UNIVERSITAS INDONESIA OPTIMASI METODE ANALISIS ...lib.ui.ac.id/file?file=digital/2016-7/20181175-S33125-Ani...diff) dari metode ini -13,67% sampai 12,33% dengan presisi (KV) antara

UNIVERSITAS INDONESIA

OPTIMASI METODE ANALISIS ASAM VALPROAT DALAM

PLASMA IN VITRO SECARA KROMATOGRAFI GAS

SKRIPSI

ANI SUSANTI

0606070503

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM STUDI FARMASI

DEPOK

JULI 2010

Optimasi metode..., Ani Susanti, FMIPA UI, 2010

ii

UNIVERSITAS INDONESIA

OPTIMASI METODE ANALISIS ASAM VALPROAT DALAM

PLASMA IN VITRO SECARA KROMATOGRAFI GAS

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Farmasi

ANI SUSANTI

0606070503

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM STUDI FARMASI

DEPOK

JULI 2010


iii


iv


v

KATA PENGANTAR

Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat

dan rahmat-Nya, saya dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini

dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar

Sarjana Science Jurusan Farmasi pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam Universitas Indonesia.

Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, dari

masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit bagi saya

untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih

kepada:

(1) Ibu Dr. Yahdiana Harahap, M.S, selaku Ketua Departemen dan pembimbing I

atas segala bimbingan, saran, dan bantuan, kesabaran, serta dukungan moril

selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

(2) Bapak Dr. Harmita, Apt., selaku pembimbing II atas segala bimbingan, saran,

bantuan serta dukungan moril selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

(3) Ibu Dr. Nelly D. Leswara, M. Sc, selaku pembimbing akademik yang telah

memberikan bimbingan selama penulis menempuh pendidikan di program S1

Reguler Farmasi UI.

(4) Bapak Drs. Hayun, M.Si, selaku ketua laboratorium Kimia Analisis Kuantitatif

dan Instrumen tempat penulis melakukan kegiatan penelitian atas segala

kepercayaan, bantuan, dan pengertian yang diberikan kepada penulis selama

penelitian.

(5) Seluruh dosen, laboran dan staf karyawan di Departemen Farmasi, atas segala

ilmu, dukungan, dan saran kepada penulis selama masa pendidikan di

Departemen Farmasi.


vi

(6) PT. Mersifarma Tirmaku Mercusana yang telah memberikan bantuan bahan

baku natrium divalproat kepada penulis.

(7) Kedua orang tua dan adikku tercinta atas segala kasih sayang, do’a, dukungan

dan pengorbanan yang tiada terkira kepada penulis.

(8) Teman-teman seperjuangan di Laboratorium Analisis Instrumen : Ekope, Indra,

Yose, Hifdzi, Anisa, Jenny, Nindy, Ankie, Maul, Marvin, Sinta, Ka Anyu, dan

Ka Nila.

(9) Teman-teman senasib sepenanggungan : Anisa Suci Aprila, Dira Aztiani,

Yaserita Achiro, Eka Irmawati Achmad, Wahyu Astuti, dan Arikadia Noviani

dan teman-teman satu angkatan.

Penulis menyadari dalam penelitian dan penulisan skripsi ini masih jauh dari

sempurna. Namun kiranya, semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak

yang membutuhkan.

Penulis

2010


vii


viii Universitas Indonesia

ABSTRAK

Nama : Ani Susanti

Program studi : Farmasi

Judul : Optimasi Metode Analisis Asam Valproat dalam

Plasma In Vitro Secara Kromatografi Gas

Asam valproat dan bentuk garamnya merupakan obat antikonvulsi yang

bekerja dengan meningkatkan kadar γ-aminobutyric acid (GABA).

Penetapan kadar asam valproat menjadi masalah yang cukup sulit karena

tidak terdapat gugus kromofor di dalam strukturnya. Metode analisis

menggunakan kromatografi gas (KG) dengan detektor ionisasi nyala untuk

penentuan asam valproat dalam plasma manusia in vitro telah

dikembangkan dan dioptimasi. Asam valproat diekstraksi dari plasma

dengan metode ekstraksi cair-cair menggunakan dietil eter. Kondisi analisis

optimum asam valproat dalam plasma in vitro dengan kromatografi gas

diatur pada suhu injektor dan detektor 250 oC dan pemrograman suhu yang

digunakan adalah dengan suhu awal 70 o

C dengan kenaikan suhu 5 o

C per

menit sampai suhu 100 o

C, kemudian ditahan selama 1 menit, lalu suhu

dinaikkan sebesar 2 o

C per menit sampai suhu kolom menjadi 150 o

C.

Kondisi optimum ini membutuhkan waktu analisa 32 menit. Pada range

konsentrasi 40,0-100,0 μg/mL dihasilkan kurva kalibrasi yang linier dengan

koefisien korelasi (r) 0,9894. Akurasi (% diff) dari metode ini -13,67%

sampai 12,33% dengan presisi (KV) antara 9,33% sampai 14,92%, dan uji

perolehan kembali relatif sebesar 86,33% sampai 112,33%.

Kata kunci : asam valproat, kromatografi gas, optimasi, plasma in vitro.

xiii + 69 hlm ; 14 gambar; 12 tabel; 7 lampiran

Daftar Acuan : 25 (1977-2009)


ix Universitas Indonesia

ABSTRACT

Name : Ani Susanti

Study program : Pharmacy

Title : Analytical Method Optimation of Valproic Acid

in Plasma In Vitro using Gas Chromatography

Valproic acid an anticonvulsant drug that works by increasing the levels

of γ-aminobutyric acid (GABA). Determination of valproic acid is quite

difficult because it has no chromophore groups in its structure.

Analytical methods using gas chromatography (GC) with flame

ionization detector for the determination of valproic acid in human

plasma has been developed and optimized. Valproic acid extracted from

plasma by liquid-liquid extraction method using diethyl ether. The

optimum analysis conditions for valproic acid in plasma achieved by

regulated gas chromatography injector and detector at a temperature of

250oC and temperature programming was used with an initial

temperature of 70oC and 5

oC temperature rise per minute until a

temperature of 100oC, then held for 1 minute. Then the temperature is

increased by 2°C per minute until the column temperature to 150oC.

The optimum conditions of analysis takes 32 minutes. In the

concentration range from 40,0 to 100,0 μg/mL yielded a linear

calibration curve with correlation coefficient (r) of 0.9894. Accuracy

(% diff) of this method is -13.67% to 12.33% with precision (CV)

between 9.33% to 14.92%, and relative recovery test 86.33% to

112.33%.

Keywords : gas chromatography, optimation, plasma in vitro,

valproic acid

xiii + 69 pp ; 14 figures; 12 tables; 7 appendices

Bibliography : 25 (1977-2009)


x Universitas Indonesia

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................. ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. iii

HALAMAN PENGESAHAN ..............................................................................iv

KATA PENGANTAR ........................................................................................... v

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS

AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ............................................ vii

ABSTRAK ......................................................................................................... viii

ABSTRACT ..........................................................................................................ix

DAFTAR ISI .......................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR .............................................................................................xi

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xii

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xiii

BAB 1. PENDAHULUAN ..................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ...................................................................................... 1

1.2 Tujuan Penelitian .................................................................................. 3

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 4

2.1 Natrium Divalproat ............................................................................... 4

2.2 Analisis Obat dalam Plasma ................................................................. 7

2.3 Kromatografi Gas ........................................................................................ 8

2.4 Validasi Metode Analisis ......................................................................... 13

2.5 Metode Analisis Asam Valproat ............................................................. 18

BAB 3. METODE PENELITIAN ............................................................................. 23

3.1 Lokasi ......................................................................................................... 23

3.2 Bahan .......................................................................................................... 23

3.3 Alat .............................................................................................................. 23

3.4 Cara Kerja .................................................................................................. 23

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................... 29

4.1 Pencarian Kondisi Analisis Optimum untuk Analisis

Asam Valproat dengan Kromatografi Gas ........................................... 29

4.2 Validasi Metode Analisis Asam Valproat Dalam Plasma

In Vitro ....................................................................................................... 32

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN .................................................................... 36

5.1 Kesimpulan ................................................................................................ 36

5.2 Saran ........................................................................................................... 36

DAFTAR ACUAN........................................................................................................ 37


xi Universitas Indonesia

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

2.1 Rumus struktur natrium divalproat ................................................................ 4

4.1 Alat kromatografi gas Shimadzu GC-17A ................................................... 40

4.2 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/mL dengan laju alir gas He

1,0 mL/menit ................................................................................................ 41


1,5 mL/menit ................................................................................................ 42


2,0 mL/menit ................................................................................................ 43

4.5 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/ml dengan suhu awal

kolom 70°C ................................................................................................... 44

4.6 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/ml dengan suhu awal

kolom 90°C ................................................................................................... 45 4.7 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/ml dalam plasma yang

diekstraksi dengan metanol .......................................................................... 46

4.8 Kromatogram larutan natrium divalproat 100 μg/ml dalam plasma yang

diekstraksi dengan kloroform ....................................................................... 47


diekstraksi dengan heksan ............................................................................ 48


diekstraksi dengan dietil eter ........................................................................ 49

4.11 Kurva hubungan antara waktu vorteks dengan luas area dari larutan natrium

divalproat konsentrasi 100μg/mL yang diekstraksi dengan dietil eter ......... 50

4.12 Kurva hubungan antara waktu sentrifugasi dengan luas area dari larutan

natrium divalproat konsentrasi 100μg/mL yang diekstraksi dengan dietil

eter.. ............................................................................................................. .50

4.13 Kurva kalibrasi natrium divalproat dalam plasma in vitro yang terdiri dari 7

sampel plasma dengan konsentrasi 40 sampai 100 μg/mL .......................... 51


xii Universitas Indonesia

DAFTAR TABEL Tabel Halaman

4.1 Hubungan waktu retensi, jumlah lempeng teoritis, dan faktor ikutan dari

larutan natrium divalproat terhadap perubahan laju alir gas pembawa……..52

4.2 Hubungan waktu retensi, jumlah lempeng teoritis, dan faktor ikutan dari

larutan natrium divalproat terhadap perubahan suhu awal kolom ................ 53

4.3 Hubungan luas area ekstrak plasma dari larutan natrium divalproat

terhadap pelarut organik yang digunakan sebagai pengekstrak .................... 54


terhadap perubahan waktu vorteks ................................................................ 55


terhadap perubahan waktu sentrifugasi ......................................................... 56

4.6 Data uji kesesuaian sistem ............................................................................ 57

4.7 Data kurva kalibrasi natrium divalproat dalam plasma in vitro .................... 57

4.8 Data Lower Limit of Quantification (LLOQ) larutan natrium divalproat

dalam plasma in vitro .................................................................................... 58

4.9 Data uji selektivitas larutan natrium divalproat dalam plasma in vitro ........ 59

4.10 Data akurasi larutan natrium divalproat dalam plasma in vitro .................... 60

4.11 Data presisi larutan natrium divalproat dalam plasma in vitro ..................... 61

4.12 Data uji perolehan kembali larutan natrium divalproat dalam plasma in

vitro ............................................................................................................... 62


xiii Universitas Indonesia

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Cara perhitungan nilai N, HETP, dan Tf ............................................................ 63 2. Cara memperoleh regresi linier dari persamaan garis y = a + bx ....................... 64 3. Cara perhitungan koefisien variasi dari fungsi ................................................... 65 4. Cara perhitungan presisi ..................................................................................... 66

5. Cara perhitungan akurasi .................................................................................... 67 6. Cara perhitungan uji perolehan kembali ............................................................ 68 7. Sertifikat analisis natrium divalproat ................................................................. 69


Universitas Indonesia

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Antiepilepsi digunakan terutama untuk mencegah dan mengobati kejang

epilepsi. Terdapat dua mekanisme antiepilepsi yang penting, yaitu mencegah

timbulnya letupan depolarisasi eksesif pada neuron epileptik dalam fokus epilepsi

dan mencegah terjadinya letupan depolarisasi pada neuron normal akibat

pengaruh dari fokus epilepsi (Gan & Utama, 1995).

Masing-masing obat antiepilepsi memiliki efektivitas yang berbeda dalam

mengobati tiap jenis kejang. Oleh karena itu, terapi antiepilepsi harus bersifat

individual dan pemilihan obat yang digunakan harus berdasarkan kepada jenis

kejang, sindrom epileptik, dan respon pasien. Secara umum, obat pilihan untuk

mengobati kejang tonik-klonik adalah fenitoin, karbamazepin, atau asam valproat

(Hoover, 2005). Untuk mengobati kejang lena, obat pilihan yang biasa digunakan

adalah etosuksimid atau asam valproat. Dapat dilihat bahwa asam valproat efektif

untuk mengobati jenis kejang umum. Sejauh ini, tidak ada bukti yang meyakinkan

bahwa bahwa obat ini efektif pada kejang parsial (Pitlick & Porter, 2006).

Asam valproat (asam-2-propilpentanoat) dan bentuk garamnya yaitu

natrium valproat dan natrium divalproat, merupakan senyawa golongan asam

karboksilat rantai sederhana yang digunakan dalam penanganan epilepsi karena

memiliki spektrum aktivitas yang cukup luas (Gikas, Kazanis, Panderi, Parissi-

Poulou, Rompotis, & Vavayannis, 2002). Obat ini biasa digunakan dalam

pengobatan bipolar disorders dan epilepsi, terutama dalam penanganan kejang

umum (Amini, Ghaeli, Kamalinia, & Rouini, 2009).

Berdasarkan fakta bahwa obat ini digunakan secara luas dalam

penanganan pasien dengan gangguan psikiatrik atau neurologik, penentuan kadar

asam valproat dalam plasma merupakan hal yang penting dalam studi monitoring

obat (Amini, Ghaeli, Kamalinia, & Rouini, 2009). Asam valproat merupakan obat

yang wajib untuk uji bioekuivalensi (Food and Drug Administration, 2007).

Untuk itu diperlukan suatu metode analisis obat yang terpercaya dalam matriks

1


2


biologis yang sesuai. Metode analisis yang selektif dan sensitif untuk penilaian

secara kuantitatif suatu obat dan metabolitnya penting agar berhasil menuntun uji

preklinik dan/atau biofarmasetik dan uji farmakologi klinik. Pengukuran analit

dalam matriks biologis harus divalidasi. Validasi metode bioanalisis mencakup

semua prosedur yang menunjukkan bahwa metode khusus yang digunakan untuk

pengukuran kuantitatif analit yang berasal dalam matriks biologis, seperti darah,

plasma, serum, atau urin, dapat dipercaya dan dapat dilakukan ulang

(reproducible) untuk penggunaan yang diinginkan (Food and Drug

Administration, 2001). Validasi metode yang sempurna hanya dapat terjadi jika

metode tersebut sudah dikembangkan dan dioptimasi (Gandjar & Rohman, 2007)

Kadar asam valproat dalam plasma berkisar antara 40-90 μg/ml (Davis,

DeVane, Ennis, Figueroa, Smith, & Winter, 2007). Apabila kadar asam valproat

dalam plasma lebih dari 100 μg/ml, dikhawatirkan akan timbul efek samping yang

membahayakan seperti hepatotoksik, trombositopenia, dan ensefalopati akut (

Pitlick & Porter, 2006; Degel, Heidrich, Schmid, & Weidemann, 1984).

Penetapan kadar asam valproat dalam plasma merupakan masalah yang

cukup sulit karena asam valproat memiliki absorpsi UV yang rendah (Brega,

Lucarelli, Lombaradi, Prandini, & Villa, 1992). Oleh karena itu, sangat penting

untuk mengembangkan suatu metode analisis yang mudah dilakukan, cepat, dan

terpercaya untuk penetapan kadar asam valproat dalam cairan biologis, termasuk

dalam plasma (Gikas, Kazanis, Panderi, Parissi-Poulou, Rompotis, & Vavayannis,

2002).

Sejumlah metode, termasuk metode penetapan kadar dengan Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi (KCKT) detektor fluoresensi dan detektor UV-Vis telah

digunakan untuk menentukan kadar asam valproat dalam plasma (Amini, Ghaeli,

Kamalinia, & Rouini, 2009; Brega, Lucarelli, Lombaradi, Prandini, & Villa, 1992;

Gikas, Kazanis, Panderi, Parissi-Poulou, Rompotis, & Vavayannis, 2002). Ketiga

metode yang dikembangkan dengan menggunakan KCKT tersebut, memerlukan

proses derivatisasi untuk mengubah analit menjadi senyawa yang dapat dideteksi

oleh detektor. Hal ini memang memberikan hasil analisis yang akurat dan sensitif

namun proses analisis yang dilakukan menjadi rumit dan memakan waktu lama.

Sementara itu, metode yang dikembangkan dengan menggunakan kromatografi


3


gas lebih mengutamakan proses ekstraksi seoptimal mungkin dan penggunaan

instrumen yang lebih modern seperti kromatografi gas-spektrometri massa

sehingga diperoleh hasil analisis yang akurasi dan sensitifitasnya tidak kalah

dengan KCKT (Degel, Heidrich, Schmid, & Weidemann, 1984; Deng, Duan, Ji,

Li, Yang, & Zhang, 2006).

Oleh karena itu, dalam penelitian ini penulis ingin mengembangkan metode

analisis asam valproat dalam plasma in vitro dengan menggunakan kromatografi

gas detektor ionisasi nyala dan pengembangan teknik ekstraksi cair-cair sehingga

diperoleh metode yang sederhana dan sensitif untuk analisis asam valproat.

1.2 Tujuan Penelitian

1. Memperoleh kondisi analisis optimum untuk analisis asam valproat dalam

plasma in vitro secara kromatografi gas.

2. Memperoleh metode ekstraksi optimum untuk analisis asam valproat

dalam plasma in vitro secara kromatografi gas.


4 Universitas Indonesia

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Natrium Divalproat

2.1.1 Monografi (Abbott Laboratories, 2009; Ikatan Sarjana Farmasi Indonesia,

2006; Sweetman, 2005; Budavari, 1996)

Gambar 2.1 Rumus struktur natrium divalproat (Hoover, 2005)

Nama dagang : Depakote ®

Rumus molekul : C16H31NaO4

Bobot molekul : 310,4

Sinonim : Sodium hydrogen bis(2-propylpentanoate)

Fungsi : Antikonvulsi, antiepilepsi

Pemerian : Serbuk putih dengan bau spesifik

Kelarutan : Sangat larut dalam alkohol dan metanol

2.1.2 Sifat Farmakologi

Natrium divalproat merupakan obat antiepilepsi yang mengalami disosiasi

dalam saluran gastrointestinal menjadi dua molekul asam valproat. Oleh karena

itu, senyawa ini memiliki indikasi, efek samping, dan kontraindikasi yang sama

dengan asam valproat (Hoover, 2005).

Asam valproat efektif terhadap kejang umum, seperti kejang tonik-klonik

dan kejang lena, sedangkan terhadap kejang parsial efektivitasnya kurang

memuaskan. Walaupun efektivitasnya sebagai obat untuk kejang umum telah


5


diakui, hal ini tidak menjadikan asam valproat sebagai obat terpilih dalam

pengobatan epilepsi karena efek toksiknya terhadap hati (Gan & Utama, 1995).

Mekanisme aksi dari asam valproat sampai saat ini masih belum diketahui

secara pasti. Efek yang ditimbulkan dari pemberian obat ini diperkirakan

berkaitan dengan meningkatnya kadar γ-aminobutyric acid (GABA), suatu

neurotransmiter inhibitor di otak. Suatu studi mengindikasikan bahwa asam

valproat menghambat aktivitas neuron dengan meningkatkan konduktansi kalium

(McEvoy, 2002).

Toksisitas asam valproat berupa gangguan saluran gastrointestinal, sistem

saraf, hati, ruam kulit, dan alopesia. Efek terhadap sistem saraf pusat berupa rasa

kantuk, ataksia, dan tremor. Efek terhadap sistem saraf pusat ini akan menghilang

seiring dengan penurunan dosis. Gangguan pada hati berupa peningkatan aktivitas

enzim-enzim hati, dan pernah terjadi pula kasus nekrosis hati yang berakibat fatal

(Gan & Utama, 1995).

2.1.3 Sifat Farmakokinetika

2.1.3.1 Absorpsi

Natrium divalproat mengalami disosiasi menjadi asam valproat dalam

saluran gastrointestinal. Pemberian dosis oral yang ekuivalen antara natrium

divalproat dan asam valproat memberikan jumLah ion valproat yang ekuivalen

secara sistemik. Pemberian natrium divalproat bersama dengan makanan akan

memperlambat laju absorpsi namun tidak mempengaruhi jumlah zat yang

diabsorpsi.

Konsentrasi plasma puncak setelah pemberian oral dosis tunggal dari

natrium divalproat tercapai setelah 3-5 jam, dan pemberian natrium divalproat

tablet extended-release dosis ganda akan mencapai konsentrasi plasma puncak

setelah 7-14 jam (McEvoy, 2002).


6


2.1.3.2 Distribusi

Asam valproat terdeteksi dalam cairan serebrospinal (sekitar 10% dari

kosentrasi serum) dan air liur (sekitar 1% dari konsentrasi plasma). Asam valproat

dapat melewati plasenta.

Ikatan protein plasma dari asam valproat merupakan tipe tergantung

dosis. Fraksi bebas dari obat meningkat dari 10% pada konsentrasi 40 μg/mL

sampai 18,5 % pada konsentrasi 130 μg/mL. Ikatan protein dari asam valproat

akan menurun pada pasien geriatrik, pasien dengan gangguan hati atau ginjal, dan

adanya obat lain yang dapat menggeser ikatan obat-protein (McEvoy, 2002).

2.1.3.3 Metabolisme

Valproat mengalami metabolisme di hati. Pada pasien dewasa yang

melakukan monoterapi, 30-50% dari dosis yang diberikan akan diekskresi di urin

dalam bentuk konjugat glukuronida. Kurang dari 3% dari dosis yang diberikan

akan diekskresi dalam bentuk yang tidak berubah di urin.

Hubungan antara dosis dan konsentrasi total valproat dalam plasma

bersifat nonlinier. Konsentrasi obat dalam plasma tidak meningkat sebanding

dengan dosis, karena adanya ikatan dengan protein yang bersifat dapat jenuh

(Abbott Laboratories, 2009).

2.1.3.4 Eliminasi

Klirens plasma dan volume distribusi dari total valproat berturut-turut

sebesar 0,56 L/jam/1,73 m2 dan 11 L/1,73 m

2. Waktu paruh dari valproat berkisar

antara 9 sampai 16 jam apabila rejimen dosis yang diberikan ada pada rentang

250-1000 mg.

Nilai-nilai perkiraan yang disebutkan di atas berlaku pada pasien yang

tidak mengonsumsi obat yang memengaruhi sistem metabolisme enzim hepatik.

Contoh, pasien yang mengonsumsi obat antiepilepsi yang bersifat induksi

(karbamazepin, fenitoin, dan fenobarbital) akan menyebabkan valproat

tereliminasi lebih cepat. Karena terjadi perubahan pada klirens valproat,

monitoring terhadap konsentrasi obat dalam darah harus dilakukan secara lebih

intensif (Abbott Laboratories, 2009).


7


2.2 Analisis Obat dalam Plasma

Konsentrasi obat dalam plasma umumnya rendah pada dosis terapi, oleh

karena itu diperlukan persiapan sampel khusus untuk analisis obat dalam plasma.

Dalam plasma, obat terikat pada permukaan protein sehingga obat harus

dibebaskan terlebih dahulu. Beberapa cara yang bisa dilakukan untuk mencapai

tujuan di atas di antaranya dengan pengendapan protein, ekstraksi cair-cair, dan

ekstraksi fase padat (Evans, 2004).

2.2.1 Pengendapan Protein

Pada pengendapan protein, biasanya digunakan asam atau pelarut organik

yang dapat bercampur dengan air untuk memisahkan protein dari plasma. Asam

trikloroasetat dan asam perklorat sangat efisien sebagai pengendap protein, tetapi

asam yang terlalu kuat dapat menimbulkan efek kerusakan terhadap obat yang

diekstraksi. Pelarut organik seperti metanol, asetonitril, aseton dan etanol,

meskipun memiliki efisiensi yang relatif rendah dalam memisahkan protein, tetapi

pelarut ini telah digunakan secara luas dalam bioanalisis karena kompatibilitasnya

dengan fase gerak kromatografi cair kinerja tinggi.

Setelah dicampur (biasanya menggunakan bantuan vorteks), sampel

disentrifugasi untuk menghasilkan supernatan yang jernih, berisi komponen yang

diinginkan. Larutan yang telah bebas protein mungkin perlu diekstraksi lebih

lanjut dengan teknik ekstraksi cair-cair dengan pelarut organik yang tidak

bercampur, atau dapat langsung disuntikkan pada sistem analisis yang akan

digunakan, bila diyakini obat sepenuhnya larut dalam supernatan (Evans, 2004).

2.2.2 Ekstraksi Cair-cair

Ekstraksi cair-cair adalah proses pemindahan suatu komponen dari satu fase

cair ke fase cair lainnya yang tidak saling bercampur sesamanya. Prosesnya

disebut partisi atau distribusi.

Umumnya, salah satu fasenya berupa air atau larutan air. Cara paling umum

yang sering digunakan untuk pemisahan parsial adalah metode ekstraksi dengan

pelarut organik. Agar obat dapat terekstraksi dalam pelarut organik, maka obat itu

harus dalam bentuk tidak terionisasi. Oleh karena itu, pH fase air harus dioptimasi


8


agar diperoleh bentuk tidak terionisasi dengan sempurna. Optimasi dapat

dilakukan dengan menghitung atau menentukan pKa obat.

Setelah dipisahkan dari fase air, fase organik harus benar-benar bebas air.

Untuk mempercepat penguapan, dapat ditambahkan beberapa tetes etanol, dan air

dapat dihilangkan dari fase organik dengan penambahan sedikit natrium sulfat

anhidrat pada saat penyaringan. Penguapan dapat dilakukan dengan alat

evaporator vakum atau diuapkan pada temperatur kamar (Chamberlain, 1985).

2.2.3 Ekstraksi Fase Padat

Pada ekstraksi fase padat, analit ditahan oleh fase padat saat sampel

dilewatkan, kemudian dilanjutkan dengan elusi analit oleh pelarut yang sesuai.

Pada teknik ini digunakan kolom berukuran kecil dengan adsorben yang mirip

dengan yang digunakan pada saat analisis. Metode ekstraksi fase padat ini

berdasarkan prinsip dari kromatografi, yaitu adsorpsi obat dari larutan ke dalam

adsorben atau fase diam.

Pemilihan cara isolasi obat dalam plasma harus dilakukan karena akan

memberikan nilai perolehan kembali (recovery) yang maksimum dari obat yang

dianalisis. Selain itu juga untuk memperbaiki ketelitian, maka penggunaan baku

dalam dapat ditambahkan pada sampel (Evans, 2004).

2.3 Kromatografi Gas

2.3.1 Teori

Kromatografi gas adalah suatu cara untuk memisahkan senyawa atsiri

dengan meneruskan arus gas melalui fase diam. Bila fase diam berupa zat padat,

maka cara itu disebut sebagai kromatografi gas padat (KGP).Bila fase diam

berupa zat cair, cara tadi disebut kromatografi gas cair (KGC). Banyaknya macam

fase cair yang dapat digunakan sampai suhu 400oC mengakibatkan KGC

merupakan bentuk kromatografi gas yang paling serba guna dan selektif. KGC

digunakan untuk menganalisis gas, zat cair, dan zat padat.

Pada KGC, komponen yang akan dipisahkan dibawa oleh gas lembam (gas

pembawa) melalui kolom. Campuran cuplikan terbagi diantara gas pembawa dan


9


pelarut (fase diam) yang terdapat pada zat padat dengan ukuran partikel tertentu

(penyangga padat). Pelarut akan menahan komponen secara selektif berdasarkan

koefisien distribusinya sehingga terbentuk sejumlah pita yang berlainan pada gas

pembawa. Pita komponen ini meninggalkan kolom bersama aliran gas pembawa

dan dicatat sebagai fungsi waktu oleh detektor.

Keuntungan dari kromatografi gas yaitu :

a. Kecepatan

Seluruh analisis dapat diselesaikan dalam waktu singkat. Penggunaan gas

sebagai fase gerak mempunyai keuntungan, yaitu tercapainya kesetimbangan

antara fase gerak dan fase diam, dan dapat digunakan kecepatan gas pembawa

yang tinggi.

b. Daya pisah

Misalnya puncak C18, C18:1, dan C18:2 yang menyatakan ester metil asam

stearat, oleat, dan linoleat. Pemisahan ketiga senyawa ini dengan cara lain sangat

sukar atau tidak mungkin, perbedaan titik didihnya kecil sekali, hanya dalam

derajat ketidakjenuhan. Tetapi dengan menggunakan fase cair yang selektif, KGC

dapat memisahkan ketiganya, suatu hal yang tidak mungkin dilakukan dengan

cara penyulingan atau cara lain.

c. Analisis kualitatif

Waktu retensi adalah waktu sejak penyuntikan sampai maksimum puncak.

Sifat ini merupakan ciri khas cuplikan dan fase cair pada suhu tertentu. Waktu

retensi ini tidak terpengaruh oleh adanya komponen lain dan dapat digunakan

untuk mengidentifikasi puncak yang terbentuk.

d. Analisis kuantitatif

Luas tiap puncak yang terbentuk berbanding lurus dengan konsentrasi

puncak tersebut. Ini dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi yang tepat

dari setiap komponen.

e. Kepekaan

Alasan utama mengapa penggunaan kromatografi gas pada analisis begitu

meluas adalah karena kepekaannya. Bentuk sel penghantar panas yang paling

sederhana dapat mendeteksi sampai 0,01% (100 bpj = bagian per juta). Detektor

pengionan nyala dapat mendeteksi dengan mudah bagian per juta. Detektor


10


tangkap elektron dan detektor fosfor dapat mengukur pada skala pikogram (10-12

gram). Keuntungan tambahan dari kepekaan yang tinggi ini adalah cuplikan yang

diperlukan sedikit sekali. Beberapa mikroliter saja sudah cukup untuk analisis

lengkap.

f. Kesederhanaan

Penafsiran data yang diperoleh biasanya cepat dan langsung, serta mudah.

Bila dibandingkan dengan data yang diperoleh, harga instrumentasi ini termasuk

murah (McNair & Bonelli, 1988)

2.3.2 Instrumentasi

Bagian-bagian utama dari sebuah kromatografi gas yaitu silinder dengan gas

pembawa (carrier gas), pengukur tekanan dan pengontrol flow rate, tempat

injeksi sampel (injection port), kolom, detektor dan amplifier, rekorder/perekam,

dan oven dengan termostat untuk tempat injeksi (gerbang suntik), kolom, dan

detektor (Harmita, 2006).

2.3.3 Sistem Kromatografi

2.3.3.1 Gas Pembawa

Tangki gas bertekanan tinggi berlaku sebagai sumber gas pembawa. Suatu

pengatur tekanan digunakan untuk menjamin tekanan yang seragam pada

pemasok kolom sehingga diperoleh laju aliran gas yang tetap. Gas yang biasa

dipakai adalah hidrogen, helium, dan nitrogen. Gas pembawa harus memiliki sifat:

inert, untuk mencegah interaksi dengan cuplikan atau pelarut (fase diam), dapat

meminimumkan difusi gas, mudah didapat dan murni, murah serta cocok untuk

detektor yang digunakan (McNair & Bonelli, 1988).

2.3.3.2 Pemasukan Cuplikan

Cuplikan zat cair biasanya dimasukkan dengan semprit. Untuk cuplikan

berbetnuk zat padat, cara yang biasa digunakan adalah dengan melarutkannya

dalam suatu pelarut yang tidak mengganggu cuplikan yang dianalisis. Suatu cara

baku untuk memasukkan gas dan zat cair adalah dengan memasukkan jarum


11


suntik melalui septum yang dapat menutup kembali sendiri dan menyuntikkan

sejumlah volume terukur dari semprit (McNair & Bonelli, 1988).

2.3.3.3 Kolom

Pipa kolom dapat terbuat dari tembaga, baja nirkarat, aluminium, dan kaca

yang berbentuk lurus, lengkung, atau melingkar. Pada umumnya digunakan baja

nirkarat, yang dikemas dalam bentuk lurus agar kemasan seragam, kemudian

dilingkarkan agar dapat dipasang dalam ruang kolom yang terbatas. Kolom lurus

lebih efisien, tetapi dapat menjadi tidak praktis, terutama bila alat bekerja pada

suhu tinggi (McNair & Bonelli, 1988).

Kolom pada kromatografi gas dikelompokkan menjadi dua kelompok

utama, yaitu kolom yang terkemas (packed column) dan kolom kapiler (capillary

column). Kolom yang terkemas (packed column) mempunyai panjang antara 1-10

meter dengan diameter dalam antara 3-10 mm atau sampai lebih dari 10 cm bagi

kolom preparative. Kolom kapiler (capillary column) panjangnya dapat mencapai

10-50 meter dengan diameter dalam sangat kecil, yaitu 0,2-1,2 mm (Harmita,

2006).

Berdasarkan mekanisme pembuatannya, kolom kapiler dibagi menjadi tiga

jenis, yaitu :

a. Kolom WCOT (Wall Coated Open Tubular) adalah jenis kolom kapiler yang

fase diamnya terikat pada permukaan bagian dalam kolom kapiler.

b. Kolom SCOT (Support Coated Open Tubular Column) adalah jenis kolom

kapiler yang cairan fase diamnya masih ditambah partikel pendukung padat

seperti tanah diatom atau partikel silika yang telah disilinisasi.

c. Kolom FSOT (Fused Silica Open Tubuler) adalah jenis kolom kapiler yang fase

diamnya terikat secara kimia dengan permukaan bagian dalam kolom kapiler

sedangkan bagian luar dilapisi resin poliimida (Harmita, 2006).

2.3.3.4 Fase Diam

Pemilihan fase diam yang tepat mungkin merupakan parameter terpenting

pada KGC. Secara ideal fase diam tersebut harus mempunyai ciri sebagai berikut :

a. Cuplikan harus menunjukkan koefisien distribusi yang berbeda pada fase diam,


12


b. Cuplikan harus mempunyai kelarutan yang berarti dalam fase diam,

c. Fase diam harus mempunyai tekanan uap yang dapat diabaikan pada suhu kerja

(McNair & Bonelli, 1988).

2.3.3.5 Suhu

Dalam sistem kromatografi diperlukan sekali untuk memiliki tiga

pengendali suhu yang berlainan.

a. Suhu gerbang suntik

Gerbang suntik harus cukup panas untuk menguapkan cuplikan sedemikian

cepat sehingga tidak menghilangkan keefisienan yang disebabkan oleh cara

penyuntikan. Sebaliknya, suhu gerbang suntik harus cukup rendah untuk

mencegah peruraian akibat panas.

b. Suhu kolom

Suhu kolom harus cukup tinggi sehingga analisis dapat diselesaikan dalam

waktu yang layak, dan harus cukup rendah sehingga pemisahan yang dikehendaki

tercapai. Menurut pendekatan sederhana yang dilakukan oleh Giddings, waktu

retensi naik dua kali lipat tiap penurunan suhu kolom 30oC.

Untuk kebanyakan cuplikan, semakin rendah suhu kolom, semakin tinggi

koefisien partisi dalam fase diam sehingga hasil pemisahan semakin baik. Pada

beberapa kasus tidak dapat digunakan suhu rendah, terutama bila cuplikan terdiri

atas senyawa yang rentangan titik didihnya lebar. Untuk itu suhu perlu diprogram.

c. Suhu detektor

Pengaruh suhu pada detektor sangat bergantung pada jenis detektor yang

digunakan. Tetapi, sebagai patokan umum dapat dikatakan bahwa detektor dan

sambungan antara kolom dan detektor harus cukup panas sehingga cuplikan

dan/atau fase diam tidak mengembun. Pelebaran puncak dan menghilangnya

puncak komponen merupakan ciri khas terjadinya pengembunan (McNair &

Bonelli, 1988).

2.3.3.5 Detektor

Dalam kromatografi gas dikenal beberapa macam detektor yang lazim

digunakan dan setiap detektor mempunyai karakteristik dalam selektivitas,


13


linearitas, sensitivitas atau kemampuan mendeteksi pada jumlah terkecil (limit

detection).

a. Detektor daya hantar panas (Thermal Conductivity Detector/TCD)

Bersifat non dekstruktif, tidak selektif (bersifat umum), batas linearitas

104 dan jumlah terkecil yang masih dapat terdeteksi sampai 10

-5 g/mL.

b. Detektor ionisasi nyala (Flame Ionization Detector/FID)

Bersifat dekstruktif, dapat mendeteksi semua senyawa organik, batas

linearitas 107 dan batas terkecil pendeteksian 2 x 10

-11 g/mL.

c. Detektor fotometrik nyala (Flame Photometric Detector/FPD)

Bersifat dekstruktif, selektif terhadap senyawa sulfur dan fosfor organik,

batas linearitas 103 dan batas terkecil pendeteksian 2 x 10

-12 g/mL.

d. Detektor termionik nyala (Flame Thermal Detector/FTD)

Bersifat dekstruktif, selektif terhadap senyawa nitrogen dan fosfor

organik, batas linearitas 103 dan batas terkecil pendeteksian 2 x 10

-10 g/mL.

e. Detektor penangkap elektron (Electrolytic Conductivity Detector/ECD)

Bersifat dekstruktif, selektif terhadap senyawa dengan sifat elektronegatif

seperti halogen organik, batas linearitas 5 x 102 dan batas terkecil pendeteksian

2 x 10-13

g/mL (Harmita, 2006).

2.3.3.8. Rekorder/Perekam

Pada kebanyakan peralatan kromatografi yang telah menggunakan teknologi

maju, peran pengolahan data dilakukan oleh suatu alat pengolah data atau

komputer. Informasi yang diperoleh dapat dimanfaatkan dalam analisis kualitatif

biasanya dilakukan dengan membandingkan waktu retensi contoh zat baku pada

kondisi analisis yang sama. Sedangkan untuk analisis kuantitatif biasanya

dilakukan dengan perhitungan relatif dari tinggi atau luas puncak kromatogram

contoh terhadap zat baku melalui metode baku luar atau baku dalam (Harmita,

2006).

2.4 Validasi Metode Analisis

Pada validasi metode bioanalisis terdapat tiga tipe dan tingkatan validasi

yaitu sebagai berikut :


14


a. Validasi lengkap (full validation)

Validasi lengkap ini sangat penting apabila ingin mengembangkan metode

dan mengimplementasikan metode bioanalisis untuk pertama kalinya. Validasi ini

penting untuk obat baru dan untuk penentuan metabolitnya.

b. Validasi parsial (partial validation)

Validasi parsial merupakan modifikasi dari metode bioanalisis yang sudah

divalidasi. Beberapa tipe metode analisis yang termasuk dalam validasi parsial

antara lain :

1. Metode bioanalisis yang ditransfer antar laboratorium atau analisis.

2. Ada perubahan pada metode analisanya (misalnya ada perubahan pada sistem

deteksi).

3. Perubahan antikoagulan.

4. Perubahan matriks pada spesies yang sama (misalnya plasma manusia diganti

urin).

5. Perubahan prosedur proses sampling.

6. Perubahan spesies pada matriks yang sama (misalnya plasma mencit diganti

plasma tikus).

7. Perubahan kisaran konsentrasi.

8. Perubahan instrument atau platform software.

9. Volume sampel terbatas.

10.Matriksnya jarang.

c. Validasi silang (cross validation)

Validasi ini dilakukan dengan membandingkan parameter-parameter

validasi apabila digunakan dua atau lebih metode bioanalisis untuk mendapatkan

data pada studi yang sama atau pada studi yang berbeda. Pada validasi ini

digunakan metode validasi yang original sebagai pembanding dan metode

bioanalisis lainnya sebagai komparator.

Analisis obat dalam matriks biologi memerlukan standar acuan (reference

standard) dan sampel yang digunakan sebagai quality control (QC). Standar


15


acuan yang digunakan sebaiknya identik dengan analit, apabila tidak bisa

digunakan basa bebas atau asamnya, maka dapat digunakan garam atau ester

dengan kemurnian yang diketahui. Standar acuan dapat berupa baku dalam dan

baku luar. Ada tiga macam standar acuan, antara lain :

a. Standar acuan yang mempunyai sertifikat (misalnya USP standar).

b. Standar acuan yang dijual secara komersil dari sumber yang mempunyai

reputasi.

c. Standar acuan yang disintesis oleh laboratorium analit, atau institusi non

komersial lainnya (Food And Drug Administration).

Parameter yang dibutuhkan untuk keseluruhan proses validasi metode

bioanalisis meliputi evaluasi dari selektivitas, akurasi, presisi, uji perolehan

kembali (% recovery), kurva kalibrasi, lower limit of quantification (LLOQ),

linearitas, dan stabilitas (Food and Drug Administration, 2001).

2.4.1 Selektivitas

Selektivitas merupakan kemampuan metode analisis untuk mengukur kadar

analit dengan adanya komponen-komponen lain dalam sampel (cairan biologis).

Pada uji selektivitas ini dilakukan pengukuran pada 6 blanko plasma manusia

yang berbeda. Setiap sampel blanko sebaiknya diuji terhadap adanya gangguan

dan selektivitas pada lower limit of quantification (LLOQ) (Food and Drug

Administration, 2001).

2.4.2 Akurasi

Akurasi menggambarkan kedekatan hasil pengujian dengan kadar

sebenarnya. Akurasi dilakukan minimal 5 replikat untuk tiap kadar yaitu pada

konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi. Pengukurannya dapat dilakukan intra

assay (dalam satu kali analisis) dan inter assay (dilakukan analisis selama 5 hari).

Pengukuran akurasi memenuhi syarat jika nilai % diff tidak menyimpang ±15%,

kecuali jika pengukuran dilakukan pada kadar LLOQ maka tidak boleh

menyimpang ±20% (Food and Drug Administration, 2001).


16


2.4.3 Presisi

Presisi menggambarkan kedekatan antara hasil pengujian yang satu dengan

hasil pengujian lainnya. Pada pengukuran presisi dilakukan minimal 5 replikat

untuk tiap kadar yaitu pada konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi.

Pengukurannya dapat dilakukan intra assay (dalam satu kali analisis) dan inter

assay (dilakukan analisis selama 5 hari). Penentuan presisi pada tiap konsentrasi

memenuhi syarat jika koefisien variasi (KV) tidak menyimpang ±15%, kecuali

jika pengukuran dilakukan pada kadar LLOQ maka tidak boleh menyimpang

±20% (Food and Drug Administration, 2001).

2.4.4 Uji Perolehan Kembali (% recovery)

Uji perolehan kembali (% recovery) merupakan perbandingan respon

detektor analit yang diekstraksi dari sampel biologis dengan respon detektor kadar

yang sebenarnya dari standar murni. Perolehan kembali dari analit tidak perlu

100% tetapi perolehan kembali dari analit dan baku dalam harus konsisten,

presisi, dan reprodusibel. Uji perolehan kembali dilakukan dengan

membandingkan hasil analisis dari sampel yang diekstraksi pada tiga konsentrasi

(konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi) dan standar yang tidak diekstraksi di

mana uji perolehan kembalinya 100%. Penentuan uji perolehan kembali (%

recovery) pada tiap konsentrasi memenuhi syarat jika % recovery berkisar antara

80-120% (Food and Drug Administration, 2001).

2.4.5 Kurva Kalibrasi

Kurva kalibrasi merupakan hubungan antara respon instrumen dengan

konsentrasi analit yang diketahui. Kurva kalibrasi harus terdiri dari 1 blank

sample (matriks tanpa baku dalam), 1 zero sample (matriks dengan baku dalam )

dan 6-8 non-zero samples yang mencakup kisaran konsentrasi pengukuran

(termasuk konsentrasi pada LLOQ). Standar terendah dari kurva kalibrasi yang

dapat diterima sebagai LLOQ jika memenuhi kondisi sebagai berikut :

a. Respon analit pada LLOQ sedikitnya lima kali respon blanko.

b. Respon analit (puncak analit) dapat diidentifikasi, terpisah, dan reproduksibel

dengan koefisien variasi 20% dan akurasi 80-120% (Food and Drug



17


2.4.6 Linearitas dan Rentang

Linearitas suatu metode bioanalisis harus diuji untuk mengetahui adanya

hubungan yang linear antara kadar zat dengan respon detektor. Linearitas

diperoleh dari koefisien korelasi (r) pada analisis regresi linier yang didapat dari

kurva kalibrasi. Dengan dilakukan uji ini, maka dapat diketahui batas-batas

konsentrasi dari analit yang memberikan respon detektor yang linear. Analisis

harus dilakukan pada konsentrasi yang termasuk batas-batas linier dari konsentrasi

yang telah dilakukan. Rentang metode adalah pernyataan konsentrasi terendah dan

tertinggi analit yang dianalisis memberikan kecermatan, keseksamaan, dan

linearitas yang dapat diterima (Food and Drug Administration, 2001).

2.4.7 Stabilitas

Berbagai kondisi seperti panas, cahaya, kelembaban, dan pH yang

berbeda, kandungan kimia dari obat, matriks serta wadah penyimpanan dapat

mempengaruhi kestabilan obat, sehingga obat yang ada dalam matriks biologis

dapat terurai sewaktu penyimpanan dan tidak dapat terdeteksi sewaktu sampel

dianalisis. Untuk menentukan stabilitas obat dalam matriks biologis maka

digunakan beberapa sampel yang dipersiapkan dari larutan induk analit yang

dibuat segar dan analit dalam matriks biologi. Penentuan stabilitas obat dalam

matriks biologi dapat dilakukan dengan lima cara antara lain :

a. Stabilitas freeze dan thaw

Stabilitas sebaiknya ditentukan setelah tiga siklus pembekuan/pencairan.

Pengujian dilakukan paling sedikit pada tiga konsentrasi sampel uji (konsentrasi

rendah, sedang, tinggi) dalam plasma, kemudian disimpan pada temperatur yang

diharapkan selama 24 jam dan pada temperatur kamar. Jika analit tidak stabil

selama penyimpanan pada temperatur yang diharapkan, maka sampel sebaiknya

disimpan pada temperatur -70o

C selama tiga siklus freeze dan thaw (Food and

Drug Administration, 2001).

b. Stabilitas temperatur jangka pendek

Pengujian dilakukan dengan menggunakan tiga konsentrasi sampel uji

(konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi) dalam plasma, kemudian disimpan pada

temperatur kamar selama 4 sampai 24 jam (Food and Drug Administration, 2001).


18


c. Stabilitas jangka panjang

Pada stabilitas jangka panjang, pengujian dilakukan dengan menggunakan

tiga konsentrasi sampel uji (konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi) dalam plasma.

Pengujian dilakukan pada waktu mulai sampel dikumpulkan sampai tanggal

terakhir sampel dianalisis, misalnya selama 0, 20, 60, dan 90 hari. Selama periode

uji stabilitas, larutan uji disimpan pada lemari pendingin (-20oC). Konsentrasi

analit diukur setelah rentang waktu penyimpanan tersebut (Food and Drug


d. Stabilitas larutan stok

Uji stabilitas larutan stok dilakukan dengan pengujian menggunakan larutan

stok obat dan baku selama 6 jam pertama pada temperatur kamar dan untuk hari

ke 20 pada penyimpanan di lemari pendingin (Food and Drug Administration,

2001).

e. Stabilitas post-preparative

Stabilitas post-preparative yaitu stabilitas selama analit berada pada

autosampler (Food and Drug Administration, 2001).

2.5 Metode Analisis Asam Valproat

Terdapat beberapa studi yang berkaitan dengan metode analisis asam

valproat dalam serum atau plasma yang sudah dipublikasikan, diantaranya yaitu :

a. Penetapan Kadar Asam Valproat dalam Plasma Manusia dengan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Detektor Fluoresensi (Rompotis,

Parissi-Poulou, Gikas, Kazanis, Vavayannis, & Panderi, 2002).

Preparasi sampel :

Dimasukkan 25 μL plasma manusia, 100 μL larutan asam valproat dengan

konsentrasi tertentu, dan 100 μL larutan asam sikloheksankarboksilat (baku

dalam), ditambahkan 275 μL asetonitril untuk mengendapkan protein.

Dikocok dengan vorteks selama 30 detik kemudian disentrifugasi pada 2890

g selama 5 menit. Diambil 50 μl supernatant kemudian direaksikan dengan

50 μL N-(4-Bromometil-7-hidroksi-2-okso-2H-6-kromenil)bromoasetamida

(senyawa penderivat), ditambahkan aseton sampai volume tepat 1 mL.

Diambil 100 μL larutan hasil derivatisasi, diencerkan dengan 100 μL fase


19


gerak. Disuntikkan 20 μL hasil pengenceran ke sistem kromatografi cair

kinerja tinggi (KCKT).

Kondisi Analisis :

Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan kolom

LiChrospher RP 18 (125 x 4,6 mm) ukuran partikel 5 μm (Merck, Germany)

dengan kolom pelindung BDS C-18 (10 x 4,6 mm) ukuran partikel 5 μm

pada kondisi isokratik. Fase gerak asetonitril-air (60:40) dengan laju alir 1,0

mL/menit. Detektor yang digunakan adalah detector fluoresensi dengan

λeksitasi = 345 nm dan λemisi = 435 nm.

Hasil :

Limit deteksi asam valproat dalam plasma sebesar 0,13 μg/mL. Nilai

perolehan kembali rata-rata sebesar 100,4 % dan akurasi metode sebesar -

0,5%-1,3% pada rentang konsentrasi 6,0-150,0 μg/mL.

b. N-(1-naftil)etilendiamin, Senyawa Penderivat UV untuk Penetapan Kadar

Asam Valproat dalam Plasma Manusia (Kamalinia, Rouini, Ghaeli, &

Amini, 2009).

Preparasi Sampel :

Dimasukkan 1 mL plasma yang sudah di-spike asam valproat konsentrasi

tertentu, 1 mL asam sikloheksanpropionat (baku dalam), 1 mL NaCl jenuh,

dan 1 mL asam fosfat ke dalam tube uji, dicampur selama 1 menit.

Ditambahkan 6 mL diklormetan, disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm,

kemudian diambil lapisan organiknya. Ditambahkan Na2SO4 ke dalam

lapisan organik, kemudian dialiri dengan gas N2. Diambil residu yang

terbentuk, kemudian ditambahkan 200 μL asetonitril, 200 μL N-(1-

naftil)etilendiamin, 100 μL N-hidroksisuksinimid, dan 100 μL

disikloheksilkarbodiimida. Campuran kemudian dipanaskan pada suhu

85oC selama 1 jam. Setelah didinginkan, diambil 25 μL campuran, lalu

suntikkan ke sistem KCKT.

Kondisi Analisis :

Sistem KCKT yang terdiri dari injektor Rheodyne 20 μl dan detektor UV

486. Kolom yang digunakan adalah kolom Tecknokroma C18 (250 x 4,6


20


mm) ukuran partikel 5 μm. Fase gerak yang digunakan adalah asetonitril-air

(75:25) dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit.

Hasil :

Kurva kalibrasi linier pada rentang 0,1-100 μg/mL. Batas deteksi sebesar 10

ng/mL dan batas kuantisasi sebesar 0,1 μg/mL.

c. Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi untuk Analisis Asam Valproat

dan Obat Antiepilepsi Lain dalam Serum atau Plasma Manusia (Lucarelli,

Villa, Lombaradi, Prandini, & Brega, 1992)

Preparasi Sampel :

Dimasukkan 200 μL serum atau plasma yang mengandung asam valproat ke

dalam microtube, ditambahkan 200 μL asam nonanoat (baku dalam), 100

μL larutan penderivat (campuran 4-bromofenasil bromida dan

disikloheksan-18-crown-6, masing-masing dengan konsentrasi 20 μg/mL

dan 0,5 μg/mL), dan 25 μL dapar fosfat pH 7,0. Campuran dikocok dengan

vorteks, kemudian disentrifus 1000 g selama 10 menit. Diambil 200 μL

supernatan kemudian dipanaskan pada suhu 70 oC selama 15 menit. Setelah

didinginkan, diambil 40 μL aliquot untuk dianalisis menggunakan

kromatografi cair kinerja tinggi.

Kondisi Analisis :

Sistem KCKT Perkin Elmer 410 Series yang dilengkapi detektor LC 90 UV.

Kolom yang digunakan adalah kolom Pecosphere C18 (300 x 4,6 mm)

ukuran partikel 3 μm. Fase gerak yang digunakan adalah asetonitril-dapar

fosfat (70:30) dengan kecepatan alir 2,0 mL/menit.

Hasil :

Kurva kalibrasi linier pada rentang 12,5-100 μg/mL. Batas deteksi sebesar 3

ng/mL.

d. Metode Kromatografi Gas Cair Untuk Penetapan Kadar Asam Valproat

dalam Cairan Biologis (Jensen & Gugler, 1977)

Preparasi Sampel :

Masukkan 1 mL plasma dan 1 mL larutan baku dalam (40 μg/mL) ke dalam

tabung sentrifugasi. Larutan kemudian diasamkan dengan 1 mL HCl 0,5 N.

Campuran ini kemudian diekstraksi dengan pelarut organik (heksan –


21


kloroform, 1:1), lalu dikocok dengan vorteks selama 4 menit. Diambil 3,5

mL lapisan organik, dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi lain.

Ditambahkan 2 mL larutan NaOH 0,5 N, lalu dikocok dengan vorteks dan

sentrifus, kemudian diambil 1,5 mL lapisan air. Masukkan lapisan air ke

dalam tabung sentrifus lain, lalu tambahkan 1 mL larutan HCl 3N dan 50 μl

kloroform. Tabung sentrifugasi lalu dikocok dengan vorteks selama 30 detik

dan disentrifus selama 2 menit. Ambil 1 μl lapisan organik kemudian

disuntikkan ke instrumen kromatografi gas.

Kondisi Analisis :

Kromatografi gas dual kolom Hewlett-Packard Model 5736 A dengan

detektor ionisasi nyala. Suhu injektor dan detektor diatur pada suhu 250 oC,

sementara suhu kolom diatur pada suhu 170 oC, laju alir gas pembawa

(nitrogen) diatur sebesar 30 mL/menit.

Hasil :

Kurva kalibrasi linier pada rentang 0,5-150 μg/mL dalam plasma.

e. Metode Kromatografi Gas yang Mudah dan Cepat untuk Kuantitasi Asam

Valproat Bebas dan Kadar Asam Valproat Total dalam Serum Manusia

(Bigdeli, Falahat-Pisheh, & Neyestani, 2006)

Preparasi Sampel :

Masukkan 200 μL plasma dan 200 μL HCl 0,1 N, lalu dikocok dengan

vorteks, kemudian ditambahkan 400 μL campuran kloroform:metanol (1:1)

yanag sudah mengandung larutan baku dalam dengan konsentrasi 186

μg/mL. Larutan dihomogenkan kemudian disentrifus dengan kecepatan

3000 g selama 10 menit pada suhu kamar. Diambil 1,0 μL dari lapisan

terbawah kemudian disuntikkan ke kromatografi gas.

Kondisi Analisis :

Kromatografi gas Younglin Model M600 D dengan kolom Teknokroam

TRB-1 dan detektor ionisasi nyala. Suhu injektor 200oC dan suhu detektor

290oC. Elusi dilakukan dengan program temperatur mulai dari suhu 80

oC

hingga 100oC dengan kenaikan suhu 10

oC/menit, ditahan selama 1 menit,

kemudian dinaikkan hingga suhu 106oC dengan kenaikan suhu 5

oC/menit.

Laju alir gas pembawa (helium) diatur sebesar 20 mL/menit.


22


Hasil :

Metode ini linier pada rentang 2,5-6400 μg/mL dengan % perolehan

kembali sebesar 92%. Presisi intra-assay dan inter-assay pada rentang 25-

100 μg/mL memberikan nilai koefisien variasi sebesar 1,49 dan 2,61.

f. Metode Kromatografi Gas Kapiler-Spektrometri Massa dalam Monitoring

Kadar Asam Valproat dan Tujuh Metabolitnya dalam Serum Manusia

(Darius & Meyer, 1994).

Preparasi Sampel :

Dimasukkan 100 μL plasma ke dalam microtube Effendorf, lalu

ditambahkan 50 μL dapar fosfat 1 M, 100 μL larutan asam 2-etil-2-

metilkaproat, dan 1 mL etil asetat, kemudian dikocok dengan vorteks.

Setelah pengocokan, campuran kemudian disentrifus selama 5 menit dengan

kecepatan 500 g. Diambil lapisan organik, kemudian dialiri dengan gas N2

hingga kering. Setelah itu, ditambahkan kembali 1 mL etil asetat dan 10 μL

asetonitril. Fase etil asetat kemudian dipekatkan hingga 20 μL. Fase etil

asett yang sudah dipekatkan selanjutnya ditambahkan 40 μL N-trimetilsilil-

N-metil-trifluorasetamida (senyawa penderivat) lalu dikocok dengan

vorteks. Larutan yang sudah dikocok dengan vorteks kemudian dipindahkan

ke dalam vial lalu dipanaskan selama 1 jam pada suhu 70oC.

Kondisi Analisis :

Kromatografi gas-spektrometri massa Hewlett- Packard dengan kolom non

polar kapiler HP1. Suhu injektor 250oC dan suhu detektor 250

oC. Elusi

dilakukan dengan program temperatur mulai dari suhu 90oC hingga 150

oC

dengan kenaikan suhu 5oC/menit, ditahan selama 1 menit, kemudian

dinaikkan hingga suhu 250oC dengan kenaikan suhu 40

oC/menit. Tekanan

gas pembawa yang digunakan (helium) diatur sebesar 75 kPa.

Hasil :

Metode ini memiliki limit deteksi 100 ng/mL. Presisi intra-assay pada

konsentrasi 18, 36, dan 72 μg/mL memberikan nilai koefisien variasi

sebesar 5,5; 3,2; dan 1,4 %.



BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Analisis Instrumen,

Departemen Famasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Indonesia.

3.2 Bahan

Natrium divalproat (Katwijk Chemie bv), metanol p.a (Merck), kloroform

p.a (Merck), n-heksan p.a (Merck), dietil eter p.a (Merck), HCl (Merck), aquadest,

plasma darah (Palang Merah Indonesia).

3.3 Alat

Kromatografi Gas Shimadzu model GC 17A yang dilengkapi dengan

detektor ionisasi nyala (FID), kolom kapiler CBP-10 dengan panjang 50 meter

dan diameter dalam 0,25 mm, pemroses data Class GC Solution, dan integrator

CBM 102; microsyringe 5 μL (Hamilton Co, Nevada); sentrifugator (TGL-16);

mikropipet 100 dan 1000 μL (Soccorex); alat vorteks; microtube; blue tip; yellow

tip; lemari pendingin; timbangan analitik; alat-alat gelas yang umum digunakan

dalam analisis kuantitatif.

3.4 Cara Kerja

3.4.1 Penyiapan Bahan Percobaan

3.4.1.1 Pembuatan Larutan Induk Natrium Divalproat dan Larutan Uji

Natrium divalproat ditimbang 100,0 mg secara seksama, dimasukkan ke

dalam labu ukur 10,0 mL dan dilarutkan dengan metanol, ditambahkan hingga

batas, sehingga diperoleh larutan natrium divalproat dengan konsentrasi 10


24


mg/mL (10.000 μg/mL = 10.000 ppm). Pengenceran dengan aquadest dilakukan

untuk mendapatkan larutan dengan konsentrasi tertentu.

3.4.1.2 Pembuatan Larutan HCl 0,1 N

Larutan HCl pekat diambil sebanyak 10,0 mL dengan menggunakan pipet

volume, kemudian diencerkan dengan aquadest hingga diperoleh volume akhir

120,0 mL dengan konsentrasi 1 N. Diambil 60,0 mL larutan HCl 1 N, kemudian

diencerkan dengan aquadest hingga diperoleh volume akhir 600,0 mL dengan

konsentrasi 0,1 N.

3.4.2 Pencarian Kondisi Analisis Optimum untuk Analisis Asam Valproat dengan

Kromatografi Gas

Untuk mencari kondisi analisis optimum, dibuat larutan induk natrium

divalproat 100 ppm. Dipipet 1,0 mL larutan induk natrium divalproat 10.000 ppm,

dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL dan dicukupkan volumenya dengan

aquadest. Diperoleh larutan natrium divalproat 1000 ppm. Dipipet 1,0 mL larutan

baku natrium divalproat 1000 ppm, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL dan

dicukupkan volumenya dengan aquadest. Diperoleh larutan natrium divalproat

100 ppm. Sebanyak 1,0 μL larutan natrium divalproat 100 ppm disuntikkan pada

kromatografi gas.

3.4.2.1 Pemilihan Laju Alir Gas Pembawa untuk Analisis Asam Valproat secara

Kromatografi Gas

Larutan natrium divalproat konsentrasi 100 ppm disuntikkan sebanyak 1,0

μL pada alat KG dengan kondisi awal laju alir 2,0 mL/menit. Kemudian dilakukan

modifikasi laju alir menjadi 1,0 dan 1,5 mL/menit. Suhu injektor dan detektor

yang digunakan adalah 250°C. Elusi dilakukan dengan suhu kolom terprogram

80°C sampai 100oC dengan kenaikan suhu 5

oC per menit. Setelah itu, suhu kolom

ditahan selama 1 menit lalu dinaikkan sampai 150oC dengan kenaikan suhu 2

oC

per menit. Diperoleh waktu retensi, lalu dihitung faktor ikutan, jumlah pelat

teoritis dan HETP.


25


3.4.2.2 Pemilihan Suhu Awal Kolom untuk Analisis Asam Valproat secara

Kromatografi Gas

Larutan natrium divalproat dengan konsentrasi 100 ppm disuntikkan

sebanyak 1,0 μL pada alat KG dengan kondisi laju alir terpilih. Suhu injektor dan

detektor yang digunakan adalah 250°C. Suhu awal kolom divariasikan menjadi

70°C, 80°C, dan 90°C. Elusi dilakukan dengan suhu kolom terprogram dari suhu

awal sampai 100oC dengan kenaikan suhu 5

oC per menit. Setelah itu, suhu kolom

ditahan selama 1 menit lalu dinaikkan sampai 150oC dengan kenaikan suhu 2

oC

per menit. Diperoleh waktu retensi, lalu dihitung faktor ikutan, jumlah plat teoritis

dan HETP.

3.4.2.3 Pemilihan Pelarut Organik untuk Ekstraksi Asam Valproat dalam Plasma

Ke dalam microtube, dimasukkan 200 μL larutan HCl 0,1 N dan 200 μL

plasma yang mengandung natrium divalproat dengan konsentrasi 100 ppm.

Setelah itu microtube ditutup, dikocok dengan vorteks selama 30 detik hingga

homogen. Kemudian ditambahkan 400 μL pelarut organik ke dalam masing-

masing microtube. Digunakan empat macam pelarut organik dengan polaritas

yang berbeda yaitu metanol, kloroform, dietil eter, dan heksan. Setelah itu

microtube ditutup, dikocok dengan vorteks selama 30 detik hingga homogen, lalu

disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Sebanyak1,0 μL

lapisan organik diambil lalu disuntikkan ke kromatografi gas. Untuk lapisan

organik kloroform, lapisan organik harus diuapkan terlebih dahulu hingga kering

dengan dialiri gas N2, Setelah dingin, residunya dilarutkan dengan 100 μL

metanol. Sebanyak 1,0 μL lapisan metanol kemudian disuntikkan ke dalam

kromatografi gas. Kemudian dihitung luas area asam valproat yang diekstrak dari

masing-masing pelarut organik.

3.4.2.4 Pemilihan Waktu Vorteks untuk Analisis Asam Valproat dalam Plasma



Setelah itu microtube ditutup, divorteks selama 30 detik hingga homogen.

Kemudian ditambahkan 400 μL pelarut organik terpilih. Setelah itu microtube


26


ditutup, dikocok dengan vorteks selama 30, 45, 60, dan 120 detik hingga

homogen, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit.

Sebanyak 1,0 μL lapisan organik diambil lalu disuntikkan ke kromatografi gas.

Kemudian dihitung luas area dari masing-masing waktu vorteks.

3.4.2.5 Pemilihan Waktu Sentrifugasi untuk Analisis Asam Valproat dalam

Plasma


plasma yang mengandung asam valproat dengan konsentrasi 100 ppm. Setelah itu

microtube ditutup, divorteks selama 30 detik hingga homogen. Kemudian

ditambahkan 400 μL larutan organik terpilih. Setelah itu microtube ditutup,

dikocok dengan vorteks selama waktu terpilih hingga homogen, lalu disentrifugasi

dengan kecepatan 3000 rpm selama 5, 10, 15, dan 20 menit. Sebanyak 1,0 μL

lapisan organik diambil lalu disuntikkan ke kromatografi gas. Kemudian dihitung

luas area dari masing-masing waktu sentrifugasi.

3.4.2.6 Uji Kesesuaian Sistem

Larutan standar natrium divalproat dengan konsentrasi 100 ppm

disuntikkan sebanyak 1,0 μL pada alat KG dengan kondisi laju alir dan suhu awal

kolom terpilih. Waktu retensi dicatat, lalu dihitung jumlah pelat teoritis, HETP,

faktor ikutan, dan presisi pada enam kali penyuntikan.

3.4.3 Validasi Metode Analisis Asam Valproat dalam Plasma

3.4.3.1 Penyiapan Sampel Natrium Divalproat dalam Plasma



Setelah itu microtube ditutup, divorteks selama 30 detik hingga homogen.

Kemudian ditambahkan 400 μL dietil eter. Setelah itu microtube ditutup, dikocok

dengan vorteks selama 2 menit hingga homogen, lalu disentrifugasi dengan

kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Sebanyak 1,0 μL lapisan organik diambil

lalu disuntikkan ke kromatografi gas.


27


3.4.3.2 Pengukuran LLOQ

Larutan natrium divalproat dalam plasma disiapkan dengan konsentrasi

30,0; 40,0; 50,0; 60,0; 70,0; 80,0; 90,0 dan 100,0 μg/mL, kemudian diekstraksi

seperti cara penyiapan sampel. Sebanyak 1,0 μL lapisan organik diambil lalu

disuntikkan ke kromatografi gas pada kondisi terpilih. Kemudian dicari

konsentrasi natrium divalproat terendah dalam plasma yang masih dapat dideteksi

oleh instrumen. Kemudian dihitung persentase akurasi (% diff) dan koefisien

variasi (KV) dari konsentrasi tersebut.

3.4.3.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas dalam Plasma In Vitro

Sampel blanko serta larutan natrium divalproat dalam plasma dengan

konsentrasi 40,0; 50,0; 60,0; 70,0; 80,0; 90,0 dan 100,0 μg/mL disiapkan,

kemudian diekstraksi seperti pada cara penyiapan sampel. Sebanyak 1,0 μL

lapisan organik dari masing-masing larutan tersebut disuntikkan ke alat

kromatografi gas pada kondisi terpilih.

3.4.3.4 Uji Akurasi

Larutan natrium divalproat dalam plasma dengan konsentrasi rendah (40,0

μg/mL), sedang (60,0 μg/mL), dan tinggi (80,0 μg/mL) disiapkan, lalu diekstraksi

seperti pada cara penyiapan sampel. Sebanyak 1,0 μL lapisan organik dari

masing-masing larutan tersebut disuntikkan ke alat kromatografi gas pada kondisi

terpilih, diulangi sebanyak 5 kali untuk masing-masing konsentrasi. Akurasi

dihitung sebagai perbedaan nilai terukur dengan nilai yang sebenarnya (% diff)

3.4.3.4 Uji Presisi





terpilih, diulangi sebanyak 5 kali untuk masing-masing konsentrasi. Presisi


28


dihitung sebagai nilai simpangan baku relatif atau koefisien variasi dari masing-

masing konsentrasi.

3.4.3.5 Uji Perolehan Kembali (% recovery)





terpilih, diulangi sebanyak 5 kali untuk masing-masing konsentrasi. Dihitung %

perolehan kembali relatif.

3.4.3.6 Uji Selektivitas Metode Analisis dalam Plasma

Larutan natrium divalproat dalam plasma dengan konsentrasi LLOQ (40,0

μg/mL) disiapkan, setelah itu diekstraksi seperti pada penyiapan sampel.

Sebanyak 1,0 μL lapisan organik dari masing-masing larutan tersebut disuntikkan

ke alat kromatografi gas pada kondisi terpilih. Diuji terhadap plasma yang berasal

dari enam sumber yang berbeda. Dihitung nilai akurasinya (% diff).



BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Pencarian Kondisi Analisis Optimum untuk Analisis Asam Valproat dengan

Kromatografi Gas

4.1.1 Pemilihan Laju Alir Gas Pembawa untuk Analisis Asam Valproat dengan

Kromatografi Gas

Kondisi analisis optimum untuk penetapan kadar asam valproat dalam

plasma adalah dengan laju alir gas pembawa 1,0 ml/menit. Suhu injektor dan

detektor diatur pada suhu 250ºC. Berdasarkan literatur, laju alir gas pembawa

yang digunakan sebesar 20 ml/menit. Namun, dalam penelitian ini digunakan

variasi laju alir gas pembawa, yaitu 1,0 ml/menit, 1,5 ml/menit, dan 2,0 ml/menit.

Pertimbangan variasi laju alir gas pembawa adalah diameter kolom yang

digunakan. Penelitian ini menggunakan kolom kapiler yang memiliki diameter

kecil sehingga laju alir yang digunakan memiliki rentang antara 0,2– 2 ml/menit.

Untuk semua elusi, suhu injektor dan detektor diatur pada suhu 250ºC.

Pertimbangan penetapan suhu injektor adalah suhu injektor harus diatur lebih

tinggi daripada suhu kolom maksimum. Jadi seluruh sampel akan menguap segera

setelah sampel disuntikkan sedangkan pertimbangan suhu detektor adalah

biasanya suhu detektor 15º–30ºC lebih tinggi dari titik didih senyawa yang

dianalisis. Selain itu, suhu detektor disesuaikan dengan detektor yang digunakan.

Untuk detektor ionisasi nyala, suhu detektor harus di atas 100ºC. Hal ini bertujuan

untuk mencegah terjadinya kondensasi uap air sehingga mengakibatkan

pengkaratan pada detektor ionisasi nyala atau penghilangan (penurunan)

sensitivitasnya (Gandjar & Rohman, 2007).

Kondisi optimum terpilih adalah yang memberikan nilai lempeng teoritis

(N) besar, ukuran efisiensi kolom (HETP) kecil, faktor ikutan (Tf) yang mendekati

satu, waktu retensi yang tidak terlalu lama, serta pada kromatogram plasma

blanko tidak ada puncak yang mengganggu pada waktu retensi asam valproat.

Pada laju alir 1,0 ml/menit diperoleh waktu retensi 24,1 menit dengan nilai N rata-


30


rata 13442,8; HETP rata-rata 0,0372 dan Tf masing-masing 1,055; 1,263; dan

0,857. Kemudian pada laju alir 1,5 ml/menit diperoleh waktu retensi 20,9 menit

dengan nilai N rata-rata 105481,4; HETP rata-rata 0,0474 dan Tf masing-masing

0,952; 1,509; dan 1,977. Selanjutnya, pada laju alir 2,0 ml/menit diperoleh waktu

retensi 18,9 menit dengan nilai N rata-rata 13442,8; HETP rata-rata 0,0372 dan Tf

masing-masing 1,055; 1,263; dan 0,857. Dari ketiga kondisi tersebut, dipilih laju

alir sebesar 1,0 ml/ menit karena memberikan nilai N terbesar dan HETP terkecil.

Data dan gambar selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.1, Gambar 4.2, Gambar

4.3, dan Gambar 4.4.

4.1.2 Pemilihan Suhu Awal Kolom untuk Analisis Asam Valproat secara

Kromatografi Gas.

Kondisi analisis optimum untuk penetapan kadar asam valproat dalam

plasma adalah dengan laju alir gas pembawa 1,0 ml/menit. Suhu injektor dan

detektor diatur pada suhu 250ºC. Elusi dilakukan pada suhu awal kolom 70oC

dengan kenaikan suhu 5oC per menit sampai suhu 100

oC dan ditahan selama 1

menit. Setelah itu suhu dinaikkan sampai 150 o

C dengan kenaikan suhu 2oC per

menit.

Berdasarkan literatur, suhu awal kolom yang digunakan adalah 80ºC.

Dalam penelitian ini, suhu awal kolom divariasikan menjadi 70ºC, 80ºC, dan

90ºC. Berdasarkan data pada tabel 4.2 dapat dilihat bahwa suhu awal kolom 70ºC

diperoleh nilai N terbesar dan HETP terkecil dibanding kedua kondisi lainnya.

Oleh karena itu, dapat disimpulkan kondisi analisis terpilih untuk analisis asam

valproat dalam plasma adalah elusi dengan suhu terprogram dimulai dari suhu

70ºC dengan kenaikan suhu 5ºC/menit sampai 100ºC, kemudian ditahan selama 1

menit. Setelah itu suhu dinaikkan sampai 150ºC dengan kenaikan 2ºC/menit. Data

dan gambar selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.2, Gambar 4.2, Gambar 4.5,

dan Gambar 4.6.

4.1.3 Pemilihan Pelarut Organik untuk Ekstraksi Asam Valproat dalam Plasma

Untuk memperoleh asam valproat dari plasma lebih optimal dicobakan

empat jenis pelarut organik pada saat ekstraksi, yaitu metanol, kloroform, dietil


31


eter, dan heksan. Pada saat ekstraksi dengan menggunakan metanol dan kloroform

ternyata asam valproat tidak dapat terekstraksi ke dalam pelarut organik tersebut.

Pada saat ekstraksi dengan menggunakan dietil eter, luas area rata-rata yang

diperoleh sebesar 20636,1. Pada saat ekstraksi dengan menggunakan heksan, luas

area rata-rata yang diperoleh sebesar 9704,2.

Sampel natrium divalproat dalam plasma sebelum disuntikkan ke alat

kromatografi gas harus diekstraksi terlebih dahulu untuk membebaskan ikatannya

dengan protein. Untuk memperoleh metode ekstraksi yang paling optimal,

dicobakan metode pengendapan protein menggunakan metanol dan metode

ekstraksi cair-cair dengan pelarut koroform, heksan, dan dietil eter. Setelah

dianalisis dengan menggunakan kromatografi gas, ternyata metanol dan kloroform

tidak dapat digunakan untuk ekstraksi natrium divalproat dalam plasma, yang

dapat digunakan adalah heksan dan dietil eter. Kemudian dari kedua pelarut

tersebut dibandingkan luas area yang terbentuk pada kromatogram. Karena luas

area natrium divalproat yang diekstraksi dengan dietil eter lebih besar dari luas

area yang diekstraksi dengan heksan, maka dalam penelitian ini, metode yang

akan digunakan untuk mengekstraksi natrium divalproat dalam plasma adalah

ekstraksi cair-cair dengan dietil eter. Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel

4.3. Kromatogram dari masing-masing larutan pengekstraksi dapat dilihat pada

Gambar 4.7, Gambar 4.8, Gambar 4.9, dan Gambar 4.10.

4.1.4 Pemilihan Waktu Vorteks untuk Analisis Asam Valproat dalam Plasma

Untuk memperoleh natrium divalproat dari plasma lebih optimal dicobakan

empat kondisi waktu vorteks yaitu selama 30, 45, 60, dan 120 detik. Pada waktu

vorteks selama 30 detik diperoleh luas area rata-rata sebesar 8059,8. Pada waktu



vorteks selama 120 detik diperoleh luas area rata-rata sebesar 24472,6. Dari hasil

percobaan dipilih waktu vorteks selama 120 detik karena pada kondisi ini

diperoleh nilai luas area rata-rata paling besar. Data luas area rata-rata dari

natrium divalproat pada berbagai kondisi waktu vorteks dapat dilihat pada Tabel

4.4 dan Gambar 4.11


32


4.1.5 Pemilihan Waktu Sentrifugasi untuk Analisis Asam Valproat dalam Plasma

Untuk memperoleh asam valproat dari plasma secara optimal dicobakan

empat kondisi waktu sentrifugasi yaitu selama 5, 10, 15, dan 20 menit. Pada

sentrifugasi selama 5 menit diperoleh nilai luas area rata-rata sebesar 8492,2. Pada

sentrifugasi selama 10 menit diperoleh nilai luas area rata-rata sebesar 14692,2.

Pada sentrifugasi selama 15 menit diperoleh nilai luas area rata-rata sebesar

25326,9. Pada sentrifugasi selama 20 menit diperoleh nilai luas area rata-rata

sebesar 14692,2. Dari hasil percobaan dipilih waktu sentrifugasi selama 15 menit

karena pada kondisi ini diperoleh nilai luas area rata-rata paling besar. Data luas

area rata-rata dari asam valproat pada berbagai kondisi waktu sentrifugasi dapat

dilihat pada Tabel 4.5 dan Gambar 4.12.

4.2 Validasi Metode Analisis Asam Valproat dalam Plasma In Vitro

4.2.1 Pengukuran LLOQ

Berdasarkan literatur, diperoleh rentang konsentrasi natrium divalproat

dalam plasma adalah 40,0-90,0 μg/mL (Winter, et al., 2007). Oleh karena itu,

dibuat kurva kalibrasi untuk menentukan LLOQ dengan rentang konsentrasi 30,0;

40,0; 50,0; 60,0; 70,0; 80,0; 90,0 dan 100,0 μg/mL. Karena pada konsentrasi 30,0

μg/mL instrumen sudah tidak memberikan respons, maka konsentrasi 40,0 μg/mL

ditetapkan sebagai konsentrasi LLOQ, yaitu konsentrasi terendah analit dalam

sampel yang dapat ditentukan secara kuantitatif dan masih memenuhi syarat

akurasi dan presisi, dimana nilai % diff pada lima kali penyuntikan tidak lebih dari

±20% (Food and Drug Administration, 2001). Setelah dicoba lima kali

penyuntikan, didapatkan hasil nilai % diff tidak ada yang menyimpang lebih dari

+20% atau kurang dari -20%, maka ditetapkan nilai LLOQ adalah sebesar 40,0

μg/mL. Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.8.

4.2.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Valproat dalam Plasma

Setelah diperoleh nilai LLOQ, dibuat kurva kalibrasi dan uji linearitas

dengan menghitung koefisien korelasi dari kurva kalibrasi, dengan rentang

konsentrasi lebih kurang 40,0-100,0 μg/mL, di mana nilai LLOQ harus menjadi


33


konsentrasi terendah dari kurva kalibrasi. Pada pembuatan kurva kalibrasi

disuntikkan plasma blanko (plasma tanpa penambahan natrium divalproat) dan

tujuh larutan natrium divalproat dalam plasma dengan konsentrasi 40,0; 50,0;

60,0; 70,0; 80,0; 90,0 dan100,0 μg/mL.

Dari hasil analisis diperoleh persamaan regresi linear y = 459,7 x -18964

dengan koefisien korelasi r = 0,9894, di mana kriteria linearitas untuk sediaan

dalam matriks biologis adalah r = 0,98 (Alizadeh, Mohammadi, & Shahdousti,

2007). Maka dapat disimpulkan bahwa metode analisis natrium divalproat dalam

plasma dengan rentang konsentrasi 40,0-100,0 μg/mL memenuhi kriteria uji

linearitas. Data dan gambar kurva kalibrasi natrium divalproat dalam plasma dapat

dilihat pada Tabel 4.7 dan Gambar 4.13.

4.2.3 Uji Selektivitas

Pada uji selektivitas, dilakukan analisis terhadap enam plasma dari sumber

yang berbeda pada konsentrasi LLOQ yaitu 40,0 μg/mL. Dari hasil analisis, yang

diperoleh, dihitung nilai KV kurang dari 20% , yaitu 11,57% dan % diff tidak

menyimpang lebih dari +20% atau kurang dari -20%, yaitu dalam kisaran 9,53%

sampai 13,79%, serta tidak ada puncak pengganggu pada waktu retensi asam

valproat. Maka dapat disimpulkan bahwa metode analisis yang digunakan adalah

selektif. Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.9.

4.2.4 Uji Akurasi

Pada uji akurasi, dilakukan analisis terhadap tiga rentang konsentrasi yang

disebut sebagai Quality control sample (QC), yaitu konsentrasi rendah (40,0

μg/mL), sedang (60,0 μg/mL), dan tinggi (80,0 μg/mL). Uji yang dilakukan

adalah hanya mencakup uji intra-day karena keterbatasan waktu. Hasil dari uji

akurasi adalah konsentrasi rendah (40,0 μg/mL) memberikan nilai % diff 8,06

sampai 12,33%, konsentrasi sedang (60,0 μg/mL) memberikan nilai % diff -11,63

sampai -9,95%, dan konsentrasi tinggi (80,0 μg/mL) memberikan nilai % diff -

13,67 sampai 9,41%. Nilai % diff yang diperoleh tidak menyimpang kurang dari -

15% atau lebih dari +15% untuk masing-masing konsentrasi.


34


Dari hasil pengujian akurasi yang telah dilakukan untuk analisis asam

valproat dalam plasma sudah memenuhi kriteria yang dipersyaratkan. Data hasil

uji akurasi asam valproat dalam plasma dapat dilihat pada Tabel 4.10.

4.2.5 Uji Presisi

Pada uji presisi asam valproat dalam plasma, konsentrasi rendah (40,0

μg/mL) memberikan nilai koefisien variasi (KV) 10,49 %, konsentrasi sedang

(60,0 μg/mL) memberikan nilai KV 13,92 %, konsentrasi tinggi (80,0 μg/mL)

memberikan nilai KV 9,33 %, pada. Dari hasil percobaan uji presisi yang telah

dilakukan untuk analisis natrium divalproat dalam plasma sudah memenuhi

kriteria yang dipersyaratkan karena diperoleh nilai KV kurang dari 15% untuk

masing-masing konsentrasi. Data hasil uji presisi asam valproat dalam plasma

dapat dilihat pada Tabel 4.11.

4.2.6 Uji Perolehan Kembali (% recovery)

Pada penelitian ini dilakukan uji perolehan kembali relative (% relative

recovery). Berdasarkan perhitungan dari hasil penelitian, diperoleh % recovery

sebesar 108,06 sampai 112,32% untuk konsentrasi rendah, 81,91 sampai 103,17%

untuk konsentrasi sedang, dan 86,97 sampai 101,65% untuk konsentrasi tinggi.

Berdasarkan hasil percobaan, diperoleh nilai persen perolehan kembali seluruhnya

berada dalam rentang yang dipersyaratkan, yaitu sebesar 80-120%. Data hasil uji

perolehan kembali dapat dilihat pada Tabel 4.11.

Berdasarkan jurnal yang menjadi acuan penulis dalam mengembangkan

metode analisis, rentang kalibrasi linier diperoleh pada konsentrasi 2,5-6400

μg/mL (Bigdeli, Falahat-Pisheh, & Neyestani, 2007). Berdasarkan hasil penelitian

yang dilakukan penulis, dapat dilihat bahwa validasi metode yang dilakukan

memberikan rentang kalibrasi yang linier pada konsentrasi 40,0-100,0 μg/mL dan

nilai LLOQ yang diperoleh sebesar 40,0 μg/mL. Rentang kalibrasi linier yang

diperoleh dari jurnal acuan emang lebih sensitif dibanding metode ekstraksi cair-

cair yang dikembangkan oleh penulis, namun metode yang dikembangkan oleh

penulis ini masih valid untuk digunakan karena rentang asam valproat d

Documents

UNIVERSITAS INDONESIA OPTIMASI METODE ANALISIS ...lib.ui.ac.id/file?file=digital/2016-7/20181175-S33125-Ani...diff) dari metode ini -13,67% sampai 12,33% dengan presisi (KV) antara