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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
KAMILA DE SOUSA OTÁVIO
PURIFICAÇÃO PARCIAL DA BSP5 DO PLASMA SEMINAL BOVINO
FORTALEZA
2017
KAMILA DE SOUSA OTÁVIO
PURIFICAÇÃO PARCIAL DA BSP5 DO PLASMA SEMINAL BOVINO
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Zootecnia,
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do Título de Mestre em
Zootecnia. Área de Concentração: Reprodução
Animal.
Orientador: Prof. Dr. Arlindo de Alencar
Araripe Noronha Moura.
Co-orientador: Dr. Fábio Roger Vasconcelos.
FORTALEZA
2017
KAMILA DE SOUSA OTÁVIO
PURIFICAÇÃO PARCIAL DA BSP5 DO PLASMA SEMINAL BOVINO
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Zootecnia,
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do Título de Mestre em
Zootecnia. Área de Concentração: Reprodução
Animal.
Aprovada em ____/_____/____
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________
Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_______________________________________________________
Dr. Fábio Roger Vasconcelos (Co-orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_______________________________________________________
Prof. Dr. Jorge André Matias Martins
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE)
________________________________________________________
Dr. Mauricio Fraga van Tilburg
Universidade Estadual do Ceará (UECE)
Aos meus queridos avós gostaria de dedicar
esta conquista.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por ter colocado pessoas tão especiais ao meu lado nessa trajetória.
À Universidade Federal do Ceará e ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, pela
oportunidade de realização desta conquista.
Ao Prof. Dr. Arlindo Moura por sua dedicação e conhecimentos dispensados a mim
durante o mestrado. Você é referência profissional e pessoal para o meu crescimento.
Ao Dr. Jorge Martins por ter contribuído com sua genialidade para nosso experimento,
mesmo que de longe sempre nos acompanhando. Meu profundo agradecimento pelo seu
profissionalismo e amizade.
Ao Dr. Fábio Roger Vasconcelos, agradeço pela colaboração, apoio e tempo dedicado
a mim durante a execução deste trabalho para obtenção de melhores resultados.
À CAPES pela concessão da bolsa de auxílio financeiro.
Aos membros participantes da banca examinadora: Jorge André Matias Martins, Fábio
Roger Vasconcelos e Mauricio Fraga van Tilburg, pela valorosa contribuição com a melhoria
do nosso trabalho.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia pelos conhecimentos
transmitidos.
Aos meus pais, Mário César e Carmen, obrigada pelo amor incondicional, por todo
incentivo e por sempre acreditarem em meu potencial.
Aos avós mais lindos do mundo, Maria de Lourdes e Belarmino (in memoriam), Elcisa
e Francisco (in memoriam), Maria do Socorro e Wilson. Tudo o que eu sou eu devo a vocês!
À toda minha família que representa o meu bem mais precioso e a minha maior
saudade, obrigada por todas as palavras de apoio e incentivo para que eu sempre seguisse de
cabeça erguida por onde quer que eu fosse.
À minha parceira de mestrado Bruna Félix pela amizade e companheirismo durante
esses anos, do qual teremos muitas histórias para contar, muitos áudios no Whatsapp
compartilhando desde os mais banais até os problemas mais cabeludos. Obrigada por tudo!
As minhas companheiras de apartamento Luanda Rêgo e Solange Damasceno por toda
amizade e sempre estarem ao meu lado. Obrigada por todos os conselhos e momentos
compartilhados!
A Mónica Ramírez e Aderson Viana por toda paciência e nunca hesitarem em me
ajudar, vocês são profissionais admiráveis e meus anjos da guarda nesse laboratório.
Ao Fagner Cavalcante pelo tempo dedicado ao me fazer compreender os métodos de
purificação assim que cheguei ao laboratório.
Aos amigos do laboratório pela parceria de sempre: Revila Melo, Deisy Díaz, Ana
Luiza Cazaux, Mayra Vettorazzi, Renato Passos, Moemia Portela, Taciane Alves, Thiago
Damasceno, Eduardo Pessoa, David Vale, Arabela Guedes, Antônio Carlos Albuquerque,
Maria Júlia Bezerra, Fábio Vasconcelos, Jander Fabrício, Mariana Baraldi, Nielyson Batista.
Vocês são a minha família cearense!
Aos amigos do laboratório de genética molecular, em especial ao Dr. Thalles Barbosa
Grangeiro e Dr. José Edvar Monteiro Júnior pela parceria e contribuição para o andamento do
experimento.
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,
mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou
o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou
o que era antes.”
(Marthin Luther King)
RESUMO
O plasma seminal vem sendo objeto de várias pesquisas devido a sua importância na fisiologia
espermática, ao qual a análise dos fluidos reprodutivos fornece informações cruciais para a
compreensão dos mecanismos que determinam a capacidade fecundante dos gametas
masculinos. Objetivou-se no presente estudo indicar um método para purificar a Binder of
SPerm 5 (BSP5), proteína de 30 kDa presente no fluido das glândulas vesiculares de touros Bos
indicus. O fluido seminal foi extraído das glândulas vesiculares obtidas em abatedouro, e
posteriormente, submetido às cromatografias de afinidade à heparina (Hitrap Heparin HP)
seguida pela cromatografia de troca iônica (SP Sepharose). Para o monitoramento da
purificação, realizou-se SDS-PAGE e para confirmação das proteínas foi realizado western blot
com anticorpo específico para BSP5. Baseado no perfil cromatográfico da heparina, foram
observados dois picos bem definidos (nHBP e HBP), dos quais o pico referente às proteínas
com afinidade pela heparina (HBP) representou percentual de 51,5% de proteínas do fluido das
glândulas vesiculares. As HBPs, quando separadas por meio de cromatografia de troca-iônica,
apresentaram seis picos agrupados em quatro frações cromatográficas (P1, P2, P3 e P4), dos
quais os picos de proteínas ligantes (P3 e P4) totalizou 80,97%. O Western blot com anticorpo
anti-BSP5 purificado a partir de anti-soro de coelho, confirmou a presença da banda de 30 kDa
no fluido das glândulas vesiculares, no pico com afinidade à heparina e pico 4 da troca iônica.
A partir dessa purificação parcial, foi observada que a sequência cromatográfica de afinidade
pela heparina seguida de troca catiônica, é eficaz para capturar a BSP5. Contudo, faz-se
necessário a ampliação desse método, seguido de confirmações através de sequenciamento
recombinante e espectrometria de massas. E a partir dessa purificação é possível a realização
de testes funcionais que permitem compreender os mecanismos pelos quais as proteínas BSPs
modulam a capacitação espermática, além de incrementar processos biotecnológicos.
Palavras-chave: BSP5. Bos indicus. Glândulas vesiculares. Fluido seminal.
ABSTRACT
Seminal plasma has been the subject of several studies due to its importance in sperm
physiology, which analysis of reproductive fluids provides crucial information for
understanding the mechanisms that determine the fertile ability of male gametes. The objective
of the present study was to indicate a method to purify the Binder of SPerm 5 (BSP5), a 30-kDa
protein present in the vesicles gland fluid from Bos indicus bulls. The seminal fluid extracted
from seminal vesicles glands was obtained in abattoir, and subsequently subjected to heparin
affinity chromatography (Hitrap Heparin HP), followed by ion exchange chromatography (SP
Sepharose). For the monitoring of purification, SDS-PAGE was performed and western blotting
with BSP5-specific antibody was performed for protein confirmation. Based on heparin-
binding proteins, it was observed two well-separated peaks (nHBP and HBP), which heparin-
binding proteins (HBP) represented a percentage of 51.5% of seminal vesicle fluid proteins.
HBPs, when separated by ion exchange chromatography, showed four peaks (P1, P2, P3 and
P4), which the peaks of binding proteins (P3 and P4) represented 80.97%. Western blot with
anti-BSP5 antibody purified from rabbit antiserum confirmed the presence of the 30-kDa band
in seminal vesicle fluid, HBPs and ion exchange peak 4. From this partial purification, it was
observed that heparin followed by ion exchange chromatographies are effective to capture the
BSP5. However, it is necessary to extend this method, followed by confirmations through
sequencing and mass spectrometry. Moreover, from this purification it is possible to perform
functional tests that allow the understanding of the mechanism by which BSP proteins modulate
the sperm capacitation, in addition to increasing biotechnological processes.
Keywords: BSP5. Bos indicus. Seminal fluid. Vesicle gland.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 − Vista anterior da vesícula seminal............................................................. 15
Figura 2 − Aspectos da fisiologia espermática e fertilização que são potencialmente
influenciados por proteínas identificadas no fluido das glândulas sexuais
acessórias de touros Holteins.....................................................................
17
Figura 3 − Estrutura das proteínas BSPs..................................................................... 22
Figura 4 − Cromatografia de afinidade........................................................................ 26
Figura 5 − Cromatograma de afinidade à heparina das proteínas fluido seminal
bovino........................................................................................................
32
Figura 6 − Cromatograma integrado de afinidade à heparina das proteínas do fluido
seminal bovino. A análise do cromatograma foi realizada através do
Software PrimeView..................................................................................
33
Figura 7 − SDS-PAGE de fluido seminal de touros Bos indicus e frações não-ligantes
e ligantes à heparina......................................................................
33
Figura 8 − Western blot de proteínas do fluido seminal de touros Bos indicus e frações
sem afinidade à heparina e frações retidas na heparina.................
34
Figura 9 − Cromatograma de troca-iônica das proteínas retidas à heparina................ 35
Figura 10 − Cromatograma integrado da troca-iônica das proteínas retidas à heparina.
A análise do cromatograma foi realizada através de Software
PrimeView..................................................................................................
35
Figura 11 − SDS-PAGE de fluido seminal de touros Bos indicus e frações coletadas de
cromatografias de afinidade à heparina e troca-iônica..........................
36
Figura 12 − Western blot de frações cromatográficas da troca-iônica........................... 36
Figura 13 − Estratégia aplicada para purificação da proteína BSP5.............................. 37
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µg Micrograma
µl Microlitro
aSFP Proteína ácida do fluido seminal bovino
BSP Binder of SPerm Proteins
CaCl2 Cloreto de Cálcio
g Grama
HBP Heparin Binding Proteins
HBP Proteína ligadora de heparina
HDL Lipoproteína de alta densidade
M Molar
mA Miliamperagem
mAu Miliunidade de absorbância
mBar Milibar
mL Mililitro
mm Milimetro
mM Milimolar
MWCO Molecular Weight Cut-Off
NaCl Cloreto de sódio
OPN Osteopontina
P1 Pico não retido da heparina
P2 Pico retido da heparina
PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida
pH Potencial hidrogeniônico
pI Ponto Isoelétrico
PLA2 Fosfolipase A2
PVDF Polyvinylidene difluoride
RSVP Ram Seminal Vesicle Protein
SDS Dodecil-sulfato de sódio
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
V Volts
W Watt
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 13
2 REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 15
2.1 Vesícula seminal e fluido das glândulas vesiculares ..................................................... 15
2.2 Proteínas do fluido da vesícula seminal relacionados à fertilidade ............................ 16
2.3 Binder of Sperm Proteins (BSP) .................................................................................... 20
2.4 Purificação de proteínas .................................................................................................. 24
3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 27
3.1 Coleta e processamento do fluido seminal bovino ........................................................ 27
3.2 Precipitação das proteínas do fluido seminal bovino com etanol frio ........................ 27
3.3 Cromatografia de afinidade à heparina ........................................................................ 28
3.4 Cromatografia de troca-iônica ....................................................................................... 28
3.5 Eletroforese unidimensional ........................................................................................... 29
3.6 Confirmação da proteína Binder of Sperm 5 (BSP5) por western blot ....................... 29
4 RESULTADOS ................................................................................................................ 31
5 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 38
6 CONCLUSÃO ................................................................................................................. 41
REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 42
13
1 INTRODUÇÃO
Os espermatozoides de mamíferos passam por uma série de eventos de maturação
antes de estarem aptos a fertilizar o oócito. Nas últimas décadas, diversos estudos têm sido
realizados com as proteínas presentes no fluido das glândulas vesiculares para melhor
compreensão do seu papel no processo de maturação espermática. Em inúmeras espécies, o
plasma seminal apresenta proteínas que se ligam perifericamente a superfície dos
espermatozoides, as quais são secretadas pelas glândulas sexuais acessórias, como as ampolas,
a próstata, as glândulas vesiculares e as bulbouretrais (MANJUNATH et al., 1984, 1987;
MANJUNATH; THERIEN, 2002; VILLEMURE; LAZURE; MANJUNATH; 2003;
SANCHEZ LUENGO et al., 2004; BERGERON et al., 2005; LUSIGNAN et al., 2007;
MOURA et al., 2007; MANJUNATH et al., 2009). Na espécie bovina, uma superfamília de
proteínas representada pelas BSPs (Binder of SPerm Proteins) constitui aproximadamente 60%
das proteínas totais do plasma seminal e desempenha função essencial na capacitação
espermática (MANJUNATH et al., 2008). As proteínas BSPs apresentam peso molecular
relativamente baixo (12-30 kDa), podendo ser ou não glicosiladas. No bovino, esse grupo de
proteínas é constituído pela BSP1, BSP3 e BSP5, conhecidas antes como BSP-A1/A2 ou PDC-
109, BSP-A3 e BSP-30kDa, respectivamente. As proteínas BSP1 apresentam peso molecular
entre 15,0-16,5 kDa, a BSP3 (13,0-14,0 kDa), enquanto a BP5 apresenta peso molecular entre
28,0-30,0 kDa (THERIÉN; MOREAU; MANJUNATH, 1999).
As BSPs possuem uma estrutura modular constituída de extensões de N-terminal não
conservados, seguidos de um domínio de Fibronectina tipo II (Fn2). Estes domínios estão
envolvidos na ligação da membrana espermática, mas o papel do N-terminal nas proteínas BSP
não tem sido investigado (JOIS; MANJUNATH, 2010). Além disso, as BSPs presentes no
fluido nas glândulas sexuais acessórias se ligam as células do epitélio do oviduto contribuindo
para a formação de reservatórios espermáticos (GWATHMEY et al., 2003; MOURA et al.,
2007). São conhecidas por se ligarem a membrana do espermatozoide no momento da
ejaculação devido a sua interação com as colina-fosfolipídios, no entanto ao contrário da BSP1
e BSP3 que apresentam maior afinidade a esse grupo de ligação às colina-fosfolipídios, as
proteínas BSP5 apresentam capacidade de ligação mais ampla aos lipídios (JOIS et al., 2015).
Essas proteínas estão presentes no plasma seminal de bovinos, caprinos, suínos, equinos e
bisões, e interagem com a heparina através dos seus domínios de Fn2, sendo estes responsáveis
pela sua interação com a gelatina e outros ligantes (MANJUNATH; SAIRAM, 1987;
14
MARTINS et al., 2013). Membros desta superfamília também foram isolados através de
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), utilizando coluna de fase reversa e
cromatografia de gel filtração (MANJUNATH, 1984), e cromatografia de afinidade
(RODRIGUEZ-VILLAMIL et al., 2016).
Embora essas proteínas apresentem um papel importante para a fertilidade, foi
constatado que as mesmas são prejudiciais aos espermatozoides no processo de criopreservação
(BERGERON et al., 2004), uma vez que o momento da ejaculação essas proteínas induzem o
efluxo de colesterol da membrana (THERIÉN; MOREAU; MANJUNATH, 1999). Apesar de
melhorias significativas nas últimas décadas em processos relacionados a criopreservação,
preservar o espermatozoide em estado congelado ainda é um desafio, uma vez que causa
alterações morfológicas e funcionais nos espermatozoides de ruminantes (MAXWELL et al.,
1996; MENEZES et al., 2016).
Portanto, o estudo dos componentes presentes no fluido das glândulas vesiculares tem
despertado o interesse em pesquisa nas últimas décadas. Esses estudos têm levado a descoberta
de marcadores proteicos que auxiliam nos processos de fertilidade, uma vez que o fluido possui
proteínas capazes de modular a fisiologia espermática. E em virtude dessas descobertas, este
trabalho objetivou avaliar métodos cromatográficos para a purificação da proteína BSP5
presente no fluido das glândulas vesiculares de touros (Bos indicus), constatando que é possível
capturar as proteínas BSPs do fluido por meio de cromatografias de afinidade à heparina e
cromatografia catiônica.
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Vesícula seminal e fluido das glândulas vesiculares
As vesículas seminais (Figura 1) se encontram lateralmente às ampolas, próximo a
bexiga. Em bovinos, ovinos e caprinos, esses órgãos são firmes e lobulados apresentando
lúmen estreito, enquanto em equinos e suínos, assemelham-se a uma bolsa
(CUNNINGHAM, 2014). O par de vesículas seminais secretam um fluido viscoso e
amarelado denominado fluido das glândulas vesiculares, rico em frutose que constitui
aproximadamente 70% do ejaculado. Embora este fluido também seja constituído de
aminoácidos, citratos, prostaglandinas e proteínas, a frutose é o principal componente, uma
vez que ela atua como fonte de energia para os espermatozoides (GARTNER, 2007). Por
sua vez, o fluido apresenta a função de nutrir e facilitar a motilidade dos espermatozoides, e
devido sua natureza alcalina, ajudar a neutralizar o ambiente ácido da uretra masculina e
trato genital feminino (STABENFELDT; EDQVIST, 1996).
Fonte: Netter (2000).
A identificação dos componentes proteicos do ejaculado já mostravam o fluido
seminal como uma complexa mistura de proteínas (LARSON; SALISBURY, 1954). Contudo,
Figura 1 - Vista anterior da vesícula seminal.
16
com o aperfeiçoamento de métodos em proteômica permitiu novas análises desse conteúdo do
plasma seminal (GEORGIEV, 1978), sendo que uma das principais colaborações, foram as
indicações de proteínas presentes no fluido das glândulas vesiculares como possíveis
marcadores de fertilidade e congelabilidade do sêmen bovino (JOBIM et al., 2004; MOURA et
al; 2006). Killian et al. (1993), em estudo avaliando a relação dessas proteínas com a fertilidade
in vivo de touros, observaram a presença de duas proteínas mais expressas em animais de
fertilidade superior, sendo elas a Osteopontina (55 kDa) e a Prostaglandina D sintase (26 kDa).
Proteínas presentes no fluido das glândulas vesiculares estão envolvidas na motilidade
e metabolismo espermático, equilíbrio osmótico, além de exercerem diversas outras funções
nos diferentes estágios do processo de fertilização (SHIVAJI; SCHEIT; BHARGAVA; 1990;
SOUSA, 2015).
2.2 Proteínas do fluido da vesícula seminal relacionados à fertilidade
O plasma seminal vem sendo objeto de várias pesquisas devido a sua importância na
fisiologia espermática. Considerando a função desta, a análise dos fluidos reprodutivos fornece
informações cruciais para a compreensão dos mecanismos que determinam a capacidade
fecundante dos gametas masculinos (MOURA et al., 2011). As glândulas sexuais acessórias
produzem as secreções do ejaculado que entram em contato com os espermatozoides
produzindo ambiente nutritivo e de proteção para que o mesmo entre em contato com o trato
reprodutivo da fêmea. Dessa forma, as proteínas presentes no fluido seminal desempenham
papel importante na estabilização dos espermatozoides, uma vez que conferem estabilidade à
membrana plasmática e participam de processos como formação de reservatórios espermáticos
e interação espermatozoide-oócito (JUYENA; STELLETTA, 2012; SANTOS, 2015). Dentre
as proteínas presentes no fluido das glândulas vesiculares relacionadas à alta congelabilidade
do sêmen e indicadas como marcadores, destacam-se a proteína ácida do fluido seminal bovino
(aSFP), clusterina, albumina, osteopontina (OPN), espermadesinas, TIMP-2 e BSPs (JOBIM;
GREGORY; MATTOS; 2009) (
Figura 2).
17
A proteína aSFP é secretada pelas vesículas seminais, ampolas e epidídimo. Além
disso, é conhecida por ser membro da família das espermadesinas (12 - 26 kDa) (ROMERO et
al., 1997). A aSFP liga-se a superfície do espermatozoide ejaculado (HAASE et al., 2005).
Dessa forma, acredita-se que ela atue como fator decapacitante do espermatozoide e não como
molécula de ligação da zona pelúcida (Dostalova et al., 1994). Ressalta-se uma alta atividade
antioxidante associada a aSFP devido a presença de pontes dissulfeto, que auxiliam na
manutenção das membranas plasmáticas íntegras e funcionais (EINSPANIER et al., 1993;
MOURA et al., 2007). Estudos realizados com a adição de aSPF purificada ao sêmen bovino
apresentaram influência significativas nas características seminais, no qual foi observada
redução na motilidade dos espermatozoides quando adicionada concentração de 6,0 g/L, além
de redução da atividade mitocondrial com a adição de 4,0 g/L (SCHONECK; BRAUN;
EINSPANIER; 1996).
Figura 2 - Aspectos da fisiologia espermática e fertilização que são potencialmente
influenciados por proteínas identificadas no fluido das glândulas sexuais acessórias de touros
Holteins.
Fonte: Adaptado de Moura (2007).
Por sua vez, a clusterina possui atividade de chaperona, interagindo com proteínas
danificadas e corrigindo-as ou levando-as a sua degradação, protegendo assim as células do
efeito citotóxico oriundo da precipitação proteica (IBRAHIM et al., 1999; BAILEY et al.,
2002). Acredita-se que o acúmulo de clusterina nos espermatozoides seja um indicador de
18
problemas no processo da espermatogênese (MOURA et al., 2007) pois ela pode ser expressa
na próstata, glândulas vesiculares, epidídimos e testículos (SYLVESTER et al., 1991), e está
relacionada a processos fisiológicos, tais como: adesão e agregação celular, metabolismo de
lipídios, secreção endócrina, maturação espermática e proteção espermática (MERI; JARVA;
2001; SOUSA, 2015). Ela possui peso molecular de 25,35 kDa e é conhecida por possuir sítios
de ligação à heparina (PANKHURST; BENNET; EATERBROOK-SMITH; 1998; JOBIM;
GREGORY; MATTOS; 2009). Essa proteína é induzida por danos a célula e foi previamente
identificado como parte da membrana espermática de touros. Apresenta ação de proteção ao
espermatozoide contra reações imunes e ligação a células defeituosas no epidídimo (BAILEY;
GRISWOLD, 1999; IBRAHIM et al., 2001; van TILBURG et al., 2013). Chaperonas como as
BSPs e a clusterina foram encontradas nos componentes do fluido das glândulas vesiculares
com afinidade à heparina. A clusterina apresenta-se de forma abundante na cauda do epidídimo
e fluido das glândulas sexuais acessórias de touros (MOURA et al., 2007), sendo secretada em
resposta à danos a célula (MERI; JARVA, 2001; MARTINS et al., 2013).
A albumina apresenta peso molecular de 66,0 kDa e pI 5,4, e quando adicionada ao
sêmen favorece sua motilidade (DOTT; HARRISON; FOSTER, 1979; JOBIM; GREGORY;
MATTOS, 2009). Ela está envolvida no efluxo de colesterol e fosfolipídios que ocorre durante
a capacitação, modulando assim a constituição lipídica da membrana plasmática (ALVAREZ;
STOREY, 1985; JOBIM et al., 2004). Proteínas presentes no plasma seminal quando
adsorvidas à superfície da membrana espermática são capazes de modular a capacitação
espermática (MANJUNATH et al., 1994). Dentre essas proteínas, a albumina promove o efluxo
de colesterol e demais fosfolipídios de membrana que ocorrem na capacitação (DAVIS;
BYRNE; HUNGUND; 1979; JOBIM; GREGORY; MATTOS; 2009). Em estudos realizados
por Oberst et al., (2004), demonstram que as variações nas concentrações de albumina no
plasma seminal foram associados com alterações na espermiogênese e hipoplasia testicular
(SZUMOSKI, 1956; ROCHA; GARCIA; FERREIRA NETO, 1974).
A osteopontina (OPN) é uma glicoproteína fosforilada que se liga ao cálcio e interage
com o receptor de vitronectina e integrina (GONÇALVES; WOLINETZ; KILLIAN; 2007).
Essa glicoproteína de pI 4,5, foi inicialmente identificada na matriz óssea bovina, estando
associada à grande quantidade de ácido aspártico e glutâmico na matriz óssea (FRANZEN;
HEINEGARD, 1985). A sua presença em diversos tecidos, relacionada a adesão e
reconhecimento celular estendeu o reconhecimento desta proteína (MOURA, 2005). A
19
presença da OPN no plasma seminal de touros se refere principalmente a secreções da ampola
e vesícula seminal e possivelmente pelo epidídimo e próstata (RODRÍGUEZ; DAY; KILLIAN;
2000). Ela é classificada como uma citocina, ou seja, proteína solúvel capaz de modular as
funções celulares através de efeitos mediados por receptores (PATARCA; SAAVEDRA;
CANTOR, 1993; JOBIM; GREGORY; MATTOS, 2009). Esta proteína também é secretada no
oviduto da vaca, confirmando a sua importância no local da fertilização, independente se é
oriunda do plasma seminal ou secreção tubária (GABLER, CHAPMAN; KILLIAN, 2003;
BUSTAMANTE FILHO, 2010). A OPN oriunda do fluido das glândulas sexuais acessórias se
liga a membrana dos espermatozoides por meio das integrinas, e este complexo osteopontina-
integrina interage com os receptores da membrana oocitária, atuando no momento da
fertilização (D’CRUZ, 1996). Os receptores para integrina desempenham papel na ligação
espermatozoide-oócito, na pré-implantação e implantação (VINATIER, 1995). O papel da OPN
na adesão celular acontece por meio dos receptores da família das integrinas, logo a relação
desta proteína com a congelabilidade do sêmen pode ser atribuída à modulação da função
celular da membrana espermática, levando a proteção da mesma no processo de criopreservação
(JOBIM, 2001; JOBIM et al., 2002).
As espermadesinas são polipeptídeos multifuncionais com a capacidade de ligação a
diversas moléculas como fosfolipídios e inibidores de proteases, o que indica envolvimento nas
fases do armazenamento espermático e fertilização (CALVETE; SANZ, 2007;
BUSTAMANTE FILHO, 2010). Essas proteínas apresentam baixo peso molecular (12 – 16
kDa), possuindo a capacidade de interagir com espermatozoides ejaculados (SANZ et al., 1992;
SOUSA, 2015). Apresentam em sua composição aproximadamente 109 a 113 aminoácidos,
constituídos por um único domínio que serve como suporte estrutural (ROMERO et al., 1997).
Em estudos realizados por Killian et al., foi detectado um peptídeo de baixo peso molecular
associado à antifertilidade, posteriormente identificado como espermadesina Z13. Esta
apresenta maior intensidade no fluido das glândulas sexuais acessórias de reprodutores de baixa
fertilidade (TEDESCHI et al., 2000; SOUSA, 2015).
A TIMP-2 (Metalloproteinase inhibitor 2 precursor) se liga ao espermatozoide de
touros logo após a ejaculação, o que sugere que a mesma participe do processo de interação
entre gametas (CORREA et al., 2000; RÊGO, 2014). Essa proteína atua de modo a integrar um
sistema proteolítico envolvido na reação acrossômica e interação entre gametas (MCCAULEY
et al., 2001). Ela apresentou sua expressão de RNAm detectado em todos os tecidos das
20
glândulas sexuais acessórias de touros, e posteriormente foi identificada no fluido das glândulas
vesiculares (MCCAULEY et al., 2001; MOURA et al., 2007; RÊGO, 2014).
2.3 Binder of SPerm Proteins (BSP)
As proteínas BSPs compreendem a maior parte do plasma seminal bovino (KELLY et
al., 2006; MOURA et al., 2007). As proteínas dessa família possuem a capacidade de interagir
com fosfolipídios, contendo colinas presentes na membrana dos espermatozoides no momento
da ejaculação. A interação lipídio-proteína atua na remoção de colesterol e fosfolipídios de
membrana, diminuindo dessa forma a relação colesterol:fosfolipídio, que é essencial a
capacitação espermática (DESNOYERS; MANJUNATH, 1992). Vale ressaltar que elas são
capazes de se ligar ao LDL de forma rápida e saturável, e essa interação tem efeitos
consideráveis na preservação da função espermática (BERGERON et al., 2004). Além disso,
essa família de proteínas está correlacionada com índices de fertilidade em touros, além de
constituírem o principal grupo de proteínas do plasma seminal de ruminantes, que se
apresentam como potenciais indicadores de fertilidade na reprodução de machos (MOURA et
al., 2011).
Glicosaminoglicanos são secretados na fase folicular pelo trato reprodutor feminino,
se ligando ao espermatozoide bovino através das HBPs (heparin-binding proteins), tornando-se
aptos a induzir o processo de capacitação espermática (LENZ et al., 1983; MILLER; WINER;
AX, 1990). As HBPs são produzidas pelas glândulas sexuais acessórias e secretadas no plasma
seminal, possuindo a capacidade de se ligar à membrana plasmática do espermatozoide no
momento em que entram em contato com o plasma seminal. Dessa forma, os espermatozoides
adquirem receptores específicos pelos quais tornam-se responsivos ao efeito da capacitação
pela heparina (LENZ et al., 1983; LENZ et al; 1988; SOUSA, 2015). A HDL, por sua vez,
associada as BSPs estimulam o efluxo de colesterol do espermatozoide epididimário e tem
papel no início da modificação da membrana, durante o processo de capacitação espermática
(ZARINTASH; CROSS, 1996). Este efluxo de lipídios por proteínas BSPs depende do tempo
de concentração, e a contínua exposição do espermatozoide ao plasma seminal que contém
essas proteínas é prejudicial a membrana espermática, tornando-a mais sensível no momento
21
de estocagem durante o processo de criopreservação (THÉRIEN et al., 1997; MANJUNANTH
et al., 2007; JOBIM; GREGORY; MATTOS, 2009).
Membros da família BSP compõe grande parte do fluido das glândulas sexuais
acessórias e plasma seminal dos bovinos (20-40 mg/ml ou 65% de proteínas totais) (KELLY et
al., 2006; MANJUNATH; THERIÉN, 2002). As BSPs bovinas são proteínas bem
caracterizadas em termos de estrutura e função biológica, e já bem descritas com relação as
interações com grande variedade de ligantes, tais como heparina, glicosaminoglicanos e
apoliproteína A1, além de diluidores de sêmen que atuam na sua preservação (MANJUNATH;
JOIS, 2010).
A BSP1 difere da BSP3, uma vez que a primeira é uma glicoproteína e a BSP3 não
contém nenhum carboidrato ligado covalentemente (MANJUNATH; SAIRAM, 1987),
diferendo apenas no grau de glicosilação (THÉRIEN; SOUBEYRAND; MANJUNATH, 1997).
A estrutura primária dessas proteínas consiste de dois domínios de fibronectina tipo II
arranjados em conjuntos, e cada domínio consiste de 38 e 41 aminoácidos com duas pontes
dissulfeto, respectivamente (MANJUNATH; THERIÉN, 2002). Domínios de fibronectina tipo
II, também conhecidos como Fn2, é uma assinatura das proteínas BSP e recentemente uma
análise de bioinformática com todas as proteínas contendo esse domínio de Fn2 identificou
muitas proteínas homólogas da BSP (MANJUNATH et al., 2008).
A BSP1 é conhecida por ser a proteína de maior ligação à heparina do plasma seminal
bovino, ligando-se especificamente as colina-fosfolipídios do espermatozoide durante a
ejaculação, o que facilita o processo de capacitação através do efluxo de colesterol e
fosfolipídios (THÉRIEN; MOREAU; MANJUNATH, 1999). Manjunath et al., (2002)
observaram redução significativa dessas proteínas após a criopreservação do sêmen, o que
indica modificação na membrana plasmática durante o congelamento.
A BSP3 também atua no processo de capacitação, uma vez que provoca o efluxo de
colesterol da membrana plasmática do espermatozoide. Contudo, supõe-se que altos níveis
dessa proteína associadas ao espermatozoide podem desestabilizar a membrana plasmática dos
gametas, diminuindo sua resistência ao choque térmico (MANJUNATH; SAIRAM, 1987;
MANJUNATH, 2007). Esta proteína apresenta menor peso molecular (13 - 14 kDa) quando
comparado a BSP1, uma vez que ela não apresenta glicosilação (MANJUNATH; SAIRAM,
1987).
22
A BSP5 é a mais glicosilada dessa família e apresentam um N-terminal mais longo, o
que pode explicar o seu maior peso molecular (28 - 30 kDa) em relação as outras proteínas da
família BSP (CALVETE et al., 1996; MARTINS, 2010). Assim como as demais BSPs (Figura
3), ela desempenha um papel fundamental no processo de capacitação espermática devido ao
efluxo de colesterol e fosfolipídios (JOIS; MANJUNATH, 2010). Além disso, as BSPs ligam-
se aos espermatozoides durante o trânsito no trato reprodutivo feminino para mediar a interação
entre os espermatozoides e o epitélio do oviduto, além de atuarem como chaperonas sob
condições de estresse (SANKHALA; SWAMY, 2010; RÊGO, 2014). A presença de proteínas
e açúcares componentes da membrana plasmática do espermatozoide e tuba uterina funcionam
como fatores determinantes na interação espermatozoide-células da tuba uterina (FAZELI et
al., 1999). Ressalta-se que após a cobertura ocorre a formação de reservatórios da tuba, que
acontece na região do istmo em diversas espécies de mamíferos e garante a disponibilidade de
espermatozoides viáveis e aptos a fertilização (GUALTIERI et al., 2010). Os espermatozoides
permanecem ligados no reservatório da tuba uterina até o momento da ovulação, no qual eles
se desprendem de forma gradativa e seguem para a ampola (GUALTIERI et al., 2010).
Consiste em um N-Terminal longo, seguido de dois similares domínios de Fn2 denominados A
e B. Ao contrário das BSP1 e BSP3 que se ligam especificamente à fosfatidilcolinas, a BSP5
tem apresentado um padrão de ligar-se também a lipídios. Até agora, a maioria dos
conhecimentos obtidos sobre as proteínas tem sido coletados a partir BSP1 devido a sua grande
concentração no plasma seminal. Todavia, a BSP5 é conhecida por ser a mais glicosilada, com
um N-Terminal mais longo e ser o membro mais ativo dessa família (JOIS; MANJUNATH,
2010). A estrutura da BSP5 sugere que essa glicoproteína possa ser um dos fatores contribuintes
para o fenótipo específico do espermatozoide bovino, modulando os efeitos da heparina na
capacitação espermática (CALVETE et al., 1996). Um comparativo entre a sequência de
aminoácidos da BSP5, BSP1, BSP3 mostram que além do domínio de Fn2, essas proteínas são
modeladas por único e exclusivo N-Terminal.
As proteínas BSPs são capazes de modular in vitro a atividade da proteína C e tirosina
quinase (YU et al., 2003). A sua interação com oligossacarídeos presentes no epitélio do
oviduto é responsável pela manutenção do reservatório espermático, uma vez que protege os
espermatozoides contra processos oxidativos (GWATHMEY et al., 2003; MOURA et al.,
2007). A BSP5 expressa no fluido das glândulas sexuais acessórias apresenta uma associação
com o índice de fertilidade de touros, e esta associação apresenta um “link” das BSPs em
23
modelar o efluxo de colesterol da membrana espermática e seu potencial de interação com a
fosfolipase A2 (MOURA et al., 2007). Esta apresenta uma variedade de características
funcionais aos quais estão relacionadas sobretudo com a reação acrossômica e a fusão da
membrana espermatozoide-oócito (RIFFO; PARRAGÁ, 1997; YUAN et al., 2003; MOURA
et al., 2007). A fosfolipase A2 (PLA2) desempenha funções durante a interação
espermatozoide-oócito, uma vez que estas podem ser desenvolvidas via zona pelúcida ou por
sinalizações intracelulares via mensageiros secundários (YUAN et al., 2003; RÊGO, 2014).
Figura 3 - Estrutura das proteínas BSPs
Fonte: Manjunath e Thérien (2002).
Fatores de capacitação como glicosaminoglicanos, bicarbonato, BSA e heparina possuem
capacidade similar a das proteínas BSP promovendo o processo de capacitação espermática
(LEE; AX, 1984; RODRÌGUEZ-VILLAMIL et al., 2016). Em estudos realizados por
Rodrìguez-Villamil et al., no qual os mesmos avaliaram taxa de reação acrossômica de
24
espermatozoides incubados com diferentes concentrações de BSP1 (0, 10, 20 e 40 µg/ml),
observaram que as taxas aumentaram até a concentração de 20 µg/ml e que após incubação com
heparina essas taxas subiram em 74,5%.
2.4 Purificação de proteínas
O processo de purificação de proteínas apresenta como objetivos principais a obtenção
da amostra pura para melhor compreensão de suas características estruturais e bioquímicas,
além de um produto com maior atividade específica para aplicação em diversos processos
(KOBLITZ et al., 2004).
Para o estudo de proteínas determinando suas características físico-químicas são
necessárias preparações homogêneas e determinado teor de pureza. A metodologia de
purificação de proteínas utiliza como ponto de partida as características de cada proteína para
separá-las. Essas características envolvem o peso molecular, carga de superfície,
hidrofobicidade e afinidade por alguns ligantes. Essas metodologias utilizadas, tais como
centrifugação, diálise e cromatografias são realizadas em sequência de modo a obter a amostra
purificada (MORAES et al., 2013).
A cromatografia consiste em método físico-químico de separação de componentes de
uma amostra, através da distribuição desses componentes em duas fases que estão em íntimo
contato (COLLINS et al., 1993). Embora existam diversas técnicas e sistemas, todos os
métodos envolvem uma fase móvel e outra fase estacionária, no qual os componentes a serem
separados são deslocados ao longo da fase estacionária com auxílio da fase móvel, e a separação
consiste na velocidade na migração da amostra (PESSOA, 1993). Ressalta-se que a fase
estacionária distingue-se em sólida, líquida ou quimicamente ligada.
São vários os critérios utilizados para definição das diversas modalidades de
cromatografias, sendo os mais comuns relacionados à técnica empregada, ao mecanismo de
separação envolvido e aos diferentes tipos de fases utilizadas. Ela se subdivide em
cromatografia planar ou cromatografia em coluna, sendo que estas apresentam uma fase
estacionária na forma de partículas e a fase móvel na forma de um sólido ou líquido que pode
recobrir a superfície do sólido ou estar quimicamente ligado a ele. De acordo com a fase móvel,
a cromatografia se subdivide em gasosa, líquida ou supercrítica. A cromatografia líquida em
25
coluna, por sua vez, é dividida em cromatografia líquida clássica no qual é realizada em colunas
de vidro, com o fluxo da fase móvel exercido pela força da gravidade; e a cromatografia líquida
de alta eficiência, no qual usa colunas metálicas e pressões de fase móvel elevadas, obtidas com
o auxílio de bomba de alta pressão (COLLINS et al., 1993). Dentre os métodos de
cromatografia em coluna, diferem quanto à matriz utilizada, sendo classificados de acordo com
suas propriedades físico-químicas e ao método de separação da amostra. As cromatografias são
realizadas de acordo com o volume molecular (cromatografia de exclusão molecular),
polaridade (cromatografia de troca-iônica), hidrofobicidade (cromatografia de interação
hidrofóbica e de fase-reversa) além de especificidade de ligação (cromatografia de afinidade)
(MORAES, 2013).
A cromatografia líquida clássica ou cromatografia em coluna é uma técnica muito
utilizada para o isolamento de diversas substâncias químicas. Dentre os materiais mais
utilizados para a realização de cromatografia em coluna destacam-se a sílica e a alumina.
Durante o seu trajeto pela coluna cromatográfica, a molécula apresenta mudança entre a fase
estacionária e a fase móvel, deslocando-se ao longo da coluna apenas quando está na fase
móvel. Dessa forma, o tempo que a molécula permanece em cada fase após a transferência
depende da afinidade a cada uma delas. Logo, essas podem deslocar-se rapidamente devido a
um tempo relativamente curto na fase móvel enquanto permanecem por mais tempo na fase
estacionária. Portanto, uma separação eficiente dessas amostras vai depender basicamente do
equilíbrio e diferença de afinidade entre as fases estacionária, móvel e o volume de retenção do
soluto (PESSOA, 1993). Para a escolha do eluente a ser utilizado na corrida cromatográfica,
deve ser levado em consideração a constituição da amostra, uma vez que características como
a polaridade seja crucial para definição de eluentes polares e apolares (DEGANI et al., 1998).
Logo, o volume a ser recolhido depende do grau de dificuldade da separação da amostra, além
da quantidade de material injetado no sistema.
A cromatografia de afinidade (Figura 4) consiste na interação reversível entre a
proteína ou um grupo de proteínas, e um ligante acoplado à matriz de resina, no qual o momento
da eluição representa o momento no qual as proteínas se desacoplam da coluna seja por uma
mudança no pH, polaridade ou salinidade. Dessa forma, a eluição dos componentes retidos à
matriz que ocorreram devido a mudanças nas propriedades da fase móvel, que por sua vez
modificam as propriedades do grupo ligado (COLLINS et al., 1993). A liberação das
biomoléculas do suporte de afinidade pode ser realizada de modo específico ou inespecífico.
26
Para o modo específico utiliza-se um competidor, o que leva a uma quebra de interações
existentes apenas a nível de sítio de ligação. As eluições inespecíficas ocorrem com a quebra
de interações hidrofóbicas, pontes de hidrogênio e pontes salinas presentes no contato
específico entre o sítio específico de ligação e a matriz (LOTAN; NICOLSON, 1979; SANTOS
FILHO, 2001).
Figura 4 - Cromatografia de afinidade
(A) Matriz com ligantes presos à fase estacionária. (B) Aplicação da amostra com diferentes sítios de ligação. (C)
Apenas o grupo de proteínas com capacidade de reconhecer o ligante da matriz interagiu com a fase estacionária.
(D) Proteínas com alta afinidade à resina. (E) Eluição da amostra após alteração nas condições físico-químicos.
Fonte: Moraes (2013).
Essa técnica cromatográfica é eficaz no isolamento de BSPs, devido a sua propriedade
de ligação à heparina. Outra técnica utilizada é a cromatografia líquida de alta performance
(FPLC), onde as proteínas são separadas de forma mais específica, considerando o peso
molecular e a afinidade a coluna (SALVADOR, 2005). A associação das técnicas de
cromatografia e eletroforese permitem a separação de proteínas específicas, tais como as
proteínas que participam de processos de capacitação (FOLHADELLA et al., 2013).
27
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta e processamento do fluido seminal bovino
O fluido seminal foi obtido de glândulas vesiculares colhidas de dez touros Bos indicus
em um abatedouro comercial da região metropolitana de Fortaleza. As glândulas foram
transportadas em recipiente refrigerado para o Laboratório de Fisiologia Animal do
Departamento de Zootecnia da Universidade Federal do Ceará. Após dissecadas, uma incisão
longitudinal de 2 cm foi feita em cada glândula com o auxílio de um bisturi com lâmina número
24. Em seguida, as glândulas foram gentilmente massageadas na incisão para extração do
fluido, que foi colhido em tubos Falcon de 15 mL. Imediatamente após extração, coquetel de
inibidor de protease (Sigma Aldrich, USA) foi adicionado na proporção 1:1000 ao fluido das
glândulas vesiculares e, em seguida centrifugado (700 x g, 4ºC, 15 min), para separação dos
artefatos celulares do sobrenadante. O sobrenadante foi pipetado em tubos Falcon limpos de 15
mL e centrifugados novamente (5000 x g, 4ºC, 60 min). Então, foi realizado um pool de todas
as amostras para uniformizar o conteúdo e foram feitas alíquotas de 1,0 ml, armazenando-as a
-20ºC. Uma alíquota foi utilizada para determinar a concentração de proteína seguindo
metodologia descrita por Bradford (1976).
3.2 Precipitação das proteínas do fluido seminal bovino com etanol frio
Para a precipitação, foram adicionados 36 mL de etanol frio (-20ºC) em 4 mL de fluido
seminal em um tubo Falcon de 50 mL, e estes permaneceram em agitação por duas horas em
um isopor para que as proteínas pudessem precipitar, as quais foram recuperadas por meio de
centrifugação (10000 x g, 4ºC, 15 min). Logo, foram realizadas três lavagens com etanol frio
seguidas de centrifugações, conforme descrito acima, e as amostras permaneceram secando
“overnight” (18h) a 4ºC. Quando as amostras estavam completamente secas, elas foram
solubilizadas em 50mM de bicarbonato de amônio e então liofilizadas. Aproximadamente 300
mg de pó seco foram recuperados e ressuspendidos em 55 mL de tampão de ligação
(BERGERON, 2005).
28
3.3 Cromatografia de afinidade à heparina
Proteínas do fluido seminal (3mg) foram injetadas em uma coluna Hitrap Heparin HP
anexada a um sistema Äkta Prime System Plus (GE Healthcare, USA). A coluna foi
previamente equilibrada com um tampão de ligação (Solução A: Tris 40mM, CaCl2 20mM, pH
7,4). As proteínas misturadas com a solução A foram injetadas no sistema sob fluxo de 1ml/min.
As proteínas ligantes a heparina (HBP) foram eluídas com solução B (Sol. B: Sol.A + 1 M
NaCl, pH 7,4). Estas foram então dessalinizadas e centrifugadas utilizando os filtros Amicon
MWCO 10 kDa (Sigma Aldrich, USA) e por meio de diálise, no qual foram realizadas oito
trocas de água em um intervalo de uma hora cada. Para diálise, membranas de 10 kDa (Sigma
Aldrich, USA) foram utilizadas para cada pico cromatográfico e então liofilizados. Para
ressuspender os picos, foi utilizado tampão de ligação. Para estimar o percentual de proteínas
que se ligam à heparina foi realizado uma integração dos picos através do Software PrimeView
Evaluation (GE Healthcare, USA) (RODRÍGUEZ-VILLAMIL et al., 2016). Proteínas do
plasma seminal (3 mg) foram submetidas a cromatografia de afinidade à heparina com o intuito
de estabelecer um comparativo ao experimento conduzido com amostras de fluido seminal.
Essas foram submetidas à SDS-PAGE e posterior análise por espectrometria de massas para
confirmação das bandas.
3.4 Cromatografia de troca-iônica
A fração ligante à heparina foi separada por cromatografia de troca-iônica utilizando
uma coluna de 5 mL SP Sepharose empacotada em uma coluna vazia de vidro (GE Healthcare,
USA). A coluna foi equilibrada com tampão de ligação (Sol. A: 20 mM C6H8O7, pH 3,4)
utilizando o sistema Äkta Prime Plus System. As amostras foram injetadas na coluna em um
fluxo de 2 ml/min. As frações da heparina retidas na troca-iônica foram eluídas com solução B
(Sol. B: C6H8O7 20 mM, NaCl 1M, pH 3,4). Estas frações foram dessalinizadas e concentradas
através de diálise, seguidas de liofilização por 48h à -50ºC e a um mínimo de pressão de 0.035
mBar. As frações foram armazenadas a -20ºC até posterior análise. Para estimar o percentual
29
de proteínas da fração retida na heparina que se ligaram à coluna de troca-iônica, foi realizada
uma integração dos picos e estes foram analisados através de Software PrimeView Evaluation
(GE Healthcare, USA).
3.5 Eletroforese unidimensional
Amostras liofilizadas de HBP e troca-iônica obtidas através de cromatografia de
afinidade à heparina e troca-iônica, respectivamente, foram ressuspendidas em 200 µl de
tampão de amostra e as proteínas quantificadas por meio do método protein A280
(Nanodrop,Thermo Scientific) . Para a eletroforese, foram utilizados 20 µg de proteínas do
fluido das glândulas vesiculares (controle positivo), HBPs, proteínas não-retidas à heparina e
frações cromatográficas da troca-iônica adicionado de tampão de corrida (0,125 M Tris–HCl,
pH 6,8, 4% SDS, 20% (v/v) glicerol, 0,2 M DTT, 0,02% azul de bromofenol). As amostras
foram aquecidas por 90 segundos, e pipetadas nos poços do gel de concentração (4% de
acrilamida), colocado sobre um gel de corrida de 12,5% de acrilamida. Em um poço do gel de
concentração foram colocados 5 µl de marcador molecular Amersham ECL Full-Range
Rainbow Molecular Weight (GE Healthcare, USA) para estimar o peso molecular das proteínas
nas bandas. Para a corrida eletroforética foi utilizado o seguinte padrão da eletroforese (SE600
Ruby, GE Healthcare): 500V, 25mA/gel, 90W. O gel foi corado com Coomassie Brilliant Blue
(CBB-R250) “overnight” e descorado após lavagens com soluções contendo etanol (40%),
ácido acético (10%) e água destilada (50%). Os géis foram digitalizados com o auxílio do
ImageScaner (GE Healthcare, USA) a 300 dpi.
3.6 Confirmação da proteína Binder of Sperm 5 (BSP5) por western blot
Fluido seminal, proteínas ligantes à heparina e não-ligantes obtidas através de
cromatografias de afinidade à heparina foram avaliadas através de Western Blot. Em resumo,
20 µg de proteínas totais do fluido seminal, HBPs, proteínas não-retidas à heparina e frações
cromatográficas da troca-iônica foram separadas de acordo com seu peso molecular por meio
de SDS-PAGE em gel de acrilamida (12,5%). Proteínas foram transferidas do gel para uma
30
membrana de PVDF (Hybond-P, GE Lifesciences, USA) utilizando uma unidade de
transferência (TE 70, GE Lifesciences, USA). As membranas foram bloqueadas “overnight” à
4ºC submersa em mistura de 30 ml de PBS-T (PBS + 0,5% de Tween-20) e 5% de leite
desnatado, seguidas de um hora de incubação com anticorpo primário contra a BSP5 bovina
(1:6000) cedido pelo Dr. Puttaswamy Manjunath (Departamento de Medicina, Universidade de
Montreal, Canadá). A membrana de PVDF foi lavada três vezes com PBS-T por dez minutos,
seguida de 1h de incubação com anticorpo secundário (1:5.000 Dnk pAb to Rb IgG; Abcam or
Donkey anti-rabbit) e então enxaguados três vezes com PBS-T por dez minutos. A
imunorreação foi visualizada após a exposição da membrana ao substrato fosfatase alcalina
BCIP/NBT (Sigma Aldrich, USA). A reação foi parada após lavar a membrana com água Mili-
Q.
31
4 RESULTADOS
O cromatograma de afinidade à heparina das proteínas do fluido das glândulas
vesiculares demonstrou um pico sem afinidade (agrupado como P1) e dois picos com afinidade
à heparina (agrupado como P2). A amplitude máxima atingida em P1 e P2 foram de 200 mAu
e 180 mAu, eluídos aos 5 e 25 minutos, respectivamente (Figura 5). As proteínas que se ligam
à heparina representaram 51,5% (1,54 mg) das proteínas do fluido seminal de touros Bos indicus
(FIGURA 6).
Figura 5 - Cromatograma de afinidade à heparina das proteínas fluido seminal bovino.
P1= Pico não-retido; P2= Pico retido à heparina. Fonte: o Autor.
32
Figura 6 - Cromatograma integrado de afinidade à heparina das proteínas do fluido seminal
bovino. A análise do cromatograma foi realizada através do Software PrimeView.
P1 = Pico não-retido; P2 = Pico retido à heparina. Fonte: o Autor.
A eletroforese unidimensional confirmou a presença de diversas proteínas no fluido
seminal bovino. Quatorze bandas foram detectadas no fluido seminal, com peso variando entre
12 e 225 kDa, sete bandas no P1, com peso variando entre 12 kDa e 102 kDa, e sete bandas no
P2, com peso variando entre 12 kDa e 225 kDa (
Figura 7).
33
Figura 7- SDS-PAGE de fluido seminal de touros Bos indicus e frações não-ligantes e ligantes
à heparina.
FS = fluido seminal bovino; P1 = Pico não-retido; P2 = Pico retido à heparina. Fonte: o autor.
Uma estratégia utilizando cromatografia de afinidade à heparina com plasma seminal
bovino detectou BSP5 no P2, e o plasma seminal apresentou um perfil proteico semelhante ao
do fluido das glândulas vesiculares, os géis foram analisados por espectrometria de massas e a
proteína próxima a banda de 30 kDa, foi identificada como TIMP 2.
Após análise por western blot foi verificada imunorreação para BSP5 no fluido seminal
(controle positivo) e no P2, enquanto que em P1 não houve marcação. Portanto, a banda de 30
kDa se liga à heparina e é separada em dois picos quando passada na coluna Hitrap Heparin HP
(
Figura 8).
34
Figura 8 – Western blot de proteínas do fluido seminal de touros Bos indicus e frações sem
afinidade à heparina e frações retidas na heparina.
As membranas PVDF foram imunizadas com anticorpo anti-BSP5. FS = fluido seminal bovino; P1 = Pico não-
retido; P2 = Pico retido à heparina. Fonte: o autor.
Quando o P2 da cromatografia de afinidade à heparina foi submetido a cromatografia
de troca-iônica, observamos seis picos bem definidos agrupados em quatro frações, no qual os
picos 3, 4 e 5 foram agrupados em P3 devido à proximidade de suas cargas isoelétrica, com
amplitude máxima para P4 com 10 mAu, eluído em 40 minutos de corrida cromatográfica,
seguidos de P1 eluído aos 10 minutos, P2 eluído aos 25 minutos e P3 eluído aos 40 minutos de
corrida cromatográfica (Figura 9). As proteínas ligantes a troca-iônica representaram 80,97%
das proteínas ligantes à heparina, representando a maior concentração de proteínas na troca-
iônica (Figura 10). Eletroforese unidimensional com material da coluna de heparina e troca-
iônica foram realizados para confirmação da presença da BSP5 dentre as diversas bandas. SDS-
PAGE confirmou a presença da mesma no pico retido na heparina, uma banda foi detectada no
pico 1 da troca-iônica, duas bandas no pico 2, três bandas no pico 3 e quatro bandas no P4
(Figura 11).
35
Figura 9 - Cromatograma de troca-iônica das proteínas retidas à heparina.
Fonte: o Autor.
Figura 10 - Cromatograma integrado da troca-iônica das proteínas retidas à heparina. A
análise do cromatograma foi realizada através de Software PrimeView.
Fonte: o Autor.
36
Figura 11 - SDS-PAGE de fluido seminal de touros Bos indicus e frações coletadas de
cromatografias de afinidade à heparina e troca-iônica.
MM=Marcador Molecular; P2 = Pico retido à heparina; P1 = Pico não-retido; P1I = Pico 1 da Troca-Iônica; P2I
= Pico 2 da Troca-Iônica; P3T = Pico 3 da Troca-Iônica; P4T = Pico 4 da Troca-Iônica. Fonte: o Autor.
Após realização de SDS-PAGE dos picos cromatográficos e identificação da BSP5 no
pico 4 da troca iônica, a técnica de western blot foi realizada para analisar a presença das
proteínas BSP no fluido seminal de touros Bos indicus. Estas demonstraram que a banda
imunorreativa correspondente a BSP5 foi detectada na fração P4 da troca-iônica (Figura 12).
Figura 12 – Western blot de frações cromatográficas da troca-iônica.
As membranas PVDF foram imunizadas com anticorpo anti-BSP5. P1= P1 da troca- iônica; P2 = Pico 2 da
troca-iônica; P3 = Pico 3 da troca- iônica; P4 = Pico 4 da troca-iônica. Fonte: o Autor.
37
O esquema da Figura 13 ilustra a estratégia utilizada para purificação da proteína BSP5
do fluido seminal bovino, no qual em 13A observa-se o primeiro passo realizado com a coluna
de heparina Hitrap Heparin HP, no qual obteve-se o pico retido à esta que foi utilizado para o
passo seguinte. Como observado na figura 13B, o pico das HBPs que foi utilizado para ser
injetado na coluna SP Sepharose originou quatro picos na cromatografia de troca-iônica. Os
géis demonstraram a presença de diversas bandas proteicas no fluido seminal, enquanto o pico
de interesse da heparina (Figura 13C) mostrou-se mais fracionado com a presença de poucas
bandas. Uma vez realizada a cromatografia de troca-iônica com este material, o pico 4 no qual
a banda de 30 kDa mostrou-se com maior intensidade apresentou a presença de outras três
bandas na mesma coluna.
Figura 13 - Estratégia aplicada para purificação da proteína BSP5.
(A) Cromatograma de afinidade à heparina de proteínas presentes no fluido seminal. (B) Cromatograma de troca-
iônica das proteínas ligantes à heparina. (C) Géis realizados com material oriundo de fluido seminal de touros Bos
indicus, onde: FS = fluido seminal, P1= Pico não retido; P2 = Pico retido na heparina; MM = Marcador molecular;
P1H = Pico não retido; P2H = Pico retido na heparina; P1T = Pico 1 da troca-iônica; P2 = Pico 2 da troca-iônica;
P3 = Pico 3 da troca-iônica; P4 = Pico 4 da troca-iônica. Fonte: o autor.
38
5 DISCUSSÃO
Baseado nos conhecimentos funcionais das HBPs e informação oriunda da literatura,
foram discutidos os métodos utilizados para purificação da BSP5 e participação desta na
reprodução do macho. Para tanto, foi utilizada a propriedade de ligação à heparina dessas
proteínas para isolá-las por cromatografia de afinidade, no qual a coluna Hitrap Heparin HP
pôde separá-las em dois picos bem definidos. A estratégia incluiu a purificação da BSP5 a partir
do fluido seminal bovino.
Esse estudo descreve a purificação parcial da BSP5 do fluido das glândulas vesiculares
bovinas utilizando cromatografias de afinidade e troca-iônica. A cromatografia de afinidade
apresenta como principal estratégia a separação de determinado grupos de proteínas por meio
da interação reversível entre a amostra e um ligante acoplado a matriz. As proteínas presentes
no fluido seminal foram separadas devido a sua capacidade de se ligar à heparina, um
glicosaminoglicano. A seguir, as proteínas retidas por interação com a heparina foram
submetidas a cromatografia de troca-iônica para que as mesmas fossem separadas de acordo
com seu pI por uma coluna SP Sepharose. Logo, proteínas com composição de aminoácidos
diferentes poderão ter cargas distintas, isso varia de acordo com as condições a que são
submetidas. As proteínas, possuem pI característico, nos quais possuem carga líquida igual a
zero (MORAES et al., 2013).
Neste trabalho foi possível observar que o cromatograma de afinidade à heparina
(FIGURA 5) apresentou dois picos bem definidos e absorbâncias semelhantes. Para definição
de qual fração seria utilizada para a cromatografia seguinte, foi realizada uma SDS-PAGE com
as frações obtidas e verificou-se que a proteína de 30 kDa possivelmente encontrava-se no pico
retido à heparina. Dados que corroboram com trabalhos publicados por Manjunath (1993), no
qual em gel realizado com três diferentes amostras, a banda de 30 kDa esteve presente no
espermatozoide epididimário, no ejaculado e no plasma seminal. Em estudos realizado por
Martins et al (2011), foi realizada cromatografia líquida de afinidade à heparina em modo de
eluição “step wise”, no qual as frações cromatográficas foram submetidas à eletroforese
unidimensional e a bandas com pesos semelhantes às BSPs (1, 3 e 5) foram detectadas,
mostrando-se uma técnica eficiente para a purificação desse grupo de proteínas.
A integração das áreas sob os picos da cromatografia de afinidade por heparina
ilustrada na figura 6 revela que as proteínas ligantes representaram mais da metade das proteínas
39
presentes no fluido das glândulas vesiculares, no qual as proteínas de interesse representaram
51,5% do fluido seminal bovino. Resultados semelhantes foram encontrados por Rodriguez-
Villamil et al., (2016), no qual houve formação de dois picos bem definidos. Contudo, a
intensidade de absorbância do pico retido foi ligeiramente maior, retendo 55,1% de HBPs.
Conforme observado nos resultados, as bandas grifadas no fluido seminal (FS) e pico
retido na heparina (P2) apresentaram peso molecular aproximado a 30 kDa (FIGURA 7). As
bandas grifadas apresentaram intensidade de 3,10% e 4,24%, respectivamente, em análises
realizadas em Software Quantity One. O fluido seminal apresentou 14 bandas proteicas,
enquanto o P1 e P2 apresentaram 7 bandas proteicas. Baseado na similaridade de peso
molecular, acredita-se que as bandas presentes destacadas sejam BSP5 e TIMP2 encontradas
no fluido seminal bovino, com 30 kDa e 28 kDa, respectivamente. A TIMP2 foi detectada no
plasma seminal de carneiros Santa Inês (SOUZA et al., 2012), cauda do epidídimo e fluido das
glândulas sexuais acessórias de bovinos (MOURA et al., 2007; MARTINS et al., 2013). Há
uma associação positiva entre aqueles touros que apresentaram atividade da TIMP2, sugerindo
que esta module aspectos importantes na função espermática (HAO et al., 2008; MARTINS et
al., 2013).
A análise por Western Blot utilizando anticorpo contra BSP5 confirmou a presença da
referida proteína na banda de 30 kDa, no pico retido à heparina e no fluido seminal bovino
(controle positivo). Em trabalho realizado por Manjunanth et al. (1993), três amostras foram
testadas por meio de imunoblot (espermatozoide epididimário, ejaculado e plasma seminal
precipitado), no qual apenas duas apresentaram marcação para o anticorpo anti-BSP5, sendo
eles o espermatozoide ejaculado e o plasma seminal, demonstrando que a proteína ainda não
está aderida a membrana do espermatozoide epididimário.
O cromatograma da troca-iônica (FIGURA 9), demonstrou quatro picos bem
definidos, com amplitude máxima para P4, de 10 mAu, eluído aos 80 minutos de corrida
cromatográfica. A partir da integração desse pico no Software PrimeView (FIGURA 10)
obteve-se o percentual de proteínas (80,97%) presentes no material retido à heparina que foram
fracionadas na cromatografia de troca iônica.
Como avaliado na figura 11, um SDS-PAGE realizado com amostras de heparina e
troca-iônica, as bandas de 30 kDa estão presentes no fluido seminal, pico retido à heparina e
pico 4 da troca-iônica. O pico não-ligante da heparina apresentou 7 bandas proteicas, enquanto
o pico retido à heparina apresentou 8 bandas proteicas. Seguidos de 4 picos da troca iônica que
40
apresentaram 2 bandas nos picos 1 e 2, 4 bandas proteicas no pico 3, e 4 bandas proteicas no
pico 4. Acredita-se que as mesmas presentes na troca-iônica sejam BSP1, BSP3, BSP5 e
clusterina com base em géis realizados com frações cromatográficas de afinidade à heparina,
uma vez que por meio de confirmação de espectrometria de massas obtivemos resultados dessas
proteínas em bandas semelhantes às encontradas no presente estudo. No entanto se faz
necessário confirmação através de espectrometria de massas.
A técnica de western blot com frações cromatográficas de troca iônica foi utilizada
para avaliar a expressão de BSPs no fluido seminal bovino. Os resultados demonstraram que a
BSP5 foi detectada em todas as amostras, entretanto, foi mais significativo no pico 4 devido a
sua maior intensidade. Resultados que necessitam ser confirmados por demais técnicas, tais
como espectrometria de massas e N-terminal, no entanto demonstram pré-purificação dessa
proteína.
41
6 CONCLUSÃO
A estratégia de purificação adotada não foi eficiente em isolar complementarmente a
BSP5 do fluido das glândulas vesiculares, mas foi eficiente em capturar esse grupo de proteínas
em certo grau de pureza. A partir dessa previa purificação, foi observada que a sequência
cromatográfica de heparina com troca iônica, foi eficaz em capturar as proteínas do grupo BSP,
principalmente a BSP5. Contudo, faz-se necessário a ampliação desse método, seguido de
confirmações por meio de sequenciamento recombinante e western blot. E a partir dessa
purificação é possível a realização de testes funcionais que permitem entender os mecanismos
pelos quais as proteínas BSPs modulam a capacitação espermática, além de incrementar
processos biotecnológicos.
42
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