergic neurons, neurochemical and neurobehavioral
abnormalities that are reflected in motor control dysregulation, causing severe long-term
disability. Croton argyrophylloides is a small northeastern Brazilian shrub widely used
by traditional folk medicine for the treatment of various diseases. Several studies
indicate that oxidative stress and pro-inflammatory events are related to the apoptotic
process that affects the loss of dopaminergic neurons in PD. In this context, the present
study analyzed the antioxidant and neuroprotective effect of a new diterpene (MP-1)
isolated from the leaves of C. argyrophylloides, on the DPPH inhibition test and in rats
submitted to the 6-OHDA-induced Parkinson's disease model, respectively. For the
evaluation of the reducing activity, the DPPH radical capture test was performed, in
which 6 different concentrations (10-2000 μg / mL) of MP-1 dissolved in DMSO1%
were tested. Ascorbic acid was used as a positive control. Male Wistar rats (250-300g)
were used to evaluate the MP-1 neuroprotective potential, which were submitted to the
PD disease model by intra-atrial injection of 6-OHDA (21 μg / animal) and after 10
minutes, treated with said bioactive (MP-1) by intracranial route only once. On the 14th
day of treatment the animals were submitted to specific behavioral tests (Open Field,
Rotarod and Rotational Test induced by apomorphine) and, after euthanasia and
dissection of the cerebral areas (ipsi and contralateral striatum, Hippocampus and Pre
Frontal Cortex), (determination of nitrite / nitrate levels, MDA and GSH) were
performed. The results showed that diterpene MP-1 showed a reducing effect, being
able to neutralize more than 50% of the DPPH radicals, presenting very high
antiradicalar efficiency and a short reaction time. In addition, a neuroprotective effect
can be observed in vivo in motor damage recovery, with increased spontaneous
exploratory activity and gain of body mass by the animals. The compound was also able
to prevent neurotoxin-induced neurochemical changes by reducing levels of nitrite /
nitrate and MDA. However MP-1 was not able to induce the cytoprotective response via
GSH. These findings demonstrate an antioxidant and neuroprotective effect of MP-1,
which possibly acts on the capture of free radicals, attenuating neurotoxic injuries
caused by reactive molecules, with important implications for future studies and their
application for the development of new therapeutic strategies for PD.
Key words: 6-hydroxydopamine, Diterpene, Antioxidant effect, Neuroprotection.
12
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS.
L Microlitros
M Micromolar
6-OHDA 6-hidroxidopamina
A/ABS Aborbância
ATP Adenosina trifosfato
AP Antero-posterior
CAT Catalase
DP Doença de Parkinson
DAT Transportador de Dopamina
DA Dopamina
DMSO Dimetilsulfóxido
DPPH 2,2-difenil-1picril-hidrazila
DTNB Ácido 2-nitrobenzóico
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EROS Espécies reatiavas de oxigênio
Gaba Ácido gama-butírico
G Gramas
GPe Globo Pálido Externo
GPi Globo Pálido Interno
GPx Glutationa Peroxidase
GSH Glutationa reduzida
HO Homeoxigenase
iNOS/NOS2 Óxido nítrico sintase induzida
Ipsi Ipsilateral
13
Kg Quilogramas
L-DOPA L-3-4 diihidroxifenilanina
L Médio-lateral
MDA Malonildialdeído
Mg Miligramas
Min Minutos
MSNs Neurônios Espinhosos Médio
mM Milimolar
N Quantidade de animais por grupo
NaNO2 Nitrito de Sódio
NaOH Hidróxido de Sódio
NEED N-naftil-etilenodiamina
NAT Transportador de noradrenalina
NST Núcleo Subtalâmico
NF-KB Fator Nuclear Kappa B
Nm Nanômetros
ºC Graus Célsius
Rpm Rotações por minuto
SNpc Substância Negra Pars Compacta
S Segundos
SNCA α - Sinucleína
SNpr Substância Negra Pars Reticulata
SNC Sistema Nervoso Central
SOD Superóxido Desmutase
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
UFC Universidade Federal do Ceará
14
VTA Área Tegumentar Ventral
V Vertical
i.c Via intracraniana
Vol Volume
Δ Variação
15
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação esquemática da neuropatologia da Doença de Parkinson
(DP)........................................................................................................................... 25
Figura 2 - Geração de EROS e mecanismos antioxidantes..................................... 29
Figura 3 - Espécies reativas de oxigênio................................................................. 29
Figura 4 - Mecanismos envolvidos no processo neuroinflamatório na DP............ 32
Figura 5 - Mecanismo de ação da 6-OHDA.......................................................... 38
Figura 6 - Produção de terpenos a partir da condensação de unidades de isoprenos.. 41
Figura 7 - Estrutura química do diterpeno (MP-1) isolado e aplicado na presente
pesquisa..................................................................................................................... 41
Figura 8 - Classificação diagramática de ações de moléculas diterpenólicas...... 42
Figura 9 - Esquema representativo da reação no ensaio de inibição de DPPH... 46
Figura 10 - Gráfico de dispersão da equação da reta (y= ax+b) para a obtenção da
EC50.......................................................................................................................... 47
Figura 11 - Procedimento esteriotáxico de indução de hemiparkinsonismo através
de injeção unilateral intraestriatal de 6-hidroxidopamina (6-OHDA)...................... 51
Figura 12 - Equipamento utilizado no teste de campo aberto (Open Field Test).... 53
Figura 13 - Equipamento utilizado para o teste do rota-rod................................... 54
Figura 14 - Representação da reação de Griess...................................................... 56
Figura 15 - Reação do ácido tiobarbitúrico com os produtos de decomposição dos
hidroperóxidos........................................................................................................... 57
Figura 16 - Reação entre glutationa reduzida e DNTB (reagente de Ellman) para a
determinação de hidroperóxidos empregando a enzima glutationa peroxidase....... 58
Figura 17 - Atividade antioxidante – Ensaio de DPPH......................................... 60
Figura 18 - Análise da atividade exploratória espontânea através do teste de Campo
Aberto...................................................................................................................... 62
Figura 19 - Avaliação do comportamento motor através do teste de Rota-rod.... 64
Figura 20 - Análise temporal do teste rotacional induzido por apomorfina.......... 66
Figura 21 - Análise do número de rotações contralaterais totais......................... 67
16
Figura 22 - Variação ponderal da massa corpórea (Δ g)................................... 69
Figura 23 - Níveis de nitrito/nitrato em áreas cerebrais.................................... 71
Figura 24 - Análise dos níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS) nas áreas
cerebrais.............................................................................................................. 73
Figura 25 - Níveis de glutationa reduzida (GSH) nas áreas cerebrais.............. 75
17
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Modelos experimentais de DP e toxinas utilizadas......................................35
Tabela 2 - Classificação do Comportamento Cinético Antioxidante.............................48
Tabela 3 - Classificação da Eficiência Antiradicalar (EA)........................................... 49
Tabela 4 - Protocolo de tratamento experimental...........................................................52
18
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 20
1.1 Doença de Parkinson .............................................................................................. 22
1.2 Etiologia e fisiopatologia da Doença de Parkinson .............................................. 23
1.3 Epidemiologia da Doença de Parkinson ............................................................... 26
1.4 Estresse oxidativo e Doença de Parkinson .......................................................... 27
1.5 Processo Neuroinflatório e Doença de Parkinson ............................................... 32
1.6 Tratamento Farmacológico da Doença de Parkinson ........................................ 34
1.7 Modelos animais de Doença de Parkinson ........................................................... 36
1.7.1 Modelo da Doença de Parkinson induzido por 6-OHDA ...................................... 38
1.8. Potencial biotecnológico dos Diterpenos.............................................................. 39
2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 43
2.1 Objetivo geral .......................................................................................................... 43
2.2 Objetivos específicos ............................................................................................... 43
3. METODOLOGIA ..................................................................................................... 44
3.1 Coleta e identificação do material vegetal ............................................................ 44
3.2 Isolamento e purificação do Diterpeno ................................................................. 44
3.2.1 Determinação da estrutura química ....................................................................... 45
3.3 Ensaio de inibição de DPPH .................................................................................. 45
3.3.1 Determinação do percentual da atividade antioxidante ......................................... 46
3.3.2 Determinação da EC50 .......................................................................................... 47
3.3.3 Determinação da TEC50 ....................................................................................... 47
3.3.4 Determinação da eficiência antiradicalar (AE) ..................................................... 48
3.4 Animais .................................................................................................................... 49
3.5 Indução experimental do modelo de hemiparkinsonismo através da injeção
intraestriatal de 6-OHDA. ........................................................................................... 50
3.6 Protocolo de tratamento experimental ................................................................ 51
3.7 Análises comportamentais ..................................................................................... 52
3.7.1 Teste do Campo aberto (Open Field Test)............................................................. 52
3.7.2 Teste do Rota-rod .................................................................................................. 53
3.7.3 Teste Rotacional induzido por apomorfina ........................................................... 54
3.8 Análise da variação ponderal de massa corpórea ............................................... 55
3.9 Análises neuroquímicas .......................................................................................... 55
3.9.1 Determinação da Concentração de Nitrito/Nitrato ................................................ 55
19
3.9.2 Determinação da Peroxidação Lipídica ................................................................. 56
3.9.3 Determinação da Concentração de Glutationa Reduzida (GSH)........................... 57
3.10 Análises estatísticas .............................................................................................. 58
4. RESULTADOS ......................................................................................................... 59
4.1 Análise da Atividade Antioxidante in vitro .......................................................... 59
4.1.1 Teste de inibição de DPPH .................................................................................... 59
4.2 Análises Comportamentais .................................................................................... 61
4.2.1 Teste do Campo Aberto (Open field Test) ............................................................ 61
4.2.2 Teste de Rota-rod................................................................................................... 63
4.2.3 Teste Rotacional induzido por apomorfina ........................................................... 65
4.3 Análise ponderal da massa corpórea .................................................................... 68
4.4 Análises Neuroquímicas ......................................................................................... 70
4.4.1 Derterminação da concentração de Nitrito (NO2) / Nitrato (NO3) em áreas
cerebrais .......................................................................................................................... 70
4.4.2 Determinação dos níveis de peroxidação lipídica (TBARS) nas áreas cerebrais .. 72
4.4.3 Determinação dos níveis de glutationa reduzida (GSH) nas áreas cerebrais ........ 74
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................. 76
6. CONCLUSÃO ........................................................................................................... 82
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................83
20
1. INTRODUÇÃO
Croton argyrophylloides Muell. Arg é um pequeno arbusto amplamente
difundido em regiões semiáridas no nordeste do Brasil (SALATINO et al., 2007;
SANTOS et al., 2009; CORDEIRO et al., 2014; SOUZA et al., 2017). O gênero desta
espécie pertence à família Euphorbiaceae, sendo bastante explorado pela medicina
popular para o tratamento de enfermidades diversas, tais como câncer, constipação,
diabetes, feridas externas, febre, hipercolesterolemia, hipertensão, inflamação, vermes
intestinais, malária, dor, úlceras e perda de peso (DE MORAIS et al., 2006; SANTOS
et al., 2009; ALVES et al., 2012; SANTOS et al., 2014;.FIRMINO et al., 2016).
Estudos anteriores com metabólitos secundários isolados da casca de C.
argyrophylloides, tais como os diterpenos kaurano, clerodanos (XU et al., 2011; WANG
et al., 2012; GONZALEZ-BURGOS et al., 2013), bem como outras subclasses de
moléculas terpenólicas das demais espécies deste gênero, demostraram ampla
aplicabilidade em estudos in vitro e em modelos in vivo de distúrbios motores e
neurocomportamentais, fornecendo novas perspectivas e subsídios para a pesquisa pré-
clínica em busca de novos bioativos com propriedades biotecnológicas e farmacológicas
de interesse (DEVAPPA; MAKKAR; BECKER, 2010; HU et al., 2012; SINGH et al.,
2013; WU, CHI-REI et al., 2015; ISLAM et al., 2016).
A doença de Parkinson (DP) é uma afecção neurodegenerativa crônica que afeta
o sistema nervoso central (SNC). A DP é causada pela perda progressiva de neurônios
dopaminérgicos seguida da escassez de dopamina no estriado e associada à acumulação
de agregados proteicos de α-sinucleína e ubiquitina (corpos de Lewy) nos neurônios da
medula, tronco e córtex cerebral (WIRDEFELDT et al., 2011; WERNECK, 2010;
HWANG, 2013; SARRAFCHI et al., 2016). Estas partes do SNC executam tarefas
importantes, tais como execução e coordenação dos movimentos, consequentemente, o
déficit de dopamina na via nigroestriatal acarreta distúrbios motores que se manifestam
em sinais clínicos como bradicinesia, tremores em repouso, rigidez, instabilidade
postural e marcha lenta (acinesia) (SILVERTHORN, 2010; RIZEK; KUMAR; JOG,
2016; LINS et al., 2017).
Esta enfermidade também provoca alterações em outros sistemas neuroquímicos,
tais como o serotonérgico, noradrenérgico e colinérgico, vindo a causar sintomas
psiquiátricos como alucinações, depressão e ansiedade (DEXTER; JENNER, 2013;
21
PARKER et al., 2013). Devido à etiologia ainda desconhecida, o mal de Parkinson é
classificado como uma doença idiopática que envolve fatores ambientais e genéticos
(AGUIAR, 2009; PRINGSHEIM et al., 2014; SOUZA, 2017).
O tratamento da DP está limitado a reposição de dopamina (DA), através do uso
da L-3,4-diidroxifenilanina (L-DOPA), considerado a melhor escolha de tratamento
para a redução dos sintomas (DEXTER; JENNER, 2013; OLANOW, 2015). Entretanto,
nenhum dos tratamentos disponíveis é capaz de prevenir a neurodegeneração que
progride lentamente, ou de restaurar o dano neuronal característico desta patologia
(LINS et al., 2017). Contudo, a eficácia da terapia com L-DOPA reduz ao longo do
tempo, havendo ocorrência de efeitos colaterais como discinesias e flutuações motoras
(AZEVEDO et al., 2009; HAMETNER et al., 2010; BARBOSA et al., 2014).
O envelhecimento é caracterizado como o fator de risco mais proeminente para
esta doença, tendo em vista que a incidência e prevalência da DP aumentam com a
idade (CHAIMOWICZ, 2013; GOPALAKRISHNA; ALEXANDER, 2015). Nos
últimos anos, o aumento da prevalência da DP tem gerado altos custos econômicos para
os sistemas de saúde e para as famílias dos pacientes, pois os sintomas costumam
acarretar incapacidade severa com a evolução da doença (LAU; BRETELER, 2006;
PRINGSHEIM et al., 2014; REEVE; SIMCOX; TURNBULL, 2014).
Os tecidos neuronais são mais suscetíveis ao dano oxidativo, pois são ricos em
ácidos graxos poli-insaturados e apresentam elevado teor de utilização de oxigênio,
além disso, estudos recentes sugerem que o estresse oxidativo está envolvido na morte
celular neuronal dopaminérgica na DP (HAM; KHURANA; GAJBHIYE, 2013; WU,
CHI-REI et al., 2015). Nesse contexto, os diterpenos apresentam-se como moléculas
promissoras, visto que alguns bioativos desta classe apresentam atividades antioxidantes
e anti-inflamatórias já descritas, e alguns têm demonstrado efeito neuroprotetor em
modelos animais de DP induzidos por neurotoxinas (LEUNG et al., 2007; MA et al.,
2009; XU et al., 2010; SONG et al.,2012; PÉREZ-HERNÁNDEZ et al., 2016).
Desta forma, é de grande interesse para a pesquisa pré-clínica a realização de
estudos de triagem através da aplicação de bioativos em testes in vitro e modelos de
distúrbios locomotores in vivo, na busca por novos compostos que exerçam efeitos de
neuroproteção e que atuem de modo preventivo impedindo o dano neuronal.
22
1.1 Doença de Parkinson
A doença de Parkinson foi descrita em 1817 pelo médico inglês James
Parkinson, que a descreveu com um distúrbio neurológico que afeta as funções motoras,
denominando-a de Paralisia Agitante em sua obra intitulada Essay on the Shaking Palsy
(GOETZ et al., 2011). Alguns anos mais tarde esta enfermidade recebeu a designação
pelo médico francês Jean-Martin Charcot de doença de Parkinson, que descreveu mais
precisamente os principais sintomas desta patologia (FIRMINO et al., 2016; LINS et al.,
2017). Tais estudos contribuíram para diferenciar a DP de outras doenças neurológicas
que afetam os movimentos e provocam tremores, tal como a esclerose múltipla
(GOETZ, 2011; OVALLATH; DEEPA, 2013; DONALDSON, 2015).
A DP é caracterizada como uma doença crônica, neurodegenerativa, provocada
pela perda progressiva de neurônios dopaminérgicos da substância negra pars compacta
(SNpc), com ocorrência de perturbações motoras (LANE; DUNNETT, 2008;
FAGOTTI, 2016). É considerada a segunda doença neurodegenerativa mais comum,
vindo a afetar homens e mulheres, com incidência ligeiramente maior em pessoas do
sexo masculino (FERREIRA et al., 2010; LITIM; MORISSET; DI PAOLO, 2016;
TSYNES; STORSTEIN, 2017).
Dados epidemiológicos consideram a DP como a segunda doença
neurodegenerativa de maior ocorrência após o Alzheimer, afetando 1% das pessoas com
mais de 60 anos de idade (LAU; BRETELER, 2006; PRINGSHEIM et al., 2014;
REEVE; SIMCOX; TURNBULL, 2014). Aproximadamente 10 milhões de pessoas são
acometidas em todo o mundo e devido ao aumento da prevalência de doenças crônicas
neurodegenerativas em idosos, o mal de Parkinson pode estar associado ao processo de
envelhecimento populacional, visto que sua incidência aumenta drasticamente com a
idade (CHAIMOWICZ, 2013; PRINGSHEIM; SANTOS, 2015; MENOTTI;
ZANUSSO JÚNIOR, 2016).
Por ser crônica e neurodegenerativa, pode gerar comprometimentos físico,
mental, social e econômico, e ainda, afetar o humor, a cognição, o psicológico, a fala e a
comunicação, interferindo na qualidade de vida dos indivíduos acometidos e de seus
familiares (GOLDSTEIN; YOUNG, 2013). Em alguns casos o Parkinson é hereditário,
podendo afetar também pessoas jovens, portadoras de mutações genéticas (GILKERS et
23
al., 2005; LESS et al., 2009; WERNECK, 2010; DE OLIVEIRA VILHENA, 2014;
TEIXEIRA et al., 2016).
Caracterizada por ser uma enfermidade causadora de debilidade e incapacidade
em longo prazo, a DP é considerada uma doença de alto custo, visto que gera gastos
diretos com medicamentos, serviços de saúde e exames diagnósticos, além de prejuízos
indiretos como a redução da produtividade (BRIEN et al., 2009; FILIPPIN et al., 2014;
TAKAHASHI et al., 2016). O tratamento está restrito ao alívio sintomático e a média de
vida dos pacientes idosos diagnosticados é de 15 anos após a confirmação da doença
(SANTOS et al., 2014).
1.2 Etiologia e fisiopatologia da Doença de Parkinson
As causas para a degeneração neuronal na DP ainda são desconhecidas,
entretanto, diversos estudos apontam alguns processos endógenos tais como disfunção
mitocôndrial, estresse oxidativo e neuroinflamação, que podem desencadear o
metabolismo apoptótico (SCHAPIRA; JENNER, 2011; DEXTER; JENNER, 2013;
RIZEK; KUMAR; JOG, 2016). Além disso, fatores ambientais, genéticos e exposição a
toxinas também são responsáveis por alguns casos de DP, porém o parkinsonismo
causado por estes fatores correspondam a menos de 10% de todos os casos da doença,
sendo a maioria de etiologia desconhecida (GOPALAKRISHNA; ALEXANDER,
2015).
Alguns casos de pacientes com DP apresentando início da doença prococemente,
até mesmo antes dos 21 anos, já foram mencionados e, nestes indivíduos, o Parkinson
pode ser hereditário, ocasionado pela presença de múltiplas mutações genéticas,
incluindo alterações nos genes SNCA (α-sinucleína), PARK 2, PARK 7 (parkina) e
LRRK2 (Quinase 2 repetida rica em leucina) (AGUIAR; SEVERINO; WERNERCK,
2010; GONÇALVES, 2013). Estas mutações podem ser responsáveis pelo acúmulo de
filamentos intra-citoplasmáticos denominados corpos de Lewy, constituídos
principalmente por α-sinucleína e ubitquitina (Figura 1), nos neurônios remanescentes.
Contudo, estudos imunohistoquímicos tem demonstrado a presença de 90 tipos ou mais
de moléculas proteicas compondo estas inclusões (PERFEITO; REGO, 2012;
WAKABAYASHI et al., 2013; MILLER; O’CALLAGHAN, 2015).
24
Outra característica histopatológica proeminente na DP é a degeneração de
neurônios pigmentados dopaminérgicos, da substância negra pars compacta (SNpc),
presente no estriado (núcleo caudado e putâmen) (MORAIS et al., 2015; CUNHA et al.,
2017). As projeções do corpo estriado abrangem o córtex cerebral e o tálamo, sendo
responsáveis pela seleção de ações, permitindo a execução dos movimentos
(SILVERTHORN, 2010; SOUZA, 2017).
Boa parte dos neurônios estriatais são neurônios espinhosos médios (MSNs),
produtores de ácido gama-butírico (GABA), podendo ser classificados em dois
subtipos: estriado-nigrais que emitem suas projeções axonais para a Substância Negra
parte reticulata (SNpr) e Globo Pálido interno (GPi) através da via direta (estriatonigral)
ou estriado-palidais com projeções para o Globo Pálido externo (GPe) através da via
indireta (via estriado-palidal) (KREITZER, 2009; LINS et al., 2017). Com a
degeneração de neurônios dopaminérgicos a dopamina se torna escassa e,
consequentemente, a disfunção estriatal causa um desequilíbrio nas vias excitatórias e
inibitórias, levando ao aparecimento dos distúrbios motores relacionados à doença
(CALABRESI et al., 2014).
Os MSNs que executam a via direta são gabaérgicos e produzem ácido gama-
butírico, inibindo os neurônios gabaérgicos da SNpr e globo pálido interno, estes ficam
impedidos de inibir os neurônios glutamatérgicos (excitatório) do tálamo (AGUIAR,
2009; KREITZER, 2009; DOS SANTOS STEIDL; ZIEGLER; 2016). Desta forma, o
tálamo é capaz de excitar o córtex cerebral através de suas projeções glutamatérgicas,
executando o movimento. De modo contrário, quando a via indireta é ativada, ocorre
uma inibição dos movimentos devido a ativação dos MSNs que inibem os neurônios
gabaérgicos do GPe, os quais deixam de inibir os neurônios glutamatérgicos do núcleo
subtalâmico (NST). Uma vez ativados, os neurônios do NST excitam os neurônios
gabaérgicos da SNpr e do GPi que causam a inibição dos neurônios glutamatérgicos do
tálamo reduzindo a transmissão tálamo-cortical (CALABRESI et al., 2014; LINS et al.,
2017).
Na DP, os neurônios dopaminérgicos que se projetam para o estriado fenecem,
provocando alterações nas vias direta e indireta (Figura 1) (OLANOW; SCHAPIRA et
al., 2015). Além disso, a depleção de dopamina no estriado leva a uma hiperativação da
via indireta e reduz as atividades da via direta, promovendo a hiperestimulação do NST
25
e Gpi/SNpr e uma inibição da via tálamo-cortical, resultando em uma redução da
atividade locomotora e movimentos (CALABRESI et al., 2014). A degeneração
neuronal na DP atinge também outras áreas cerebrais, tais como área tegumentar ventral
(VTA- ventral tegumentar area), locus coeruleus e núcleos da rafe, vindo a afetar
outros sistemas de transmissão, resultando nos sintomas não motores da doença, tais
como distúrbios do sono, ansiedade e depressão (BRAAK et al., 2004; DEXTER;
JENNER, 2013; OBESO et al., 2010).
Figura 1. Representação esquemática da neuropatologia da Doença de Parkinson (DP).
Via nigroestriatal em condição normal (A) e na DP (B). Em (C), marcação
imunohistoquímica demonstrando corpos de Lewy, contendo alfa sinucleina e
ubiquitina em neurônios dopaminérgicos da SNpc.
Fonte: Adaptado por Lins (2017) de Dauer e Przedborski (2003).
26
1.3 Epidemiologia da Doença de Parkinson
Estima-se que na América do Sul, a prevalência da DP é de aproximadamente
600 casos por 100.000 pessoas em indivíduos com idade entre 60 e 69 anos
(PRINGSHEIM et al., 2014). A média da incidência mundial é de 15-20 casos por 100
mil habitantes por ano, com aproximadamente 1% da população acima de 65 anos
apresentando manifestações clínicas evidentes (DE, 2012; DESPRENG; POWER,
2013). O acometimento da DP não distingue raça e classe social, entretanto alguns
dados na literatura discorrem sobre uma prevalência maior em pessoas europeias e
norte-americanas (100-300/100.000 habitantes), e menores taxas em africanos e
asiáticos (10-30/100.000 habitantes), sugerindo uma predisposição maior em raças
caucasianas (DA SILVA CORREIA et al., 2013; MENOTTI; ZANUSSO JÚNIOR,
2016).
No Brasil, a prevalência em pessoas com idade entre 60 e 69 anos é de
700/100.000 habitantes, e entre 70 e 79 anos é de 1500/100.000, sendo que 10% dos
portadores possuem menos de 50 anos e 5% têm menos de 40 anos (PEREIRA;
GARRET, 2010). Aproximadamente 15% dos portadores da DP apresentam histórico
familiar da doença, sendo que uma pequena porcentagem tem a doença a três gerações
(SCORZA; HENRIQUES, 2001; MENOTTI; ZANUSSO JÚNIOR, 2016).
De acordo com Valadas e colaboradores (2014), dada a relevância do processo
de envelhecimento na DP e no aumento da expectativa de vida na população mundial, a
incidência desta patologia está aumentando drasticamente. Estima-se que afete 6
milhões de pessoas no mundo (BOVÉ; PERIER, 2012), afetando cerca de 1 a 2% da
população acima de 65 anos de idade (SUBRAMANIAN; CHESSELET, 2013). Além
disso, homens apresentam 1,5 a 2 vezes mais chances de adquirir a doença
(GEORGIEV et al., 2017).
No Brasil, não existem dados oficiais do número de pessoas diagnosticadas com
DP, porém estima-se que aproximadamente 200 mil indivíduos são acometidos pela
doença e 36 mil novos casos surgem por ano no país (SOUZA et al., 2011; PEREIRA;
GARRET; 2010; LINS et al., 2017). Estudos conduzidos por Santos e colaboradores
(2015), inferiram que em 2060 o mal de Parkinson afetará aproximadamente 881.547
brasileiros, com um aumento de 440, 80%.
27
1.4 Estresse oxidativo e Doença de Parkinson
A produção de radicais livres é um resultado inevitável da respiração dependente
de oxigênio (aeróbica). Em eucariotos, as mitocôndrias geram energia na forma de ATP
a partir de macromoléculas via ciclo de Krebs e cadeia de transporte de elétrons (CTE)
(TSANG; CHUNG, 2009). Muitos sistemas celulares eucarióticos apresentam
mecanismos endógenos de proteção contra moléculas reativas, os quais podem ser
constituídos por vias enzimáticas e não enzimáticas (GONZÁLEZ-BURGOS; GÓMEZ-
SERRANILLOS, 2012).
O estresse oxidativo é compreendido como a disfunção no sistema endógeno de
defesa do organismo e a produção exacerbada de espécies reativas de oxigênio (ROS) e
espécies reativas de nitrogênio (RNS) (BLESA, 2015; SARRAFCHI et al., 2016). Estes
radicais livres causam danos no material genético, lipídeos, proteínas, organelas e
macromoléculas podendo levar a morte celular por apoptose (BARREIROS; DAVID;
DAVID, 2006; TJALKENS; STREIFEL; MORENO, 2017). Na via enzimática, a ação
de enzimas como a catalase (CAT), superóxido desmutase (SOD), glutationa peroxidase
(GPx) e hemeoxigenase 1 (HO-1) reagem diretamente com os ROS, neutralizando-os.
No segundo caso, a neutralização destes compostos se dá pela reação de moléculas
como a vitamina E, vitamina C, bilirrubina e glutationa (GONZÁLEZ-BURGOS;
GÓMEZ-SERRANILLOS, 2013).
Os neurônios dopaminérgicos são mais suscetíveis ao dano oxidativo, em virtude
da elevada produção de dopamina, que gera EROs como subproduto nas reações de
síntese deste neurotransmissor (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; UTTARA et al.,
2009; HWANG, 2013). Além disso, os neurônios dopaminérgicos da substância negra
são ricos em íons ferro (Fe2+
), os quais reagem com o peróxido de hidrogênio através da
reação de Fenton, produzindo radicais hidroxila (HO•) (FOLLMER; NETTO, 2013;
FERNANDES, 2017). O radical HO• é altamente reativo, sendo deletério para o
organismo, apresentando meia-vida curta e dificuldade em ser neutralizado in vivo pelas
enzimas antioxidantes (HWANG, 2013; ARAÚJO; SANTOS 2017). Além disso, outras
espécies de radicais, tais como o radical superóxido (•O2-), radicais peróxido (•O2
-2) e o
peróxido de hidrogênio (H2O2) também são tóxicos para os tecidos neurais (Figura 2)
(ARAÚJO; AQUINO et al., 2017; DOS SANTOS et al., 2018).
28
Outro importante contribuinte do estresse oxidativo é o metabolismo do óxido
nítrico (NO) (RIECK, 2016). O NO é uma molécula sinalizadora, responsável pela
transdução de sinais envolvidos nos processos de vasodilatação e neurotransmissão
(SARRIS et al., 2016). Durante a transdução de sinal, o NO ativa a guanilato ciclase
solúvel para gerar monofosfato cíclico de adenosina (GMPc), o qual atua como segundo
mensageiro (NELSON; COX, 2014; FLORA FILHO; ZILBERSTEIN, 2018). O NO é
gerado por três isoformas da óxido nítrico sintase (NOS): NOS induzida (iNOS), NOS
endotelial (eNOS) e NOS neuronal (nNOS) (KAVYA et al., 2006; TSANG; CHUNG,
2009).
Embora o NO seja uma importante molécula de sinalização, este pode reagir
com outras ROS para formar RNS extremamente tóxicos, tais como níveis elevados de
nitrito e nitrato, os quais, quando em excesso, promovem um evento citotóxico,
provocando a morte dos neurônios dopaminérgicos por apoptose (SZABO;
ISCHIROPOULOS; RADI, 2007; FERRER-SUETA; RADI; 2009; MEIRELES; 2014).
O estresse oxidativo decorrente da excessiva produção de ROS (Figura 3) podem
causar um aumento na peroxidação lipídica e modificações químicas em proteínas e
ácidos nucléicos e, com isso, resultar em neurodegeneração (FOLMER; NETTO, 2013).
Uma vez formada, as ROS podem abstrair hidrogênio do DNA formando DNA
radicalar, que leva a uma fragmentação do DNA, depleção de NADH e ATP e, por fim,
apoptose (BISWAS; HUSSAIN et al., 2016). Além disso, o tratamento tradicional de
restituição da dopamina também tem sido sugerido como um dos principais mecanismos
envolvidos na produção de ROS e metabólitos tóxicos nos neurônios dopaminérgicos
(OLANOW; SCHAPIRA, 2015; MENOTTI; ZANUSSO JÙNIOR; 2016).
Nesse contexto, provavelmente a Doença de Parkinson resulta de complexas
interações entre fatores genéticos e ambientais, ocasionando a disfunção mitocondrial, o
estresse oxidativo, a inflamação e a excitotoxicidade (TEIVE; ARRUDA, 2003;
SOUZA et al., 2011). Os fatores ambientais são correlacionados com a vivência na zona
rural, o uso de água de poço e exposição a pesticidas e herbicidas (WERNECK, 2010;
MARTINS, 2013). Sendo assim, agentes antioxidantes representam uma estratégia
terapêutica promissora para a prevenção ou tratamento da neurodegeneração observada
na DP (KOPPULA et al., 2012; PÉREZ-HERNÁNDEZ et al., 2016; SHAHPIRI et al.,
2016).
29
Figura 2. Geração de EROS e mecanismos antioxidantes.
Legenda: A superóxido (O2•−
) é gerada a partir de O2 como um subproduto do
complexo da cadeia respiratória nas mitocôndrias ou por NADPH-oxidase. Por
superóxido dismutase (SOD), o O2•−
pode ser transformado em peróxido de hidrogénio
(H2O2), que pode ainda ser transformado para uma série de outros EROs, tais como os
radicais hidroxila (OH•).
Fonte: Adaptado de KIM HÁ et al., 2015.
Figura 3. Espécies reativas de oxigênio
Legenda: O metabolismo aeróbico, por meio da redução do oxigênio na aquisição de
elétrons leva a formação de EROs, dentre os quais se destacam: o ânion superóxido
(O2•−
), radical hidroxila (OH•), íon hidroxila (OH
-) e peróxido de hidrogénio (H2O2). O
ponto vermelho indica um elétron não emparelhado.
Fonte: Pontes, adaptado de KIM HÁ et al., 2015.
30
1.5 Processo Neuroinflatório e Doença de Parkinson
A neuroinflamação e a ativação neuroimune demonstram desempenhar um papel
na etiologia de uma variedade de distúrbios neurológicos, tais como acidente vascular
cerebral (AVC), esclerose múltipla, Alzheimer e doença de Parkinson (TANSEY;
GOLBERG, 2010). Os processos neuroinflamatórios envolvem mecanismos complexos
(Figura 4) de respostas bioquímicas de todas as células imunes presentes no SNC,
incluindo micróglia, astrócitos e linfócitos T infiltrados (LE; WU; TANG, 2016).
Estudos recentes com animais transgênicos portadores de mutações ligadas ao
parkinsonismo, bem como neurotoxinas e modelos animais da DP, forneceram
informações valiosas sobre os potenciais mecanismos patogênicos envolvendo a
neuroinflamação (DUKE et al., 2007). Desta forma, muitas evidências sugerem que o
estresse oxidativo derivado da neuroinflamação e toxicidade dependente de citocinas
podem contribuir para a degeneração da via nigroestriatal e acelerar a progressão da
doença em humanos com DP idiopática (MACHADO; DE SOUZA; BRAGA, 2016).
O processo inflamatório é ativado pela produção de um fator transcricional, o
fator nuclear Kappa B (NF-KB), o qual atua na modulação positiva de mediadores pro-
inflatórios, tais como óxido nítrico sintase induzível (iNOS), interleucina 1 beta (IL1B),
ciclo-oxigenase 2 (COX-2) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (BASSANI;
VITAL; RAUH, 2015). A existência de processos inflamatórios em curso que podem
contribuir a progressão da DP é apoiada por evidência de micróglia ativada, acúmulos
de citocinas, ativação da via do NF-KB e dano oxidativo a proteínas do líquido
cefalorraquidiano em cérebros de indivíduos com DP, sendo observado também em
autópsias de tecidos neurais pos-mortem e modelos experimentais (GAO et al., 2008;
HIRSCH; HUNOT, 2009; RAPPOLD; TIEU; TANSEY; GOLBERG, 2010).
Consistente com o papel do estresse oxidativo derivado da inflamação e da
disfunção mitocondrial, estudos com microarranjos de DNA, envolvendo análises de
cérebros com DP e controle, relevaram um aumento na expressão de genes que
codificam citocinas e subunidades pro-infamatórias da CTE, além da modulação
negativa na expressão de vários genes relacionados à glutationa na região lateral mais
vulnerável do sistema nervoso (FRANK-CANNON; GAO et al., 2008; TANSEY;
GOLBERG, 2010)..
31
Os astrócitos atuam sinergicamente com a micróglia e amplificam a resposta
imune, aumentando a produção de fatores neurotóxicos e induzindo a morte de
neurônios dopaminérgicos (SAIJO et al., 2009; TENTILLIER et al., 2016). Resultados
de estudos com modelos animais da DP também têm demonstrado ativação da microglia
e seu envolvimento com a neurodegeneração após a injeção de neurotoxinas, tais como
MPTP e 6-OHDA (JOERS et al., 2016). A injeção intraestriatal de 6-OHDA induz um
aumento significativo dos níveis de N-acetilglucosaminidase (NAG), um marcador de
ativação microglial no SN e estriado de ratos após uma semana da lesão (TORRÃO et
al., 2012; MACHADO-FILHO et al., 2014; SILVA et al., 2016).
Desta forma, o processo infamatório exerce uma função crítica na DP, e
fármacos anti-inflamatórios têm sido considerados para o tratamento de pacientes com
mal de Parkinson (WANG; LIU; ZHOU, 2015; ALCALY, 2016). Nesse contexto, a
busca por bioativos que exerçam efeitos anti-inflamatórios tem sido um alvo promissor
nas pesquisas pré-clínicas, que através da aplicação desses compostos em modelos in
vivo e testes in vitro, avaliam suas atividades terapêuticas, bem como determinam seus
mecanismos de ação, respectivamente (WU et al., 2015; GONZÁLEZ-BURGOS et al.,
2012; ESSA et al., 2014).
32
Figura 4. Mecanismos envolvidos no processo neuroinflamatório na DP.
Fonte: Adaptado de Rasool et al., 2016.
1.6 Tratamento Farmacológico da Doença de Parkinson
Atualmente, o tratamento medicamentoso da DP é mediado pela ação de
agonistas dopaminérgicos, que aumentam as atividades dos gânglios da base,
configurando-se o principal meio para o controle dos sintomas do mal de Parkinson
(BASTIDE et al., 2015; MENOTTI; ZANUSSO JÚNIOR, 2016). A levodopa (L-
DOPA) é a droga mais prescrita e eficaz para diminuição dos sintomas da DP,
entretanto, não é capaz de retardar a progressão da doença (SÁ, 2009; DE OILIVEIRA
VILHENA; CARDOSO; STAYTE; VISSEL, 2014). Além disso, o uso continuado
deste medicamento provoca efeitos colaterais como discinesias e flutuações motoras,
afetando 40 a 50% dos pacientes após 5 anos de tratamento crônico e, após 10 anos 70 a
80% dos pacientes apresentam complicações motoras (RIZEK; KUMAR; JOG, 2016;
LINS et al., 2017).
Estresse oxidativo
Excitotoxicidade
Depleção de
Neurotransmissores
Estresse Nitrosativo
Dano na barreira
hematoencefálica
Ubiquitinação
NEUROINFLAMAÇÃO
33
A intervenção medicamentosa está direcionada ao aumento dos níveis de
dopamina, de modo a influenciar as manifestações clínicas da doença, não sendo capaz
de abolir todos os sintomas, principalmente os não-motores (VARA; MEDEIROS;
STRIEBEL, 2011). Contudo, dependendo da concentração sérica do medicamento, o
paciente pode ser acometido por um quadro clínico, denominado “on”, no qual
apresenta efeito máximo da droga e um período “off”, onde se observa o mínimo efeito
da droga (FOLLMER; NETTO, 2013; MONTEIRO et al., 2015).
A dopamina é uma catecolamina assim como a noradrenalina e a adrenalina,
também denominadas de amidas biogênicas, substâncias classificadas como pequenas
moléculas neurotransmissoras, cuja síntese ocorre nos terminais pré-sinápticos, a partir
do aminoácido tirosina (PINHEIRO GERSZT et al., 2014). A reação é catalisada pela
tirosina hidroxilase, enzima que converte o aminoácido em Di-hidroxifenilanina
(levodopa - [ácido (S)-2-amino-3-(3,4-di-hidroxifenil propanoico) em um processo que
requer o oxigênio como co-substrato e a tetrahidropteridina como co-fator (DAUBNER;
LE; WANG, 2011).
No tecido cerebral a L-DOPA é convertida através da ação da enzima L-
aminoácido DOPA-descarboxilase em seu metabólito ativo dopamina, que é
armazenada em vesículas pré-sinápticas até sua liberação para os receptores pós-
sinápticos (CANHOS, 2010; BARBOSA, 2012). Quando liberada, a dopamina atua
sobre os receptores dopaminérgicos específicos e a alguns receptores beta-adrenérgicos,
sendo removida da fenda sináptica por recaptação (PINHEIRO GERSZT et al., 2014).
O metabolismo da L-DOPA gera espécies reativas de oxigênio, os quais contribuem
com o estresse oxidativo e a neuroinflamação, causando toxicidade e aceleração do
processo neurodegenerativo (FARIAS; STAYTE; VISSEL, 2014).
Após exercer seus efeitos transmissores através dos receptores D1 e D2, a
dopamina é recaptada para dentro dos terminais nervosos ou células gliais vizinhas por
um transportador dependente de sódio, sendo metabolizada por enzimas como
monoaminaoxidase (MAO) e a catecol O-metiltransferase (COMT) (DEXTER;
JENNER, 2013; FAHN, 2015). A dopamina não é capaz de cruzar a barreira
hematoencefálica (BHE), porém, a L-DOPA, após ser absorvida no intestino delgado
atravessa a BHE facilmente. Contudo, devido à sua alta taxa de metabolização pelos
tecidos periféricos, apenas 1% do fármaco inalterado consegue alcançar a circulação
34
cerebral, apresentando baixa biodisponibilidade (DE OLIVEIRA VILHENA;
CARDOSO; PINHEIRO GERSZT et al., 2014).
Desta forma, o tratamento farmacológico para a Doença de Parkinson consiste
no uso de agonistas dopaminérgicos através da restituição de dopamina, por meio da
administração do seu precursor L-DOPA (OLANOW; SCHAPIRA, 2015). Outros
fármacos também são utilizados como coadjuvantes da L-DOPA, tais como os agonistas
dopaminérgicos, inibidores das enzimas monoamina oxidase (MAO) e catecol o-metil
transferase (COMT), agentes anticolinérgicos, antagonistas do receptor A2A de
adenosina e antagonistas glutamatérgicos (DEXTER; JENNER, 2013; STAYTE;
VISSEL, 2014; FAHN, 2015). Entretanto, muito dos inibidores da MAO utilizados na
clínica são irreversíveis, ligando-se covalentemente à enzima causando sua inativação,
resultando em efeitos colaterais importantes, devido à interação com fármacos
sinaptomiméticos e com alimentos contendo tiraminas, o que resulta em reações
hipertensivas severas (FOLLMER; NETTO, 2013).
Nesse contexto, a busca por compostos antioxidantes e anti-inflamatórios que
possam ser utilizados como suplemento ou até mesmo coadjuvantes dos medicamentos
atuais no tratamento da DP se tornam uma boa estratégia para o desenvolvimento de
novas terapias neuroprotetoras (SANTOS, 2014; LINS et al., 2017).
1.7 Modelos animais de Doença de Parkinson
Atualmente, a literatura científica discorre sobre um amplo conhecimento a
respeito dos aspectos fisiopatológicos da DP (PEREIRA, 2007; LEÃO et al., 2015).
Estes conceitos foram desenvolvidos através de modelos experimentais em animais
roedores, tais como ratos e camundongos. Ao longo das últimas décadas vários modelos
animais da DP têm sido desenvolvidos permitindo a investigação de seus mecanismos
fisiopatológicos, além de fornecer ferramentas para o teste de novos compostos
terapêuticos que possam exercer efeito de neuroproteção (DUTY; JENNER, 2011;
STAYTE; VISSEL, 2014).
Os modelos experimentais são classificados em dois grupos: modelos tóxicos,
são aqueles induzidos por neurotoxinas, tais como MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-
tetraidropiridina), 6-hidroxidopamina (6-OHDA), reserpina (RES) e rotenona, os quais
35
são capazes de reproduzir algumas alterações na sinalização das vias direta e indireta
dos núcleos da base, resultando em achados clínicos e sintomáticos similares aquelas
observadas em pacientes com DP; e modelos genéticos que utilizam a expressão in vivo
de mutações relacionadas a DP (BLESA et al., 2012; PIFL et al., 2013; JAGMAG et al.,
2016).
Nos modelos induzidos por neurotoxinas (Tabela1), algumas características
presentes na DP idiopática humana estão ausentes, desta forma os modelos atualmente
disponíveis não são capazes de reproduzir todas as características de DP em humanos
(PROU; PRZEDBORSKI, 2005; BLESA; PRZEDBORSKI, 2014). Entretanto, estes
métodos são uma alternativa viável para a obtenção dos conhecimentos relacionados ao
mal de Parkinson, seus aspectos etiológicos, fisiopatológicos e possíveis alvos
terapêuticos, bem como o teste de novos bioativos isolados de fontes vegetais ou
animais com valor farmacológico e biotecnológico (DUTY; JENNER, 2011; JAGMAG
et al., 2016; LEÃO et al., 2015).
Tabela 1. Modelos experimentais de DP e toxinas utilizadas.
MODELO PATOLÓGICO TOXINA
Estresse Oxidativo 6-OHDA e Paraquat
Estresse Nitrativo LPS
Disfunção Mitocondrial Rotenona, MPTP e MPP+
Excitotoxidade Ácido ibotênico, Ácido Quinolínico
Disfunção Proteassomal PSI
Ativação das células da Glia LPS
Legenda: 6-OHDA= 6-hidroxidopamina; LPS= lipopolissacarídeo; MPTP= 1-metil-4-
fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina; MPP=1-metil-4-fenilpirimidina; PSI= inibidor de
proteassoma.
Fonte: Dexter; Jenner, 2013.
36
1.7.1 Modelo da Doença de Parkinson induzido por 6-OHDA
A 6-OHDA é uma neurotoxina semelhante às catecolaminas dopamina e
noradrenalina, apresentando-se como um análogo estrutural desses compostos, contendo
um grupo hidroxila adicional. Esta toxina, também conhecida como 2,4,5-
trihidroxifeniletilamina foi descrita pela primeira vez em 1959, sendo atualmente a
neurotoxina mais utilizada no modelo da DP (LIMA et al., 2006; VIEIRA, 2015).
Os efeitos tóxicos desta substância ocorrem sobre os neurônios
catecolaminérgicos, exibindo alta afinidade pelos seus transportadores (dopamine
transporter- DAT e noradrenaline transporter -NAT), afetando o sistema nervoso
central e periférico. A 6-OHDA não atravessa a BHE, sendo administrada diretamente
dentro da SNPc, MFB (feixe prosencefálico medial) ou estriado, através de injeções
intracraniana (PROU; PRZEDBORSKI, 2005; LEHMENSIEK et al., 2006; SIMOLA;
MORELLI; CARTA, 2007).
A injeção de 6-OHDA é geralmente realizada unilateralmente, com o hemisfério
contralateral servindo como controle (hemiparkinsonismo), gerando distúrbios motores
assimétricos afetando apenas um lado do corpo (BATASSINI, 2015). Uma vez dentro
do neurônio, a 6-OHDA acumula-se no citosol sofrendo oxidação e promovendo a
produção de espécies reativas de oxigênio, incluindo o peróxido de hidrogênio, que
causa citotoxicidade e estresse oxidativo com consequente morte neuronal (Figura 5)
(BLUM et al., 2001; CARVALHO et al., 2017).
A aplicação de injeções bilaterais de 6-OHDA são menos viáveis devido à alta
taxa de mortalidade dos animais, que apresentam afagia e adipsias alguns dias após a
cirurgia (BLANDINI; ARMENTERO; MARTIGNONI, 2008; JAGMAG et al., 2016).
O modelo experimental de DP utilizando 6-OHDA também induz a processos
inflamatórios no local da lesão, que são caracterizadas pelo aumento dos níveis de
citocinas pró-infalmatórias, tais como TNF-α, IL-β, aumento na expressão da enzima
COX-2 e fatores apoptóticos como a caspase 3 (HERNANDEZ-BALTAZAR;
MENDOZA-GARRIDO; MARTINEZ-FONG, 2013).
A 6-OHDA atinge também as mitocôndrias bloqueando o complexo I da cadeia
respiratória, interrompendo a transferência de elétrons, causando inibição respiratória e
intensificação do processo oxidativo (BLANDINI; ARMENTERO; MARTIGNONI,
37
2008; DEXTER; JENNER, 2013). Contudo, os efeitos tóxicos desta toxina quando
aplicada sobre o estriado, causam alterações em vias importantes, promovendo um
desequilíbrio no sistema dopaminérgico, resultando em alterações motoras e depleção
no conteúdo de dopamina. Portanto, além de fornecer subsídios para o conhecimento
fisiopatológico da DP, este modelo é bastante útil para avaliação de novas abordagens
terapêuticas em pesquisas pré-clínicas (SIMOLA; MORELLI; CARTA, 2007; DE
JESÚS-CORTÉS et al., 2015).
38
Figura 5: Mecanismo de ação da 6-OHDA.
Legenda: Mecanismos envolvidos na neurotoxicidade induzida pela 6-OHDA. Após ser
captada do espaço extracelular pelo DAT ou NAT, a 6-OHDA é estocada nos neurônios
catecolaminérgicos. Dentro dos neurônios, a 6-OHDA é degradada pela MAO-A e sofre
um processo de auto-oxidação, produzindo várias espécies citotóxicas, que
comprometem a função celular e produzem dano neuronal. Além disso, a 6-OHDA
também induz neurotoxicidade por comprometer a atividade do complexo I da cadeia
respiratória mitocondrial.
Fonte: Adaptado por Ribeiro, 2013 de Blum et al., 2001.
39
1.8. Potencial Biotecnológico dos Diterpenos
Os diterpenos são moléculas produzidas a partir da condensação de 4 moléculas
de isopreno. Estas substâncias estão presentes em uma ampla variedade de organismos
desde fungos, algas, bactérias e vegetais fazendo parte dos 30.000 metabólitos
secundários que compõem a classe dos terpenos (GERSHENZON; DUDAVERA, 2007;
BOER; DE VRIES-VAN LEEUWEN, 2012). Estes compostos são abundantes em óleos
essenciais e seiva elaborada, podendo desempenhar diversas funções endógenas em seus
produtores, tais como: proteção contra vírus e bactérias, resposta à herbivoria ou
estresse, atrativo para polinizadores e produção de fitohormônios (ZWENGER; BASU,
2008; GONZÁLEZ-BURGOS; GÓMEZ-SERRANILLOS, 2012).
Os produtos naturais usados para fins terapêuticos tiveram início desde a
antiguidade. Contudo, a partir do século XIX, os primeiros fármacos para tratar
condições patológicas do sistema nervoso, principalmente no SNC foram baseados em
recursos naturais, especificamente compostos de plantas (GOMES et al., 2009; ISLAM
et al., 2016). Atualmente, as atividades endógenas e o comportamento químico destas
moléculas podem ser explorados através da aplicação em testes pré-clínicos, de acordo
com interesses farmacológicos e biotecnológicos, contribuindo para o desenvolvimento
de novos medicamentos (SANTOS; ELFAHMI et al., 2014).
Vários diterpenos são conhecidos por suas atividades neurobiológicas. Estudos
conduzidos por Zhang e colaboradores (2015), sugere que os diterpenos, tanshinona
IIA, previnam a perda de neurônios dopaminérgicos nigrostriatais pela ativação da via
do elemento de resposta antioxidante ao fator 2 relacionado ao NF-E2 (Nrf2) em
neuroblastoma humano, em linhagens de células SH-SY5Y. Além disso, outros
diterpenos são conhecidos por inibir as vias de estresse oxidativo e neuroinflamação.
Tais achados foram relatados em estudos conduzidos por Wu e colaboradores (2015),
onde o diterpeno fenólico ácido carnósico (CA), isolado de Rosmarinus officinalis
protegeu contra a neurotoxicidade induzida por 6 – OHDA.
O crescente interesse pela descoberta de novos diterpenos e suas aplicações é
acompanhado pelo grande número publicações nessa área nos últimos anos. Chen e
colaboradores (2006) relatam atividade neuroprotetora para cinco novos diterpenoides
isolados do corpo de frutificação da Antrodia camphorata. Resultados similares são
descritos por Xu e colaboradores (2011) para diterpenos isolados de Fritillaria
40
ebeiensis, Guo e colaboradores (2011) para Ajuga ciliata. González-Burgos e
colaboradores (2013) a fim de entender os mecanismos celulares por trás da atividade
antioxidativa apresentada pelos diterpenos foliol, linaerol e sidol extraídos de Sideritis
spp., verificaram a expressão das CAT, SOD, GPx, GR e HO-1. Ainda, os autores
verificaram um aumento de Nrf2, bem como, a diminuição de produtos da peroxidação
de lipídeos.
A DP é rotineiramente tratada pela administração do precursor de DA
(dopamina), L-3,4-dihidroxifenilanina (L-DOPA), resultando em uma síntese
aumentada do neurotransmissor DA no cérebro (ISLAM et al., 2016). O tratamento
também promove a degeneração de neurônios dopaminérgicos nigrais, causando
estresse oxidativo adicional a partir de produtos de auto-oxidação, devido ao aumento
no conteúdo de DA, além de efeitos colaterais em longo prazo (MÜLLER; LIPSKI et
al., 2011).
Nesse contexto, diterpenos de diferentes fontes podem ser de grande interesse
para pesquisas pré-clínicas, pois estes achados aumentam as perspectivas acerca do
potencial de identificação e utilização de novos diterpenoides para o desenvolvimento
de novas terapias neuroprotetoras.
41
Figura 6. Produção de terpenos a partir da condensação de unidades de isoprenos.
Legenda: Produção de diversas classes de terpenos a partir de ligações covalentes
realizadas entre unidades de isoprenos.
Fonte:
https://www.researchgate.net/publication/297301899_Microrganismos_x_Planta_guerra
_ou_parceria.
Figura7. Estrutura química do diterpeno (MP-1) isolado e aplicado na presente
pesquisa.
Fonte: Autor
42
Figura 8. Classificação diagramática de ações de moléculas diterpenólicas.
Fonte: Adaptado de Islam et al., 2016.
DIT
ER
PE
NO
Varredores de ROS
Indução de enzimas
antioxidantes (SOD, CAT,
GPx)
Indução do sistema
antioxidante endógeno
(Síntese de Glutationa)
Quelação de metais (ferro e
cobre)
Inibição ou repressão de
enzimas formadoras de ROS
(XO, NOX, LOX, MAO,
iNOS) Form
açã
o d
e R
OS
N
eutr
ali
zaçã
o d
e R
OS
An
tioxid
an
tes
C
ito-g
enotó
xic
os
Efeito sobre o sistema
cardiovascular: anti-inflamatório,
Antiagregantes plaquetares,
vasodilatadores
Ação quimiopreventiva:
antimutagênico, antiproliferativo,
proapoptótico, antiogiogênico
Ação sobre o trato gastrointestinal
Ação sobre o sistema imune
Ou
tras
açõ
es
43
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Verificar o potencial do efeito neuroprotetor de um novo diterpeno isolado de
folhas de Croton argyrophylloides, em ratos submetidos ao modelo neurodegenerativo
de hemiparkinsonismo induzido por 6-OHDA.
2.2 Objetivos específicos
a) Determinar o potencial da ação redutora in vitro de um novo diterpeno (MP-1)
isolado de folhas de Croton argyrophylloides.
b) Investigar os efeitos neurocomportamentais e locomotores (campo aberto,
Rotacional e RotaRod) em ratos submetidos ao modelo de doença de Parkinson
e tratados com diferentes doses de MP-1.
c) Investigar os efeitos neuroquímicos através da mensuração dos níveis de
nitrito/nitrato, peroxidação lípídica e glutationa reduzida nas áreas cerebrais de
animais com parkinsonismo induzido por 6-OHDA e tratados com diferentes
doses de MP-1.
44
3. METODOLOGIA
3.1 Coleta e identificação do material vegetal
O material vegetal coletado foi constituído de folhas, caule e raízes de Croton
argyrophyloides da flora da região norte do estado do Ceará, no município de Ubajara, na
localidade do Assentamento dos Tucuns (03º 51' 16" S, 40º 55' 16" W). Durante a coleta
foi realizado a exsicata da amostra vegetal, que foi submetida ao Herbário da Universidade
Estadual Vale do Acaraú para a identificação botânica, realizada pelo professor Dr. Elnatan
Bezerra de Souza.
Fonte da imagem: arquivo pessoal do autor, 2016.
3.2 Isolamento e purificação do Diterpeno
A obtenção e purificação do respectivo metabólito secundário foram realizadas
através de procedimentos de extração e processos cromatográficos, pelo grupo de
pesquisa do professor Dr. Hélcio Silva dos Santos, no Laboratório de Química Orgânica
da Universidade Estadual Vale do Acaraú campus Betânea, através de procedimentos
cromatográficos.
45
3.2.1 Determinação da estrutura química
A determinação estrutural do metabólito secundário isolado foi obtida através da
análise dos dados espectroscópicos de Infravermelho (IV), Ressonância Magnética
Nuclear (RMN) de 1H e 13C uni e bi-dimensionais e espectrometria de massas (E.M.).
Os procedimentos experimentais foram realizados no Departamento de Química
Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará e no Centro Nordestino de
Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear (CENAUREMN).
3.3 Ensaio de inibição de DPPH
A atividade antioxidante foi realizada de acordo com a metodologia da captura
do radical orgânico 2,2-difenil-1picril-hidrazila (DPPH•) (BRAND-WILIAMS et al.
1995). O método é baseado na transferência de elétrons de um radical livre que, por
ação de um antioxidante ou uma espécie radicalar, reduz o radical DPPH• formando
difenil-picril-hidrazina, pelos mecanismos de transferência de elétrons (TE) ou
transferência de um átomo de hidrogênio (TAH). A redução do DPPH• (cor violeta)
pode ser visualizada pela mudança de cor, que varia do violeta claro ao amarelo, sendo
monitorada em espectrofotômetro pelo decréscimo da absorbância em comprimento de
onda a 515 nm.
O diterpeno (MP-1) foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) 1% e diluído
seriadamente de 10-2000 µg / mL. Os testes foram realizados em triplicata nos tubos de
ensaio contendo 100 µL das soluções seriadas de MP-1 e 2,4 mL de solução etanólica
de DPPH. Para o controle negativo foi utilizado 100 µL de etanol absoluto e 2,4 mL da
solução de DPPH. Os tubos foram deixados em repouso durante 30 minutos na
ausência de luz e, em seguida foi realizada a leitura das absorbâncias em
espectrofotômetro (Ultrospec 1100 pro UV/visível – Amersham) a 515 nm. Para o
controle positivo, foi utilizada uma solução seriada de ácido ascórbico (10-2000 µg /
mL).
Os resultados foram expressos em percentual de atividade antioxidante (AA%),
concentração da amostra capaz de reduzir em 50% a concentração inicial do DPPH
(EC50), tempo necessário para atingir o estado estacionário da reação (TEC50) e
eficiência antiradicalar (AE).
46
Figura 9. Esquema representativo da reação no ensaio de inibição de DPPH.
Legenda: Reação entre o radical DPPH• e um antioxidante através da transferência de
um átomo de hidrogênio.
Fonte: Autor.
3.3.1 Determinação do percentual da atividade antioxidante
Onde:
AA% = atividade antioxidante em porcentagem
ABS (bioativo) = absorbância do composto
ABS (controle negativo) = absorbância do controle negativo
ABS (controle positivo) = absorbância do controle positivo
AA% = [Abs controle DPPH – (Abs bioativo – Abs branco) x 100
Abs controle DPPH
47
3.3.2 Determinação da EC50
O cálculo da EC50 foi realizado através de ferramentas do programa Excel, baseado
na curva dos valores de atividade antioxidante (AA%), onde no eixo y foi plotado a AA% e
no eixo x a concentração da amostra. Após a obtenção da equação da reta (y= ax+b) (Figura
10) a incógnita y foi substituída por 50 (equivalente a 50% da atividade antioxidante),
considerando o valor resultante de X como a concentração mínima capaz de inibir 50% de
DPPH. Os dados foram expressos em µg / mL.
Figura 10. Gráfico de dispersão da equação da reta (y= ax+b) para a obtenção da
EC50.
Fonte: Autor
3.3.3 Determinação da TEC50
O tempo (TEC50) de reação necessário para a amostra alcançar o estado
estacionário da EC50 foi obtido através de ensaios para cada concentração de amostra,
realizando as leituras em intervalos de tempo de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos.
Os dados foram expressos a partir da equação da reta (y= ax+b), obtida plotando os
intervalos de tempo no eixo X e as absorbâncias no eixo Y, admitindo o valor resultante de
X como a TEC50. Os dados foram analisados com ferramentas do programa Excel. A
classificação do comportamento cinético do diterpeno (MP-1) foi determinada de acordo os
parâmetros descritos por Sanchez-Moreno e colaboradores (1998).
48
Tabela 2. Classificação do Comportamento Cinético Antioxidante.
COMPORTAMENTO CINÉTICO ANTIOXIDANTE
Tempo para atingir o estado estacionário
correspondente ao EC50
Classificação
< 5 minutos Rápido
5 – 30 minutos Intermediário
> 30 minutos Lento
Sanchez-Moreno et al., 1998
3.3.4 Determinação da eficiência antiradicalar (AE)
Onde:
AE = eficiência antiradicalar
TEC = tempo de reação necessário para a amostra alcançar o estado estacionário da
EC50.
A eficiência antiradicalar (AE) foi calculada levando em consideração a EC50 e o
tempo necessário para se atingir o estado estacionário da EC50 (TEC50). A AE do
composto (MP-1) foi determinada segundo a classificação descrita por Sanchez-Moreno
e colaboradores (1998).
AE = 1/EC50 X TE50
49
Tabela 3. Classificação da Eficiência Antiradicalar (EA).
Eficiência antiradicalar (AE) Classificação
AE ≤ 1 x 10-3 baixa
1 x 10-3 < AE ≤ 5 x 10-3
média
5 x 10-3 < AE ≤ 10 x 10-3
alta
AE > 10 x 10-3
Muito alta
Sanchez-Moreno et al., 1998
3.4 Animais
Neste trabalho foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar (Rattus
novergicus albinus), pesando entre 250-300 g, oriundos do biotério Setorial do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará – UFC.
Os animais foram mantidos no Biotério, em grupos de 6 animais por caixa de moradia, à
temperatura media de 24 ± 2 °C em ciclos de alternância claro/escuro de 12 horas,
recebendo ração padrão e água ad libitum.
Todas as medidas necessárias foram tomadas a fim de minimizar o sofrimento
dos animais, além de permitir a redução do n amostral. Os procedimentos foram
seguidos de acordo com o “Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório” da
Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL). Todos os
experimentos utilizados neste estudo foram devidamente aprovados pela Comissão de
Ética no Uso de Animais – CEUA, da Universidade Federal do Ceará, sob o protocolo
de número 12/2016.
50
3.5 Indução experimental do modelo de hemiparkinsonismo através da injeção
intraestriatal de 6-OHDA
Os animais foram divididos aleatoriamente em grupos de 5, com o n=6 por
grupo. Estes foram posteriormente anestesiados com cetamina (100 mg/kg) e xilasina
(10mg/kg), administrada por via intraperitoneal (i.p.). O animal foi fixado ao
equipamento esteriotáxico (INSIGHT), com duas barras sendo anexadas através dos
meatos auditivos externos e os dentes incisivos fixados em uma barra de sustentação.
Após o ajuste do animal ao equipamento, foi realizado assepsia com álcool 70%
no local, seguida de uma tricotomia. A incisão foi realizada para a remoção da pele e,
em seguida foi feita a retirada do periósteo para a exposição do bregma. A partir deste,
foram determinadas as coordenadas esteriotáxicas (em milímetros), segundo o atlas de
Paxinos e Watson (1986), para a realização de 3 orifícios: 1º: L: −2,5; AP: +0,5; V:+5,0;
2º: L:−3,0; AP: −0,5; V: +6,0; e 3º: L: −3,7; AP: −0,9; V: +6,5 como descrito por Souza
e colaboradores (2015). Após a cautelosa injeção com uma seringa de Hamilton de 5
μL, a agulha permaneceu no local por 2:30 minutos para permitir uma difusão completa
da solução, que logo em seguida foi retirada e o corte suturado (Figura 11).
51
Figura 11: Procedimento esteriotáxico de indução de hemiparkinsonismo através de
injeção unilateral intraestriatal de 6-hidroxidopamina (6-OHDA).
Fonte: Frota, 2015.
3.6 Protocolo de tratamento experimental
Após 15 minutos a administração unilateral de 6-OHDA no estriado, os animais
foram tratados com o bioativo através de injeções esteriotáxicas, contendo MP-1
dissolvido em DMSO1% nas doses de 10, 100 e 500 µg/Kg, por via intracraniana (i.c.),
somente uma vez (Tabela 4). Os animais foram tratados apenas uma vez e pesados
diariamente durante 14 dias, a fim de observar uma possível variação no ganho de
massa corpórea. No 14° dia foram realizados os testes comportamentais: teste do
Campo Aberto seguido de Rotarod e teste Rotacional com um agonista doparminérgico,
a apomorfina (3 mg/kg, i.p.). O controle negativo (Sham) recebeu uma solução do
veículo DMSO1% diluído em água destilada, e o controle positivo foi tratado apenas
com 6-OHDA (21µg). No 15° dia os animais foram eutanaseados utilizando guilhotina,
sendo as áreas cerebrais (Hipocampo, Estriado e Córtex pré-frontal) dissecadas logo em
seguida para posteriores análises neuroquímicas.
52
Tabela 4. Protocolo de tratamento experimental.
Fonte: Autor.
3.7 Análises comportamentais
3.7.1 Teste do Campo aberto (Open Field Test)
O teste do campo aberto foi realizado de acordo com a metodologia descrita por
Sielgel (1946) e validade por Archer (1973), que permite avaliar a atividade
exploratória, emocionalidade ou locomoção em animais roedores, submetidos a
mecanismos neurais subjacentes a determinadas toxinas. O experimento foi realizado
em uma arena feita de madeira e fórmica, onde os animais foram submetidos ao campo
aberto, sendo observados por 5 minutos a fim de mensurar a atividade exploratória
espontânea (Figura 12). Os parâmetros comportamentais avaliados foram: atividade
locomotora (número de cruzamento das linhas subdivisoras do equipamento), atividade
locomotora vertical (número de vezes em que o animal fica suspenso sobre duas patas,
GRUPOS
EXPERIMENTAIS
TRATAMENTO DOSE
(µg/kg)
VIA DE
ADMINISTRAÇÃO
DURAÇÃO
DO TTO
1 – Sham (Controle -)
DMSO 1% + água destilada
(controle -)
-
i.c.
1 dia
2 - 6-OHDA (Controle
+)
6-OHDA (controle +)
-
i.c.
1 dia
3 - 6-OHDA + MP1- 10
MP-1 dissolvido em solução
DMSO1%
10
i.c.
1dia
4 - 6-OHDA + MP1-100
MP-1 dissolvido em solução
DMSO1%
100
i.c
1 dia
5 - 6-OHDA + MP1-500
MP-1 dissolvido em solução
DMSO1%
500
i.c 1 dia
53
sendo denominado de rearing), autolimpeza (grooming) e o tempo em que o animal
permaneceu parado.
Figura 12. Equipamento utilizado no teste de campo aberto (Open Field Test).
Fonte: Autor
3.7.2 Teste do Rota-rod
Este teste é capaz de mensurar os danos na coordenação motora de roedores
induzidos pelo tratamento com drogas e toxinas (CARLINI; BURGOS, 1979). Os
animais foram submetidos a um período de treinamento, a fim de reduzir qualquer
variável tendenciosa para a queda do animal que não esteja relacionada a seu
condicionamento físico, tais como a falta de adaptação ao equipamento. Desta forma, os
animais foram devidamente treinados no 11°, 12° e 13° dia, antes do teste
comportamental, utilizando rotações de 5 a 10 rpm, durante 5 minutos. No 14° dia, os
animais foram avaliados com rotação variando entre 4 a 40 rpm, também durante 5
minutos. Os parâmetros avaliados foram: a velocidade da primeira queda (RPM), o
número de quedas e o tempo de permanência sobre a barra giratória (DUNHAM; MYA,
1957 com adaptações) (Figura 13).
54
Figura 13. Equipamento utilizado para o teste do rota-rod.
Fonte: Autor.
3.7.3 Teste Rotacional induzido por apomorfina
O modelo experimental de hemiparkinsonismo induzido por 6-OHDA provoca
um processo neurodegenerativo no estriado, causando a apoptose de neurônios
dopaminérgicos. Consequentemente, o desequilíbrio no metabolismo da dopamina
provoca alterações entre os núcleos da base (contralateral e Ipsilateral), acarretando o
surgimento de um comportamento assimétrico e hipersensibilidade a agonistas
dopaminérgicos. A apomorfina induz a um aumento temporário da atividade locomotora
no lado contralateral a lesão, promovendo uma rotação do animal no sentido para o
mesmo lado e, portanto, possibilitando uma quantificação comportamental do nível da
lesão (HEFTI et al., 1980; GREALISH et al., 2010).
O teste rotacional, induzido por apomorfina, representa o principal teste para
avaliar o nível da degeneração neuronal causado por neurotoxinas, com base na
mensuração da rotação contralateral em relação ao local lesionado. No 14° dia os
animais foram previamente tratados com apomorfina (3mg/kg; i.p), e foram
monitoradas as rotações contralaterais, em torno do próprio eixo, sendo contabilizados a
cada dez minutos durante 1 hora (KIM et al., 1998).
55
3.8 Análise da variação ponderal de massa corpórea
A massa corpórea foi medida (g) diariamente desde o tempo zero (antes da
cirurgia esterotáxica), até o 14° dia após a indução do modelo de DP, para análise de
possíveis variações no ganho de massa e alterações sistêmicas. Após a realização da
curva ponderal, os valores foram expressos como variação (Δ) de massa corpórea (g),
em relação à massa inicial.
3.9 Análises neuroquímicas
No 15° dia os animais foram devidamente eutanasiados, e em seguida os
encéfalos retirados rapidamente, onde foram colocados sobre papel alumínio numa
placa de Petri com gelo. Em seguida, o corpo estriado (caudado, putâmen e globo
pálido), o córtex pré-frontal e hipocampo foram isolados das estruturas circunjacentes
por divulsionamento com uma tesoura de microdissecação após o rebatimento lateral do
córtex. Após a dissecação, as áreas foram embrulhadas em papel alumínio, sob gelo,
pesadas e armazenadas a -80 °C para uso posterior. Os tecidos foram considerados
como tendo a mesma viabilidade para experimentação até 24h após a dissecação.
3.9.1 Determinação da Concentração de Nitrito/Nitrato
Para a determinação da nitrito/nitrato, primeiramente preparou-se uma curva
padrão. Para isso, foram pesados 7 mg de NaNO2 e dissolvidos em 10 mL de água
destilada (estoque - 10 mM) e foram feitas diluições em série (10 e 20X), ficando
1mM, 100 µM, 10 µM, 5 µM, 2,5 µM, 1,25 µM, 0,625 µM, 0,312 µM. Assim, foi
realizada uma equação da reta para o cálculo das concentrações do teste (GREEN;
TANNEMBAUN; GOLDMAN, 1981). Para a determinação da concentração de nitrito
em cada tecido, foram preparados homogenatos das áreas cerebrais a 10% (p/v) em
solução de fosfato de sódio 150 mM, pH 7,4, após centrifugação (11000 g/15 min/4 °C),
os sobrenadantes foram coletados e a produção de óxido nítrico (NO) determinada
através da reação de Griess (Figura 14). Uma alíquota de 100 µL do sobrenadante foi
56
incubada com 100 µL do reagente de Griess [sulfanilamida 1% em H3PO4 1%/N-(-1-
naphthyl)-ethylenediamine 0,1%/ H3PO4 1% / diluído em água (1:1:1:1)] a temperatura
ambiente por 10 minutos. A absorbância foi, então, medida em espectrofotômetro a
540nm. A concentração de nitrito (µM) foi determinada a partir de uma curva padrão de
NaNO2. Os resultados foram expressos em µM/mg de tecido.
Figura 14. Representação da reação de Griess.
Fonte: Adaptado por Souza (2015) de Ramos et al. (2006).
3.9.2 Determinação da Peroxidação Lipídica
O grau de lipoperoxidação lipídica em corpo estriado de ratos foi medido através
da determinação das concentrações de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico
(TBARS), conforme o método de Draper e Hadley (1990) (Figura 15). Foram
preparados homogenatos das áreas cerebrais a 10% em solução de fosfato de sódio 150
mM, pH 7,4. Um volume de 0,25 mL do homogeneizado foi mantido em banho maria a
37 °C por 1 hora, seguido por precipitação com 400 µL de ácido perclórico (35%).
Após centrifugação (14000 g/15 min/4 °C), o sobrenadante foi transferido e, a ele,
adicionado 200 µL de solução de ácido tiobarbitúrico (1,2%). Após banho de água
fervente (95-100 °C/30 min), o conteúdo de TBARS foi determinado em
57
espectrofotômetro a 532 nm. Os resultados foram expressos em micromol de MDA por
mg de tecido.
Figura 15. Reação do ácido tiobarbitúrico com os produtos de decomposição dos
hidroperóxidos.
Fonte: Osawa; Felício; Gonçalves (2005).
3.9.3 Determinação da Concentração de Glutationa Reduzida (GSH)
Para determinação da atividade antioxidante, fora determinada a concentração da
GSH, a qual baseia na reação do reagente de Ellman (5,5’ –ditiobis; ácido 2-
nitrobenzóico) (DTNB) com o tiol livre originando um dissulfeto misto mais ácido 2-
nitro-5-tiobenzóico (Figura 16). A mensuração do produto de reação formado fora feita
por leitura da absorbância a 412 nm. A concentração da glutationa reduzida fora
expressa em nanograma de GSH / g de tecido. Para a determinação da concentração de
GSH, foi construída uma curva padrão a partir da solução padrão de GSH (1 mg/mL), a
qual foi preparada em triplicata de soluções a 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL. O branco
foi feito com água destilada (4mL) e a cada tubo das soluções de GSH foi acrescentado
4 mL de tampão Tris HCL 0,4M (pH 8,9). Para a determinação da equação da curva
padrão de GSH, foi adicionado ainda a cada tudo 0,1 mL de DTNB (0,01 M) e, logo
após, feita a leitura da absorbância a 412 nm.
Preparou-se o homogenato a 10% em EDTA 0,02 M, em seguida foi retirado
400 µL desse homogenato e adicionado 320 µL de água destilada e mais 80 µL de ácido
58
tricloroacético a 50%. O material foi agitado e centrifugado (3000 g/15 min/4 °C). Em
seguida foi recolhido 400 uL do sobrenadante e acrescido 800 uL de tampão Tris-HCL
0,4 M, pH 8,9 e mais 20 µL de DTNB 0,1M. Após1 minuto da reação foi feita a leitura
da coloração em 412 nm, através de um espectrofotômetro. A concentração da
glutationa reduzida foi expressa em micrograma de GSH por grama de tecido como
descrito por Sedlak e Lindsay (1968).
Figura 16. Reação entre glutationa reduzida e DNTB (reagente de Ellman) para a
determinação de hidroperóxidos empregando a enzima glutationa peroxidase.
Fonte: Rover Junior et al. (2001).
3.10 Análises estatísticas
Todos os valores numéricos foram submetidos a análises de diferenças
estatísticas através da análise de variância (one-way ou Two-way ANOVA), seguido
pelo pós-teste de Comparações Múltiplas de Bonferroni. Consideram-se os valores com
P<0,05 como estatisticamente significativos. As análises estatísticas foram realizadas no
programa Graph Pad Prism, versão 7.0, (San Diego, Ca, EUA).
59
4. RESULTADOS
4.1 Análise da Atividade Antioxidante in vitro
4.1.1 Teste de inibição de DPPH
Anteriormente à análise neuroprotetora in vivo, o composto (MP-1) isolado foi
analisado quanto a sua atividade redutora in vitro, a fim de testar sua capacidade
antioxidante. A atividade antioxidante foi realizada de acordo com a metodologia de
captura do radical orgânico 2,2-difenil-1picril-hidrazila (DPPH), o qual considera uma
molécula antioxidante quando esta apresenta a capacidade de inibir (sequestrar radicais
livres) em, pelo menos 50%. Observou-se no screening de concentrações de MP-1 (10-
2000 ug/ml), um alto percentual em atividade antioxidante de aproximadamente
56,98%, 86,25%, 93,67%, 94,27%, 94,47% e 95,36%, respectivamente, o qual
demonstrou similaridade em relação aos dados do controle positivo (10-2000 ug/mL de
ácido ascórbico) (Figura 17). Tais resultados demonstram uma alta capacidade redutora
do composto testado, o qual apresentou uma concentração necessária para inibição em
50% das moléculas de DPPH (EC50) de 13,59 µg/mL, e eficiência antiradicalar
classificada como muito alta (AE > 10 x 10-³; AE = 0,05). Em outro parâmetro de
análise, como o tempo necessário para atingir o estado estacionário da reação
correspondente ao EC50 (TEC50), a velocidade de reação do diterpeno foi classificada
em muito rápida, pois o MP-1 foi capaz de reduzir 50% das moléculas de DPPH em
menos de 5 minutos.
60
Figura 17. Atividade antioxidante – Ensaio de DPPH
MP-1 Ác. ascórbico
Fonte: Autor. Legenda: O método é descrito de acordo com BRAND-WILIAMS et al.,
1995. A reação foi realizada com DPPH (100 mM) diluído em etanol e lido após 30 min
à 517 nm. (%) = [(A0-A1) / A0] x 100; onde A0 é absorbância do controle negativo
(solução de DPPH + solvente) e A1 é a absorbância da média obtida da triplicata de
cada amostra. O resultado é expresso em % de ação antioxidante e admite-se ação
antioxidante positiva quando o resultado for superior a 50 %.
61
4.2 Análises Comportamentais
4.2.1 Teste do Campo Aberto (Open field Test)
A análise da atividade exploratória através do teste de campo aberto mostra o
efeito da administração de 6-hidroxidopamina (6–OHDA; 21 µg) sobre a atividade
locomotora dos animais. Observou-se que os ratos submetidos à injeção intracraniana
no estriado contendo a neurotoxina 6–OHDA (controle positivo) apresentaram
diminuição acentuada na atividade locomotora, de acordo com os parâmetros
analisados: diminuição significativa (p<0,001) da atividade locomotora horizontal de
aproximadamente 57,1% (28,3 ± 5,7 número de linhas cruzadas) (Figura 18 A) e 49,1%
(p<0,05) da vertical (14,8 ± 2,6 rearings) (Figura 18 B); consequentemente foi
observado um aumento significativo no tempo parado (48,38 ± 12,87 segundos) em
mais de 2000% (Figura 18 D) e uma diminuição na frequência de autolimpeza de
aproximadamente 77,4% (p<0,001) (5,25 ± 0,77 groomings) (Figura 18 C), em relação
ao grupo Sham (DMSO1% + água destilada – controle negativo) (cruzamentos: 65,91 ±
3,9; rearings: 25,56 ± 2,0; tempo parado: 1,66 ± 0,6 s; groomings: 23,13 ± 3,7,
respectivamente).
Foi observado nos grupos tratados com o diterpeno (MP-1) nas doses de 100 e
500 µg/kg (MP-1 + água destilada + DMSO 1%, i.c) um aumento significativo na
atividade locomotora horizontal de aproximadamente 143,21% (p<0,05) (60,83 ± 7,58
número de linhas cruzadas) e 140,28% (p<0,001), respectivamente, em relação ao
controle positivo. O MP-1 na dose de 10 µg/kg, no entanto, não apresentou efeito
significativo na contraposição dos efeitos deletérios da 6-hidroxidopamina neste
parâmetro de observação. Na atividade locomotora vertical, somente os animais tratados
com MP-1 nas doses de 100 e 500 µg/kg apresentaram um aumento significativo de
117,36% (32,17 ± 3,94 rearings) (p<0,001) e 72,29% (25,5 ± 1,71 rearings) (p<0,05),
respectivamente. Entretanto, nenhuma das três doses testadas foi capaz de restaurar a
frequência de autolimpeza, não apresentando diferenças significativas em relação ao
grupo lesionado. Por outro lado, todas as doses administradas foram capazes de reduzir
significativamente o tempo em que os animais permaneceram parados. As doses de 10,
100 e 500 µg/kg reduziram o tempo de imobilidade em 73,49% (12,83 ± 4,6 s), 92,44%
(3,66 ± 3,28 s) e 74,29% (12,44 ± 5,07 s), respectivamente, em relação ao controle
positivo.
62
Figura 18. Análise da atividade exploratória espontânea através do teste de Campo
Aberto.
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M P - 1 ( g /k g , i . c )
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intracraniana no estriado,
contendo água destilada + DMSO 1% (Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA (21µg)
(controle positivo). Decorridos 15 minutos após a injeção de 6-OHDA, os animais foram tratados com injeções
intracraniana contendo o diterpeno (10, 100 e 500 µg/kg + água destilada + DMSO 1%; i.c). Após 14 dias, os
animais foram submetidos ao teste de campo aberto, onde foram avaliados os seguintes parâmetros: (A) número de
cruzamentos, (B) Atividade locomotora vertical (rearing), (C) Tempo de Imobilidade e (D) Autolimpeza
(grooming). One-way ANOVA, Bonferroni. *, ** e *** indicam P<0,05, P<0,01 e P<0,001 respectivamente, em
relação ao grupo Sham; e #, ## e ### indicam P<0,05, P<0,01 e P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6-
OHDA. Os dados estão expressos em média ± EPM. Programa utilizado: GraphPad Prism (v.7,0), considerando
p<0,05. (b) indica p< 0,01 em relação ao grupo sham.
63
4.2.2 Teste de Rota-rod
Os distúrbios locomotores e alterações na coordenação motora causados pela 6-
hidroxidopamina foram avaliados através do teste de Rota–rod. Previamente, todos os
animais foram submetidos a um treinamento em três períodos diferentes antes do teste
comportamental, a fim de descartar possíveis variáveis relacionadas à ausência de
adaptação do animal ao equipamento. Os parâmetros avaliados foram: latência para
queda, velocidade da primeira queda, número de quedas e tempo de permanência na
barra giratória.
Foi observado nos animais do controle positivo, os quais receberam injeção
intraestriatal de 6-OHDA, uma redução significativa (p<0,05) no tempo de latência de
aproximadamente 43,36% (42,64 ± 6,3 segundos) (Figura 19 A), 31,69% de redução
(9,66 ± 0,8 RPM) (p<0,001) na velocidade da primeira queda (Figura 19 B) e
diminuição de 35,23% (68,4 ± 9,7 segundos) no tempo de permanência sobre a barra
giratória, em relação ao grupo Sham (água destilada + DMSO1% i.c) (Figura 19 D).
Além disso, estes apresentaram um aumento significativo (p<0,05) de 110,81% no
número de quedas (7,84 ± 1,4 quedas), apresentando maior dificuldade em se equilibrar
na barra giratória, dificuldades no agarre e tremor, em relação ao controle negativo (3,7
± 0,26 quedas) (Figura 19 C).
Os animais tratados com MP-1 nas doses de 100 µg/kg e 500 µg/kg, por sua vez,
foram capazes de contrapor os danos motores induzidos pela 6-hidroxidopamina em
todos os parâmetros analisados. O grupo tratado com MP-1 a 100 µg/kg apresentou um
aumentou significativo (p<0,001) de 153,28% (108 ± 10,02 segundos) no tempo de
latência e 77,74% (17,17 ± 0,7 RPM) (p<0,001) na velocidade da primeira queda, em
relação aos animais hemiparkinsonianos. Além disso, este também apresentou um
aumento (p<0,01) de 70,76% (116,8 ± 5,3 segundos) no tempo de permanência sobre a
barra giratória e, consequentemente uma redução significativa (p<0,05) de 65,9% no
número de quedas (2,66 ± 0,21 quedas), em relação ao controle positivo.
A dose de 500 µg/kg também inibiu os efeitos deletérios da neurotoxina,
aumentando significativamente os parâmetros a saber: latência: 97,70% (p<0,01) (84,3
± 8,7 segundos); velocidade da primeira queda: 48,03% (14,3 ± 1,05 RPM) (p<0,01) e
permanência na barra giratória: 63,15% (111,6 ± 6,4 segundos). Ademais, foi observado
64
neste grupo uma redução significativa (p<0,01) de 62,83% (2,9 ± 0,3 quedas) no
número de quedas em relação ao controle positivo. No entanto, a dose de 10 µg/kg não
apresentou efeito significativo em nenhum dos parâmetros observados.
Figura 19: Avaliação do comportamento motor através do teste de Rota-rod
S H A M - 1 0 1 0 0 5 0 0
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6 -O H D A (2 1 g )
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intracraniana no estriado,
contendo água destilada + DMSO 1% (Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA (21µg)
(controle positivo). Decorridos 15 minutos após a injeção de 6-OHDA, os animais foram tratados com injeções
intracraniana contendo o diterpeno (10, 100 e 500 µg/kg + água destilada + DMSO 1%; i.c). Após 14 dias os
animais foram submetidos ao teste do Rota-rod onde foram avaliados os seguintes parâmetros: (A) Latência para a
queda, (B) Velocidade da primeira queda, (C) Número de quedas e (D) Tempo de permanência. Os animais foram
treinados previamente antes da realização do teste, para adaptação do animal ao equipamento. One-way ANOVA,
Bonferroni *, ** e *** indicam p<0,05, p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham; ; e #, ## e
65
### indicam P<0,05, P<0,01 e P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6-OHDA. Os dados estão expressos
em média ± EPM. Programa utilizado: GraphPad Prism (v.7,0), considerando p<0,05.
4.2.3 Teste Rotacional induzido por apomorfina
O teste rotacional induzido por apomorfina é considerado o principal teste para
avaliação do processo neurodegenerativo dopaminérgico no modelo de DP, apenas no
caso de lesão unilateral por 6-OHDA (SOUZA, 2015). Os danos induzidos pelo estresse
oxidativo causados pela ação da neurotoxina, culmina em degeneração seletiva de
neurônios doparminérgicos e, consequentemente escassez de dopamina no sistema
nigro-estriatal (SALAMA; ARIAS-CARRIÓN, 2011).
Este mecanismo induz a uma elevada expressão de receptores dopaminérgicos
nas células neurais do estriado em resposta a depleção de dopamina, tornando a
membrana das células extremamente sensíveis (DAUER; PRZEDBORSKI, 2003;
TIEU, 2011). Desta forma, o teste reflete a hipersensibilidade do animal a dopamina
(escassa) no lado lesionado, ocasionado pela administração intraperitoneal de
apomorfina, um agonista doparminérgico (AGUIAR, 2009; SOUZA, 2015). A
apomorfina induz a um aumento temporário da atividade locomotora no lado
contralateral a lesão, promovendo uma rotação do animal no sentido contrário ao lado
lesionado e, portanto, possibilitando uma quantificação comportamental do nível da
lesão (DEUMENS et al., 2002; BLANDINI et al., 2008).
No 14º dia de tratamento, os animais foram submetidos ao teste rotacional
induzido por apomorfina, a fim de quantificar o grau de degeneração através de rotações
contralaterais ao local lesionado (Núcleo da base ipsilateral) pela neurotoxina (6-
OHDA; 21 µg). Os resultados indicam um processo neurodegenerativo induzido por 6-
OHDA no estriado de ratos, os quais apresentaram rotações contralaterais
significativamente elevadas (p<0,001), e no período de 10 a 50 minutos,
respectivamente após a injeção intraperitoneal de apomorfina (Figura 20). Os resultados
indicaram um aumento em mais de 2900% (p<0,05) (101,6 ± 24.63 rotações) no número
de rotações contralaterais no grupo 6-OHDA em relação ao grupo Sham (3,3 ± 0,8
rotações) (Figura 21).
Os animais tratados com MP-1 a 100 µg/kg e 500 µg/kg apresentaram
diminuição no número de rotações contralaterais de 75,4% (p<0,05) (25 ± 18,55
66
rotações) e 91,15% (p<0,05) (9 ± 3,5 rotações), respectivamente, em relação ao grupo
lesionado. No entanto, não houve diferenças quanto o número de rotações contralaterais
induzidas por apomorfina, entre os animais submetidos à dose de 10 µg/kg e o grupo
hemiparkinsoniano.
Figura 20. Análise temporal do teste rotacional induzido por apomorfina
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0
0
1 0
2 0
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M P - 1 1 0 0 g /k g
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**M P - 1 5 0 0 g /k g*
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intracraniana no estriado,
contendo água destilada + DMSO 1% (Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA (21µg)
(controle positivo). Decorridos 15 minutos após a injeção de 6-OHDA, os animais foram tratados com injeções
intracraniana contendo o diterpeno (10, 100 e 500 µg/kg + água destilada + DMSO 1%; i.c). Após 14 dias, os
animais foram submetidos ao teste Rotacional induzido por apomorfina (3 mg/kg; i.p), sendo contabilizado o
número de rotações contralaterais a cada 10 minutos durante 1 hora. Two-way ANOVA, Bonferroni. *, ** e
*** indicam p<0,05, p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham. Os dados estão expressos
em média ± EPM. Programa utilizado: GraphPad Prism (v.7,0), considerando p<0,05 como diferença estatística
significativa.
67
Figura 21. Análise do número de rotações contralaterais totais
S H AM - 1 0 1 0 0 5 0 0
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#
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7 5 ,4 %
9 1 ,1 5 %
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intracraniana no estriado,
contendo água destilada + DMSO 1% (Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA (21µg)
(controle positivo). Decorridos 15 minutos após a injeção de 6-OHDA, os animais foram tratados com injeções
intracraniana contendo o diterpeno (10, 100 e 500 µg/kg + água destilada + DMSO 1%; i.c). Após 14 dias, os
animais foram submetidos ao teste Rotacional induzido por apomorfina (3 mg/kg; i.p), sendo contabilizado o
número de rotações contralaterais durante 1 hora. Two-way ANOVA, Bonferroni. *, ** e *** indicam p<0,05,
p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham. Os dados estão expressos em média ± EPM.
Programa utilizado: GraphPad Prism (v.7,0), considerando p<0,05 como diferença estatística significativa.
68
4.3 Análise ponderal da massa corpórea
Para uma análise mais acurada dos efeitos sistêmicos induzidos pela cirurgia
estereotáxica e pelas disfunções no sistema dopaminérgico provocadas pela
neurotoxina, respectivamente, a massa corpórea dos animais foi mensurada diariamente
durante os 14 dias de tratamento, com o propósito de observar uma possível variação no
ganho de massa dos animais (Figura 22). De acordo com a análise dos dados, observou-
se que todos os animais apresentaram uma perda na massa corpórea entre o 1º e o 5º dia
após a cirurgia, sendo esta mais acentuada nos animais hemiparkinsonianos (6-OHDA;
21 µg - controle positivo) que apresentaram uma diminuição significativa (p<0,001) na
massa, bem como maior dificuldade em recuperar a mesma durante os dias observados.
No entanto, todos os animais submetidos ao tratamento com injeção
intracraniana contendo MP-1 (10, 100 e 500 µg/kg; i.c) recuperaram normalmente o
ganho de massa a partir do 6º (100 µg / kg, i.c) ou 8º (10 e 500 µg / kg, i.c) dia de
tratamento, evidenciando a proteção do composto contra os efeitos sistêmicos
provocados pela neurotoxina.
69
Figura 22. Variação ponderal da massa corpórea (Δ g)
-3 0
-2 5
-2 0
-1 5
-1 0
-5
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
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***
**** *
***
***
* *
***
* *
***
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intraestriatal com água
destilada e DMSO 1% (Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA (21 mg).
Decorridos 20 minutos após a indução, os animais foram tratados com o diterpeno 10, 100 e 500 mg/kg
(diterpeno + água destilada + DMSO 1%, i.c) e os controles com DMSO1%/água destilada. Os animais
foram pesados diariamente durante os 14 dias de tratamento. Two-Way ANOVA, Bonferroni. *, **, ***
indicam diferença estatística com p<0,05, p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6-
OHDA. Os dados estão expressos em média ± EPM. Programa utilizado: GraphPad Prism (v.7,0),
considerando p<0,05.
70
4.4 Análises Neuroquímicas
4.4.1 Derterminação da concentração de Nitrito (NO2) / Nitrato (NO3) em áreas
cerebrais
A análise neuroquímica das áreas cerebrais revelou um acentuado aumento nos
níveis de nitrito/nitrato em mais de 100% no corpo estriado (p<0,001) e mais de 150%
no hipocampo (p<0,001) de animais hemiparkinsonianos, evidenciando o efeito
oxidativo da produção de nitrito/nitrato provocado pela administração intraestriatal de
6-OHDA, em relação ao grupo Sham (Figura 23). Por outro lado todos os animais
tratados com MP-1 nas de 10, 100 e 500 µg / kg, i.c, apresentaram redução significativa
(p<0,001) no nível de nitrito/nitrato de aproximadamente 87,2%, 75,41% e 65,25%,
respectivamente, em corpo estriado, e de aproximadamente 72,45%, 84,45% e 76,97%,
respectivamente, em hipocampo, em relação ao grupo 6-OHDA. Os níveis de
nitrito/nitrato no córtex pré-frontal de animais do controle positivo (6-OHDA, 21 µg)
também apresentaram aumento significativo (p<0,01) de 137,94% em relação ao grupo
Sham. Entretanto, todas as doses administradas (10, 100 e 500 µg / kg, i.c) de MP-1
reduziram significativamente o nível de nitrito/nitrato no córtex pre-frontal em 62,11%
(p<0,01), 72,99% (p<0,001) e 68,3% (p<0,01), em relação ao grupo lesionado,
demonstrando que o composto testado foi capaz de contrapor os danos oxidativos
relacionados à produção de nitrito/nitrato em todas as áreas cerebrais.
71
Figura 23. Níveis de nitrito/nitrato em áreas cerebrais.
S H A M - 1 0 1 0 0 5 0 0
0
2
4
6
C o r p o e s tr ia d o ( Ip s ila te r a l)
* * *
Nit
rit
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# # #
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S H A M - 1 0 1 0 0 5 0 0
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4
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S H A M - 1 0 1 0 0 5 0 0
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6 -O H D A (2 1 g )
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6 -O H D A (2 1 g )
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e t
ec
ido
D
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intracraniana no estriado,
contendo água destilada + DMSO 1% (Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA (21µg)
(controle positivo). Decorridos 15 minutos após a injeção de 6 - OHDA, os animais foram tratados com
injeções intracraniana contendo o diterpeno (10, 100 e 500 µg/kg + água destilada + DMSO 1%; i.c). No 15º
dia após a cirurgia os animais foram eutanasiados e as áreas cerebrais de interesse devidamente dissecadas: (A)
Corpo estriado ipsilateral, (B) Corpo estriado contralateral, (C) Hipocampo e (D) Córtex Pré-Frontal para
análise dos níveis de Nitrito/Nitrato. One way ANOVA, Bonferroni. *, ** e *** indicam p<0,05, p<0,01 e
p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham; #, ## e ### indicam p<0,05, p<0,01 e p<0,001,
respectivamente, em relação ao grupo 6 - OHDA. Os dados estão expressos em média ± EPM. Programa
utilizado: GraphPad Prism (V.7,0), considerando p<0,05 como diferença estatística significativa.
72
4.4.2 Determinação dos níveis de peroxidação lipídica (TBARS) nas áreas
cerebrais
O malonialdeído (MDA) é um dos principais produtos do processo da peroxidação
lipídica, e a mensuração da concentração deste composto nos tecidos cerebrais pode indicar
o nível de oxidação de lipídeos das membranas celulares, sejam causados pela
administração de neurotoxinas como a 6-OHDA ou mecanismo intrínseco desregulado,
produtor de radicais livres. Desta forma, a análise dos níveis de MDA nas áreas cerebrais
fornece mecanismos de investigação quanto à capacidade preventiva de determinados
compostos, capazes de proteger as células neurais do processo oxidativo. A fim de
observar os efeitos oxidativos gerados pela neurotoxina (6-OHDA; 21) nas áreas cerebrais
analisadas, foram mensurados os níveis de peroxidação lipídica baseando-se nas
substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBA), através da concentração de
malonialdeído (MDA). De acordo com os dados, a neurotoxina (6-OHDA) promoveu um
aumento significativo em mais de 100% nos níveis de malonialdeído (MDA) nos núcleos
da base ipsilateral (p<0,001) e contralateral (p<0,05), 89,90% (p<0,01) de aumento no
hipocampo, e mais de 400% (p<0,001) no córtex pré-frontal, em relação ao grupo Sham.
Por outro lado, todas as amostras cerebrais coletadas de animais tratados com MP-1 nas
doses de 100 e 500 µg / kg; i.c, apresentaram uma redução significativa (p<0,001) nos
níveis de peroxidação lipídica em mais de 75% nos núcleos da base, em relação aos
animais hemiparkinsonianos. Entretanto, nenhuma das três doses administradas foi capaz
de reverter os efeitos deletérios da 6-OHDA no córtex pré-frontal, além disso, apenas a
dose de 500 µg / kg reduziu os níveis de MDA no hipocampo, apresentando diminuição
significativa (p<0,01) de 48,03%, em relação ao controle positivo (figura 24).
73
Figura 24. Análise dos níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS) nas áreas cerebrais
S H A M - 1 0 1 0 0 5 0 0
0
5 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
1 5 0 0 0 0
C o r p o e s tr ia d o ( Ip s ila te r a l)
* * *
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6 0 0 0 0
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6 -O H D A (2 1 g )
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D
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intracraniana no estriado,
contendo água destilada + DMSO 1% (Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA
(21µg) (controle positivo). Decorridos 15 minutos após a injeção de 6 - OHDA, os animais foram tratados
com injeções intracraniana contendo o diterpeno (10, 100 e 500 µg/kg + água destilada + DMSO 1%; i.c).
No 15º dia após a cirurgia os animais foram eutanasiados e as áreas cerebrais de interesse devidamente
dissecadas: (A) Corpo estriado ipsilateral, (B) Corpo estriado contralateral, (C) Hipocampo e (D) Córtex
Pré-Frontal para análise dos níveis de TBARS. One way ANOVA, Bonferroni. *, ** e *** indicam
p<0,05, p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham; #, ## e ### indicam p<0,05,
p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6 - OHDA. Os dados estão expressos em média
± EPM. Programa utilizado: GraphPad Prism (V.7,0), considerando p<0,05 como diferença estatística
significativa.
74
4.4.3 Determinação dos níveis de glutationa reduzida (GSH) nas áreas cerebrais
De acordo com a análise de GSH, houve um aumento significativo em todas as
áreas cerebrais do grupo 6-OHDA, em relação ao grupo Sham. Contudo, a análise das
áreas cerebrais revelou que os animais submetidos ao tratamento com MP-1 não
conseguiram reverter os danos oxidativos via GSH (figura 25).
75
Figura 25. Níveis de glutationa reduzida (GSH) nas áreas cerebrais
S H A M - 1 0 1 0 0 5 0 0
0
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o)
Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 6 por grupo) foram submetidos à injeção intracraniana no estriado,
contendo água destilada + DMSO 1% (Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA
(21µg) (controle positivo). Decorridos 15 minutos após a injeção de 6 - OHDA, os animais foram tratados
com injeções intracraniana contendo o diterpeno (10, 100 e 500 µg/kg + água destilada + DMSO 1%; i.c).
No 15º dia após a cirurgia os animais foram eutanasiados e as áreas cerebrais de interesse devidamente
dissecadas: (A) Corpo estriado ipsilateral, (B) Corpo estriado contralateral, (C) Hipocampo e (D) Córtex
Pré-Frontal para análise dos níveis de GSH. One way ANOVA, Bonferroni. *, ** e *** indicam p<0,05,
p<0,01 e p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham; #, ## e ### indicam p<0,05, p<0,01 e
p<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6 - OHDA. Os dados estão expressos em média ± EPM.
Programa utilizado: GraphPad Prism (V.7,0), considerando p<0,05 como diferença estatística
significativa.
76
5. DISCUSSÃO
Os diterpenos são moléculas versáteis classificadas como metabólitos
secundários, fazendo parte dos produtos gerados no metabolismo vegetal a partir dos
compostos primários (macromoléculas, carboidratos, lipídios e proteínas) que atuam nas
rotas metabólicas geradoras de energia (ATP), poder redutor (NADPH) e biossíntese de
compostos essenciais à sua sobrevivência (PETERS, 2010; BOER; DE VRIES-VAN
LEEUWEN, 2012). Contudo, estes compostos apresentam atividades endógenas
diversas que conferem vantagens adaptativas aos seus produtores (vegetais, algas,
fungos, líquens) (RUZICKA, 1953; GONZÁLEZ-BURGOS; GÓMEZ-
SERRANILLOS, 2012). Estas moléculas apresentam comportamento químico
extremante diversificado e, é justamente esta diversidade química entre os diterpenos
que podem ser exploradas através de aplicações biotecnológicas, permitindo verificar
sua eficácia terapêutica e mecanismos de ação diante os diversos testes e modelos
experimentais (HWANG et al., 2008; JO et al., 2012; ISLAM; MARQUES et al., 2016).
Testes como o ensaio de inibição de DPPH permitem determinar eficientemente
se um dado composto possui propriedades antioxidantes (GONZÁLEZ-BURGOS et al.,
2010; JUNIOR; DE LIMA YAMAGUCHI; ALCANTARA, 2011). De acordo com os
resultados obtidos o diterpeno MP-1 apresentou uma elevada atividade redutora frente
aos radicais livres de DPPH neutralizando-os em mais de 50%, confirmando sua ação
antioxidante. Estes achados corroboram com dados descritos na literatura a cerca destas
moléculas, visto que alguns diterpenos apresentam atividades redutoras já descritas.
Estudos conduzidos por González-Burgos e colaboradores (2010), mostraram que os
diterpenos andalusol e lagascatriol isolados de diferentes espécies vegetais do gênero
Sideritis, reduziram em 20% o conteúdo de DPPH, em concentração de 50 µg/mL.
Estes resultados sugerem que estes compostos tem a capacidade de capturar radicais
livres, propriedade atribuída à possibilidade de doar um átomo de hidrogênio.
Os modelos experimentais, além de permitir um melhor entendimento a cerca da
patogênese da DP, possibilitam também avaliar a eficiência terapêutica de novos
fármacos e bioativos frente a injúrias provocadas por neurotoxinas (BLESA;
PRZEDBORSKI, 2014; SARMENTO SILVA et al., 2015; LINS et al., 2017). Ao longo
dos últimos anos, vários modelos animais de DP têm sido desenvolvidos e têm
contribuído extensivamente para a expansão do conhecimento da DP. O uso de drogas
77
como a RES e 6-OHDA tem se mostrado eficaz para modelar diferentes aspectos da DP
em roedores (BLESA; PRZEDBORSKI, 2014).
A 6-OHDA afeta o sistema nigroestriatal causando degeneração seletiva de
neurônios dopaminérgicos, culminando no surgimento dos principais sintomas motores,
comportamentais e neuroquímicos associados à DP (TIEU; DUTY; JENNER, 2011;
BOVÉ; PERIER, 2012). De acordo com a análise dos resultados, estas alterações foram
observadas na diminuição da atividade exploratória (Figura 18), disfunção na
coordenação motora (Figura 19) e alterações no ganho normal de peso dos animais
(Figura 22). Estes sintomas estão relacionados às alterações neuroquímicas, tais como
diminuição no conteúdo de dopamina, sensibilização à agonistas dopaminérgicos,
processos pró-inflamatórios e pró-oxidativos. Além disso, a toxicidade induzida pela
neurotoxina é capaz de induzir uma adaptação celular para autoproteção contra o
estresse oxidativo (TIRMENSTEIN et al., 2005; CUNHA et al., 2013;
MAGALINGAM et al., 2014). Em nossos resultados, pode-se observar uma alteração
no sistema antioxidante endógeno, que apresentou um aumento significativo no
conteúdo de GSH nos animais do controle positivo (Figura 25).
Os diterpenos vêm despertando interesse por apresentarem potencial aplicação
na terapia de doenças relacionadas ao estresse oxidativo (CHEN et al., 2006; HWANG;
JEONG, 2008; NELSEY; WILKINS; LINSEMAN, 2010; XU et al., 2011;
GONZÁLEZ-BURGOS; GÓMEZ-SERRANILLOS, 2012; YAN et al., 2013). A partir
de então, a literatura tem demonstrado que diterpenos de diversas fontes podem exercer
efeitos neuroprotetores, atuando na contraposição de alterações neuroquímicas, sendo
capazes de reduzir os distúrbios motores e neurocomportamentais (HONG et al., 2007;
ZHANG; WU et al., 2015; LIN; TSAI; ISLAM; HABTEMARIAM, 2016).
No modelo de DP, induzido por 6-OHDA, pôde-se observar alguns dos
principais achados descritos na literatura desta neurotoxina em ratos, como uma
diminuição na atividade exploratória, redução no comportamento de bipedestação
(rearings) e aumento no tempo de imobilidade. No presente estudo, foi possível
observar um efeito do diterpeno (MP-1), na melhora da atividade exploratória
espontânea dos animais (100 e 500 µg/kg; i.c.), aumentando o número de linhas
cruzadas e de rearings, além da diminuição do tempo de imobilidade (10, 100 e 500
µg/kg; i.c.) (Figura 18). Além da dopamina estriatal, a 6-OHDA também é capaz de
78
alterar o sistema serotonérgico, causando redução dos níveis de serotonina hipocampal
(5-HT) e sintomas de depressão em roedores (SANTIAGO et al., 2010). Em nosso
estudo, algumas destas alterações foram observadas na redução da taxa do
comportamento de autolimpeza (groomings) em animais hemiparkinsonianos. Contudo,
não foi observada uma melhora nas taxas de groomings nos grupos de tratamento, que
apresentaram diferenças significativas em relação ao controle negativo, demostrando
que o MP-1 não foi capaz de reverter este parâmetro.
O teste do rotarod é bastante utilizado para avaliar os déficits comportamentais e
o grau de lesão induzidos pela 6-OHDA em modelos animais de DP, e tem se mostrado
uma ferramenta útil para investigar a eficácia de novas drogas para o tratamento da DP
(ROZAS; GARCIA, 1997; LINS et al., 2017). Este teste é utilizado para avaliar a
coordenação motora e o equilíbrio de roedores quando os mesmos são colocados sobre
um eixo de rotação com um protocolo de frequência fixa ou de aceleração. No presente
estudo, utilizamos um protocolo de aceleração de 4 a 40rpm, que tem demonstrado ser
eficaz para identificar ratos lesionados após a injeção unilateral no estriado
(MONVILLE; TORRES; DUNNETT, 2006; SOUZA et al., 2017).
Animais com lesão tendem a apresentar uma dificuldade de permanecer no
aparato à medida que a frequência do eixo de rotação aumenta e, desta forma, eles
apresentam uma latência menor para a queda comparado aos animais controles sem
lesão (IANCU et al., 2005; MONVILLE; TORRES; DUNNETT, 2006; DECRESSAC;
MATTSSON; BJÖRKLUND, 2012). Estas alterações foram observadas em nossos
resultados, que apontaram uma maior dificuldade nos animais hemiparkinsonianos em
se manter sobre a barra giratória, com diminuição considerável da latência e maior
número de quedas, em relação ao controle negativo (Figura 19). Contudo, os animais
que receberam injeção intracraniana de MP-1 (100 e 500 µg/kg; i.c.), apresentaram
melhora significativa na coordenação motora observada no teste. Resultados
semelhantes foram observados por Hong e colaboradores (2007), que relataram o efeito
do melhoramento motor em camundongos submetidos ao modelo de DP induzido por
MPTP, e tratados por via intraperitoneal com o diterpeno tripchlorolide (TW397),
apresentando redução no número de quedas e melhor desempenho sobre a barra
giratória. Estes dados demonstram uma ação neuroprotetora de determinados compostos
diterpenoides, contra a toxicidade induzida por neurotoxinas, com importantes
implicações para o tratamento da DP.
79
Ratos com lesões unilaterais do sistema nigroestriatal possuem um
comportamento estereotipado de rotação que tem sido associado a um desequilíbrio
neuroquímico, especialmente dos níveis de dopamina, entre os sistemas nigroestriatal do
lado ipsilateral e contralateral à lesão (HUDSON et al., 1993). Este comportamento
rotacional pode ser potencializado por agonistas dopaminérgicos, tais como a
apomorfina. A administração deste agonista, portanto, culmina em um comportamento
assimétrico, contralateral ao local lesionado. Dessa forma, pode-se validar a cirurgia
esteriotáxica unilateral de 6-OHDA, mensurando o número dessas rotações que
representa o principal teste de verificação do processo neurodegenerativo
dopaminérgico no modelo de DP induzido por esta neurotoxina (HEFTI et al., 1980;
GREALISH et al., 2010; SOUZA et al., 2017).
No presente estudo, observamos um aumento significativo no número de
rotações contralaterais do grupo 6-OHDA em relação ao grupo Sham (Figuras 20 e 21).
Os animais tratados com MP-1 (100 e 500 µg/kg; i.c.), por sua vez, apresentaram uma
redução no número de rotações, demonstrando um possível efeito neuroprotetor do
bioativo, que preveniu a redução dos níveis de dopamina endógena. Alguns diterpenos
encontram-se descritos pelos efeitos de prevenção de lesões nigroestriatais provocadas
por neurotoxinas. Estudos conduzidos por Wu e colaboradores (2015) mostraram que
ratos pré-tratados com o diterpeno ácido carnósico (CA) apresentaram diminuição no
número de rotações contralaterais. Resultados semelhantes também podem ser
observados em estudos conduzidos por Zhang e colaboradores (2015), que relataram a
redução no número de rotações contralaterais em camundongos submetidos a danos
unilaterais de 6-OHDA no estriado direito, e tratados intraperitonealmente com 10
mg/kg do diterpeno tanshionina IIA. Em nossos estudos, efeitos semelhantes foram
observados utilizando menores doses da droga, o que demonstra a ação eficaz de
neuroproteção do diterpeno MP-1 contra injúrias neurotóxicas.
A 6-OHDA é uma neurotoxina capaz de gerar alterações sistêmicas que se
refletem também na alteração do ganho normal de peso em animais
hemiparkinsonianos, em decorrência de desordens gastrointestinais, perturbação da
deglutição e/ou alterações no comportamento alimentar (KISTNER; LHOMMEÉ;
KRACK, 2014), visto que esta droga é capaz de mimetizar cerca de 60-70% dos
sintomas da DP (BOVÉ; PIER, 2012). De acordo com a literatura, pacientes com DP
mostram uma desregulação na massa corpórea, quando comparado com sujeitos sadios
de mesma idade (VAN DER MARCK et al., 2012). Alterações semelhantes foram
80
observadas em nossos resultados, que apontaram uma perda de peso em ratos
submetidos à lesão pela neurotoxina. Entretanto, os animais tratados com o MP-1,
recuperaram o ganho de peso normal a partir do 6° (100 µg/kg i.c.) e 8° dia (10 e 500
µg/kg i.c.) de tratamento (Figura 22). Produtos de plantas são, frequentemente,
considerados menos tóxicos e com menos efeitos colaterais que drogas sintéticas, sendo
amplamente utilizadas pela população no tratamento de várias doenças (DORNAS et
al., 2009). Além disso, alguns diterpenos presentes em extratos vegetais são relatados
pelos seus efeitos de prevenção contra alterações metabólicas e hiperglicêmicas (LI et
al., 2007). Desta forma, a prospecção de compostos diterpenoides em modelos de DP
podem auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias farmacológicas para a
neuroproteção com menos efeitos adversos.
Os mecanismos pró-apoptóticos causados pela neurotoxina 6-OHDA estão
relacionados a processos geradores de estresse oxidativo e nitrosativo, os quais
envolvem o aumento dos níveis de nitrito/nitrato (NO2/NO3) e peroxidação lipídica em
áreas cerebrais de roedores (DATTA et al., 2000; GILGUN-SHERKI; MELAMED;
OFFEN, 2001; DAUER; PRZEDBORSKI, 2003; ARAÚJO et al., 2013). No presente
estudo, este aumento foi observado nos animais hemiparkinsonianos, em relação ao
controle negativo. O tratamento com MP-1 foi capaz de reverter significativamente o
estresse nitrosativo, nas três doses testadas (figura 23). Entretanto, apenas as doses de
100 e 500 µg/kg (i.c.) foram capazes de reverter os níveis de MDA, previnindo a
peroxidação lipídica apenas no corpo estriado (ipsilateral e contralateral) e hipocampo
(500 µg/kg, i.c.) (Figura 24).
A GSH é um antioxidante potente presente em todos os tecidos de mamíferos,
participando da sinalização REDOX para o controle da peroxidação lipídica, bem como
para espécies reativas de oxigênio de nitrogênio (SCHOLZ et al., 1989; YANG et al.,
2002; XU et al., 2002; LU, 2013). Em estudos conduzidos por Tirmensteins e
colaboradores (2005), foi observado um aumento da concentração de glutationa
reduzida em cultura de neuroblastomas humanos (SH-SY5Y). No presente estudo,
resultados semelhantes foram observados em áreas cerebrais de animais do controle
positivo, que apresentaram um aumento nos níveis de GSH. Contudo, o MP-1 não foi
capaz de induzir a ação antioxidante por esta via, sendo observados níveis elevados de
GSH apenas nas áreas de animais submetidos à dose de 10 µg/kg (i.c.), que apresentou
menor eficiência na atividade de neuroproteção dentre os parâmetros analisados. Estes
81
resultados sugerem que os altos níveis encontrados nos grupos tratados com 10 µg/kg
(i.c.) ocorreram devido à toxicidade induzida pela neurotoxina.
O diterpeno MP-1 testado no presente estudo é constituído por anéis cíclicos, de
estrutura volumosa, contendo grupos substituintes, principalmente cadeias alifáticas e
grupos hidroxilas. Desta forma, levando em consideração os resultados da TEC50 de
MP-1 que apresentou um curto tempo de reação (TEC50), pode-se sugerir que a sua
ação antioxidante e neuroprotetora ocorra pela neutralização de radicais livres, através
da transferência de átomos de hidrogênio, visto que o MP-1 apresenta uma alta
eficiência antiradicalar e não foi capaz de modular positivamente a resposta
citoprotetora via GSH em áreas cerebrais de ratos submetidos à neurotoxina 6-OHDA.
82
6. CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos, o presente estudo conclui que o novo diterpeno
MP-1, isolado de C. argyrophylloides possui propriedades redutoras e exerce efeito de
neuroproteção, impedindo alterações neuroquímicas e neurocomportamentais induzidas
pela neurotoxina 6-OHDA e, portanto, apresenta-se como uma ferramenta
farmacológica em potencial, fornecendo subsídios para a continuidade de estudos
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