UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF

Institut für Pathologie

Prof. Dr. med. Guido Sauter

Intratumorale Heterogenität der EGFR Genvermehrung im nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizinan der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.

vorgelegt von:

Tobias Hoenig aus Hamburg

Hamburg 2015

1

Angenommen von der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: 27.05.2015

Veröffentlicht mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.

Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: Prof. Dr. Guido Sauter

Prüfungsausschuss, zweite/r Gutachter/in: Prof. Dr. Heinz-Eckard Laack

Prüfungsausschuss, dritte/r Gutachter/in: PD Dr. Ronald Simon

2

Danksagung

Zunächst möchte ich mich herzlich bei Prof. Dr. med. Guido Sauter bedanken, der mir das Thema dieser Doktorarbeit in seinem Institut für Pathologie angeboten hat.

Dr. Dr. Tobias Grob gilt mein besonderer Dank für seine engagierte Zusammenarbeitmit mir. Dank seiner tatkräftigen Unterstützung war die Publikation unseres Papers im Journal „Lung Cancer“ erst möglich.

Frau Christina Koop danke ich für ihre stetige Betreuung im Labor und ihre große Hilfe beim Erstellen eines Tissue Microarrays.

Zuletzt möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir zu jeder Zeit Rückhalt und Zuversicht gegeben haben.

3

Inhaltsverzeichnis1 Einleitung....................................................................................................................5

1.1 Tyrosinkinaserezeptoren (TKR)..........................................................................51.1.1 Epidermal-Growth-Factor-Rezeptor (EGFR)..............................................6

1.2 Molekular zielgerichtete Therapie.......................................................................71.2.1 Monoklonale Antikörper...............................................................................71.2.2 Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI)....................................................................71.2.3 EGFR- Aberrationen als prädiktiver Marker................................................8

1.3 Heterogenität von Tumoren................................................................................91.4 Ziel der Doktorarbeit...........................................................................................9

2 Material und Methoden.............................................................................................102.1 Erstellen eines Tissue Microarrays (TMA)........................................................102.2 Zusammenstellen des Gewebekollektivs.........................................................112.3 EGFR Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)............................................112.4 EGFR Immunhistochemie (IHC).......................................................................122.5 EGFR Sequenzierung ......................................................................................12

3 Ergebnisse................................................................................................................133.1 EGFR FISH ......................................................................................................13

3.1.1 Lymphknotenmetastasen..........................................................................143.2 EGFR Immunhistochemie ................................................................................153.3 EGFR Mutationsanalyse amplifizierter Tumore................................................15

4 Diskussion................................................................................................................164.1 Molekulare Diagnostik bei Heterogenität..........................................................164.2 EGFR Aberrationen..........................................................................................164.3 Hohe Polysomie................................................................................................164.5 EGFR Amplifikationen.......................................................................................174.6 Vergleich Primärtumor vs Metastase ...............................................................184.7 Prädiktiver Wert................................................................................................194.8 EGFR Mutationen.............................................................................................19

5 Fazit..........................................................................................................................216 Literaturverzeichnis..................................................................................................227. Paper.......................................................................................................................288. Lebenslauf...............................................................................................................369. Eidesstattliche Versicherung ................................................................................38

4

1 Einleitung

Das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom (NSCLC) ist ein maligner epithelialer Tumor

der Lunge. Es ist eines der weltweit am häufigsten zum Tode führenden Karzinome

bei Männern und Frauen (61).

Je nach Tumorstadium unterscheidet sich das therapeutische Vorgehen. Während

nicht disseminierte NSCLC in frühem Stadium primär kurativ reseziert werden, wird

bei fortgeschrittenem Tumorstadium oder Inoperabilität eine Chemo- und/oder

Radiotherapie durchgeführt (62).

Ein weiterer, seit einigen Jahren etablierter Behandlungsansatz ist eine molekular

gezielte Therapie mit Tyrosinkinaseinhibitoren gegen den Epidermal-Growth-Factor-

Receptor (EGFR). Diese Therapien werden abhängig von molekularen Analysen von

EGFR-Aberrationen in einer (in der Regel durch eine Biopsie gewonnenen)

Tumorgewebeprobe eingeleitet (s. Abschnitt 1.2).

Studien über prädiktive Marker für das Ansprechen dieser molekular zielgerichteten

Therapien ergaben unterschiedliche Ergebnisse (s. Abschnitt 1.2.3). Dies könnte

durch eine Heterogenität von EGFR-Aberrationen in einem Tumor begründet sein (s.

Abschnitt 1.3).

Die folgenden Abschnitte beschreiben die Grundlagen des Epidermal-Growth-Factor-

Receptor und dessen molekular zielgerichteter Therapie bei nicht-kleinzelligen

Bronchialkarzinomen und liefern damit die Basis zur Zieldefinition dieser Arbeit (s.

Abschnitt 1.4).

1.1 Tyrosinkinaserezeptoren (TKR)

Wachstum, Morphogenese und Stoffwechselprozesse einer Körperzelle werden

maßgeblich von Wachstumsfaktoren/-hormonen beeinflusst, welche an spezifische

Rezeptoren binden, diese aktivieren und damit eine intrazelluläre Signalkaskade

initiieren. Viele dieser Prozesse werden durch Phosphorylierung und

Dephosphorylierung von Proteinen reguliert, wobei die Phosphatgruppen meist auf

die Aminosäuren Serin und Threonin aber auch auf Tyrosin übertragen werden (43).

Eine wichtige Familie von membranständigen Wachstumshormonrezeptoren, welche

die Phosphorylierung von Tyrosin katalysieren, sind die sogenannten

Tyrosinkinaserezeptoren, zu denen u.a. die Insulin-, PDGF-, VEGF- und ErbB-

Rezeptor-Familien gehören (s. Abschnitt 1.1.1).

5

Mit der Aktivierung der Tyrosinkinase durch Phosphorylierung der Tyrosinreste

werden weitere Adapterproteine aktiviert. Hierdurch werden verschiedene

Signalkaskaden, wie z.B. der RAS/RAF-MAP-Kinase-Pathway oder der PI3K/AKT-

Pathway aktiviert, die das Zellwachstum stimulieren und den apoptotischen Zelltod

hemmen (41, 42, 44).

Mutationen im Gen von Tyrosinkinaserezeptoren können onkogene Wirkungen

haben, indem sie über verschiedene Mechanismen eine konstitutive Aktivierung der

Rezeptorkinasen bewirken und so zu einem unkontrollierten Wachstum und maligner

Entartung der Zelle führen.

1.1.1 Epidermal-Growth-Factor-Rezeptor (EGFR)

Auf der Basis struktureller Homologien lassen sich die Rezeptor-Tyrosinkinasen in

verschiedene Familien einteilen. Eine von ihnen ist die ErbB- oder auch HER-

(Human Epidermal Growth Factor Receptor) Familie, zu der insgesamt vier

Rezeptoren gezählt werden: HER1/EGFR (ErbB1), HER2/c-neu (ErbB2), HER3

(ErbB3) und HER4 (ErbB4). Diese 170-200 kDa großen Glykoproteine haben trotz

großer Gemeinsamkeiten alle eine unterschiedliche, spezifische Funktion (41, 42).

Der EGF-Rezeptor kann parakrin, juxtakrin und autokrin durch verschiedene

Liganden (EGF, TGF-α, Amphiregulin, Betacellulin und Epiregulin) aktiviert werden

und mehrere, für das Zellwachstum essentielle, Signalkaskaden einleiten. Zu diesen

gehören vor allem der bereits genannte RAS/RAF-MAP-Kinase-Pathway sowie der

PI3K/AKT-Pathway. Des Weiteren findet eine Aktivierung der Proteine STAT3/5 und

Proteinkinase C statt, welche ebenfalls eine proliferative Wirkung besitzen.

In vielen soliden Tumoren konnte eine verstärkte EGFR-Expression (u.a. aufgrund

einer Amplifikation des auf Chromosom 7p12 kodierten EGFR-Gens) nachgewiesen

werden (51, 52). EGFR-Überexpression wurde bei vielen Tumorentitäten mit

fortgeschrittener Krankheit, aggressiveren Phenotyp und generell schlechter

Prognose in Verbindung gebracht (1). Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass

von diesen Tumoren häufig auch ein oder mehrere EGFR-Liganden produziert

werden, wodurch es zu einer autokrinen Überstimulation kommt (44).

Die proliferativen Eigenschaften und das damit verbundene onkogene Potential des

EGF-Rezeptors machen diesen zu einem stark beforschten Therapieziel in der

Krebsbekämpfung.

6

1.2 Molekular zielgerichtete Therapie

Die zytostatische Wirksamkeit klassischer Chemotherapeutika und die damit

verbundene mittlere Überlebenszeit/-rate ist bei fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen

Bronchialkarzinomen relativ gering, die systemischen Nebenwirkungen sind aber

teilweise erheblich (53, 54). Daher ist es von großem Interesse, neue Medikamente

zu entwickeln, die einen spezifischen Prozess der Signaltransduktion, der in den

Tumorzellen verändert ist, hemmen und so molekular gezielt und nebenwirkungsarm

wirken.

1.2.1 Monoklonale Antikörper

Ein möglicher Therapieansatz ist die Gabe von monoklonalen Antikörpern, die an

Oberflächenmoleküle binden, die von den Tumorzellen vermehrt exprimiert werden.

Die Bindung dieses Antikörpers an einen Rezeptor kann die Ligandenbindung und

damit die Initiierung der Signaltransduktion verhindern, oder sie führt zur Zelllyse

durch Aktivierung zytotoxischer Zellen des Immunsystems.

Ein klinisch etabliertes Beispiel bei Mamma- und Magenkarzinomen ist Trastuzumab,

ein monoklonaler Antikörper gegen den HER2/Neu Rezeptor, der von ca 15-20%

aller Mammakarzinome auf Grund einer HER2-Gen-Amplifikation vermehrt exprimiert

wird. Bei Patienten mit HER2/Neu positiven Tumoren konnte unter der Behandlung

mit Trastuzumab eine Überlebenszeitverlängerung, sowie eine Verringerung des

Rezidivrisikos festgestellt werden (55).

Ein weiteres Beispiel ist Bevacizumab, ein Antikörper, der gegen den vaskulären

epithelialen Wachstumsfaktor (VEGF) gerichtet ist und somit die Angioneogenese

von Tumoren hemmt. Dieser Antikörper wird besonders für die Behandlung von

fortgeschrittenen kolorektalen Karzinomen eingesetzt.

Weitere Präparate, welche für die Behandlung von Kolonkarzinomen Verwendung

finden sind Cetuximab und Panitumumab. Sie sind gegen den EGF-Rezeptor

gerichtete Antikörper.

1.2.2 Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI)

Neben den extrazellulär wirkenden Antikörpern gibt es auch Medikamente, die

intrazellulär Moleküle inhibieren, die für die Signaltransduktion und Zellproliferation

essentiell sind. Das wohl bekannteste Präparat aus dieser Reihe ist Imatinib, ein

Tyrosinkinaseinhibitor. Imatinib inaktiviert gezielt die Kinase des durch Translokation7

entstehenden BCR-ABL Fusionsproteins, welches für die Entstehung der chronisch-

myeloischen Leukämie verantwortlich ist und führt bei fast allen Patienten zu einer

hämatologischen und in ca. 85% der Fälle zu einer molekulargenetischen Remission

(60).

Auch in der Behandlung des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms sind Inhibitoren

der EGF-Rezeptor-Tyrosinkinasen wie Erlotinib und Gefitinib als molekular

zielgerichtete Therapie bereits etabliert. Der Einsatz dieser Pharmaka ist allerdings

nur in einigen Fällen indiziert (s. Abschnitt 1.2.3). In den meisten Fällen konnten

keine oder nur sehr geringe Überlebensvorteile gegenüber der Chemotherapie

beobachtet werden (56).

1.2.3 EGFR- Aberrationen als prädiktiver Marker

EGFR-Mutationen, EGFR-Genkopienanzahl und EGFR-Proteinexpression in NSCLC

wurden in klinischen Studien als prädiktive Marker für das Ansprechen auf molekular

zielgerichtete Therapien untersucht (2, 9, 13, 35, 58). Hierbei traten EGFR-

Mutationen stets als stark prädiktive Marker für ein Ansprechen auf eine Therapie mit

TKI, nicht jedoch mit Cetuximab hervor.

Es konnte gezeigt werden, dass in den Tumoren von Patienten, die besonders gut

auf die Therapie ansprechen, eine Mutation des EGFR-Gens im Bereich der

katalytischen Domäne vorhanden ist (Exon 18 - 21), was zu einer Etablierung der

TKI-Erstlinientherapie bei Patienten mit EGFR-Mutationen führte (5-7, 45, 46).

Verschiedene Studien zur Untersuchung der EGFR-Genkopienanzahl als prädiktiver

Marker für ein Ansprechen auf TKI und Cetuximab ergaben sehr unterschiedliche

Resultate (8, 9, 13-18). Es wurde vorgeschlagen, dass durch Fluoreszenz-in-situ-

Hybridisierung (FISH) ermittelte EGFR-Genkopieerhöhungen als prädiktiver Marker

für eine TKI Therapie nicht nur auf EGFR-Genamplifikationen beschränkt sind,

sondern auch auf hohe Polysomien von Chromosom 7 (≥40% der Tumorzellen mit

mindestens vier Kopien) (10, 13-16, 49).

Die EGFR-Proteinexpression erwies sich in einigen Studien als unbrauchbarer

prädiktiver Maker für TKI-Therapien (2, 3), jedoch wurde sie nach Ergebnissen der

FLEX Studie als prädiktiver Marker für eine Cetuximab-Therapie vorgeschlagen (4).

Eine Validierung dieser Resultate steht jedoch noch aus.

8

1.3 Heterogenität von Tumoren

Zellpopulationen ein und desselben Tumors können verschiedene Merkmale bzw.

Mutationen tragen. Ursache dafür scheint ein Selektionsvorgang während des

Tumorwachstums zu sein, der es ermöglicht, weitere Mutationen und chromosomale

Aberrationen in den ohnehin schon unkontrolliert wachsenden Tumorzellen

entstehen zu lassen. So kann es sein, dass zwei Biopsien aus demselben Karzinom

verschiedene Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen, Mutations-

oder FISH-Analysen haben (27, 34, 35, 47, 48).

1.4 Ziel der Doktorarbeit

Trotz beachtlicher Bemühungen hat sich kein klares Bild vom prädiktiven Wert der

EGFR-Genkopienanzahl für eine Therapie mit TKI oder Antikörpern ergeben. Eine

intratumorale genetische Heterogenität könnte eine mögliche Ursache für die

unterschiedlichen Resultate sein. Solche Tumorheterogenitäten können besonders

bei Bronchialkarzinomen von großer Bedeutung sein, da die Diagnose üblicher

Weise anhand einer kleinen Biopsie (oder sogar weniger Zellen in Fällen von

Zytologieproben) gestellt wird. Beim Vorliegen heterogener Tumore bestünde die

Gefahr der Fehldiagnose und Fehlbehandlung. Bei entsprechender Heterogenität

könnte der Großteil eines vermeintlich „EGFR-negativen“ Tumors durchaus mit TKIs

wirksam in seiner Progression gehemmt werden. Auf der anderen Seite hätte ein

vermeintlich „EGFR-positiver“ Befund bei Heterogenität zur Folge, dass nur ein Teil

der Karzinomzellen durch diese Therapie gehemmt werden und der Rest nicht zur

Remission gebracht werden kann.

Ziel dieser Doktorarbeit ist es, das Ausmaß von intratumoraler Heterogenität der

EGFR-Genkopienanzahl und EGFR-Proteinexpression in nicht-kleinzelligen

Bronchialkarzinome, mittels immunhistochemischer Färbung und Fluoreszenz-in-situ-

Hybridisierung von Tissue Micro Arrays, zu untersuchen.

9

2 Material und Methoden

2.1 Erstellen eines Tissue Microarrays (TMA)

Der Tissue Microarray (TMA) stellt eine seit mehreren Jahren etablierte Methode dar,

mit Hilfe derer man eine große Anzahl von Geweben schnell und kostengünstig

untersuchen kann. Hierzu werden aus den zu untersuchenden, in Paraffin

eingebetteten Tumorgeweben (FFPE) Stanzen entnommen und diese anschließend

in einen neuen Empfänger-Paraffinblock gebettet (Abb. 1). Auf diese Weise ist es

möglich, mehrere hundert verschiedene Tumorgewebe auf einem solchen

Empfängerblock zu sammeln und anschließend das gesamte Kollektiv auf einem

Schnitt mit einer Färbung auf DNA-, RNA- und Proteinebene zu untersuchen (11).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der TMA-Herstellung a) Kopf des Arrayers mit Bohrer und

Hohlnadel, HE-Schnitt als Schablone und Tumorparaffinblock; b) Hohlnadel mit Tumorgewebe, Array;

c) und d) Übertragung eines TMA-Schnittes auf einen Objektträger (Sauter et al. 2003)

10

2.2 Zusammenstellen des Gewebekollektivs

Um die Heterogenität von Biomarkerabweichungen in NSCLC zu analysieren,

wurden in der Datenbank des Instituts für Pathologie der Universität Hamburg-

Eppendorf 373 Patienten auf ausreichend verfügbares Tumorgewebe untersucht. In

144 Fällen waren mindestens vier in Paraffinblöcken eingebettetes, formalinfixiertes

Tumorgewebe in den Archiven des Instituts gelagert. Von diesen Tumoren wurden

jeweils acht verschiedene Gewebestanzen für die TMA-Konstruktion entnommen.

Hierbei wurde darauf geachtet, dass die Stanzen von Arealen entnommen wurden,

die weitest möglich von einander entfernt lagen (nach Möglichkeit von verschiedenen

Blöcken; für genauere Angaben siehe Publikation). Außerdem wurden bis zu vier

verschiedene Lymphknotenmetastasen von 62 (von den 144) Patienten mit positivem

Lymphknotenbefall untersucht. Es wurde eine Stanze pro Metastase entnommen.

Alle originalen Schnitte des für den TMA benutzen Gewebes wurden erneut gemäß

den WHO 2004 Kriterien auf ihren histologischen Typ und ihr histologisches Grading

untersucht (12).

2.3 EGFR Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Die TMA-Schnitte wurden mittels eines kommerziellen Kits proteolytisch

vorbehandelt (Paraffin pre-treatment reagent kit, Abbott). Das Vysis LSI EGFR

Spectrum Orange/CEP7 Spectrum Green Probe Kit (Abbott) wurde nach

Herstelleranweisungen für die Detektion von EGFR-Genen benutzt. Das

Vorhandensein von Tumorzellen wurde in jeder Tumorprobe durch Vergleich mit

einem Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbten Referenz-TMA-Schnitt verifiziert. Auf jedem

Spot wurden 20 Tumorzellen nach vorgeschlagenen Richtlinien zur Evaluation der

EGFR-Genkopienanzahl ausgewertet (19).

FISH-Kriterien für die Wertung „EGFR positiv“:

1.) ≥40% der Tumorzellen weisen ≥4 EGFR Gensignale auf

2.) Tumorproben mit einer EGFR-Genamplifikation entsprechend folgender Kriterien:

a) Das EGFR zu CEP7 Verhältnis aller Zellen ist >2 (bei ≥2 CEP7 Kopien pro Zelle)

b) Gen-Cluster (≥4 EGFR Gensignale mit Clusterverteilung) in ≥10% der Zellen

c) ≥15 EGFR Gensignale in ≥10% der Tumorzellen

11

2.4 EGFR Immunhistochemie (IHC)

Für die immunhistochemische Färbung der TMA-Schnitte wurde das EGFR pharmDx

IHC-Kitsystem (Dako) nach Anweisung des Herstellers angewandt. Im Anschluss an

die Inkubation mit dem primären monoklonalen Antikörper, Klon 2-18C9, gegen

humanes EGFR-Protein verwendet dieses Kit ein gebrauchsfertiges

Visualisierungsreagenz auf der Basis der Dextrantechnologie.

Auswertung:

Die Auswertung wurde von einem geschulten Pathologen mithilfe eines

Lichtmikroskops durchgeführt. Dabei wurde die Intensität der Membranfärbung auf

den einzelnen Gewebespots (in Analogie zum Scoringsystem von HER2 in Brust-

und Magenkrebs (20)) in eine vierstufige Skala unterteilt (0, 1+, 2+, 3+).

2.5 EGFR Sequenzierung

Alle EGFR-amplifizierten Fälle wurden zusätzlich sequenziert, um etwaige

Mutationen in der EGFR-Tyrosinkinasedomäne (Exons 18-21) festzustellen.

Nachdem per Makrodissektion oder Laser-Capture Mikrodissektion (PALM Micro

Beam Laser System, Zeiss Microlmaging) ein Tumorzellgehalt von mindestens 70%

gewährleistet war, wurde die Tumor DNA vom FFPE Gewebe nach Standardprotokoll

extrahiert (QiAmp DNA Mini Kit, Qiagen). Quantität und Qualität der DNA wurde

mittels Nanodrop Spektrophotometer ND-1000 (Thermo-Scientific) evaluiert. 50 ng

der DNA wurden in der PCR Reaktion eingesetzt, wobei der AmpliTaq Gold PCR

Mastermix (Applied Biosystem) unter den empfohlenen Bedingungen des Herstellers

verwendet wurde. DNA-Fragmente der Exons 18-21 wurden mittels spezifischer

Primer amplifiziert. Nach Verifizierung per QlAxcel System (Qiagen) wurden die PCR

Produkte mit einem enzymatischen Verfahren gereinigt (ExoSAP-IT; USB Products)

und eine Sequenzierreaktion mit einem BidDye Terminater Cycle Sequencing Kit

(Applied Biosystems) durchgeführt. Die Sequenzierprodukte wurden mit einem ABI

PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) analysiert.

12

3 Ergebnisse

3.1 EGFR FISH

Die EGFR-Genkopienanzahl war mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung in

insgesamt 1055 Spots (durchschnittlich 7,3 Spots pro Tumor) der TMAs

interpretierbar. In den 261 anderen Spots war die Analyse entweder aufgrund

mangelnder Qualität der Hybridisierung, unzureichender Anzahl der analysierbaren

Tumorzellen, oder komplett fehlender Tumorgewebeprobe auf dem TMA-

Schnittpräparat nicht möglich.

In 37 (25,7%) Tumoren wurde eine hohe Polysomie (40% der Tumorzellen mit ≥4

Signalen des Chromosoms 7, gemäß (19)) nachgewiesen. 36 dieser Tumore waren

heterogen für hohe Polysomie und wiesen andere Proben ohne EGFR-

Genkopieerhöhung auf. In zwei von diesen Fällen konnte in verschiedenen Proben

zusätzlich eine EGFR-Genamplifikation nachgewiesen werden. Ein Tumor konnte

nicht auf seine Heterogenität evaluiert werden, da nur eine Gewebeprobe in der

EGFR FISH Analyse analysierbar war, so dass in keinem der Tumore mit mehreren

interpretierbaren Gewebeproben eine homogene hohe Polysomie aufgefunden

werden konnte (Fig 1B der Publikation). Von den 35 Tumoren ohne gleichzeitige

EGFR-Amplifikation wies ein Durchschnitt von 26,1% (1,8/6,8) Spots eine hohe

Polysomie auf.

In dreizehn Tumoren konnte in ein bis elf Spots eine EGFR-Genamplifikation

festgestellt werden, wobei sechs Fälle eine homogene Amplifikation und sieben Fälle

eine intratumorale Heterogenität aufwiesen. Bei den heterogenen Fällen konnten im

Durchschnitt in 34% (2,4/7,1) der Spots eine Genamplifikation nachgewiesen

werden. Zwei dieser sieben Fälle beinhalteten, wie oben beschrieben, Spots mit

hoher Polysomie des Chromosoms 7 neben Spots mit Amplifikation und negativen

Spots.

Heterogene Tumore wurden separat histologisch untersucht, wobei keine

morphologischen Unterschiede zwischen amplifizierten und nicht amplifizierten

Tumorarealen im Grenzgebiet festgestellt wurden (Abb. 2).

13

Abbildung 2: Beispiel eines NSCLC mit heterogener EGFR Amplifikation und EGFR Expression

A) HE Färbung; B) EGFR Immunhistochemie; C) EGFR FISH Analyse eines amplifizierten

Tumorgebietes; D) EGFR FISH Analyse eines nicht amplifizierten Tumorgebietes (Grüne Signale der

FISH Analyse repräsentieren das Zentromer 7, orangene Signale repräsentieren das EGFR Gen)

3.1.1 Lymphknotenmetastasen

Zwischen den Primärtumoren und den korrespondierenden Lymphknotenmetastasen

konnte keine Abweichung der EGFR-Amplifikationen festgestellt werden. Vier

Tumore mit homogener EGFR-Amplifikation wiesen eine identische Amplifikation in

bis zu drei Lymphknotenmetastasen auf.

14

Insgesamt konnten in 16 Fällen mit heterogener EGFR-Genkopieerhöhung

zusätzliche Lymphknotenmetastasen evaluiert werden. Hierbei zeigten zwei Tumore

eine fokale Amplifikation und 14 Tumore eine fokale hohe Polysomie. Die EGFR-

Genkopienanzahl der Lymphknotenmetastasen war stets mit einem Teil des

Primärtumors identisch. Unterschiedliche EGFR-Genkopieerhöhungen zwischen

einzelnen Lymphknotenmetastasen eines Primärtumors konnten in vier von 11 Fällen

nachgewiesen werden.

3.2 EGFR Immunhistochemie

Die immunhistochemische Analyse des EGFR-Proteins konnte in 1203 Gewebespots

erfolgreich durchgeführt werden. Die anderen 113 Gewebespots wurden aus der

Analyse ausgeschlossen, da die Spots auf dem TMA-Schnitt fehlten, oder zu wenige

Tumorzellen für eine Evaluation enthielten. Im Durchschnitt waren 8,4 Spots eines

jeden Tumors analysierbar. Eine starke Immunfärbung mindestens eines Spots kam

in 84 (58,3%) und eine komplett negative Immunfärbung aller untersuchten Spots in

8 (5,6%) Tumoren vor. Die meisten Tumore zeigten ein gewisses Ausmaß an

Heterogenität der EGFR-Expression. Nur 20 (13,9 %) Tumore wiesen eine komplette

Homogenität in allen untersuchten Spots auf (8 Tumore negativ, 1 Tumor schwach

positiv, 11 Tumore stark positiv). Alle 6 homogen amplifizierten Fälle wiesen hierbei

eine homogen stark positive IHC-Färbung auf. 31 (21,5%) Tumore zeigten Areale mit

starker Expression neben vollständig negativen Tumoranteilen.

3.3 EGFR Mutationsanalyse amplifizierter Tumore

In vier der dreizehn amplifizierten Tumore konnte per Sequenzanalyse eine typische

Mutation des EGFR-Gens nachgewiesen werden. Zwei dieser Tumore zeigten eine

homogene EGFR-Amplifikation, die zwei anderen eine heterogene EGFR-

Amplifikation.

15

4 Diskussion

4.1 Molekulare Diagnostik bei Heterogenität

Für molekular zielgerichtete Krebstherapien stellt Tumorheterogenität ein großes

Problem dar. Der zu untersuchende Biomarker könnte lediglich in einer Fraktion

eines Tumors vorhanden sein. Die molekulare Diagnostik von durch Biopsien

gewonnenen Gewebeproben wäre dadurch in ihrer Aussagekraft limitiert. Unter einer

zunächst effektiven molekular zielgerichteten Krebstherapie könnte es daher nach

einiger Zeit zu Resistenzen kommen, nachdem zielstrukturpositive Tumorzellen

abgestorben sind und zielstrukturnegative Zellen die Überhand gewinnen.

Gemessen an ihrer Wichtigkeit wurde die Heterogenität von Tumoren bisher in relativ

wenigen Studien untersucht. In den meisten dieser Studien wurde die Heterogenität

durch Analyse eines oder zweier Gewebeblöcke pro Tumor/Patient quantifiziert (28,

29, 37). Die gesamte Biologie eines großen Tumors kann jedoch nicht durch lediglich

eine kleine Gewebesektion repräsentiert werden.

Unser Verfahren, in dem wir mittels TMA Proben von acht so weit wie möglich von

einander lokalisierten Arealen pro Tumor analysiert haben, ermöglicht eine deutlich

umfassendere Analyse molekularer Eigenschaften in einer großen Anzahl von

Tumoren.

4.2 EGFR Aberrationen

In unserer Studie fanden wir in 48 (33,3%) von 144 NSCLC eine Erhöhung der

EGFR-Genkopienanzahl. Hierbei waren keine signifikanten Unterschiede zwischen

den verschiedenen histologischen Subtypen erkennbar. Wir konnten auch keine

signifikante Assoziation einer erhöhten EGFR-Genkopienanzahl mit dem

histologischen Grad, oder mit dem Staging des Tumors feststellen. Vorherige

Studien, die mittels FISH die EGFR-Genkopienanzahl in Bronchialkarzinomen

untersucht haben, haben, mit einer Erhöhung bei 31-45% aller Tumore,

vergleichbare Ergebnisse erzielt (15, 22, 23).

4.3 Hohe Polysomie

Hohe Polysomie wurde in der Vergangenheit als prädiktiver Marker für die

Wirksamkeit einer Anti-EGFR-Therapie vorgeschlagen (10). Dieses Vorgehen hat

16

sich jedoch nicht bewährt. Eine ausgeprägte Heterogenität könnte Grund für den

niedrigen prädiktiven Wert sein.

Die Daten unserer Studie zeigen eine sehr hohe Rate von Bronchialkarzinomen mit

einer Heterogenität der Aberrationen der EGFR-Genkopienanzahl. Dies trifft

insbesondere zu, wenn die EGFR-Aberration durch hohe Polysomie bedingt ist. Alle

36 Bronchialkarzinome (mit mindestens zwei auswertbaren Gewebespots), in denen

eine hohe Polysomie nachgewiesen wurde, hatten Tumoranteile mit und ohne hohe

Polysomie. Da die Evaluation von hoher Polysomie durch FISH schwierig und

anfällig für Fehler ist, sind weitere Studien zur Validierung unserer Resultate sinnvoll

(19).

Technische Limitationen können zu der Variabilität unserer Daten beigetragen

haben. So ist z.B. bei der Determinierung, ob 40% der Zellen 4 oder mehr Signale

aufweisen, oder nicht, die Dicke des Paraffinschnittes von entscheidender

Bedeutung. Mit Zunahme der Schnittdicke werden FISH Analysen immer mehr

Signale hervorbringen, da der Durchmesser von Tumorzellkernen stets größer ist, als

die Tiefe des Schnittes.

Die Validität unserer FISH Daten wird durch die signifikante Assoziation zwischen

hoher Polysomie und hohem Level von EGFR-Proteinexpression unterstützt. TMAs

ermöglichen eine größtmögliche Standardisierung. Dennoch ist anzunehmen, dass

sich in unseren Daten Fehler befinden können. Die lange Erfahrung unseres Labors

für FISH Analyse bestärkt wiederum, dass eine wesentlich bessere Quantifikation

von hoher Polysomie schwer zu erzielen ist (25-27).

Unabhängig davon zeigt unsere Studie, dass Analysen der EGFR-Genkopienanzahl

durch eine einzelne Gewebeproben nur sehr unwahrscheinlich ein gesamtes

Bronchialkarzinom repräsentieren können. Die Tumorgewebeproben auf unserem

TMA simulieren bis zu einem gewissen Grad die Vorgehensweise in der Klinik, in

der Biomarkeranalysen bei Bronchialkarzinomen mit sehr kleinen Biopsien

durchgeführt werden.

4.4 EGFR Amplifikationen

Wir konnten in 13 (9,0%) Bronchialkarzinomen hochgradige EGFR-

Genamplifikationen, ohne signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen

histologischen Subtypen nachweisen. Dies ist mit Ergebnissen anderer Studien17

vereinbar, die eine Genamplifikation in 6-13% der NSCLC festgestellt haben (10, 13,

24).

Die Diagnose von Genamplifikationen durch FISH ist gegenüber der von hoher

Polysomie einfach und mit sehr geringer Variabilität zu stellen (26). In 7 der 13

EGFR-amplifizierten NSCLC unserer Studie konnte ein heterogenes

Amplifikationsmuster nachgewiesen werden. Dies demonstriert noch klarer die hohe

Frequenz einer intratumoralen Heterogenität der EGFR-Genkopienanzahl.

Nur in 2 von 37 Tumoren mit hoher Polysomie konnte eine gleichzeitige EGFR-

Genamplifikation in anderen Tumorarealen nachgewiesen werden. Dies spricht eher

gegen die Hypothese, dass sich eine Amplifikation aus einer hohen Polysomie

entwickelt.

4.5 Vergleich Primärtumor vs Metastase

Daniele et al. und Sun et al. führten zwei Studien durch, welche mittels FISH die

Anzahl der EGFR-Genkopien in primären NSCLC und ihren Fernmetastasen

verglichen (28, 29). Sun et al. untersuchten 55 Primärtumore und ihre

korrespondierenden Gehirnmetastasen. Hierbei stimmten die Ergebnisse für hohe

Polysomie in 50% und die für Genamplifikation in 67% der Fälle nicht überein. Die

Autoren stellten eine deutlich höhere Frequenz von EGFR-Amplifikationen in

Gehirnmetastasen im Vergleich zu ihren korrespondierenden Primärtumoren fest.

Daniele et al. verglichen 38 NSCLC mit ihren korrespondierenden Gehirn- und

Nebennierenmetastasen. Zwei der Fälle wiesen eine EGFR-Amplifikation auf. Ein

Unterschied zwischen Primärtumor und Metastasen wurde hierbei nicht beschrieben.

Die Ergebnisse für hohe Polysomie waren in 53% der Fälle nicht übereinstimmend.

Es lag eine Tendenz höherer Polysomie in Metastasen verglichen mit den jeweiligen

Primärtumoren vor.

In unserer Studie konnten wir keinen signifikanten Anstieg von Genamplifikationen

oder hoher Polysomie in Lymphknotenmetastasen verglichen mit ihren

Primärtumoren beobachten.

18

4.6 Prädiktiver Wert

Zwar liegen uns keine klinischen Verlaufsdaten der Patienten vor, dennoch rufen

unsere Ergebnisse Zweifel an einem relevanten prädiktiven Wert von EGFR FISH

Untersuchungen hervor, welche an Biopsien durchgeführt werden.

In unserer Studie wurden 6 von 144 (4,2%) Tumoren mit homogenen EGFR-

Amplifikationen im Primärtumor und dessen Metastasen identifiziert. Angenommen

dass EGFR, mit massiver Gen-Amplifikation, eine entscheidende biologische Rolle in

diesen Krebszellen spielt, ist zu erwarten, dass zielgerichtetes Therapieren mit

Tyrosinkinaseinhibitoren oder monoklonalen Antikörpern eine effektive Strategie bei

solchen Tumoren darstellen könnte.

4.7 EGFR Mutationen

Mehrere klinische Studien haben eine positive Korrelation zwischen einer durch FISH

bewerteten, erhöhten Anzahl der EGFR-Genkopien und dem Ansprechen auf

EGFR-TKI gezeigt (13-16). In der großen Phase III INTEREST-Studie war eine hohe

EGFR-Genkopienanzahl jedoch nicht prädiktiv für ein, durch eine Gefitinibtherapie

erzieltes, progressionsfreies Überleben bei Patienten mit fortgeschrittenem NSCLC

(17, 18). Dementsprechend haben Ergebnisse der IPASS Studie nahegelegt, dass

der anscheinende Erfolg von Gefitinib, der bei Patienten mit hoher EGFR-

Genkopienanzahl beobachtet wurde, auf eine gleichzeitig vorhandene EGFR-

Mutation zurückzuführen ist (5). Es fand sich bei einem hohen Anteil (77,6%) der

Tumore der Patienten eine EGFR-Mutation. Patienten ohne diese gleichzeitige

Mutation haben nicht von einer Gefitinibtherapie profitiert.

Eine Mutation in der Tyrosinkinasedomäne vom EGFR-Gen ist der bisher am

stärksten prädiktive Wert für das Ansprechen auf eine Anti-EGFR-Therapie. Hierbei

ist zu beachten, dass möglicherweise auch Mutationen heterogen in Tumoren

ausgeprägt sein können (35, 47, 48).

Taniguchi et al. entnahm aus 21 NSCLC mit bekannter EGFR-Mutation jeweils 50-60

separate Gewebeproben, die er einzeln auf das Vorhandensein einer Mutation

untersuchte. Es wurden 15 homogene und 6 heterogene Fälle beschrieben. Bai et al.

untersuchte in einer Studie 45 EGFR-mutierte NSCLC auf eine solche Heterogenität.

Er analysierte jeweils 28-34 Foki pro Tumor. In ca 30% der Tumore zeigte sich eine

intratumorale Heterogenität für EGFR-Mutationen. Heterogene Fälle waren dabei im

19

Vergleich zu homogenen Fällen mit einer niedrigeren EGFR-Genkopienanzahl

assoziiert.

In unserer Studie wurde zur Mutationsanalyse der EGFR-amplifizierten NSCLC die

DNA von jeweils nur einem großen Gewebefokus, anstatt mehrerer kleiner

sequenziert. Eine Aussage zur Heterogenität dieser Mutationen lässt sich somit nicht

machen.

Die Heterogenität von EGFR-Mutationen ist seltener, als die von Änderungen der

EGFR-Genkopienanzahl (34, 36). Yatabe et al. legen daher nahe, dass EGFR-

Amplifikationen während der Tumorprogression in EGFR-mutierten

Adenokarzinomen erworben werden (37). Erhöhungen der EGFR-Genkopienanzahl

in Tumoren mit gleichzeitiger Mutation sind mit einem ansteigenden Verhältnis von

mutiertem zu Wildtypallel assoziiert, was impliziert, dass das mutierte Allel selektiv

amplifiziert wird (38).

Mehrere Studienergebnisse lassen vermuten, dass EGFR-Mutationen mit höherer

Frequenz in EGFR-amplifizierten NSCLC auftreten (30-32). Die berichtete Frequenz

von gleichzeitigen EGFR-Mutationen in EGFR-amplifizierten NSCLC hängt jedoch

stark vom untersuchten Patientenkollektiv ab. EGFR-Mutationen sind in spezifischen

Subgruppen wesentlich häufiger vorhanden. So z.B. bei Asiaten, Patienten mit

Adenokarzinomen, Nichtraucher und Frauen (57, 59). Auf der anderen Seite ist die

berichtete Frequenz der EGFR-Genkopienanzahl nicht abhängig vom ethnischen

Ursprung (33), oder histologischem Subtyp (13, 24). Wir fanden gleichzeitig

vorhandene EGFR-Mutationen in 4 von 13 amplifizierten Tumoren (30,8%). Dieses

Ergebnis ist mit anderen Berichten über unselektierte europäische Kohorten

vergleichbar. Capuzzo et al. fand in 6 von 9 amplifizierten NSCLC EGFR-Mutationen,

während die gesamtdurchschnittliche Mutationsfrequenz der untersuchten Kohorte

bei 17% lag (13).

EGFR-Mutationen kommen fast ausschließlich in Adenokarzinomen vor (39). Einige

Autoren schlagen deshalb eine Limitierung von EGFR-Testungen auf

Adenokarzinome vor (40). Es ist erwähnenswert, dass ein EGFR-mutiertes

Plattenepithelkarzinom in unserer Studie gefunden wurde. Diese Beobachtung

könnte ein Hinweis dafür sein, dass zumindest einige Patienten mit

Plattenepithelkarzinomen von einer TKI-Therapie profitieren könnten.

20

5 Fazit

Der EGF-Rezeptor ist ein etabliertes therapeutisches Ziel bei fortgeschrittenen nicht-

kleinzelligen Bronchialkarzinomen. EGFR-Mutationen sind der bisher stärkste

prädiktive Marker für ein positives Ansprechen auf eine Therapie mit

Tyrosinkinaseinhibitoren. Der prädiktive Wert einer erhöhten EGFR-

Genkopienanzahl ist bis heute nicht einheitlich geklärt.

Unsere Daten zeigen, dass Aberrationen der EGFR-Genkopienanzahl in nicht-

kleinzelligen Bronchialkarzinomen in den meisten Fällen heterogen sind. Dies trifft

insbesondere zu, wenn die EGFR-Aberration auf eine hohe Polysomie

zurückzuführen ist. In unserer Studie zeigten 100% der Tumore mit hoher Polysomie

(36 von 36) und 54% der Tumore mit einer EGFR-Amplifikation (7 von 13) eine

heterogene Ausprägung. Diese Beobachtung stellt das Konzept in Frage, dass

therapeutische Entscheidungen auf EGFR-FISH-Analysen basieren, welche durch

kleine Biopsien gewonnen wurden.

Diskrepante Studienergebnisse über den prädiktiven Wert von EGFR-Aberrationen

für molekular zielgerichtete Therapien mit Tyrosinkinaseinhibitoren (wie Erlotinib und

Gefitinib) oder monoklonalen Antikörpern (z.B. Cetuximab) können durchaus durch

eine solche intratumorale Heterogenität begründet sein.

21

6 Literaturverzeichnis

1. Nicholson RI, Gee JM, Harper ME: EGFR and cancer prognosis. Eur J

Cancer 37 Suppl 2001, 4:S9-15

2. Clark GM, Zborowski DM, Culbertson JL, et al: Clinical utility of

epidermal growth factor receptor expression for selecting patients with advanced

non-small cell lung cancer for treatment with erlotinib. J Thorac Oncol 2006, 1:837-46

3. Keedy VL, Temin S, Somerfield MR, et al: American Society of Clinical

Oncology provisional clinical opinion: epidermal growth factor receptor (EGFR)

Mutation testing for patients with advanced non-small-cell lung cancer considering

first-line EGFR tyrosine kinase inhibitor therapy. J Clin Oncol 2011, 29:2121-7

4. Pirker R, Pereira JR, von Pawel J, et al: EGFR expression as a

predictor of survival for first-line chemotherapy plus cetuximab in patients with

advanced non-small-cell lung cancer: analysis of data from the phase 3 FLEX study.

Lancet Oncol 2011, 13:33–42

5. Fukuoka M, Wu YL, Thongprasert S, et al: Biomarker Analyses and

Final Overall Survival Results From a Phase III, Randomized, Open-Label, First-Line

Study of Gefitinib Versus Carboplatin/Paclitaxel in Clinically Selected Patients With

Advanced NSCLC in Asia (IPASS). J Clin Oncol 2011, 29:2866-74

6. Mitsudomi T, Morita S, Yatabe Y, et al: Gefitinib versus cisplatin plus

docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harbouring mutations of the

epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomised phase 3

trial. Lancet Oncol 2010, 11:121-8

7. Zhou C, Wu YL, Chen G, et al: Erlotinib versus chemotherapy as first-

line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung

cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, open-label, randomised, phase 3

study. Lancet Oncol 2011, 12:735–42

8. Carlson JJ, Garrison LP, Ramsey SD, et al: Epidermal growth factor

receptor genomic variation in NSCLC patients receiving tyrosine kinase inhibitor

therapy: a systematic review and meta-analysis. J Cancer Res Clin Oncol 2009,

135:1483-93

9. Dahabreh IJ, Linardou H, Siannis F, et al: Somatic EGFR mutation and

gene copy gain as predictive biomarkers for response to tyrosine kinase inhibitors in

non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2010, 16:291-303

22

10. Hirsch FR, Varella-Garcia M, Bunn PA, Jr., et al: Epidermal growth

factor receptor in non-small-cell lung carcinomas: correlation between gene copy

number and protein expression and impact on prognosis. J Clin Oncol 2003,

21:3798-807

11. Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, Barlund M, Schraml P, Leighton

S, et al.: Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor

specimens. Nat Med 1998, 4:844–7

12. Travis WD, Brambilla E, Müller-Hermelink HK, Harris CC, editors. World

Health Organization classification of tumors. Lyon: IARC Press; 2004. p. 9–124.

13. Cappuzzo F, Hirsch FR, Rossi E, et al: Epidermal growth factor

receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in non-small-cell lung cancer. J

Natl Cancer Inst 2005, 97:643-55

14. Goss G, Ferry D, Wierzbicki R, et al: Randomized phase II study of

gefitinib compared with placebo in chemotherapy-naive patients with advanced non-

small-cell lung cancer and poor performance status. J Clin Oncol 2009, 27:2253-60

15. Hirsch FR, Varella-Garcia M, Bunn PA, Jr., et al: Molecular predictors of

outcome with gefitinib in a phase III placebo-controlled study in advanced non-small-

cell lung cancer. J Clin Oncol 2006, 24:5034-42

16. Hirsch FR, Varella-Garcia M, McCoy J, et al: Increased epidermal

growth factor receptor gene copy number detected by fluorescence in situ

hybridization associates with increased sensitivity to gefitinib in patients with

bronchioloalveolar carcinoma subtypes: a Southwest Oncology Group Study. J Clin

Oncol 2005, 23:6838-45

17. Douillard JY, Shepherd FA, Hirsh V, et al: Molecular predictors of

outcome with gefitinib and docetaxel in previously treated non-small-cell lung cancer:

data from the randomized phase III INTEREST trial. J Clin Oncol 2010, 28:744-52

18. Kim ES, Hirsh V, Mok T, et al: Gefitinib versus docetaxel in previously

treated non-small-cell lung cancer (INTEREST): a randomised phase III trial. Lancet

2008, 372:1809-18

19. Varella-Garcia M, Diebold J, Eberhard DA, et al: EGFR fluorescence in

situ hybridisation assay: guidelines for application to non-small-cell lung cancer. J

Clin Pathol 2009, 62:970-7

20. Wolff AC, Hammond ME, Schwartz JN, et al: American Society of

Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for

23

human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol

2007, 25:118-45

21. Varella-Garcia M: Stratification of non-small cell lung cancer patients for

therapy with epidermal growth factor receptor inhibitors: the EGFR fluorescence in

situ hybridization assay. Diagn Pathol 2006, 1:19

22. Hirsch FR, Varella-Garcia M, Dziadziuszko R, et al: Fluorescence in situ

hybridization subgroup analysis of TRIBUTE, a phase III trial of erlotinib plus

carboplatin and paclitaxel in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2008,

14:6317-23

23. Tsao MS, Sakurada A, Cutz JC, et al: Erlotinib in lung cancer -

molecular and clinical predictors of outcome. N Engl J Med 353:133-44, 2005

24. Morinaga R, Okamoto I, Fujita Y, et al: Association of epidermal growth

factor receptor (EGFR) gene mutations with EGFR amplification in advanced non-

small cell lung cancer. Cancer Sci 2008, 99:2455-60

25. Press MF, Sauter G, Buyse M, et al: Alteration of topoisomerase II-

alpha gene in human breast cancer: association with responsiveness to

anthracycline-based chemotherapy. J Clin Oncol 2011, 29:859-67

26. Sauter G, Lee J, Bartlett JM, et al: Guidelines for human epidermal

growth factor receptor 2 testing: biologic and methodologic considerations. J Clin

Oncol 2009, 27:1323-33

27. Sauter G, Moch H, Moore D, et al: Heterogeneity of erbB-2 gene

amplification in bladder cancer. Cancer Res 1993, 53:2199-203

28. Daniele L, Cassoni P, Bacillo E, et al: Epidermal growth factor receptor

gene in primary tumor and metastatic sites from non-small cell lung cancer. J Thorac

Oncol 2009, 4:684-8

29. Sun M, Behrens C, Feng L, et al: HER family receptor abnormalities in

lung cancer brain metastases and corresponding primary tumors. Clin Cancer Res

2009, 15:4829-37

30. Hirsch FR, Varella-Garcia M, Cappuzzo F, et al: Combination of EGFR

gene copy number and protein expression predicts outcome for advanced non-small-

cell lung cancer patients treated with gefitinib. Ann Oncol 2007, 18:752-60

31. Pinter F, Papay J, Almasi A, et al: Epidermal growth factor receptor

(EGFR) high gene copy number and activating mutations in lung adenocarcinomas

24

are not consistently accompanied by positivity for EGFR protein by standard

immunohistochemistry. J Mol Diagn 2008, 10:160-8

32. Sholl LM, Yeap BY, Iafrate AJ, et al: Lung adenocarcinoma with EGFR

amplification has distinct clinicopathologic and molecular features in never-smokers.

Cancer Res 2009, 69:8341-8

33. Li C, Sun Y, Fang Z, et al: Comprehensive analysis of epidermal growth

factor receptor gene status in lung adenocarcinoma. J Thorac Oncol 2011, 6:1016-21

34. Sakurada A, Lara-Guerra H, Liu N, et al: Tissue heterogeneity of EGFR

mutation in lung adenocarcinoma. J Thorac Oncol 2008, 3:527-9,

35. Taniguchi K, Okami J, Kodama K, et al: Intratumor heterogeneity of

epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer and its correlation to the

response to gefitinib. Cancer Sci 2008, 99:929-35

36. Yatabe Y, Matsuo K, Mitsudomi T: Heterogeneous distribution of EGFR

mutations is extremely rare in lung adenocarcinoma. J Clin Oncol 2011, 29:2972-7

37. Yatabe Y, Takahashi T, Mitsudomi T: Epidermal growth factor receptor

gene amplification is acquired in association with tumor progression of EGFR-

mutated lung cancer. Cancer Res 2008, 68:2106-11

38. Takano T, Ohe Y, Sakamoto H, et al: Epidermal growth factor receptor

gene mutations and increased copy numbers predict gefitinib sensitivity in patients

with recurrent non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 2005, 23:6829-37

39. Marchetti A, Martella C, Felicioni L, et al: EGFR mutations in non-small-

cell lung cancer: analysis of a large series of cases and development of a rapid and

sensitive method for diagnostic screening with potential implications on

pharmacologic treatment. J Clin Oncol 2005, 23:857-65

40. Horn L, Pao W: EML4-ALK: honing in on a new target in non-small-cell

lung cancer. J Clin Oncol 2009, 27:4232-5

41. Mohammed Akli Ayoub, Heng B. See, Ruth M. Seeber, et al: Profiling

Epidermal Growth Factor Receptor and Heregulin Receptor 3 Heteromerization

Using Receptor Tyrosine Kinase Heteromer Investigation Technology. PLOS ONE

2013, 8(5):e64672

42. Monilola A.Olayioye, Richard M.Neve, et al: The ErbB signaling

network: receptor heterodimerization in development and cancer. EMBO J 2000,

19:3159-67

25

43. Markus BACH, Mark LARANCE, et al: The serine/threonine kinase

ULK1 is a target of multiple phosphorylation events. Biochem. J 2011, 440:283–291

44. Adi F. Gazdar, John D. Minna: Deregulated EGFR Signaling during

Lung Cancer Progression: Mutations, Amplicons, and Autocrine Loops. Cancer Prev

Res (Phila) 2008, 1(3):156–160

45. William Pao, Vincent Miller, Maureen Zakowski, et al: EGF receptor

gene mutations are common in lung cancers from ‘‘never smokers’’ and are

associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. PNAS 2004,

101(36):13306–13311

46. Lecia V. Sequist, Victoria A. Joshi, Pasi A. Jänne, et al: Epidermal

Growth Factor Receptor Mutation Testing in the Care of Lung Cancer Patients. Clin

Cancer Res 2006, 12:4403-4408

47. Akira Sakurada, Humberto Lara-Guerra, et al: Tissue Heterogeneity of

EGFR Mutation in Lung Adenocarcinoma. Journal of Thoracic Oncology 2008, 3(5):

527-579

48. Hua Bai, Zhijie Wang, Yuyan Wang, et al: Detection and Clinical

Significance of Intratumoral EGFR Mutational Heterogeneity in Chinese Patients with

Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. PLOS ONE 2013, 8(2):e54170

49. Fang Wang, Sha Fu, Qiong Shao, et al: High EGFR copy number

predicts benefits from tyrosine kinase inhibitor treatment for non-small cell lung

cancer patients with wild-type EGFR. Journal of Translational Medicine, 11:90, 2013

50. Soley Bayraktar, Caio M Rocha-Lima: Molecularly targeted therapies for

advanced or metastatic non-small-cell lung carcinoma. World J Clin Oncol 2013, 4(2):

29-42

51. Hiroaki Kato, Tokuzo Arao, Kazuko Matsumoto, et al: Gene

amplification of EGFR, HER2, FGFR2 and MET in esophageal squamous cell

carcinoma. Int. Journal of Oncology 2013, 42:1151-1158

52. Krishna M. Talasila, Anke Soentgerath, Philipp Euskirchen, et al: EGFR

wild-type amplification and activation promote invasion and development of

glioblastoma independent of angiogenesis. Acta Neuropathol 2013, 125:683–698

53. J. Michael Randall, Anjali A. Bharne, Lyudmila A. Bazhenova:

Hypersensitivity reactions to carboplatin and cisplatin in non-small cell lung cancer. J

Thorac Dis 2013, 5(2):E53-E57

26

54. Rajeswaran A, Trojan A, Burnand B, Giannelli M.: Efficacy and side

effects of cisplatin- and carboplatin-based doublet chemotherapeutic regimens

versus non-platinum-based doublet chemotherapeutic regimens as first line

treatment of metastatic non-small cell lung carcinoma: a systematic review of

randomized controlled trials. Lung Cancer 2008, 59(1):1-11

55. Untch M, et al: Pathologic complete response after neoadjuvant

chemotherapy plus trastuzumab predicts favorable survival in human epidermal

growth factor receptor 2-overexpressing breast cancer: results from the TECHNO

trial of the AGO and GBG study groups. J Clin Oncol. 2011, 29(25):3351-7

56. Herbst RS, Prager D, Hermann R, et al: TRIBUTE: a phase III trial of

erlotinib hydrochloride (OSI-774) combined with carboplatin and paclitaxel

chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2005,

23(25):5892-9

57. Bell DW, Brannigan BW, Matsuo K, et al: Increased prevalence of

EGFR-mutant lung cancer in women and in East Asian populations: analysis of

estrogen-related polymorphisms. Clin Cancer Res 2008, 14:4079-4084

58. Mukohara T, Engelman JA, Hanna NH, Yeap BY, et al: Differential

effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal

growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst 2005, 97:1185-1194

59. Bell DW, Lynch TJ, Haserlat SM, et al: Epidermal growth factor receptor

mutations and gene amplification in non-small-cell lung cancer: molecular analysis of

the IDEAL/INTACT gefitinib trials. J Clin Oncol 2005, 23:8081-92

60. W. Siegenthaler, H. Blum: Klinische Pathophysiologie, Thieme 2006, 9:

1110

61. Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al: Estimates of worldwide burden of

cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J of Cancer 2010, 127(12):2893-2917

62. Goulart B, Reys C, Fedorenko C, Mummy D, et al: Referral and

Treatment Patterns Among Patients With Stages III and IV Non-Small-Cell Lung

Cancer. J Oncol Pract 2013, 9(1): 42-50

27

7 Paper

28

Lung Cancer 79 (2013) 221– 227

Contents lists available at SciVerse ScienceDirect

Lung Cancer

j our na l ho me p age: www.elsev ier .com/ locate / lungcan

Frequent intratumoral heterogeneity of EGFR gene copy gain in non-small cell

lung cancer

Tobias J. Grob a,∗,1, Tobias Hoenig a,1, Till S. Clauditz a, Djordje Atanackovicb, Alexandra M. Koenigd,Yogesh K. Vashistd, Hans Kloseb, Ronald Simon a, Klaus Pantel c, Jakob R. Izbickid, Carsten Bokemeyerb,Guido Sauter a, Waldemar Wilczak a

a Department of Pathology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germanyb Department of Oncology, Hematology with Section Pneumology, Hubertus-Wald Tumorzentrum (University Cancer Center Hamburg), University Medical Center Hamburg-Eppendorf,

Hamburg, Germanyc Institute of Tumour Biology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germanyd Department of General, Visceral and Thoracic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany

a r t i c l e i n f o

Article history:

Received 23 April 2012

Received in revised form 8 November 2012

Accepted 11 November 2012

Keywords:

Non-small cell lung cancer

EGFR

Fluorescence in situ hybridization

Immunohistochemistry

Mutation

Heterogeneity

a b s t r a c t

Next to EGFR mutation, EGFR gene copy number evaluated by fluorescence in situ hybridization (FISH)

emerged as a potential predictive marker for sensitivity to EGFR tyrosine kinase inhibitors, although

controversial data exist. As the diagnostic accuracy of predictive biomarkers can be substantially limited

by regional differences within tumors, heterogeneity of EGFR gene copy gain in NSCLC was assessed in

this study. For this purpose, a novel tissue microarray (TMA) based analysis platform was developed.

TMAs were constructed containing 8 different tissue cylinders from 144 primary NSCLCs. From 62 of

these patients additional nodal metastases were sampled. EGFR gene copy number and EGFR expression

was analyzed by FISH and immunohistochemistry according to the suggested guidelines. 13 (9.0%) of the

144 evaluated tumors showed EGFR amplification and 37 (25.7%) tumors high polysomy in at least one

tumor area. In 7 (53.8%) of 13 amplified cases the analysis of different tumor areas revealed subclones

without EGFR gene copy gain next to subclones with amplification. All of the 36 evaluable tumors with

high polysomy showed heterogeneity of EGFR gene copy number with areas negative for gene copy

gain within the individual tumors. Heterogeneity of EGFR gene copy gain in lung cancer challenges the

concept of using small biopsies for the analysis of EGFR FISH status. EGFR gene copy number is highly

heterogeneous within individual NSCLCs and this finding might well be a reason for the controversial

clinical data existing regarding responsiveness to anti-EGFR therapy.

© 2012 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

The epidermal growth factor receptor (EGFR) is a receptor tyro-

sine kinase of the ErbB family and has been implicated in the

proliferation and survival of cancer cells. Aberrant expression of

EGFR has been detected in many human epithelial malignancies

including non-small cell lung cancer (NSCLC). Moreover EGFR over-

expression has been linked to advanced disease, a more aggressive

phenotype and overall poor prognosis in many tumor entities [1].

EGFR is the target for tyrosine kinase inhibitors (TKIs) such as

gefitinib or erlotinib and monoclonal antibodies such as cetuximab

∗ Corresponding author at: Institute of Pathology, University Medical Center

Hamburg-Eppendorf, Martinistr. 52, 20246 Hamburg, Germany.

Tel.: +49 40 7410 53173; fax: +49 40 7410 56815.

E-mail address: t.grob@uke.de (T.J. Grob).1 These authors contributed equally.

or panitumumab. The identification of the patients who are most

likely to derive clinical benefit from these drugs is of paramount

importance.

EGFR mutations, EGFR gene copy number and EGFR protein

expression have been studied as predictive biomarkers in major

clinical trials in NSCLC. EGFR protein expression yielded largely

disappointing results predicting response to TKI [2,3]. However,

recently published results from the FLEX study suggest EGFR

expression as a predictor for cetuximab therapy [4]. EGFR mutation

analysis has consistently emerged as strong predictor for response

to EGFR TKI therapy in NSCLC and lead to the introduction of first-

line EGFR TKI treatment for patients with activating EGFR mutations

[5–7]. Findings regarding EGFR gene copy number as a predictive

marker of response to TKIs, have been inconsistent [8,9]. In con-

trast to HER2 testing for trastuzumab therapy in breast cancer, it

is suggested that EGFR gene copy gain as a predictive marker is

not restricted to gene amplification but also to an increased EGFR

copy number due to balanced polysomy of chromosome 7 [10].

0169-5002/$ – see front matter © 2012 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

http://dx.doi.org/10.1016/j.lungcan.2012.11.009

222 T.J. Grob et al. / Lung Cancer 79 (2013) 221– 227

The criteria for EGFR positivity assessed by fluorescence in situ

hybridization (FISH) are either gene amplification or a minimum

subset of tumor cells (≥40%) with at least four copies of the EGFR

gene (high polysomy). This definition led to considerable obstacles

[11]. Especially the reproducibility using different methods such

as quantitative real-time PCR is limited [12]. Nevertheless, sev-

eral clinical trials showed positive correlation between increased

EGFR gene copy number as assessed by FISH and response to EGFR

TKI [13–16]. However, in the large phase III INTEREST study high

EGFR gene copy number was not predictive for progression-free

survival achieved by gefitinib treatment in patients with advanced

NSCLC [17,18]. Accordingly, results from the IPASS study suggest

that the apparent benefit of gefitinib seen in patients with high

EGFR gene copy number was driven by overlap with a coexisting

EGFR mutation [5].

Despite these considerable efforts a clear picture of the predic-

tive value of EGFR gene copy number has not yet emerged. Genetic

tumor heterogeneity represents a possible source for the controver-

sial results. Genetic heterogeneity might be particularly essential in

lung cancer because diagnosis is usually made on small biopsies or

even on a few cells in cases of cytology specimens. To better under-

stand the extent of such heterogeneity we analyzed 144 surgical

specimens of non-small cell lung cancers extensively on the EGFR

protein and gene copy number level using a novel tissue microarray

(TMA) based platform for heterogeneity analysis. Our results sug-

gest that substantial heterogeneity exists for EGFR amplification in

lung cancer and that high polysomy of chromosome 7 as assessed

by FISH is an unreliable predictive marker without consistency in

NSCLC.

2. Materials and methods

2.1. Tissues and construction of tissue micro arrays

Patients with extensive retained tumor material (at least 4 tis-

sue blocks per patient) were identified to analyze heterogeneity of

biomarker alterations in NSCLC. Among 373 patients reviewed for

availability of large tissue quantities, there were 144 patients for

whom at least 4 blocks of paraffin embedded formalin fixed tis-

sue had been stored at the archives of the Institute of Pathology

of the University Medical Center, Hamburg-Eppendorf. The num-

ber of available tissue blocks was 8 in 24, 7 in 12, 6 in 26, 5 in

32 and 4 in 50 patients. Eight different tissue cores were taken

per patient for TMA construction. Accordingly no more than two

cores were removed from one tissue block. Emphasis was placed

on taking these samples from areas that were as distant from each

other as possible. Up to 4 different lymph node metastases were

also examined from 62 (of the 144) patients with nodal positive

disease. One tissue core was analyzed per metastasis. The number

of analyzed metastases was 4 in 18, 3 in 11, 2 in 18, and 1 in 15

patients. TMAs were constructed as previously described [19]. The

usage of TMAs for research purposes has been approved by the local

ethics committee. Consecutive 4 �m sections of the resulting multi-

tumor TMA blocks were transferred to an adhesive coated slide

system (Instrumedics, Hackensack, USA) for fluorescence in situ

hybridization, immunohistochemical analysis and H&E stained ref-

erence. All original slides of the tissues included in these TMAs

had been reviewed determining histological type based on mor-

phology and histological grade according to WHO 2004 [20]. The

pathologic stage was obtained from the primary report of the Insti-

tute of Pathology. For four cases the pathologic stage is missing

due to incomplete lymph node sampling. The median patient age

at surgery was 65 years (range 38–82 years). An overview of the

clinical and pathological parameters of the studied cohort is given

in Table 1.

Table 1

Clinical and pathological characteristics of the study cohort. EGFR gene copy gain

(high polysomy or EGFR amplification) found in at least one tumor area.

High polysomy EGFR amplification

Total cases 144 37 (25.7%) 13 (9.0%)

Sex

Female 36 7 (19.4%) 5 (13.9%)

Male 108 30 (27.8%) 8 (7.4%)

Histologic type

Adenocarcinoma 79 22 (27.8%) 6 (7.6%)

Squamous cell

carcinoma

48 12 (25.0%) 5 (10.4%)

Adenosquamous

carcinoma

2 1 (50.0%) 1 (50.0%)

Large cell

undifferentated

carcinoma

15 2 (13.3%) 1 (6.7%)

Histologic grade

1 2 0 0

2 64 19 (29.7%) 4 (6.3%)

3 63 16 (25.4%) 8 (12.7%)

4 15 2 (13.3%) 1 (6.7%)

Stage (UICC)

Ia 12 3 (25.0%) 1 (8.3%)

Ib 29 6 (20.7%) 0

IIa 6 1 (16.7%) 0

IIb 37 11 (29.7%) 4 (10.8%)

IIIa 30 6 (20.0%) 3 (10.0%)

IIIb 19 6 (31.6%) 3 (15.8%)

IV 7 3 (42.9%) 1 (14.3%)

2.2. EGFR fluorescence in situ hybridization

FISH was performed on TMA sections using a commercial kit for

proteolytic slide pre-treatment (paraffin pre-treatment reagent kit,

Abbott Molecular, Wiesbaden, Germany). The Vysis LSI EGFR Spec-

trum Orange/CEP7 Spectrum Green Probe (Abbott Molecular) was

used for EGFR copy number detection according to manufacturer’s

instructions. Presence of tumor cells was verified in each spot by

comparison of an H&E stained consecutively cut reference section

of the TMA. Tumor cells of each spot were evaluated according to

the suggested guidelines for evaluation of EGFR gene copy gain [21].

2.3. EGFR immunohistochemistry

For EGFR protein detection, the EGFR pharmDX kit (Dako,

Glostrup, Denmark) was used according to the manufacturer’s

instructions. Membrane staining intensity in tumor cells was

scored in four categories (0–3+): no staining (0), weak staining (1+,

light brown membrane staining, visible only with high magnifica-

tion), intermediate staining (2+, between 1+ and 3+), and strong

staining (3+, dark-brown linear membrane staining).

2.4. EGFR sequencing

All EGFR amplified cases were sequenced for mutations in

the EGFR tyrosine-kinase domain (exons 18–21). Tumor DNA

was extracted from FFPE tissue after macrodissection or laser-

capture microdissection (PALM Micro Beam Laser System, Zeiss

MicroImaging, Munich, Germany) to ensure tumor cell content of

at least 70%. Extraction was performed as per standard protocols

(QiAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germany). 100 ng of DNA

were subjected to PCR reactions using the AmpliTaq Gold PCR

mastermix (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany) under the

conditions recommended by the manufacturer. Specific DNA frag-

ments of the individual exons were amplified using the following

primers: EGFR exon 18 forward 5′-GCTGAGGTGACCCTTGTCTC-

3′ and reverse 5′-TGGAGTTTCCCAAACACTCAG-3′; exon 19

T.J. Grob et al. / Lung Cancer 79 (2013) 221– 227 223

diffe

rent are

as

prim

ary

tum

or

corr

espondin

gm

eta

sta

se

s

#026

#028

#059

#021

#097

#091

#116

#038

#080

#089

#139

#023

#107

EGFR ampli fication

high po lysomy

EGFR FISH ne gative

test fail ure

A

diffe

rent are

as

prim

ary

tum

or

corr

espondin

gm

eta

sta

se

s

#100

#065

#085

#089

#033

#067

#101

#035

#020

#041

#052

#066

#082

#087

#088

#122

#132

#045

#139

#008

#012

#032

#040

#048

#054

#060

#072

#075

#102

#112

#115

#118

#125

#133

#009

#046

#144

B

Fig. 1. Intratumoral heterogeneity of EGFR amplification (A) and high polysomy of chromosome 7 (B). The columns represent EGFR FISH results in eight different areas of the

primary tumor and in up to four different available lymph node metastases from the same tumor. Of note: two cases (#089 and #139) show concomitant EGFR amplification

and high polysomy of chromosome 7. These cases are therefore included in both figures.

forward 5′-GCTGGTAACATCCACCCAGA-3′ and reverse 5′-

GCAGGGTCTAGAGCAGAGCA-3′; exon 20 forward 5′-CACACTG-

ACGTGCCTCTCC-3′ and reverse 5′-TATCCCCATGGCAAACTCTT-3′;

exon 21 forward 5′-CCTCACAGCAGGGTCTTCTC-3′ and reverse

5′-ATCCTCCCCTGCATGTGTTA-3′. PCR products were subjected to

sequencing reaction with BigDye Terminater Cycle Sequencing Kit

(Applied Biosystems) and analyzed on ABI PRISM 3100 genetic

analyzer (Applied Biosystems).

2.5. Statistics

Contingency table analysis and chi square tests were used to

study the relationship between FISH and IHC results. SAS software

(SAS Institute Inc, NC USA; JMP 5.1 software) was used for data

analysis.

3. Results

3.1. EGFR FISH

EGFR gene copy number was interpretable in 1055 arrayed

tumor samples. An average of 7.3 different spots (range 0–12 spots)

was analyzable of each tumor. Analysis failed in 261 spots either

because the hybridization quality was too low, insufficient numbers

of tumor cells were analyzable or the entire tissue spot was lacking

on the TMA slide. EGFR gene amplification was found in 13 tumors

(Table 1). Between 1 and 11 different analyzable spots of these

tumors showed EGFR amplification (Fig. 1A). 6 tumors showed

homogeneous EGFR gene amplification in all analyzable spots (4–11

different spots; 3 squamous cell carcinomas, 2 adenocarcinomas,

and one adenosquamous carcinoma). 7 tumors revealed intratu-

moral heterogeneity resulting in spots with gene amplification and

spots with a negative EGFR FISH. Two of these cases also included

spots with high polysomy of chromosome 7, next to amplifica-

tion and negative spots. Of these heterogeneous tumors an average

of 34.0% (2.4/7.1) spots showed gene amplification. Histologic

review of the borders between amplified and unamplified areas

revealed no morphological differences within the tumor (Fig. 2).

High polysomy as defined by the University of Colorado Group

(40% of tumor cells with ≥4 EGFR gene signals) [22] was found

in 37 (25.7%) tumors (Table 1). Two of these tumors also showed

gene amplification and negative results in different spots. Of the 35

remaining tumors 34 were heterogeneous for high polysomy show-

ing other spots negative for EGFR copy number gain. One tumor

could not be evaluated for heterogeneity as only one tissue spot

was analyzable in EGFR FISH analysis. Of the 35 tumors without

concomitant EGFR amplification an average of 26.1% (1.8/6.8) spots

showed high polysomy. In none of the tumors for which multiple

spots were interpretable homogeneous high polysomy was found

(Fig. 1B).

No discrepant results were found between primary tumors

and the corresponding lymph node metastases. Four cases with

homogeneous EGFR amplification in the primary tumor showed

identical amplification in up to three lymph node metastases

224 T.J. Grob et al. / Lung Cancer 79 (2013) 221– 227

Fig. 2. Example of a NSCLC with heterogeneous EGFR amplification and EGFR expression (case #107). H&E staining (A), EGFR immunohistochemistry (B) and EGFR FISH

analysis of amplified tumor areas (C) and non-amplified tumor areas (D). FISH analysis shows green signals representing centromere 7 and orange signals representing EGFR

gene. Cell nuclei are counterstained with DAPI. (For interpretation of the references to color in text, the reader is referred to the web version of the article.)

(Fig. 1A). Lymph node metastases could be evaluated in 16 cases

with heterogeneous EGFR gene copy gain (two tumors showing

focal amplification and 14 tumors showing focal high polysomy).

In all cases heterogeneity was found within the primary tumor

and EGFR copy number in lymph node metastases was identical

to parts of the primary tumor (Fig. 1A and B). Discrepant EGFR gene

copy gain between different lymph node metastases of a tumor was

detected in four of 11 evaluable cases reflecting the heterogeneity

found in the primary tumors.

3.2. EGFR immunohistochemistry

Immunohistochemical analysis of EGFR protein was successful

in 1203 tumor tissue cores. An average of 8.4 different spots

(range 3–12 spots) was analyzable of each tumor. One hundred

and thirteen tissue spots were excluded from analysis because the

spots were missing on the TMA slide or did not contain enough

tumor cells for evaluation. The applied scoring for EGFR protein

expression followed the recently published scoring system of the

FLEX study in regard of staining intensity. As small tumor tissue

cores on a TMA were analyzed, only one intensity score for the

most common pattern was evaluated. This is in contrast to the

scoring system used in the FLEX study where the frequency of

different staining intensities within a tumor is integrated in the

scoring system [4]. Complete negative EGFR immunostaining in all

examined tumor areas was seen in 8 (5.6%) tumors. A strong posi-

tivity in at least one tumor area was found in 84 (58.3%) cases. Most

tumors showed some extent of heterogeneity in EGFR expression.

Only 20 (13.9%) tumors showed complete homogeneity of EGFR

expression in all examined tumor areas (8 tumors negative, 1

tumor weak positive, 11 tumors strong expression). Thirty one

(21.5%) tumors showed tumor areas with strong expression next

to negative tumor areas. Both FISH and IHC were interpretable

in 1048 tissue spots and therefore could be matched (Fig. 3).

Strong EGFR immunostaining was found significantly associated

with EGFR amplification (p < 0.001) as well as high polysomy of

chromosome 7 (p < 0.001). The 6 homogeneously amplified tumors

also showed homogeneous strong EGFR expression.

3.3. EGFR mutation analysis of amplified tumors

Sequence analysis of the 13 amplified tumors revealed EGFR

mutations in four cases (case #059: p.L747 T571del; #080:

p.L858R; #097: p.E746 A750del; #139: p.E746 T751>A). Two of

these tumors show homogeneous and two show heterogeneous

EGFR amplification. Mutated cancers included two adenocarci-

nomas, one adenosquamous carcinoma and one squamous cell

carcinoma.

T.J. Grob et al. / Lung Cancer 79 (2013) 221– 227 225

FISHnegativen=910

highpolysomy

n=71

EGFR

amplificatio nn=67

IHC 3+

IHC 2+

IHC 1+

IHC negative

Fig. 3. Comparison between EGFR FISH results and EGFR expression as assessed by

immunohistochemistry. 1048 TMA spots of 143 different tumors could be matched.

4. Discussion

We found EGFR gene copy gain in 48 (33.3%) of 144 non-small

cell lung cancers without any significant differences between histo-

logic subtypes. This finding is in line with other studies performing

EGFR fluorescence in situ hybridization in lung cancer describ-

ing EGFR gene copy gain in 31–45% of cancers [15,23,24]. We did

not observe significant associations with histologic grade or tumor

stage in this relatively small cohort. High-level EGFR gene amplifica-

tion was found in 13 (9.0%) tumors with a slight, but not significant,

predilection for squamous cell carcinomas. Other authors reported

gene amplification in 6–13% of NSCLC without significant differ-

ences between tumor types [10,13,25].

Tumor heterogeneity is a critical issue and a major limitation

for molecular diagnostics and targeted cancer therapy. Diagnos-

tic accuracy of a molecular assay may be limited if the analyzed

biomarker is only present in a fraction of a tumor. Absence of a

drug target structure in a cancer subpopulation of a patient tested

“positive” for a specific drug target may cause drug resistance

after outgrowth of the target-negative population under therapy.

Considering its importance, the number of studies analyzing target

heterogeneity in cancer is relatively small. If tumor heterogeneity

is analyzed and quantified, this is often only based on the analy-

sis of one or two tissue block(s) per tumor/patient. However, one

tissue section cannot completely represent the biology of a large

cancer. The TMA analysis of samples from eight tumor areas that

are located as distant from each other as possible enables a com-

prehensive three-dimensional analysis of molecular features in a

large series of tumors.

The data of our present study demonstrate a dramatically high

rate of heterogeneity for EGFR gene copy number alterations in

lung cancer. This is particularly true for high-polysomy, a molec-

ular feature proposed to be predictive for response to anti-EGFR

therapy. All 36 lung tumors with high polysomy and interpretabil-

ity of at least two tissue spots had tumor areas with and without

high-polysomy. Technical issues may have contributed to the high

variability of these data. The evaluation of high-polysomy by FISH

is difficult and error-prone. Determination of whether or not 40%

of the cells have 4 or more signals per cell depends on technical

issues like section thickness (as the nuclear diameter of cancer cells

is always larger than the depth of a tissue section, FISH analyses

will always yield more signals per nucleus the thicker a slide has

been cut) and is prone to inter- and intra-observer variability [21].

The validity of our FISH data is, however, supported by the sig-

nificant association found between high-polysomy and high levels

of EGFR protein expression. We still assume that errors regarding

high-polysomy exist in our dataset. The longstanding experience

of our laboratory in FISH analysis at least argues that a much better

quantification of high-polysomy may be difficult to achieve

[26–28].

Our data on high-level gene amplification even more clearly

demonstrate the high frequency of EGFR gene copy number hetero-

geneity in lung cancer. Diagnosis of high-level gene amplification

is easy to achieve by FISH with very low inter- and intraobserver

variability [27]. The majority (7) of our 13 tumors with EGFR gene

amplification showed a heterogeneous EGFR amplification pat-

tern within the primary tumor. Only two of 37 tumors with high

polysomy evidenced an additional EGFR gene amplification in other

tumor areas. The low number of concomitant amplification and

polysomy argues against a precursor role of high polysomy in the

development of EGFR amplification.

Substantial heterogeneity of EGFR gene copy number aberra-

tions in lung cancer is further supported by two earlier reports

analyzing primary tumors and their metastases. Daniele et al. [29]

compared EGFR gene copy numbers between primary tumor and

distant metastasis in 35 NSCLC. Analyzing only two tissue samples

per patient, they showed that high-polysomy was inconsistent in

53% of their cases with a tendency toward more high-polysomy in

the metastases as compared to the primary tumors. No discordance

was found in two tumors with EGFR amplification. Sun et al. [30]

analyzed the EGFR gene by FISH in 55 primary lung cancers and

their corresponding brain metastases. Analyzing again only two

tissue samples per patient, these authors found a discordance for

high polysomy in 50% and for gene amplification in 67% of cases (18

cases had amplification). In this study, a particular high frequency

of EGFR amplification was described in adenocarcinoma metastases

(14 of 55 amplified) as compared to their corresponding primary

tumors where only 6 of these tumors show gene amplification. In

our study, we did not observe a significant increase of gene amplifi-

cation or high polysomy in lymph node metastases as compared to

their primary tumors. On the other hand, no data exist on hetero-

geneity of EGFR gene copy gain within metastatic sites. Although

we found a high rate of heterogeneity in primary tumors this might

not hold true for metastases which possibly could give more reliable

information in respect of a potential benefit from targeted therapy.

In contrast to the studies on metastatic NSCLC we have evaluated

EGFR gene copy number in tumors of different stages. 58% of the

tumors in our cohort were resected in stage I and II. We did not

observe any trend in the frequency of heterogeneity in associa-

tion to tumor stage, but the number of cases is too small to draw

significant conclusions.

Irrespective of what fraction of discrepant high-polysomy

results is due to true heterogeneity or diagnostic errors, the data

of this study show, that EGFR gene copy number analysis of one tis-

sue sample is unlikely to reflect an entire lung cancer. This is all the

more true, as biomarker analysis in lung cancer is usually made on

small biopsies. The tumor tissue cores analyzed on the TMA slides

simulate this practice. Even though clinical data are unavailable

from our patients, our results do not support a relevant predic-

tive value of EGFR FISH results obtained on such biopsies. However,

our study also identified 6 of 144 (4.2%) cancers with homogeneous

EGFR amplification in the primary tumor and its metastases. Assum-

ing that EGFR may have an important biological role in cancer cells

with massive increase of this gene, it could be expected that tar-

geting EGFR might be a valuable strategy in such tumors. Clinical

trials applying tyrosine kinase inhibitors or monoclonal antibodies

on lung cancers with homogeneous EGFR amplification should thus

be considered.

Mutation in tyrosine kinase domain of EGFR is the strongest

predictor of response to anti-EGFR therapy. Several studies have

suggested that these mutations occur at higher frequency in ampli-

fied cases [31–33] but the reported frequency of concomitant EGFR

mutation in EGFR amplified NSCLC heavily depends on the selected

population. EGFR mutations are much more frequent in specific

226 T.J. Grob et al. / Lung Cancer 79 (2013) 221– 227

sub-groups such as the Asian population, patients with adeno-

carcinomas, non-smokers and females. On the other hand, the

reported frequency of EGFR gene copy gain is not dependent on

ethnic origin [34] or histologic subtype [13,25]. We found con-

comitant EGFR mutations in 4 of the 13 amplified tumors (30.8%).

This result is comparable with other reports on unselected cohorts

of Caucasian origin. Cappuzzo et al. found EGFR mutation in 6 of

9 amplified NSCLC, while the overall mutation frequency of the

examined cohort was 17% [13]. Evidence suggests that heterogene-

ity for EGFR mutation is less extensive than for EGFR gene copy

number changes [35–37]. Yatabe et al. therefore suggested that

EGFR gene amplification is acquired upon tumor progression in

EGFR mutated adenocarcinomas [38]. EGFR copy gains in tumors

with concomitant mutations are associated with an increasing ratio

of mutant to wild-type allele, implying that the mutant allele is

selectively gained [39].

5. Conclusion

In summary, our data demonstrate that EGFR gene copy number

alterations are mostly heterogeneous in lung cancer. This observa-

tion challenges the concept of using small biopsies for the analysis

of EGFR FISH status. Studies evaluating EGFR targeted therapy in

the small subgroup of homogeneously EGFR amplified lung cancers

appear to be warranted.

Conflict of interest statement

None declared.

Acknowledgement

We appreciate the excellent technical support of Silvia Schnöger

and Sascha Eghtessadi.

References

[1] Nicholson RI, Gee JM, Harper ME. EGFR and cancer prognosis. Eur J Cancer2001;37(Suppl 4):S9–15.

[2] Clark GM, Zborowski DM, Culbertson JL, Whitehead M, Savoie M, Seymour L,et al. Clinical utility of epidermal growth factor receptor expression for selectingpatients with advanced non-small cell lung cancer for treatment with erlotinib.J Thorac Oncol 2006;1:837–46.

[3] Keedy VL, Temin S, Somerfield MR, Beasley MB, Johnson DH, McShane LM, et al.American Society of Clinical Oncology provisional clinical opinion: epidermalgrowth factor receptor (EGFR) mutation testing for patients with advancednon-small-cell lung cancer considering first-line EGFR tyrosine kinase inhibitortherapy. J Clin Oncol 2011;29:2121–7.

[4] Pirker R, Pereira JR, von Pawel J, Krzakowski M, Ramlau R, Park K, et al. EGFRexpression as a predictor of survival for first-line chemotherapy plus cetuximabin patients with advanced non-small-cell lung cancer: analysis of data from thephase 3 FLEX study. Lancet Oncol 2012;13:33–42.

[5] Fukuoka M, Wu YL, Thongprasert S, Sunpaweravong P, Leong SS, Sriuranpong V,et al. Biomarker analyses and final overall survival results from a phase III, ran-domized, open-label, first-line study of gefitinib versus carboplatin/paclitaxelin clinically selected patients with advanced non-small-cell lung cancer in Asia(IPASS). J Clin Oncol 2011;29:2866–74.

[6] Mitsudomi T, Morita S, Yatabe Y, Negoro S, Okamoto I, Tsurutani J, et al. Gefiti-nib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancerharbouring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405):an open label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol 2010;11:121–8.

[7] Zhou C, Wu YL, Chen G, Feng J, Liu XQ, Wang C, et al. Erlotinib versus chemother-apy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positivenon-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, open-label, randomised, phase 3 study. Lancet Oncol 2011;12:735–42.

[8] Carlson JJ, Garrison LP, Ramsey SD, Veenstra DL. Epidermal growth factor recep-tor genomic variation in NSCLC patients receiving tyrosine kinase inhibitortherapy: a systematic review and meta-analysis. J Cancer Res Clin Oncol2009;135:1483–93.

[9] Dahabreh IJ, Linardou H, Siannis F, Kosmidis P, Bafaloukos D, Murray S. SomaticEGFR mutation and gene copy gain as predictive biomarkers for responseto tyrosine kinase inhibitors in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res2010;16:291–303.

[10] Hirsch FR, Varella-Garcia M, Bunn Jr PA, Di Maria MV, Veve R, Bremmes RM,et al. Epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung carcinomas: cor-relation between gene copy number and protein expression and impact onprognosis. J Clin Oncol 2003;21:3798–807.

[11] Eberhard DA, Giaccone G, Johnson BE. Biomarkers of response to epidermalgrowth factor receptor inhibitors in non-small-cell lung cancer working group:standardization for use in the clinical trial setting. J Clin Oncol 2008;26:983–94.

[12] Bell DW, Lynch TJ, Haserlat SM, Harris PL, Okimoto RA, Brannigan BW, et al.Epidermal growth factor receptor mutations and gene amplification in non-small-cell lung cancer: molecular analysis of the IDEAL/INTACT gefitinib trials.J Clin Oncol 2005;23:8081–92.

[13] Cappuzzo F, Hirsch FR, Rossi E, Bartolini S, Ceresoli GL, Bemis L, et al. Epidermalgrowth factor receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in non-small-cell lung cancer. J Natl Cancer Inst 2005;97:643–55.

[14] Goss G, Ferry D, Wierzbicki R, Laurie SA, Thompson J, Biesma B, et al. Random-ized phase II study of gefitinib compared with placebo in chemotherapy-naivepatients with advanced non-small-cell lung cancer and poor performance sta-tus. J Clin Oncol 2009;27:2253–60.

[15] Hirsch FR, Varella-Garcia M, Bunn Jr PA, Franklin WA, Dziadziuszko R, ThatcherN, et al. Molecular predictors of outcome with gefitinib in a phase IIIplacebo-controlled study in advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol2006;24:5034–42.

[16] Hirsch FR, Varella-Garcia M, McCoy J, West H, Xavier AC, Gumerlock P, et al.Increased epidermal growth factor receptor gene copy number detected by flu-orescence in situ hybridization associates with increased sensitivity to gefitinibin patients with bronchioloalveolar carcinoma subtypes: a Southwest oncologygroup study. J Clin Oncol 2005;23:6838–45.

[17] Douillard JY, Shepherd FA, Hirsh V, Mok T, Socinski MA, Gervais R, et al. Molec-ular predictors of outcome with gefitinib and docetaxel in previously treatednon-small-cell lung cancer: data from the randomized phase III INTEREST trial.J Clin Oncol 2010;28:744–52.

[18] Kim ES, Hirsh V, Mok T, Socinski MA, Gervais R, Wu YL, et al. Gefitinib versusdocetaxel in previously treated non-small-cell lung cancer (INTEREST): a ran-domised phase III trial. Lancet 2008;372:1809–18.

[19] Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, Barlund M, Schraml P, Leighton S, et al.Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor speci-mens. Nat Med 1998;4:844–7.

[20] Travis WD, Brambilla E, Müller-Hermelink HK, Harris CC, editors. World HealthOrganization classification of tumors. Lyon: IARC Press; 2004. p. 9–124.

[21] Varella-Garcia M, Diebold J, Eberhard DA, Geenen K, Hirschmann A, Kockx M,et al. EGFR fluorescence in situ hybridisation assay: guidelines for applicationto non-small-cell lung cancer. J Clin Pathol 2009;62:970–7.

[22] Varella-Garcia M. Stratification of non-small cell lung cancer patients for ther-apy with epidermal growth factor receptor inhibitors: the EGFR fluorescencein situ hybridization assay. Diagn Pathol 2006;1:19.

[23] Hirsch FR, Varella-Garcia M, Dziadziuszko R, Xiao Y, Gajapathy S, Skokan M,et al. Fluorescence in situ hybridization subgroup analysis of TRIBUTE, a phaseIII trial of erlotinib plus carboplatin and paclitaxel in non-small cell lung cancer.Clin Cancer Res 2008;14:6317–23.

[24] Tsao MS, Sakurada A, Cutz JC, Zhu CQ, Kamel-Reid S, Squire J, et al. Erlotinibin lung cancer – molecular and clinical predictors of outcome. N Engl J Med2005;353:133–44.

[25] Morinaga R, Okamoto I, Fujita Y, Arao T, Sekijima M, Nishio K, et al. Associationof epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutations with EGFR ampli-fication in advanced non-small cell lung cancer. Cancer Sci 2008;99:2455–60.

[26] Press MF, Sauter G, Buyse M, Bernstein L, Guzman R, Santiago A, et al.Alteration of topoisomerase II-alpha gene in human breast cancer: associa-tion with responsiveness to anthracycline-based chemotherapy. J Clin Oncol2011;29:859–67.

[27] Sauter G, Lee J, Bartlett JM, Slamon DJ, Press MF. Guidelines for humanepidermal growth factor receptor 2 testing: biologic and methodologic con-siderations. J Clin Oncol 2009;27:1323–33.

[28] Sauter G, Moch H, Moore D, Carroll P, Kerschmann R, Chew K, et al.Heterogeneity of erbB-2 gene amplification in bladder cancer. Cancer Res1993;53:2199–203.

[29] Daniele L, Cassoni P, Bacillo E, Cappia S, Righi L, Volante M, et al. Epidermalgrowth factor receptor gene in primary tumor and metastatic sites from non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol 2009;4:684–8.

[30] Sun M, Behrens C, Feng L, Ozburn N, Tang X, Yin G, et al. HER family recep-tor abnormalities in lung cancer brain metastases and corresponding primarytumors. Clin Cancer Res 2009;15:4829–37.

[31] Hirsch FR, Varella-Garcia M, Cappuzzo F, McCoy J, Bemis L, Xavier AC, et al.Combination of EGFR gene copy number and protein expression predicts out-come for advanced non-small-cell lung cancer patients treated with gefitinib.Ann Oncol 2007;18:752–60.

[32] Pinter F, Papay J, Almasi A, Sapi Z, Szabo E, Kanya M, et al. Epidermalgrowth factor receptor (EGFR) high gene copy number and activating muta-tions in lung adenocarcinomas are not consistently accompanied by positivityfor EGFR protein by standard immunohistochemistry. J Mol Diagn 2008;10:160–8.

[33] Sholl LM, Yeap BY, Iafrate AJ, Holmes-Tisch AJ, Chou YP, Wu MT, et al. Lungadenocarcinoma with EGFR amplification has distinct clinicopathologic andmolecular features in never-smokers. Cancer Res 2009;69:8341–8.

[34] Li C, Sun Y, Fang Z, Han X, Fang R, Zhang Y, et al. Comprehensive analysis ofepidermal growth factor receptor gene status in lung adenocarcinoma. J ThoracOncol 2011;6:1016–21.

T.J. Grob et al. / Lung Cancer 79 (2013) 221– 227 227

[35] Sakurada A, Lara-Guerra H, Liu N, Shepherd FA, Tsao MS. Tissue heterogeneityof EGFR mutation in lung adenocarcinoma. J Thorac Oncol 2008;3:527–9.

[36] Taniguchi K, Okami J, Kodama K, Higashiyama M, Kato K. Intratumor hetero-geneity of epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer and itscorrelation to the response to gefitinib. Cancer Sci 2008;99:929–35.

[37] Yatabe Y, Matsuo K, Mitsudomi T. Heterogeneous distribution of EGFR muta-tions is extremely rare in lung adenocarcinoma. J Clin Oncol 2011;29:2972–7.

[38] Yatabe Y, Takahashi T, Mitsudomi T. Epidermal growth factor receptor geneamplification is acquired in association with tumor progression of EGFR-mutated lung cancer. Cancer Res 2008;68:2106–11.

[39] Takano T, Ohe Y, Sakamoto H, Tsuta K, Matsuno Y, Tateishi U, et al. Epidermalgrowth factor receptor gene mutations and increased copy numbers predictgefitinib sensitivity in patients with recurrent non-small-cell lung cancer. J ClinOncol 2005;23:6829–37.

8 Lebenslauf

entfällt aus datenschutzrechtlichen Gründen

36

entfällt aus datenschutzrechtlichen Gründen

37

9 Eidesstattliche Versicherung

Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfeverfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutztund die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stelleneinzeln nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite desbenutzten Werkes kenntlich gemacht habe.Ferner versichere ich, dass ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter aneiner anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig umZulassung zur Promotion beworben habe.

Unterschrift: ......................................................................

38