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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)
Taissa Vieira Machado Vila
Avaliação da atividade antifúngica de novos compostos em
células planctônicas e na formação, desenvolvimento e
maturação de biofilme de Candida albicans em superfícies
abióticas.
Orientadora: Profa. Dra. Sonia Rozental
Rio de Janeiro
2010
Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
TAISSA VIEIRA MACHADO VILA
Avaliação da atividade antifúngica de novos compostos em células
planctônicas e na formação, desenvolvimento e maturação de biofilme de
Candida albicans em superfícies abióticas.
Orientadora: Profa. Dra. Sonia Rozental
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Biológicas (Biofísica).
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO
Rio de Janeiro, 2010
i
FICHA CATALOGRÁFICA
Vila, Taissa Vieira Machado
Avaliação da atividade antifúngica de novos compostos na formação, desenvolvimento e maturação de biofilme de candida albicans em superfícies abióticas. Rio de Janeiro, 2010 - 119 folhas.
Dissertação (Mestre em Ciências Biológicas – Biofísica). Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho.
Orientadora: Profa. Dra. Sonia Rozental.
1. Candida albicans 2. Biofilmes 3. Antifúngicos 4. ∆24(25)-esterol metiltransferase 5. Análogos de fosfolipídios. 6. Resistencia
I. Universidade Federal do Rio de Janeiro
II. Título
ii
AGRADECIMENTOS
Este espaço é dedicado a todos os que participaram, direta ou indiretamente, da
realização deste trabalho. A todos eles deixo aqui o meu sincero agradecimento.
Agradeço à minha orientadora, Dra. Sonia Rozental pela oportunidade, confiança,
apoio e ensinamentos durante todos estes anos.
À Kelly, pela orientação durante a iniciação científica, pelo modo empenhado e
estimulante com que acompanhou todas as fases de realização deste trabalho, pela constante
disponibilidade e por todos os conselhos e sugestões.
À todos do Laboratório de Biologia Celular de Fungos, Carol, Amanda, Luana, Talita,
Raul e Anderson, pela boa convivência, colaboração e sugestões.
Àos professores, alunos e funcionários do Laboratório de Ultraestrutura Celular
Hertha Meyer pela convivência e apoio técnico durante esses anos.
Agradeço, em especial, aos meus pais e à minha avó, pelo apoio incondicional e
incentivo constante, sem os quais nada disso seria possível.
À Camilla pela amizade, carinho, incentivo e conversas, sem as quais toda minha
caminhada teria sido muito menos prazerosa. Agradeço por ser meu porto seguro, sempre.
Ao Luis, pelo carinho, apoio e paciência nos dias mais difíceis, pelos fins-de-semana
perdidos, pelo seu colo, pela companhia e por toda sua compreensão.
Às amigas da graduação, Alicia, Anne, Letícia e Mariah, pela amizade, conselhos e
trocas de experiências. E às amigas ―de sempre‖, Ana, Taty e Maíra, por toda amizade, apoio
e carinho durante tantos e tantos anos.
iii
Foi o tempo que perdeste com tua rosa que
fez tua rosa tão importante.
Antoine de Saint-Exupéry
iv
RESUMO
VILA, Taissa Vieira Machado. Avaliação da atividade antifúngica de novos compostos em
células planctônicas e na formação, desenvolvimento e maturação de biofilme de Candida
albicans em superfícies abióticas. Rio de Janeiro, 2010. Dissertação (Mestrado em Ciências
Biológicas – Biofísica) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
Infecções relacionadas à utilização de cateter são a principal causa de mortalidade entre
pacientes hospitalizados e a formação de biofilmes está associada a 90% destas infecções.
Candida albicans é a levedura mais isolada em pacientes com dispositivos médicos
associados. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antifúngica de inibidores
da enzima Δ24-esterol metil transferase (24-SMT) e de análogos de fosfolipídios em células
planctônicas (em suspensão) e de biofilme em C. albicans. Analisamos, também, o efeito
destes compostos sobre a hidrofobicidade de superficie celular (HSC) e as alterações na
morfologia e no perfil lipídico destas leveduras em suspensão. A susceptibilidade das células
planctônicas e de biofilmes a dois inibidores da 24-SMT, azasterol (AZA) e
epiminolanosterol (EIL), e a dois análogos de fosfolipídios, miltefosina (MLT) e Tcan26 foi
comparada à dos antifúngicos padrão anfotericina B (AMB), fluconazol (FLU) e itraconazol
(ITRA). As suspensões das duas cepas testadas (ATCC 10231 e 44A) mostraram-se
susceptíveis aos 7 antifúngicos, porém, apenas AMB, AZA, MLT e Tcan26 determinaram
redução significativa na formação de biofilme, em placa de 96 poços. As concentrações
inibitórias de crescimento para células de biofilme mostraram-se de 4 a 64 vezes maiores do
que as de células planctônicas. Os biofilmes maduros mostraram-se mais resistentes aos
tratamentos do que os biofilmes em formação e os biofilmes da cepa ATCC 10231 foram
mais susceptíveis aos tratamentos do que os de isolado clínico. Em cateter venoso central
(CVC), a capacidade de formação de biofilme parece relacionar-se a HSC, pois, a cepa mais
hidrofóbica, 44A, formou biofilmes mais densos. O desenvolvimento do biofilme da cepa
44A, em CVC, sofreu alterações morfológicas significativas, quando ocorreu na presença de
FLU, EIL, MLT ou Tcan 26, sendo composto, basicamente, por leveduras e pseudohifas e
poucas camadas de células. Os análogos de fosfolipidios inibiram a filamentação do biofilme
sobre cateter de ambas as cepas, enquanto o inibidores da 24-SMT apenas inibiram
filamentação da cepa ATCC. MLT e Tcan26 mostraram um perfil de atividade sobre a
formação e maturação do biofilme melhor do que os inibidores da 24-SMT. Dentre os
agentes testados, o Tcan26 apresentou o melhor perfil de atividade para ambas as cepas e,
para a cepa ATCC, a susceptibilidade das células no biofilme foi semelhante à das células em
suspensão. As leveduras em suspensão, tratadas com MLT, apresentaram alterações
ultraestruturais, principalmente, na parede e membrana celular, e na formação de
brotamentos. Ainda, o conteúdo de ergosterol, fosfolipidios e ácidos graxos mostraram-se
alterados. Portanto, nossos resultados sugerem que os inibidores da 24-SMT e os análogos de
fosfolipídios inibem a filamentação das células de C. albicans durante o desenvolvimento do
biofilme, levando, provavelmente, à redução da virulência associada às eles. Além disso,
MLT e seu análogo, Tcan26, reduziram significativamente a formação de biofilme,
apresentando-se, então, como substâncias antifúngicas com ação tanto sobre células
planctônicas como células em biofilmes.
v
ABSTRACT
VILA, Taissa Vieira Machado. Avaliação da atividade antifúngica de novos compostos em
células planctônicas e na formação, desenvolvimento e maturação de biofilme de Candida
albicans em superfícies abióticas. Rio de Janeiro, 2010. Dissertação (Mestrado em Ciências
Biológicas – Biofísica) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
Infections related to the use of catheters are the leading mortality cause among hospitalized
patients and the formation of biofilms is associated with 90% of these infections. Candida
albicans is the yeast most commonly isolated in patients with associated medical devices.
Therefore, the aim of this work was to evaluate the antifungal activity of Δ24-sterol methyl
transferase (24-SMT) inhibitors and analogues of phospholipids in planktonic cells (in
suspension) and in biofilms of C. albicans. We have also analyzed the effect of these
compounds on the cell surface hydrophobicity (CSH) and changes in morphology and lipid
profile of this yeast in suspension. Susceptibility of planktonic cells and biofilms to two
inhibitors of 24-SMT, azasterol (AZA) and epiminolanosterol (EIL) and two analogues of
phospholipids, miltefosine (MLT) and Tcan26 was compared to these of standard antifungal
drugs: amphotericin B (AMB), fluconazole (FLU) and itraconazole (ITRA). The suspensions
of two strains tested (ATCC 10231 and 44A) were susceptible to seven antifungal agents,
however, only AMB, AZA, MLT and Tcan26 determined a significant reduction in biofilm
formation in 96-well plate. Inhibitory concentrations for biofilm cells growth were shown to
be 4-64 times higher than those of planktonic cells. Mature biofilms were more resistant to
treatment than biofilms under development and biofilm formation of strain ATCC 10231 were
more susceptible to treatments than those of clinical isolate. On central venous catheter
(CVC), the ability of biofilm formation appears to be related to the HSC, because the more
hydrophobic strain, 44A, formed thicker biofilms. The biofilm development of strain 44A, in
CVC, suffered significant morphological changes when occurred in the presence of FLU,
EIL, MLT or Tcan26, being composed primarily by yeast and pseudohyphae and few layers
of cells. The analogues of phospholipids inhibited the filamentation of the biofilm, on
catheter, of both strains, while the 24-SMT inhibitors only inhibited filamentation of strain
ATCC. MLT and Tcan26 showed a better profile of activity on the formation and maturation
of biofilm than the 24-SMT inhibitors. Among the agents tested, Tcan26 showed the best
activity profile for both strains and, for the ATCC strain, the susceptibility of the biofilm cells
was similar to cells in suspension. The yeast in suspension, treated with MLT, showed
ultrastructural changes mainly in the cell wall and membrane, and in the budding process.
Still, the content of ergosterol, phospholipids and fatty acids were shown to be altered.
Therefore, our results suggest that inhibitors of 24-SMT and analogues of phospholipids
inhibit filamentation of the cells of C. albicans during biofilm development, probably leading
to the reduction in virulence associated with them. Moreover, MLT and its analog, Tcan26,
significantly reduced biofilm formation, presenting, then, as possible substances with
antifungal action on both planktonic and biofilms cells.
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Esquema ilustrativo da transição entre as diferentes morfologias em C. albicans.
Adaptado de: Romani L., 2004. .................................................................................................. 2
Figura 2: Esquema ilustrativo dos componentes da parede celular de C. albicans. Os
polímeros de β-1,3 e β-1,6 glucana estão representados em amarelo e azul, respectivamente; proteinas em verde, filamentos de quitina em laranja e mananas em vermelho. ................................................................................................................................... 4
Figura 3: Colônias brancas e opacas de C. albicans. Em (a) colônia branca com um setor
opaco, (b) colônica branca (acima) e opaca (abaixo), (c) e (d) micrografias de microscopia
eletrônica de varredura, em aumento de 1000 x, das células de colônia branca (c) e opaca (d).
Adaptado de: Johnson A., 2003 .................................................................................................. 7
Figura 4: Esquema ilustrativo da seqüência de desenvolvimento do biofilme de C. albicans,
em suas diferentes fases. A: adesão de leveduras em suspensão à superfície, B: formação de
colônias e multiplicação celular, C: secreção de matriz extracelular (MEC) e formação de
hifas, formando uma estrutura tridimensional complexa. Adaptado de: Douglas J.L., 2003... 13
Figura 5: Microscopia eletrônica de varredura de biofilmes de Candida albicans. (a) biofilme
fino mostrando extensa matriz extracelular, indicado pela seta branca. (b) biofilme altamente
filamentado, seta branca indica um canal de água. (c) biofilme maduro com presença de hifas
e leveduras, matriz extracelular não visível. Barras = 10 µm. ................................................. 15
Figura 6: Possíveis mecanismos envolvidos na resistência antifúngica do biofilme de C.
albicans. Adaptado de: Niimi et al., 2010 ................................................................................ 17
Figura 7: Principais alvos de ação na célula fúngica dos agentes empregados, atualmente, no
tratamento das candidemias. Adaptado de: Katzung B.G., 2009. ............................................ 19
Figura 8: Estrutura química dos agentes azóis. Retirado de: www.doctorfungus.com ............ 21
Figura 9: Estrutura química dos agentes poliênicos. Retirado de: www.doctorfungus.com .... 21
Figura 10: Mecanismo de ação da anfotericina B na célula fúngica. (A) bicamada lipídica com
poro, permitindo a saída de material citoplasmático. (B) esquema explicativo da interação da
molécula de anfotericina B com o ergosterol e formação do poro na mambrana celular.
Adaptado de: Ghannoum e Rice, 1999 ..................................................................................... 22
Figura 11: Estrutura química das equinocandinas. Adaptado de: www. doctorfungus.com. ... 24
Figura 12: Via biosintética do ergosterol e colesterol, mostrando as principais etapas e as
enzimas envolvidas. Em vermelho estão demonstradas as etapas inibidas pelos azóis e
azasteróis. Adaptado de: De Souza e Rodrigues, 2009. ........................................................... 27
vii
Figura 13: Esquema representativo da microdiluição em caldo utilizando diluições seriadas
dos antifúngicos para determinação do IC50 e IC90 de cada um dos compostos. Após a diluição
dos compostos (fileiras 1-10), todos os poços da microplaca, exceto a coluna 12, receberam a
mesma alíquota de suspensão fúngica padronizada. ................................................................ 36
Figura 14: Esquema representativo dos testes in vitro utilizados para a determinação da
atividade de drogas na formação e no biofilme maduro; e da quantificação por reação com
XTT. Cada fileira (A-G) da placa de 96 poços recebeu 100 µL de um composto antifúngico
nas concentrações determinadas entre colchetes (64, 16, 4 vezes maior ou igual a IC de cada
droga). Todos os poços receberam 100 µL de suspensão antifúngica padronizada, exceto os
poços 7-9 da fileira H, que receberam apenas meio de cultura. Os poços 1-6 da fileira H
receberam apenas suspensão fúngica e são isentos de drogas (controle positivo). Após a
incubação com XTT:Menadiona, a intensidade de cor laranja formada pela presença do
composto formazan é proporcional à concentração de células viáveis em cada poço. ............ 41
Figura 15: Comparação entre os índices de hidrofobicidade obtidos para as células controle
das cepas ATCC 10231 e 44A de C. albicans. ......................................................................... 49
Figura 16: Micrografias de microscopia eletrônica de transmissão de C. albicans 44A controle
(A-B) e tratada com 3 μg/mL de miltefosina (C-F). Células controle apresentaram membrana
celular contínua (mp, em B), parede celular homogênea e compacta (pc, em B) e fibrilas
organizadas e compactadas (f, em B). As células tratadas mostram desorganização e
afrouxamento das fibrilas (setas pretas em C e E), invaginações e alterações na membrana
celular (setas amarelas em D-F), aumento da espessura da parede celular (setas vermelhas em
E-F), vacúolos (v, em C) e inchaço mitocondrial (m, em C e F). As leveduras tratadas
apresentaram alteração de forma celular (C-F) e brotamentos alterados (* em C). Barras
correspondem a 0,5 μm em A,B,C e E, e a 1 μm em D e F. ................................................... 51
Figura 17: Cromatografia em camada delgada da fração polar de lipídeos extraídos de C.
albicans (44A) tratada com 0,5 e 1,0 µg/mL de miltefosina, em meio RPMI 1640, por 48 h, a
35 °C. A concentração inibitória que inibiu 100% do crescimento fúngico foi de 4,0 µg/mL.
Concentrações das drogas estão µg/mL. .................................................................................. 55
Figura 18: Redução de formação de biofilme por C. albicans ATCC 10231 na presença de
drogas padrão em concentrações iguais ao IC50 e 4, 16 e 64 vezes maiores, sendo a menor
concentração em cada gráfico igual ao valor de IC50 da droga. ................................................ 59
Figura 19: Redução de formação de biofilme por C. albicans ATCC 10231 na presença de
inibidores da 24-SMT e análogos de fosfolipidios em concentrações iguais ao IC50 (AZA e
EIL) ou IC90 (miltefosina e Tcan 26), 4 e 16 vezes maiores, sendo a menor concentração em
cada gráfico igual ao valor de IC50 ou IC90 da droga. .............................................................. 60
Figura 20: Redução de formação de biofilme por C. albicans 44A na presença de drogas
padrão em concentrações iguais ao IC50 e 4, 16 e 64 vezes maiores, sendo a menor
concentração em cada gráfico igual ao valor de IC50 da droga. ................................................ 62
viii
Figura 21: Redução de formação de biofilme por C. albicans 44A na presença de inibidores
da 24-SMT (AZA e EIL) em concentrações iguais ao IC50, 4 e 16 vezes maiores, e na
presença de análogos de fosfolipidios (miltefosina e Tcan26) em concentrações iguais ao IC90,
4 e 8 ou 16 vezes maiores. A menor concentração em cada gráfico é referente ao valor de IC50
ou IC90 da droga. ....................................................................................................................... 63
Figura 22: Redução do biofilme maduro de C. albicans ATCC 10231 após a adição de drogas
padrão em concentrações iguais ao IC50 e 4, 16 e 64 vezes maiores, sendo a menor
concentração em cada gráfico igual ao valor de IC50 da droga. ................................................ 65
Figura 23: Redução do biofilme maduro de C. albicans ATCC 10231 após a adição de
inibidores da 24- SMT e análogos de fosfolipidios em concentrações iguais ao IC50 (AZA e
EIL) ou IC90 (miltefosina e Tcan 26), 4 e 16 vezes maiores, sendo a menor concentração em
cada gráfico igual ao valor de IC50 ou IC90 da droga. .............................................................. 66
Figura 24: Redução do biofilme maduro de C. albicans 44A após a adição de drogas padrão,
em concentrações iguais ao IC50 e 4, 16 e 64 vezes maiores, sendo a menor concentração em
cada gráfico igual ao valor de IC50 da droga............................................................................. 67
Figura 25: Redução do biofilme maduro de C. albicans 44A após a adição de inibidores da
24-SMT (AZA e EIL) em concentrações iguais ao IC50, 4 e 16 vezes maiores, e após a adição
de análogos de fosfolipidios (miltefosina e Tcan26) em concentrações iguais ao IC90, 4 e 8 ou
16 vezes maiores. A menor concentração em cada gráfico é referente ao valor de IC50 ou IC90
da droga. ................................................................................................................................... 68
Figura 26: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans ATCC 10231 (A e B) e formado
na presença de 16 μg/mL de FLU(C-D), 256 μg/mL de AZA (E e F) e 16 μg/mL de EIL (G e
H) por 48h, a 35 ºC. Barras correspondem a 500 μm em A,C,E,G e 10 μm em B,D,F,H. Insets
com barras de 10 μm (D) e 5 μm (H). É Possivel observar alterações na quantidade de células
aderidas ao cateter após o tratamento com FLU, AZA e EIL, em relação ao controle nao
tratado. ...................................................................................................................................... 71
Figura 27: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans ATCC 10231 (A e B) e formado
na presença de 32 μg/mL de miltefosina (C-D) e 64 μg/mL de Tcan26 (E e F), por 48h, a 35
°C. Barras correspondem a 500 μm em A,C,E e 10 μm em B,D,F. Insets em D e F com barras
de 5 μm. É possível observar alterações tanto na densidade de células aderidas à superfície do
cateter quanto na divisão celular nos biofilmes formados na presença de MLT e Tcan26, em
relação ao biofilme controle. .................................................................................................... 73
Figura 28: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans 44A (A e B) e formado na
presença de 16 μg/mL de FLU(C-D), 4 μg/mL de AZA (E e F) e 32 μg/mL de EIL (G e H)
por 48h, a 35 °C. Barras correspondem a 500 μm em A,C,E,G e 10 μm em B,D,F,H.
Observamos tanto a redução da densidade de células aderidas à superfície do cateter quanto a
inibição da filamentação, nos biofilmes formados na presença de FLU e EIL, em relação ao
controle. Nenhuma alteração foi observada em biofilmes formados na presença de AZA...... 76
ix
Figura 29: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans 44A (A e B) e formado na
presença de 32 μg/mL de miltefosina (C-D) e 64 μg/mL de Tcan26 (E e F), por 48h, a 35 °C.
Barras correspondem a 500 μm em A,C,E e 5 μm em B,D,F. Observamos tanto a redução da
densidade de células aderidas à superfície do cateter quanto a inibição da filamentação nos
biofilmes formados na presença de MLT e Tcan26, em relação ao controle. .......................... 78
Figura 30: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans ATCC 10231 (A e B) e após a
adição de 16 μ g/mL de FLU(C-D), 256 μ g/mL de AZA (E e F) e 16 μ g/mL de EIL (G e
H), ao bifilme já formado, por 48h, a 35 °C. Barras correspondem a 500 μ m em A,C,E,G; 10
μ m em B,D,F,H e 5 μ m no inset (H). é Possivel observar tanto a redução da densidade de
células aderidas à superfície do cateter quanto a inibição da filamentação, nos biofilmes apos
a adição de FLU, AZA e EIL, em relação ao controle. ............................................................ 82
Figura 31: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans ATCC 10231 (A e B) e após a
adição de 32 μg/mL de miltefosina (C-D) e 64 μg/mL de Tcan26 (E e F), ao biofilme já
formado, por 48h, a 35 °C. Barras correspondem a 500 μm em A,C,E e 10 μm em B,D,F.
Observamos tanto a redução da densidade de células aderidas à superfície do cateter nos
biofilmes apos a adição de MLT e Tcan26, quanto a inibição da filamentação, nos biofilmes
adicionados de Tcan26, quando comparados ao controle. ....................................................... 84
Figura 32: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans 44A (A e B) e após a adição de
16 μg/mL de FLU(C-D), 4 μg/mL de AZA (E e F) e 32 μg/mL de EIL (G e H), ao biofilme já
formado, por 48h, a 35 °C. Barras correspondem a 500 μm em A,C,E,G; 10 μm em B,D,F,H e
5 μm no inset (F). Observamos alterações de superfície celular em biofilmes tratados com
AZA. A adição detes antifúngcos não alterou nem densidade de células aderidas ao cateter
nem filamentação. ..................................................................................................................... 86
Figura 33: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans 44A (A e B) e após a adição de
32 μg/mL de miltefosina (C-D) e 64 μg/mL de Tcan26 (E e F), ao biofilme já formado, por
48h, a 35 °C. Barras correspondem a 500 μm em A,C,E; 10 μm em B,D,F e 5 μm no inset
(D). É Possivel observar grumos de celular com alterações de superfície em biofilmes tratados
com MLT. Biofilmes tratados com Tcan26 exibem tanto redução na densidade de células
aderidas à superfície do cateter quanto inibição da filamentação, quando comparado ao
controle. .................................................................................................................................... 88
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Principais condições de pacientes, em ambiente hospitalar, associadas à candidemia.
Publicado por: Hinrichsen et al., 2008. ..................................................................................... 9
Tabela 2: Incidência de C. albicans em 712 casos de candidemia, entre 2003 e 2004, no
Brasil. Publicado por: Colombo et al., 2006 ............................................................................ 10
Tabela 3: Estruturas químicas e mecanismos de ação de algumas substâncias antifúngicas
utilizadas . ................................................................................................................................. 34
Tabela 4: Interpretação dos resultados da determinação da IC das drogas padrão (CLSI, 2008)
.................................................................................................................................................. 36
Tabela 5: Susceptibilidade das cepas de C. albicans aos inibidores da 24-SMT, aos análogos
de fosfolipídios e aos antifúngicos padrão, analisados pelo método da microdiluição em caldo.
Resultados de CI50 e CI90 estão expressos em µg/mL. ............................................................. 45
Tabela 6: Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) dos inibidores da 24-SMT
(AZA e EIL) e dos análogos de fosfolipidios (MLT e Tcan 26) contra cepas de C. albicans. 45
Tabela 7: Índice de hidrofobicidade celular de leveduras em suspensão após tratamento com
AZA, EIL, fluconazol (FLU), itraconazol (ITRA), ou anfotericina B (AMB), nas
concentrações de IC50 de cada substância. ............................................................................... 48
Tabela 8: Índice de hidrofobicidade celular de leveduras em suspensão após tratamento com
miltefosina (MLT) ou Tcan26, nas concentrações de IC90 de cada substância. ....................... 48
Tabela 9: Porcentagem relativa de esteróis extraídos de leveduras de C. albicans 44A não
tratadas (controle) e tratadas com miltefosina (concentrações em µg/mL), obtido por meio de
um cromatógrafo gasoso acoplado a um espectro de massas. .................................................. 53
Tabela 10: Porcentagem relativa de ésteres de ácidos graxos extraídos de leveduras de C.
albicans (44A) controle e tratadas com 0,5 e 1 µg/ml de miltefosina, obtidos por meio de um
cromatógrafo à gás acoplado a um espectrômetro de massas. ................................................. 57
Tabela 11: Resumo do perfil de atividade dos agentes antifúngicos, nas duas fases de
desenvolvimento do biofilme, formado sobre dois substratos diferentes. Análise quantitativa
do biofilme em poliestireno (placa de 96 poços) por redução de XTT e avaliação visual do
cateter tratado quanto a redução de densidade e filamentação das células fúngicas, em relação
ao cateter controle não tratado. ................................................................................................. 91
xi
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
24-SMT: Δ24(25)-esterol metiltransferase
AMB: Anfotericina B
ASD: Ágar Saburaud dextrose
ATCC: American Type Culture Colection
AZA: 22,26 azasterol
CFM: Concentração fungicida mínima
DNA: Ácido desoxiribonucléico
EIL: Epiminolanosterol
FLC: Fluconazol
HIV: Vírus da imunodeficiência adquirida
IC: Concentração inibitória Minima
IC50: Concentração inibitória mínima capaz de inibir 50% do crescimento
IC90: Concentração inibitória mínima capaz de inibir 90% do crescimento
ITC: Itraconazol
MEC: Matriz Extracelular
MLT: Miltefosina
MOPS: Ácido 3-(N-morfolino)propanosulfônico
PBS: Salina tamponada com fosfato
SAP: Aspartil proteinases secretadas
SFB: Soro fetal bovino
UFC: Unidade formadora de colônia
xii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................... 1
1.1 O gênero Candida spp. ............................................................................................. 1
1.2 C. albicans e seus fatores de virulência .................................................................... 2
1.2.1 Morfogênese ...................................................................................................................... 2 1.2.2 Aderência .......................................................................................................................... 3 1.2.3 Enzimas hidrolíticas .......................................................................................................... 5 1.2.4 Alteração fenotípica .......................................................................................................... 6 1.3 Candidíases ............................................................................................................. 8
1.4 Epidemiologia .......................................................................................................... 9
1.5 Biofilmes ................................................................................................................ 11
1.6 Formação de biofilmes por C. albicans .................................................................. 12
1.6.1 Matriz extracelular do biofilme de C. albicans ............................................................... 16 1.6.2 Resistência a antifúngicos em biofilmes de C. albicans ................................................. 16 1.7 Terapia antifúngica para candidemia .................................................................... 19
1.7.1 Derivados azólicos .......................................................................................................... 20 1.7.2 Poliênicos ........................................................................................................................ 21 1.7.3 Equinocandinas ............................................................................................................... 23 1.8 Novas substâncias com atividade antifúngica ........................................................ 25
2 OBJETIVOS ...................................................................................... 32
2.1 Objetivo geral: ....................................................................................................... 32
2.2 Objetivos específicos .............................................................................................. 32
3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................ 33
3.1 Micro-organismos.................................................................................................. 33
3.2 Drogas antifúngicas ............................................................................................... 33
3.3 Teste de susceptibilidade in vitro aos agentes antifúngicos .................................... 35
xiii
3.3.1 Determinação da concentração inibitória mínima (IC) ................................................... 35 3.3.2 Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) .............................................. 36 3.4 Efeito das drogas sobre a hidrofobicidade de superfície celular (HSC) ................. 36
3.5 Análise de lipídeos ................................................................................................. 37
3.5.1 Extração e separação de lipídeos neutros (LN) e polares (LP) ....................................... 37 3.5.2 Análise de lipídeos neutros ............................................................................................. 38 3.5.3 Análise de fosfolipídios................................................................................................... 38 3.5.4 Análise de ácidos graxos ................................................................................................. 39 3.6 Formação de biofilme por C. albicans ................................................................... 39
3.6.1 Condições de cultivo ....................................................................................................... 39 3.6.2 Formação do biofilme ..................................................................................................... 40 3.6.3 Quantificação do biofilme ............................................................................................... 40 3.7 Efeito do tratamento com compostos antifúngicos no biofilme .............................. 40
3.7.1 Efeito da adição dos compostos durante a formação do biofilme ................................... 40 3.7.2 Efeito dos compostos no biofilme maduro...................................................................... 41 3.8 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ......................................................... 42
3.9 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) .................................................... 42
3.10 Análise estatística .................................................................................................. 43
4 RESULTADOS ................................................................................. 44
4.1 Perfil de susceptibilidade aos agentes antifúngicos ................................................ 44
4.1.1 Determinação da concentração inibitória minima........................................................... 44 4.1.2 Determinação da concentração fungicida minima .......................................................... 44 4.2 Efeito das drogas sobre a Hidrofobicidade de Superfície Celular (HSC) .............. 47
4.3 Alterações ultraestruturais após tratamento com miltefosina ............................... 49
4.3.1 Análise de esteróis........................................................................................................... 53 4.3.2 Análise de fosfolipídios................................................................................................... 54 4.3.3 Análise de ácidos graxos ................................................................................................. 57 4.4 Avaliação quantitativa dos efeitos da adição de drogas em diferentes fases de
desenvolvimento do biofilme de C. albicans .................................................................... 58
xiv
4.4.1 Avaliação do feito da adição de drogas durante a formação do biofilme ....................... 58 4.4.2 Avaliação do efeito da adição de drogas ao biofilme maduro ........................................ 64 4.5 Alterações morfológicas após a adição de drogas em diferentes fases de
desenvolvimento do biofilme de C. albicans em catéter venoso central .......................... 69 4.5.1 Alterações por adição de drogas durante a formação do biofilme .................................. 69 4.5.2 Alterações morfológicas por adição de drogas ao biofilme maduro ............................... 80
5 DISCUSSÃO ...................................................................................... 92
6 CONCLUSÕES .............................................................................. 108
REFERÊNCIAS .................................................................................. 109
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 O gênero Candida spp.
Os fungos do gênero Candida ssp. são micro-organismos eucariotos, não fotossintéticos, com
organelas citoplasmáticas, membrana celular rica em esteróis (comumente o ergosterol) e
parede celular. (AKPAN e MORGAN, 2002). Esse gênero compreende mais de 150 espécies
que crescem em amplas faixas de temperatura, entre 20 e 38 °C, e de pH, entre 2,5 e 7,5
(ODDS, 1998). Este comportamento permite que estes micro-organismos colonizem o
hospedeiro tanto em sua superficie, onde as temperaturas são mais baixas, quanto
internamente, em temperaturas de 36 °C. Da mesma maneira, é possível que ocorra
colonização por Candida spp. tanto em mucosas ácidas como o trato gênito-urinário, onde o
pH pode chegar a 2,5, quanto na corrente sanguínea, onde o pH está em torno de 7.
Cerca de 15 espécies de Candida spp. são reconhecidas como patógenos do hospedeiro
humano: C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. guilliermondii,
C. lusitaniae, C. dubliniensis, C. pelliculosa, C. kefyr, C. lipolytica, C. famata, C.
inconspicua, C. rugosa e C. norvegenis (PAPAS P., 2006). Dentro deste gênero, a C. albicans
é a espécie mais patogênica ao homem e também é a mais frequentemente isolada em
pacientes com infecção por Candida spp.(COLOMBO et al., 2006).
O comportamento patogênico e a invasividade tecidual de C. albicans parecem estar
relacionados à expressão de alguns fatores de virulência, como: morfogênese, aderência,
produção de enzimas hidrolíticas e mudança de fenótipo.
2
1.2 C. albicans e seus fatores de virulência
1.2.1 Morfogênese
Morfogênese (ou dimorfismo celular), em C. albicans e em C. dubliniensis, refere-se à
transição entre a forma leveduriforme, unicelular, e o crescimento filamentoso, formando
hifas e/ou pseudohifas (CALDERONE e FONZI, 2001) (Figura 01). A relação entre a
formação de hifas e a virulência permanece incerta mas sabe-se que esta é atenuada em
mutantes incapazes de mudar de forma. Assim, mutantes exclusivamente formadores de hifas
ou de leveduras são menos virulentos do que aqueles que desenvolvem as duas morfologias
(CALDERONE e FONZI, 2001). Dessa forma, ambas as morfologias parecem estar
envolvidas no desenvolvimento da doença, considerando que a maioria das lesões apresenta
tanto leveduras quanto hifas em seu interior e, portanto, ambas devem ser necessárias para a
virulência do fungo.
Figura 1: Esquema ilustrativo da transição entre as diferentes morfologias em C. albicans. Adaptado
de: Romani L., 2004.
Três observações levam a hipótese de que a formação de hifas está relacionada com a
virulência, em C. albicans: primeiro, a formação de filamentos é estimulada por soro fetal
bovino ou humano, a 37 °C (BROWN e GOW, 1999), e estas circunstâncias mimetizam o
ambiente do hospedeiro. Segundo, os filamentos recém-formados (tubos germinativos)
3
aderem-se com maior facilidade às células de mamíferos do que as leveduras unicelulares
(CUTLER et al., 1991), e a aderência é essencial para que ocorra penetração tecidual. E
terceiro, leveduras fagocitadas por macrófagos produzem filamentos e lisam a célula
fagocítica, portanto, a produção de filamentos é, também, um mecanismos de evasão das
defesas imunológicas do hospedeiro que permite a sobrevivência do patógeno e o
desenvolvimento da infecção (CUTLER et al.,1991; LO et al., 1997; MITCHELL, P. et
al.,1998).
1.2.2 Aderência
A aderência de C. albicans às células teciduais é um passo crucial para a
sobrevivência do fungo no hospedeiro e é essencial para a invasão e disseminação do fungo
pelo organismo. A levedura apresenta, na superfície da parede celular, receptores
responsáveis pela aderência às células epiteliais e endoteliais, às proteínas do soro e às
proteínas de matriz extracelular (CHAFFIN et al., 1998). Além disso, as células fúngicas
também aderem à superfícies abióticas, como dispositivos médicos, levando à formação de
biofilmes.
A parede celular de C. albicans é construída de β-glucanas (polímeros ramificados de
glicose contendo resíduos com ligações do tipo β-1,3 e β-1,6), quitina (polímeros de N-acetil-
glucosamina contendo ligações β-1,4), manoproteínas, pequenas quantidades de outras
proteínas e lipídios (CHAFFIN et al., 1998) (Figura 2).
4
Figura 2: Esquema ilustrativo dos componentes da parede celular de C. albicans. Os polímeros de β-1,3 e β-1,6 glucana estão representados em amarelo e azul, respectivamente; proteinas em verde, filamentos de quitina em laranja e mananas em vermelho.
A adesão às células e às superfícies é conferida por proteínas de superficie celular
especializadas, chamadas adesinas, que ligam aminoácidos específicos ou resíduos de açúcar
na superfície de outras células, ou promovem a ligação à superfícies abióticas
(VERSTREPEN et al., 2006). Estas adesinas incluem proteínas da família Als, Hwp1p,
Eap1p, Csh1p e outros receptores de superfície celular menos conhecidos.
A família de proteínas Als (seqüência ―aglutinina-like") inclui diversas proteínas
ligadas à superfície da célula fúngica, com estrutura semelhante mas com ligantes diferentes,
que são responsáveis pela adesão ao colágeno, fibronectina, laminina, células endoteliais e
epiteliais, e agregação de célula a célula (FILLER et al., 2006).
O receptor Hwp1p está presente somente na superfície de hifas e facilita a adesão ao
epitélio (STAAB et al., 1999). Um outro receptor, o Eap1p ("maior aderência ao
poliestireno") mostra homologia e similaridade estrutural ao Hwp1p, mas seus ligantes ainda
são desconhecidos (FILLER et al., 2006).
5
Além disso, o receptor Csh1p, de 38 kDa, que foi descrito por Singleton et al. (2001),
aumenta a hidrofobicidade de superfície das células de C. albicans e, com isso, facilita
interações específicas entre receptor e ligante no processo de aderência às células epiteliais,
endoteliais e às proteínas da matriz extracelular.
Embora muitas adesinas fúngicas tenham sido identificadas (STAAB et al., 1999;
Singleton et al., 2001; FILLER et al., 2006), pouco se sabe sobre receptores do hospedeiro
envolvidos na adesão. Atualmente, sabemos que os receptores ―Toll-like‖ e outros receptores
presentes na superfície das células imunológicas humanas estão envolvidos nestas interações.
Proteínas presentes na superfície das células epiteliais ou endoteliais, como N-caderina, são
importantes para o reconhecimento de diferentes formas de C. albicans e para sua endocitose
(PHAN et al.2005; FILLER, 2006).
1.2.3 Enzimas hidrolíticas
A produção e secreção de enzimas hidrolíticas, como: proteases, lipases e fosfolipases
são importantes fatores de virulência de C. albicans. Essas enzimas desempenham papel não
só na nutrição, mas, também, nos danos teciduais, na disseminação no interior do hospedeiro,
na aquisição de ferro e na evasão do sistema imunológico do hospedeiro. Desta maneira,
contribuem para a patogenicidade do fungo.
Diferentes tipos de enzimas hidrolíticas secretadas por C. albicans são conhecidas
atualmente. A atividade de fosfolipases é muito alta durante a invasão do tecido, pois estas
enzimas são responsáveis pela hidrólise das ligações de um ou mais ésteres de
glicerofosfolípidos, componentes da membrana celular do hospedeiro. Ibrahim et al. (1995)
mostrou que células de C. albicans isoladas de sangue têm atividades de fosfolipase
extracelular maiores do que as estirpes comensais. Quatro diferentes fosfolipases secretadas
são conhecidas: A, B, C e D (CALDERONE e FONZI, 2001; YANG, 2003). Dentre estas, a
atividade de fosfolipase B1 (PLB1), que é tanto hidrolase quanto lisofosfolipase-transacilase
6
(GHANNOUM, 2000; YANG, 2003), é de extrema importância para a virulência de C.
albicans, pois, mutantes deficientes na produção desta enzima mostraram virulência atenuada
em modelos murinos de infecção (CALDERONE e FONZI, 2001), caracterizando-a como
importante fator de virulência para este fungo.
C. albicans pode, ainda, produzir proteinases, como as SAPs (―Secreted Aspartyl
Proteinases‖), já descritas como fator de virulência destas leveduras (NAGLIK et al., 2003).
Diversas proteínas do hospedeiro sofrem hidrolise por SAPs, incluindo: colágeno, laminina,
fibronectina, mucina, imunoglobulinas, citocinas pró-inflamatórias, complemento e
precursores de fatores de coagulação do sangue (NAGLIK et al., 2004; SCHALLER et al.,
2005).
Além de aspartil proteinases, uma serina peptidase que hidrolisa diversos substratos,
incluindo proteínas da matriz extracelular e proteínas do soro, também é secretada por C.
albicans (DOS SANTOS et al., 2006).
1.2.4 Alteração fenotípica
A alteração de fenótipo, ou switching fenotípico, em C. albicans, pode ocorrer com
alta frequência e de maneira reversível. Esta troca de fenótipos tem sido relacionada à
virulência desta levedura uma vez que os isolados clínicos, que tendem a ser mais virulentos,
fazem estas alterações com frequência mais alta do que as cepas laboratoriais, de menor
virulência (JONES et al., 1994).
A alteração classificada como sistema branco-opaco, em cepas WO-1, no qual
colônias lisas e brancas transformam-se em colônias opacas e cinzentas, é a mais estudada
dentre todas as alterações fenotípicas, em C. albicans. Algumas diferenças entre estes dois
tipos de colônias são: a forma das células (células brancas são ovóides e células opacas são
alongadas ou em forma de feijão) (Figura 3) e a germinação, a 37 °C e em pH 6,7, só ocorre
em células brancas e não em opacas (CALDERONE e FONZI, 2001).
7
Figura 3: Colônias brancas e opacas de C. albicans. Em (a) colônia branca com um setor opaco, (b)
colônica branca (acima) e opaca (abaixo), (c) e (d) micrografias de microscopia eletrônica de
varredura, em aumento de 1000 x, das células de colônia branca (c) e opaca (d). Adaptado de: Johnson
A., 2003
Em experimentos de expressão diferencial de genes de proteínas da família SAP, foi
demonstrado que SAP1 e SAP3 foram específicas de células opacas e SAP2 específica de
células brancas. O gene EFG1, relacionado à morfogênese celular, foi expresso em células
brancas, mas não em células opacas e a expressão ectópica deste gene em células opacas
resultou na conversão imediata para a fase branca (CALDERONE e FONZI, 2001). Além
disso, as células opacas mostraram-se melhores colonizadoras, em um modelo cutâneo de
infecção, do que células em fase branca, mas, no entanto, as células opacas foram menos
virulentas em um modelo animal de infecção sistêmica (KVAAL,C. et al., 1999).
A expressão de fatores de virulência em C. albicans relaciona-se diretamente com a
patogenicidade da cepa e sua capacidade de adaptação, sobrevivência e disseminação no
organismo hospedeiro, determinando, assim, o desenvolvimento de doença.
8
1.3 Candidíases
Fungos do gênero Candida spp. são componentes normais da microbiota da pele, do
trato gastrintestinal e do trato urinário em indivíduos saudáveis. A partir de um desequilíbrio
imunológico ou competitivo do hospedeiro, o crescimento destes fungos perde a sua
regulação e pode ocorrer proliferação excessiva, levando ao desenvolvimento da doença,
denominada candidíase. Esse comportamento caracteriza a candidíase como uma infecção
fúngica oportunista. Na maioria dos casos, a infecção se instala na superfície cutânea ou nas
mucosas mas pode, também, se disseminar para órgãos adjacentes ou distantes. Em casos de
infecção da via hematogênica, chamados de candidemia, pode haver disseminação do fungo
por todo o organismo do hospedeiro, permitindo a colonização de diversos orgãos e mucosas.
Ao longo dos últimos trinta anos, o desenvolvimento da medicina, dos procedimentos
cirúrgicos e dos transplantes, levou a um aumento drástico no número de indivíduos
imunocomprometidos, que são mais susceptíveis às infecções fúngicas oportunistas. Pacientes
com o sistema imunológico comprometido, como aqueles com infecção por HIV, portadores
de doenças hematológicas, pós-cirúrgicos, pós-transplantados ou em terapia contra o câncer,
encontram-se sob maior risco de desenvolver micoses invasivas. Além disso, o uso
indiscriminado de agentes antimicrobianos de largo espectro de ação, de agentes
imunossupressores e terapia prolongada com corticosteróides também determinam fatores de
risco para o desenvolvimento destas infecções (KARKOWSKA-KULETA et al., 2009).
Nessas circunstâncias, espécies de Candida spp. são capazes de causar infecções fúngicas
invasivas (IFIs), que são complicações cada vez mais comuns em pacientes muito debilitados
e são freqüentemente fatais. Um estudo, em um hospital terciário de recife - PE, realizado por
Hinrichsen et al. (2008) mostrou que, em ambiente hospitalar, as principais condições de
pacientes associadas à candidemia foram: antibióticoterapia, internação em unidade de
tratamento intensivo (UTI), presença de cateter venoso central, terapia com corticosteróides,
9
nutrição parenteral total, adminstração de bloqueador de receptor H2 (bloqueadores do
receptor de histamina do tipo 2, são inibidores da secreção ácida estomacal) e terapia com
imunossupressores (Tabela 1).
Tabela 1: Principais condições de pacientes, em ambiente hospitalar, associadas à candidemia.
Publicado por: Hinrichsen et al., 2008.
Condições associadas Número* Porcentagem
Antibióticos 19 90,0
Internação na unidade de terapia itensiva 13 62,0
Cateter venoso central 12 57,0
Corticoesteróide 11 52,0
Nutrição parenteral total 5 24,0
Bloqueador H2 3 14,0
Imunossupressor 1 4,8
* Número de vezes em que as condições aparecem.
(No período do estudo foram observados 21 episódios de candidemia em 18 pacientes)
A disseminação de Candida spp. por via hematogênica ocorre, com frequência, em
consequência ao uso de catéteres intravasculares, sondas gástricas ou prótese valvular
cardíaca, estando frequentemente associada à formação de biofilmes (SENEVIRATNE,
2008).
1.4 Epidemiologia
A candidemia tem demonstrado importância cada vez maior em casos de infecções
hospitalares e Candida spp. é o quarto patógeno mais freqüentemente isolado de culturas
sanguíneas hospitalares, sendo os mais isolados, em ordem decrescente: Staphylococcus
coagulase-negativo, Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae (COLOMBO et al.,
2006).
10
Nos últimos anos, alguns estudos têm reportado uma mudança na etiologia da
candidemia em todo o mundo. Enquanto C. albicans ainda é considerada a espécie causadora
mais comum (COLOMBO et al., 2006), o aumento de candidemias causadas por C. tropicalis,
C. parapsilosis, C. glabrata e C. krusei tem sido demonstrado por diversas pesquisas
(COLOMBO et al., 1999; SANDVEN et al., 1998; TRICK et al., 2002). Ainda assim, um
estudo epidemiológico de Colombo et al. (2006) mostrou que, no Brasil, C. albicans foi
responsável por 40% dos casos de candidemia, em um estudo com 712 pacientes (Tabela 2),
onde a taxa de mortalidade foi de 54% (COLOMBO et al., 2006). Este mesmo estudo
confirmou que C. tropicalis e C. parapsilosis foram responsáveis pela maior parte das
infecções fúngicas por Candida não-albicans no Brasil e, também, que a taxa de candidemia
em hospitais brasileiros foi de 2 a 15 vezes mais elevada do que em centros de controle nos
Estados Unidos (WISPLINGHOFF et al., 2004), Canadá (MACPHAIL et al., 2002), e Europa
(TORTORANO et al., 2002).
Tabela 2: Incidência de C. albicans em 712 casos de candidemia, entre 2003 e 2004, no Brasil.
Publicado por: Colombo et al., 2006
Espécies Número de casos (%) Incidência em 1,000
admissões
Incidência em 1,000
pacientes/dia
C. albicans 291 (40,9) 1,01 0,15
C. tropicalis 149 (20,9) 0,52 0,07
C. parapsilosis 146 (20,5) 0,51 0,07
C. pelliculosa 44 (6,2) 0,15 0,02
C. glabrata 35 (4,9) 0,12 0,02
C. guilliermondii 17 (2,4) 0,06 0,009
P. ohmeri 9 (1,3) 0,03 0,005
C. krusei 8 (1,1) 0,03 0,004
Outrasa 13 (1,3)
a: Outras espécies de Candida: C. lusitaniae, quatro casos; C. lipolytica, três casos; C. zeylanoides, um
caso; Candida spp., cinco casos.
Mais da metade das infecções da corrente sanguínea, incluindo infecções por Candida
spp. em UTI estão relacionados com cateteres. A utilização de cateter venoso central (CVC)
parece ser o fator de risco mais comum para o desenvolvimento de candidemia em pacientes
11
sem neutropenia ou imunodeficiências graves (TUMBARELLO et al., 2007). Em um estudo
multicêntrico de 427 pacientes com candidemia, a taxa de mortalidade para pacientes com
candidemia relacionada à utilização de cateter foi de 41%. Cerca de 40% dos pacientes com
colonização microbiana em cateter venoso desenvolveram fungemia, com consequências que
foram desde doenças focais até sepsemia e morte (CHANDRA et al., 2001). A alta
mortalidade em pacientes com candidemia associada à utilização de CVC parece estar
relacionada com a capacidade de formação de biofilme destes isolados clínicos. Em um
estudo recente, Tumbarello et al. (2007), mostraram que a taxa de mortalidade em pacientes
com candidemia, causada por isolados formadores de biofilme, apresentou-se
significativamente maior do que em pacientes com infecções causadas por isolados não
formadores de biofilme, demonstrando que a formação de biofilmes afetou a saúde de
pacientes hospitalizados com candidemia e também mostrou-se um indicador significativo de
mortalidade.
1.5 Biofilmes
Desde o século XVII, biofilmes têm sido descritos em vários sistemas. A maioria das
bactérias crescem, preferencialmente, em biofilmes, em todos os ecossistemas aquáticos auto-
suficientes em nutrientes, e estas células sésseis bacterianas diferem profundamente das suas
homólogas planctônicas (células em suspensão) ( COSTERTON et al., 1995).
As definições de biofilme evoluíram ao longo dos anos, paralelamente aos avanços da
biologia e de pesquisas acerca do tema. Inicialmente, Costerton et al. (1987) postularam que
biofilmes eram compostos por células individuais e microcolônias, embutidas em uma matriz
altamente hidratada predominantemente composta por hexopolímeros aniônicos. Em seguida,
Costerton e Lappin-Scott (1995) demonstraram que este processo é regulado por genes
específicos, transcritos a partir da fixação inicial da célula. Em uma definição atual, um
biofilme é uma comunidade microbiana de derivados sésseis caracterizado por células que
12
estão ligadas a um substrato, ou umas às outras, incorporadas em uma matriz de substâncias
poliméricas extracelulares, produzida por elas mesmas, e exibem um fenótipo alterado no que
diz respeito a taxa de crescimento e transcrição de genes (DONLAN e COSTERTON, 2002).
Frequentemente, isolados de Candida spp. são identificados como agentes de
candidemias, pneumonias hospitalares e infecções do trato urinário e, quase invariavelmente,
estas infecções estão associadas à utilização de algum dispositivo médico e à formação de
biofilme na superfície deste dispositivo.
O dispositivo médico mais comumente colonizado é o CVC, utilizado para
administração de líquidos, nutrientes e medicamentos. O fluido de infusão ou o cateter podem
estar contaminados, mas, com maior frequência, os micro-organismos são introduzidos a
partir da pele do paciente ou das mãos dos profissionais de saúde. Alternativamente, estes
micro-organismos podem migrar para o cateter a partir de uma lesão pré-existente. No
entanto, se Candida spp. colonizar o trato gastrointestinal como comensal, é capaz de
penetrar a mucosa intestinal, disseminar-se através da corrente sangüínea e, então, leveduras
circulantes podem colonizar de maneira endógena o cateter. Este poderia ser um mecanismo
de disseminação do patógeno comum em pacientes com câncer que recebem quimioterapias
causadoras de danos à mucosa intestinal (DOUGLAS, J.L., 2003).
Após a formação do biofilme na superfície do cateter, o desprendimento de leveduras
deste biofilme pode resultar em uma infecção disseminada aguda. Esta infecção pode,
eventualmente, responder à terapia antimicrobiana mas as células que permanecerem no
biofilme serão resistentes e poderão persistir como um reservatório da infecção até o cateter
ser removido (BAILLIE e DOUGLAS, 1999).
1.6 Formação de biofilmes por C. albicans
O desenvolvimento do biofilme de C. albicans, in vitro, em superfícies abióticas,
ocorre em quatro etapas seqüenciais: (i) fase inicial, na qual as leveduras em suspensão e
13
circulantes aderem à superfície; (ii) fase intermediária, referente ao desenvolvimento do
biofilme; (iii) fase de maturação, na qual a matriz polimérica embebe completamente todas as
camadas de células aderidas à superfície, em uma estrutura tridimensional; (iv) dispersão,
onde as células mais superficiais se desprendem do biofilme e colonizam áreas adjacentes da
superfície (Figura 04) (CHANDRA et al., 2001; RAMAGE et al., 2005, SENEVIRATNE et
al., 2008).
Figura 4: Esquema ilustrativo da seqüência de desenvolvimento do biofilme de C. albicans, em suas
diferentes fases. A: adesão de leveduras em suspensão à superfície, B: formação de colônias e
multiplicação celular, C: secreção de matriz extracelular (MEC) e formação de hifas, formando uma
estrutura tridimensional complexa. Adaptado de: Douglas J.L., 2003.
14
A fase inicial de desenvolvimento ocorre a partir da aderência da primeira levedura à
superfície e estende-se por cerca de 11 horas. Inicialmente (0-2 h), a maior parte das células
de C. albicans é de leveduras, que aderem à superfície e desenvolvem colônias, ao longo das
4 horas seguintes. Ao fim de 11 h, com a expansão lateral das colônias, as mesmas acabam
por formar um filme de poucas camadas de células sobre a superfície. A fixação das leveduras
ao substrato abiótico é mediada, primeiramente, por fatores inespecíficos, como
hidrofobicidade de superfície celular e forças eletrostáticas (DONLAN et al., 2002) e,
posteriormente, por adesinas específicas, como proteínas da família Als, presentes na
superfície celular do fungo, que reconhecem ligantes na superfície ou nos componentes do
meio fluido, tais como proteínas do soro (fibronectina e fibrinogênio) e fatores salivares
(ZHAO et al., 2005).
Durante a fase de desenvolvimento do biofilme (entre 12 e 30 h), as leveduras
multiplicam-se e iniciam a formação de pseudo-hifas e hifas. As células, começam a produzir
polissacarídeos e proteínas, formando uma matriz polimérica que embebe as células do
biofilme, mantendo-as juntas e aderidas (Figura 5 a). Ao logo da fase de maturação (de 38 a
72 horas), a quantidade de material extracelular aumenta, de forma que todas as células
encontram-se encorporadas à matriz polimérica. Ao final do processo, o biofilme consiste em
uma rede densa de células sob a forma de leveduras, hifas e pseudo-hifas, embebidas por
matriz extracelular polimérica e com canais de água entre as células, que facilitam a difusão
de nutrientes do meio ambiente através da biomassa para as camadas inferiores e, também,
permitem a eliminação de resíduos (Figura 5 b-c) (CHANDRA et al., 2001; RAMAGE et al.,
2005; RAMAGE et al., 2001a). O biofilme maduro, ao atingir uma massa crítica, encontra um
equilíbrio dinâmico no qual o aumento da densidade de células é compensado pela liberação
de células de camadas mais superficiais para a colonização de outras superfícies, em um
fenômeno chamado dispersão.
15
Figura 5: Microscopia eletrônica de varredura de biofilmes de Candida albicans. (a) biofilme fino
mostrando extensa matriz extracelular, indicado pela seta branca. (b) biofilme altamente filamentado,
seta branca indica um canal de água. (c) biofilme maduro com presença de hifas e leveduras, matriz
extracelular não visível. Barras = 10 µm.
Biofilmes de Candida spp., formados em modelos in vivo, parecem seguir a mesma
seqüência de formação (ANDES et al., 2004), no entanto, a maturação ocorre mais
rapidamente e a espessura final é maior nestes biofilmes do que naqueles cultivados em
sistemas in vitro. O biofilme cultivado in vitro pode ter espessura variável entre 25 e 450 µm
(CHANDRA et al., 2001; RAMAGE et al., 2001a; KUHN et al., 2002a), e, em modelos in
vivo, a espessura é geralmente superior a 100 µm (ANDES et al., 2004).
A arquitetura final do biofilme é variável e depende, em parte, do substrato sobre o
qual ele é formado. O biofilme de Candida formado em superfícies de polimetilmetacrilato é
descrito como uma camada espessa de matriz extracelular em que uma densa rede de
leveduras, pseudo-hifas, e hifas estão inseridas. Já em um biofilme formado em superfícies
planas e hidrofóbicas, tais como silicone e PVC, existe uma distribuição bifásica de
componentes, ou seja, uma camada aderente de leveduras coberta por várias camadas de hifas
e pseudo-hifas incorporadas em matriz extracelular (SENEVIRATNE et al., 2008).
Além da composição da superfície do substrato, as condições de crescimento nas quais
o biofilme é formado, tais como: meio de cultura utilizado (in vitro), concentração e tipos de
açúcares, presença de proteínas do soro, pH e temperatura (KUMAMOTO, 2002;
16
SENEVIRATNE et al., 2008), influenciarão na composição final. E, ainda, diferentes cepas
de C. albicans divergirão em sua capacidade de formação de biofilme. (KUHN, 2002a).
1.6.1 Matriz extracelular do biofilme de C. albicans
A matriz extracelular (MEC) é uma das características mais peculiares de um biofilme
microbiano e é a responsável por formar a estrutura tridimensional do biofilme. A MEC
mostra-se similar a um gel, altamente hidratado, no qual os micro-organismos apresentam-se
imobilizados. A composição da matriz varia de acordo com a natureza dos organismos
presentes no biofilme (AL FATTANI et al., 2006). Os polímeros que compõem a MEC de
biofilmes bacterianos são principalmente exopolissacarídeos, dentre os quais, muitos são
carregados negativamente, devido à presença da carboxila, grupamentos sulfato ou fosfato.
Quantidades menores de proteínas, ácidos nucléicos e lipídios também podem estar presentes.
Dois polissacarídeos de MEC bacteriana já caracterizados são: alginato, produzido por
Pseudomonas aeruginosa, e poli β-1,6-N-acetilglicosaminas, secretados por bactérias
Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus aureus (STARKEY et al. 2004; GOTZ, 2002).
A síntese de ambos os polissacarídeos tem sido relacionada à virulência dessas bactérias.
A composição geral da MEC de biofilmes de C. albicans foi determinada por Al-
fattani et al. (2006) e esta apresentou, majoritariamente, carboidratos (39,6%), onde a maior
proporção foi de glicose (32,2%), seguido de pequenas quantidades de manose e galactose. A
matriz mostrou, ainda, pequenas quantidades de proteínas (5,0%), hexosamina (3,3% ),
fósforo (0,5%) e ácido urônico (0,1%).
1.6.2 Resistência a antifúngicos em biofilmes de C. albicans
Segundo a definição de biofilme, as células que compõem esta estrutura apresentam
fenótipo alterado e diferem das células planctônicas na expressão de genes, taxa de
crescimento e, principalmente, na susceptibilidade aos agentes antifúngicos. O aumento
17
drástico da resistência antifúngica em células de C. albicans cultivadas como biofilmes, em
relação às suas formas planctônicas, é a alteração comportamental de maior relevância
médica.
Múltiplos mecanismos têm sido sugeridos para explicar o aumento da resistência a
antifúngicos do biofilme de C. albicans, incluindo a dificuldade de penetração da droga
através da MEC e a morfológia das células fúngicas, que podem apresentar bombas de efluxo
de drogas (Figura 6).
Figura 6: Possíveis mecanismos envolvidos na resistência antifúngica do biofilme de C. albicans.
Adaptado de: Niimi et al., 2010
A MEC pode se apresentar como uma barreira física, impedindo o acesso de agentes
antimicrobianos às células incorporadas na comunidade do biofilme e, então, colaborar para o
aumento da resistência à droga. Este obstáculo parece depender da quantidade e da natureza
da matriz, assim como das propriedades físico-químicas da droga. Em biofilmes de bactérias,
enzimas da MEC, também, podem digerir drogas, reduzindo seu efeito final
(SENEVIRATNE, 2008). Em biofilmes de C. albicans, a produção de matriz aumenta
drasticamente quando biofilmes são cultivados sob agitação, em comparação ao
desenvolvimento em condições estáticas e, no entanto, ambos os tipos de biofilmes mostram-
se igualmente resistentes às drogas antifúngicas. Da mesma maneira, células em suspensão,
recuperadas de biofilmes maduros, ressuspensas em meio líquido mostraram-se resistentes ao
18
fluconazol e à anfotericina B, mas não no mesmo nível que as células que permanecem no
biofilme maduro (RAMAGE et al., 2005). Estes resultados parecem indicar que a MEC
desempenha um papel parcial na resistência de células sésseis mas outros fatores,
provavelmente, estão envolvidos.
A resistência aos azóis em células planctônicas de C. albicans pode ser mediada por
bombas de efluxo localizadas na membrana, pelos transportadores ligados a ATP
(transportadores tipo ABC) e pelos facilitadores (MUKHERJEE, 2005). O papel dos genes
que codificam bombas de efluxo na resistência antifúngica de biofilmes de C. albicans foi
investigado por Ramage et al. (2002). Neste trabalho, demonstrou-se que a expressão dos
genes CDR1, CDR2 e MDR1, responsáveis pela formação das bombas de efluxo de drogas
em C. albicans, é regulada durante o curso de formação do biofilme. Mutantes de C. albicans
com depleções simples e duplas (Δcdr1, Δcdr2, Δmdr1, Δcdr1/Δcdr2 e Δmdr1/Δcdr1) foram
hiper-sensíveis ao fluconazol quando cultivados como células planctônicas, mas, ainda assim,
mantiveram o fenótipo de resistência durante o crescimento do biofilme. Posteriormente,
Mukherjee et al. (2003) demonstraram que os biofilmes formados pelas estirpes ―knockout‖
para Cdr1, Cdr2 e/ou Mdr1, mostraram-se mais suscetíveis ao fluconazol no início do
desenvolvimento do biofilme mas, ao longo do desenvolvimento e maturação, todas as cepas
se tornaram resistentes ao antifúngico, indicando que o envolvimento de bombas de efluxo na
resistência, em fases posteriores da formação do biofilme, é reduzido e que outros fatores
parecem estar contribuindo para o comportamento resistente das células do biofilme maduro
aos azóis.
Análises de esteróis de membrana celular mostraram que os níveis de ergosterol
apresentam-se significativamente menores nas fases intermediária e matura de
desenvolvimento do biofilme de C. albicans em comparação à fase inicial. Uma vez que o
metabolismo dos esteróis é o processo afetado pelas drogas mais amplamente empregadas na
19
terapia antifúngica, os níveis diminuídos de ergosterol presente nas células sésseis de
biofilmes maduros de C. albicans podem refletir um estado fisiológico destas células mais
propício para o comportamento resistente (RAMAGE, 2005).
1.7 Terapia antifúngica para candidemia
As principais classes de antifúngicos comercializadas compreendem os poliênicos, os
azóis, os tiocarbamatos, as alilaminas, os derivados morfolínicos, a 5-fluorocitosina, a
griseofulvina e as equinocandinas (ODDS, 2003). A escolha da classe de antifúngico, assim
como sua formulação, é feita a partir do quadro clínico desenvolvido pelo paciente. Para o
tratamento da candidíase disseminada, desde 2004, a Sociedade Americana de Doenças
Infecciosas recomenda equinocandinas (caspofungina), derivados azólicos (fluconazol e
itraconazol) e polienos (anfotericina B). Entretanto, novos antifúngicos estão sendo incluídos
ao tratamento, como voriconazol, posaconazol e micafungina (PAPPAS, 2004). A figura 7
mostra os principais alvos de ação dos agentes antifúngicos empregados no tratamento das
candidemias.
Figura 7: Principais alvos de ação na célula fúngica dos agentes empregados, atualmente, no
tratamento das candidemias. Adaptado de: Katzung B.G., 2009.
20
1.7.1 Derivados azólicos
Os azóis podem ser classificados, de acordo com sua estrutura química, em imidazóis
e triazóis. Os imidazóis são caracterizados pela presença do anel imidazol (contendo 2 átomos
de nitrogênio) enquanto os triazóis, pelo anel triazol (contendo 3 átomos de nitrogênio).
Dentre os imidazóis, somente o cetoconazol possui atividade sistêmica, mas não é utilizado
no tratamento de candidemias. Todos os triazóis têm atividade sistêmica e esta subclasse
inclui: fluconazol, itraconazol, posaconazol, voriconazol e ravuconazol (Figura 8). O
mecanismo de ação destes fármacos baseia-se na inibição da enzima C-14-α-lanosterol
demetilase, componente de um sistema microssomal dependente do citocromo P450,
prejudicando a biossíntese de ergosterol da membrana citoplasmática e levando ao acúmulo
de 14-α-metilesteróis (do tipo 14α-metil-3,6-diol) no citoplasma da célula fúngica. Esses
metilesteróis não possuem a mesma conformação nem as mesmas propriedades físicas que o
ergosterol e, por isso, determinam alterações na permeabilidade e na fluidez da membrana
celular do fungo. A inibição da síntese do ergosterol pode resultar em inibição do crescimento
da célula fúngica (efeito fungistático) ou em morte celular (efeito fungicida), dependendo da
sensibilidade da cepa causadora da infecção e do azol empregado no tratamento (SHEEHAN
et al., 1999).
Os novos triazóis (voriconazol, posaconazol e ravuconazol) apresentam maior
potência e espectro de ação mais amplo quando comparados aos antigos azóis (fluconazol e
itraconazol). Em estudo comparativo utilizando isolados clínicos de Candida spp., os três
novos antifúngicos mostraram atividade semelhante entre si, substancialmente maior que a
do fluconazol e pouco maior que a do itraconazol (PFALLER et al.,1998).
21
Figura 8: Estrutura química dos agentes azóis. Retirado de: www.doctorfungus.com
1.7.2 Poliênicos
Os representantes desta classe são anfotericina B e nistatina (Figura 9). A nistatina não
pode ser administrada sistemicamente por conta de sua alta toxicidade e, portanto, apenas a
anfotericina B é utilizada para o tratamento de candidemias. Anfotericina B é um dos
fármacos de escolha na maioria das doenças fúngicas em humanos. Sua ação é fungicida,
sendo indicada, em infecções sistêmicas, com administração por infusão endovenosa.
Figura 9: Estrutura química dos agentes poliênicos. Retirado de: www.doctorfungus.com
A estrutura básica dos poliênicos consiste em um anel lactâmico, com uma cadeia
lipofílica rígida e uma porção hidrofílica flexível. Como mecanismo de ação, a anfotericina B
liga-se diretamente à molécula de ergosterol formando poros na membrana celular,
permitindo a saída de componentes intracelulares de baixo peso molecular (como íons) e
culminando na morte celular por desestabilização da célula (Figura 10). A associação da
22
molécula de anfotericina B ao ergosterol ocorre por interação da cadeia hidrofóbica da
substância antifúngica ao esterol de membrana (GHANNOUM e RICE, 1999).
Figura 10: Mecanismo de ação da anfotericina B na célula fúngica. (A) bicamada lipídica com poro,
permitindo a saída de material citoplasmático. (B) esquema explicativo da interação da molécula de
anfotericina B com o ergosterol e formação do poro na mambrana celular. Adaptado de: Ghannoum e
Rice, 1999
Os esteróis são essenciais para a estrutura normal e função das membranas celulares.
Em mamíferos, o colesterol é o principal esterol de membrana na célçula, entretanto, em
outros organismos eucariotos, como fungos e tripanosomatídeos, há a predominância de
outros esteróis, incluindo o ergosterol e 24-metil esteróis. Esses esteróis são vitais para a
viabilidade e crescimento das células fúngicas e tripanosomatídeos, mas estão ausente nas
células de mamífero (SONG, 2007).
Ergosterol e colesterol são moléculas estruturalmente muito parecidas, diferindo em
poucos pontos. É sabido que algumas partes das moléculas de colesterol e ergosterol são
importantes para a atividade da membrana celular, como o núcleo tetracíclico esteroidal e 3β-
OH. Diferentemente do colesterol, o ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) é um esterol
anfipático caracterizado por conter uma hidroxila no C3 do anel A da molécula, o que
caracteriza a porção polar, e o restante da cadeia alifática é a porção apolar da molécula.
Também, possui duas duplas ligações no anel B, e uma dupla ligação na cadeia lateral
alifática em C22(23), além de um grupo metil em C24. Essas três últimas características e
ausência de metila em C4 e C14 parecem ser essenciais para o crescimento dos fungos
23
(SONG, 2007). A molécula de ergosterol dos fungos possui conformação tridimencional
cilíndrica enquanto que o colesterol, esterol majoritário nas membranas celulares de
mamíferos, possui conformação sigmóide. Esta diferença conformacional, provavelmente, é
suficiente para explicar a maior afinidade de ligação da anfotericina B ao ergosterol em
comparação ao colesterol. Entretanto, esta seletividade é baixa e a droga tem seu uso limitado
devido ao alto grau de toxicidade (nefrotoxicidade, hepatotoxicidade e anemia hemolítica)
(ODDS et al., 2003).
Diversas formulações lipídicas foram desenvolvidas na tentativa de diminuir a
natureza tóxica da formulação convencional. A tecnologia lipossomal foi empregada na
produção da anfotericina B lipossomal (L-AMB), diminuindo drasticamente os efeitos
adversos da anfotericina deoxicolato, entretanto estudos mostram que a eficácia terapêutica é
similar a anfotericina deoxicolato. L-AMB é composto de anfotericina B complexado com
fosfatidilcolina de soja hidrogenada, distearoilfosfatidilglicerol e colesterol, caracterizando
um verdadeiro composto de lipossomas unilamelares (Ambisome, Astellas). Além da L-
AMB, outras formulações lipídicas também foram desenvolvidas, como o complexo lipídico
de anfotericina B (Abelcet, Enzon) e anfotericina B dispersão coloidal (Amphotec, Three
Rivers). Também, está sendo desenvolvida a nistatina lipossomal para uso sistêmico
(Nyotran, Aronex Pharmaceuticals) (ODDS et al., 2003). No entanto, a forma lipossomal é
muito mais cara que as formas paternas, anfotericina B deoxicolato, o que pode restringir a
sua utilização em centros médicos públicos, custanto cerca de 20 vezes mais que a
anfotericina B deoxicolato (The Medical Letter, 2009).
1.7.3 Equinocandinas
As equinocandinas são uma nova classe de antifúngicos altamente seletivos. São
lipopetídeos que se ligam à β-(1,3) glucano sintase, inibindo a síntese das β-(1,3) glucanas,
constituintes da parede celular fúngica e levando a perda de função da mesma.
24
A parede celular é absolutamente essencial para a sobrevivência; mutações ou drogas
que afetam a síntese dos componentes de parede celular podem resultar em células fúngicas
inviáveis ao crescimento e ao estabelecimento de infecção.
Tendo em vista que a parede celular não está presente como componente de células de
mamíferos, estes não possuem β-(1,3) glucanas e esta classe de antifúngicos torna-se
altamente seletiva em sua ação em fungos, apresentando reduzida toxicidade em células de
mamíferos (KURTZ e DOUGLAS, 1997).
Atualmente, existem três equinocandinas liberadas para uso pelo FDA: micafungina,
caspofungina e anidulafungina (Figura 11). Dentre estas, somente a caspofungina está
aprovada para o tratamento de candidíase (PERLIN, 2007).
Figura 11: Estrutura química das equinocandinas. Adaptado de: www. doctorfungus.com.
Em um estudo anterior, Pfaller et al. (2003) identificaram 351 isolados de Candida
spp. resistentes ao fluconazol in vitro (IC > 64 µg/mL) e todos estes isolados mostraram-se
sensíveis a caspofungina (99% dos ICs foram < 2 µg/mL). Em seguida, Cocuaud et al. (2005)
demonstraram os efeitos do tratamento com doses terapêuticas de caspofungina em diferentes
fases do desenvolvimento do biofilme de C. albicans e C. parapsilosis. A utilização deste
antifúngico em concentrações de 2 µg/mL inibiu a formação de biofilme de ambas as espécies
testadas, em todos os estágios de maturação (2, 24 ou 48 h) e este efeito mostrou-se
independente da sensibilidade das cepas ao fluconazol (no caso de C. albicans). A eficácia da
25
caspofungina nestes experimentos confirma o potencial deste antifúngico como inibidor da
formação de biofilmes de C. albicans e C. parapsilosis em dispositivos médicos.
1.8 Novas substâncias com atividade antifúngica
Nas últimas décadas, o avanço da medicina vem propicíando um aumento na
sobrevida de pacientes e no tempo de internação destes. Com isso, um aumento do número de
indivíduos sob risco de aquisição de infecções fúngicas invasivas, bem como outras infecções
oportunistas, também pode ser observado atualmente. O limitado arsernal terapêutico
disponível para o tratamento de infeções fúngicas, associado às altas taxas de resistência aos
antifúngicos, apontam para a necessidade de busca de novos alvos de ação na célula fúngica e
novas moléculas com ação antifúngica para o tratamento destas infeções.
Desde a década de 70, além dos agentes azólicos, novas moléculas inibidoras da
síntese de ergosterol têm sido sintetizadas. Dentre estas, a atividade antifúngica dos
azasteróis, inibidores da Δ24-esterol metiltransferase (24-SMT), foi demonstrada por diversos
estudos ao longo dos últimos anos (BURBIEL et al., 2003). A inibição da 24-SMT é um alvo
de estudo bastante interessante porque esta enzima é exclusiva da via biossintética de
ergosterol, estando ausente na biossintese de outros esteróis, como o colesterol. Sendo assim,
a 24-SMT está presente apenas em células de fungos, tripanossomatídeos e plantas e
encontra-se ausente em células de mamíferos. Esta característica confere aos inibidores da 24-
SMT seletividade e específicidade, que provavelmente determinarão uma redução dos efeitos
adversos comuns durante a utilização de agentes inibidores de enzimas presentes tanto na
biosintese de ergosterol quanto de colesterol.
Estudos anteriores mostraram que o 15-azasterol, em concentrações entre 0,01 e 4,08
μg/mL, inibe o crescimento de Saccharomyces cerevisae e C. albicans, com um acúmulo
26
concomitante de moléculas intermediárias da via biosintética de esgosterol
(OEHLSCHLAGER, 1984; GEORGOPAPADAKOU et al., 1987; HAYS et al., 1977).
Dois azasteróis específicos, o 22-24 azasterol (AZA) e o Epiminolanosterol (EIL) têm sido
largamente estudados nos últimos anos e suas atividades tanto antifúngica quanto
antiprotozoário já foram demonstradas por diferentes grupos de pesquisa. Recentemente,
Ishida et al. (2009) mostraram que AZA e EIL induzem alterações ultraestruturais, acúmulo
de corpos lipídicos e alterações no ciclo celular, em C. albicans. Além disso, a atividade
antifúngica de AZA contra Paracoccidioides brasiliensis (VISBAL et al., 2003) foi
demonstrada, assim como contra Pneumocystis carinii, no qual observa-se interrupção do
crescimento e acúmulo de esteróis intermediários, indicando inibição de 24-SMT (URBINA
et al., 1997).
Estudos em protozoários, também, confirmaram a atividade inibitória de AZA e EIL
em Trypanossoma cruzi (URBINA et al., 1995), L. amazonensis (RODRIGUES et al., 2007;
RODRIGUES et al., 2002), Toxoplasma gondii (DANTAS-LEITE et al., 2004), e Giardia
lamblia (MAIA, C. et al., 2007).
27
Figura 12: Via biosintética do ergosterol e colesterol, mostrando as principais etapas e as enzimas
envolvidas. Em vermelho estão demonstradas as etapas inibidas pelos azóis e azasteróis. Adaptado de:
De Souza e Rodrigues, 2009.
28
Alternativamente, um novo alvo de ação antifúngica parece estar surgindo a partir de
estudos com análogos de fosfolipídios, como a miltefosina. Análogos de lisofosfolipidios
constituem uma ampla classe de compostos metabolicamente estáveis que incluem as
alquilfosfocolinas, tais como a hexadecilfosfocolina (miltefosina). A miltefosina foi
inicialmente desenvolvida como agente antiproliferativo celular para o tratamento do câncer,
porém sua atividade anticancerígena mostrou-se limitada devido a inaceitável toxicidade
gastrointestinal e atividade limitada quando administrada por via oral. No entanto, este
composto tem demonstrado ser eficaz como uma formulação tópica no tratamento de linfomas
cutâneos e foi licenciado na Europa para o tratamento de metástases da pele devido ao câncer
de mama.
Em paralelo, os análogos de fosfolipídios mostraram ter potente atividade
antiparasitária e seletividade, em especial contra parasitas tripanossomatídeos, como
Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi. Esses resultados levaram a estudos clínicos de
administração oral de miltefosina em pacientes com leishmaniose visceral, incluindo aqueles
infectados com cepas de L. donovani resistentes aos antimôniais. A elevada taxa de resposta e
os efeitos colaterais relativamente suaves têm levado muitos pesquisadores a considerar essa
substância como o tratamento oral aguardado para esta condição de risco de vida. A
miltefosina é licenciada, para esta indicação, na India e na Alemanha, bem como na Colômbia
para o tratamento de leishmaniose cutânea.
Dada a sua natureza química e propriedades físico-químicas, esperamos que os
análogos de fosfolipídios sejam capazes de interagir com uma variedade de estruturas
subcelulares e enzimas, particularmente aquelas associadas às membranas celulares. Apesar
deste fato, os resultados de muitos estudos independentes concluíram que a interferência com
um número relativamente pequeno de alvos parece justificar os efeitos biológicos conhecidos
destas substâncias.
29
Por conta da sua estrutura molecular, os análogos de fosfolipidios têm sido
intensamente investigados como potenciais inibidores de enzimas envolvidas na síntese,
degradação ou modificação da membrana lipídica. Os mais investigados são os efeitos destes
análogos na via de síntese de fosfatidilcolina. Estudos têm demonstrado que estes compostos
inibem a síntese deste fosfolipídio essencial em vários tipos celulares e, ainda, outros
pesquisadores relataram uma correlação entre a inibição da síntese de fosfatidilcolina e o
bloqueio da proliferação celular (Revisado em URBINA JA, 2006).
Além disso, um possível mecanismo de ação para estes análogos seria a indução de
apoptose. A diminuição da síntese de fosfocolina irá deprimir a produção de esfingomielina,
já que estas vias biossintéticas são fortemente acoplados, e, por sua vez, levará à elevação dos
níveis intracelulares de ceramida, que é um conhecido indutor de apoptose. Outra
possibilidade, deduzida a partir de estudos em leveduras, é que os níveis intracelulares de
ácido fosfatídico, produzido a partir da hidrólise fosfatidilcolina pela fosfolipase D, são os
principais reguladores do crescimento das células nestes organismos (URBINA JA, 2006).
O metabolismo da miltefosina e edelfosina foi investigado em L. mexicana
por Lux et al. (2000), que verificou que esses compostos inibem uma enzima chave na
remodelação de lipídios. Lira et al. (2001) realizou um estudo detalhado dos efeitos da
miltefosina, edelfosina e ilmofosine na composição de fosfolipídios e esteróis de
epimastigotas de T. cruzi e verificou que a biossíntese de fosfatidilcolina nestas células
procede principalmente através da via Brenmer-Greenberg (transmetilação), que também é a
principal via de fungos, mas só é usado em mamíferos sob condições de privação de colina.
Além disso, os estudos em T. cruzi sugerem que a inibição da síntese de fosfatidilcolina
através da via de Brenmer-Greenberg, especificamente ao nível de fosfatidiletanolamina-
metil-transferase-N, é um efeito primário da atividade antiparasitária destes compostos. Lira
et al. (2001) observaram, ainda, que os IC50 para edelfosina e miltefosina, necessários para
30
inibir a biossíntese de fosfatidilcolina em T. cruzi, foram 10-20 vezes menores do que os
necessários para atingir os mesmos efeitos em células de mamíferos. Estes resultados
explicam a maior seletividade dos análogos de fosfolipidios em protozoários, comparado às
células de mamíferos. Neste mesmo trabalho, ficou demonstrado que os análogos de
fosfolipidios também induzem modificação na composição de esteróis livres em
epimastigotas de T. cruzi, através da inibição da Δ-22-esterol desaturase, provavelmente um
efeito secundário, resultante da alteração na composição fosfolipídica. Esta constatação levou
a uma investigação sobre o possível sinergismo entre a antividade antiproliferativa dos
análogos de fosfolipidios e os inibidores da biossíntese de ergosterol.
Ainda que muitos estudos em protozoários já tenham sido realizados, pouco se sabe
sobre os efeitos dos análogos de fosfolipídios em fungos. Recentemente, Widmer et al. (2006)
demonstraram a atividade inibitória da miltefosina em diversas espécies fúngicas de
importância médica, como: C. albicans, Cryptococcus neoformans e C. gattii, Aspergillus
fumigatus, Fusarium solani, Scedosporium apiospermum, S. prolificans, e alguns
zigomicetos. Entretanto, os mecanismos de ação relacionados a esta atividade antifúngica
permanecem pouco conhecidos.
O estudo de novas moléculas com potencial antifúngico contra os principais agentes
causadores de micoses invasivas é importante para direcionar a busca por substâncias com
maior espectro de ação e seletividade e menor toxicidade, visando o desenvolvimento de
novos agentes antifúngicos.
Diversos tipos de infecções por Candida spp. podem estar relacionadas com a
formação de biofilme. Estas infecções são um sério problema de saúde humana, uma vez que
a sensibilidade das células sésseis aos antifúngicos é reduzida quando comparada às células
plactônicas (HAWSER e DOUGLAS,1995; RAMAGE et al., 2001b). Conseqüentemente, o
31
tratamento destas infecções torna-se complicado e o biofilme pode estabelecer-se como uma
fonte permanente de infecção (DONLAN, 2001).
Dentre os poucos antifúngicos disponíveis para o tratamento de candidemias, apenas
as formulações lipídicas de anfotericina B e as equinocandinas (BACHMANN et al., 2002;
KUHN et al., 2002b) mostraram atividade inibitória sobre o biofilme de Candida spp.. Em
concentração terapêutica (2 µg/mL), a caspofungina foi capaz de reduzir significativamente a
atividade metabólica do biofilme de C. albicans e C. tropicalis (COCUAUD et al., 2005).
Tendo em vista que diversos procedimentos médicos exigem a utilização de
dispositivos internos por longos períodos de tempo, como marca-passos, nutrição parenteral, e
administração de medicamentos por via endovenosa, a disponibilidade de antifúngicos
eficazes na prevenção da formação de biofilmes por C. albicans em dispositivos médicos
torna-se extremamente importante. O reduzido número de classes de drogas disponíveis para
o tratamento de candidemias associadas à formação de biofilmes e a alta incidência de
resistência às drogas disponíveis, demonstra a necessidade de busca de novos compostos com
atividade antifúngica e que também sejam ativos sobre células de biofilmes de C. albicans.
32
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral:
Avaliar a atividade antifúngica de compostos com diferentes mecanismos de ação sobre
células planctônicas e de biofilme de C. albicans.
2.2 Objetivos específicos
Determinar a Concentração Inibitória Mínima e a Concentração Fungicida Mínima de cada
um dos agentes antifúngicos para as células planctônicas de C. albicans;
Avaliar o efeito dos compostos antifúngicos sobre a hidrofobicidade de superfície celular
de cada uma das cepas de C. albicans;
Avaliar as alterações ultraestruturais em cepas de C. albicans tratadas, através de
microscopia eletrônica de transmissão;
Avaliar as alterações no perfil lipídico de C. albicans após tratamento antifúngico;
Avaliar quantitativamente o efeito dos compostos antifúngicos sobre a capacidade de
formação de biofilme de duas cepas de C. albicans;
Avaliar quantitativamente o efeito dos compostos antifúngicos sobre o biofilme maduro de
duas cepas de C. albicans;
Avaliar as alterações morfológicas causadas por compostos antifúngicos adicionados
durante a formação de biofilme por cepas de C. albicans, em cateter venoso central,
utilizando microscopia eletrônica de varredura;
Avaliar as alterações morfológicas causadas por compostos antifúngicos adicionados sobre
o biofilme maduro formado em cateter venoso central por cepas de C. albicans, utilizando
microscopia eletrônica de varredura.
33
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Micro-organismos
Foram utilizadas neste trabalho: uma cepa de C. albicans da American Type Culture
Colection (ATCC 10231) e um isolado clínico de C. albicans (44A), obtido a partir de lavado
gástrico de paciente atendido no Laboratório de Microbiologia e Micologia do Instituto
Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti (HemoRio), Rio de Janeiro, Brazil
(BRAGA-SILVA et al., 2009) e gentilmente cedido por Marcos Dornellas Ribeiro.
3.2 Drogas antifúngicas
Os antifúngicos utilizados como padrão nos experimentos foram: fluconazol (Pfizer),
itraconazol (SIGMA) e anfotericina B (SIGMA). Estas drogas foram diluídas em
dimetilsulfóxido (DSMO) obtendo-se soluções estoque de 2000, 1600 e 1600 μg/mL,
respectivamente. Os compostos 22,26 Azasterol (AZA) e 25-Epiminolanosterol (EIL)
(cedidos pelo pesquisador Dr. Julio Urbina – Caracas, Venezuela) foram diluídos em DMSO
para obtenção das concentrações estoque de 12,5 e 1 mM, respectivamente. Miltefosina
(MLT)(Caymen) e Tcan26 (composto cedido pela Dra. Theodora Calogeropoulou, Institute of
Organic and Pharmaceutical Chemistry, National Hellenic Research Foundation, Grécia),
foram diluídos em DMSO:Etanol (1:1) para a obtenção de concentração estoque de 1,56 e 50
mM, respectivamente. As soluções estoque foram diluídas em RPMI 1640, tamponado com
MOPS, para a obtenção da concentração ideal em cada teste. A concentração final de DMSO
não excedeu 1% para evitar a influência no crescimento das leveduras.
O AZA e o EIL são inibidores sintéticos da enzima ∆24(25) esterol metil transferase
(24-SMT) da via biosintética do ergosterol. Já a MLT e seu análogo sintético Tcan26, são
alquilfosfocolinas (análogos de fosfolipídios) que atuam interferindo no metabolismo lipídico
34
da célula fúngica. A tabela 3 mostras as estruturas químicas de alguns compostos utilizados.
A estrutura química do Tcan26 não está demonstrada porque ainda não foi publicada.
Tabela 3: Estruturas químicas e mecanismos de ação de algumas substâncias antifúngicas utilizadas .
Estrutura química Substância Mecanismo de ação
Anfotericina B
Ligação à molécula de
ergosterol na membrana
fúngica e formação de poros
Fluconazol
Inbição da 14-α-lanosterol
demetilase na biossíntese de
ergosterol
Itraconazol
22-26 Azasterol
Inibição da 24-SMT na
biossíntese de ergosterol
Epiminolanosterol
Miltefosina Alteração do metabolismo
lipídico na célula fúngica
35
3.3 Teste de susceptibilidade in vitro aos agentes antifúngicos
3.3.1 Determinação da concentração inibitória mínima (IC)
A concentração inibitória mínima foi determinada pela técnica de microdiluição em
caldo (Figura 13) descrito no documento M27-A3 (CLSI, 2008). Leveduras cultivadas em
meio Sabouraud dextrose, por 48 h, foram padronizadas para 1-5 x 106
UFC/mL e diluídas
para a obtenção de uma suspensão a 1-5 x 103
UFC/mL, em microplacas de 96 poços. 100 µL
de meio RPMI 1640, com tampão MOPS 0,165 M, foram distribuídos em cada poço da
microplaca, posteriormente, diluições seriadas das drogas foram realizadas para obter
concentrações finais de 0,03 a 16 μg/mL para AZA, EIL, miltefosina e Tcan26; 0,25 a 128
μg/mL para fluconazol (FLU) e itraconazol (ITRA); e 0,015 a 8 µg/mL μg/mL para
anfotericina B (AMB). Um volume de 100 µL da suspensão de leveduras (1-5 x 103
UFC/mL)
foi dispensado nos poços para obter uma concentração fúngica final de 0,5-2,5 x 103
UFC/mL.
As microplacas foram incubadas em uma câmara umidecida, a 35°C. A IC é definida como
menor concentração da droga capaz de inibir o crescimento microbiano in vitro. As
concentrações que inibem o crescimento de leveduras em 50% (IC50) e em 90% (IC90) foram
determinadas no tempo de 48 h, por meio da densidade ótica em comprimento de onda de 492
nm, e a susceptibilidade aos antifúngicos padrão foi avaliada de acordo com os pontos de
corte propostos pelo CLSI (2008), especificados na tabela 4 .
36
Figura 13: Esquema representativo da microdiluição em caldo utilizando diluições seriadas dos
antifúngicos para determinação do IC50 e IC90 de cada um dos compostos. Após a diluição dos
compostos (fileiras 1-10), todos os poços da microplaca, exceto a coluna 12, receberam a mesma
alíquota de suspensão fúngica padronizada.
Tabela 4: Interpretação dos resultados da determinação da IC das drogas padrão (CLSI, 2008)
Antifúngicos Concentração (µg/mL)
Susceptível (S) Susceptível dose-dependente (SDD) Resistente (R)
Fluconazol ≤ 8 16-32 ≥ 64
Itraconazol ≤ 0,125 0,25-0,5 ≥ 1
Anfotericina B < 2 - ≥ 2
3.3.2 Determinação da concentração fungicida mínima (CFM)
Após a determinação da IC da droga, uma alíquota de 2 µL das concentrações
inibitórias de cada droga foi semeada na superfície de agar Sabouraud dextrose isento de
droga, incubadas a 35 °C por 48 h. A CFM foi obtida pela observação da menor concentração
da droga onde não houve crescimento de colônias. O efeito fungicida foi considerado
quando a CFM for igual ou até 4 vezes maior que o valor de IC (PFALLER et al., 2004).
3.4 Efeito das drogas sobre a hidrofobicidade de superfície celular (HSC)
A determinação da hidrofobicidade de superfície celular foi feita utilizando a uma
metodologia baseada na afinidade das leveduras por um hidrocarboneto.
37
Leveduras tratadas ou não com as drogas, em RPMI 1640 tamponado com MOPS por
24h a 35 °C, foram centrifugadas a 3300 rpm por 10 min, lavadas em PBS 0,05M pH 7,4
estéril, e resuspendidas no mesmo tampão. A absorbância da suspensão de leveduras foi
determinada em espectrofotômetro, em comprimento de onda de 660 nm. Posteriormente, a
suspensão de leveduras em PBS foi coloca em contato com xileno, em proporção 2,5:1; v/v.
Os tubos falcon contendo a mistura foram agitados por 2 min e deixados em repouso por 20
min. A absorbância da fase aquosa foi determinada, e o índice de hidrofobicidade (IH) foi
calculado utilizando a fórmula: IH = (Asuspensão – Axileno) x 100 / Asuspensão ; na qual: Asuspensão é
absorbância da suspensão de levedura em PBS e Axileno é a absorbância da fase aquosa obtida
após a adição de xileno (TEIXEIRA et al., 1993).
3.5 Análise de lipídeos
Acomposição lipídica da membrana células planctônicas do isolado clínico 44A foi
avaliada em duas condições distintas de crescimento: na ausência e na presença de duas
concentrações sub-inibitórias de miltefosina. O estudo do perfil lipídico foi realizado com
objetivo de investigar se o mecanismo de ação antifúngica desta substância, um análogo de
fosfolipídio, estaria relacionado ao metabolismo lipídico da célula. Para a determinação deste
perfil foram avaliados dois grupos de lipídios presentes em grande quantidade na mebrana
celular fúngica: lipídeos neutros e lipídeos polares. O grupo de lipídeos polares foi ainda
dividido em fosfolipídios e ácidos graxos.
3.5.1 Extração e separação de lipídeos neutros (LN) e polares (LP)
Leveduras de C. albicans (isolado 44A) foram tratadas com miltefosina, em diferentes
concentrações previamente diluídas em meio RPMI 1640, tamponado com MOPS, por 48h, a
35 ⁰C. Os lipídeos totais de membrana de leveduras foram extraídos com uma mescla de
clorofórmio:metanol (2:1, v/v), filtrados e concentrados à pressão reduzida. As amostras de
38
lipídeos foram ressuspendidas em clorofórmio e aplicadas em uma coluna de sílica gel (100
mesh, Sigma Aldrich), previamente ativado a 100 °C, por 24 h. Os lipídeos neutros (LN) e
polares (LP) foram separados utilizando clorofórmio e uma mescla de clorofórmio:metanol
(1:1, v/v), respectivamente (BLIGH; DYER, 1959). Depois da separação, os LN e LP foram
secos por pressão reduzida e armazenados a -70 °C, até as próximas análises, como descrito a
seguir.
3.5.2 Análise de lipídeos neutros
As frações de LN foram analisadas por cromatografia em fase gasosa, acoplada à um
espectrômetro de massas (CG-EM) para a análise quantitativa e estrutural dos lipídeos
(VISBAL & SAN-BLAS, 2007). Os lipídeos neutros foram separados em uma coluna capilar
de alta resolução HP-5 ultra 2 (25 m de comprimento, 0,20 mm de diâmetro interno, 5%
difenil e 95 % dimetil polisiloxano com 0,33 mm de espessura) em um cromatógrafo a gás,
modelo CG 5890 series II (Hewlett Packard), equipado com um detector de massas HP5972
(Hewlett Packard). Brevemente, os lipídeos foram diluídos em clorofórmio e injetados em
uma coluna, que foi mantida a 50 °C, por 1 min, em seguida, foi realizado um aumento
crescente da temperatura até alcançar 280 °C em uma taxa de aumento de 25 °C /min, e
finalmente, um aumento a 300 °C na taxa de 1 °C /min. O fluxo da fase móvel gasosa (hélio)
foi mantido constante a 0,6 mL/min e as temperaturas do injetor e do detector foram mantidas
a 250 °C e 280 °C, respectivamente.
3.5.3 Análise de fosfolipídios
A fração de LP, que contém, principalmente, fosfolipídios, foi ressuspendida em 50
µL de uma mescla de clorofórmio:metanol (2:1, v/v) e um volume de 10 µL da amostra foi
aplicado em uma placa sílica gel de dimensões de 10 x 20 cm (fase estacionária). As amostras
foram eluídas da sílica gel usando uma mescla de clorofórmio:metanol: 32% amoníaco p/v
39
(17:7:1, por volume) (fase móvel) (CUZNER et al., 1967). Paralelamente às amostras, foram
aplicados padrões de fosfolipídios (todos da Sigma Aldrich): L-α-fosfatidil-DL-glicerol, L-α-
ácido fosfatídico dipalmitoil, L-α-fosfatidil-N1N-dimetil etanolamina dipalmitoil, L-α-
fosfatidil-L-serina, L-α-fosfatidilcolina, L-α-fosfatidilinositol, 3-sn- L-α-ácido fosfatídico e
L-α-fosfatidiletanolamina. Os fosfolipídios separados por CCD foram revelados com iodo, e o
fator de retenção (Rf) de cada substância foi calculado, sendo a razão da distância do percurso
da substância (cm) e a distância do percurso da fase móvel (cm).
3.5.4 Análise de ácidos graxos
Para a análise de ácidos graxos esterificados, a fração de LP foi dissolvida em 200 µL
de clorofórmio, e uma alíquota 50 µL de cada fração foi transmetilada pela adição de 200 µL
de H2SO4 5% em metanol, em banho-maria a 60 °C, por 1h. Posteriormente, a reação foi
parada adicionando 200 µL de água destilada (GUCKERT et al., 1985). Os ácidos graxos
esterificados foram extraídos com éter de petróleo, secos e quantitativamente analisados pelo
CG-MS, como descrito anteriormente para análise de LN.
3.6 Formação de biofilme por C. albicans
3.6.1 Condições de cultivo
As cepas de C. albicans foram cultivadas em agar Sabouraud dextrose a 35 °C por 24 h,
e, em seguida, em caldo Sabouraud a 35 °C, por 24h. As leveduras foram lavadas em PBS
0,01 M, pH 7,2 e padronizadas a 1 x 107 UFC/mL em meio RPMI 1640 tamponado com
MOPS e suplementado com 2% de glicose e 20% de Soro Fetal Bovino (SFB) (adaptado de
JIN, Y. et al., 2003, 2004; NIKAWA et al., 2000).
40
3.6.2 Formação do biofilme
O biofilme foi formado na superfície de poliestireno da microplaca de 96 poços.
Primeiramente, 100 μL da suspensão fúngica (1 x 107 UFC/mL) foi dispensada nos poços, e
incubadas a 37 °C por 1,5 h, sob agitação. Após esse período as placas foram lavadas com
PBS 0,01 M estéril e 100 μL de meio RPMI 1640 suplementado com 2% de glicose e 20%
SFB foi adicionado em cada um dos poços. As placas foram incubadas por até 48 h a 35 °C,
sob agitação constante (adaptado de KUHN et al., 2002a).
3.6.3 Quantificação do biofilme
A quantificação do biofilme formado em microplaca de 96 poços foi realizada através
do ensaio de redução do sal 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino) carbonil]-
2H-hidróxido de tetrazolium (XTT)(Sigma). O biofilme foi lavado com PBS e 150 μL de
solução XTT-menadiona em PBS, onde a concentração final é de 0,5mg/mL de XTT e 1mM
de menadiona (Sigma), foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas por 2 h, a
35 °C e ao abrigo da luz. Foram transferidos para uma placa de 96 poços, 100 μL da solução
para a leitura da absorbância em 490 nm (adaptado de BIZERRA et al., 2008).
3.7 Efeito do tratamento com compostos antifúngicos no biofilme
3.7.1 Efeito da adição dos compostos durante a formação do biofilme
Inicialmente, 100 μL de suspensão fúngica padronizada (1 x 107 UFC/mL) foi
dispensada nos poços de uma microplanca de 96 poços, e esta incubada a 35 °C, por 1,5 h,
sob agitação. Após este período de aderência, as placas foram lavadas com PBS 0,01 M
estéril e 100 μL de diferentes concentrações das drogas, diluídas em meio RPMI 1640,
tamponado com MOPS, suplementado com 2% de glicose e 20% de SFB, foram adicionados
nos poços. As placas foram incubadas por até 48 h, a 35 °C, sob agitação. O sobrenadante foi
41
descartado e o biofilme foi lavado em tampão PBS. A quantificação do biofilme foi realizada
pela redução do XTT (Figura 14) (BRAGA et al., 2008).
3.7.2 Efeito dos compostos no biofilme maduro
O biofilme foi formado por 48 h na superfície da placa de poliestireno, como descrito
anteriormente. Após esse período, o sobrenadante foi retirado e o biofilme foi lavado com
PBS 0,01 M, pH 7,2. Em seguida foram adicionados à placa 100 μL das diferentes
concentrações das drogas, previamente diluídas em meio RPMI 1640, tamponado com
MOPS, suplementado com 2% de glicose e 20% de SFB e a placa foi incubada a 35 °C, sob
agitação, por mais 48 h. O sobrenadante foi descartado, o biofilme foi lavado em tampão PBS
e a quantificação foi realizada pela redução do XTT (Figura 14) (CHANDRA et al., 2008).
Figura 14: Esquema representativo dos testes in vitro utilizados para a determinação da atividade de
drogas na formação e no biofilme maduro; e da quantificação por reação com XTT. Cada fileira (A-G)
da placa de 96 poços recebeu 100 µL de um composto antifúngico nas concentrações determinadas
entre colchetes (64, 16, 4 vezes maior ou igual a IC de cada droga). Todos os poços receberam 100 µL
de suspensão antifúngica padronizada, exceto os poços 7-9 da fileira H, que receberam apenas meio de
cultura. Os poços 1-6 da fileira H receberam apenas suspensão fúngica e são isentos de drogas
(controle positivo). Após a incubação com XTT:Menadiona, a intensidade de cor laranja formada pela
presença do composto formazan é proporcional à concentração de células viáveis em cada poço.
42
3.8 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
O cateter intravenoso central do tipo BD Intracath™ em biomaterial Vialon™, de 1.7
mm de diâmetro e 61 cm de comprimento, foi cortado para a obtenção de secções de
aproximadamente 5 mm. Estas secções de cateter, com biofilmes controle e tratados com
drogas em concentração 16 ou 8 vezes maior que a respectiva IC50 ou IC90 obtida para as
células planctônicas, foram processados para MEV. Os cateteres foram lavados em PBS 0,01
M, pH 7,2, fixados em glutaraldeído 2,5% e paraformaldeído 4%, em tampão cacodilato 0,1
M, por 1 h, a temperatura ambiente. Posteriormente, os cateteres foram lavados no mesmo
tampão e pós fixados em tetróxido de ósmio 1 % e ferrocianeto de potássio 1,25 % por 2h.
Em seguida, foram desidratados em concentrações crescentes de etanol (30, 50, 70, 90, 100%)
e etanol ultra-seco, durante 30 min em cada concentração. As amostras foram secas, em ponto
crítico de CO2, metalizadas com ouro e observadas em microscópio eletrônico de varredura
Jeol JSM-5310.
3.9 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
As suspensões de células tratadas ou não, por 48h, a 35 °C, com concentração sub-IC90
de miltefosina foram processadas para MET. As suspensões foram lavadas em PBS 0,01 M,
pH 7,2, fixadas em glutaraldeído 2,5% e paraformaldeído 4%, em tampão cacodilato 0,1 M,
por 1 h, a temperatura ambiente. Posteriormente, as células foram lavadas no mesmo tampão
e pós fixadas em tetróxido de ósmio 1 % e ferrocianeto de potássio 1,25 % por 2h. Em
seguida, foram desidratados em concentrações crescentes de etanol (30, 50, 70, 90, 100%) e
etanol ultra-seco durante 30 min em cada concentração. Após a desidratação, as amostras
foram infiltradas, gradativamente, em mistura de resina spurr:etanol (1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1) e,
em seguida, em spurr puro, overnight, a temperatura ambiente. Os materiais foram incluídos
em spurr com DMAE, por 48 h, a 60 °C. Os blocos foram cortados e os cortes ultrafinos
43
coletados em grades de cobre para contrastação com acetato de uranila 5%, por 45 minutos, e
citrato de chumbo, por 5 minutos. A observação do material foi feita em microscópio Zeiss
900.
3.10 Análise estatística
Os resultados obtidos nos itens 3.4 e 3.7 foram analisados utilizando o programa
PRISM 5.0, e o intervalo de confiança de 95% foi considerado estatisticamente significativo.
44
4 RESULTADOS
4.1 Perfil de susceptibilidade aos agentes antifúngicos
4.1.1 Determinação da concentração inibitória minima
Os resultados do teste de susceptibilidade aos antifúngicos padrão (fluconazol,
itraconazol e anfotericina B), aos inibidores da 24-SMT (AZA e EIL) e aos análogos de
fosfolipídios (miltefosina e Tcan 26), podem ser vistos na tabela 5. Nela podemos observar as
concentrações, em microgramas por mililitro (μg/mL), capazes de inibir 50% e 90% do
crescimento fúngico, em relação ao controle, das duas cepas de C. albicans utilizadas neste
estudo, frente a cada um dos inibidores. Esta determinação foi realizada no tempo de 48 h, por
meio da densidade ótica, em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 492 nm.
Dentre os antifúngicos padrão, a anfotericina B mostrou menores valores de IC50 e
IC90 para ambas as cepas. A cepa ATCC 10231 não foi sensível ao tratamento com AZA,
enquanto que o isolado clínico (44A) apresentou valores de IC50 e IC90 significativamente
baixos, semelhantes aos antifúngicos padrão, para este mesmo composto. Ambas as cepas
mostraram-se sensíveis ao EIL, com valores de IC50 semelhantes ao fluconazol. Os análogos
de fosfolipídios mostraram IC90 de 4 μg/mL para ambas as cepas e, tanto a MLT quanto o
Tcan26, demonstraram atividade fungicida para a cepa 44A, com valor de CFM igual e duas
vezes maior que o IC90, respectivamente.
4.1.2 Determinação da concentração fungicida minima
Os resultados do ensaio de determinação do efeito fungicida podem ser vistos na
tabela 6, onde observamos a concentração fungicida mínima (CFM), em μg/mL, de cada um
dos inibidores, para cada cepa de C. albicans. Esta determinação foi realizada no tempo de 48
horas, por meio de leitura visual da ausência de crescimento fúngico.
45
Tabela 5: Susceptibilidade das cepas de C. albicans aos inibidores da 24-SMT, aos análogos de fosfolipídios e aos antifúngicos padrão, analisados pelo
método da microdiluição em caldo. Resultados de CI50 e CI90 estão expressos em µg/mL.
Fluconazol Itraconazol Anfotericina B Azasterol EIL MLT Tcan 26
IC50 IC90 IC50 IC90 IC50 IC90 IC50 IC90 IC50 IC90 IC50 IC90 IC50 IC90
C. albicans
ATCC 10231 1 >128
T 0,5 >16
T 0,12 0,06 >16 >16 1 >16 2 2 4 4
C. albicans
44A 1 4 0,12 0,5
SDD 0,12 0,25 0,25 1 2 4 * 4 * 4
*Não foi possível determinar o IC50
t: Efeito ―trailling‖
SDD: Susceptível dose-dependente
Tabela 6: Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) dos inibidores da 24-SMT (AZA e EIL) e dos análogos de fosfolipidios (MLT e Tcan 26)
contra cepas de C. albicans.
22,26 Azasterol EIL MLT Tcan 26
C. albicans ATCC 10231 >16 >16 * *
C. albicans 44A * >16 4 8
46
* Não foram determinados.
47
4.2 Efeito das drogas sobre a Hidrofobicidade de Superfície Celular (HSC)
De acordo com Hazen et al. (2000), leveduras com índice de hidrofobicidade celular
menor que 10% são classificadas como células hidrofílicas, enquanto leveduras com índice
maior que 90%, são consideradas hidrofóbicas.
As suspensões de células de C. albicans tratadas com os inibidores da 24-SMT (AZA
e EIL), com os análogos de fosfolipidios (miltefosina e Tcan 26) e com as drogas padrão
(fluconazol, itraconazol e anfotericina B) tiveram sua hidrofobicidade de superfície
determinada através de metodologia baseada na afinidade celular por hidrocarboneto
insolúvel (TEIXEIRA et al., 1993). A HSC das células após o tratamento com os agentes
antifúngicos foi comparada à HSC da célula controle não tratada.
Os índices de hidrofobicidade (IH) calculados para cada uma das cepas de C. albicans
anteriormernte e posteriormente ao tratamento com os agentes antifúngicos, assim como para
os controles não tratados, estão descritos nas tabelas 7 e 8.
O tratamento da cepa ATCC com fluconazol, em concentrações iguais ao IC50
para esta droga, resultou em diminuição significativa na HSC, enquanto o tratamento com
azasterol, também em concentrações iguais ao IC50, determinou aumento significativo da
hidrofobicidade superficial da célula. Os tratamentos com itraconazol, anfotericina B e EIL
(tabela 7), bem como com miltefosina e Tcan26 (tabela 8) na cepa ATCC não determinaram
alterações significativas de hidrofobicidade de superfície. Da mesma maneira, no isolado
clínico, enquanto fluconazol, itraconazol, anfotericina B, AZA, EIL e miltefosina não
alteraram a HSC, o tratamento com Tcan26 determinou redução significativa (tabelas 7 e 8)
da mesma.
48
Tabela 7: Índice de hidrofobicidade celular de leveduras em suspensão após tratamento com AZA, EIL, fluconazol (FLU), itraconazol (ITRA), ou
anfotericina B (AMB), nas concentrações de IC50 de cada substância.
Controle
X ± DPM
FLU
X ± DPM
ITRA
X ± DPM
AMB
X ± DPM
AZA
X ± DPM
EIL
X ± DPM
C. albicans ATCC 10231 21.93 ± 0.7850 13.03 ± 0.2618 ** 17.75 ± 2.697 39.87 ± 9.750 46.69 ± 2.874 * 21.83 ± 4.959
C. albicans 44A 42.96 ± 3.803 22.20 ± 7.186 38.02 ± 2.549 41.79 ± 5.001 43.93 ± 6.025 33.48 ± 2.877
X: Média; DPM: Desvio Padrão da Média.
* Estatisticamente diferente, onde p<0,05 (teste t-Student).
** Estatisticamente diferente, onde p<0,01 (teste t-Student).
Tabela 8: Índice de hidrofobicidade celular de leveduras em suspensão após tratamento com miltefosina (MLT) ou Tcan26, nas concentrações de IC90 de cada
substância.
Controle
X ± DPM
MLT
X ± DPM
Tcan 26
X ± DPM
C. albicans ATCC 10231 18.90 ± 4.512 19.52 ± 2.018 28.28 ± 3.327
C. albicans 44A 45.25 ± 3.808 42.40 ± 3.633 24.49 ± 0.4768 *
X: Média; DPM: Desvio Padrão da Média.
* Estatisticamente diferente, onde p<0,05 (teste t-Student).
** Estatisticamente diferente, onde p<0,01 (teste t-Student).
49
Em relação aos controles positivos, crescidos na ausência de antifúngicos, a cepa de C.
albicans ATCC 10231 mostrou-se menos hidrofóbica do que o isolado clínico, C. albicans
44A, com índices de hidrofobicidade em torno de 21 e 45, respectivamente (figura 15).
Hidrofobicidade de Superfície Celular
ATCC 10231 44A0
10
20
30
40
50 ***
Índ
ice
de
Hid
rofo
bic
ida
de
Figura 15: Comparação entre os índices de hidrofobicidade obtidos para as células controle das cepas
ATCC 10231 e 44A de C. albicans.
*** Estatisticamente diferentes, onde p<0,0005.
4.3 Alterações ultraestruturais após tratamento com miltefosina
Células de C. albicans 44A em suspensão, controle e tratadas com 3µg/mL de
miltefosina, foram avaliadas por microscopia eletrônica de transmissão. A concentracão de
3µg/mL (inferior a IC90) foi escolhida para que houvesse crescimento celular significativo na
presença da droga, ainda que com alterações morfológicas.
A figura 16 apresenta as alterações morfológicas na célula após o tratamento com
miltefosina (Figura 16 C-F), em relação à célula controle de C. albicans 44A (Figura 16 A-B).
Na figura 16 A-B observamos a ultraestrutura da levedura controle, não tratada, que
possui forma definida, fibrilas bem compactadas, parede celular homogênea e delimitada,
com a membrana celular justaposta e citoplasma homogêneo. Em contrapartida, células
tratadas com miltefosina (Figura 16 C-F) apresentaram espessamento e afrouxamento das
50
fibrilas (setas pretas na figura 16 C e E, respectivamente), parede celular espessada em
determinados pontos (setas vermelhas nas figuras 16 E-F), alterações na integridade da
membrana celular (setas amarelas na figura 16 D-F), e presença de invaginações de
membrana celular (setas amarelas na figura 16 D-E). A divisão celular por brotamentos
parece ser afetada pelo tratamento com a miltefosina, pois, muitas células filhas
apresentaram-se extremamente alteradas (* na figura 16 E). Em algumas células tratadas com
miltefosina foi possível observar inchaço mitocondrial (m, figuras 16 C e F), presença de
vacúolos eletrondensos (v, figura 16 C) e citoplasma granuloso (Figura 16 F).
51
Figura 16: Micrografias de microscopia eletrônica de transmissão de C. albicans 44A controle (A-B) e
tratada com 3 μg/mL de miltefosina (C-F). Células controle apresentaram membrana celular contínua
(mp, em B), parede celular homogênea e compacta (pc, em B) e fibrilas organizadas e compactadas (f,
em B). As células tratadas mostram desorganização e afrouxamento das fibrilas (setas pretas em C e
E), invaginações e alterações na membrana celular (setas amarelas em D-F), aumento da espessura da
parede celular (setas vermelhas em E-F), vacúolos (v, em C) e inchaço mitocondrial (m, em C e F).
As leveduras tratadas apresentaram alteração de forma celular (C-F) e brotamentos alterados (* em C).
Barras correspondem a 0,5 μm em A,B,C e E, e a 1 μm em D e F.
52
53
4.3.1 Análise de esteróis
As células controle de C. albicans (44) apresentaram o esqualeno como esterol
majoritário (88,87%), seguido de colesterol e ergosterol (Tabela 9). Quando as leveduras
foram tratadas com concentrações sub-inibitórias de miltefosina, foi verificada presença de
ergosterol em 39,5%, sobretudo quando o tratamento foi feito com 0,5 µg/mL do composto.
Entretanto, o aumento da síntese de ergosterol na maior concentração utilizada, de 1 µg/mL,
não foi proporcional à concentração de droga utilizada, como o esperado (Tabela 9). É
importante relatar que na concentração de 1 µg/mL de miltefosina observou-se, por meio de
um microscópio de luz, a presença de ―debris‖ celulares , o que poderia ter influenciado na
perda de lipídeos durante o processo de extração. O número de células na amostras controle e
tratadas foi padronizado antes da realização da análise, assim, as porcentagens de esteróis
encontradas se relacionam a uma mesma concentração de células, em cada uma das situações
analisadas.
Tabela 9: Porcentagem relativa de esteróis extraídos de leveduras de C. albicans 44A não tratadas
(controle) e tratadas com miltefosina (concentrações em µg/mL), obtido por meio de um cromatógrafo
gasoso acoplado a um espectro de massas.
Esteróis (Peso molecular) Tempo de retenção (min) Controle 0,5 µg/mL 1 µg/mL
Esqualeno (410) 16,20 88,87 56,04 83,04
Colesterol (386) 21,61 6,15 4,44 6,80
Ergosterol (396) 23,37 4,97 39,50 10,15
54
4.3.2 Análise de fosfolipídios
Uma análise qualitativa do perfil de fosfolipídios extraídos de leveduras tratadas com
diferentes drogas pode ser avaliada por meio de uma cromatografia em camada delgada.
Os padrões de fosfolipídios utilizados neste trabalho foram testados previamente em
por meio de uma cromatografia em camada delgada de sílica gel, onde os Rfs foram
determinados: (1) L-α-fosfatidil-DL-glicerol (Rf=não detectado), (2) L-α- ácido fosfatidico
dipalmitoil (Rf=0), (3) L- α -fosfatidil-N1N-dimetil etanolamino dipalmitoil (Rf=0,62), (4) L-
α-fosfa-L-serina (Rf=não detectado), (6) L-α-fosfatidilcolina (Rf=0,38), (7) L-α-
fosfatidilinositol (Rf=0,21), (8) 3-sn-L-α- ácido fosfatidico de sódio (Rf=0,16) e (9) L-α-
fosfatidiletanolamina (Rf=0,52). Colunas (5) e (10) são mesclas dos padrões de fosfolipídios.
Esses valores de Rf serão utilizados para identificar as manchas encontradas em
cromatograma de amostras de lipídeos polares analisadas posteriormente.
Na amostra de leveduras de C. albicans 44A controle foi possível identificar todos os
fosfolipídios com Rf determinado em experimento anterior (Figura 17). No entanto, o
crescimento em meio RPMI 1640, tamponado com MOPS, contendo 0,5 ou 1,0 µg/mL de
miltefosina parece afetar a síntese de fosfolipídios, diminuindo qualitativamente a síntese de
(2), (6) e (8). Considerando que estes são, respectivamente, ácido fosfatídico dipalmitoil,
fosfatidilcolina e ácido fosfatídico de sódio, o tratamento de C. albicans com concentrações
subinibitórias de MLT parece determinar alterações nos níveis de fosfolipídios, em especial
os derivados de fosfatidilcolina. Devemos considerar o efeito inibitório drástico que a
miltefosina exerce sobre o crescimento de C. albicans (44A) em concentração igual ou
superior a 4,0 µg/mL (concentração inibitória mínima – IC), apresentando 100 % de inibição
do crescimento fúngico. Adicionalmente, em concentrações ≤ 1,0 µg/mL, miltefosina não
apresenta nenhum efeito inibitório. Interessantemente, esta droga apresenta efeito fungicida
em leveduras tratadas com a IC90 (4 µg/mL) e concentrações acima da IC90.
55
Figura 17: Cromatografia em camada delgada da fração polar de lipídeos extraídos de C. albicans
(44A) tratada com 0,5 e 1,0 µg/mL de miltefosina, em meio RPMI 1640, por 48 h, a 35 °C. A
concentração inibitória que inibiu 100% do crescimento fúngico foi de 4,0 µg/mL. Concentrações das
drogas estão µg/mL.
56
57
4.3.3 Análise de ácidos graxos
Após a reação de esterificação dos ácidos graxos com 5% H2SO4 em metanol, as
amostras foram analisadas em um cromatógrafo a gás acoplado a um espectrômetro de
massas. Podemos observar a presença de ésteres de ácidos graxos em C. albicans 44A, tais
como: ácido palmitoleico (C16:1), ácido palmítico (C16:0), ácido linolenico (C18:3), ácido
linoleico (C18:2), ácido oleico (C18:1) e ácido esteárico (C18:0).
O ácido graxo majoritário, em C. albicans 44A controle, foi o ácido palmítico (C16:0)
(Tabela 10). Foi possível identificar pequenas alterações no perfil de ácidos graxos em células
de C. albicans (44A) tratadas com miltefosina, em concentrações de 0,5 e 1 µg/mL, como o
aumento de ácido oleico (C18:1) e ácido linolenico (C18:3), quando comparado com as
células controle (Tabela 10).
Tabela 10: Porcentagem relativa de ésteres de ácidos graxos extraídos de leveduras de C. albicans
(44A) controle e tratadas com 0,5 e 1 µg/ml de miltefosina, obtidos por meio de um cromatógrafo à
gás acoplado a um espectrômetro de massas.
Miltefosina
Ácidos graxos Tempo de
retenção (min) Controle 0,5 µg/mL 1,0 µg/mL
C16:1 17,92 6,7 6,2 5,4
C16:0 18,35 26,4 32,7 19,9
C18:3 18,97 23,9 21,6 29,7
C18:2 22,54 15,0 11,9 13,0
C18:1 22,70 22,3 22,4 27,3
C18:0 23,30 5,5 5,1 4,6
58
4.4 Avaliação quantitativa dos efeitos da adição de drogas em diferentes
fases de desenvolvimento do biofilme de C. albicans
4.4.1 Avaliação do feito da adição de drogas durante a formação do biofilme
A formação de biofilme por C. albicans ATCC 10231 na presença dos azóis
(fluconazol e itraconazol), em concentrações iguais ao IC50 das células planctônicas, e em 4,
16 e 64 vezes maiores que o IC50, não foi reduzida significativamente, quando comparada ao
biofilme controle, formado na ausência de drogas (Figura 18). Contudo, o número de células
viáveis no biofilme de C. albicans ATCC 10231 formado na presença de fluconazol mostrou
uma pequena redução que, apesar de não ser estatisticamente significativa para as
concentrações testadas, apresenta um padrão dose-dependente (Figura 18).
A formação de biofilme por C. albicans ATCC 10231 foi significativamente reduzida
(p<0,05) quando na presença de concentracões de 8 μ g/mL de anfotericina B (concentração
64 vezes maior do que o IC50), mas o mesmo não ocorreu com concentracões menores desta
droga (Figura 18). A cepa ATCC 10231 mostrou formação de biofilme significativamente
reduzida (p<0,01) quando na presença de 256 μg/mL de AZA, mas concentracões menores
desta droga não resultaram em redução do biofilme formado (Figura 19). A atividade
metabólica do biofilme formado na presença de EIL, em todas as concentracões testadas
(igual ao IC50, 4 e 16 vezes maior que o IC50), foi semelhante à do controle (Figura 19).
Dentre os análogos de fosfolipidios, a miltefosina, em concentracões de 32 μg/mL (16
vezes maiores que IC90), reduziu significativamente (p<0,05) a formação do biofilme,
enquanto que concentracões menores desta droga não mostraram os mesmos resultados
(Figura 19). A adição de Tcan26, em todas as concentracões testadas, durante o
desenvolvimento do biofilme de C. albicans ATCC 10231, levou a formação de um biofilme
significativamente (p<0,05) reduzido, quando comparado ao controle (Figura 19).
59
Fluconazol
Controle 1 4 16 64 0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490 n
m)
Itraconazol
Controle 0,5 2 8 320.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Concentração(g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Anfotericina B
Controle 0,12 0,5 2 80.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
*
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490 n
m)
Figura 18: Redução de formação de biofilme por C. albicans ATCC 10231 na presença de drogas
padrão em concentrações iguais ao IC50 e 4, 16 e 64 vezes maiores, sendo a menor concentração em
cada gráfico igual ao valor de IC50 da droga.
*Estatisticamente diferente, onde p<0,05 (teste de t-Student)
60
AZA
Controle 16 64 2560.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
**
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490 n
m)
EIL
Controle 1 4 160.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490 n
m)
Miltefosina
Controle 2 8 320.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
*
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbâ
nc
ia (
49
0 n
m)
Tcan 26
Controle 4 16 640.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
**
*
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbâ
nc
ia (
49
0n
m)
Figura 19: Redução de formação de biofilme por C. albicans ATCC 10231 na presença de inibidores
da 24-SMT e análogos de fosfolipidios em concentrações iguais ao IC50 (AZA e EIL) ou IC90
(miltefosina e Tcan 26), 4 e 16 vezes maiores, sendo a menor concentração em cada gráfico igual ao
valor de IC50 ou IC90 da droga.
*Estatisticamente diferente, onde p<0,05 (teste de t-Student)
**Estatisticamente diferente, onde p<0,01 (teste de t-Student)
61
A susceptibilidade do isolado cínico (44A) aos antifúngicos padrão não foi semelhante
à cepa ATCC 10231 (Figuras 18 e 20). O biofilme de C. albicans 44A, quando formado na
presença de 16 e 64 μg/mL de fluconazol (16 e 64 vezes maiores que o IC50,
respectivamente), mostrou atividade metabólica significativamente reduzida (p<0,05 e
p<0,01, respectivamente) em relação ao controle (Figura 20). A adição de itraconazol ou
anfotericina B, em concentracões até 64 vezes maiores que o IC50 destas substâncias, não
alterou a capacidade de formação de biofilme do isolado clínico (Figura 20). A atividade
metabólica das células no biofilme formado na presença de anfotericna B mostrou redução
com padrão dose-dependente, mas não siginicativa em relação ao controle (Figura 20).
Os biofilmes de C. albicans 44A, formados na presença de diferentes concentrações
dos inibidores da 24-SMT, mostraram atividade metabólica semelhante ao controle, formado
na ausência das drogas (Figura 21). Entretanto, os análogos de fosfolipidios mostram-se
capazes de reduzir a formação de biofilme por esta cepa. A adição de concentrações de 16 e
32 μg/ml de miltefosina (4 e 8 vezes maiores que o IC50) culminaram em redução
significativa (p<0,05) do biofilme formado ao final de 48h (Figura 21). Da mesma maneira,
redução significativa foi obtida quando concentracões de 64 μg/mL de Tcan26 (16 vezes
maiores que o IC50) foram adicionadas durante a formação do biofilme do isolado clínico
(Figura 21).
62
Fluconazol
Controle 1 4 16 64 0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
* **
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Itraconazol
Controle 0,12 0,5 2 80.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Anfotericina B
Controle 0,06 0,25 1 40.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Figura 20: Redução de formação de biofilme por C. albicans 44A na presença de drogas padrão em
concentrações iguais ao IC50 e 4, 16 e 64 vezes maiores, sendo a menor concentração em cada gráfico
igual ao valor de IC50 da droga.
*Estatisticamente diferente, onde p<0,05 (teste de t-Student)
**Estatisticamente diferente, onde p<0,01 (teste de t-Student)
63
AZA
Controle 0,25 1 40.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490 n
m)
EIL
Controle 2 8 320.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490 n
m)
Miltefosina
Controle 4 16 320.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
**
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Tcan 26
Controle 4 16 640.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
*
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490 n
m)
Figura 21: Redução de formação de biofilme por C. albicans 44A na presença de inibidores da 24-
SMT (AZA e EIL) em concentrações iguais ao IC50, 4 e 16 vezes maiores, e na presença de análogos
de fosfolipidios (miltefosina e Tcan26) em concentrações iguais ao IC90, 4 e 8 ou 16 vezes maiores. A
menor concentração em cada gráfico é referente ao valor de IC50 ou IC90 da droga.
*Estatisticamente diferente, onde p<0,05 (teste de t-Student)
64
4.4.2 Avaliação do efeito da adição de drogas ao biofilme maduro
Em biofilmes maduros de C. albicans ATCC 10231, formados em placas de 96 poços,
por 48h, o tratamento com diferentes concentrações de azois, por 48h adicionais, não reduziu
a massa final de biofilme, em relação ao controle (Figura 22). Entretanto, o tratamento do
biofilme maduro com anfotericina B, nas concentrações de 2 e 8 μg/ml (16 e 64 vezes
maiores que o IC50, respectivamente) determinaram reduções significativas (p<0,05 e p<0,01,
respectivamente) na atividade metabólica da massa final de células que compõe o biofilme
(Figura 22).
O tratamento de biofilmes maduros, formados pela cepa ATCC 10231, com inibidores
da 24-SMT, em concentrações iguais e maiores que o IC50 de cada uma das drogas, não
reduziu a atividade metabólica final do biofilme. Da mesma maneira, após o tratamento de
biofilmes maduros desta cepa com análogos de fosfolipídios, nenhuma redução significativa
de viabilidade celular foi observada, em relação ao biofilme controle (Figura 23).
O biofilme maduro formado por C. albicans 44A, após ser tratado, por 48h adicionais,
com fluconazol, itraconazol, anfotericina B, inibidores da 24-SMT ou análogos de
fosfolipidios, mostrou atividade metabólica final semelhante ao biofilme controle, em todas as
concentrações utilizadas (Figuras 24-25). Entretanto, o tratamento de biofilmes maduros do
isolado clínico (44A) com 4 μg/mL de Tcan26 (concentração igual ao IC90) determinou
aumento significativo (p<0,05) na massa final de biofilme (Figura 25).
65
Fluconazol
Controle 1 4 16 640.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Itraconazol
Controle 0,5 2 8 320.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Anfotericina B
Controle 0,12 0,5 2 80.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
***
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490 n
m)
Figura 22: Redução do biofilme maduro de C. albicans ATCC 10231 após a adição de drogas padrão
em concentrações iguais ao IC50 e 4, 16 e 64 vezes maiores, sendo a menor concentração em cada
gráfico igual ao valor de IC50 da droga.
*Estatisticamente diferente, onde p<0,05 (teste de t-Student)
**Estatisticamente diferente, onde p<0,01 (teste de t-Student)
66
AZA
Controle 16 64 2560.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490 n
m)
EIL
Controle 1 4 160.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Miltefosina
Controle 2 8 320.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Tcan 26
Controle 4 16 640.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Figura 23: Redução do biofilme maduro de C. albicans ATCC 10231 após a adição de inibidores da
24- SMT e análogos de fosfolipidios em concentrações iguais ao IC50 (AZA e EIL) ou IC90
(miltefosina e Tcan 26), 4 e 16 vezes maiores, sendo a menor concentração em cada gráfico igual ao
valor de IC50 ou IC90 da droga.
67
Fluconazol
Controle 1 4 16 640.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Itraconazol
Controle 0,12 0,5 2 80.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Anfotericina B
Controle 0,06 0,25 1 40.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Figura 24: Redução do biofilme maduro de C. albicans 44A após a adição de drogas padrão, em
concentrações iguais ao IC50 e 4, 16 e 64 vezes maiores, sendo a menor concentração em cada gráfico
igual ao valor de IC50 da droga.
68
AZA
Controle 0,25 1 40.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
EIL
Controle 2 8 320.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Miltefosina
Controle 4 16 320.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Tcan 26
Controle 4 16 640.0
0.1
0.2
0.3
0.4
*
Concentração (g/mL)
Ab
so
rbân
cia
(490n
m)
Figura 25: Redução do biofilme maduro de C. albicans 44A após a adição de inibidores da 24-SMT
(AZA e EIL) em concentrações iguais ao IC50, 4 e 16 vezes maiores, e após a adição de análogos de
fosfolipidios (miltefosina e Tcan26) em concentrações iguais ao IC90, 4 e 8 ou 16 vezes maiores. A
menor concentração em cada gráfico é referente ao valor de IC50 ou IC90 da droga.
*Estatisticamente diferente, onde p<0,05 (teste de t-Student)
69
4.5 Alterações morfológicas após a adição de drogas em diferentes fases de
desenvolvimento do biofilme de C. albicans em catéter venoso central
4.5.1 Alterações por adição de drogas durante a formação do biofilme
A formação de biofilmes de C. albicans ATCC 10231 e C. albicans 44A, em cateter
venoso central (CVC), na presença de concentrações 16 vezes maiores que o IC50 de
fluconazol, AZA e EIL, 8 e 16 vezes maiores que o IC90 de miltefosina e Tcan26,
respectivamente, foi analizada em relação ao biofilme controle crescido na ausência de
drogas. Para esta análise de alterações morfológicas foi utilizada a microscopia eletrônica de
varredura (MEV).
O biofilme formado, por 48 h, por C. albicans ATCC 10231 (figuras 26 A-B, 27 A-B)
mostrou menor densidade de células do que o formado pela cepa de C. albicans 44A (figuras
28 A-B, 29 A-B).
As células de C. albicans ATCC 10231 aderidas ao cateter, na ausência de drogas,
apresentaram formato de levedura, com abundantes brotamentos e poucos filamentos (Figuras
26-B, 27-B). A adição de 16 μg/mL de fluconazol ao cateter durante o desenvolvimento do
biofilme da cepa ATCC levou à redução do número de células aderidas ao dispositivo (figura
26-C), além de determinar alterações na morfologia de algumas células (figura 26-D e inset).
Em contrapartida, a adição de 256 μg/mL de AZA ao cateter levou ao aumento no número de
células aderidas (figura 26-E) e não pareceu determinar alterações morfológicas às células,
que apresentaram-se íntegras, leveduriformes e com abundância de brotamentos (figura 26-F).
O tratamento com EIL (16 μg/mL), no entanto, levou a redução pronunciada da aderência de
leveduras ao cateter e, além disso, as células crescidas na presença desta droga parecem estar
maiores do que as células do biofilme controle (Figura 26 G-H).
70
Os análogos de fosfolipídios, ao serem adicionados ao CVC, durante a formação do
biofilme de C. albicans ATCC 10231, determinaram alterações significativas na morfologia
celular (Figura 27 D e F). Os cateteres, após adição de miltefosina ou Tcan26, em
concentracões de 32 e 64 μg/ml, respectivamente, (16 vezes maiores que o IC90 de cada
droga) apresentaram células aderidas em quantidade semelhante ao controle (Figuras 27 C e
E), porém, as células tratadas parecem estar aumentadas (análise visual), quando comparadas
ao controle, e a formação de brotamentos parece estar bastante alterada (Figuras 27 D e F,
insets).
71
Figura 26: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans ATCC 10231 (A e B) e formado na
presença de 16 μg/mL de FLU(C-D), 256 μg/mL de AZA (E e F) e 16 μg/mL de EIL (G e H) por 48h,
a 35 ºC. Barras correspondem a 500 μm em A,C,E,G e 10 μm em B,D,F,H. Insets com barras de 10
μm (D) e 5 μm (H). É Possivel observar alterações na quantidade de células aderidas ao cateter após o
tratamento com FLU, AZA e EIL, em relação ao controle nao tratado.
72
73
Figura 27: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans ATCC 10231 (A e B) e formado na
presença de 32 μg/mL de miltefosina (C-D) e 64 μg/mL de Tcan26 (E e F), por 48h, a 35 °C. Barras
correspondem a 500 μm em A,C,E e 10 μm em B,D,F. Insets em D e F com barras de 5 μm. É
possível observar alterações tanto na densidade de células aderidas à superfície do cateter quanto na
divisão celular nos biofilmes formados na presença de MLT e Tcan26, em relação ao biofilme
controle.
74
75
O biofilme formado por C. albicans 44A na ausência de drogas mostrou-se altamente
filamentado, com ampla aderência de células e praticamente todo o cateter apresentava-se
revestido por filamentos (Figuras 28 A e 29 A). As hifas formadas mostraram-se longas e com
brotamentos em abundância (Figuras 28 B e 29 B).
A adição de 16 μg/mL de fluconazol ao cateter durante a formação do biofilme, do
isolado clínico 44A, determinou significativa redução no número de células aderidas ao
dispositivo (Figura 28 C) e na filmentação das células, que apresentavam-se majoritariamente
como leveduras e pseudo-hifas (Figura 28 D), não apresentando hifas longas e multibrotantes,
como o controle. A adição de AZA, em concentracão de 4 μg/mL, ao biofilme em formação
não determinou redução da massa final de células no cateter e estas apresentaram-se pouco
alteradas (hifas onduladas) em relação às células controle (Figura 28 E-F). A formação de
estruturas largas e com superfície rugosa e irregular, lembrando uma hifa alterada, foi
observada tanto em biofilmes tratados com AZA (Figura 28 E-F) quanto em biofilmes
controle (dado não mostrado). Esta estrutura, provavelmente, é formada por fios do cateter
que se desprendem durante a secção com a navalha. Entretanto, o tratamento do biofilme em
formação com 32 μg/mL de EIL culminou em redução drástica do número de células aderidas
ao cateter e inibiu completamente a filamentação das células, que apresentaram-se
exclusivamente sob a forma de leveduras (Figura 28 G-H).
Da mesma maneira, a adição de análogos de fosfolipidios ao biofilme em formação
reduziu a massa final de células aderidas e inibiu a formação de hifas, em C. albicans 44A
(Figura 29). Concentrações de 32 μg/mL de miltefosina e 64 μg/mL de Tcan26 determinaram
menor formação de biofilme (Figura 29 C e E) e alterações na morfologia das leveduras que,
visualmente, parecem, também, estar maiores do que as células controle (Figura 29 D e F).
76
Figura 28: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans 44A (A e B) e formado na presença de 16
μg/mL de FLU(C-D), 4 μg/mL de AZA (E e F) e 32 μg/mL de EIL (G e H) por 48h, a 35 °C. Barras
correspondem a 500 μm em A,C,E,G e 10 μm em B,D,F,H. Observamos tanto a redução da densidade
de células aderidas à superfície do cateter quanto a inibição da filamentação, nos biofilmes formados
na presença de FLU e EIL, em relação ao controle. Nenhuma alteração foi observada em biofilmes
formados na presença de AZA.
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78
Figura 29: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans 44A (A e B) e formado na presença de 32
μg/mL de miltefosina (C-D) e 64 μg/mL de Tcan26 (E e F), por 48h, a 35 °C. Barras correspondem a
500 μm em A,C,E e 5 μm em B,D,F. Observamos tanto a redução da densidade de células aderidas à
superfície do cateter quanto a inibição da filamentação nos biofilmes formados na presença de MLT e
Tcan26, em relação ao controle.
79
80
4.5.2 Alterações morfológicas por adição de drogas ao biofilme maduro
Após 96 horas totais de incubação, em meio rico em glicose (2%) e SFB (20%),
leveduras de ambas as cepas, ATCC e 44A, de C. albicans formaram biofilmes densos e
altamente filamentados, por toda a extensão do CVC, com o qual estiveram em contato. Os
biofilmes controle de ambas as cepas (Figuras 30 A-B, 31 A-B, 32 A-B e 33 A-B) formaram
hifas longas e abundantes em ramificações e brotamentos.
O tratamento do biofilme maduro de C. albicans ATCC 10231, formado por 48h, em
meio de cultura rico em glicose (2%) e SFB (20%), com 16 μg/mL de fluconazol, por 48h
adicionais, reduziu discretamente a extensão de cateter colonizado por leveduras, mas não
interfiriu na densidade final da rede de filamentos que compõe o biofilme (Figura 30 C-D).
Por outro lado, o tratamento com 256 μg/mL de AZA ou com 16 μg/mL de EIL, reduziu
significativamente a colonização do cateter por leveduras (Figuras 30 E e G), e , ainda, inibiu
a formação da rede de hifas, característica do biofilme controle. O tratamento com AZA
inibiu completamente a formação de hifas e o biofilme, ao final da incubação, apresentava-se
composto, exclusivamete, por células leveduriformes e com a presença de muitas células
alongadas (Figura 30-F). O biofilme tratado com EIL, ao final da incubação com a droga,
apresentava cadeias de pseudo-hifas e brotamentos leveduriformes abundantes (Figura 30-H),
alem de algumas células bastante alteradas quanto à forma (inset na figura 30-H).
A adição de 32 μg/mL de miltefosina e 64 μg/mL de Tcan26 ao biofilme maduro da
cepa ATCC 10231 levou a redução drástica da área do cateter colonizada (Figura 31 C e E).
Após o tratamento com miltefosina, as células apresentavam alguns filamentos curtos e
muitas células leveduriformes (Figura 31-D). O tratamento com Tcan26, entretanto, levou a
inibição total da filamentação das células, onde todas apresentavam–se leveduriformes, além
da presença de células alongadas, semelhantes a bastonetes (Figura 31-F).
81
Já o biofilme de C. albicans 44A, não teve sua densidade ou extensão reduzidas após
o tratamento com 16 μg/mL de fluconazol, por 48h (Figura 32-C). As células, ao final da
incubação, não apresentavam-se alteradas com relação ao controle (Figura 32-D). Da mesma
maneira, o tratamento do biofilme maduro com 4 μg/mL de AZA ou 32 μg/mL de EIL, não
determinou redução da colonização do cateter ou da densidade do biofilme formado sobre ele
(Figura 32 E e G). Entretanto, células com alterações de forma mostraram-se presentes nos
biofilmes tratados com AZA ( inset na figura 32-F).
Os análogos de fosfolipidios apresentaram comportamento diferente frente ao biofilme
maduro de C. albicans 44A. Enquanto o tratamento com 32 μg/mL de miltefosina (8 vezes o
IC90 desta droga) não foi capaz de reduzir a extensão do cateter colonizada por leveduras
(Figura 33 C), 64 μg/mL de Tcan26 (16 vezes o IC90 desta droga) determinou redução
significativa tanto da extensão quanto da espessura do biofilme sobre o cateter (Figura 33 E).
A adição de miltefosina ao biofilme, apesar de não reverter a densidade de biofilme já
formado, determinou alterações significativas na forma celular. O biofilme final, após o
tratamento com miltefosina, apresentava células em grumos (Figura 33-D) e com alterações
de forma (inset na figura 33-D). Ainda, ao final do tratamento com Tcan26, as células ainda
aderidas ao cateter apresentavam-se exclusivamente leveduriformes, com presença de
algumas pseudo-hifas e muitos brotamentos (Figura 33 F), demonstrando a inibição da
filamentação destas células pelo Tcan26. Além disso, visualmente, algumas células parecem
estar aumentadas em relação ao controle (Figura 33 F).
82
Figura 30: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans ATCC 10231 (A e B) e após a adição de
16 μg/mL de FLU(C-D), 256 μg/mL de AZA (E e F) e 16 μg/mL de EIL (G e H), ao bifilme já
formado, por 48h, a 35 °C. Barras correspondem a 500 μm em A,C,E,G; 10 μm em B,D,F,H e 5 μm no
inset (H). é Possivel observar tanto a redução da densidade de células aderidas à superfície do cateter
quanto a inibição da filamentação, nos biofilmes apos a adição de FLU, AZA e EIL, em relação ao
controle.
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84
Figura 31: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans ATCC 10231 (A e B) e após a adição de
32 μg/mL de miltefosina (C-D) e 64 μg/mL de Tcan26 (E e F), ao biofilme já formado, por 48h, a 35
°C. Barras correspondem a 500 μm em A,C,E e 10 μm em B,D,F. Observamos tanto a redução da
densidade de células aderidas à superfície do cateter nos biofilmes apos a adição de MLT e Tcan26,
quanto a inibição da filamentação, nos biofilmes adicionados de Tcan26, quando comparados ao
controle.
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Figura 32: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans 44A (A e B) e após a adição de 16 μg/mL
de FLU(C-D), 4 μg/mL de AZA (E e F) e 32 μg/mL de EIL (G e H), ao biofilme já formado, por 48h,
a 35 °C. Barras correspondem a 500 μm em A,C,E,G; 10 μm em B,D,F,H e 5 μm no inset (F).
Observamos alterações de superfície celular em biofilmes tratados com AZA. A adição detes
antifúngcos não alterou nem densidade de células aderidas ao cateter nem filamentação.
87
88
Figura 33: Micrografias de MEV de biofilme de C. albicans 44A (A e B) e após a adição de 32 μg/mL
de miltefosina (C-D) e 64 μg/mL de Tcan26 (E e F), ao biofilme já formado, por 48h, a 35 °C. Barras
correspondem a 500 μm em A,C,E; 10 μm em B,D,F e 5 μm no inset (D). É Possivel observar grumos
de celular com alterações de superfície em biofilmes tratados com MLT. Biofilmes tratados com
Tcan26 exibem tanto redução na densidade de células aderidas à superfície do cateter quanto inibição
da filamentação, quando comparado ao controle.
89
90
A comparação entre os resultados descritos nos tópicos 4.5 e 4.6 pode ser vista na
tabela 11.
91
Tabela 11: Resumo do perfil de atividade dos agentes antifúngicos, nas duas fases de desenvolvimento do biofilme, formado sobre dois substratos diferentes.
Análise quantitativa do biofilme em poliestireno (placa de 96 poços) por redução de XTT e avaliação visual do cateter tratado quanto a redução de densidade e
filamentação das células fúngicas, em relação ao cateter controle não tratado.
C. albicans ATCC 10231 C. albicans 44A
Poliestireno
(Avaliação quantitativa)
Cateter
(Avaliação visual)
Poliestireno
(Avaliação quantitativa)
Cateter
(Avaliação visual)
Formação Maturação Formação Maturação Formação Maturação Formação Maturação
Fluconazol N N S S S (16 μg/mL) N S N
Itraconazol N N * * N N * *
Anfotericina B S (8 μg/mL) S (2-4 μg/mL) * * N N * *
Azasterol S (256 μg/mL) N N S N N N N
EIL N N S S N N S N
Miltefosina S (32 μg/mL) N N S S (16 μg/mL) N S N
Tcan26 S (64 μg/mL) N N S S (64 μg/mL) N S S
* Drogas não utilizadas no ensaio
N – Não reduziu significativamente o biofilme
S – Redução significativa de biofilme
(Menor concentração que determinou redução significativa do biofilme, ao final do experimento)
92
5 DISCUSSÃO
A candidemia tem demonstrado importância cada vez maior em casos de infecções
hospitalares e, em culturas sanguíneas, Candida spp. já é o quarto patógeno mais
freqüentemente isolado em hospitais (COLOMBO et al., 2006). A disseminação desta
levedura, por via hematogênica, ocorre, muitas vezes, em consequência ao uso de catéteres
intravasculares, sondas gástricas ou prótese valvular cardíaca, estando, constantemente,
associada à formação de biofilmes na superfície destes dispositivos (SENEVIRATNE, 2008).
No biofilme, as leveduras encontram-se aderidas à superfície do dispositivo médico e
embebidas em uma matriz extracelular polimérica. Em relação às células planctônicas, as
leveduras do biofilme apresentam fenótipo alterado no que diz respeito à expressão gênica,
taxa de crescimento e, principalmente, mostram-se menos susceptíveis aos tratamentos
antifúngicos disponíveis do que as células em suspensão (DONLAN e COSTERTON, 2002).
Para o tratamento das candidemias, no Brasil, utiliza-se anfotericina B e fluconazol.
Kuhn et al. (2002b) já demonstraram que apenas as formulações lipossomais de anfotericina
B e as equinocandinas possuem atividade contra biofilmes de Candida spp.. Esse cenário
atual ilustra a necessidade de novas alternativas para o tratamento das candidíases
disseminadas, principalmente, aquelas relacionadas à formação de biofilmes.
Assim, neste trabalho, quatro compostos, que mostraram-se ativos contra células
planctônicas, foram estudados a fim de determinar se os mesmos também possuiam atividade
inibitória no desenvolvimento do biofilme de C. albicans.
Nosso estudo mostrou que a susceptibilidade das células planctônicas de C. albicans
ATCC 10231 ao fluconazol, itraconazol e anfotericina B foi similar a do isolado clínico de C.
albicans (44A) e ambas mostraram-se susceptíveis aos três antifúngicos. Tobudic et al.
(2010), demonstraram que 0,25 μg/mL de anfotericina B inibe completamente o crescimento
93
de C. albicans ATCC 10231. Em outro estudo, Ramage et al. (2001c) mostraram que, outras
cepas ATCC de C. albicans, têm seu crescimento inibido por 0,25-0,5 μg/mL de anfotericina
B ou 0,25-16 μg/mL de fluconazol. Estes resultados são similares aos encontrados em nosso
trabalho, onde 0,06 μg/mL de anfotericina B ou 1 μg/mL de fluconazol inibiram em 90% e
50%, respectivamente, o crescimento de C. albicans ATCC 10231. Da mesma maneira,
Nguyen et al. (1998) mostraram que 0,125 μg/mL de itraconazol são necessários para inibir o
crescimento de cepas ATCC de C. albicans. Posteriormente, concentrações de 0,03 μg/mL
deste mesmo antifúngico foram demonstradas como suficientes para inibir 80% do
crescimento da cepa ATCC 10231 de C. albicans (MAEBASHI et al., 2001). No nosso
estudo, o IC50 encontrado para itraconazol, com a cepa ATCC 10231, foi de 0,5 μg/mL.
Com relação ao isolado clínico 44A, os valores de IC50 e IC90 encontrados neste
trabalho, são semelhantes aos reportados em estudos epidemiológicos de diferentes grupos de
pesquisa. Ostrosky-Zeichner et al. (2003), em um estudo com 2000 isolados clínicos,
encontraram IC50 e IC90 de 0,06 e 0,25 μg/mL, respectivamente, para anfotericina B. Esse
resultado se assemelha ao encontrado para o isolado 44A no nosso trabalho e, também, ao
encontrado por outros grupos (COLOMBO et al., 2006; JAIN et al.,2007; ISHIDA et al.,
2009). Com relação aos azois, Tortorano et al. (2005) mostraram, em um estudo com 375
isolados clínicos, um IC90 de 4 μg/mL para o fluconazol, que foi o mesmo valor encontrado
para C. albicans 44A em nosso trabalho. Em estudos com grandes amostragens, os isolados
clínicos tendem a apresentar valores médios de IC50 e IC90, para itraconazol, bastante baixos,
em torno de 0,03 e 0,06 μg/mL, respectivamente (DA MATTA et al., 2007). Esse valores são
relativamente mais baixos do que o encontrado para o isolado clínico 44A em nosso estudo
(0,12 e 0,5 μg/mL para IC50 e IC90, respectivamente). Ostrosky-Zeichner et al. (2003),
também utilizando ampla amostragem, encontraram média de 0,5 μg/mL para IC90 do
itraconazol. Em um outro trabalho, utilizando 561 isolados clínicos de Candida spp., o IC
94
para itraconazol variou entre 0,03 e 16 μg/mL, tendo 19,1% (n=107) destes isolados
demonstrado perfil de susceptibilidade dose-dependente (IC50 entre 0,25-0,5 μg/mL) para este
antifúngico (BORG-VON ZEPELIN et al., 2007), como ocorreu, também, para o isolado
clínico 44A, em nosso estudo. Além disso, Braga-Silva et al. (2009) já haviam reportado que
o isolado clínico 44A apresenta efeito ―trailing‖ para o itraconazol. O termo "trailling" é
usado para descrever o crescimento reduzido, mas persistente, que alguns isolados de C.
albicans e C. tropicalis apresentam em concentrações acima da IC da droga, em testes de
diluição em caldo, com antifúngicos azólicos, como fluconazol e itraconazol.
Nossos resultados mostraram, ainda, que este isolado clínico 44A, apesar de
apresentar susceptibilidade menor do que a esperada para itraconazol, é bastante sensível ao
tratamento com azasteróis, com IC50 de 0,25 μg/mL para o AZA e 2 μg/mL para o EIL. Estes
valores são semelhantes aos encontrados para um outro azasterol, o 15-azasterol, tanto em
Saccharomyces cerevisae quanto C. albicans (GEORGOPAPADAKOU et al., 1987; HAYS
et al., 1977). Recentemente, em um screening com 65 isolados clínicos de Candida spp.,
Ishida et al. (2009), mostraram valores de IC50 e IC90 para AZA e EIL, em C. albicans,
semelhantes ao encontrado aqui para o isolado 44A. Ainda, assim como para 44A, os isolados
analisados no estudo de Ishida et al. (2009) apresentaram IC50 menor para AZA (media de 0,5
μg/mL) do que para EIL (media de 2 μg/mL), mostrando uma maior sensibilidade dos
isolados clínicos a este azasterol. Entretanto, em estudos com protozoários, o EIL mostrou
maior atividade inibitória do que o AZA (URBINA et al., 1995; RODRIGUES et al., 2002,
2007) e, da mesma maneira, em nossos estudos, as células planctônicas da cepa ATCC 10231
de C. albicans, também, apresentaram-se mais susceptíveis ao EIL, com IC50 de 1 μg/mL,
comparados ao AZA que obteve IC50 maior que 16 μg/mL para esta cepa. Nosso grupo de
pesquisa, recentemente, mostrou que EIL possuiu ação antifúngica contra C. neoformans e C.
95
gatti similar ao encontrado para Candida albicans, com medianas de IC50 de 1 e 2 µg/mL,
respectivamente (GUERRA, 2009; COSTA, 2009).
As células planctônicas de C. albicans ATCC 10231 e do isolado clínico 44A foram,
ainda, susceptíveis ao tratamento com os dois análogos de fosfolipídios, miltefosina e Tcan26.
A miltefosina é uma alquilfosfocolina e sua atividade antifúngica já foi demonstrada por
outros estudos (WIDMER et al., 2006). C. albicans ATCC 10231 e 44A mostraram-se
susceptíveis à miltefosina, com valores de IC90 de 2 e 4 μg/mL, respectivamente, e estes
valores foram similares aos encontrados por OBANDO et al. (2007), em um trabalho com a
mesma cepa, ATCC 10231, e por WIDMER et al. (2006), em um trabalho com isolados
clínicos. Em ambos os estudos (OBANDO et al., 2007; WIDMER et al., 2006), a IC
encontrada foi de 2 μg/mL. Em uma amostragem de 14 isolados clínicos de C. albicans,
WIDMER et al. (2006) encontrou, para miltefosina, CFM de 4 μg/mL. Da mesma maneira,
em nosso trabalho, a miltefosina mostrou-se fungicida na mesma concentração, frente ao
isolado clinico de C. albicans 44A.
As alquilfosfocolinas, como a miltefosina, possuem similaridade estrutural com os
substratos naturais de fosfolipase B1 (PLB1) de fungos, fosfatidilcolina e lisofosfatidilcolina
(WIDMER et al., 2006). Além disso, alquil-bis-fosfocolinas estão presentes em plantas
medicinais com atividade antifúngica conhecida (LU Q et al., 1999).
Com base nas alterações de metabolismo lipídico descritas para outros organismos,
como Leishmania spp. (CROFT et al., 2003; LUX et al., 1996; ZUFFREY et al., 2002), onde
o tratamento com miltefosina inibe a síntese de fosfatidilcolina, a biossíntese de ancoras de
glicosilfosfatidilinositol e a absorção de colina, é possível que as alterações da forma celular,
membrana plasmática e parede celular, observadas em isolado clínico de C. albicans (44A)
tratado com concentrações subinibitórias de miltefosina estejam, portanto, relacionadas ao
desequilíbrio das vias biossintéticas de fosfolipídios de membrana e alteração do metabolismo
96
lipídico celular. Entretanto, outros mecanismos parecem estar envolvidos na ação desta droga
em C. albicans, pois, a análise qualitativa do perfil de fosfolipídios de leveduras tratadas com
miltefosina não apresentou alterações pronunciadas e, principalmente, os níveis de
fosfatidilcolina e fosfatidilinositol não apresentaram alterações em relação ao controle. Assim,
outros alvos de ação ainda não conhecidos, independentes do metabolismo lipídico,
provavelmente, existem para miltefosina, em C. albicans. Em Cryptococcus spp., o
tratamento com miltefosina leva a inibição dose-dependente da atividade da lisofosfolipase
transacilase (LPTA) e da PLB1 (WIDMER et al. 2006). A associação da inibição da atividade
de PLB1 e de LPTA com a atividade antifúngica in vitro e in vivo é interessante, pois, a
atividade da PLB parece ser necessária para a adesão às células epiteliais do pulmão, onde o
Cryptococcus inicia sua infecção no hospedeiro, enquanto LPTA parece estar associada à
síntese de membranas, remodelação e reparação. Portanto, miltefosina pode exercer um efeito
antifúngico interferindo tanto nas paredes celulares criptocócica quanto na bioquímica da
membrana celular. Como PLB1 é essencial para a adesão do Cryptococcus às células de
mamíferos e para a disseminação hematogênica da infecção, a inibição desta enzima por
miltefosina pode impedir a progressão da infecção (WIDMER et al., 2006).
Além disso, a miltefosina é ativa contra Leishmania donovani, outras espécies de
Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi em cultura de células e, ainda, existem evidências de
que fosfolipases estão ativas em ambos esses parasitas e que podem ser inibidas por
alquilfosfonados (WIDMER et al., 2006). Portanto, o tratamento com análogos de
fosfolipídios nas cepas de C. albicans no nosso trabalho pode estar, também, levando a
inibição da atividade das fosfolipases e, provavelmente, reduzindo a virulência destas
leveduras.
Além da secreção de enzimas hidrolíticas, outros fatores de virulência de C. albicans
podem ser afetados pelos agentes antifúngicos testados, como a aderência e, associado à ela, a
97
hidrofobicidade de superfície celular. O processo de adesão de Candida às superficies
abióticas é complexo e envolve fatores biológicos, como adesinas, e fatores não-biológicos,
como atração de Van der Waals e forças hidrofóbicas. A HSC é considerada uma força física
envolvida em processos não especializados de aderência de Candida spp. tanto às células
hospedeiras quanto às superficies abióticas e às proteínas de matriz extracelular (ANIL S et
al., 2001).
A capacidade de aderência de C. albicans às células teciduais do hospedeiro está
diretamente relacionada à patogenicidade desta levedura, que é, também, influenciada pela
HSC. Esta relação pode ser confirmada por estudos onde leveduras que apresentam alta
hidrofobicidade de superfície mostram-se mais virulentas do que leveduras hidrofílicas
(HAZEN et al., 1988). A correlação entre HSC e aderência é, entretanto, controversa em
relação às células hospedeiras e está, também, relacionada à interações específicas, mediadas
por adesinas e fatores de transcrição especializados (VERSTREPEN et al., 2006). Porém, em
relação às superfícies abióticas, a hidrofobicidade de superfície, tanto da célula fúngica
quanto do substrato, apresenta correlação significativa com a capacidade de aderência das
leveduras (YOSHIJIMA et al., 2010). Assim, tanto as características de hidrofobicidade
inerentes à superfície da própria célula, quanto aquelas inerentes à superfície sobre a qual a
levedura irá aderir, mostram-se importantes para que a fixação ao substrato seja eficiente.
Desta maneira, a formação de biofilmes em CVC, bem como em outras superfícies, também
estará relacionada à HSC da cepa causadora da infecção e à composição do cateter utilizado
no paciente.
A análise de HSC demonstrou que as células planctônicas do isolado clínico 44A
possuem superfície celular mais hidrofóbica do que a da cepa ATCC 10231. A maior
hidrofobicidade do isolado clínico pode ser responsável por determinar a formação de
biofilmes mais densos por esta cepa, em relacão ao biofilme formado pela cepa ATCC 10231,
98
em cateter venoso central. Li, X et al. (2003) já demonstraram, em isolados clínicos de C.
albicans, a correlação positiva entre HSC e formação de biofilme em poliestireno, onde as
cepas de maior HSC também foram as maiores formadoras de biofilme. Entretanto, ambas as
cepas utilizadas no nosso estudo formaram biofilmes com atividade metabólica semelhante
em poliestireno (placas de 96 poços), apesar de diferirem significativamente em relação à
HSC. Chandra et al. (2005) mostraram que a composição química da superfície influencia na
capacidade de formação de biofilmes por Candida spp. e que estas alterações químicas no
substrato podem alterar tanto densidade quanto morfologia do biofilme formado. Em um
estudo recente, Yoshijima et al. (2010), demonstraram que a redução da hidrofobicidade de
superfície do acrílico, por tratamento químico, reduziu a aderência das leveduras. Desta
forma, as diferenças de composição química entre a superficie de poliestireno e o CVC podem
estar influenciando na capacidade de aderência das cepas de C. albicans utilizadas em nosso
estudo. Além disso, Yoshijima et al. (2010), também, demonstraram que a conversão de
leveduras em hifas aumentou a HSC dos isolados de Candida spp. e, também, a aderência ao
acrílico. Assim, a maior densidade do biofilme formado pela cepa 44A, em nosso trabalho,
pode estar, também, relacionada à maior conversão de leveduras em hifas observada para esta
cepa, durante o desenvolvimento do biofilme, em comparação ao biofilme formado por C.
albicans ATCC 10231. Portanto, concluimos que, tanto a composição química da superfície
quanto a HSC das células estão envolvidas na aderência ao dispositivo de uso médico e,
modificações destes dois parâmetros são responsáveis pelas diferenças de comportamento de
cada cepa frente aos substratos.
Atualmente, muitos estudos tentam demonstrar os efeitos dos agentes antifúngicos na
HSC e a relação destas alterações com a capacidade de aderência destas células aos tecidos e
às supefícies abióticas. A maior parte destes estudos utiliza concentrações subterapeuticas de
azóis e anfotericina B e os resultados obtidos parecem controversos (ELLEPOLA et al.,1998;
99
HAZEN et al., 2000; ANIL, S., 2001). Anil, S. et al.(2001) demonstraram que o tratamento de
suspensões de leveduras de C. albicans com anfotericina B e fluconazol reduzem a HSC.
Estes resultados são similares ao encontrado, no nosso trabalho, em C. albicans ATCC 10231,
onde o tratamento de suspensões com fluconazol reduziu significativamente a HSC . Esta
redução, no entanto, não parece influenciar na formação de biofilme em poliestireno, pois, a
adição de fluconazol, durante as diferentes fases de desenvolvimento do biofilme, não
determinou redução no número final de células, em relação ao controle. No entanto, em CVC,
a adição de fluconazol durante a formação do biofilme reduziu significativamente o número
de células aderidas, em relação ao controle e esta redução pode estar relacionada à menor
HSC das células tratadas. Este comportamento corrobora com a afirmação de que a formação
de biofilmes, em C. albicans, relaciona-se diretamente com a HSC (LI X et al., 2003).
De forma geral, o biofilme formado em CVCs, pela cepa mais hidrofóbica, o isolado
clínico 44A, apresentou maior extensão e densidade do que aquele formado pela cepa ATCC.
Estes dados reproduzem o encontrado por Li, X. et al (2003), com relação à maior formação
de biofilmes pelos isolados de maior HSC. Da mesma maneira, o biofilme formado a partir do
isolado clínico, tanto em poliestireno quanto em CVC, mostrou-se menos susceptível ao
tratamento com agentes antifúngicos do que o biofilme formado pela cepa ATCC 10231.
O perfil de susceptibilidade de biofilmes de Candida spp. a agentes antifúngicos vem
sendo relatado em diversos estudos, onde cepas de C. albicans foram testadas quanto a
susceptibilidade a anfotericina B e aos azóis, sob forma planctônica e em biofilmes.
A anfotericina B inibe o crescimento células planctônicas, em 50%, com
concentrações de 0,06-0,5 μg/mL, enquanto concentrações de 1-8 μg/mL foram necessárias
para alcançar a mesma inibição quando as células encontravam-se em biofilme. (CHANDRA
et al., 2001; RAMAGE et al., 2001b; KUHN et al., 2002b; MUKHERJEE et al., 2004; JAIN,
et al., 2007; SHUFFORD et al., 2007; TOBUDIC et al., 2010). Da mesma maneira,
100
concentrações de 0,25-16 μg/mL de fluconazol são necessárias para inibir o crescimento, em
50%, de células planctônicas de C. albicans enquanto 128-256 μg/mL de fluconazol fizeram-
se necessárias para inibir 50% do crescimento destas células em biofilme (RAMAGE et al.,
2001c; KUHN et al., 2002a, 2002b; MUKHERJEE et al., 2004). Estes resultados são
similares aos encontrados em nossos estudos com cepas de C. albicans ATCC e 44A.
Em nosso estudo, o biofilme da cepa ATCC 10231, assim como relatado por Tobudic
et al. (2009), mostrou-se significativamente reduzido quando sua formação ocorreu na
presença de 8 μg/mL de anfotericina B, ou quando foi tratado, após sua maturação, com 2-8
μg/mL do mesmo antifúngico. Entretanto, concentrações maiores que 8 μg/mL parecem ser
necessárias para interferir na formação de biofilme pelo isolado clínico 44A.
Assim, como reportado por outros estudos com C. albicans (RAMAGE et al., 2001c;
KUHN et al., 2002a, 2002b; MUKHERJEE et al., 2004), concentrações maiores que 64
μg/mL de fluconazol são necessárias para reduzir a formação de biofilme por ambas as cepas,
ATCC 10231 e 44A.
No presente trabalho, concentrações de itraconazol superiores a 32 e 8 μg/mL parecem
ser necessárias para reduzir a formação de biofilme por C. albicans ATCC 10231 e 44A,
respectivamente. Valores semelhantes foram encontrados por Hawser e Douglas (1995) em
um estudo onde concentrações entre 9,9 e 40 μg/mL de itraconazol foram necessárias para
inibir 50% da atividade metabólica do biofilme formado por isolados de C. albicans.
Recentemente, a baixa atividade antibiofilme dos azóis, também, foi demonstrada para
C. parapsilosis, por Ruzicka et al. (2007) em um trabalho onde o IC50 de células sésseis (em
biofilme), para fluconazol e itraconazol, foi maior que 256 μg/mL.
Nenhum estudo demonstrando a susceptibilidade de biofilmes de C. albicans aos
inibidores de 24-SMT ou a análogos de fosfolipídios foi ainda publicado. Neste trabalho, os
perfis de susceptibilidade de biofilmes de C. albicans, frente a dois inibidores da 24-SMT e a
101
dois análogos de fosfolipídios foram avaliados e os análogos de fosfolipidios mostraram
melhor perfil inibitório no processo de formação e maturação do biofilme de C. albicans do
que os inibidores da 24-SMT.
Os inibidores da 24-SMT (AZA e EIL) utilizados mostraram perfil inibitório
semelhante ao fluconazol, tanto em poliestireno quanto em CVC, provavelmente, por conta do
mecanismo de ação similar destes agentes. Tanto AZA e EIL quanto fluconazol, possuem
como alvo de ação a via biossintética do ergosterol, no interior da célula fúngica. Estas droga
precisam, portanto, penetrar através da matriz extracelular (MEC) do biofilme pra chegar à
levedura e, ainda, entrar na célula para inibir seu crescimento.
Os análogos de fosfolipídios, parecem exercer seus efeitos sobre as células fúngicas
alterando o metabolismo lipídico das mesmas. Por serem estruturalmente semelhantes aos
fosfolipídios de membrana celular, esta ação sobre o metabolismo pode ocorrer diretamente
na membrana plasmática, bem como por inibição de vias biossintéticas dos lipídios de
membrana, no interior celular. Em ambos os casos, os análogos de fosfolipídios precisam,
também, penetrar através da MEC do biofilme para chegar à célula fúngica. É possível que a
melhor atividade destes análogos em reduzir o desenvolvimento do biofilme de C. albicans,
em relação aos inibidores de 24-SMT, tenha relação com a melhor penetração destas drogas
através da matriz extracelular, já que ambos os grupos de agentes antifúngicos mostraram-se
ativos em células planctônicas. A MEC de biofilmes de C. albicans, também chamada de
matriz polimérica, é constituída, majoritariamente, por carboidratos, proteínas e hexosamina.
Assim, a natureza fosfolipídica da miltefosina e do Tcan26 pode estar favorecendo a
penetração destas moléculas através da matriz e, assim, estas substâncias tornam-se mais
disponíveis pra exercer suas ações sobre as células fúngicas. Esta comparação entre a
capacidade de penetração através da MEC e a atividade antibiofilme, em C. albicans, é uma
das explicações existentes para a maior eficácia de formulações lipídicas de anfotericina B em
102
biofilmes, quando comparada à formulação tradicional de anfotericina B (desoxicolato), ao
fluconazol e aos outros antifúngicos disponíveis na clinica médica (KUHN et al., 2002b).
A quantidade de matriz extracelular polimérica produzida pelas células durante a
formação do biofilme é influenciada pelas condições de cultivo a que ele é submetido. Por
exemplo, in vitro, biofilmes formados em condições estáticas produzem quantidades menores
de matriz do que aqueles formados sob agitação constante (HAWSER et al., 1998). Em nosso
estudo, os biofilmes foram formados sob agitação constante e, portanto, possuem grande
quantidade de MEC, podendo esta ser, parcialmente, responsável pela baixa atividade
antibiofilme das substâncias testadas.
Em geral, a matriz polimérica pode agir como uma barreira física que impede o acesso
de agentes antimicrobianos às células incorporadas ao biofilme e, por sua vez, contribuir para
a resistência destas comunidades aos tratamentos. Este obstáculo, no entanto, parece depender
da quantidade e natureza da MEC, bem como das propriedades físico-químicas da droga
(SENEVIRATNE et al., 2008).
O papel da matriz extracelular na resistência do biofilme de Candida ainda permanece
controversa. Em um estudo recente, Al Fattani e Douglas (2006) demonstraram que biofilmes
de C. albicans formados sob um fluxo constante de líquido e, portanto, com síntese de matriz
pronunciada, possuem resistência à anfotericina B significativamente aumentada. Em outro
estudo, a taxa de sobrevivência de células de Candida em biofilmes tratados com anfotericina
B diminuiu em 20% quando a MEC foi removida (BAILLIE e DOUGLAS, 1999). Entretanto,
alguns pesquisadores, também, já haviam demonstrado que células de biofilme de Candida
cultivadas estaticamente (com formação mínima de matriz) apresentam o mesmo nível de
resistência a antifúngicos do que células que crescem em um agitador, formando grande
quantidade de matriz (BAILLIE e DOUGLAS, 2000). Além disso, Baillie e Douglas (1998),
mostram que células de biofilmes de C. albicans, após serem ressuspensas em meio de cultura
103
(perdendo grande parte da MEC), permaneciam altamente resistentes aos antifúngicos.
Portanto, a baixa penetração de drogas através da matriz polimérica parece não ser a única
responsável por determinar o aumento da resistência a drogas antifúngicas em biofilmes.
Ainda assim, esta área de estudo é certamente de grande importância para investigações
futuras por possuir implicações clínicas, já que, tanto a MEC quanto seus principais
componentes, podem ser alvos potenciais para novas drogas antifúngicas.
Além da barreira física, representada pela matriz extracelular, a regulação gênica,
também, parece exercer um importante papel na resistência aumentada de biofilmes de C.
albicans aos agentes azólicos. Esta regulação baseia-se na superexpressão dos genes
relacionados a produção de bombas de efluxo de drogas CDR e MDR, como discutido na
introdução deste trabalho. Esta regulação positiva da síntese de bombas de efluxo, em
biofilmes de C. albicans, parece ser fase-específica e participa apenas da resistência aos azóis
durante as fases iniciais de desenvolvimento do biofilme. Em biofilmes maduros, mesmo
aqueles formados por mutantes depletados de MDR e CDR, ainda é possível verificar
resistência aos agentes azólicos, como o fluconazol, demonstrando que outros mecanismos,
que não a regulação gênica, devem estar envolvidos na resistência a antifúngicos em fases
avançadas de desenvolvimento do biofilme (RAMAGE et al., 2002a; MUKHERJEE et al.,
2003). Sendo o AZA e o EIL, drogas inibidoras da via biossintética do ergosterol, assim como
o fluconazol, é possível que o aumento na síntese de bombas de efluxo inespecíficas (MDR)
esteja reduzindo a quantidade de droga disponível no interior da célula durante a formação do
biofilme, determinando maior resistência das cepas estudadas ao tratamento com os azasteróis
testados.
Em fases tardias de desenvolvimento do biofilme de C. albicans, a menor
susceptibilidade ao tratamento com antifúngicos deixa de estar relacionada às bombas de
efluxo de drogas e parece ter como principais causas a alteração na composição da membrana
104
celular (redução da quantidade de moléculas de ergosterol) e a alteração dos níveis de
intermediários da biossíntese do ergosterol (MUKHERJEE et al., 2003). Esta alteração pode
influenciar tanto na susceptibilidade dos biofilmes à anfotericina B, por reduzir a
disponibilidade da molécula alvo desta droga, quanto às drogas que atuam na via biossintética
do ergosterol. Além disso, a alteração da composição da membrana pode reduzir sua
permeabilidade às drogas antifúngicas, levando à redução da susceptibilidade aos tratamentos
(KUMAMOTO e VINCES, 2005).
Posto que os mecanismos envolvidos na resistência antifúngica em fases iniciais de
desenvolvimento do biofilme são diferentes dos presentes em fases tardias, as estratégias para
redução da formação de biofilmes devem ser diferentes daquelas que visam eliminar
biofilmes maduros.
Estudos anteriores de Ghannoum et al. (1986), com a cepa de C. albicans ATCC
10231, demonstraram que a composição lipídica da membrana celular é diferente entre
leveduras e células filamentosas, principalmente, quanto ao conteúdo de esteróis. A análise do
perfil lipídico mostrou que a filamentação leva a redução na composição de esteróis livres e
aumento do conteúdo de ácidos graxos polinsaturados e lipidios complexos contendo esteróis
(GHANNOUM et al. 1986). Assim, provavelmente, células extraídas de biofilmes maduros de
C. albicans, compostos em maior parte de filamentos e com camada basal de leveduras,
apresentarão menor conteúdo de esteróis do que a mesma massa de células quando encontra-
se em suspensão (não filamentadas). Portanto, as células recuperadas de biofilme maduro, por
apresentarem menor conteúdo de esteróis, serão, possivelmente, menos susceptíveis aos
tratamentos antifúngicos que tenham como alvo de ação a síntese ou a própria molécula de
ergosterol. Esta seria uma possível explicação para a resistência aumentada das células do
biofilme maduro, formado em poliestireno, tanto pela cepa ATCC 10231 quanto pelo isolado
clínico 44A, aos tratamentos com anfotericina B, fluconazol, itraconazol, AZA e EIL,
105
mostrada em nosso trabalho. Da mesma maneira, a alteração da composição lipídica da
membrana, durante o dimorfismo, pode estar relacionada com as diferenças na
susceptibilidade aos análogos de fosfolipídios. Estes análogos apresentaram ação inibitória
quando adicionados durante a formação do biofilme, em poliestireno, do isolado clínico, mas
não mostraram atividade sobre as células do biofilme maduro desta cepa. Este comportamento
pode estar relacionado com a predominância de células leveduriformes no inicío da formação
do biofilme, quando estes análogos mostraram-se ativos, e, posteriormente, a prevalência de
filamentos no biofilme maduro, onde os compostos deixaram de mostrar atividade.
Apesar do fraco perfil de inibição da atividade metabólica das células do biofilme
apresentado pelos compostos, quando estes foram testados em biofilmes formados em placas
de poliestireno, a maioria dos agentes antifúngicos utilizados neste trabalho inibiu a
filamentação das células em biofilmes formados em cateter venoso central, por ambas as
cepas. Esse comportamento pode ser explicado com base nas diferenças de composição
química entre a superficie de poliestireno e o CVC, que podem estar influenciando na
capacidade de aderência de C. albicans, levando a formação de biofilmes com perfis de
susceptibilidade diferentes frente ao mesmo composto antifúngico.
O isolado clínico 44A, que desenvolveu biofilmes mais densos e filamentados, teve
transição morfológica entre levedura e hifa inibida por todas as drogas, quando estas foram
adicionadas em fase inicial de formação do biofilme, mas apenas o Tcan26 foi capaz de inibir
a filamentação das células do biofilme maduro desta cepa. O biofilme controle da cepa ATCC
10231, quando formado em CVC, mostrou-se filamentado apenas após 96 horas de incubação,
entretanto, esta formação de hifas foi inibida pelo tratamento com todos os agentes
antifúngicos, quando a adição destes ocorreu após 48h de formação do biofilme.
Em um estudo sobre a relação entre o dimorfismo e o desenvolvimento de biofilmes,
Baillie e Douglas (1999) utilizaram cepas mutantes de C. albicans, uma incapaz de formar
106
leveduras e a outra incapaz de formar hifas, e ambas foram capazes de gerar biofilmes
maduros, indicando que o dimorfismo não é uma condição indispensável para que tal
desenvolvimento ocorra. Entretanto, o biofilme formado pela cepa incapaz de filamentação
mostrou apenas uma fina camada basal de leveduras, enquanto a cepa não formadora de
leveduras gerou biofilmes com densa rede de filamentos e ausência de camada basal de
células leveduriformes. Curiosamente, os biofilmes da cepa capaz de filamentação foram mais
facilmente despreendidos da superfície, sugerindo que a camada basal de leveduras
desempenha um papel importante na fixação do biofilme à superfície abiótica. Desta maneira,
ambas a morfologias de C. albicans parecem ser necessárias para o desenvolvimento da
estrutura complexa de um biofilme maduro. Assim, a inibição da transição morfológica, pelo
tratamento com os agentes antifúngicos testados em nosso trabalho, determina a formação de
um biofilme menos complexo, em CVC, composto, principalmente, por leveduras e
pseudohifas.
A inibição da morfogênese torna-se importante uma vez que a menor complexidade do
biofilme formado pode estar relacionada com uma menor virulência das células envolvidas.
Segundo Calderone e Fonzi (2001), leveduras possuem menor virulência do que as formas
filamentosas e, com isso, em um modelo vivo, a disseminação de células leveduriformes a
partir de um cateter, provavelmente, irá determinar uma infecção menos resistente aos
tratamentos antifúngicos do que a infecção adquirida por disseminação de formas
filamentadas de C. albicans.
Com base nos resultados apresentados neste trabalho, os compostos sintéticos
inibidores da 24-SMT mostraram perfil de atividade sobre o biofilme de C. albicans
semelhante ao apresentado por antifúngicos padrão, enquanto análogos de fosfolipídios
mostraram-se ainda mais eficazes como inibidores do desenvolvimento de biofilmes de C.
albicans do que os agentes utilizados, atualmente, na clinica médica. De uma maneira geral,
107
todos os compostos testados interferiram no processo de filamentação das células de C.
albicans, durante a formação do biofilme em cateter venoso central, reduzindo a densidade de
hifas aderidas a este dispositivo, ao final de 48 ou 96h de incubação. Uma vez que o
dimorfismo celular é um dos principais fatores de virulência associados a este fungo, o
comportamento dos agentes testados os caracteriza como interessantes alvos de estudo
visando o aperfeiçoamento de suas ações, através do desenvolvimento de análogos estruturais,
e o aprofundamento de pesquisas acerca do entendimento dos mecanismos de ação principais
na célula fúngica, principalmente para análogos de fosfolipídios. Além disso, a descoberta de
novas moléculas cujos alvos de ação são diferentes daqueles já conhecidos possibilita estudos
sobre a viabilidade de uma terapia combinada destes compostos. A combinação de compostos
com alvos de ação diferentes é de grande importância para a clínica já que o objetivo
principal, neste caso, é a redução da dose efetiva e, consequentemente, a redução dos efeitos
adversos associados à terapia. Portanto, tendo em vista a alta toxicidade da terapia antifúngica
atual, a possibilidade de combinar diferentes substâncias visando a redução da dose necessária
no tratamento é um grande passo na busca de melhorias no tratamento das candidemias.
108
6 CONCLUSÕES
Os inibidores da 24-SMT, AZA e EIL, mostraram perfis de atividade diferentes nas
cepas de C. albicans testadas, sendo estas mais susceptíveis ao EIL;
Ambas as cepas testadas foram susceptíveis a miltefosina e ao Tcan26, sendo o perfil
de atividade do Tcan26 fungicida para o isolado clinico 44A;
A redução de HSC em leveduras tratadas com antifúngicos mostrou relação com a
menor formação de biofilme por estas cepas, na presença destes antifúngicos;
As leveduras tratadas com miltefosina apresentaram alterações ultraestruturais,
principalmente, na parede celular, membrana plasmática, e na formação de brotamentos;
Suspensões de células tratadas com miltefosina apresentaram aumento no conteúdo de
ergosterol e alterações nos perfis de fosfolipídios e de ácidos graxos;
Dentre os antifúngicos testados, os análogos de fosfolipidios mostraram melhor perfil
de atividade nas diferentes fases de desenvolvimento do bioflime;
O Tcan26 reduziu a formação de biofilme da cepa ATCC 10231 com concentração
semelhante à necessária para inibir 90% do crescimento da suspensão de células;
A formação de biofilme pela cepa ATCC 10231 foi mais susceptível aos tratamentos
antifúngicos do que a formação pelo isolado clínico;
Em cateter venoso central, os agentes antifúngicos adicionados durante ou após a
formação do biofilme levaram a redução da extensão de superficie colonizada e a inibição do
dimorfismo celular;
Apenas o Tcan26 determinou inibição do dimorfismo celular no biofilme maduro de
C. albicans 44A.
109
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