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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas
Efeito do tratamento com os esteróides flunisolida e NCX-1024 sobre a resposta inflamatória pulmonar induzida por sílica em camundongos
Januário Gomes Mourão e Lima
Orientadores: Profª. Drª Patrícia Machado Rodrigues e Silva Profº Dr. Marco Aurélio Ma rtins
Rio de Janeiro
2007
Livros Grátis
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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas
Efeito do tratamento com os esteróides flunisolida e NCX-1024 sobre a resposta inflamatória pulmonar induzida por sílica em camundongos
Januário Gomes Mourão e Lima
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro para obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas.
Rio de Janeiro
2007
Januário Gomes Mourão e Lima
Efeito do tratamento com os esteróides flunisolida e NCX-1024 sobre a resposta inflamatória pulmonar induzida por sílica em camundongos
Banca Examinadora composta para defesa de Tese de Doutorado para obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas pela Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Aprovada em: _____ de ____________ de 2007.
Presidente da Banca Examinadora:_____________________________________
1º Membro:________________________________________________________
2º Membro:________________________________________________________
Rio de Janeiro
2007
Lima, Januário Gomes Mourão
Efeito do tratamento com os esteróides flunisolida e NCX-1024 sobre a resposta inflamatória pulmonar induzida por sílica em camundongos. / Januário Gomes Mourão e Lima – Rio de Janeiro, RJ: [s.n.], 2007. Orientadora: Profª Drª Patrícia Machado Rodrigues e Silva
XIV, 123 p.; Dissertação (doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro Rio de Janeiro, Instituto de Ciências Biológicas – Programa de Pós-graduação em Ciências Morfológicas.
1. Inflamação; 2. Pulmão; 3. Partículas de sílica; 4. Glicocorticóides. I. Patrícia Machado Rodrigues e Silva; II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Ciências Biológicas. III. Título (série).
Agradecimentos
Quando optamos por fazer um doutorado, sabemos que não será fácil e
que teremos que contar com a ajuda de diversas pessoas que estão a nossa volta,
familiares, amigos e colegas de trabalho. Por conta disso gostaria de agradecer a
todos que me ajudaram e principalmente incentivaram a realização desse projeto.
Porém, existem algumas pessoas que devem receber um agradecimento especial
por sua participação na minha vida.
Agradeço inicialmente a minha orientadora Dra. Patrícia M. Rodrigues e
Silva , por sempre me apoiar nos momentos mais difíceis quando, por conta do
meu trabalho, precisei me ausentar do laboratório. Agradeço também ao Dr.
Marco Aurélio Martins , a oportunidade de poder desenvolver minha tese em seu
laboratório.
Não poderia deixar de agradecer muito à minha amiga Tatiana Paula
Ferreira , que conheci como estagiária do Laboratório de Inflamação e hoje é uma
colega de trabalho, pela sua enorme ajuda no desenvolvimento dessa tese.
Aproveito para agradecer ao Francisco pela sua importante colaboração na tese
e a todos os colegas do Laboratório de Inflamação da FIOCRUZ.
Ao Dr. John Wallace pela concessão no fornecimento das NCX-1024. Ao
Dr. Marcelo Pelajo pela colaboração nos ensaios de visualização de neutrófilos
nos cortes histológicos. À Dra Patrícia R. Macedo Rocco , Cristiane Garcia e
Alba Barros de Souza , pela colaboração na realização dos ensaios de função
pulmonar realizados no Laboratório de Investigação Pulmonar/IBCCFº/UFRJ.
Agradecer à FIOCRUZ, ao CNPq e a UNESCO pelo auxílio financeiro ao
projeto.
Aos meus amigos professores da UNISUAM, especialmente: Luis Felipe
da F. Reis , Gilson Ramos de Oliveira Filho , Anke Bergmann e Marcus Stutz .
À Chancelaria da UNISUAM, Prof. Ana Cristina e seus filhos Daniel , Arapuan e
Paulo Vitor , pelo imenso apoio desde o início da minha carreira até hoje.
Aos meus amigos e estagiários do Laboratório de Morfologia da UNISUAM
– LABMORF, pela fidelidade e dedicação ao trabalho.
A minha mãe, Nilza , pelo amor e dedicação na minha formação como
pessoa. Sempre me apoiando de todas as formas. Minha namorada, Mariana ,
pelo incentivo, amor e paciência na reta final desse projeto.
Epígrafe
"O único lugar onde o sucesso vem antes que o trabalho é no dicionário."
(Albert Einstein)
Lima, Januário Gomes Mourão e Lima . Efeito do tratamento com os esteróides flunisolida e NCX-1024 sobre a resposta inflamatória pulmonar induzida por sílica em camundongos. Rio de Janeiro, 2007, 123pp. Tese (Doutorado em Ciências Morfológicas) – Instituto de Ciências Biológicas. Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Resumo
A silicose é uma das doenças ocupacionais mais antigas, já matou milhares de
pessoas no mundo todo. Neste estudo nós desenvolvemos um modelo não-
invasivo do silicose em camundongos para investigar os efeitos do tratamento
curativo com os glicocorticóides flunisolida e NCX-1024 sobre a resposta silicótica.
A análise comparativa entre diferentes espécies de camundongos como
C57Black6, Balb/c e Swiss-Webster revelou a ocorrência de inflamação
leucocitária ao dia 7, formação de granuloma peribronquiolar no dia 14, seguido
por um quadro de fibrose no dia 28. Tomando por base que todas as três espécies
exibiram o mesmo padrão de resposta inflamatória foram escolhidos
camundongos Swiss-Webster, espécie não-isogênica, por melhor representar a
variabilidade da resposta em humanos. A análise do infiltrado inflamatório no BAL
revelou que há um aumento significativo no número de leucócitos totais e células
mononucleares em 7 dias, que reduziu progressivamente com tempo. O número
de neutrófilos permaceu elevado nos três tempos analisados. A análise do tecido
mostrou, pela coloração com HE, um progressivo infiltrado leucocitário (neutrófilos
e macrófagos), com aparecimento de numerosos nódulos silicóticos. Vimos
também um aumento significativo nos níveis de KC, MIP-2, IFN-γ, TNF-α e TGF-ß,
bem como maior expressão de MMP-2 e MMP-9 nos animais silicóticos. O
tratamento curativo com flunisolida e NCX-1024, realizado diariamente entre os
dias 21 e 28 após instilação da sílica, levou a uma significativa diminuição da
resposta inflamatória e granulomatosa, assim como da geração de mediadores
inflamatórios. Nossos achados indicam que a instilação intranasal de sílica
reproduz as da silicose humana. O tratamento com flunisolida e NCX-1024 foi
eficiente em inibir, de forma curativa, componentes inflamatórios relevantes dentro
do quadro da silicose, constituindo assim opção terapêutica promissora no caso
da silicose.
Palavras chaves: Inflamação, pulmão, partículas de sílica, glicocorticóides.
Abstract
Silicosis is one of the oldest occupational diseases, still killing thousands of people
in the world. In this study we developed a non-invasive model of silicosis in mice, in
order to investigate the effect of the treatment with glucocorticoids flunisolide and
NCX-1024 on the silicosis. The comparative analysis among different strains of
mice as C57Black6, Balb/c and Swiss Webster revealed the occurrence of
leukocyte infiltration at day 7, peribronchiolar granuloma formation at day 14,
followed by an extensive tissue fibrosis at day 28. The tissue analysis showed,
under conditions of HE staining, a progressive inflammatory infiltration (neutrophils
and macrophages), in parallel with numerous silicotic nodules. A significant
progressive increase in the levels of KC, MIP-2, IFN-γ, TNF-α e TGF-ß was
detected. By means of immunohistochemistry we noted a strong staining for MMP-
2 and MMP-9 in the silicotic group. Curative treatment with flunisolide and NCX-
1024, once a day from 21 to 28 days, reduced significantly the inflammatory and
granulomatosus response, as well as the increased levels of inflammatory
mediators. Our findings indicate that nasal silica instillation reproduces several
features of the human silicosis. In addition, treatment with flunisolide or NCX-1024
showed to be effective to inhibit curatively silicotic response, indicating that they
seem to constitute promising therapeutic approach in the case of silicosis.
Key words : Inflammation, lung, silica particles, glucocorticoids.
Lista de Abreviaturas
SDRA - Síndrome do Desconforto Respiratório no Adulto
DPOC - Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica
PIFD - Pneumopatias Intersticiais Fibrosantes Difusas
IARC – Agência Internacional de Pesquisa em Câncer
OMS – Organização Mundial de Saúde
MIP-2 - Proteína Inflamatória de Macrófago – 2
ROI - Intermediários Reativos de Oxigênio ()
NF-κβ – Fator Nuclear-κβ
IFN-γ - Interferon Gamma
TNF-α - Fator de Necrose Tumoral Alpha
TGF-β - Transforming Growth Factor Beta
IGF – Insulin Growth Factor
MMP – Metaloproteinase
TIMP - Inibidor Tecidual de Metaloproteinase
PAF – Fator Ativador de Plaquetas
GRE - Elementos Responsivos aos Glicocorticóides
POMC - Pró-opiomelanocortina
GM-CSF - Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
COX-2 - Ciclooxigenase-2
∆P1, L – Variação de Pressão do Pulmão
Pi, L – Ponto de Inflexão do Pulmão
∆P2, L - Variação de Pressão do Pulmão
Pel, L – Pressão de Resistência Elástica
Est, L - Elastância Estática
Edyn, L - Elastância Dinâmica
VT - Volume Corrente
Sumário Pág.
Folha de Rosto II
Folha de Aprovação III
Agradecimentos IV
Epígrafe VI
Resumo VII
Abstract IX
Lista de Abreviaturas X
1. Introdução 16 1.1 Pulmão 16 1.2 Disfunções Pulmonares 17 1.3 Silicose 18 1.3.1 Epidemiologia 19 1.3.2 Sílica 20 1.4 Fibrose Pulmonar 22 1.4.1 Células Epiteliais 23 1.4.2 Macrófagos Alveolares 24 1.5 Modelos Experimentais 25 1.6 Tratamento da Silicose 26
1.6.1 Glicocorticóides 27
2. Objetivos Gerais 33
2.1 Objetivos Gerais 33 2.2 Objetivos Específicos 33 3. Material e Métodos 34
3.1 Animais 34 3.2 Indução da Silicose e Tratamento 34 3.3 Técnica do Lavado Broncoalveolar 35 3.3.1 Contagem dos Leucócitos 35 3.4 Análise Histopatológica 36 3.4.1 Hematoxilina-Eosina (HE) 36 3.4.2 Picro-Sírius 36
3.4.3 Giemsa de Lennert 37 3.4.4 Imunohistoquímica para MMP-2 e MMP-9 37 3.4.5 Histoquímica para Marcação de Macrófagos Ativados 38
3.5 Quantificação de Quimiocinas e Citocinas por ELISA 38 3.6 Mecânica Respiratória 39 3.7 Análise Estatística 40
4. Resultados 41 4.1 Análise Comparativa da Resposta Inflamatória Pulmonar 41 Induzida pela Instilação de Sílica em Camundongos 4.2 Cinética da Resposta Inflamatória Pulmonar Induzida 42 pela Instilação de Sílica em Camundongos Swiss-Webster 4.2.1 Avaliação do Conteúdo Leucocitário no Lavado 42
Broncolaveolar 4.2.2 Avaliação das Alterações Morfológicas ao Nível 42 do Tecido Pulmonar 4.2.3 Avaliação do Infiltrado Celular ao Nível do Parênquima 43 Pulmonar 4.2.4 Identificação de Mediadores Inflamatórios Gerados 44 Durante a Resposta Silicótica em Camundongos 4.2.5 Análise da Presença de Metaloproteinase 2 e 9 45 (MMP-2 e MMP-9) no Tecido Pulmonar 4.2.6 Avaliação da Mecânica Respiratória em Camundongos 45 Silicóticos
4.3 Efeito do Tratamento Curativo com Flunisolida e NCX-1024 45
Sobre a Resposta Silicótica em Camundongos 4.3.1 Avaliação da População Leucocitária no Lavado 46 Broncolaveolar
4.3.2 Avaliação das Alterações Morfológicas ao Nível do 46 Tecido Pulmonar
4.3.3 Avaliação do TNF-α no Lavado Broncoalveolar 47 4.3.4 Avaliação da Mecânica Respiratória 47
5. Figuras
5.1. Figura 2 - Estrutura química dos compostos flunisolida 50 e NCX-1024.
5.2. Figura 3 – Análise do Lavado Broncoalveolar. Comparação das 51 Espécies.
5.3. Figura 4 – Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 52 de camundongos Swiss-Webster (HE). Comparação das espécies. 5.4. Figura 5 - Cinética do infiltrado leucocitário do lavado 53 broncoalveolar (BAL). 5.5. Figura 6 – Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 54 de camundongos Swiss-Webster (HE). Análise da cinética. 5.6. Figura 7 - Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 55 de camundongos Swiss-Webster (HE). Análise da cinética. 5.3. Figura 8 - Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 53 de camundongos Swiss-Webster (Picro-Sírius). Análise da cinética. 5.3. Figura 9 - Fotomicrografias de histoquímica (BSL-1) de pulmões 57 de camundongos de camundongos Swiss-Webster. 5.3. Figura 10 - Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 58 de camundongos Swiss-Webster (Giemsa). Análise da cinética. 5.3. Figura 11 - Cinética da geração de quimiocinas e citocinas no 59 lavado broncoalveolar (BAL). 5.3. Figura 12 - Cinética da geração de quimiocinas e citocinas no 60 tecido pulmonar. 5.3. Figura 13 - Fotomicrografias de imunohistoquímica para MMP-2. 61 5.3. Figura 14 - Fotomicrografias de imunohistoquímica para MMP-9. 62 5.3. Figura 15 - Avaliação temporal da mecânica respiratória de 63 camundongos Swiss-Webster. 5.3. Figura 16 - Análise do Lavado Broncoalveolar. Tratamento 64 com a flunisolida e NCX-1024. 5.3. Figura 17 - Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 65 de camundongos Swiss-Webster (HE). Tratamento com a flunisolida e NCX-1024. 5.3. Figura 18 - Fotomicrografias de cortes histológicos de pulmões 66 de camundongos Swiss-Webster (Picro-Sírius). Tratamento com a flunisolida e NCX-1024.
5.3. Figura 19 - Fotomicrografias de histoquímica (BSL-1) de pulmões 67 de camundongos de camundongos Swiss-Webster. 5.3. Figura 20 - Fotomicrografias de imunohistoquímica para MMP-2. 68 5.3. Figura 21 - Fotomicrografias de imunohistoquímica para MMP-9 69 5.3. Figura 22 – Quantificação de TNF-alfa no BAL. 70 5.3. Figura 23 - Avaliação temporal da mecânica respiratória de 71 camundongos. Tratamento com a flunisolida e NCX-1024.
6. Discussão 73
7. Conclusão 85
8. Referências Bibliográficas 86
9. Anexo 104
1. Introdução
Um significante número de patologias graves implicam no aparecimento de
uma resposta inflamatória pulmonar aguda, que é seguida, em tempos mais
tardios, pelo desenvolvimento de um processo fisiológico de reparo, associado à
ocorrência de fibrose, com acúmulo excessivo de matriz extracelular e células
mesenquimatosas, ou de remodelamento tissular. Em conjunto, estes eventos
levam a uma progressiva alteração da arquitetura das vias aéreas, redução no
processo de trocas gasosas e perda funcional do órgão.
1.1 Pulmão
O pulmão é um órgão que atua efetivamente no processo de trocas
gasosas entre o sangue e o ar inspirado, tendo como estrutura básica de
condução o sistema da árvore respiratória que se constitui da traquéia, a qual ao
ramificar-se origina dois brônquios também conhecidos como primários. Estes ao
penetrarem nos pulmões irão dirigir-se para baixo e para fora, e ao ramificarem-se
darão origem aos brônquios lobares. Estes últimos ao se dividirem repetidas vezes
formando estruturas cada vez menores darão origem a uma estrutura complexa
que constitui os bronquíolos (terminais), que por sua vez terminarão nos
bronquíolos respiratórios que marcam, então, o início da porção respiratória. Esta
compreende os ductos alveolares, sacos alveolares e alvéolos que compõem no
seu todo o parênquima pulmonar (Kobzik, 1999).
Desta forma o pulmão encontra-se em contato amplo com o meio externo,
ficando, assim exposto à ação de diversos agente agressores incluindo
patógenos, poluentes, substâncias antigênicas e xenobióticos. Para manter a
integridade indispensável ao fenômeno de trocas gasosas que se dá ao nível dos
alvéolos e capilares, o pulmão no curso do processo evolutivo, manteve um
sistema de detoxicação e de defesa particularmente adaptativos e eficazes. No
entanto, as estruturas alveolares são bastante finas e com grande susceptibilidade
a respostas de natureza inflamatória. Isto tem por conseqüência a ocorrência uma
ampla gama de patologias inflamatórias, que podem ser classificadas de uma
maneira mais geral em obstrutivas e restritivas (Kobzik, 1999; Caramori & Adcok,
2003).
1.2 Disfunções pulmonares
No caso das doenças de natureza obstrutivas, observa-se um aumento na
resistência ao fluxo de ar que resulta em obstrução parcial ou substancial em
diferentes níveis da árvore brônquica incluindo desde a traquéia e grandes
brônquios até bronquíolos terminais e respiratórios. No caso das restritivas,
verifica-se a ocorrência de redução da expansão do parênquima pulmonar e
queda da funcionalidade do órgão. De forma geral, grande parte destas patologias
encontra-se associada ao processo de remodelamento tissular como verificado no
caso da asma brônquica, na síndrome aguda de desconforto respiratório (SDRA),
doenças pulmonares obstrutivas crônicas (DPOC) e pneumopatias intersticiais
fibrosantes difusas (PIFD) como a silicose. Neste contexto, insere-se de forma
importante a resposta de fibrose pulmonar, que é uma condição progressiva e até
mesmo fatal, caracterizada patologicamente por proliferação de células
mesenquimais (fibroblastos) (Lehnert e col., 1994), expansão da matriz
extracelular e extenso processo de remodelamento tecidual. Embora a
patogênese das disfunções pulmonares obstrutivas e restritivas seja complexa e
não completamente esclarecida fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas e
reguladores de apoptose têm sido implicados no processo (Kobzik, 1999).
1.3 Silicose
Dentro do contexto acima mencionado situa-se a silicose, que é uma
doença crônica, difusa do parênquima pulmonar que resulta da exposição
prolongada a poeiras inaladas que contenham dióxido de silício ou sílica, sob a
forma livre e cristalina (Beckett e col., 1997). É diagnosticada através de
radiografia de tórax simples que revela a presença de finas nodulações nas
regiões superiores dos pulmões. A função pulmonar pode estar na condição
normal ou moderadamente afetada, sendo que na maioria dos pacientes a
dispnéia surge numa fase mais tardia. Esta patologia apresenta em geral uma
evolução bastante lenta, progressiva e irreversível, levando à insuficiência
respiratória, mesmo em condições nas quais o paciente não esteja mais exposto à
inalação da sílica. A insuficiência respiratória resultante é decorrente de alterações
da ventilação pulmonar e das trocas gasosas, sendo o comprometimento da
função respiratória um fator limitante para as atividades cotidianas do paciente
(Godleski, 1994). Em humanos caracteriza-se por nódulos fibróticos causados por
uma inflamação persistente que leva à proliferação de fibroblastos e acúmulo
exagerado de colágeno (Hunninghake e col., 1984; Cook, 2002). O infiltrado
inflamatório mononuclear e a fibrose subseqüente ocorrem nos locais de
deposição da partícula mineral. Esta doença inclui-se no grupo de patologias
pulmonares causadas pela exposição à “poeira” (pneumoconioses) descritas
desde a Antigüidade, tendo sido no período do Renascimento adotadas as
primeiras medidas preventivas como o uso de máscaras. Isto teve como base a
identificação de associação direta entre lesões pulmonares e o óbito precoce de
indivíduos trabalhadores em minas de carvão ou em fundições (Fujimura, 2000).
Muito embora após a segunda guerra mundial medidas sanitárias de controle
tenham sido implementadas em países desenvolvidos, naqueles
subdesenvolvidos e em desenvolvimento, estatísticas apontam para um
incremento nos índices de incidência destas fisiopatologias (Parkes e col, 1982).
Encontram-se como de atividades de maior risco aquelas que envolvem o
jateamento de areia, mineração, trabalho em fundição de ferro, indústrias
cerâmica e abrasivos, pedreiras e moagem de granito (Mossman, 1998).
Até a década de 80, não se relacionava a sílica e o câncer de pulmão.
Porém, em 1982, Parkes, descreveu a associação entre o carcinoma
broncogênico e pacientes com silicose. A OMS – Organização Mundial de Saúde
(1986), afirmou que não há risco de câncer de pulmão em exposições
ocupacionais até 40 mg/m3. No entanto, o parecer publicado pela Agência
Internacional de Pesquisa em Câncer da OMS - IARC (International Agency for
Research on Cancer) (1997) refere haver evidências suficientes em humanos e
em animais de experimentação de que a sílica cristalina inalada na forma de
quartzo ou cristobalita de fontes ocupacionais é carcinogênica.
1.3.1 Epidemiologia
A silicose representa um sério problema de saúde pública uma vez que,
apesar de ser evitável, apresenta altos índices de incidência e prevalência,
especialmente nos países menos desenvolvidos. Pois é irreversível e não passível
de tratamento, podendo cursar com graves transtornos para a saúde do
trabalhador, assim como resultar em um sério impacto sócio-econômico.
No Vietnam a silicose é a doença ocupacional com maior número de
concessões de benefícios, chegando a 90%. Na Índia a prevalência da silicose
chega a 55% dos trabalhadores. Nos Estados Unidos esses números diminuem
bastante, onde 1 milhão de trabalhadores estão expostos à sílica na forma livre e
cristalina, e 100 trabalhadores correm o risco de desenvolver silicose (Goelzer,
2000). No Brasil a silicose também é a pneumoconiose de maior prevalência e
estima-se que cerca de seis milhões de trabalhadores estejam expostos à sílica
em todo o país (Terra-Filho, 2006). Deste número, estima-se que 4 milhões
trabalhem na construção civil, 500 mil na mineração e 2 milhões na industria
(Goelzer, 2000).
As partículas de sílica estão presentes em uma ampla variedade de
situações: extração e beneficiamento de rochas como o granito e pedras em geral,
mineração de ouro, arsênico, estanho e de pedras preciosas e perfuração de
poços, nas indústrias de cerâmica, de materiais de construção, na fabricação de
vidro e de fertilizantes (rocha fosfática), em fundições e na produção de talco
(comumente contaminado com sílica), operação de jateamento de areia,
rebarbação, retífica e polimento de metais e minerais com abrasivos contendo
sílica, e em atividades de manutenção e limpeza de fornos, moinhos e filtros;
confecção de prótese dentária (Terra-Filho, 2006).
1.3.2 Sílica
A sílica é um nome genérico utilizado para denominar compostos que
possuem átomos de silício e oxigênio, e ao se estruturarem entre si formam
diversas substâncias químicas. Apresenta-se na forma cristalina (quartzo,
cristobalita e tridimita) ou amorfa, sendo a primeira a de maior importância no
contexto ocupacional, já que a forma amorfa praticamente é atóxica para os
pulmões (Balaan & Banks, 1992). As partículas de poeira inalada depositam-se
em vários locais do sistema respiratório dependendo do tamanho, forma, massa,
características aerodinâmicas e outras propriedades físicas (Hounam & Morgan,
1977). Como as partículas são irregulares, seu tamanho é expresso em diâmetro
aerodinâmico, um parâmetro que descreve o movimento da partícula inalada no ar
inspirado. O diâmetro aerodinâmico determina onde as partículas inaladas se
depositarão no pulmão (Hounam & Morgan, 1977). Partículas maiores do que 15
µm de massa média de diâmetro aerodinâmico (MMAD) ficam retidas na região
nasal. As intermediárias, entre 5 a 10 µm depositam-se nos brônquios e
bronquíolos, sendo removidas através do mecanismo mucociliar. As menores
penetram nos bronquíolos terminais e alvéolos e são parcialmente removidas,
pelos macrófagos alveolares. No pulmão humano verificou-se que as partículas de
sílica retidas têm diâmetros que variam entre 0,5 a 0,7 µm. Outras partículas
entram em contato com o epitélio alveolar levando ao aumento da síntese de
Macrophage Inflammatory Protein-2 (MIP-2) e outras quimiocinas para a atração
de neutrófilos (Barret e col., 1998). Além disso, parte das partículas atravessa o
epitélio respiratório sendo fagocitadas pelos macrófagos intersticiais ou
depositando-se diretamente no interstício (Brody e col., 1982). Uma parte da sílica
inalada e depositada nos pulmões pode ser eliminada (Davis e col., 1981). Horas
após exposição a aerossóis de sílica, foi verificado que os macrófagos alveolares
que em condições fisiológicas encontram-se dispostos ao acaso nos alvéolos
pulmonares, encontram-se concentrados na bifurcação do duto alveolar, local
onde as partículas depositam-se (Brody e col., 1980). Evidências indicam que a
interação dos macrófagos alveolares com as partículas de sílica se faz através de
receptores do tipo “scavenger” (Kobzik, 1995; Palencada & Kobzik, 2000). Vale
ressaltar que a sílica tem propriedades citotóxicas, em grande parte dependentes
de radicais livres presentes na superfície cristalina. Estes radicais, intermediários
reativos de oxigênio (ROI) são formados durante a ruptura ou esmagamento da
sílica e tem uma meia-vida de cerca de 1-2 dias (Lapp e Castranova, 1993;
Vallyathan e col., 1988). Os ROI podem atuar como mensageiros secundários
estimulando a translocação do fator de transcrição relacionado com estresse, o
fator nuclear kappa beta (NF-kB) (Schreck e col., 1992). A citocina pró-
inflamatória TNF-α também possui um papel crítico na silicose pulmonar,
mediando inicialmente a reação inflamatória aguda e participando mais
tardiamente da indução do processo fibrogênico (Piguet e col., 1990).
1.4 Fibrose Pulmonar
Para muitos a resposta de fibrose pulmonar é vista tradicionalmente como
um fenômeno que ocorre posteriormente a uma resposta inflamatória de caráter
agudo, muito embora até o presente momento não haja evidências clínicas que
comprovem a real existência de uma correlação direta entre parâmetros
inflamatórios e a evolução da doença. No entanto, tem sido descrito na literatura
que a fibrose tissular amplifica-se a partir da ocorrência de uma lesão inicial e atua
modulando o fenômeno de reparo tecidual, no que tange tanto o acúmulo de
células mesenquimatosas como o de síntese de componentes da matriz
extracelular (Keane & Strieter, 2002). Este fato tem direcionado diversos grupos
de pesquisadores a focar seus estudos na expressão de componentes da matriz
extracelular e moléculas normalmente envolvidas na regulação da homeostase.
No caso particular da matriz extracelular, evidências indicam que sua manutenção
é um processo dinâmico, no qual há a síntese de proteínas como colágeno fibrilar,
fibronectina e proteoglicanos, seja sempre balanceada por uma taxa equivalente
de proteólise. Como reguladores, tem sido dada ênfase a uma classe de
proteases conhecida como metaloproteinases (MMP), que sofre por sua vez
regulação de sua atividade enzimática por ação de uma família de inibidores
teciduais de metaloproteinases (TIMPs). Tem sido reportado na literatura que
durante um processo de desregulação do processo homeostático, ocorre a
formação de fibrose tecidual, que corresponde a um fenômeno de reparo
excessivo, traduzido por alterações funcionais importantes (Keane & Strieter,
2002). Neste cenário amplo, incluem-se também outras células residentes como
as epiteliais de revestimento da árvore brônquica, bem como outras células
constitutivas (macrófagos), que desempenham uma participação importante como
contribuintes do processo de agressão tissular mediante a ativação em cascata de
diferentes tipos celulares e fenômenos de reparo (Mossaman & Churg, 1998;
Rocco e col, 2003).
1.4.1 Células epiteliais
Células epiteliais têm como característica básica apresentarem-se
classificadas em subtipos específicos, exercendo como função básica o
revestimento de diferentes locais do organismo, dentre os quais a árvore
respiratória encontra-se incluída. No caso particular dos alvéolos, adquirem a
denominação de pneumócito I e II e possuem participação ativa no processo de
trocas gasosas. Neste sentido, um crescente número de evidências aponta para
um papel importante das células epiteliais das vias aéreas no estabelecimento do
quadro inflamatório, fenômeno este que parece estar associado a uma alteração
fenotípica no sentido de levar à produção de uma variedade de mediadores que
incluem prostaglandinas, Platelet-activating factor (PAF), citocinas e quimiocinas
(Smith, 1990; Jany e cols., 1995; Kinnula e col., 1992). Mais ainda, estudos
complementares demonstraram a capacidade de células epiteliais brônquicas em
expressar moléculas de adesão (CD 11b/CD18, ICAM-1), o que de forma clara
reforça a potencial contribuição destas células no recrutamento leucocitário para o
foco inflamatório (Kai e col., 1994).
1.4.2 Macrófagos alveolares
Macrófagos alveolares aparecem, em geral, localizados no interior dos
alvéolos e constituem as primeiras células pulmonares residentes que entram em
contato com o agente agressor, apresentando-se em número elevado no
interstício pulmonar e dentro dos alvéolos e constituindo assim uma importante
células efetora do processo de imunidade imediata. Sua implicação no processo
de reparação é relevante uma vez que possuem a capacidade de liberar citocinas
e fatores quimiotáticos que podem regular tanto o acúmulo local de células
mesenquimatosas (fibroblastos) como de matriz extracelular.
Macrófagos alveolares constituem importantes membros da família de
células macrofágicas, que apresentam heterogeneidade de fenótipos, em
conseqüência: a) do processo de diferenciação celular que está diretamente
relacionado ao tipo de citocina com a qual faz contato e interação com o estroma
em órgãos hematopoiéticos; b) da ampla distribuição em tecidos do organismo e
variada responsividade a estímulos endógenos e exógenos. O reconhecimento
destes estímulos faz-se mediante interação com uma gama extensa de receptores
ligados à membrana plasmática, que irá resultar em fagocitose ou endocitose,
sinalização intracelular e alterações complexas de ativação e repressão de gens.
Os ligantes são reconhecidos por macrófagos incluem os receptores do tipo
”scavenger”, opsoninas (no caso de anticorpos, complemento, colectinas e
proteína ligante de lipopolissacarídeo), ou ainda por reconhecimento direto de
carbohidratos, proteínas, lipídios e ácido nucléico através dos receptores do tipo
“Toll” e lectinas. Estes últimos possuem marcada importância no reconhecimento
não apenas de resíduos bacterianos conservados como também de estruturas
endógenas como lipoproteínas, hidrolases lisosomais, proteínas de choque
térmico e complexos de proteinases, o que os torna peças fundamentais no
“clearance” do espaço extracelular e homeostase tecidual, compondo parte do
mecanismo de defesa do organismo (Dunn, 2003).
1.5 Modelos Experimentais de Silicose
Os modelos animais de silicose procuram reproduzir a seqüência de
eventos da silicose pulmonar humana (Reiser e cols., 1982 e 1983; Kumar, 1989;
Ohtsuka e cols., 1995; Gossart e cols., 1996; Mariani e cols., 1996; Weirich e cols.,
1996; Huaux e cols., 1998 e 1999; Davis e cols., 1999; Piguet e cols., 1994;
Hubbard e cols., 1989) e têm sido explorados para a compreensão dos
mecanismos celulares e moleculares envolvidos na doença. Basicamente,
existem duas formas de se induzir silicose em animais: por meio de inalação das
partículas em aerosol (Davis e cols., 1999) e por instilação intratraqueal das
partículas de sílica. Essa última sendo a forma mais comum de indução da doença
em modelos experimentais (Borges e cols., 2001; Faffe e cols., 2001; Reasor e
cols., 2000). Porém, existem alguns problemas nessas duas modalidades de
indução da silicose em animais. O aerossol exige um período de
aproximadamente duas semanas de exposição diária à sílica e a instilação
intratraqueal, apesar de rápida, se torna muito invasiva por conta do procedimento
cirúrgico para exposição da traquéia e introdução da sílica utilizando uma seringa.
Além disso, com a injeção intraqueal é anulada uma parte do caminho seguido
pelas partículas de sílica uma vez inaladas, incluindo as fossas nasais, laringe e a
traquéia propriamente dita.
1.6 Tratamento da Silicose
Quanto mais precoce for o diagnóstico e a interrupção da exposição, melhor
é o prognóstico do paciente. Porém, dificilmente o paciente procura o serviço de
saúde precocemente, pois as alterações funcionais decorrentes da silicose
acontecem numa fase mais tardia.
Alguns trabalhos indicam a utilização de um alcalóide isolado da Stephania
tetrandra, uma planta utilizada na medicina chinesa, como eficaz no tratamento
experimental e clínico da silicose (Liu e cols., 1994; Ernst, et at. 2002). Entretanto,
é importante mencionar que a maioria dos trabalhos referentes à terapêutica da
silicose tem como base a fase precoce da fibrose pulmonar, o que não
corresponde a realidade dos pacientes silicóticos, uma vez que estes só procuram
o atendimento de saúde na fase crônica da doença. Mais ainda, a lavagem
broncoalveolar tem sido proposta como método para a remoção de partículas do
pulmão em indivíduos com silicose crônica e nos casos de silicoproteinose,
embora não tenha sua eficácia bem estabelecida. Um dos questionamentos
levantados relaciona-se ao fato das partículas que se encontram em vias aéreas
mais distais serem pouco alcançáveis por este procedimento, já que o retorno de
partículas do interstício para o espaço alveolar é discreto. Uma outra forma de
tratamento utilizada, apenas para casos selecionados, é o transplante pulmonar
(Terra-Filho, 2006). Com base no acima exposto, fica clara a importância pela
busca de terapias mais eficazes para a silicose.
1.6.1 Glicocorticóides
O uso de glicocorticóides é a mais efetiva forma de tratamento para
doenças de caráter inflamatório como reumática, autoimune e alérgicas. Os
glicocorticóides exercem seus efeitos se ligando a receptores específicos
localizados no citoplasma das células alvo (Barnes, 1998) e atuam regulando a
expressão de genes de diversas citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão e
metabólitos de ácido araquidônico (Buckingham e cols., 1994). Os glicocorticóides
interagem com proteínas receptoras específicas localizadas no citoplasma de uma
grande variedade de células-alvo para regular a expressão de determinados
genes. Estudos de imunolocalização e de hibridização in situ revelaram níveis
particularmente elevados de receptores para glicocorticóides no pulmão humano,
merecendo destaque a expressão nas células epiteliais e endoteliais. Esses
receptores pertencem a uma superfamília de proteínas estruturalmente
relacionadas, que transduzem os efeitos de um grupo diverso de pequenos
ligantes hidrofóbicos, como os hormônios esteroidais, o hormônio tireoidiano e a
vitamina D (Mangelsdorf e cols., 1995).
De acordo com estudos de mutagênese sítio-direcionada, os receptores de
corticosteróides exibem dois domínios extremamente conservados: uma região
contendo em torno de 70 aminoácidos, que formam dois domínios de ligação ao
zinco (dedos de zinco), e são essenciais para a interação do receptor com
seqüências específicas de DNA; e uma região na extremidade C-terminal, que
interage com o ligante. A extremidade N-terminal constitui a porção menos
conservada da molécula e parece importante não somente para a ativação da
transcrição gênica após ligação ao DNA, como também para ligação a outros
fatores de transcrição.
O receptor de glicocorticóides está localizado no citoplasma numa forma
predominantemente inativa e a transição para a forma ativa, seguida de
translocação para o compartimento nuclear, depende da ligação do esteróide
(Gronemeyer, e cols., 1992; Beato, e cols., 1995; Truss & Beato, 1993). O receptor
de glicocorticóide inativo é encontrado na forma de um complexo com outras
proteínas, como a proteína de choque térmico (hsp90), membro da família de
proteínas de choque térmico induzidas por estresse; uma imunofilina de 59 kDa,
pertencente ao grupo de proteínas intracelulares que se ligam aos
imunossupressores ciclosporina e tacrolimo; e outras proteínas inibitórias. A hsp90
atua como uma chaperona molecular e acredita-se que, mediante interações com
o domínio de ligação aos esteróides, mantenha a conformação do receptor
adequada para a ligação do glicocorticóides, impedindo sua translocação para o
núcleo na ausência de ligante (Barnes, e cols., 1998).
Após a ligação dos glicocorticóides, o receptor torna-se livre de suas
proteínas associadas e dirige-se para o núcleo, onde regula a transcrição de
genes-alvo, direta ou indiretamente. O complexo hormônio-receptor interage com
seqüências de DNA específicas nas regiões reguladoras dos genes afetados. As
seqüências curtas de DNA, denominadas elementos responsivos aos
glicocorticóides (GRE), fornecem especificidade para a indução da transcrição
gênica. A seqüência de consenso do GRE é um palíndromo imperfeito
GGTACAnnnTGTTCT, onde n representa qualquer nucleotídeo ao qual o receptor
de glicocorticóide, na forma dimérica, se liga (Barnes, e cols., 1998).
Sabe-se, no entanto, que nem sempre a transcrição gênica é regulada
positivamente pelos glicocorticóides. A regulação negativa do gene da pró-
opiomelanocortina (POMC) nos corticotropos constitui parte importante da
regulação do eixo hipotálamo/hipófise/supra-renal pelo mecanismo de
retroalimentação negativa. O receptor de glicocorticóide parece inibir a transcrição,
interagindo diretamente com um GRE no promotor POMC (Webster e Cidlowski,
1999).
Os receptores de glicocorticóides podem interagir diretamente com outros
fatores de transcrição, como NF-κB e AP-1 que regulam a expressão de
componentes do sistema imune e esses efeitos negativos sobre a expressão
gênica parecem contribuir significativamente para os efeitos antiinflamatórios e
imunossupressores dos glicocorticóides. Essas interações proteína-proteína entre
o receptor de glicocorticóide e os fatores de transcrição reprimem a expressão de
genes que codificam enzimas como, por exemplo, a colagenase e a estromelisina.
Além disso, a inibição do NF-κB pelos corticosteróides pode controlar muitos
aspectos do processo inflamatório em doenças pulmonares obstrutivas crônicas
visto que o NF-κB induz os genes de citocinas pró-inflamatórias, de enzimas-
chave na síntese de mediadores, de moléculas de adesão envolvidas no
recrutamento de eosinófilos e de receptores inflamatórios (Xu, e cols., 1999;
McKay & Cidlowski, 1999).
Resumindo o que foi relatado anteriormente, a importância dos
corticosteróides em processos inflamatórios deve-se à estimulação da transcrição
de genes antiinflamatórios e à inibição da transcrição de genes inflamatórios. Os
glicocorticóides inibem a transcrição dos genes de várias citocinas de interesse
em afecções respiratórias, como IL-1β, TNF-α, GM-CSF, entre outras. Seguem,
abaixo, alguns exemplos:
i) Anexinas - Os glicocorticóides podem controlar a inflamação pela inibição
da enzima fosfolipase A2, responsável pela conversão de lipídios de
membrana em ácido araquidônico. Esta inibição, no entanto, é indireta e
deve-se à capacidade destes hormônios em induzir a síntese de um grupo
de proteínas denominadas anexinas, que modulam a atividade da
fosfolipase A2 (Flower & Rothwell, 1994).
ii) NF-κB - Os glicocorticóides induzem a expressão de IκB-α, uma proteína
inibitória presente em algumas células e responsável pelo controle das
ações do NF-κB (Auphan e cols, 1995; Scheinman, e cols., 1995).
iii) Interleucina-10 (IL-10) - Os glicocorticóides parecem aumentar a secreção
de IL-10 pelos macrófagos alveolares in vivo. A IL-10 participa da inibição
da transcrição de muitas citocinas pró-inflamatórias (Ho & Moore, 1994).
iv) Antagonista do receptor de IL-1 (IL-1rα) - Os corticosteróides controlam o
efeito da IL-1, uma citocina pró-inflamatória, aumentando a expressão de
um antagonista do receptor de IL-1 (IL-1rα) em células epiteliais in vivo e in
vitro. Trata-se de uma proteína de 17 kDa, que compete com a IL-1 pela
ligação ao receptor e interrompe sua atividade tanto in vivo quanto in vitro
(Levine, e cols., 1996).
v) Ciclooxigenase-2 (COX-2) - A primeira enzima envolvida na via de síntese
das prostaglandinas é a prostaglandina endoperóxido-sintetase ou
ciclooxigenase. Atualmente, duas formas de COX, denominadas COX-1 e
COX-2, são conhecidas. A COX-1 é uma isoforma constitutiva, encontrada
na maioria das células e tecidos normais, enquanto a COX-2 é induzida em
condições de inflamação por citocinas e mediadores da inflamação (Seibert
e cols., 1997). Apesar dessa distribuição preferencial, a COX-2 também é
constitutivamente expressa em algumas células renais e cerebrais. (Breder
e cols., 1995; Harris e cols., 1994).
Apesar da grande potência como antiinflamatórios, os glicocorticóides
podem produzir uma série de efeitos adversos, tais como: osteoporose,
hipertensão e hiperglicemia (Turesin e cols., 2003), o que tem motivado a busca
por novas estratégias no sentido de minimizar estas ações. Neste sentido
compostos com maior potência inflamatória foram sintetizados (beclometasona,
budesonida, flunisolida) e a busca por esteróides de ação local intensificada. No
caso particular de doenças pulmonares crônicas, esteróides inalatórios têm
apresentado uma eficácia satisfatória como verificado no caso da asma brônquica
(Barnes, 1995). Alternativamente, coloca-se como otimização terapêutica, a
síntese de compostos com formulações que modificam o tempo de liberação de
fármacos ou, ainda, de pró-drogas (Belvisi & Hele, 2003). Como forma inovadora,
foi descrita uma outra classe de compostos, que inclui os esteróides nitrosilados.
Estes agentes se caracterizam por ter uma cadeia aromática que faz a ligação do
derivado glicocorticódie convencional com a molécula doadora de óxido nítrico.
Como representantes desta classe, podem ser citados NCX-1015 (NO-
prednisolona), NCX- 1024 (NCX-1024nisolida) e NCX-1022 (NO-hidrocortisona)
(Turesin e col., 2003; Wallace e col., 2004; Hyun e col., 2004). Com todos os
compostos nitrosilados foi verificada uma ocorrência de liberação lenta de óxido
nítrico e uma atividade antiinflamatória mais potente quando comparados aos
fármacos parentes. Devido ao efeito sinérgico foi evidenciado um aumento de 10
vezes da atividade inibitória da NO-prednisolona em modelos de peritonite e artrite
murina (Perretti e col., 2003). De forma extremamente interessante, já foi
demonstrado que NO-predinisolona apresenta menor toxicidade (osteoporose) do
que o composto parente. Em conjunto, os dados obtidos até o presente momento
indicam que esta manobra química melhorou substancialmente a potência dos
glicocorticóides, que desta forma colocam-se como extremamente promissoras na
aplicação terapêutica futura.
2. Objetivos
2.1 Objetivos Gerais
� Desenvolver um modelo experimental de silicose utilizando instilação de
partículas de sílica por via nasal em camundongos;
� Estudar o efeito do tratamento com o glicocorticóide flunisolida e do
derivado nitrosilado NCX-1024, visando a busca por alternativas
terapêuticas eficazes no caso de doenças que envolvam fibrose
pulmonar na fase crônica.
2.2 Objetivos Específicos
� Realizar estudo comparativo do desenvolvimento da resposta silicótica,
utilizando-se três diferentes linhagens de camundongos que incluíram
as linhagens isogênicas Balb/c e C57Black 6 e a linhagem não
isogênica Swiss-Webster;
� Analisar a participação de mediadores inflamatórios incluindo citocinas,
quimiocinas e metaloproteinases de matriz na resposta silicótica
pulmonar;
� Analisar o padrão da resposta inflamatória do tecido pulmonar através
do estudo histopatológico;
� Avaliar a função pulmonar através da análise da mecânica respiratória;
� Avaliar o efeito do tratamento curativo com flunisolida e NCX-1024 sobre
o desenvolvimento da silicose.
3. Material e Métodos
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos C57/BL6, Balb/c e Swiss Webster (machos,
peso corporal de 18 a 20g) provenientes do Centro de Criação de Animais
(CECAL) da Fundação Oswaldo Cruz e todos os procedimentos foram aprovados
pelo Comitê de Ética de Uso de Animais (CEUA) (Protocolo 0213-4). Os animais
foram mantidos sob condições de temperatura entre 25 e 28oC, ciclo de luz
definido em 12 h de claro e 12 h de escuro e livre acesso à ração e água.
3.2 Indução da Silicose e Tratamento
Os animais foram submetidos à anestesia por halotano (Tanohalo, Cristália,
São Paulo) sendo em seguida instilados por via intranasal com 10 mg sílica (SiO2),
(SiO2, S-5631 Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA, tamanho de partícula: 0,5
-10 µm) diluídos em 50 µl de salina estéril. Os animais do grupo controle
receberam igual volume de salina estéril intranasal. As análises foram realizadas
em diferentes tempos, variando entre 7, 14 e 28 dias (fig.1). Para a análise
comparativa entre diferentes linhagens de camundongos, foi fixado o tempo de 28
dias após a instilação da sílica.
Para o estudo acerca do efeito do tratamento com glicocorticóides, os
animais foram divididos em quatro grupos. Um grupo recebendo salina (SAL),
outro recebendo sílica (SIL) por via intranasal, conforme descrito acima, sendo
sacrificados 28 dias após a instilação. Mais dois grupos de animais que receberam
sílica intranasal foram tratados por via intranasal com flunisolida (FLU) ou NCX-
1024 (0.005 e 0.022 µmoles/sítio) (Fig.1) durante sete dias consecutivos, incluindo
do 21º até o 28º dia após a instilação de sílica (Fig.1).
Fig. 1. Esquema de indução da silicose e tratamento.
3.3 Lavado Broncoalveolar (BAL)
A lavagem broncoalveolar foi realizada utilizando-se uma cânula de
polietileno inserida na traquéia e um volume total de 1,5 mL de solução salina
tamponada (PBS) contendo EDTA 10mM foi instilado e aspirado em 2 lavagens
consecutivas de 0,75 mL. As amostras foram centrifugadas a 300 x g por 10 min e
o sobrenadante recolhido congelado para posterior quantificação de mediadores.
O “pellet” celular foi ressuspendido em 0,25 mL para a realização da avaliação
celular.
3.3.1 Contagem de Leucócitos
Os leucócitos totais foram analisados mediante diluição das amostras em
líquido de Türk (1:10) e contagem realizada em câmara de Neubauer em
microscópio de luz. Para a análise diferencial foram utilizados citoesfregaços
corados pelo método de May-Grunwald-Giemsa, com avaliação feita em objetiva
de imersão em óleo em microscópio de luz (BX51, Olympus).
Instilação de sílica Sacrifício Grupo 28 d
O d 7 d 14 d 21 d 28 d
Sacrifício Grupo 7 d Sacrifício Grupo 14 d
3.4 Análise Histopatológica
Após o sacrifício com alta dose de Tiopental (i.p.), foi realizada perfusão por
meio de uma cânula intracardíaca com solução de salina e heparina (1:10) para a
retirada do sangue. Posteriormente os animais receberam paraformaldeído
tamponado a 4% pela mesma via. Em ambos os procedimentos os frascos com as
soluções ficaram elevados a 110 cm de altura para que a pressão hidrostática
reproduzisse as condições fisiológicas da circulação sangüínea. Em seguida, os
pulmões foram fixados em formol tamponado a 10% (24 h), desidratados em
soluções crescentes de etanol, clarificados em xileno e incluídos em parafina.
Cortes histológicos de 5 µm de espessura foram realizados utilizando-se blocos de
parafina contendo fragmentos do tecido pulmonar, e submetidos às seguintes
colorações e imunohistoquímicas:
3.4.1 Hematoxilina-eosina (HE)
Para a análise dos aspectos gerais do tecido pulmonar, cortes histológicos
foram corados com hematoxilina-eosina, analisados em microscópio de luz (BX51,
Olympus) em diversos aumentos, e fotografados através de câmera digital (C-
7070, Olympus).
3.4.2 Picro-Sírius
Para a quantificação do colágeno utilizamos cortes histológicos corados
pela técnica do ácido fosfomolíbdico-Sirius Red (PMA-SR) e observados em
microscópio de luz (BX51, Olympus). Foram obtidas cinco imagens de cada
lâmina em câmera digital (C-7070, Olympus) contendo áreas com lesões
nodulares induzidas pela sílica, no aumento de 20X. As imagens foram
processadas e a quantidade de colágeno foi quantificada através do programa de
análise de imagens Image Pro Plus 4.0 (Media Cybernetics, USA).
3.4.3 Giemsa de Lennert
Para a avaliação da presença de neutrófilos no tecido pulmonar utilizamos a
coloração por Giemsa de Lennert com diferenciação em ácido acético a 0,5%.
Após a coloração, foram realizadas fotomicrografias das lâminas para posterior
análise.
3.4.4 Imunohistoquímica
Para evidenciação das metaloproteinases 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9), foram
utilizados anticorpos MMP-2 (SC6838, Santa Cruz, CA, USA) e MMP-9 murinas
(SC6841, Santa Cruz, CA, USA). Após desparafinização, os cortes foram
hidratados com TBS pH 7,6, bloqueados com H2O2 a 3% em metanol por dez
minutos, posteriormente as lâminas foram lavadas três vezes com TBS e
bloqueadas com Tris-HCL + BSA 2% por 20 minutos. Os anticorpos primários anti-
MMP-2 e MMP-9 foram diluídos com Tris-HCL + BSA 1% na proporção de 1:100 e
1:80, respectivamente. As lâminas foram incubadas com o anticorpo primário por
12 horas. Após a incubação, as lâminas foram lavadas por duas vezes com TBS.
O anticorpo secundário, anti-IgG de cabra (811620, Zymed, USA), foi diluído em
Tris-HCL e feita incubação por 30 minutos. A revelação foi feita com AEC por
aproximadamente 10 minutos. Posteriormente as lâminas foram lavadas em água
destilada, contra-coradas com hematoxilina de Mayer e montadas em meio
aquoso.
3.4.5 Histoquímica para Marcação de Macrófagos Ativ ados
Para evidenciação dos macrófagos alveolares foi utilizada lectina BSL 1
biotinilada (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA). Após
desparafinização, os cortes foram hidratados procedendo-se à inibição da
peroxidase endógena (H2O2 a 3% em metanol) e bloqueio de cargas existentes no
tecido (bórax a 3%) e das ligações inespecíficas dos reagentes através da
incubação com tampão salina fosfato (PBS) contendo albumina bovina (BSA) 3%.
A lectina biotinilada foi incubada por 16 horas a temperatura de 4oC, em câmara
úmida (diluição de 1:250 em PBS-BSA 1%) e revelada pela Streptavidina-
Peroxidase utilizando a diaminobenzidina como substrato cromógeno – FAST DAB
(Sigma, St Louis, MO, USA) segundo as instruções do fabricante. As lâminas
foram contracoradas pela hematoxilina.
3.5 Quantificação de Quimiocinas e Citocinas por EL ISA
Foram utilizadas placas de 96 poços, às quais foram adicionados
50mL/poço do anticorpo capturador e diluído no tampão composto de NaCl 1,5 M
,H3BO4 0,5 M e NaOH 1N, sendo mantido período de incubação de 12 horas a
40Cº. A seguir, os poços foram lavados 3 vezes (200mL/poço) com tampão 1,
composto por salina tamponada PBS/0,005% de Tween 20. Após esta etapa,
para bloqueio de sítios inespecíficos, a placa foi preenchida (200µL/poço) com
solução salina tamponada PBS/soro albumina bovina (BSA, 2%) por 1 hora à
370Cº. Em seguida os poços foram lavados 3 vezes com tampão 1 (200µL/poço).
As amostras e os padrões foram diluídos em tampão 1 contendo 2%de soro fetal
bovino (SBF) (tampão2) e adicionados aos poços (50 µL/poço). Após o período de
incubação (1 hora a 370 Cº), procedeu-se nova seqüência de 3 lavagens (200
mL/poço) com tampão 1. A seguir foi acrescentado (50 µL/poço) o anticorpo
detector biotinilado ( 50mg/mL), sendo mantida incubação por 45 minutos a 370Cº.
Os poços foram lavados com o tampão 1 (200µL/poço), seguindo-se a etapa de
incubação por 30 minutos a 37 Cº (100 µL/poço) com a mistura neutravidina-
“horseradish peroxidase” (HRP) diluído no tampão 2. Após a última lavagem com
tampão 1 (200µL/poço), foi feita a adição do substrato orfofenilenodiamina
dicloreto (OPD) (100 µL/poço), para o desenvolvimento da reação colorimétrica
(aproximadamente 3 a 5 minutos), que foi interrompida após acréscimo de
50mL/poço de H2SO4 (3mM). A análise espectrofotométrica foi realizada em leitora
de placa no comprimento de onda de 450 nm.
A quantificação dos mediadores inflamatórios incluiu as citocinas TNF-α,
INF-γ, TGF-β e as quimiocinas KC e MIP-2α. Foram utilizados kits comerciais
(R&D System, Estados Unidos), sendo seguidas as recomendações do
frabricante. As amostras analisadas foram provenientes do lavado broncoalveolar
(item 3.3) e do tecido pulmonar. No caso do tecido, foi realizada homogeneização
em 1 mL de PBS contendo “complete” (Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Suiça),
que é um coquetel de inibidores de proteases, seguida de centrifugação a 3000
rpm por 10 minutos sendo o sobrenadante recuperado para posterior quantificação
de mediadores.
3.6 Mecânica Respiratória
Para os testes de mecânica respiratória, foram utilizados 5 animais de cada
grupo. Os mesmos foram sedados com diazepam (5 mg/Kg, i.p.) e,
posteriormente, anestesiados com pentobarbital sódico (20 mg/Kg, i.p.) e
traqueotomizados para introdução de um Jelco 20. Os animais foram
posicionados em decúbito dorsal para a retirada das paredes torácica e
abdominal, paralisados com trietiliodeto de galamina (2 mg/Kg, i.v) e, em seguida,
ventilados mecanicamente com fluxo e volume corrente constantes.
Um pneumotacógrafo foi conectado a uma cânula traqueal para medir o
fluxo aéreo (V') e, por integração do sinal de fluxo, obtivemos o volume gasoso
mobilizado (V) (Mortola, 1983). A pressão traqueal (Ptr) foi medida através de uma
saída lateral no circuito por meio de um transdutor diferencial de pressão.
A mecânica respiratória foi analisada pelo método de oclusão ao final da
inspiração, que se baseia na insuflação do sistema respiratório, com fluxo aéreo
constante, seguida de um rápido fechamento da via aérea ao final da inspiração.
Em seguida, foi observada uma queda rápida inicial em Ptr (∆P1, L) até um ponto
de inflexão da curva (Pi, L), seguida de uma queda lenta (∆P2, L) até ser atingido
um platô que representa a pressão elástica do sistema respiratório (Pel, L). ∆P1, L
e ∆P2, L correspondem respectivamente aos componentes viscoso e viscoelástico
do sistema respiratório. A soma de ∆P1, L e ∆P2, L é igual a ∆PTOT, L. As
elastâncias estática (Est, L) e dinâmica (Edyn, L) do sistema foram calculadas pela
divisão de Pel, L e Pi, L respectivamente, pelo volume corrente (VT ) (Bates, 1988).
3.7 Análise estatística
Todos os resultados foram expressos como média ± erro padrão da
média (EPM) e analisados estatisticamente através de análise de variância
(ANOVA), seguida de teste de comparação múltipla de Newman-Keuls-Student.
Para ambos os testes, os valores de p < 0.05 foram considerados estatisticamente
significativos.
4. Resultados
4.1 Análise Comparativa da Resposta Inflamatória Pu lmonar Induzida
pela Instilação de Sílica em Camundongos
Objetivando estabelecer um modelo de silicose não invasiva, inicialmente
fizemos uma avaliação comparativa da resposta induzida por sílica em três
diferentes linhagens de camundongos. Foram escolhidas duas linhagens
isogênicas (Balb/c e C57 Bl6) e uma não isogênica (Swiss-Webster). Para tal
análise foi escolhido o tempo de 28 dias, por ser este correspondente à fase
crônica da doença e, assim, a fase mais crítica do processo silicótico. Inicialmente
avaliamos o conteúdo celular do lavado broncoalveolar dos animais silicóticos em
comparação com os controles (instilados com salina), e constatamos haver um
aumento no número de leucócitos presentes no lavado broncoalveolar (BAL) dos
animais em teste, com claro predomínio de macrófagos e um significativo infiltrado
de polimorfonucleares neutrófilos (Fig.3). Verificamos que todas as três linhagens
analisadas apresentaram resposta granulomatosa de intensidade similar,
conforme atestado pela coloração com hematoxilina e eosina (Fig. 4). Com base
nestes resultados, optamos por utilizar a linhagem Swiss-Webster nos ensaios
subseqüentes, uma vez que por ser não isogênica pode representar melhor a
variabilidade de resposta verificada na doença em humanos.
4.2 Cinética da Resposta Inflamatória Pulmonar Indu zida pela
Instilação de Sílica em Camundongos Swiss-Webster
4.2.1 Avaliação do Conteúdo Leucocitário no Lavado
Broncolaveolar
De nossa análise constaram os tempos de 7, 14 e 28 dias por
representarem os estágios agudo, intermediário e crônico da disfunção silicótica.
Vimos que no lavado broncoalveolar houve aumento no número de leucócitos
totais, máximo no tempo de 7 dias e, com progressivo decréscimo nos tempos de
14 e 28 dias. A análise diferencial revelou predominância de macrófagos, porém
com significativo aumento no número de neutrófilos. Estes últimos apresentaram
níveis elevados constantes ao longo do período de análise (Fig. 5).
4.2.2 Avaliação das Alterações Morfológicas no Teci do
Pulmonar
Verificamos que os pulmões dos animais controles exibiram um parênquima
pulmonar preservado em todos os tempos analisados, com espaços alveolares
livres de células inflamatórias e estruturas bronquiolares revestidas por epitélio
cuboidal a cilíndrico, pseudo-estratificado (fig 6A). Como ilustrado nas figuras 6 e
7, foi observado que, em 7 dias, os animais silicóticos exibiram parênquima
difusamente alterado pela presença de células inflamatórias e grandes áreas de
colapso alveolar (fig. 6B). Observamos que esse infiltrado inflamatório mostrou-se
constituído pela presença marcante de polimorfonucleares neutrófilos (fig. 7A). No
grupo de animais silicóticos de 14 dias, observamos a existência de estruturas
nodulares (granulomas), por vezes confluentes (fig. 6C), constituídas por células
inflamatórias em meio a partículas de sílica (fig. 7B). No tempo mais tardio, de 28
dias, notamos que os granulomas mostraram-se melhor delimitados, com
celularidade mantida, incluindo macrófagos e neurófilos (fig. 6D). Os septos
alveolares apresentaram maior quantidade de células mononucleares, o que
determinou a identificação de um espessamento septal evidente (fig. 7C).
Utilizando-se a coloração com Picrus sirius para visualização de fibras
colágenas, foi verificado através de microscopia que havia uma pequena
quantidade de fibras colágenas no parênquima pulmonar nos animais controles,
em todos os tempos analisados (Fig. 8A). Na condição dos animais silicóticos, foi
detectado um aumento no conteúdo de fibras colágenas de forma tempo
dependente, com máximo sendo verificado em 28 dias, período correspondente à
fase crônica da resposta silicótica (Fig. 8B, 8C e 8D).
4.2.3 Avaliação do Infiltrado Celular ao Nível do P arênquima
Pulmonar
Os macrófagos existentes nos pulmões dos animais controles mostraram-
se não reativos ou fracamente reativos à BSL-1 (fig. 9B). No caso dos animais
silicóticos foi observado que os macrófagos intersticiais e alveolares apresentaram
grande positividade na membrana celular, o que favoreceu a identificação da
população ativada nos tempos de 7 (Fig. 9C), 14 (Fig. 9D) e 28 (Fig. 9E).
Utilizando a coloração pelo Giemsa de Lennert observamos que não houve
marcação para polimorfonucleares neutrófilos nos animais controles (Fig. 10A).
Nas mesmas condições experimentais, entretanto, foi notada a presença de
neutrófilos com aspecto apoptótico no tecido pulmonar dos animais silicóticos nos
três tempos analisados (Fig. 10B, 10C e 10D).
4.2.4 Identificação de Mediadores Inflamatórios Ger ados Durante a
Resposta Silicótica em Camundongos
Objetivando identificar mediadores inflamatórios participantes na resposta
silicótica, partimos para analisar algumas quimiocinas e citocinas relevantes para
o processo. Foram avaliados o lavado broncoalveolar e tecido pulmonar.
Inicialmente, verificamos haver no lavado broncoalveolar um aumento no conteúdo
de KC, uma quimiocina C-X-C correspondente à IL-8 humana (Fig. 11A).
Quantidades equivalentes de KC foram detectadas nos vários tempos de análise.
No que se refere aos medidores TNF-α e TGF-β, observamos que houve um
aumento de forma tempo dependente nos níveis de ambos os fatores no BAL,
com máximo sendo notado no tempo de 28 dias após a instilação da sílica (Fig.
11B e 11C, respectivamente).
Quando da análise do tecido pulmonar, observamos níveis aumentados de
KC (Fig. 12A) durantes os três tempos de análise. Para outros mediadores, foi
evidenciado um aumento progressivo nos níveis de quimiocinas e citocinas em
animais silicóticos, com máximo sendo notado no tempo de 28 dias. Foram
avaliadas MIP-2 (Fig. 12B), IFN-γ (Fig. 12C), TNF-α (Fig.12D) e TGF-β (Fig. 12E).
4.2.5 Análise da Presença de Metaloproteinase 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) no Tecido Pulmonar
Para a avaliação das MMP-2 e MMP-9 foi utilizada a técnica de
imunohistoquímica, o que permitiu a visualização de que nos pulmões dos animais
controles foi detectada uma fraca marcação para MMP-2 e 9 (Fig. 13B e 14B). Já
os animais silicóticos mostraram uma forte marcação para MMP-2 e MMP-9 nos
tempos de 7 a 28 dias (Fig. 13 e 14).
4.2.6 Avaliação da Mecânica Respiratória em Camundo ngos Silicóticos
Através da análise da mecânica respiratória observamos um aumento
significativo das variações das pressões resistivas. Em ∆P1, L (relacionado a vias
aéreas mais centrais) vimos um aumento dos animais sílica em relação ao grupo
salina (Fig. 15A). Já em ∆P2, L (relacionado com vias aéreas mais periféricas),
observamos um aumento apenas no grupo 28 dias (Fig. 15B) em relação aos
animais salina e aos silicóticos. Esse aumento parece estar relacionado à fibrose
pulmonar observada nos animais após 28 dias da instilação da sílica.
Observamos um aumento significativo nos animais silicóticos em relação a
salina em ∆Ptot (soma das duas pressões, ∆Ptot L= ∆P1, L + ∆P2, L) (Fig. 15C).
4.3 Efeito do Tratamento Curativo com Flunisolida e NCX-1024 Sobre a
Resposta Silicótica em Camundongos
4.3.1 Avaliação da População Leucocitária no Lavado
Broncoalveolar
Com vistas a verificar o potencial efeito curativo da flunisolida e NCX-1024,
foi utilizado o tempo de 28 dias, por se tratar da fase crônica e, portanto, mais
crítica e, também, por corresponder à situação verificada no caso de humanos.
Conforme ilustrado na figura 16, verificamos que o tratamento com flunisolida e
NCX-1024 não modificou o número de leucócitos totais e células mononucleares
(Fig. 16), enquanto que polimorfonucleares neutrófilos apresentaram-se em níveis
inferiores àqueles notados no caso dos animais silicóticos.
4.3.2 Avaliação das Alterações Morfológicas a o Nível do Tecido
Pulmonar
Verificamos que os pulmões dos animais controles exibiram um parênquima
pulmonar preservado e com espaços alveolares livres de células inflamatórias
(Fig. 17A). O tratamento dos animais silicóticos com flunisolida (Fig. 17C) e NCX-
1024 (Fig. 17D) determinou uma diminuição bastante significativa no infiltrado
inflamatório tecidual, assim como no número e tamanho dos granulomas, quando
comparados aos animais silicóticos não tratados (Fig. 17B).
Através da coloração com Picrus sirius, foi possível identificar a presença
de uma pequena quantidade de fibras colágenas no parênquima pulmonar nos
animais controles (Fig. 18A). Nos animais silicóticos, foi visto um aumento
significativo no depósito de fibras colágenas (Fig. 18B). Entretanto, nos cortes
histológicos dos animais tratados com flunisolida e NCX-1024 pode ser notada
uma diminuição significativa na quantidade de colágeno no parênquima pulmonar
em comparação ao conteúdo detectado no pulmão dos animais estimulados com
sílica (Fig. 18C e 18D).
Novamente os macrófagos existentes nos pulmões dos animais controles
apresentaram fraca reatividade a lectina BSL-1 (Fig. 19B). Nos animais do
grupo sílica observamos forte marcação na membrana célular (Fig. 19C).
Entretanto, na condição do tratamento com flunisolida e NCX-1024 vimos uma
fraca reatividade a BSL-1 nos animais tratados com flunisolida ou NCX-1024
(Fig. 19D e 19E), refletindo a inibição verificada no caso dos granulomas.
Considerando-se a importância das metaloproteinases para o processo
fibrótico, passamos à análise da presença das MMP-2 e MMP-9 no tecido
pulmonar mediante técnica de imunohistoquímica. Vimos uma forte marcação
nas amostras teciduais dos animais silicóticos (Fig. 20C e 21C), enquanto que
nos tecido dos animais submetidos ao tratamento com flunisolida e NCX-1024
apresentaram uma diminuição importante da marcação para as MMPs (Fig. 20D
e 20E; 21D e 21E).
4.3.3 Avaliação do TNF- αααα no Lavado Broncoalveolar
Ao quantificarmos os níveis de TNF-α no BAL observamos um aumento
significativo na condição dos animais silicóticos em comparação com os controles,
enquanto que o tratamento com flunisolida e NCX-1024 promoveu significativa
redução no conteúdo desta citocina (Fig. 22).
4.3.4 Avaliação da Mecânica Respiratória
Ao analisarmos a função respiratória dos animais tratados curativamente
com flunisolida ou NCX-1024 observamos uma redução significativa dos
parâmetros de ∆P1, L no grupo flunisolida em relação ao grupo sílica (Fig. 23A).
Ao analisar o ∆P2, L observamos uma diminuição significativa desse parâmetro
nos dois grupos tratados em relação aos animais silicóticos (Fig. 23B). Ao analisar
a soma das variações resistivas (∆Ptot L), podemos ver uma diminuição
significativa no grupo flunisolida e uma tendência a diminuição no grupo NCX-
1024 se comparados ao grupo sílica (Fig. 23C). A diminuição desses parâmetros,
principalmente ∆P2, L, pode estar relacionado com a diminuição do infiltrado
inflamatório, a menor formação de nódulos silicóticos no parênquima pulmonar e a
diminuição do depósito de fibras colágenas.
NCX-1024
OF
OO
HO
O
O
O
O2 NO
Flunisolida
OF
OO
HO
O
O
O
Figura 2. Estrutura química dos compostos flunisolida e NCX-1024.
Figura 3. Análise do conteúdo leucocitário do lavado broncoalveolar (BAL) de camundongos das cepas Swiss-Webster, Balb/c e C57 Bl6, 28 dias após a instilação nasal de sílica (10 mg). A- Leucócitos totais; B- Células mononucleares e C- Neutrófilos. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina.
Salina
Sílica
0
1
2
3
4
5
6 *
**
Leucócitos Totais (x10
-5)/BAL
0
1
2
3
4
5
6*
* *
Mononucleares (x10
-5)/BAL
0.00
0.25
0.50
0.75
** *
Swiss Webster Balb/c C57 Bl6
Neutrófilos (x10
- 5)/BAL
A
B
C
Figura 4. Fotomicrografias (aumento de 200X) de cortes histológicos de pulmões de camundongos Swiss-Webster (A), Balb/C (B) e C57/Bl6 (C), 28 dias após a instilação nasal de sílica (10 mg). Pode ser observado padrão de formação de granulomas e infiltrado celular inflamatório semelhante. Coloração por Hematoxilina e Eosina.
A
C
A
B
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0 *#
*#
*#
Leucócitos Totais (x10
-5)/BAL
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0 *#
*#
*#
Mononucleares (x10
-5)/BAL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
* * *
Neutrófilos (x10
- 5)/BAL
7 d
14 28
Salina
Sílica
Figura 5. Cinética do infiltrado leucocitário do lavado broncoalveolar (BAL) de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (10 mg). A. Leucócitos totais; B. Células mononucleares e C. Neutrófilos. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.
C
B
A
Figura 6. Fotomicrografias (aumento de 200X) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados por via nasal com sílica (SIL, 10 mg). A. Grupo salina (SAL), mostrando a arquitetura do parênquima pulmonar preservada; B. Grupo SIL 7, intenso infiltrado inflamatório; C. Grupo SIL 14, formação de granulomas difusos no parênquima pulmonar; e D. Grupo SIL 28, granulomas bem formados, porém com uma diminuição do infiltrado celular inflamatório. Coloração por Hematoxilina e Eosina.
B
C D
A
Figura 7. Fotomicrografias (aumento 1000X) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg). A. Grupo SIL 7, mostrando a presença de intenso infiltrado inflamatório formado por uma grande quantidade de células polimorfonucleares (setas pretas); B. Grupo SIL 14, presença de partículas de sílica em meio às células (setas brancas); C. Grupo SIL 28, ocorrência de edema septal incluindo presença de células inflamatórias. Coloração por Hematoxilina e Eosina.
A
B C
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
SAL 7 SIL 7 SAL 14 SIL 14 SAL 28 SIL 28
*#
*#
*#
Fib
ras
Col
ágen
as/
µµ µµm2
B
C D
A
Figura 8. Fotomicrografias (aumento de 200X) referentes à cinética de deposição de fibras colágenas no pulmões de camundongos Swiss-Webster estimulados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg). A. Grupo salina (SAL), parênquima pulmonar normal e com poucas fibras colágenas; B. Grupo SIL 7, formação de pequenos granulomas, jácom intenso depósito de colágeno; C. Grupo SIL 14, estruturas granulomatosas bem formadas e circundadas por fibras colágenas; e D. Grupo SIL 28, fibras dispostas de maneira difusa no parênquima pulmonar. E. Avaliação quantitativa do depósito de fibras colágenas no pulmão através de sistema de análise de imagem (Olympus, Image Pro). * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica em tempos respectivamente anteriores. Coloração comPicro Sírius.
E
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
SAL 7 SIL 7 SAL 14 SIL 14 SAL 28 SIL 28
*#
*#
*#
Fib
ras
Col
ágen
as/
µµ µµm2
B
C D
A
Figura 8. Fotomicrografias (aumento de 200X) referentes à cinética de deposição de fibras colágenas no pulmões de camundongos Swiss-Webster estimulados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg). A. Grupo salina (SAL), parênquima pulmonar normal e com poucas fibras colágenas; B. Grupo SIL 7, formação de pequenos granulomas, jácom intenso depósito de colágeno; C. Grupo SIL 14, estruturas granulomatosas bem formadas e circundadas por fibras colágenas; e D. Grupo SIL 28, fibras dispostas de maneira difusa no parênquima pulmonar. E. Avaliação quantitativa do depósito de fibras colágenas no pulmão através de sistema de análise de imagem (Olympus, Image Pro). * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica em tempos respectivamente anteriores. Coloração comPicro Sírius.
E
Figura 9. Fotomicrografias (aumento de 1000X) de histoquímica de pulmões de camundongos de camundongos Swiss-Webster estimulados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg). Foi utilizada marcação com a lectina BSL-1. A. Controle Negativo; B. Grupo salina (SAL), apresentando uma fraca marcação para BSL-1; C. Grupo SIL 7; D. Grupo SIL 14; e E. Grupo SIL 28. Foi identificada marcação positiva para macrófagos, não sendo verificada diferença significativa entre os grupos de animais silicóticos em nenhum dos tempos analisados. Setas brancas indicam macrófagos ativados.
B C
D E
AA
Figura 9. Fotomicrografias (aumento de 1000X) de histoquímica de pulmões de camundongos de camundongos Swiss-Webster estimulados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg). Foi utilizada marcação com a lectina BSL-1. A. Controle Negativo; B. Grupo salina (SAL), apresentando uma fraca marcação para BSL-1; C. Grupo SIL 7; D. Grupo SIL 14; e E. Grupo SIL 28. Foi identificada marcação positiva para macrófagos, não sendo verificada diferença significativa entre os grupos de animais silicóticos em nenhum dos tempos analisados. Setas brancas indicam macrófagos ativados.
B C
D E
AA
Figura 10. Fotomicrografias (aumento de 200X) de pulmões de camundongos Swiss-Webster estimulados por via intranasal com sílica (SIL, 10mg). A. Grupo salina (SAL) apresentando discreta presença de neutrófilos; B. Grupo SIL 7; C. Grupo SIL 14; e D. Grupo SIL 28. Foi identificada marcação positiva para neutrófilos (setas brancas), com infiltrado mais acentuado em tempos mais agudos. Coloração por Giemsa de Lennert.
A B
C D
0
100
200
300
400
TGF
β(pg)/BAL
Salina
Sílica
7 d 14 d 28 dSAL
0
100
200KC (pg)/BAL * *
*
* #
Figura 11. Cinética da geração de quimiocinas e citocinas no lavado broncoalveolar(BAL) de camundongos Swiss-Webster instilados por via intranasal com sílica (10 mg). Quimiocina KC em A e citocinas TNFα e TGFß em B e C, respectivamente. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.
0
100
200
TNF
α(pg)/BAL
**
*
A
B
C
ND0
100
200
300
400
TGF
β(pg)/BAL
Salina
Sílica
Salina
Sílica
7 d 14 d 28 dSAL
0
100
200KC (pg)/BAL * *
*
0
100
200KC (pg)/BAL * *
*
* #
Figura 11. Cinética da geração de quimiocinas e citocinas no lavado broncoalveolar(BAL) de camundongos Swiss-Webster instilados por via intranasal com sílica (10 mg). Quimiocina KC em A e citocinas TNFα e TGFß em B e C, respectivamente. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.
0
100
200
TNF
α(pg)/BAL
**
*
0
100
200
TNF
α(pg)/BAL
**
*
A
B
C
ND
Salina
Figura 12. Cinética da geração de quimiocinas e citocinas no tecido pulmonar de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (10 mg). A. KC; B. MIP-2; C. IFNγ; D. TNFα e E. TGFß. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.
0.000
0.005
0.010
0.015TNF
α(ng)/m
g proteína
7 d 14 d 28 dSAL
* #
* #
Sílica
0.0
0.1
0.2
TGF
β(ng)/m
g poteína
7 d 14 d 28 dSAL
* *
0.0
0.1
0.2
KC (ng)/mg proteína * #
**
7 d 14 d 28 dSAL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
MIP-2 (ng)/mg proteína
** *
7 d 14 d 28 dSAL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
IFN
γ(ng)/m
g proteína
*
* #
7 d 14 d 28 dSAL
A B
C D
E
Salina
Figura 12. Cinética da geração de quimiocinas e citocinas no tecido pulmonar de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (10 mg). A. KC; B. MIP-2; C. IFNγ; D. TNFα e E. TGFß. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.
0.000
0.005
0.010
0.015TNF
α(ng)/m
g proteína
7 d 14 d 28 dSAL
* #
* #
Sílica
0.0
0.1
0.2
TGF
β(ng)/m
g poteína
7 d 14 d 28 dSAL
* *
0.0
0.1
0.2
KC (ng)/mg proteína * #
**
7 d 14 d 28 dSAL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
MIP-2 (ng)/mg proteína
** *
7 d 14 d 28 dSAL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
IFN
γ(ng)/m
g proteína
*
* #
7 d 14 d 28 dSAL
0.000
0.005
0.010
0.015TNF
α(ng)/m
g proteína
7 d 14 d 28 dSAL
* #
* #
0.000
0.005
0.010
0.015TNF
α(ng)/m
g proteína
7 d 14 d 28 dSAL
* #
* #
Sílica
0.0
0.1
0.2
TGF
β(ng)/m
g poteína
7 d 14 d 28 dSAL
* *
0.0
0.1
0.2
TGF
β(ng)/m
g poteína
7 d 14 d 28 dSAL
* *
0.0
0.1
0.2
KC (ng)/mg proteína * #
**
7 d 14 d 28 dSAL
0.0
0.1
0.2
KC (ng)/mg proteína * #
**
7 d 14 d 28 dSAL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
MIP-2 (ng)/mg proteína
** *
7 d 14 d 28 dSAL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
IFN
γ(ng)/m
g proteína
*
* #
7 d 14 d 28 dSAL0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
IFN
γ(ng)/m
g proteína
*
* #
7 d 14 d 28 dSAL
A B
C D
E
Figura 13. Fotomicrografias (aumento de 20X) de imunohistoquímica para metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) no pulmão de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A. Controle negativo. B. Grupo salina (SAL), mostra fraca marcação para MMP-2; C. Grupo SIL 7; D. Grupo SIL 14; e E. Grupo SIL 28. Os grupos que receberam sílica apresentaram forte marcação para MMP-2.
B
E
C
D
A
Figura 13. Fotomicrografias (aumento de 20X) de imunohistoquímica para metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) no pulmão de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A. Controle negativo. B. Grupo salina (SAL), mostra fraca marcação para MMP-2; C. Grupo SIL 7; D. Grupo SIL 14; e E. Grupo SIL 28. Os grupos que receberam sílica apresentaram forte marcação para MMP-2.
B
E
C
D
A
Figura 14. Fotomicrografias (aumento de 200X) de imunohistoquímica para metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9) no pulmão de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). . A. Controle Negativo; B. Grupo salina (SAL), mostra fraca marcação para MMP-2; C. Grupo SIL 7; D. Grupo SIL 14; e E. Grupo SIL 28. Os grupos que receberam sílica apresentaram marcação intensa para MMP-9.
B
D
C
D E
A
Figura 14. Fotomicrografias (aumento de 200X) de imunohistoquímica para metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9) no pulmão de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). . A. Controle Negativo; B. Grupo salina (SAL), mostra fraca marcação para MMP-2; C. Grupo SIL 7; D. Grupo SIL 14; e E. Grupo SIL 28. Os grupos que receberam sílica apresentaram marcação intensa para MMP-9.
B
D
C
D E
A
0
1
2
3
4
(cm
H2O
/ml)
0
1
2
(cm
H2O
/ml)
0
1
2
3
4
5
(cm
H2O
/ml)
∆P1
∆P2
∆Pto
t
Salina
Sílica
7 d 14 d 28 d
Figura 15. Avaliação temporal da mecânica respiratória de camundongos Swiss-Webster estimulados através de instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A. ∆P1; B. ∆ P2 e C. ∆ Ptot. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.
*
* #
*
*
*
*
*
A
B
C
0
1
2
3
4
(cm
H2O
/ml)
0
1
2
(cm
H2O
/ml)
0
1
2
3
4
5
(cm
H2O
/ml)
∆P1
∆P2
∆Pto
t
Salina
Sílica
7 d 14 d 28 d
Figura 15. Avaliação temporal da mecânica respiratória de camundongos Swiss-Webster estimulados através de instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A. ∆P1; B. ∆ P2 e C. ∆ Ptot. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.
*
* #
*
*
*
*
*
A
B
C
0
1
2
3
*Le
ucóc
itos
Tot
ais
(x10
-5)/
BA
L
0
1
2
3
*
Mon
onuc
lear
es(x
10-5
)/B
AL
0.0
0.1
0.2
0.3 *
*#
*#
Neu
tróf
ilos
(x10
-5)/
BA
L
Estímulo:
Tratamento:
SAL SIL SIL SIL
SAL SAL FLU NCX-1024
Figura 16. Efeito do tratamento curativo com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022 µmol/Kg) sobre o infiltrado leucocitário no labado broncoalveolar (BAL) de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A análise foi realizada 28 dias após a indução da silicose. A- Leucócitos totais; B- Células mononucleares e C-Neutrófilos. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.
A
B
C
0
1
2
3
*Le
ucóc
itos
Tot
ais
(x10
-5)/
BA
L
0
1
2
3
*
Mon
onuc
lear
es(x
10-5
)/B
AL
0.0
0.1
0.2
0.3 *
*#
*#
Neu
tróf
ilos
(x10
-5)/
BA
L
Estímulo:
Tratamento:
SAL SIL SIL SIL
SAL SAL FLU NCX-1024
Figura 16. Efeito do tratamento curativo com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022 µmol/Kg) sobre o infiltrado leucocitário no labado broncoalveolar (BAL) de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A análise foi realizada 28 dias após a indução da silicose. A- Leucócitos totais; B- Células mononucleares e C-Neutrófilos. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; # p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.
A
B
C
B
C D
A
Figura 17. Fotomicrografias (aumento de 200X) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Grupo salina (SAL), mostrando a arquitetura do parênquima pulmonar preservada; B. Grupo SIL 28, formação de granulomas difusos; C. Grupo FLU; e D. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser observada uma significativa diminuição do infiltrado inflamatório e a ausência de granulomas no parênquima pulmonar. Coloração por Hematoxilina e Eosina.
B
C D
A
Figura 17. Fotomicrografias (aumento de 200X) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Grupo salina (SAL), mostrando a arquitetura do parênquima pulmonar preservada; B. Grupo SIL 28, formação de granulomas difusos; C. Grupo FLU; e D. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser observada uma significativa diminuição do infiltrado inflamatório e a ausência de granulomas no parênquima pulmonar. Coloração por Hematoxilina e Eosina.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
SAL 28 SIL 28 FLU NO-FLU
Fib
ras
Col
ágen
as/
µµ µµm2
*
+ +
Figura 18. Fotomicrografias (aumento de 200X) referentes deposição de fibras colágenas em pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Grupo salina (SAL), mostrando a arquitetura do parênquima pulmonar preservada; B. Grupo SIL 28, grande depósito de colágeno; C. Grupo FLU; e D. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser observada uma significativa diminuição da quantidade de colágeno no parênquima pulmonar. E.Avaliação quantitativa do depósito de fibras colágenas no pulmão através de sistema de Analisador de Imagem (Image Pro). * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; + p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica. Coloração por Picrus sírius.
E
B
C D
A
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
SAL 28 SIL 28 FLU NO-FLU
Fib
ras
Col
ágen
as/
µµ µµm2
*
+ +
Figura 18. Fotomicrografias (aumento de 200X) referentes deposição de fibras colágenas em pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Grupo salina (SAL), mostrando a arquitetura do parênquima pulmonar preservada; B. Grupo SIL 28, grande depósito de colágeno; C. Grupo FLU; e D. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser observada uma significativa diminuição da quantidade de colágeno no parênquima pulmonar. E.Avaliação quantitativa do depósito de fibras colágenas no pulmão através de sistema de Analisador de Imagem (Image Pro). * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; + p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica. Coloração por Picrus sírius.
E
B
C D
A
B C
D E
Figura 19. Fotomicrografias (aumento de 1000X) de histoquímica de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Controle Negativo; B. Grupo SAL, mostrando fraca marcação para BSL-1; C. Grupo SIL 28, podem ser observados macrófagos alveolares ativados e fortemente marcados pela BSL-1; D. Grupo FLU; e E. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser notada uma diminuição significativa da intensidade de marcação para macrófagos alveolares e intersticiais.
A
B C
D E
Figura 19. Fotomicrografias (aumento de 1000X) de histoquímica de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados por via intranasal com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Controle Negativo; B. Grupo SAL, mostrando fraca marcação para BSL-1; C. Grupo SIL 28, podem ser observados macrófagos alveolares ativados e fortemente marcados pela BSL-1; D. Grupo FLU; e E. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser notada uma diminuição significativa da intensidade de marcação para macrófagos alveolares e intersticiais.
A
Figura 20. Fotomicrografias (aumento de 200X) de imuohistoquímica para metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Controle Negartivo; B. Grupo salina (SAL), mostrando fraca marcação para MMP-2; C. Grupo SIL 28 apresentou forte marcação para MMP-2; D. Grupo FLU; e E. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser notada uma diminuição significativa da intensidade da marcação para MMP-2.
A B
C D
A
Figura 20. Fotomicrografias (aumento de 200X) de imuohistoquímica para metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL, 10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022µmol/Kg). A. Controle Negartivo; B. Grupo salina (SAL), mostrando fraca marcação para MMP-2; C. Grupo SIL 28 apresentou forte marcação para MMP-2; D. Grupo FLU; e E. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser notada uma diminuição significativa da intensidade da marcação para MMP-2.
A B
C D
A
Figura 21. Fotomicrografias (aumento de 200X) de imuohistoquímica para metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL,10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024nisolida (NCX-1024) (0.022µmol/Kg). A. Controle Negativo; B. Grupo salina (SAL), mostrando fraca marcação para MMP-9; C. Grupo SIL 28 apresentou marcação acentuada para MMP-9; D. Grupo FLU; e E. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser notada uma diminuição significativa da intensidade da marcação para MMP-9.
A B
C D
A
Figura 21. Fotomicrografias (aumento de 200X) de imuohistoquímica para metaloproteinase de matriz 9 (MMP-9) de pulmões de camundongos Swiss-Webster instilados intranasalmente com sílica (SIL,10 mg) e tratados curativamente com Flunisolida (FLU) e NCX-1024nisolida (NCX-1024) (0.022µmol/Kg). A. Controle Negativo; B. Grupo salina (SAL), mostrando fraca marcação para MMP-9; C. Grupo SIL 28 apresentou marcação acentuada para MMP-9; D. Grupo FLU; e E. Grupo NCX-1024. Nos grupos tratados (FLU e NCX-1024), pode ser notada uma diminuição significativa da intensidade da marcação para MMP-9.
A B
C D
A
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
TNF-
α/m
g pr
oteí
na
SAL SIL SIL SIL
*
+
Figura 22. Efeito do tratamento curativo com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022 µmol/Kg) sobre a produção de TNFα no tecido pulmonar de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A análise foi realizada 28 dias após a indução da silicose. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. *p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; +p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.
SAL SAL FLU NCX-1024
Estímulo:
Tratamento:
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
TNF-
α/m
g pr
oteí
na
SAL SIL SIL SIL
*
+
Figura 22. Efeito do tratamento curativo com Flunisolida (FLU) e NCX-1024 (0.022 µmol/Kg) sobre a produção de TNFα no tecido pulmonar de camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (SIL, 10 mg). A análise foi realizada 28 dias após a indução da silicose. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. *p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; +p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica.
SAL SAL FLU NCX-1024
Estímulo:
Tratamento:
0
1
2
(cm
H2O
/ml)
0
1
2
(cm
H2O
/ml)
0
1
2
3
4
(cm
H2O
/ml)
∆P1
∆P2
∆Pto
t
SAL SIL SIL SIL
SAL SAL FLU NCX-1024
Estímulo:
Tratamento:
*
*
*
*+
+ +
++
Figura 23. Efeito do tratamento curativo com Flunisolida (FLU) e NCX- (0.022 µmol/Kg) sobre alteração na mecânica pulmonar verificada em camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (10 mg). A análise foi realizada 28 dias após a indução da silicose. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; + p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica que não foram tratados.
A
B
C *
*
*+
0
1
2
(cm
H2O
/ml)
0
1
2
(cm
H2O
/ml)
0
1
2
3
4
(cm
H2O
/ml)
∆P1
∆P2
∆Pto
t
SAL SIL SIL SIL
SAL SAL FLU NCX-1024
Estímulo:
Tratamento:
*
*
*
*+
+ +
++
Figura 23. Efeito do tratamento curativo com Flunisolida (FLU) e NCX- (0.022 µmol/Kg) sobre alteração na mecânica pulmonar verificada em camundongos Swiss-Webster após a instilação nasal de sílica (10 mg). A análise foi realizada 28 dias após a indução da silicose. As colunas representam a média ± EPM de no mínimo 6 animais. * p< 0.05 em comparação com animais instilados com salina; + p< 0.05 em comparação com animais instilados com sílica que não foram tratados.
A
B
C *
*
*+
5. Discussão
A silicose é causada pela inalação de poeira contendo partículas de sílica,
sendo o quartzo a forma mais comum de sílica cristalina. O desenvolvimento e a
gravidade da silicose dependem da quantidade inalada, da intensidade da
inalação e da duração da exposição à sílica (Weil,1994). Em humanos a silicose
pulmonar é caracterizada por nódulos fibróticos causados por uma inflamação
persistente que leva à proliferação de fibroblastos e acúmulo de colágeno
(Hunninghake e cols., 1984), principalmente no ápice do pulmão (Fujimura, 2000).
A silicose representa um sério problema de saúde pública, uma vez que,
apesar de ser potencialmente evitável, apresenta altos índices de incidência e
prevalência, especialmente nos países menos desenvolvidos (Carneiro, 2001). O
diagnóstico é baseado na radiografia de tórax, em conjunto com histórias clínica e
ocupacional coerentes. A Organização Internacional do Trabalho padronizou a
técnica adequada para obtenção de radiografias de boa qualidade, assim como a
codificação das alterações radiológicas das pneumoconioses, de maneira
reprodutível. Porém, os casos iniciais de silicose, como as demais doenças
pulmonares intersticiais crônicas em fases precoces são de difícil avaliação, com
alterações radiológicas discretas, confundindo-se com estruturas normais do
parênquima pulmonar. Os diagnósticos nessa situação são os que causam maior
desacordo, mesmo entre leitores radiológicos mais experientes. Nesse estágio,
pequenos desvios da técnica radiológica ideal podem ocasionar distorções no
diagnóstico e a situação torna-se mais problemática se o leitor for inexperiente
(Carneiro, 2001).
Observações realizadas em humanos demonstraram haver, para uma
exposição comparável, diferenças interindividuais com respeito ao
desenvolvimento das lesões silicóticas (Katsnelson e cols., 1986; Honda e cols.,
1993). Existem algumas evidências, ainda não conclusivas, de que fatores
genéticos possam estar relacionados à susceptibilidade individual.
Os modelos experimentais de silicose procuram reproduzir a seqüência de
eventos da silicose humana e têm sido explorados ao longo dos anos com vistas a
permitir a compreensão acerca dos mecanismos celulares e moleculares
determinantes desta doença. Porém, existem poucos trabalhos publicados
voltados para descrição de um modelo experimental que reproduza de forma
fidedigna a fisiopatologia da silicose pulmonar.
Basicamente, foram descritas duas formas de se induzir silicose em
animais: por meio de inalação das partículas em aerosol, utilizado por Davis e
cols. (1998), na qual os animais eram mantidos em uma câmara por 5 horas
durante 12 dias consecutivos, recebendo 70 mg/m3 de sílica, e a análise sendo
analisados de 16 a 20 semanas após o final da instilação. Apesar de melhor
reproduzir o que ocorre em humanos, este modelo demanda um tempo longo de
estabelecimento, além de requerer uma infra-estrutura especial. A outra forma de
indução, bastante utilizada, envolve a instilação intratraqueal das partículas de
sílica. Nesta condição, é realizada uma pequena cirurgia na qual há exposição da
traquéia do animal, sendo a sílica introduzida através de uma seringa. A dose
normalmente utilizada é 20 mg de sílica diluídos em 50µl de salina estéril (Borges
e cols., 2001; Faffe e cols., 2001).
Entretanto, em um trabalho realizado no Laboratório de Patologia Celular da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, foi demonstrado que não havia diferença
entre a dose de 10 mg e de 20 mg de sílica intratraqueal. Apesar da indução
rápida e em dose única no caso da silicose induzida mediante instilação
intratraqueal, existem algumas críticas quanto a ser um processo invasivo o que
poderia influenciar no desenvolvimento do processo inflamatório, além da forma
de indução da doença que foge completamente a condição da silicose em
humanos.
No presente trabalho procuramos desenvolver um modelo que reproduzisse
de forma mais precisa os eventos associados à ocorrência na doença humana.
Com a indução da silicose por via intranasal, conseguimos superar os problemas
encontrados nos modelos de aerolisação e no de instilação intratraqueal. A
utilização de 10 mg de sílica diluídos em 50µl de salina se mostrou eficaz em
produzir uma lesão extensa, com comprometimento principalmente do terço médio
e ápice dos pulmões dos camundongos.
Optamos pela utilização da linhagem de camundongo Swiss-Webster por
serem camundongos não isogênicos e assim representarem melhor a
variabilidade na resposta inflamatória encontrada em humanos. Não existem na
literatura trabalhos mostrando a utilização do camundongo Swiss-Webster no
desenvolvimento do modelo de silicose pulmonar. Por conta disso, optamos por
comparar nosso animal com duas outras linhagens isogênicas de camundongos
(Balb/c e C57 Bl6) (Borges e col, 2001; Faffe e cols., 2001), sendo o camundongo
Balb/c o mais comumente utilizado nesse modelo de doença. Nossos resultados
mostraram que não havia diferença significativa entre linhagens de animais
analisadas no que se refere ao perfil de celularidade total e diferencial no lavado
broncoalveolar e nas alterações verificadas ao nível do tecido pulmonar quando da
coloração por hematoxilina e eosina. A partir desses resultados vimos que
poderíamos utilizar a linhagem Swiss-Webster uma vez que foi capaz de
reproduzir a resposta verificada em outras linhagens utilizadas por outros grupos.
Embora a silicose em humanos se desenvolva ao longo de anos de
inalação, os estudos em animais mostraram que mesmo uma única exposição de
sílica pode levar a mudanças funcionais e morfológicas similares nos pulmões, o
que claramente valida a utilização destes modelos (Kuncová,1971; Lugano, 1982;
Mariani, 1995; Schapira, 1998). Apesar de ser uma doença de caráter crônico,
optamos por estabelecer tempos de análise que incluíram de 7 a 28 dias, por
representarem os estágios agudo, intermediário e crônico da silicose. Outros
autores utilizaram os tempos de 10 e 30 dias, como representantes da fase aguda
e crônica, respectivamente (Faffe e cols., 2001; Borges e cols., 2001).
Quando da entrada das partículas de sílica nas vias aéreas, estas
caminham em direção aos alvéolos, onde são fagocitadas por macrófagos,
havendo como conseqüência processo de ativação celular e liberação de
mediadores inflamatórios tais como espécies reativas de oxigênio, enzimas
lisossomais, metabólitos de ácido araquidônico, quimiocinas e citocinas,
importantes para o recrutamento celular e intensificação do processo de
fibrogênese (Fujimura, 2000).
A ação citotóxica da sílica é relatada pela ativação dos macrófagos
alveolares e pela produção de espécies reativas de oxigênio, levando a lesão
celular e ruptura da membrana lisossomal (Davis, 1986; Vallyathan e cols., 1988).
Com a lise dos macrófagos, as partículas de sílica são ingeridas por novos
macrófagos alveolares que também morrem após a ingestão das partículas. Por
conta disso, os macrófagos alveolares não conseguem remover completamente as
partículas de sílica dos pulmões (Reasor, 2001).
De forma complementar aos macrófagos, incluem-se também como células
mononucleares, os linfócitos, que também foram identificados por participar na
reação pulmonar à sílica. Tanto em animais quanto em humanos, os linfócitos
estão presentes no infiltrado inflamatório ao redor dos granulomas, no interstício e
também formando agregados linfóides intrapulmonares e no tecido linfóide
associado aos brônquios (BALT) (Reise e cols., 1982; Kumar, 1989). Struhar e
cols. (1989) demonstraram, em ratos, que após a instilação da sílica houve um
aumento do número de linfócitos T no BAL e no tecido pulmonar. Foi verificado
também que a resposta linfocitária era dominada por células CD4+, com pico de
resposta ocorrendo entre 14-30 dias de exposição (Kumar, 1989). Além disso,
populações específicas de linfócitos T em pulmões silicóticos produzem IFN-γ em
quantidade aumentada. Esta citocina seria responsável pela manutenção da
população macrofágica ativada na silicose (Davis e cols., 2000). A diminuição
temporal do inflitrado inflamatório também pode ser observada na análise do
tecido pulmonar corado pela hematoxilina e eosina.
Em nossos resultados verificamos que a estimulação por sílica determinou
um aumento significativo no número de neutrófilos presentes no BAL, fenômeno
este que se mostrou de igual intensidade ao longo de todo o processo. Além
disso, vimos um aumento nos níveis de KC de no lavado broncoalveolar nos
animais silicóticos. Na análise do BAL não vimos diferenças significativas no
número de neutrófilos entre os grupos sílica, mesmo fato que foi observado
quando da quantificação do KC (IL-8 murina) que possui um importante papel no
recrutamento desse tipo celular.
Vanhee (1995) mostrou que citocinas e fatores de crescimento tais como o
TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-8, TGF-β, PDGF e IGF produzidos pelos macrófagos
alveolares estão diretamente implicados na cascata de eventos que levam ao
desenvolvimento da fibrose pulmonar. Já foi demonstrado que na silicose, o TGF-
β promove o acúmulo de matriz extracelular tanto por aumentar a síntese de
colágeno e fibronectina, quanto por inibir a degradação da matriz extracelular pela
diminuição da secreção de proteases e/ou aumento da secreção de inibidores de
proteases (Jagirdar, 1996). Esses fenômenos corroboram com os resultados
encontrados com a quantificação das fibras colágenas, quando foi detectado um
aumento significativo, principalmente, no grupo silicótico em 28 dias.
Vimos em nosso trabalho um aumento significativo no conteúdo de
algumas dessas citocinas e fatores de crescimento envolvidos na silicose nos
animais que receberam sílica, quando comparados com o grupo salina.
Analisando o BAL, observamos um aumento temporal significativo dos níveis de
TNF-α, e TGF-β. Porém, no caso da quimiocina KC foram verificados níveis
aumentados durante todo o período de análise. Já na análise desses fatores no
tecido pulmonar, verificamos aumento nos níveis de KC e MIP-2, bem como de
TNF-α, IFN-γ e TGF-β. A geração destes fatores apresenta correlação temporal
com o infiltrado leucocitário e a cronificação do quadro, revelada pela ocorrência
de intensa fibrose e formação de granulomas. Estes achados encontram respaldo
na literatura e reforçam o fato de que o modelo desenvolvido foi capaz de
reproduzir o quadro silicótico verificado em outros modelos experimentais e
também na doença humana.
A degradação da MEC constitui um evento essencial em muitos processos
fisiológicos como durante o desenvolvimento embrionário, crescimento e reparo
dos tecidos. Por outro lado, sua excessiva degradação pode acarretar o
desenvolvimento de várias condições patológicas, dentre as quais cita-se artrite
reumatóide, osteoartrite e doenças autoimunes (Westermarck, 1999). Algumas
proteases específicas conhecidas como metaloproteinases de matriz (MMPs), do
inglês "matrix metalloproteinases", formam uma importante família de
endopeptidases metal-dependentes, secretadas na forma inativa, com zinco no
sítio ativo (Curran, 2000). Existem, atualmente 20 tipos de MMPs humanas, as
quais são agrupadas de acordo com a estrutura e substrato específico em:
colagenases (MMP-1, -8 e -13), estromelisinas, gelatinases (MMP-2, -9) e
metaloproteinases ligadas à membrana plasmática (Thomas, 1999; Nabeshima,
2002). O desequilíbrio existente entre as metaloproteinases (MMPs) e seus
respectivos inibidores teciduais (TIMPs) permite o acúmulo destas proteínas
secretadas principalmente por fibroblastos (Perez-Ramos cols., 1999). Ao
fazermos a marcação para MMP-2 e -9 no tecido pulmonar, observamos uma forte
marcação no caso dos animais silicóticos, em comparação com os controles. No
caso particular da MMP-9, observou-se marcação predominante em macrófagos o
que vem reforçar achados de literatura indicativos de ser esta MMP mais
associada a células inflamatórias (Corbel, 2000).
De forma interessante, podemos associar o aumento significativo no
conteúdo de colágeno no tecido pulmonar numa fase mais crônica ao aumento de
∆P2, L, (relacionado a vias aéreas periféricas). Faffe e cols. (2001), ao analisarem
a mecânica tecidual de pulmões silicóticos, também observaram um aumento
significativo da resistência tecidual em relação a dos animais controle. O aumento
de ∆P1, L (relacionado com vias aéreas centrais) parece estar mais relacionado
com o infiltrado inflamatório encontrado principalmente ao redor dos brônquios.
Segundo Marchiori (2002), a silicose na sua forma crônica clássica em geral
se desenvolve após longos períodos de exposição (acima de dez anos) a baixas
concentrações de poeira inalada. O tipo acelerado pode se desenvolver em
períodos de exposição de cinco a dez anos, sendo este um termo clínico aplicado
à doença com progressão intermediária entre a forma crônica e a aguda. A forma
aguda se desenvolve com um tempo de exposição relativamente curto a grandes
concentrações de sílica (de meses até cerca de cinco anos), com início rápido dos
sintomas clínicos e uma evolução progressiva fatal, não alterada pelo tratamento.
Clinicamente, os pacientes apresentam dispnéia de início súbito, que se torna
progressiva e incapacitante. Outras queixas comuns são tosse, fadiga, febre e
perda de peso.
Conforme mencionado anteriormente, o tratamento da silicose se baseia na
prevenção e no afastamento do trabalhador da sua atividade profissional. Porém,
as alterações funcionais são bastante tardias e com isso o paciente não procura o
atendimento médico a tempo de impedir a instalação da doença. Outro fato
importante é a autoprogressão da doença mesmo após o afastamento do paciente
do contato com a sílica (Reiser, 1983).
Existem poucos trabalhos na literatura a respeito do tratamento da silicose
em humanos ou com a utilização de modelos experimentais. Trabalhos utilizando
a tetrandrina (extraído da raiz da Stephania tetrandra) foram realizados como
terapia alternativa para o tratamento da silicose (Xie, 2002; Liu, 1994). Segundo
Liu (1994), foram observadas melhoras significativas nos aspectos radiográficos
de pacientes tratados com a tetrandrina de 1 a 3 anos. Outro composto bastante
testado na silicose pulmonar foi a polivinilpiridina-N-oxido (PVNO). O PVNO é
conhecido por reduzir ou prevenir os efeitos tóxicos, fibrogênicos e
imunossupressores da sílica, provavelmente por agir diretamente nos macrófagos
pulmonares (Larry, 1983). Zhao e cols. (1983) observaram significativa melhora
nos pacientes tratados com PVNO, porém quando o tratamento era interrompido a
doença progredia novamente.
Também, quando da utilização do tratamento profilático com PVNO,
Goldstein & Rendall (1987), descreveram haver melhora no caso dos animais
tratados, porém observaram, também, a progressão da doença quando do término
do tratamento.
Os glicocorticóides (exógeno ou endógeno) suprimem a resposta
imunológica normal, sendo esta propriedade imunossupressora a que melhor
caracteriza as suas indicações terapêuticas para o tratamento dos processos
inflamatórios, doenças auto-imunes e para a viabilização de transplantes
(Finamor, 2002; Kountz, 1997).
Os efeitos antiinflamatórios e imunossupressores dos glicocorticóides
ocorrem devido às suas seguintes ações: Interferem na circulação das células
imunes, diminuem o número de linfócitos periféricos, principalmente linfócitos T e
inibem o acúmulo de neutrófilos no local da inflamação. Além disso, promovem
apoptose das células linfóides, inibem a síntese de citocinas, modulam direta e
indiretamente a função das células B, inibem a resposta proliferativa dos
monócitos ao fator de estimulação de colônias e sua diferenciação em
macrófagos, também inibindo as suas funções fagocíticas e citotóxicas. Inibem o
movimento de células e fluídos a partir do compartimento intravascular; Inibem a
ação da histamina, a síntese das prostaglandinas e a ação dos ativadores do
plasminogênio (Kountz, 1997).
Sharma e cols. (1991), avaliaram o efeito da utilização do corticóide
prednisolona por seis meses em pacientes com silicose crônica. Os resultados
desse trabalho mostraram que a prednisolona, em determinados pacientes,
diminuiu a alveolite causada pela sílica, em associação com redução na
população leucocitária presente no lavado broncoalveolar, melhora na função
pulmonar e na PaO2 (pressão parcial de oxigênio).
Com base na escassez de tratamentos realmente eficazes no caso da
silicose, no presente trabalho buscamos investigar o potencial efeito curativo de
composto esteroidal de mais nova geração, a flunisolida. Este é um glicocorticóide
derivado da fluocinolona acetonida, usado no tratamento das inflamações das vias
aéreas, principalmente aqueles que possuem um componente alérgico. É
administrado primeiramente como um aerossol (nasal ou oral) (Pakes, 1980;
Wallace, 2004). O uso local de corticóides pode reduzir a dose total utilizada no
tratamento do paciente e minimizar efeitos colaterais sistêmicos.
Este pensamento conduziu ao desenvolvimento dos corticóides inalatórios
para o tratamento principalmente de quadros alérgicos. A segunda geração destes
compostos inclui o dipropionato do beclometasona, a budesonida, a fluticasona e
a flunisolida, entre outros. Os efeitos sistêmicos desses corticóides inalatórios são
mínimos quando utilizados nas doses recomendadas. Apesar da eficiência
corticóides inalatórios, entre eles a flunisolida, no tratamento da alergia, esses
compostos ainda não foram testados na silicose pulmonar (Szefler, 2001).
Estudos prévios demonstraram a eficiência de compostos associados a
uma molécula doadora de óxido nítrico. Wallace e cols. (2004), observaram uma
redução significativa da toxicidade sistêmica do NCX-1024, que nada mais é do
que a clássica flunisolida à qual foi acoplada uma molécula doadora de óxido
nítrico. Em estudos com a NXC-1015 (NO-prednisolona), Paul-Clark e cols.
(2002) observaram uma redução significativa da erosão óssea e cartilaginosa
associada à artrite em ratos tratados apenas com a prednisolona.
Ao testamos o efeito da NCX-1024 no tratamento da silicose, também
optamos pela via de administração intranasal de forma a minimizar a ocorrência
de efeitos sistêmicos adversos provocados pelo uso dos corticóides. Adotamos a
utilização de um tratamento curativo, ou seja, administração dos compostos por
um período de 7 dias, inciando-se 21 dias após a instilação de sílica. Com isto
buscamos nos aproximar mais da condição verificada na clínica, quando o
paciente ao procurar auxílio médico já se encontra com o quadro da doença
instalado.
Como resultado observamos que houve uma diminuição significativa da
resposta inflamatória nos animais tratados com flunisolida e com NCX-1024, no
que se refere ao infiltrado celular e deposição de componentes de matriz
extracelular e TNF-α. De forma coerente, as alterações verificadas na mecânica
respiratória, tanto nas vias aéreas centrais como periféricas, foram revertidas pelo
tratamento com flunisolida e NCX-1024. Entretanto, diferentemente dos estudos
realizados utilizando compostos nitrosilados em outros modelos experimentais, até
o presente momento não detectamos diferença significativa na intensidade de
inibição verificada nos animais tratados com flunisolida e aqueles que receberam
NCX-1024. Porém, vale mencionar que a dose de flunisolida utilizada mostrou-se
extremamente potente em inibir a fase crônica do processo silicótico, o que veio a
dificultar nossa análise comparativa entre as potências de NCX-1024 e o
composto parente flunisolida. Novos experimentos já encontram-se em andamento
no sentido de esclarecer este ponto.
6. Conclusões
6.1. O estabelecimento de um modelo experimental de silicose em
camundongos Swiss-Webster, mediante instilação nasal de dose única de
partículas de sílica, mostrou-se eficaz em induzir resposta inflamatória marcante e
quadro de fibrose pulmonar, o que se refletiu em claro comprometimento da
função respiratória;
6.2. O tratamento curativo com flunisolida e NCX-1024 se mostrou
extremamente eficaz em reverter o quadro de infiltrado inflamatório e da
conseqüente fibrose pulmonar, com conseqüente na melhoria da capacidade
respiratória dos animais silicóticos;
6.3. Devido à intensa supressão do quadro silicótico verificada na condição do
tratamento com flunisolida e NCX-1024, não nos foi possível detectar diferenças
significativas entre a potência anti-inflamatória de ambos os compostos, o que
implica na necessidade da realização de experimentos adicionais para
esclarecimento acerca deste ponto;
6.4. Em conjunto, nossos resultados indicam que tanto flunisolida e NCX-1024
constituem terapias promissoras de utilização no caso de doenças inflamatórias
pulmonares crônicas, de caráter fibrótico, como a silicose.
8. Referências Bibliográficas
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PRELIMINARY VERSION
Respiratory mechanics and morphological changes in
lung injury induced by intranasal silica in mice
Januário M. Lima; Tatiana P.T. Ferreira; Francisco A. Farias Filho, Patrícia B.
Jurgilas1, Jonas H. Perales1, Marcelo Pelajo2, Patrícia R. M. Rocco3; Cristiane
Garcia3, Alba Fernandes3, Vincent Lagente4, Cory Hogaboam5, Marco Martins and
Patrícia Silva.
Laboratory of Inflammation, 1Laboratory of Toxinology , 2Laboratory of Pathology,
Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ, Av. Brasil, no 4365, Manguinhos, CEP 21045-
900, 3 Laboratory of Pulmonary Investigation, CCS, Federal University of Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil; 4Université de Rennes 1, France; 5Department of
Pathology, University of Michigan, USA.
*Author for correspondence
E-mail address: [email protected]
Tel: 55.21.2562-0818, Fax: 55.21.2558-7382
A ser submetido ao American Journal of Pathology
Abstract
Silicosis is one of the oldest occupational diseases, still killing thousands of
people in the world. In this study we developed a non-invasive model of silicosis in
mice, in order to investigate the role of mediators involved in the genesis of
pulmonary fibrosis processes and the chronology of inflammatory phenomena
preceding the processes of tissue lesion and repair. The comparative analysis
among different strains of mice as C57Black6, Balb/c and Swiss Webster revealed
a the occurrence of leukocyte infiltration at day 7, peribronchiolar granuloma
formation at day 14, followed by an extensive tissue fibrosis at day 28. As revealed
by staining with pricrus-sirius, 28-day silicotic mice exhibited a massive deposition
of collagen in the lungs when compared from control mice. Analysis of different
mice strain responsiveness to intranasal silica showed that all three species
exhibited a similar pattern of response. Further experiments were performed in
Swiss Webster mice since this is not an inbred mouse strain thereby modeling the
outbred human condition associated with silicosis. The kinetics of leukocyte
infiltration in BAL fluid revealed that there is a marked increase in the number of
total leukocytes, at 7 days, which reduces progressively with time. A similar profile
was noted in the case of mononuclear cells, while neutrophil numbers remained
elevated for at least 60 days after the introduction of silica into mice. Tissue
analyses showed that there is a marked inflammatory celIn parallel, a marked
increase in the levels of fibrogenic cytokines namely TNF-alpha, TGF-beta and IL-
13 was detected. These responses directly correlated with alteration of lung
function as attested by elevation in lung resistance and static elastance.
Altogether, our findings indicate that the nasal instillation of silica into various
strains of inbred and outbred mice reproduces critical features of the human
silicosis.
Key words : Inflammation, lung, silica particles.
Introduction
Environmental and occupational lung disorders are an important aspect of
clinical medicine and the economic costs are staggering. Billions of dollars are
paid out in workers compensation annually for job-related illness and injuries
associated with silicosis. According to publications by the World Health
Organization, silicosis is an occupational disease that produces the largest number
of victims and kills thousands worldwide each year.
Silicosis is the consequence of a long-term exposure to inhaled dust of silica
dioxide or silica in its free and crystalline form, and it can be detected through a
simple chest X ray, which will reveal the presence of small nodules in the upper
lungs. The resulting respiratory insufficiency is a consequence of changes in lung
ventilation and gas exchange, and the decrease in respiratory function is a limiting
factor for the patient’s activities.
Pulmonary fibrosis response is traditionally seen as a phenomenon
occurring after an acute inflammatory response, although up to this moment there
is no clinical evidence proving the actual existence of a direct relationship between
inflammatory parameters and the evolution of this disease. However, it has been
described, in specialized literature, that tissue fibrosis begins its amplification from
an initial lesion, and thus acts by modulating the phenomenon of tissue repair,
regarding both the accumulation of mesenchymal cells and the synthesis of
extracellular matrix components (Keane and Strieter, 2002). This has led some
research groups to focus their studies on the expression of components of the
extracellular matrix and on molecules that are normally involved in the regulation of
homeostasis.
Experimental silicosis models attempt to reproduce the sequence of events
of human silicosis and have been explored over the years to provide
comprehension regarding the determination of cellular and molecular mechanisms
of this disease. However, there are very few published articles describing an
experimental model which faithfully reproduces the physiopathology of pulmonary
silicosis. Basically there are two described forms of inducing silicosis in animals.
According to Davis et al. (1998), animals inhaled aerosol particles during 5 hours
a day, during 12 consecutive days, receiving 70 mg/m3 of silica dust, and the
analysis was carried out from 16 to 20 weeks after instillation. Although it is a good
reproduction of what happens in humans, this model requires a long time for the
disease to establish itself, besides needing special infrastructure. The other, more
commonly used, form of induction involves the intratracheal instillation of silica
particles. A small surgical procedure is performed in which the animal’s trachea is
exposed and silica dust is introduced with a syringe. The commonly used dose is
20 mg of silica dust diluted in 50µl of sterile saline (Borges et al., 2001; Faffe et al.
2001). Although induction is fast and requires only one dose, this technique has
been criticized for being invasive, which might influence the development of the
inflammatory process, besides inducing the disease in a completely different
manner from what happens in humans.
In this paper we sought to develop a model which reproduced in a more
accurate manner the events associated to what happens in the human disease. By
inducing silicosis intranasally, we were able to overcome the problems found in
aerosol models and in intratracheal models.
We will focus our attention on the development of a non-invasive model of
silicosis in mice, in order to investigate the role of mediators involved in the
genesis of pulmonary fibrosis processes and the chronology of inflammatory
phenomena preceding the processes of tissue lesion and repair. We will give
particular emphasis to connective tissue elements, including extracellular matrix
components, as well as to matrix metalloproteinases, cytokines and chemokines,
aiming to identify potential therapeutic targets.
Materials and Methods
Animals
Male C57/BL6, Balb/c and Swiss Webster mice (180-200 g) were obtained
from the Oswaldo Cruz Foundation Breeding (Rio de Janeiro, Brazil) and and kept
in the animal-housing facilities of the Department of Physiology and
Pharmacodynamics with controlled room temperature (22-25 ºC) and a 12-h (6:00
AM-6 PM) light dark cycle. All the procedures involving care and use of laboratory
animals in this study were examined and approved by the Animal Ethics
Committee of the Oswaldo Cruz Foundation (licence 0213).
Silicosis induction
Animals were anaesthetised by halothane (Tanohalo, Cristália, São Paulo)
and then injected intranasally with 10 mg of silica (SiO2), (SiO2, S-5631 Sigma
Chemical Co, St. Louis, MO, USA, particle size: 0.5 -10 µm) diluted in 50 µl of
sterile saline intranasal solution. Tests were performed in different times, after 7,
14 and 28 days (figure 1). For comparative analysis between different types of
mice, a time of 28 days was fixed after silica dust instillation.
Bronchoalveolar Lavage (BAL)
Bronchoalveolar lavage was carried out with a polyethylene cannula
inserted in the trachea and a total volume of 1.5 ml of buffered saline solution
(PBS) containing 10 mM of EDTA was instilled and then aspirated in 2 consecutive
lavages of 0.75 ml. Samples were centrifuged at 300 x g for 10 minutes, and the
supernatant was collected and frozen for later quantification of mediators. The
cellular pellet was suspended again in 0.25 ml for cell analysis.
Leukocyte counting
The total number of leukocytes was analyzed by diluting the samples in Türk
liquid (1:10), and counting was carried out in a Neubauer chamber with light
microscope. The differential analysis used cell smears stained with the May-
Grunwald-Giemsa method. Evaluation was carried out with immersion in oil and
light microscope (BX51, Olympus).
Histopathologic Analysis
After being put down with a high dose of Thiopental (i.p.), perfusion was
performed by means of an intracardiac cannula with a solution of saline and
heparin (1:10) for blood collection. All animals later received buffered
paraformaldehyde at 4% through the same means. In both procedures the flasks
containing the solutions were kept at a height of 110 cm so that hydrostatic
pressure would reproduce the physiological conditions of blood circulation. The
lungs were then fixed in buffered formaldehyde at 10% for 24 hours, dehydrated in
increasingly concentrated ethanol solutions, clarified with xylene and finally set in
paraffin. Histologic cuts of 5 µm were performed using paraffin blocks containing
fragments of lung tissue, and submitted to the following staining and
immunohistochemical methods. For the analysis of general aspects of lung tissue,
the histologic cuts were stained with hematoxilin-eosin, analyzed with light
microscope (BX51, Olympus) at different magnifications, and photographed with a
digital camera (C-7070, Olympus). For collagen quantification we used histologic
cuts stained with phosphomolybdic acid-Sirius Red (PMA-SR) technique and
observed through a light microscope (BX51, Olympus). Five images were obtained
from each slide by using a digital camera (BX51, Olympus), each containing areas
with nodular lesions induced by silica dust, visible at 20X magnification. Images
were processed and the amount of collagen was quantified by using the image
analysis program Image Pro Plus 4.0 (Media Cybernetics, USA). In order to
evaluate the presence of neutrophils in the lung tissue we used Lennert’s Giemsa
stain with differentiation in acetic acid at 0.5%. After staining, the slides were
photomicrographed for later analysis.
Immunohistochemistry for MMP-2 and MMP-9
To highlight metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) the antibodies
anti-MMP-2 (SC6838, Santa Cruz, CA, USA) and anti-MMP-9 (SC6841, Santa
Cruz, CA, USA) were used. After removal from paraffin, the cuts were hydrated
with TBS pH 7.6, blocked with H2O2 at 3% in methanol for ten minutes and the
slides were then washed three times with TBS and blocked with Tris-HCL + BSA
2% for 20 minutes. Primary anti-bodies anti-MMP-2 and MMP-9 were diluted with
Tris-HCL + BSA 1% in 1:100 and 1:80 ratios, respectively. The slides were
incubated with the primary antibody for 12 hours. After incubation they were
washed twice with TBS. The secondary antibody, anti-IgG (goat) (811620 Zymed,
USA) was diluted in Tris-HCL and incubated for 30 minutes. Development was
performed with AEC for approximately 10 minutes. The slides were finally washed
with distilled water, counter-stained with Mayer’s hematoxilin and mounted in an
aqueous substrate.
Immunehistochemistry for the marking of activated M acrophages
In order to highlight alveolar macrophages, biotinylated BSL 1 lectin (Vector
Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) was used. After removal from paraffin the
cuts were hydrated and endogenous peroxide was inhibited (H2O2 at 3% in
methanol) and tissue charges were blocked (3% borax), as were the unspecific
reagents links, by means of incubation with phosphate buffered saline (PBS)
containing bovine albumin (BSA) at 3%. The biotinylated lectin was incubated for
16 hours at 4o C in a humid room (1:250 dilution in PBS-BSA at 1%) and detected
by the Streptavidin-Peroxide conjugate by using diaminobenzidine as chromogenic
substrate – FAST DAB (Sigma, St Louis, MO, USA) according to the
manufacturer’s instruction. The slides were counter-stained with hematoxilin.
Quantification of chemokines and cytokines
We used 96-compartment plates where we added 50 ml/compartment of the
capturing antibody, diluted in a buffer composed of 1.5 M NaCl, 0.5 M of H3BO4
and 1 N of NaOH; incubation period was 12 hours at 40o C. The compartments
were washed 3 times (200 ml/compartment) with buffer 1, composed of buffered
saline solution PBS/0.005 % of Tween 20. After this phase, in order to block
unspecific sites, the plate was filled (200 ml/compartment) with buffered PBS saline
solution/bovine albumin serum (BSA, 2%) for one hour at 37o C. The
compartments were washed three times with buffer 1 (200 ml/ compartment).
Samples and standards were diluted in buffer 1 containing 2% of bovine fetal
serum (BFS) (buffer 2) and then added to the compartments (50 ml/compartment).
After the incubation period (1 hour at 37o C) a new sequence of 3 washings was
performed (200 ml/compartment) with buffer 1. The bioetinylated detector antibody
(50 mg/ml) was then added and kept in incubation for 45 minutes at 37o C. The
compartments were washed with buffer 1 (200 ml/compartment) and incubated for
30 minutes at 37o C (100 ml/compartment) with a NeutrAvidin “horseradish
peroxide” (HRP) mixture diluted in buffer 2. After the last wash with buffer 1 (200
ml/compartment) the orthophenylenediamine dichloride (OPD) substrate was
added (100 ml/compartment) to develop the colorimetric reaction (approximately 3
to 5 minutes), which was interrupted by adding 50 ml/compartment of H2SO4 (3 M).
The spectrophotometric analysis was carried out in a plate reader for 450 nm
wavelength.
The quantification of inflammatory mediators included cytokines TNF-α, INF-
γ, TGF-β and chemokines KC and MIP-2α. Commercial kits were used (R&D
System, USA) and all manufacturer’s instructions were followed. The analyzed
samples were taken from the bronchoalveolar lavage (point 3.3) and the lung
tissue. In the case of tissue, it was homogenized in 1 ml of PBS containing a
“complete” cocktail of protease inhibitors (Hoffmann-La Roche Ltd, Basel,
Switzerland), followed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and the
supernatant was recovered for later quantification of mediators.
Respiratory mechanics
For respiratory mechanic tests we used 5 animals from each group. They
were sedated with diazepam (5 mg/kg, i.p.) and then anesthetized with sodium
pentobarbital (20 mg/kg, i.p.) and tracheostomized for the introduction of a 20-
gauge Jelco needle. The animals were positioned in supine position for the
removal of thoracic and abdominal walls, paralyzed with gallamine triethiodide (2
mg/kg i.v.) and then mechanically ventilated with constant flow and volume.
A pneumotacograph was connected to a tracheal cannula to measure air
flow (V’), and by integrating the flow signal, we obtained the mobilized gas volume
(V) (Mortola, 1983). Tracheal pressure (Ptr) was measured through a side exit of
the circuit, by means of a differential pressure transducer.
Respiratory mechanics were analyzed with the method of occlusion at the
end of inspiration, based on the insufflation of the respiratory system with constant
air flow followed by a quick closure of the airway at the end of inspiration. We
observed a quick initial drop of Ptr (∆P1, L) up to a point of curve inflexion (Pi, L),
followed by a slow decrease (∆P2, L) until it reached a plateau representing the
elastic pressure of the respiratory system (Pel, L). ∆P1, L and ∆P2, L respectively
correspond to the viscous and viscoelastic components of the respiratory system.
The sum of ∆P1, L and ∆P2, L equals ∆PTOT. Static and dynamic elasticity values
(Est, L and Edyn, L, respectively) of the system were calculated by dividing Pel, L
and Pi, L by current volume (VT) (Bates, 1988).
Statistic analysis
The results were expressed as mean ± standard error mean (SEM) and
statistically analyzed by variance analysis (ANOVA), followed by a Newman-Keuls-
Student multiple comparison test. Values of p < 0.05 were considered statistically
significant for both tests.
Results
Comparative Analysis of Pulmonary Inflammatory Resp onse Induced
by Instilled Silica Dust in Rats
In order to establish a non-invasive model of silicosis, first we made a
comparative evaluation of the silica-induced response in three different species of
mice. Two isogenic species were chosen (Balb/c and C57 Bl6), together with a
non-isogenic one (Swiss-Webster). For this analysis we chose a period of 28 days,
as this corresponds to the chronic phase of the disease and therefore to the most
critical stage of the silicotic process. We initially evaluated the cellular content of
bronchoalveolar lavage of silicotic animals when compared with controls (instilled
with saline). We observed an increased number of leukocytes in the
bronchoalveolar lavage (BAL) of the tested animals, with clearly predominant
macrophages and a significant infiltrate of neutrophil polymorphonuclears (Fig. 3).
All three species analyzed presented a similarly intense granulomatous response,
as attested by hematoxilin and eosin stains (Fig. 4). Based on these results we
decided to use Swiss-Webster mice in the subsequent essays, as their non-
isogenicity may be more representative of the response observed in humans with
the disease.
Kinetics of Silica-Induced Pulmonary Inflammatory Response in
Swiss-Webster Rats
Evaluation of Leukocyte Contents in Bronchoalveolar Lavage
Our analysis worked with periods of 7, 14 and 28 days, as these represent
the acute, the intermediary and the chronic stages of silicotic disorder. We
observed that the bronchoalveolar lavage contained an increased number of total
leukocytes, with a peak at 7 days and a progressive decline at 14 and 28 days.
The differential analysis revealed a predominance of macrophages, with a
significant increase in the number of neutrophils. These latter cells presented
constant high levels throughout the analysis period (Fig. 5).
Evaluation of Morphologic Changes in Pulmonary Tiss ue
We observed that the lungs of control animals showed preserved pulmonary
parenchyma for all times analyzed, with alveolar spaces free of inflammatory cells
and bronchiolar structures lined with cuboid to cylindrical pseudo-stratified
epithelium (Fig. 6A). As shown in figures 6 and 7, we observed that after 7 days
the silicotic animals showed diffusely altered parenchyma with the presence of
inflammatory cells and large areas of alveolar collapse (Fig. 6B). This inflammatory
infiltrate had a marked presence of neutrophil polymorphonuclears (Fig. 7A). In the
group of 14-day silicotic animals we observed the existence of nodular structures
(granulomas), sometimes confluent (Fig. 6C), made up of inflammatory cells
among silica particles (Fig. 7B). The 28-day group showed better delimitated
granulomas and maintained cellularity including macrophages and neutrophils (Fig.
6D). The alveolar walls presented a larger number of mononuclear cells, which
determined the identification of evident wall thickening (Fig. 7C).
By using Picrus-Sirius stain to visualize collagen fibers, our microscopy
showed a small amount of collagen fibers in the pulmonary parenchyma of control
animals, in all analyzed times (Fig. 8A). Silicotic animals showed a time-dependent
increased content of collagen fibers; its peak was observed on day 28,
corresponding to the chronic phase of silicotic response (Figures 8B, 8C and 8D).
Evaluation of Cellular Infiltrate in Pulmonary Pare nchyma
The macrophages in the lungs of control animals were either not responsive
or weakly responsive to BSL-1 (Fig. 9A). In the case of the silicotic animals we
observed that interstitial and alveolar macrophages were highly positive in their cell
membranes, which favored the identification of the activated population after 7
(Fig. 9B), 14 (Fig. 9C) and 28 (Fig. 9D) days.
Lennert’s Giemsa stain showed no markings for neutrophil
polymorphonuclears in control animals (Fig. 10A). However, under the same
experimental conditions we observed the presence of neutrophils with apoptotic
aspect in the pulmonary tissue of silicotic animals in all three times analyzed
(Figures 10B, 10C and 10 D).
Identification of Inflammatory Mediators Generated During Silicotic
Response in Rats
With the aim to identify inflammatory mediators which take part in the
silicotic response, we went on to analyze some relevant chemokines and
cytokines. We studied the bronchoalveolar lavage and pulmonary tissue and
initially detected an increased amount of KC in the bronchoalveolar lavage; KC is a
C-X-C chemokine which corresponds to human IL-8 (Fig. 11A). Equivalent
amounts of KC were detected in different analysis times. Both TNF-α and TGF-β
were increased in a time-dependant manner in the BAL, with a peak on the 28th
day after silica instillation (Figures 11B and 11C, respectively).
During pulmonary tissue analysis we observed high levels of KC (Fig. 12A)
during all three analysis times. Other mediators showed a progressive increase:
chemokines and cytokines were increased in the silicotic animals, with their peak
on day 28. MIP-2 (Fig. 12B), IFN-γ (Fig. 12C), TNF-α (Fig.12D) and TGF-β (Fig.
12E) were analyzed.
Analysis of the Presence of Metalloproteinases 2 a nd 9 (MMP-2 and
MMP-9) in Pulmonary Tissue
For the evaluation of MMP-2 and MMP-9 we used the
immunehistochemistry technique, which allowed us to observe that the lungs of
control animals showed weak marking for MMP-2 and 9 (Figures 13A and 14A).
Silicotic animals showed strong marking for MMP-2 and MMP-9 on days 7 and 28
(Figures 13 and 14).
Evaluation of Respiratory Mechanics in Silicotic Mi ce
The analysis of respiratory mechanics showed a significant increase of
variations of resistive pressures ∆P1, L (related to central airways), ∆P2, L (related
to peripheral airways) and ∆Ptot (the sum of both pressures, ∆Ptot L= ∆P1, L + ∆P2,
L) in silicotic animals when compared to saline animals, in all three analyzed times
(Fig. 15). On day 28 the silicotic animals presented a significant increase of ∆P2, L
when compared with other silicotic animals. This increase is apparently related to
pulmonary fibrosis observed in animals after 28 days of silica instillation.
Discussion
Silicon is a serious public health problem, since its incidence and prevalence
are very high, especially in less developed countries, even though it is potentially
avoidable (Carneiro, 2001).
Observations in humans showed inter-individual differences regarding the
development of silicotic lesions (Katsnelson et. al., 1986; Honda et. al., 1993).
There is some evidence that genetic factors may be related to individual
susceptibility, although such evidence is not as yet conclusive.
Experimental silicosis models attempt to reproduce the sequence of events
of human silicosis and have been explored over the years to provide
comprehension regarding the determination of cellular and molecular mechanisms
of this disease. However, there are very few published articles describing an
experimental model which faithfully reproduces the physiopathology of pulmonary
silicosis.
Basically there are two described forms of inducing silicosis in animals.
Davis et al. had animals inhale aerosol particles (1998). In his technique, animals
were kept in a room for 5 hours during 12 consecutive days, receiving 70 mg/m3 of
silica dust, and analysis was carried out from 16 to 20 weeks after instillation was
concluded. Although it is a good reproduction of what happens in humans, this
model requires a long time for the disease to establish itself, besides needing
special infrastructure. The other, more commonly used, form of induction involves
the intratracheal instillation of silica particles. A small surgical procedure is
performed in which the animal’s trachea is exposed and silica dust is introduced
with a syringe. The commonly used dose is 20 mg of silica dust diluted in 50µl of
sterile saline (Borges et al., 2001; Faffe et al. 2001). Although induction is fast and
requires only one dose, this technique has been criticized for being invasive, which
might influence the development of the inflammatory process, besides inducing the
disease in a completely different manner from what happens in humans.
In this paper we sought to develop a model which reproduced in a more
accurate manner the events associated to what happens in the human disease. By
inducing silicosis intranasally, we were able to overcome the problems found in
aerosol models and in intratracheal models. Our choice for 10 mg of silica dust
diluted in 50µl of saline proved to be efficient as it caused an extensive lesion,
compromising mainly the middle third and the apex of mice’s lungs.
We chose Swiss-Webster mice since they are not isogenic, therefore more
representative of the inflammatory response variability found in humans. There are
no other papers the in literature describing the use of Swiss-Webster mice to
develop models of pulmonary silicosis. For this reason we compared our animals
with two other isogenic mouse types (Balb/c and C57 Bl6) (Borges et al., 2001;
Faffe et al., 2001), as Balb/c is the most commonly used in this disease model. Our
results showed that there was no significant difference between the analyzed
animal strains in terms of cell profile and differential of the bronchoalveolar lavage,
or in the alterations observed in pulmonary tissue when stained with hematoxilin
and eosin. With these results we realized we could use the Swiss-Webster
animals, since they are capable of reproducing the response observed in other
strains used by other groups.
Although silicosis in humans develops over years of inhalation, studies with
animals have showed that even a single exposure event may lead to similar
functional and morphologic changes in the lungs, which clearly validates the use of
these models (Kuncová, 1971; Lugano, 1982; Mariani, 1995; Schapira, 1998). In
spite of the disease’s chronic character, we decided to establish analysis times
which included 7 to 28 days, as these represent the acute, intermediate and
chronic phases of silicosis. Other authors used 10 and 30 days as representatives
of acute and chronic phases, respectively (Faffe et al., 2001; Borges et al., 2001).
When the silica particles enter the airways, they move towards the alveoli,
where they are phagocyted by macrophages. The consequence of this is the
process of cellular activation and release of inflammatory mediators such as
reactive oxygen species, lysosomal enzymes, metabolites of arachidonic acid,
chemokines and cytokines, important for cellular recruitment and for the
intensification of the fibrogenesis process (Fujimura, 2000).
The cytotoxic action of silica is a consequence of the activation of alveolar
macrophages and of the production of reactive oxygen species, causing cellular
lesion and the rupture of lysosome membranes (Davis, 1986; Vallyathan et al.,
1988). With macrophage lysis, silica particles are phagocyted by new alveolar
macrophages, which also die after ingesting them. For this reason alveolar
macrophages cannot completely remove the silica particles from the lungs
(Reasor, 2001).
As complementary help to macrophages there are also mononuclear cells,
the lymphocytes, also shown to take part in pulmonary reaction to silica. In animals
as well as in humans, lymphocytes are present in the inflammatory infiltrate around
the granulomas, in the interstice and also forming lymphoid aggregates in the lungs
and in the bronchus-associated lymphoid tissue (BALT) (Reise et al., 1982; Kumar,
1989). Struhar et al., (1989) demonstrated, in mice, that following silica instillation
there was in increase in the number of T-lymphocytes in BAL and in the pulmonary
tissue. They also observed that lymphocyte response was dominated by CD4+
cells, with a response peak between 14 and 30 days after exposure (Kumar, 1989).
Furthermore, specific populations of T-lymphocytes in silicotic lungs produce IFN-γ
in increased quantities. This cytokine could be responsible for the maintenance of
macrophage populations activated during silicosis (Davis et al., 2000). The time
reduction of inflammatory infiltrate can also be observed by analyzing pulmonary
tissue stained with hematoxilin and eosin.
Our results showed that silica stimulation caused a significant increase in
the number of neutrophils present in the BAL, a phenomenon which maintained the
same intensity throughout the process. We also observed increased levels of KC in
the bronchoalveolar lavage of silicotic animals. BAL analysis showed no significant
differences in the number of neutrophils among the silicotic groups; the same was
observed when quantifying KC (IL-8 murina), which plays an important role in the
recruitment of this cell type.
Vanhee (1995) showed that cytokines and growth factors such as TNF-α, IL-
1, IL-6 and IL-8, TGF-β, PDGF and IGF produced by alveolar macrophages are
directly involved in the sequence of events which lead to the development of
pulmonary fibrosis. It has been demonstrated that during silicosis TGF-β promotes
the accumulation of extracellular matrix, both because it increases the synthesis of
collagen and fibronectin and because it inhibits the degradation of extracellular
matrix by reducing the secretion of proteases and/or increasing the secretion of
protease inhibitors (Jagirdar, 1996). Such phenomena corroborate the results
found with the quantification of collagen fibers, when a significant increase was
detected mainly in the silicotic group, day 28.
Our work showed a significant increase in the content of some of these
cytokines and growth factors involved in the silicosis of animals exposed to silica
when compared to the saline group. By analyzing BAL we observed a significant
time increase of the levels of TNF-α and TGF-β. However, levels of chemokine KC
were increased throughout the analysis period. The analysis of these factors in the
pulmonary tissue showed increased levels of KC and MIP-2, as well as TNF-α,
IFN-γ and TGF-β. The generation of these factors presents a temporal relation with
leukocyte infiltrate and disease chronification, as demonstrated by the occurrence
of intense fibrosis and granuloma formation. These findings are backed by the
literature and corroborate the fact that the model developed was capable of
reproducing the silicotic scenario observed in other experimental models and in the
human disease as well.
The degradation of MEC is an essential event in many physiologic
processes such as during embrionary development and in tissue growth and
repair. On the other hand, excessive degradation may lead to the development of
various pathologic conditions, such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis and auto-
immune diseases (Westermarck, 1999). A few specific proteases known as matrix
metalloproteinases (MMPs) are an important family of metal-dependent
endopeptidases, secreted in their inactive form with zinc in the active site (Curran,
2000). Currently there are 20 known types of human MMPs, grouped according to
their structure and specific substrates in: collagenases (MMP-1, 8 and 13),
stromelysins, gelatinases (MMP-2 and 9) and metalloproteinases linked to the
plasmatic membrane (Thomas, 1999; Nabeshima, 2002). The existing imbalance
between metalloproteinases (MMPs) and their respective tissue inhibitors (TIMPs)
allows these proteins, mostly secreted by fibroblasts, to accumulate (Perez-Ramos
et al., 1999). When marking for MMP-2 and 9 in pulmonary tissue, we observed
strong marking in the case of silicotic animals when compared with controls. In the
specific case of MMP-9 we observed predominant marking in macrophages, which
strengthen literature findings indicating that this MMP is more associated with
inflammatory cells (Vincent – review). Neutrophils should also be considered
cellular sources of MMP-9.
Interestingly we may associate the significant increase of collagen contents
in pulmonary tissue in a more chronic stage to the increase of ∆P2, L (related to
peripheral airways). Faffe et al., (2001), when analyzing tissue mechanics of
silicotic lungs, also observed a significant increase of tissue resistance when
compared with control animals. The increase of ∆P1, L (related to central airways)
seems to be more related to the inflammatory infiltrate mainly found around the
bronchi.
Legends
Figure 1. Comparative analysis of the leukocyte infiltration in the bronchoalveolar
lavage (BAL) of three species of mice. White bars represent the saline group. Gray
bars represent the silica group. The mice were divided in three groups: Swiss
Webster, Balb/c and C57 Bl6. Total leucocytes (A), mononuclear cells (B) and
neutrophils (C). Values are means (SEM) of six animals. (+) Values significantly
different between salina and silica (p < 0.05). Photomicrographs of lung
parenchyma stained with hematoxylin and eosin (E, F and G) or Picro-Sirius (H, I
and J) in Swiss-Webster (E and H) Balb/c (F and I) and C57 Bl6 (G and J). 28
days after silica instillation (10 mg). We observed the same nodular infiltration of
neutrophils and macrophages in lung. (Magnification ×200. Scale bars = 200 µm).
Figure 2. Kinetics of leukocyte infiltration in the ronchoalveolar lavage (BAL).
White bars represent the saline group and Gray bars represent the silica group.
The mice Swiss Webster were divided in three groups: 7 days, 14 days and 28
days. Total leucocytes (A), mononuclear cells (B) and neutrophils (C). Cytokines
and chemokines in Bronchoalveolar Lavage (BAL). KC (D), TNF-α (E) and TGF-β
(F). Values are means (SEM) of six animals. (+) Values significantly different
between salina and silica (p < 0.05).
Figure 3. Photomicrographs of lung parenchyma stained with hematoxylin and
eosin (A, B, C and D) or Picro-Sirius (E, F, G and H) in Swiss-Webster, saline (A
and E), 7 (B and F), 14 (C and G) and 28 days (D and H) after silica instillation (10
mg). We observed a temporal increased in the size of granulomatous nodules
secondary to silica exposure. (Magnification ×200. Scale bars = 200 µm). Graphic
of quantification of collagen fiber content at pulmonary parenchyma. White bars
represent the saline group and Gray bars represent the silica group. (+) Values
significantly different from saline, P < 0.05. (*) Values significantly different from
other silica groups, P < 0.05.
Figure 4. Photomicrographs of imunohistochemistry of lung parenchyma marked
with F4/80 (A, B, C and D). Figures (E, F, G and H) were stained with Giemsa of
Lennert in Swiss-Webster, saline (A and E), 7 (B and F), 14 (C and G) and 28 days
(D and H) after silica instillation (10 mg). We observed a temporal increase in the
intensity of marking in silica groups (B, C and D). In slices stained with Giemsa,
we saw a strong marking for neutrophils (F, G and H). (Magnification ×200. Scale
bars = 200 µm).
Figure 5. Cytokines and chemokines on pulmonary tissue. White bars represent
the saline group and Gray bars represent the silica group. KC (A), MIP-2 (B), MIP-
1α (C), TNF-α (D), TGF-β (E) and IFN-γ (F). Values are means (SEM) of six
animals. (+) Values significantly different between salina and silica (p < 0.05).
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