UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO ZA FARMACIJO KAJA ROŽMAN NAČRTOVANJE, SINTEZA IN VREDNOTENJE DERIVATOV GVANIDINA ... Pharmacy in Ljubljana by virtual screening of the

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

KAJA ROŽMAN

MAGISTRSKA NALOGA

ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE

Ljubljana, 2014

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

KAJA ROŽMAN

NAČRTOVANJE, SINTEZA IN VREDNOTENJE DERIVATOV GVANIDINA

KOT ANTAGONISTOV TOLL-U PODOBNEGA RECEPTORJA 4

DESIGN, SYNTHESIS AND EVALUATION OF GUANIDINE DERIVATIVES AS

ANTAGONISTS OF TOLL LIKE RECEPTOR 4

Ljubljana, 2014

Magistrsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo pod mentorstvom doc. dr.

Mateja Sove, mag. farm.

Spektroskopske meritve, kromatografske metode in določanje tališča smo izvajali na

Fakulteti za farmacijo in na Inštitutu Jožef Stefan (Center za masno spektroskopijo).

Biološka testiranja spojin so bila opravljena na Zavodu za transfuzijsko medicino v

Ljubljani.

Zahvala

Zahvalo namenjam vsem strokovnim sodelavcem, ki so kakorkoli prispevali k nastanku

magistrske naloge. Predvsem pa se zahvaljujem mentorju doc. dr. Mateju Sovi mag. farm.

za ogromno predanega znanja, moralne podpore ter nesebične pomoči v vsakem trenutku.

S svojim pozitivnim odnosom mi je vedno znova vzbudil veselje do dela. Iskrena hvala

tudi vsem bližnjim, ki so mi stali ob strani tekom študija in mi pomagali ustvariti najlepše

spomine.

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom doc. dr.

Mateja Sove, mag. farm.

Ljubljana, 2014 Kaja Rožman

Predsednik komisije: prof. dr. Samo Kreft, mag. farm.

Članica komisije: doc. dr. Nataša Karas Kuželički, mag. farm.

Kaja Rožman – Načrtovanje, sinteza in vrednotenje derivatov gvanidina kot antagonistov toll-u podobnega receptorja 4

Vsebina

Slikovno kazalo ...................................................................................................................... I

Povzetek ................................................................................................................................II

Abstract ................................................................................................................................ III

Seznam okrajšav .................................................................................................................. IV

1. Uvod ................................................................................................................................. 1

1.1. Imunski odziv ......................................................................................................... 1

1.2. Sepsa ....................................................................................................................... 3

1.3. Toll-u podobni receptorji ........................................................................................ 4

1.4. TLR4 in njegova vloga pri obrambi telesa ............................................................. 6

1.5. Potencialne terapevtske tarče v sistemu LPS/TLR4 in razvoj učinkovin ............... 8

1.5.1. Možnosti zaviranja signaliziranja brez vpliva na TLR4 .................................. 8

1.5.1.1. Učinkovina cilja CD14. ............................................................................ 9

1.5.1.2. Učinkovina cilja LBP. .............................................................................. 9

1.5.1.3. Učinkovina je lahko LPS ligand. .............................................................. 9

1.5.1.4. Učinkovina vpliva na sintezo vnetnih mediatorjev ................................. 10

1.5.2. Možnosti zaviranja signalizacije z vplivom na TLR4 .................................... 10

1.5.2.1. Monoklonsko protitelo proti TLR4. ........................................................ 11

1.5.2.2. Učinkovina cilja MD-2 ali [TLR4:MD-2] kompleks. ............................. 11

1.5.2.3. Učinkovina, ki se neposredno veže na TLR4 ali MD-2. ......................... 13

2. Namen dela ................................................................................................................... 15

3. Materiali, laboratorijska oprema in metode ................................................................. 16

3.1. Materiali ................................................................................................................ 16

3.2. Laboratorijska oprema .......................................................................................... 17

3.3. Metode .................................................................................................................. 17

3.3.1. Kromatografske metode ................................................................................. 17

3.3.1.1. Tankoplastna kromatografija (TPK) ...................................................... 17

3.3.1.2. Kolonska kromatografija........................................................................ 17

3.3.1.3. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) ........................... 18

3.3.2. Spektroskopske metode .................................................................................. 18

3.3.2.1. Jedrska magnetna resonanca (NMR) ..................................................... 18

3.3.2.2. Masna spektroskopija ............................................................................. 19


3.3.3. Določanje temperature tališča ...................................................................... 19

3.3.4. Risanje in poimenovanje struktur spojin ter iskanje sinteznih postopkov ..... 19

3.3.5. Študije topnosti, citotoksičnosti in antagonistične aktivnosti ........................ 19

4. Eksperimentalni del ...................................................................................................... 20

4.1. Sinteza spojine 1 – [(2-aminopirimidin-5-il)(4-nitrofenil)metanol] ..................... 21

4.2. Sinteza spojine 5 – [1-(4-fluorofenil)-3-(pirimidin-2-il)gvanidin] ....................... 22

4.3. Sinteza spojine 9 – [1-(4-fluorofenil)-3-Boc-2-(pirimidin-2-il)gvanidin] ............ 26

4.4. Sinteza spojin 12a-g - [derivati gvanidina] ........................................................... 29

4.5. Čiščenje končnih spojin in priprava na biološka testiranja ................................... 38

5. Rezultati in razprava..................................................................................................... 39

5.1. Razlaga sinteznih postopkov ................................................................................ 39

5.2. Rezultati bioloških testiranj .................................................................................. 46

6. Sklep ............................................................................................................................. 48

7. Literatura ...................................................................................................................... 49


I

Slikovno kazalo

Slika 1: Prikaz poteka signalizacije preko TLR4 ob vezavi agonista (heksa aciliran lipid A)

in antagonista (manj aciliran lipid A) [11]. .......................................................................... 7

Slika 2: Strukturna formula TAK-242 [povzeto po 28].. ..................................................... 10

Slika 3: Strukturni prikaz lipida A, lipida IVa in eritorana [31]. ....................................... 12

Slika 4: Strukturna formula ß-aminoalkoholnih derivatov [32]. ........................................ 13

Slika 5: Strukturna formula paklitaksela [33]. .................................................................... 13

Slika 6: Strukturna formula spojine zadetka (spojina A) z IC50 16,6 μM [20].. .................. 14

Slika 7: Veriga A Toll-u podobnega receptorja 4 in mehanizem delovanja gvanidinskih

derivatov pri preprečevanju vezave MD-2. (A) Predvideno vezavno mesto gvanidinskih

derivatov na TLR4. (B) [povzeto po 20]. ............................................................................. 14

Slika 8: Shema neuspelih sinteznih poti. ............................................................................. 39

Slika 9: Mehanizem reakcije Grignardovih reagentov s ketoni (R',R≠H) in aldehidi (R ali

R'=H) [povzeto po 37 in 38]. .............................................................................................. 40

Slika 10: Shema sintezne poti derivatov gvanidina kot antagonistov TLR4........................ 42

Slika 11: Mehanizem nastanka Vilsmeierjevega reagenta. [povzeto po 36 in 46].............. 43

Slika 12: Mehanizem reakcije nastanka 3-formilkromona, produkta 1. stopnje sinteze

[povzeto po 36]. ................................................................................................................... 43

Slika 13: Mehanizem 2. stopnje sinteze gvanidinskih derivatov – reakcija cianogvanidina

in 3-formilkromona. [povzeto po 36, 47 in 48]. .................................................................. 44

Slika 14: Mehanizem delovanja TMS-Cl in nukleofilna adicija v tretji stopnji sinteznega

postopka. [povzeto po 44]. .................................................................................................. 44


II

Povzetek

Toll-u podoben receptor 4 (TLR4) že vrsto let povezujejo s pojavom sepse, povzročene z

vdorom Gram negativnih bakterij v človeško kri. Bolezen se v veliki meri pojavlja pri

hospitaliziranih bolnikih, smrtnost zanjo pa je izredno visoka. Pri tem se poraja dosti

vprašanj o načinu ter ustreznosti zdravljenja. Vse to je razlog za veliko povpraševanje po

zdravilih za preprečevanje ali zdravljenje sepse, a kljub številnim raziskavam na tem

področju, na tržišču še ni registriranega specifičnega zdravila. Antagonisti TLR4

predstavljajo velik potencial pri iskanju novih zdravil pri zdravljenju sepse. Toll-u podobni

receptorji 4 igrajo pomembno vlogo v prirojenem imunskem sistemu, hkrati pa v manjši

meri vplivajo tudi na pridobljeni imunski odziv posameznika. Gre za najbolj poznan in

opisan transmembranski receptor iz skupine TLR. Značilno prepoznava molekulske vzorce

povezane s patogeni, najpomembnejše pa je njegovo prepoznavanje lipopolisaharida, ki je

glavna sestavina celične membrane Gram negativnih bakterij.

V okviru magistrske naloge smo načrtovali sintezno pot za derivate spojine z dokazanim

antagonističnim delovanjem na TLR4, ki je bila odkrita na Fakulteti za farmacijo v

Ljubljani s pomočjo virtualnega rešetanja knjižnice spojin. Preizkusili smo več različnih

sinteznih poti za pripravo gvanidinskih derivatov. Za najuspešnejšo pa se je izkazala

tristopenjska sinteza, ki smo jo uporabili pri sintezi štirih končnih spojin. Sintetiziranim

spojinam smo določili topnost v celičnem mediju, citotoksičnost na celični liniji HEK 293

ter ovrednotili antagonistično delovanje na celicah s selektivno izraženim TLR4. Izmed

testiranih končnih spojin je ena izkazovala precej obetajoče antagonistično delovanje z

določeno vrednostjo srednje inhibitorne koncentracije 27 μM. Za dodatne informacije o

odnosu med strukturo in delovanjem spojin pa bi bilo potrebno sintetizirati še nekaj več

derivatov.

Ključne besede

Toll-u podobni receptorji; Toll-u podoben receptor 4; antagonisti TLR4; derivati gvanidina;

sepsa.


III

Abstract

For many years Toll-like receptor 4 has been associated with the occurrence of sepsis,

caused by intrusion of Gram negative bacteria into the human blood. The disease largely

occurs in hospitalized patients and its mortality rate is extremely high, therefore it raises a

lot of questions about methods and adequacy of the treatment. This is the reason for the

high demand for medicinal products with the purpose of treatment or prevention of sepsis.

However, despite numerous research in this area, a specific product has not been registered

on the market. TLR4 antagonists present high potencial for the development of novel

agents against sepsis. These receptors play an important role in the innate immune system

and to a lesser extent also affect the adaptive immune response of an individual. TLR4 is

well-known and described transmembrane receptor in the TLR group. It typically

recognizes molecular patterns associated with pathogens, however, the most important is

the recognition of lipopolysaccharide, which is a major component of the cell membrane of

Gram negative bacteria.

The aim of our master's thesis was to design the synthetic pathway for derivatives of a hit

compound with proven antagonism of TLR4, which was discovered at the Faculty of

Pharmacy in Ljubljana by virtual screening of the compound library. We examined several

synthetic routes and finally discovered the three-stage synthesis of guanidine derivatives.

Four final compounds were synthesized and evaluated. We have determined the solubility

of compounds in the cell medium, the cytotoxicity in HEK 293 cell line and evaluated the

antagonist activity of final compounds on cells which selectively express TLR4. Half

maximal inhibitory concentration (IC50) of 27 μM has been determined for one of the final

compounds, which shows promising antagonistic activity. However, it would be necessary

to synthesize more derivates to obtain additional informations about structure-activity

relationship.

Key words

Toll-like receptors; Toll-like receptor 4; TLR4 antagonists; guanidine derivatives; sepsis.


IV

Seznam okrajšav

ALR

Ar-H

Asp

BTC

DC

CDCl3

CD14

CLR

Cys-747

DAMP

DMF

DMSO(-d6)

DNK

GTS-21

HEK 293

HMGB1

hsp

IC50

IFN

IκB

IL

IL-1R

LBP

LL37

LPS

LRR

MAP

mCD14

MD-2

MF

MyD88

AIM2-podobni receptorji (angl. AIM2-like receptors)

aromatski vodikov atom

asparaginska kislina (omenjeni sta Asp na mestu 234 in 209)

bis(triklorometil) karbonat, trivialno ime – trifosgen

dendritične celice (angl. dendritic cells; omenjene so konvencionalne (cDC) in

plazmocitne (pDC))

devteriran kloroform

diferenciacijski faktor 14 (angl. cluster of differentiation 14)

receptorji lektina tipa C (angl. C-type lectin receptors)

cisteinski ostanek na mestu 747

molekulski vzorci povezani z nevarnostjo (angl. danger associated molecuar

patterns)

dimetilformamid

(devterirani) dimetilsulfoksid

deoksiribonukleinska kislina

učinkovina, ki deluje kot delni agonist na nikotinske acetilholinske receptorje

celična linija človeških zarodnih jetrnih celic (angl. human embryonic kidney

cells 293)

skupina visokomobilnih beljakovin B1(angl. high-mobility group protein B1)

proteini temperaturnega šoka (omenjena hsp60 in hsp70)

koncentracija učinkovine, ki povzroči polovično inhibicijo

interferon

inhibitor kinaze kapa B (angl. inhibitor of κ B)

interlevkin (omenjeni so interlevkin 1 (IL-1), 1ß (IL-1ß), 6(IL-6) ter 18(IL-18))

receptor za interlevkin 1

protein, ki veže lipopolisaharide (angl. LPS binding protein)

humani peptid iz 37 aminokislinskih ostankov iz skupine catelicidinov

lipopolisaharid

ekstracelularna domena bogata z levcinom (angl. Leucine rich repeat)

kinaze aktivirane z mitogenom (angl. mitogen-activated protein kinases)

netopna oblika CD14 (angl. membrane-bound CD14)

mieloidni diferenciacijski protein 2 (angl. myeloid diferentiation 2) ali limfocitni

antigen (Ag) 96

mobilna faza

mieloidni diferenciacijski protein 88 (angl. myeloid diferentiation primary


V

MP

MTS

NBS

NF-κB

NI-0101

NLR

NMR

NOD2

PAMP

PI3K

ppm

PRR

Rab11a

Rf

RLR

RNK

SAR

Ser-211

SOCS1

SPR

TAK-242

TFA

TFAA

THF

TIR

TIRAP

TPK

TLR

TMEDA

TMS-Cl

TNF α

response gene 88)

sestavine manoproteinov (angl. mannoprotein constituents)

tetrazolijevo barvilo za določevanje viabilnosti celic

jedrni faktor kapa B

N-bromosukcinimid

monoklonsko protitelo proti TLR4

NOD-podobni receptorji (angl. NOD-like receptors)

jedrna magnetna resonanca (angl. nuclear magnetic resonance)

oligomerizacijska domena, ki vsebuje protein 2 in veže nukleotide (angl.

nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2)

molekulski vzorci povezani s patogenom (angl. pathogen associated molecular

patterns)

fosfatidilinozitol-3-kinaza (angl. phosphatidylinositide 3-kinase)

število delcev na milijon (angl. parts per million)

receptorji, ki prepoznavajo molekulske vzorce (PAMP ali DAMP) (angl. Pattern

recognition receptor)

Ras-u soroden protein Rab11a, ki se nahaja v možganih (angl. Ras-related brain

protein Rab11a)

retencijski faktor

RIG-I podobni receptorji (angl. RIG-I like receptors)

ribonukleinska kislina

odnos med strukturo in delovanjem spojine (angl. structure-activity relationship)

serinski ostanek na mestu 211

supresor citokinske signalizacije 1 (angl. suppressor of cytokine signaling 1)

površinska plazmonska resonanca (angl. surface plasmon resonance)

resatorvid

trifluorocetna kislina (angl. trifluoroacetic acid)

trifluoracetanhidrid

tetrahidrofuran

Toll/IL-1 receptor (angl. Toll/interleukin-1 receptor)

adaptorski protein podoben MyD88 (angl. TIR-domain-containing adaptor

protein)

tankoplastna kromatografija (angl. thin layer chromatography)

Toll-u podobni receptor (angl. Toll like receptor)

tetrametiletilendiamin

tetrametilsilil klorid

dejavnik tumorske nekroze alfa


VI

TOLLIP

tR

TRAM

TRIF

protein, ki interagira s Toll-om (angl. Toll interacting protein)

retencijski čas [min]

adaptorski protein soroden TRIF (angl. TRIF-related adaptor molecule)

adaptorski protein, ki vsebuje domeno TIR (angl. TIR-domain-containing

adaptor protein inducing IFN-ß)


1

1. Uvod

1.1. Imunski odziv

V naravi smo stalno izpostavljeni številnim mikroorganizmom, ki z vdorom v naše telo

povzročijo porušenje homeostaze. Ta predstavlja normalno fiziološko stanje organizma, ki

ga je potrebno stalno vzdrževati oziroma ob vdoru tujka ponovno vzpostaviti, za kar pa

skrbi imunski sistem. Poznamo naraven (prirojen) in specifičen (pridobljen) imunski

odgovor. Oba sta kritična za preživetje v naravi [1, 2].

Imunski sistem igra pomembno vlogo pri odstranjevanju številnih patogenih organizmov,

kot so virusi, bakterije, glive in paraziti pri sesalcih. Pridobljen imunski odziv na mikrobe

deluje preko sproščanja protiteles iz limfocitov B in sproščanja limfocitov T (T-celično

prepoznavanje antigenov preko T-celičnih receptorjev), ter tako povzroči dosmrten

imunološki spomin. Pravimo mu tudi specifičen imunski odgovor, saj se ob ponovnem

stiku z antigenom aktivirajo spominske celice, ki tega prepoznajo ter povzročijo sprostitev

specifičnih protiteles proti temu antigenu. Proces zagotovitve zadostnega imunskega

odgovora lahko traja tudi več mesecev. Po drugi strani pa prirojen imunski odziv

omogoča takojšen odgovor na vdor mikrobov in je zato prva linija obrambe. V sistemu

sodelujejo makrofagi in dendritične celice, ki sproščajo provnetne citokine in dušikov

monoksid. Prirojena imunost je primorana prepoznati skrbno skrite molekulske vzorce

patogenosti v lipopeptidih, DNK, RNK, specifičnih proteinih in LPS. Tem vzorcem

pravimo PAMP (pathogen-associated molecular patterns) in so torej mikrobne narave.

Enak odziv sprožijo tudi alarmini. To so molekularni vzorci, ki so nastali zaradi poškodb

ali stresne obremenitve celice in jih drugače imenujemo tudi DAMP (damage-associated

molecular patterns). Mednje uvrščamo endogene komponente, kot so nukleinske kisline,

histoni, kristali sečne kisline, ATP, citokrom c, S100 molekule in HMGB1 [1-7].

Te vzorce prepoznajo specifični receptorji, ki so namenjeni prepoznavi patogenih vzorcev,

imenovani PRR (pattern recognition receptor). Sprva so jih uvrščali v sistem prirojenega

imunskega odziva, šele po opisu Toll receptorjev pri vinski mušici leta 1996 pa so dokazali,

da njihova aktivacija povzroči indukcijo provnetnih citokinov in kostimulatornih molekul,

kar je značilnost pridobljenega imunskega odziva. Izražajo jih prirojene imunske celice in

so pomembni za potek tako prirojenega kot pridobljenega imunskega sistema ter povezavo


2

med obema. S tem se sproži prirojeni imunski odgovor na tujek, pri čemer poteče kaskada

signalnih poti, ki izvršijo prvo linijo gostiteljskega obrambnega odgovora, nujnega za

uničenje infekcijskih mikrobov. Poleg tega PRR signalizacija istočasno inducira zorenje

dendritičnih celic, ki pa so odgovorne za opozorilno indukcijo druge linije obrambe, ki ji

pravimo pridobljena imunost. Razlikujemo več družin PRR, citosolne AIM2 podobne

receptorje (ALR), RIG-1 podobne receptorje (RLR) in NOD-u podobne receptorje (NLR),

transmembranske receptorje lektina tipa C (CLR) ter Toll-u podobne receptorje (TLR). V

večini primerov prepoznava ligandov povzroči sprostitev provnetnih citokinov, kemokinov

in protivirusnih molekul, le v primeru ALR in NLR pride do nastanka multiproteinskih

vnetnih kompleksov, ki razkrijejo in aktivirajo kaspazo-1. Ta inducira razvoj in sproščanje

IL-1ß in IL-18, za nadaljnji provnetni odgovor. ALR, RLR in izjemoma še TLR3 značilno

sodelujejo pri prepoznavi virusne DNK, NLR pri večini bakterijskih sevov, CLR pri

obrambi pred glivami in TLR pri večini Gram negativnih bakterijah. En sam patogen lahko

aktivira več različnih PRR in sproži kombiniran odgovor, ki je uspešnejši pri odstranitvi

tujka, hkrati pa lahko tak odgovor prepreči pretiran imunski odziv, ki se kaže v obliki

vnetnih in avtoimunih bolezni [5, 6, 8-10].

Bakterije razvrščamo v dve skupini glede na njihovo obarvanje po Gramovi metodi.

Drugačno obarvanje pa je posledica različne sestave membrane. Gram pozitivne

bakterije imajo večplastno mrežasto prepleten polimer peptidoglikan, ki obkroža

plazemsko membrano. Medtem ko je zunanja membrana Gram negativnih bakterij

asimetrični lipidni dvosloj s proteinskimi vključki, predvsem pa je značilna tanjši sloj

peptidoglikana. Lipidna plast je sestavljena skoraj izključno iz molekul lipopolisaharida

(LPS) [4, 11].

Lipopolisaharid je lipoglikan, sestavljen iz treh glavnih domen, in sicer iz lipida A, kratke

sredine oligosaharidov in O-antigen polisaharida. Je kritična sestavina v zagotavljanju

stabilnosti membrane in je aktivator imunskega sistema, zato je potencialna tarča

učinkovin. Lipid A je derivat D-glukozamina, ki ima z estrskimi in amidnimi vezmi vezane

fosfate ter maščobne kisline. Pogoste so 3-hidroksi maščobne kisline, dalje substituirane z

nehidroksi maščobnimi kislinami. Čeprav velja, da je vsaka izmed LPS regij imunogena,

pa je znano, da je bioaktivna domena lipid A tista, ki je odgovorna za pojav akutne

toksičnosti, O-specifična veriga pa pri tem sploh ne sodeluje. Slednja se zelo razlikuje med

posameznimi Gram negativnimi bakterijami in kljub številnim epitopom izkazuje znaten


3

potencial za antigensko aktivnost. LPS je bil povezan s sepso in visoko stopnjo umrljivosti

pri septičnem šoku, povzroči namreč sprostitev vnetnih citokinov, še posebej TNFα

(dejavnik tumorske nekroze alfa), IL-1ß (interlevkin-1-beta) in IL-6 (interlevkin-6). LPS je

tisti del bakterije, ki ga prepozna TLR4 [4, 11-14].

1.2. Sepsa

Sepsa je bila nekoč redek pojav, danes pa velja za eno pogostejših infekcijskih bolezni v

bolnišničnih ustanovah. Kljub napredku v razumevanju patofiziološkega mehanizma

nastanka sepse in izboljšane protimikrobne terapije, umrljivost za sepso predvsem na račun

septičnega šoka ostaja zastrašujoče visoka. Prav tako več kot 30% preživelih razvije

dolgotrajno invalidnost ali okvaro kognitivnih sposobnosti [6, 11].

Gre za sistemsko okužbo, ki je posledica vdora bakterij (Gram negativnih ali Gram

pozitivnih) ali gliv v normalno sterilne dele telesa. Tako mikrobi povzročijo porušenje

gostiteljeve naravne integritete. Do pojava lahko pripelje fizična okvara (vstavljanje

katetra), imunološka okvara (kožne spremembe) ali celo neposredna penetracija mikroba v

krvni obtok (piki insektov) [15].

Ameriški kolidž medicine prsnega koša/Združenje za zdravstvene oskrbe kritičnih stanj

(ACCP/SCCM) je leta 1992 sepso opisalo kot sistemski odziv na vnetje, s katerim je

povezan tudi pojav hipotenzije, ki ob prisotnosti hipoperfuzije tkiv privede do stanja,

znanega kot septični šok. To je urgentno stanje, pri katerem je nujna vzpostavitev

hemodinamskega ravnovesja. Sledijo hitri ukrepi, kot so vzdrževanje minutnega volumna

srca, infuzija raztopine koloidov, kristaloidov, po potrebi tudi dopamin in noradrenalin.

Pomembno je tudi uravnavanje očistka laktatov, kot produktov in hkrati markerjev tkivne

hiperperfuzije, ter zdravljenje motenj v strjevanju krvi. Pri hipoksiji in morebitnem

akutnem respiratornem distresnem sindromu (ARDS) se bolnikom dovaja kisik in umetno

ventilira. V primeru, ko obstaja nevarnost srčne odpovedi, pa sledi aplikacija kardiotonikov.

Pri šoku gre predvsem za odziv telesa na endotoksin Gram negativnih bakterij. Ob koncu

19. stoletja je Richard Pfeiffer prvi prepoznal termostabilne toksične komponente Gram

negativnih bakterij, ko je dokazal, da lizati toplotno inaktivirane Vibrio cholarae

povzročajo šok in smrt laboratorijskih živali. Do takrat neokarakterizirano substanco je

poimenoval »endotoksin«, na domnevi, da je bila najdena znotraj bakterije. To je bila

osnova za razlikovanje tega toksina od toksinov, ki jih bakterije izločajo med rastjo v


4

celično kulturo in jim pravimo eksotoksini. Sprva ta teorija med raziskovalci ni bila

najbolje sprejeta, tako kot tudi odkritje iz leta 1986, ki je pomembno vlogo pri akutnem

septičnem šoku pripisalo imunskemu sistemu, pa vendar obe teoriji danes veljata za

standarda v imunologiji [2, 4, 11, 16, 17].

Za diagnozo sepse je pomembna osamitev povzročitelja v krvi, če je možno pa tudi iz

mesta primarne okužbe. Laboratorijski izvidi in klinični znaki so potem osnova pravilnega

antibiotičnega zdravljenja. Če je možno se bolnikom aplicira specifične antibiotike, v

nasprotnem primeru se prične zdravljenje s širokospektralnimi antibiotiki. Zadnje smernice

za zdravljenje sepse tako priporočajo akutno obuditev pacienta, administracijo antibiotikov

in oskrbo okvar organov. Rekombinantni humani protein C (rhAPC, Xigris®, Eli Lilly) je

bilo edino zdravilo, ki je bilo specifično registrirano za zdravljenje sepse, a so ga pred

kratkim umaknili iz tržišča zaradi slabe učinkovitosti [6, 15, 17].

Pomembnost endogenih faktorjev je bila priznana po številnih neuspelih poskusih

zdravljenja sepse s pomočjo antibiotikov. Stanje pacientov se v ogromno primerih

zanimivo, po terapiji ni niti izboljšalo niti poslabšalo. Pri tem pa nikakor niso uspeli

natančno razložiti vlogo TLR v tem sistemu. Celice, ki izražajo TLR4, se namreč normalno

ne aktivirajo v okolju bogatem z endogenimi substancami, kot je na primer heparin sulfat,

ki je znan agonist TLR4, pa se le ta zgolj zadrži v ekstracelularnem matriksu. Šele, ko

proteaze cepijo matriks, ki povezuje vlakna, lahko agonisti aktivirajo TLR4, ki se ob tem

sprosti. Regulacija TLR4 pri neimunskih celicah lahko sproži sekundarni odziv kot na

primer aktivacijo endotelijskih celic, ki poveča produkcijo adhezijskih molekul, čemur

sledi infiltracija makrofagov in povečana vaskularna permeabilnost med infekcijo. Ta

kaskada lahko posledično pripelje do sindroma septičnega šoka, med drugim povečano

perfuzijo tkiv, neuravnovešeno koagulacijsko kaskado in odpoved organov [4, 16].

1.3. Toll-u podobni receptorji

Toll-u podobni receptorji so najbolj raziskana skupina receptorjev za prepoznavo

patogenih vzorcev in imajo pomembno vlogo v prirojenem imunskem odzivu. Prvič so jih

opisali leta 1997, ko so opazili podobnost z zaporedjem receptorja, imenovanega Toll, pri

muhi Drosophila melanogaster ter jih na tej osnovi tudi poimenovali [4-6, 9, 13].


5

Sodijo med transmembranske receptorje tipa 1, za katere je značilno, da le enkrat

prebadajo celično membrano. Na zunanji strani membrane se nahaja amino terminalna

skupina, na notranji pa karboksi. TLR vključuje zunanjo domeno bogato z levcinom

(LRR), ki je posrednik pri prepoznavi PAMP, transmembransko domeno in citosolno

Toll-IL-1 receptorsko domeno (TIR domena), ki aktivira signalne poti. LRR je sestavljen

iz 19-25 tandemskih kopij sekvence »xLxxLxLxx«. Zaradi njihove citoplazemske TIR

domene jih uvrščamo v skupino molekul oziroma superdružino IL-1R/TLR. Obstajajo

trije tipi TIR domene, in sicer tip z ekstracelularnim imunoglobulinom, citosolni adapterski

proteini (citoplazemske beljakovine brez ekstracelularne skupine) ter klasični TLR.

Ekstracelularna domena vsebuje več kot 600 aminokislinskih ostankov in je izredno

polimorfna v primerjavi z ostalima. TIR domena, sestavljena iz treh zelo stisnjenih regij,

vsebuje 150 aminokislinskih ostankov in modulira protein-protein interakcije med TLR in

adaptorskimi proteini, ki sodelujejo v signalno-transdukcijski kaskadi [4-6, 9, 18, 19].

TLR so izraženi na celični površini ali pa so povezani z intracelularnimi vezikli. Do danes

je bilo prepoznanih 10 človeških funkcionalnih TLR-jev in 12 mišjih. TLR1, 2, 4, 5, 6 in

11 se v večji meri nahajajo na celični površini in prepoznavajo PAMP, medtem ko TLR3,

4, 7, 8 in 9 najdemo znotraj celice, na endosomih (TLR4), lizosomih ter endoplazemskem

retikulumu. Agonisti TLR3, 7, 8 in 9 izkazujejo dobre rezultate pri zdravljenju virusnih

infekcij, antagonisti TLR4 in v manjši meri TLR2 za zdravljenje sepse, ostali receptorji pa

se predvsem raziskujejo kot tarče učinkovin za zdravljenje bakterijskih in glivičnih obolenj

[4-7, 9, 20].

Za razliko od ostalih receptorjev, TLR nimajo encimske aktivnosti. Ti receptorji aktivirajo

potencialni imunostimulatorni odgovor, ki mora biti strogo nadzorovan, saj aktivacija TLR

vodi preko transdukcijske poti do nastanka novih genov, kot so NFκB, IFN-regulatorni

faktorji in aktivatorski protein 1 (AP-1) [4, 21].

Ob vezavi liganda je značilna dimerizacija teh proteinov, pri čemer je za sprožitev signalne

kaskade preko TLR1, 2 in 6 potrebna heterodimerizacija. Tvorita se heterodimera TLR1/2

in TLR2/6, ki nato indukcirata NF-κB. Najbolj raziskani homodimeri pa so TLR3/3,

TLR4/4 in TLR9/9 [4, 5].

Z določitvijo sekvence Toll, so ugotovili, da je njegova karboksi terminalna domena pri

vretenčarjih signifikantno povezana z receptorjem za interleukin-1 (IL-1R). Aktivacija IL-

1R pa je pomemben del kaskade dogodkov, povezanih z akutno fazo odziva na infekcijo.


6

To dejstvo namiguje, da je TLR vključen tako v razvoj kot v začetek odziva na infekcijo

pri vretenčarjih [5, 19].

1.4. TLR4 in njegova vloga pri obrambi telesa

Toll-u podoben receptor 4 je prvi TLR, ki je bil identificiran s pomočjo genetskih študij, in

je osrednji signalni receptor za prepoznavo LPS Gram negativnih bakterij pri vretenčarjih

[4, 5, 9].

TLR4 se nahaja na celični površini in prepozna mikrobne membranske komponente.

Prepozna številne ligande, kot so proteini temperaturnega šoka (hsp60, hsp70), fuzijski

proteini (RSV), proteini ovojnice, HMGB1, ekstracelularna domena A (EDA), taksol,

fibrinogen, fibronektin, O-povezani manani in najpomembnejše LPS. Ti so različnega

izvora, nekatere najdemo v bakterijah, druge v glivah, rastlinah, virusih, miših in celo

gostiteljevih celicah. Pri tem je nujna ionska interakcija in tvorba vodikovih vezi z

ligandom [4-7].

Sprva so predvidevali, da je za zaznavo LPS pomembna povezava TLR s kompleksom

CD14, nato pa to sposobnost predpisali majhni molekuli receptorja, mieloidni

diferenciaciji 2 (MD-2) [4, 21].

Mieloidna diferenciacija Ag ali MD-2 je glikoprotein s 160 aminokislinskimi ostanki.

Gre za Ig domeno, ki jo uvrščamo med receptorje, ki vežejo lipide. Veže se na LPS

monomer in je občutljiv na acilirani del lipida A. Tvori nekakšno strukturno bariero s

hidrofobnim žepkom, ki je dovolj velik, da se vanj vežejo maščobne kisline lipida A.

Povezava [MD-2:LPS] kompleksa z zunanjo domeno TLR4 je ključna za začetek

transdukcije signala preko povezave z intracelularno TIR domeno in spodbujanjem

adapterskega proteina, ki sproži signalno kaskado [4, 22].

Prepoznavni receptor TLR4 in njegov ko-receptor MD-2, ki sta preko ekstracelularne

domene TLR4 tesno povezana na celični površini, najdemo v mnogih imunskih celicah,

vključujoč mikroglijo v centralnem živčnem sistemu ter tudi v številnih neimunskih

celicah [5, 19, 21].

Je edini TLR, ki aktivira 4 adaptorske proteine in dve signalni poti z različno kinetiko,

»MyD88-odvisno« in »TRIF-odvisno« pot. Ob vzdraženju receptorja se tako sproži

signalna kaskada preko proteinom TIRAP in MyD88 vse do končnih vnetnih produktov


7

kot so citokini (MP, cDC, pDC), kemokini in protimikrobni protein (MyD88-odvisna pot).

Hkrati se TLR4 transportira v Rab11a pozitivne fagosome, ki vsebujejo bakterije. To

zaznata TRAM in TRIF proteina, ki sprožita nadaljnjo kaskado do nastanka interferona

tipa 1, po drugi signalni kaskadi pa tudi do NF-κB. Posledice tega obrambnega odgovora

so sprostitev nevtrofilcev, aktivacija makrofagov in indukcija IFN stimulirajočih genov,

kar povzroči neposredno smrt patogena (TRIF-odvisna pot) [5, 9, 23, 24].

Na začetek signalne kaskade pa esencialno vplivata še CD14 in LPS-vezujoči protein LBP.

LBP nase veže LPS in ga prenese na CD14. Slednji kompleks dalje prenese na MD-2, ki je

vezan na TLR4, ter tako tvori monomerni endotoksin. Nastali heterokompleks z MD-2

([LPS:TLR4:MD-2]) aktivira TLR4, ki se poveže še z enim heterokompleksom TLR4, ter

sproži zgoraj omenjeni signalni poti (slika 1). Aktivacija lahko poteče tudi brez LPB in

CD14, vendar je zato potrebna občutno večja količina endotoksina [5, 6, 12-14, 22, 24].

Slika 1: Prikaz poteka signalizacije preko TLR4 ob vezavi agonista (heksa aciliran lipid A) in

antagonista (manj aciliran lipid A) [12].

Potencialna klinična uporaba TLR4 antagonistov je preprečevanje oziroma zdravljenje

sepse, infekcijskih bolezni, ateroskleroze, odpovedi ledvic, jeter, bolezni pljuč in ishemije

srca. TLR4 pa povezujejo tudi s povečano bolečino med drugim tudi nevropatsko bolečino

in zmanjšano morfinsko analgezijo (v povezavi z bolečino inducirano z morfin-3-

glukoronidom) [4, 19].


8

Z razrešitvijo strukture TLR4 so se pojavile možnosti strukturno podprtega načrtovanja

potencialnih inhibitorjev tega receptorja. TLR4 tvori heterodimer z MD-2, ta protein-

protein interakcija pa je ključnega pomena pri signaliziranju ob vnetju [25].

1.5. Potencialne terapevtske tarče v sistemu LPS/TLR4 in razvoj

učinkovin

Obstajajo številne možnosti delovanja na TLR4. Spojine lahko razvrstimo v tri skupine:

1. Molekule, ki vplivajo na intracelularne signalne poti povezane s TLR4 (E5564, TAK-

242, ketamin, opioidi, vitamin D3 – preko delovanja na LL37, lansoprazol – preko

delovanja na SOCS1),

2. Molekule, ki vplivajo na ekspresijo TLR4 in TLR4-mRNK (klorokin, ketamin, GTS-

21, statini, vitamin D3, lidokain, glicin),

3. Protitelesa proti TLR4 in [TLR4:MD2] kompleksu (NI-0101). Protitelesa se vežejo na

ektodomeno toll-u podobnega receptorja 4 [4, 6].

1.5.1. Možnosti zaviranja signaliziranja brez vpliva na TLR4

V telesu se nahajajo tudi topni receptorji, ki delujejo kot vaba za citokine in kemokine, s

tem pa predstavljajo pomembno vlogo v negativni regulatorni zanki pri interakciji

citokinov in kemokinov z membranskimi receptorji. Raziskovalci so odkrili najmanj 15

negativnih regulatorjev TLR4, med katere spadajo topni CD14, MD-2 in TLR ter MyD88s,

SOCS1, NOD2, PI3K, TOLLIP in drugi [4, 21].

Obstajajo še druge možnosti zaviranja intracelularnega od LPS odvisnega signaliziranja

kot odgovora na endotoksine:

a) Nevtralizacija LPS ali zaviranje začetnih LPS signalnih dogodkov s

preprečevanjem nastanka signalov,

1) Učinkovina je lahko LPS ligand.

2) Učinkovina cilja CD14.

3) Učinkovina cilja LBP.

b) Preprečevanje intracelularnih signalov induciranih z endotoksinom ali zaviranje

sinteze citokinov ter drugih celičnih mediatorjev (resatorvid),

c) Zaviranje sproščanja citokinov (IL-1, IL-6, IL-8) ter drugih celičnih mediatorjev,


9

d) Blokiranje TNF-α in IL-1 receptorjev za celične mediatorje na njihovih tarčnih

celicah,

e) Preprečevanje sledečih se patofizioloških dogodkov, kot sta akutna respiratorna

bolezen in nenormalno strjevanje krvi [4].

1.5.1.1. Učinkovina cilja CD14.

Prenos LPS na kompleks [TLR4:MD-2] vrši CD14 in s tem poveča občutljivost receptorja

za njegov ligand. Zaradi vezave LPS, CD14 uvrščamo med pomembne, a ne esencialne,

sestavne dele signalne poti. Interagira lahko tudi z lipotehojsko kislino, topnimi

peptidoglikani, glikolipidi in lipoproteini. Kljub temu, da je večina CD14 ligandov

negativno nabitih (LPS in peptidoglikani), pa se nanj vežejo tudi pozitivno nabiti

triacilirani lipopeptidi, ki pa aktivirajo TLR1-TLR2 signalno pot. Zaviranje delovanja

CD14 bi torej preprečilo začetek signalne poti in s tem imunski odziv na vdor bakterij [26].

1.5.1.2. Učinkovina cilja LBP.

LBP je v TLR4 sistemu ključen za prenos LPS na CD14. V kolikor pa njegovo delovanje

zavremo, v telesu ne poteče signalna kaskada in tako ne pride do vnetja. Že sam LBP ima

dvojno delovanje, odvisno od njegove koncentracije v telesu. V nižjih koncentracijah

namreč pospešuje začetek signalne kaskade v TLR4 sistemu, v višjih pa jo zavira, tako da

prenese LPS na lipoproteine in ga s tem nevtralizira. Dokazano pa je bilo tudi, da LBP

lahko inhibira odgovor monocitov na LPS, ki se je že vezal na membranski CD14, saj

povzroči disociacijo LPS iz mCD14 [27].

1.5.1.3. Učinkovina je lahko LPS ligand.

Lipid A je tisti del LPS, ki je odgovoren za vezavo slednjega na kompleks [TLR4:MD-2].

Zaradi svoje anionske amfifilne narave nase dobro veže številne polikationske amfifilne

molekule, ki lahko na ta način delujejo kot LPS ligandi. Tako preprečijo vezavo LPS na

kompleks [TLR4:MD-2] oziroma ga od kompleksa osamijo. Z optimizacijo strukture

liganda lahko dosežemo višjo afiniteto za LPS in zmanjšamo toksičnost povezano s

površinsko aktivnimi lastnostmi [26].


10

1.5.1.4. Učinkovina vpliva na sintezo vnetnih mediatorjev

Resatorvid ali TAK-242 je majhna molekula, ki je bila razvita z namenom zaviranja

sinteze vnetnih mediatorjev (slika 2). Spojina nima vpliva na vezavo LPS na TLR4. Sprva

so dokazali, da TAK-242 znižuje raven NO ter zavira sintezo številnih citokinov v LPS

stimuliranih mišjih makrofagih in med endotoksičnim šokom pri miših. Specifično vezavo

TAK-242 na Cys-747 na intracelularni domeni TLR4 so dokazali šele v nadaljnjih

raziskavah, ko so ugotovili zmožnost zaviranja intracelularnega signaliziranja z znižanjem

fosforilacije MAP kinaz in razpad IκB [21].

Slika 2: Strukturna formula TAK-242 [povzeto po 28].

1.5.2. Možnosti zaviranja signalizacije z vplivom na TLR4

Kljub mnogim poskusom sintetiziranja optimalnega zdravila za zdravljenje oziroma

preprečevanja sepse, jih večina ne zaključi kliničnih testiranj zaradi preslabe učinkovitosti

ali neželenih stranskih učinkov. Glede na vedno boljše poznavanje mehanizma nastanka

»Gram negativne sepse«, so tudi tarče natančneje definirane. In sicer lahko v sistem

posežemo na več načinov:

1) Učinkovina je protitelo proti TLR4.

2) Učinkovina cilja MD-2 ali [TLR4:MD-2] kompleks.

3) Učinkovina, ki se neposredno veže na TLR4 ali MD-2 [12, 22].

Pri tem je pomembno poudariti, da CD14 in LBP nista esencialna za potek signalne

kaskade TLR4, ampak zgolj pospešita prenos LPS do kompleksa [TLR4:MD-2]. Kot že

omenjeno, pri znatno višji koncentraciji endotoksina poteče vnetni odgovor tudi brez teh

dveh proteinov [12, 22].


11

1.5.2.1. Monoklonsko protitelo proti TLR4.

NI-0101 je prvo humano monoklonsko protitelo proti TLR4, ki so ga proizvedli pri

podjetju NovImmune. Veže se tako na kompleks [TLR4:MD-2], kot tudi na TLR4 brez

prisotnosti MD-2. Deluje tako, da zavira dimerizacijo TLR4 in TLR4 signalno pot,

sproženo z vdorom LPS, endogenih ali kemičnih ligandov TLR4. Rezultati prekliničnih

študij na modelih (artritis, respiratorno vnetje, poškodba organov) izkazujejo izjemno

dober terapevtski potencial protitelesa, ki je leta 2013 že prešel v 1. fazo kliničnega

testiranja. Na zdravih ljudeh bodo opazovali varnost zdravila in toleranco na zdravilo po ex

vivo in in vivo LPS izpostavitvi [6, 29].

1.5.2.2. Učinkovina cilja MD-2 ali [TLR4:MD-2] kompleks.

Učinkovina, ki cilja MD-2, se torej veže na MD-2 vezavno mesto in je lahko agonist ali

antagonist sistema TLR4. Take spojine so mimetiki lipida A, ki so zelo podobni

naravnemu lipidu A oziroma samemu lipopolisaharidu. Številni so tudi že bili sintetizirani.

Razlika med agonisti in antagonisti je v številu in prostorski porazdelitvi lipidnih verig.

Agonisti imajo 5 ali 6 verig maščobnih kislin, hidrofobni del je stožčaste oblike, medtem

ko imajo antagonisti manj kot 6 maščobnih kislin v svoji strukturi, njihov hidrofobni del pa

je bolj okrogle oblike. Najbolj znana antagonista sta naravni lipid IVa in sintetični

eritoran, ki z vezavo v hidrofobni žep MD-2, povzročita blokado provnetnega

signaliziranja [26, 30].

Lipid IVa je biosintetski prekurzor patogenega lipida A, ki se nahaja v E. coli. Nepatogeni

lipid A iz R. sphaeriodes služi kot strukturna osnova za sintetične učinkovine za

zdravljenje sepse, med drugim tudi za eritoran [6].


12

E5531 je pripadnik 1. generacije analogov lipida A, pridobljen iz endotoksina Rhodobacter

capsulatus. Blokira vezavo LPS na kompleks [TLR4:MD-2] v celični kulturi in nima

endotoksinu podobne aktivnosti. Zaradi pretirane interakcije s plazemskim LPS in nizke

učinkovitosti so prekinili nadaljnji razvoj spojine in začelo se je iskanje novih LPS

antagonistov. Predstavnik 2. generacije antagonistov je eritoran ali E5564, ki je sintetična

molekula, izpeljana iz nepatogene Rhodobacter sphaeroides. Kristalna struktura

[TLR4:MD-2] z eritoranom nakazuje njegov mehanizem delovanja. Z vezavo v veliki

notranji hidrofobni žep v MD-2 namreč preprečuje sprožitev intracelularne signalne poti,

zato deluje kot LPS antagonist. Zavira in vitro produkcijo citokinov v človeški krvi in

inducira regulacijo intracelularnih provnetnih citokinov. Tudi eritoran je bil zaradi

pomanjkanja učinkovitosti umaknjen s tržišča [6, 18, 21, 30].

Slika 3: Strukturni prikaz lipida A, lipida IVa in eritorana [30].

Sintetiziran je bil tudi peptidni antagonist kompleksa [TLR4:MD-2], sestavljen iz 17

aminokislinskih ostankov. V svoji strukturi vsebuje enako vezavno regijo za TLR4, kot jo

ima MD-2, ter vse aminokislinske ostanke potrebne za vezavo, vendar pa do aktivacije

TLR4 sistema pri tem ne pride [26].


13

ß-aminoalkoholni derivati so nizkomolekularni zaviralci kompleksa [TLR4:MD-2], ki so

bili odkriti s pomočjo virtualnega rešetanja. In silico rezultati nakazujejo, da ß-

aminoalkoholi tekmujejo z MD-2 za vezavna mesta TLR4. Na humanih embrionalnih

celicah ledvic (HEK), z dodatno izraženim TLR4, so dokazali, da zavirajo aktivacijo NF-

κB, ki se sproži ob vdoru LPS, zaradi česar naj bi delovali kot sistemski zaviralci vnetja.

Kljub ogromnemu potencialu pa je njihova učinkovitost slaba in bi bila potrebna nadaljnja

optimizacija. Njihova učinkovitost ni bila potrjena v in vitro ter in vivo modelih [20, 32].

Slika 4: Strukturna formula ß-aminoalkoholnih derivatov [32].

1.5.2.3. Učinkovina, ki se neposredno veže na TLR4 ali MD-2.

Nekatere molekule lahko zavirajo TLR4 signalno pot z neposredno vezavo na TLR4 ali

MD-2, za razliko od LPS in njegovih mimetikov, ki se morajo predhodno vezati na LBP in

CD14. Takšni molekuli sta cikloheksanski derivat TAK-242, ki se veže na Cys-747 v

intracelularni domeni TLR4, in protitumorna učinkovina Paklitaksel®, ki se veže

neposredno na MD-2 [26].

Slika 5: Strukturna formula paklitaksela [povzeto po 33].


14

1-(4-fluorofenil)-2-(5-(2-hidroksi-5-metoksibenzoil)pirimidin-2-il)gvanidin - Na

Fakulteti za farmacijo so z virtualnim rešetanjem odkrili nove spojine z delovanjem na

TLR4. Z uporabo določenih strukturnih filtrov so iz knjižnice spojin uspeli pridobiti 18

potencialnih spojin in testirali njihovo antagonistično delovanje na TLR4. Pri tem so

ugotovili, da jih je 14 citotoksičnih pri koncentracijah nad 100 μM v primerjavi s kontrolo

(DMSO). Največje antagonistično delovanje so izkazovale tri spojine, med katerimi je bila

najboljša spojina A z IC50 vrednostjo 16,6 μM (slika 6). Ta nizkomolekularni zaviralec naj

bi vplival na kompleks [TLR4-MD-2] tako, da prepreči vezavo MD-2 na TLR4, s tem pa

naj bi zaviral signalno kaskado povezano z receptorjem. Hkrati predvidevajo, da so za

vezavo na receptor ključni aminokislinski preostanki Asp-234, Asp-209 in Ser-211 na

verigi A (slika 7). Pri koncentraciji 100 μM prav tako 87 % zavira sproščanje TNF.

Neposredna vezava je bila dokazana s pomočjo površinske plazmonske resonance (SPR)

[20].

Slika 6: Strukturna formula spojine zadetka (spojina A) z IC50 16,6 μM [20].

Slika 7: Veriga A Toll-u podobnega receptorja 4 in mehanizem delovanja gvanidinskih derivatov pri

preprečevanju vezave MD-2. (A) Predvideno vezavno mesto gvanidinskih derivatov na TLR4 (B)

[povzeto po 20].


15

2. Namen dela

Glavna naloga magistrske naloge je bila načrtovanje sintezne poti za spojino A, odkrite s

pomočjo virtualnega rešetanja na Fakulteti za farmacijo, in sinteza njenih analogov -

gvanidinskih derivatov kot potencialnih antagonistov TLR4. Zastavili smo si sledeče cilje:

1. Postavitev sinteznega postopka za spojino A in njenih analogov (spojina A je bila

za potrebe testiranja kupljena iz knjižnice spojin).

2. Sinteza gvanidinskih derivatov po izbranem sinteznem postopku.

3. Vrednotenje topnosti v celičnem mediju, citotoksičnosti in potencialnega

antagonističnega delovanja gvanidinskih derivatov na celični liniji HEK 293.

4. Primerjava sintetiziranih gvanidinskih derivatov ter postavitev potencialnega

odnosa med strukturo in delovanjem spojin za pomoč pri nadaljnjih raziskavah.


16

3. Materiali, laboratorijska oprema in metode

3.1. Materiali

Pri delu smo uporabljali reagente, topila, nevtralizacijska in sušilna sredstva ter pline

različnih proizvajalcev, kot so Acros, Gram-mol, Maybridge, Merck in Sigma-Aldrich

(Aldrich, Fluka, Sigma).

Reagenti: 4-nitrobenbromobenzen, 2-aminopirimidin-5-karbaldehid, izopropilmagnezijev

klorid, kobaltov (II) klorid, tetrametiletilendiamin (TMEDA), nasičena raztopina

amonijevega klorida, amonijev tiocianat, benzoilklorid, 2-aminopirimidin, natrijev

hidroksid, klorovodikova kislina, svinčev acetat, ocetna kislina, 4-fluoroanilin,

fenilizotiocianat, vodna raztopina amonijaka, tiosečnina, natrijev hidrid, trimetil

acetanhidrid, trifluorocetna kislina, živosrebrov (II) klorid, kromon-3-karboksialdehid,

kalijev hidroksid, cianogvanidin, bis(trikloroetil)karbonat (BTC, »trifosgen«), 2-

hidroksiacetofenon, 2-hidroksi-5-metoksiacetofenon, 2-propanol, trimetilsilil klorid (TMS-

Cl), triptamin, 4-metoksianilin, anilin, sulfonilamid, morfolin, paladij na ogljiku in TAK-

242.

Topila: Prečiščena voda, acetonitril, etilacetat, heksan, ocetna kislina, triklorometan,

diklorometan, aceton, metanol, etanol (brezvodni in absolutni), vodna raztopina amonijaka,

tetrahidrofuran (THF), dimetilformamid (DMF), trietilamin, petroleter, dietileter, 1,2-

dikloroetan, cikloheksan in 2-propanol. Vsa brezvodna topila smo pripravili sami iz

kupljenih topil z destilacijo.

Nevtralizacijska sredstva: Klorovodikova kislina, natrijev hidroksid, natrijev

hidrogenkarbonat, natrijev hidrid in ocetna kislina.

Sušilna sredstva: Nasičena vodna raztopina natrijevega klorida in natrijev sulfat.

Orositveni reganti: Železov (III) klorid v etanolu (FeCl3/EtOH), 2,4-dinitrofenilhidrazin

in ninhidrin.

Plini: Argon in vodik.


17

3.2. Laboratorijska oprema

Laboratorijska tehnica Mettler toledo PB403-S, grelna pištola Skil 8000, rotavapor Buchi

waterbath B-480, magnetno mešalo IKA RTC basic, UV-svetilka Lamag cabinet II,

hladilna naprava in kapalnik za brezvodno kemijo, mikrovalovni reaktor CEM Discover z

IR in optičnim načinom merjenja temperature.

3.3. Metode

3.3.1. Kromatografske metode

3.3.1.1. Tankoplastna kromatografija (TPK)

TPK smo uporabili za spremljanje poteka reakcije, primerjalno kvalitativno določevanje

vsebine reakcijske zmesi in spremljanje čistosti izoliranih spojin iz reakcijske zmesi. Za

izvedbo smo uporabili plošče Merck DC Fertigplatten Kieselgel 60 GF254. Gre za

aluminijaste plošče z 0,20 mm nanosom silikagela, ki mu je bil predhodno dodan

fluorescenčni indikator (stacionarna faza). Za razvijanje kromatografskih ploščic pa smo

uporabili različne mobilne faze, ki so opisane v nadaljevanju pri posameznih sintezah. Za

opazovanje lis na kromatografski plošči smo uporabili UV svetilko z valovno dolžino

svetlobe 254 nm ali 366 nm. Kadar je bilo mogoče, smo si pomagali z oroševanjem

ploščice z orositvenimi reagenti, kot so ninhidrin (15 mg/mL ninhidrina, raztopljenega v 96%

etanol/ocetna kislina), 2,4-dinitrofenilhidrazin in FeCl3/H2SO4.

3.3.1.2. Kolonska kromatografija

Kolonsko kromatografijo smo uporabili za čiščenje reakcijske zmesi oziroma izolacijo

želene spojine. Stacionarna faza je bila silikagel z 0,04-0,063 nm velikimi delci

proizvajalca Merck, mobilne faze pa so bile različne in so opisane v nadaljevanju pri

posameznih sintezah.


18

3.3.1.3. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)

To tehniko smo uporabili za ugotavljanje čistosti sintetiziranih spojin in produktov

vmesnih stopenj sinteze. Analizo smo izvajali s pomočjo reverznofazne tekočinske

kromatografije visoke ločljivosti na sistemu Agilent 1100 (Agilent Technologies). Sistem

sestavlja kvartetna črpalka in detektor več valovnih dolžin.

Uporabljeni so bili sledeči parametri metode:

Kolona: Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 x 50 mm, delci velikosti 5 μm)

Pretok mobilne faze: 1 mL/min

Detekcija: pri 220 in 254 nm

Elucijski sistem:

- Temperatura sistema: 25 °C (termostat)

- Čas posamezne analize: 30 min

- Zmes elucijskih topil: 0,1% TFA v vodi (A) in metanol (B)

- Elucijski gradient:

o 0.–20. min: (10% → 90%)B v A

o 20.–25. min: 90% B v A

o 25.–30 min: (90% → 10%)B v A

3.3.2. Spektroskopske metode

3.3.2.1. Jedrska magnetna resonanca (NMR)

Spojine smo identificirali s pomočjo 1H-NMR spektrov, končnim spojinam smo posneli še

13C-NMR spektre za dodatno potrditev. Analize smo izvajali na Bruker Avance 400 DPX

400 MHz spektrometru na Fakulteti za farmacijo. Uporabili smo različna devterirana topila

(DMSO-d6 in CDCl3). Kemijski premiki so podani v ppm (»parts per million«) glede na

razdaljo od internega standarda, ki je bil v našem primeru tetrametilsilan (TMS, δ = 0,00

ppm). Sklopitvene konstante (J) so podane v hertzih (Hz), oblika vrhov pa s standardnimi

oznakami za singlet (s), široki singlet (bs), dublet (d), dublet dubleta (dd), triplet (t) in

multiplet (m). Za analizo spektrov smo uporabili računalniški program MestReNova 8.1.2.

– 11880 (Masterlab Research S.L.).


19

3.3.2.2. Masna spektroskopija

Metoda smo uporabili za natančno določitev mase molekul ter atomov. Izvajali so jo na

Inštitutu Jožef Štefan v Ljubljani (Center za masno spektroskopijo), in sicer na masnem

spektrometru VG-Analytical Autospec Q mass (Micromass). Uporabljeni sta bili tehniki

ESI in HRMS.

3.3.3. Določanje temperature tališča

Temperature tališč končnih spojin in produktov vmesnih stopenj smo določili s

Koflerjevim talilnim mikroskopom (Leica). Vrednosti so nekorigirane.

3.3.4. Risanje in poimenovanje struktur spojin ter iskanje sinteznih postopkov

S programom ChemDraw Ultra 12.0.2.1076 (CambridgeSoft) smo narisali strukturne

formule spojin in določili njihova IUPAC imena.

Za iskanje sinteznih postopkov in eksperimentalnih podatkov za spojine smo uporabili

spletni brskalnik SciFinder.

3.3.5. Študije topnosti, citotoksičnosti in antagonistične aktivnosti

In vitro testiranja so bila opravljena na Zavodu za transfuzijsko medicino v Ljubljani s

strani doc. dr. Urbana Švajgerja, mag. farm. 25 nM raztopine naših spojin v DMSO so

bile dodane k celičnemu mediju, s čimer smo določili topnost (najvišja koncentracija

spojine brez prisotnosti precipitatov). Citotoksičnost topnih spojin je bila določena na

celični kulturi HEK 293 (Invivogen), pri tem je DMSO služil kot negativna kontrola.

Antagonistično delovanje se je določilo na celični liniji HEK-BlueTM-hTLR4

(Invivogen), ki selektivno izraža TLR4 in aktivira reporterski gen (alkalna fosfataza)

preko TLR4 agonistov. Pri tem kot negativna kontrola služi LPS (Sigma-Aldrich), kot

pozitivna pa komercialno dostopni TLR4 antagonist TAK-242 (Invivogen). Vrednosti

IC50 izračunamo glede na upad izmerjene absorbance kot posledica inhibicije izražanja

alkalne fosfataze. Postopek določitve sledi navodilom proizvajalca.


20

4. Eksperimentalni del

Naša pot do načrtovanja in iskanja končne uporabne sintezne poti za spojino A in njenih

analogov se je začela z uporabo Grignardovih reagentov. Ker v zadnji stopnji sinteze

nismo uspeli dobiti končne spojine, smo poskusili preko uporabe tiosečnin. Tudi ta pot je

bila le delno uspešna, saj ponovno nismo uspeli preiti zadnje stopnje do želene spojine. Na

koncu smo se osredotočili na sintezo derivatov gvanidina. Tu smo imeli več uspeha in tako

sintetizirali nekaj spojin. Te smo izolirali iz reakcijskih zmesi, jih očistili in okarakterizirali,

nato pa določili njihovo potencialno antagonistično delovanje. Iz rezultatov smo izluščili

nekaj novih informacij o povezavi med strukturo in delovanjem antagonistov TLR4.


21

4.1. Sinteza spojine 1 – [(2-aminopirimidin-5-il)(4-nitrofenil)metanol]

Reakcija:

Postopek:

V vakuumu prežarimo bučko in jo prepihamo z argonom. Postopek ponovimo vsaj še

dvakrat. Vanjo odmerimo sveže predestiliran brezvodni THF (18,75 ml) in ohladimo na -

20 °C. Dodamo 4-nitrobromobenzen (37,5 mmol; 7,58 g) in nato po kapljicah pol ure

dodajamo raztopino iPrMgCl (2M v THF; 37,5 mmol; 18,75 ml). Pustimo, da se reakcijska

zmes segreje na -10 °C in mešamo pri tej temperaturi eno uro. Ponovno ohladimo na -

20 °C in nastali Grignardov reagent počasi kapljamo k ohlajeni raztopini 2-

aminopirimidin-5-karbaldehida (37,5 mmol; 3,08 g). To pripravimo po sledečem postopku:

V suho bučko (prežarjena v vakuumu in prepihana z argonom) dodamo CoCl2 (10 mol% -

2,5 mmol; 0,325 g), sveže predestilirani brezvodni THF (10,9 ml) in TMEDA (10 mol% -

2,5 mmol; 0,388 ml) ter ohladimo na -20 °C.

Ko dodamo ves Grignardov reagent, pustimo mešati 1,5 h pri 0 °C. Nato dodamo 50 ml

nasičene raztopine amonijevega klorida ter spiramo z etilacetatom (2 x 100 ml). Organsko

fazo speremo še z nasičeno raztopino NaCl (1 x 50 ml), sušimo z Na2SO4, filtriramo in

odparimo topilo. Oljnat zaostanek čistimo s kolonsko kromatografijo (mobilna faza

diklorometan/metanol = 13/1).

Dobili smo mešanico produktov, ki je tudi s kolonsko kromatografijo nismo uspeli najbolj

očistiti. V omenjeni mobilni fazi smo našemu produktu glede na TPK predvideli Rf 0,60.

Izolirali smo le nekaj odstotkov čiste frakcije, zato smo nadaljnjo sintezo opustili.

Za izvedbo sinteze smo uporabili patentiran sintezni postopek [34].


22

4.2. Sinteza spojine 5 – [1-(4-fluorofenil)-3-(pirimidin-2-il)gvanidin]

1. stopnja sinteze:

Postopek:

Bučko prežarimo in prepihamo z argonom, tako da ustvarimo brezvodne pogoje, ki jih

vzdržujemo tekom celotne reakcije. V bučko nato natehtamo amonijev tiocianat (30 mmol;

2,284 g) in ga raztopimo v brezvodnem acetonitrilu (~ 40 ml). V zmes po kapljicah

dodamo še benzoil klorid (20 mmol; 2,320 g) in segrevamo ob vrenju. Po približno eni uri

dodamo po kapljicah še 2-aminopirimidin (9 mmol; 0,856 g) raztopljen v brezvodnem

acetonitrilu (~ 20 ml). Reakcijsko zmes segrevamo ob vrenju 4 ure, nato oborino

odnučamo in jo takoj uporabimo v naslednji stopnji sinteze.

N-(pirimidin-2-ilkarbamotiol)benzamid (2)

Izgled Svetlo rumeni kristali

Molekulska formula C12H10N4OS

Molekulska masa 258,30 g/mol

Izkoristek reakcije 88 %

Rf (mobilna faza) 0,20 (etilacetat/heksan = 2/1)


23

2. stopnja sinteze:

Postopek:

Produkt 1. stopnje (2) raztopimo v 2M NaOH (~ 10–15 ml) in segrevamo ob vrenju 12 ur,

na hladilnik namestimo še klorkalcijevo cevko. Po končani reakciji zmes nevtraliziramo z

2M HCl (37 % (aq.); ~ 10–15 ml) oziroma uravnamo pH na 7, pri čemer izpade produkt

naše reakcije (3) in tega odfiltriramo z odsesavanjem (Büchnerjev lij). Ker matičnica tudi

po filtraciji vsebuje veliko produkta, ji lahko odstranimo topilo z rotavapiranjem in

nadaljujemo z naslednjo stopnjo reakcije.

1-(pirimidin-2-il)tiourea (3)

Izgled Beli kristali

Molekulska formula C5H6N4S




1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 7,16 (dt, J1 = 9,7 Hz, J2 = 4,9 Hz, 1H, Ar-H), 8,65 (d, J

= 4,9 Hz, 2H, Ar-H), 9,17 (bs, 1H, NH), 10,21 (bs, 1H, NH),

10,61 (s, 1H, NH)

Tališče 256-260 °C (V literaturi [35]: 255-256 °C)


24

3. stopnja sinteze:

Postopek:

Suh produkt 2. stopnje raztopimo v 1M NaOH (~ 10–15 ml) in dodamo Pb(AcO)2

(Pb(C2H3O)2x3H2O; 6,24 mmol; 2,367 g) ter segrevamo ob vrenju eno uro. Na hladilnik

namestimo klorkalcijevo cevko. Nato z ledocetom (po potrebi) uravnamo pH na 7 in

odnučamo nastale svinčeve soli. Produkt, ki se nahaja v matičnici, ekstrahiramo v

organsko topilo, kjer uporabimo mešanico kloroform/metanol = 9/1 (3x100 ml oziroma po

potrebi). Organsko fazo posušimo z Na2SO4 in topilo odparimo.

N-(pirimidin-2-il)cianamid (4)

Izgled Beli kristali

Molekulska formula C5H4N4



Rf (mobilna faza) 0,31 (etilacetat/heksan = 2/1) 1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 7,11-7,20 (m, 1H, Ar-H), 7,30-7,40 (m, 2H, Ar-H),

9,68 (s, 1H, NH)



25

4. stopnja sinteze:

Postopek:

Spojino 4 raztopimo v etanolu in po kapljicah dodamo 4-fluoroanilin (2,917 mmol; 0,280

g). Dodamo HCl (37 % (aq.); 2,917 mmol; 89,4 μl) in segrevamo ob vrenju čez noč. Po

končani reakciji zmes naalkalimo z 1M NaOH (po potrebi) do pH ~ 10-11. Produkt je bil

slabo topen v organskih topilih, zato ekstrakcija ni bila uspešna. Dodamo mu le mešanico

topil etilacetat/metanol = 10/1 in vodo odparimo kot azeotrop (rotavapiramo pri 65 °C).

Produkt očistimo s kolonsko kromatografijo (etilacetat/heksan = 2/1).

Produkta nismo uspeli izolirati in dokazati z analitskimi metodami.


26

4.3. Sinteza spojine 9 – [1-(4-fluorofenil)-3-Boc-2-(pirimidin-2-

il)gvanidin]

1. stopnja sinteze:

Spojina 7: R = 4-fluoroanilin

Spojina 8: R = 2-aminopirimidin

Postopek:

Reakcijo izvajamo v brezvodnih pogojih, zato bučko najprej prežarimo in prepihamo z

argonom. Nato dodamo raztopino tiosečnine (6,57 mmol; 0,500 g) v brezvodnem THF

(100 ml). Bučko damo na ledeno kopel, nato pa postopoma dodajamo NaH (80 %

suspenzija v mineralnem olju; 9,86 mmol; 0,296 g). Mešamo eno uro pri sobni temperaturi

do nastanka aniona. Reakcijsko zmes ohladimo na ledeni kopeli in pri 0 °C dodamo di-

terc-butil dikarbonat (Boc2O; 7,88 mmol; 1,720 g). Mešamo 8 ur pri sobni temperaturi,

nato pa reakcijsko zmes ponovno ohladimo na 0 °C. Za nadaljevanje reakcije uporabimo

celotno reakcijsko zmes, v kateri je večinski delež produkta (Boc-tiosečnina).

Reakcijski zmesi na ledeni kopeli dodamo NaH (80 % suspenzija v mineralnem olju; 26,28

mmol; 0,788 g). Mešamo eno uro pri 0 °C. Nato dodamo trifluoroacetanhidrid (10,12

mmol; 1,406 g) in mešamo eno uro ter po kapljicah dodamo še amin (10,12 mmol; 4-

fluoranilin: 0,972 ml ali 2-aminopirimidin: 0,963 g). Pustimo mešati 18 ur, pri tem pa

pustimo, da se zmes počasi segreje do sobne temperature. Reakcijo ustavimo z dodatkom

vode (~ 15 ml). Reakcijska zmes se pri tem rahlo zbistri, a ostane rumeno-oranžne barve.

Sledi ekstrakcija z etilacetatom (3 x 100 ml). Organsko fazo nato najprej posušimo z

nasičeno vodno raztopino NaCl (100 ml) in nato še z Na2SO4 ter topilo odparimo na

rotavaporju. Sledi še čiščenje in izolacija produkta s kolonsko kromatografijo

(etilacetat/heksan = 1:4).


27

N-Boc-N'-(4-fluorofenil)tiourea (7)

Izgled Rjavo oranžno olje

Molekulska formula C12H15FN2O2S



Rf (mobilna faza) 0,24 (etilacetat/heksan = 1/2) 1H NMR (400 MHz,

CDCl3)

δ (ppm) 1,56 (s, 3H, OCH3), 7,02-7,06 (m, 2H, Ar-H), 7,56-7,60

(m, 2H, Ar-H), 10,31 (bs, 1H, NH), 11,66 (bs, 1H, NH)

N-Boc-N'-(pirimidin-2-il)tiourea (8)

Izgled Rumeno oranžno olje

Molekulska formula C10H14N4O2S



Rf (mobilna faza) 0,58 (eter/petroleter = 3/1) 1H NMR (400 MHz,

CDCl3)

δ (ppm) 1,49 (s, 3H, OCH3), 6,93-6,97 (m, 1H, Ar-H), 7,52-7,55

(m, 2H, Ar-H), 8,07 (bs, 1H, NH), 9,22 (bs, 1H, NH)


28

2. stopnja sinteze:

Postopek:

K raztopini amina (4-fluoroanilin ali 2-aminopirimidin; 1 ekvivalent glede na spojino 7

oziroma 8) v DMF (5 ml) pri 0 °C dodamo Boc-tiosečninski derivat (spojina 7 ali 8),

trietilamin (3,5 ekvivalenta) in HgCl2 (1,2 ekvivalenta). Ohranjamo temperaturo 0 °C

približno 30 minut, nato mešamo pri sobni temperaturi 16 ur. Sledi še ekstrakcija in

čiščenje produkta. Reakcijski zmesi po koncu reakcije dodamo etilacetat (35 ml), filtriramo

preko Büchnerjevega lija in spiramo z etilacetatom. Organsko fazo nato spiramo z vodo

(30 ml) in z nasičeno raztopino NaCl (30 ml) ter posušimo z Na2SO4.

Produkta nismo uspeli izolirati in dokazati z analitskimi tehnikami, zato smo sklepali, da

reakcija ni potekla.


29

4.4. Sinteza spojin 12a-g - [derivati gvanidina]

1. stopnja sinteze:

Spojina 10a: R = -H

Spojina 10b: R = -OCH3

Postopek:

Reakcijo izvajamo v brezvodnih pogojih, zato bučko predhodno prežarimo in prepihamo z

argonom. Bis(triklorometil)karbonat (BTC ali trifosgen; 3,37 mmol; 1 g) raztopimo v

CH2Cl2 (10 ml), nato pa raztopino kapljamo v zmes topil DMF/ClCH2 CH2Cl (5 ml/3,6 ml)

na ledu. Mešamo 20 minut, nato led odstranimo. Pustimo, da se reakcijska zmes segreje na

sobno temperaturo in mešamo še vsaj pol ure, da nastane Vilsmeierjev reagent.

(5-metoksi-) o-hidroksiacetofenon (3 mmol) v dikloroetanu (5 ml) dodajamo mešanici pri

0-5 °C, nastalo zmes pa nato segrejemo do sobne temperature. Po končani reakciji

(spremljamo jo s TPK - uporabimo mešanico topil etilacetat, cikloheksan in ocetna kislina,

v razmerju 50:50:1), vsebino bučke zlijemo na zmes led – voda in mešamo 1-1,5 ure

(lahko tudi čez noč).

OPOMBA! Reakcija pri nesubstituiranih o-hidroksiacetofenonih poteče v nekaj minutah,

če zmes segrejemo do temperature 40-50 °C. Segrevanja pa ne smemo izvajati pri

substituiranih derivatih acetofenona.

Organsko in vodno fazo ločimo, pri tem pa shranimo organsko fazo, saj se v njej nahaja

produkt. Vodno fazo speremo z dikloroetanom (2 X 25 ml). Združene organske faze nato

speremo z 10 % NaHCO3 (aq.) (2 X 25 ml) in nasičeno raztopino NaCl (3 X 25 ml).

Topilo odstranimo na rotavaporju in če je potrebno, produkt očistimo s kolonsko

kromatografijo (etilacetat/heksan = 2/1).


30

4-okso-4H-kromen-3-karbaldehid (10a)

Izgled Belo rumeni kristali

Molekulska formula C10H6O3




1H NMR (400 MHz,

CDCl3)

δ (ppm) 7,52-7,57 (m, 2H, Ar-H), 7,69-7,73 (m, 1H, Ar-H), 8,32

(d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 8,54 (s, 1H, CH), 10,40 (s, 1H, CH=O)

Izmerjeni spekter se ujema s podatki v literaturi [36].


ESI-HRMS Izračunana vrednost [M+H

+] (m/z): 175.0395

Izmerjena vrednost (m/z): 175.0390

6-metoksi-4-okso-4H-kromen-3-karbaldehid (10b)

Izgled Belo rdeči kristali

Molekulska formula C11H8O4




1H NMR (400 MHz,

CDCl3)

δ (ppm) 3,95 (s, 3H, OCH3), 7,33-7,36 (m, 1H, CH), 7,49 (d, J =

4,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,67 (d, J = 3,3 Hz, 1H, Ar-H), 8,56 (s, 1H, Ar-

H), 10,43 (s, 1H, CH=O)

Izmerjeni spekter se ujema s podatki v literaturi [36].



+] (m/z): 205.0501



31

2. stopnja sinteze:

Spojina 10a: R = -H Spojina 11a: R = -H

Spojina 10b: R = -OCH3 Spojina 11b: R = -OCH3

Postopek:

Reakcijo izvajamo v brezvodnih pogojih, v argonovi atmosferi. Kromon (1 g; spojina 10a

ali 10b) in cianogvanidin (1,5 ekvivalenta) raztopimo v brezvodnem EtOH (20 ml). K

reakcijski zmesi dodamo še KOH (2,85 ekvivalenta), nato pa segrevamo ob vrenju 4 ure

(100 – 120 °C). Po končani reakciji, reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo in

zlijemo na zdrobljeni led ter nevtraliziramo z ocetno kislino. Odparimo topila in produkt

očistimo s kolonsko kromatografijo (etilacetat/heksan = 3/1 → etilacetat/metanol = 8/1).

N-(5-(2-hidroksibenzoil)pirimidin-2-il)karbamid (11a)

Izgled Rumeni kristali

Molekulska formula C12H8N4O2



Rf (mobilna faza) 0,12 (etilacetat/heksan = 2/1; močno rumeno obarvana lisa)

1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 5,34 (bs, 1H, OH ali NH), 6,89-6,96 (m, 2H, Ar-H),

7,31-7,40 (m, 1H, Ar-H), 8,41 (s, 2H, Ar-H), 10,35 (bs, 1H, OH

ali NH)

Tališče 205-208 °C (V literaturi [40]: 207 °C)


+] (m/z): 241.0726


N-(5-(2-hidroksi-5-metoksibenzoil)pirimidin-2-il)karbamid (11b)






1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 3,70 (s, 3H, OCH3), 6,82-6,83 (m, 1H, Ar-H), 6,86-6,88

(m, 1H, Ar-H), 6,96-6,99 (m, 1H, Ar-H), 8,41 (s, 2H, Ar-H), 9,74

(s, 1H, OH), 11,97 (s, 1H, NH)

HPLC Rt = 13,433 min (čistost = 97,0 %)

Tališče nad 300 °C


+] (m/z): 271.0831



32

3. stopnja sinteze –KLASIČEN POSTOPEK:

Spojina Strukturna formula

12a

12b

12g

Postopek:

Bučko prežarimo in jo prepihamo z argonom. Reakcijo izvajamo v argonovi atmosferi. V

bučko natehtamo derivat pirimidina (200 mg; spojina 11a ali 11b), nato dodamo anilin (1,1

ekvivalenta; spojina 12a: 4-fluoroanilin, spojina 12b: 4-metoksianilin, spojina 12g:

morfolin), izopropanol (3 ml) ter koncentrirano HCl (0,3 ekvivalenta; 126μL). Ob vrenju

segrevamo 1 uro. Po končani reakciji zmes ohladimo ter filtriramo z odsesavanjem. Na

koncu produkt očistimo s kolonsko kromatografijo (etilacetat/heksan = 3/1 →

etilacetat/metanol = 8/1).

Spojine 12g nismo uspeli izolirati in identificirati.


33

1-(4-fluorofenil)-2-(5-(2-hidroksibenzoil)pirimidin-2-il)gvanidin (12a)


Molekulska formula C18H14FN5O2




1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 6,94-6,99 (m, 2H, Ar-H), 7,15-7,19 (m, 2H, Ar-H), 7,40-

7,46 (m, 2H, Ar-H), 7,53 (s, 2H, Ar-H), 8,02 (bs, 2H, gvanidin-H),

8,72 (s, 2H, Ar-H), 9,85 (bs, 2H, OH in gvanidin-H)

13C NMR (100 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 115,3 (d, 2JC,F = 22.2 Hz); 116,7; 119,3; 121,4; 123,4 (d,

3JC,F = 8.2 Hz); 124,5; 130,3; 133,3; 141,4; 156,2; 156,3; 158,2 (d,

1JC,F = 239.8 Hz); 159,0; 166,5; 192,7


Tališče 220-223 °C


+] (m/z): 352.1210


1-(4-metoksifenil)-2-(5-(2-hidroksibenzoil)pirimidin-2-il)gvanidin (12b)






1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 6,94-6,99 (m, 2H, Ar-H), 7,15-7,19 (m, 2H, Ar-H), 7,40-

7,46 (m, 2H, Ar-H), 7,53 (s, 2H, Ar-H), 8,02 (bs, 2H, gvanidin-H),

8,72 (s, 2H, Ar-H), 9,85 (bs, 2H, OH in gvanidin-H) 13

C NMR (100 MHz,

DMSO- d6)

δ (ppm) 55,2; 114,1 (2xC); 116,6; 119,3; 120,9; 124,1; 124,5;

130,2; 133,2; 155,9; 156,3; 156,9; 158,9; 164,4; 166,7; 192,6


Tališče 186-188°C


+] (m/z): 364.1410



34

3. stopnja sinteze – POSTOPEK Z MIKROVALOVKO:

Spojina Strukturna formula

12a

12b

12c

12d

12e

12f


35

Postopek:

V epruveto za mikrovalovni reaktor natehtamo pirimidin (200 mg; spojina 11a ali 11b) in

anilin (1,1 ekvivalenta, spojina 12a: 4-fluoroanilin, spojina 12b in 12c: 4-metoksianilin,

spojina 12d: anilin, spojina 12e: triptamin, spojina 12f: sulfonilamid), nato pa reakcijsko

zmes postavimo na led in po kapljicah dodajamo še TMS-Cl (0,916 mmol; 117μl). Na

koncu zmesi dodamo acetonitril (1-3 ml).

Na mikrovalovki nastavimo metodo z naslednjimi pogoji:

Medij: CH3CN

Moč: 50 - 100 W

Pritisk: 15 bar

Temperatura: 160 °C

Čas segrevanja: 3 minute

Čas vzdrževanja temperature: 12 minut

Po 12 minutah se sistem začne ohlajati. Ohladimo do približno 60 °C. Reakcijski zmesi

dodamo izopropanol (POZOR! Pri odpiranju epruvete je potrebna dodatna previdnost, saj

je v njej še vedno lahko velik tlak!). Epruveto nato zapremo in stresamo 10 sekund. V

mikrovalovnem reaktorju ponovno segrejemo do 125 °C in pustimo, da reakcija poteka 30

sekund. Po končani reakciji produkt očistimo s kolonsko kromatografijo (etilacetat/heksan

= 3/1 → etilacetat/metanol = 8/1).

Spojin 12e in 12f nismo uspeli izolirati in identificirati.


36

1-(4-fluorofenil)-2-(5-(2-hidroksibenzoil)pirimidin-2-il)gvanidin (12a)


Molekulska formula C18H14FN5O2




1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 6,94-6,99 (m, 2H, Ar-H), 7,15-7,19 (m, 2H, Ar-H), 7,40-

7,46 (m, 2H, Ar-H), 7,53 (s, 2H, Ar-H), 8,02 (bs, 2H, gvanidin-

H), 8,72 (s, 2H, Ar-H), 9,85 (bs, 2H, OH in gvanidin-H)

13C NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 115,3 (d, 2JC,F = 22.2 Hz); 116,7; 119,3; 121,4; 123,4 (d,

3JC,F = 8.2 Hz); 124,5; 130,3; 133,3; 141,4; 156,2; 156,3; 158,2

(d, 1JC,F = 239.8 Hz); 159,0; 166,5; 192,7




+] (m/z): 352.1210


1-(4-metoksifenil)-2-(5-(2-hidroksibenzoil)pirimidin-2-il)gvanidin (12b)






1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 6,94-6,99 (m, 2H, Ar-H), 7,15-7,19 (m, 2H, Ar-H), 7,40-

7,46 (m, 2H, Ar-H), 7,53 (s, 2H, Ar-H), 8,02 (bs, 2H, gvanidin-

H), 8,72 (s, 2H, Ar-H), 9,85 (bs, 2H, OH in gvanidin-H) 13

C NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 55,2; 114,1 (2xC); 116,6; 119,3; 120,9; 124,1; 124,5;

130,2; 133,2; 155,9; 156,3; 156,9; 158,9; 164,4; 166,7; 192,6




+] (m/z): 364.1410


1-(4-metoksifenil)-2-(5-(2-hidroksi-5-metoksibenzoil)pirimidin-2-il)gvanidin (12c)





Rf (mobilna faza) 0,54 (etilacetat/metanol = 5/1)

1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 3,84 (s, 3H, OCH3), 3,88 (s, 3H, OCH3), 7,01-7,09 (m,

4H, Ar-H), 7,16-7,19 (m, 2H, Ar-H), 7,48-7,50 (m, 2H, Ar-H),

8,13 (bs, 2H, gvanidin-H), 8,83 (s, 2H, Ar-H), 9,85 (bs, 2H, OH

in gvanidin-H)

13C NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 55,2; 55,6; 102,2; 108,7; 115,1; 116,7; 121,0; 124,2;

124,5; 130,9; 131,2; 141,0; 155,1; 156,0; 157,0; 157,3; 158,7;

167,0; 190,7



37



+] (m/z): 391.1515


1-fenil-2-(5-(2-hidroksi-5-metoksibenzoil)pirimidin-2-il)gvanidin (12d)






1H NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 3,72 (s, 3H, OCH3), 6,90-6,92 (m, 2H, Ar-H), 7,03-7,08

(m, 2H, Ar-H), 7,31-7,35 (m, 2H, Ar-H), 7,45-7,47 (m, 2H, Ar-

H), 8,04 (bs, 2H, gvanidin-H), 8,72 (s, 2H, Ar-H), 9,54 (bs, 2H,

OH in gvanidin-H)

13C NMR (400 MHz,

DMSO-d6)

δ (ppm) 55,5; 111,0; 113,6, 117,7; 118,5; 119,7; 121,3; 123,1;

124, 8; 128,8; 139,0; 149,8; 151,6; 152,0; 156,1; 157,5; 159,0;

164,9; 166,7; 192,1




+] (m/z): 364.1396



38

4.5. Čiščenje končnih spojin in priprava na biološka testiranja

Produkte smo očistili na dva načina, in sicer s prekristalizacijo ali pa s kombinacijo

kolonske kromatografije in prekristalizacije.

Slednjo smo izvajali v diklorometanu, saj so bile spojine v njem dobro topne. Ko se je ves

produkt raztopil, smo začeli dokapavati zmes dietiletra in petroletra (približno 2:1 oziroma

po občutku). V večini primerov je bil petroleter tisti, ki je povzročil izpad kristalov.

Po sušenju spojin v vakuumu smo v aseptični komori v manjše epice natačno zatehtali naše

spojine in na ta način tako pripravili vzorce za biološka testiranja.


39

5. Rezultati in razprava

5.1. Razlaga sinteznih postopkov

Načrtovanje nove sintezne poti za spojino A, odkrito z virtualnim rešetanjem, in njenih

analogov, je potekalo po več različnih poteh. V sledeči shemi so strnjeni neuspešni poskusi

sinteze antagonistov TLR4 (slika 8).

Slika 8: Shema neuspelih sinteznih poti.


40

Sprva smo se torej lotili sinteze s pomočjo Grignardovih reagentov (sintezna pot 1).

Značilnost te sintezne poti so absolutno brezvodni pogoji v prvem delu reakcije, saj le ti

zagotavljajo uspešnost reakcije. Grignardovi reagenti so namreč izjemno močne baze in

reagirajo z vsako spojino, ki v svoji strukturi vsebuje vodikov atom vezan na

elektronegativni element, kot so kisik, dušik in žveplo. Taka spojina je tudi voda, ki v

prisotnosti baz deluje kot šibka kislina, zato bi nastali Grignardov reagent sproti

hidroliziral [37, 38].

Ideja sintezne poti je bila, da tvorimo C-C vez med 2-aminopirimidin-5-karbaldehidom in

substituiranim benzenovim obročem v obliki zgoraj omenjenega reagenta. Pri tem tvorimo

hidroksimetilenski mostiček med obema aromatskima obročema. Dalje bi dogradili

strukturo s substituiranim gvanidinskim delom, na koncu pa bi sledila še oksidacija

hidroksilne skupine na metilenskem motičku do karbonilne.

Prvi del reakcije izvajamo v brezvodnem THF, kjer pride do adicije C-nukleofila

(Grignardov reagnet) na elektrofilni ogljik karbonilne skupine 2-aminopirimidin-5-

karbaldehida. Nastala struktura je sol alkohola (ROMgBr), ki jo v drugem delu reakcije

pretvorimo v alkohol z dodatkom protona ali vode (slika 9) [37, 38].

Slika 9: Mehanizem reakcije Grignardovih reagentov s ketoni (R', R≠H) in aldehidi (R ali R'=H)

[povzeto po 37 in 38].

Sintezno pot smo zaradi neuspele izolacije produkta in težavne sinteze opustili.


41

Gvanidinske derivate smo nato poskusili sintetizirati preko tvorbe tiosečnin (sintezna pot

2) [reakcija povzeta po 39 in 40].

Benzoil klorid spada v skupino kislinskih halidov, ki so zelo reaktivne substance, saj halidi

predstavljajo zelo dobro izstopajočo skupino. V reakciji z amonijevim tiocianatom reagira

kot elektrofil, ki je dovzeten za napad tiocianatne skupine. Tako nastane benzoil

izotiocianat, ki mu dodamo 2-aminopirimidin. Slednji reagira kot nukleofil, ki napade

ogljik nastalega izotiocianata in tako se tvori derivat tiosečnine (N-(pirimidin-2-

ilkarbamotiol)benzamid, spojina 2). Ta je v bazičnem mediju zelo nestabilen in v naslednji

stopnji sinteze hidrolizira, odcepi se benzoilni fragment. V 3. stopnji s pomočjo svinčevega

(II) acetata odstranimo žveplo iz molekule, pri tem pa se tvorita ocetna kislina in PbS.

Slednjega nato enostavno odnučamo iz reakcijske zmesi, saj gre za črn prah netopen v

vodnem mediju. V zadnji stopnji ponovno dodamo nukleofil (4-fluoroanilin), ki napade

elektrofilni ogljik ciano skupine, in tako smo dobili končni produkt. Zaradi slabega

izkoristka reakcije in zaradi težav z izolacijo spojine, smo tudi to sintezno pot zaključili.

Tudi pri naslednji sintezni poti smo izhajali iz tiosečnin (sintezna pot 3) [reakcija povzeta

po 41 in 42].

Tokrat smo izhajali iz tiosečnine, ki smo jo v 1. stopnji zaščitili obliki terc-butilkarbamata

(Boc) na eni izmed amino skupin v molekuli. Tako smo v nadaljnjih stopnjah usmerili

reakcijo le na en dušikov atom. Za tvorbo aniona na dušiku in s tem aktivacijo za reakcijo z

Boc2O, smo uporabili NaH. Ta je eksploziven v stiku z vodo, zato uporabimo brezvoden

THF kot medij za reakcijo. Kljub nižjemu ekvivalentu dodanega Boc2O pa smo dobili

derivate z dvema zaščitenima aminskima skupinama ter posledično izjemno slab izkoristek

te stopnje sinteze. Nastali Boc-tiosečnini smo v 2. stopnji nato dodajali različne nukleofile

(2-aminopirimidin ter 4-fluoroanilin). Ugotovili smo, da vrstni red dodajanja nukleofilov

nima bistvenega vpliva na izkoristke reakcij. V tej stopnji ponovno za aktivacijo

uporabimo NaH. Za odstranitev prebitka Boc2O v reakcijsko zmes dodamo TFAA. V 3.

stopnji dodamo 2-aminopirimidin ali 4-fluoroanilin v DMF, da dobimo spojino 9. Trietil

amin uporabimo kot šibko bazo, ki iz reakcijske zmesi odstrani kisel H+, HgCl2 pa S

2- v

obliki HgS [42].

Tudi ta sintezna pot je bila neuspešna zaradi težavne izolacije produktov ter predvsem

izjemno slabih izkoristkov v vseh stopnjah sinteze.


42

Za sintezo končnih spojin in potencialnih antagonistov TLR4 smo na koncu izbrali

tristopenjski sintezni postopek (slika 10), kjer izhajamo iz derivatov 2-hidroksiacetofenona,

ki ga v 1. stopnji sinteze pretvorimo v derivate 3-formilkromona [postopek povzet po 36,

43-45].

Sinteza poteka preko nastanka t.i. Vilsmeierjevega reagenta (slika 11), ki nastane iz

trifosgena (BTC) in DMF, nato pa v naslednjem koraku dodamo še acetofenon, ki reagira z

Vilsmeierjevim reagentom [36, 46].

Slika 10: Shema sintezne poti derivatov gvanidina kot antagonistov TLR4.


43

Slika 11: Mehanizem nastanka Vilsmeierjevega reagenta. [povzeto po 36 in 46].

Tukaj sicer ne gre za klasično sintezo zgoraj omenjenega reagenta s pomočjo POCl3,

vendar mehanizem reakcije ostaja enak tudi pri uporabi BTC. Oba sta donorja kloridnih

atomov in omogočata, da v brezvodnih pogojih iz DMF nastane elektrofilni iminijev kation,

ki nato reagira z acetilno skupino 2-hidroksiacetofenona. Skupaj tako tvorita 3-

formilkromon (slika 12). Pri reakciji z BTC lahko nastaja strupen plin fosgen, zato je

potrebna dodatna previdnost pri izvajanju reakcije.

Slika 12: Mehanizem reakcije nastanka 3-formilkromona, produkta 1. stopnje sinteze [povzeto po 36].

Po tej poti smo sintetizirali 3-formilkromon (spojina 10a) in njegov derivat z metoksi

skupino na mestu 6 (spojina 10b). Dobili smo dobre izkoristke reakcij, 85 % za metoksi

derivate in 95 % za nesubstituirani 3-formilkromon.

V 2. stopnji sinteze cianogvanidin deluje kot dinukleofil, saj naprej ena primarna amino

skupina napade aldehidno skupino, druga pa napade elektrofilni ogljik kromonskega

obroča. Slednji se posledično odpre in poteče ciklokondenzacija do nastanka

pirimidinskega obroča s pripeto cianamidno skupino (slika 13).


44

Slika 13: Mehanizem 2. stopnje sinteze gvanidinskih derivatov – reakcija cianogvanidina in 3-

formilkromona [povzeto po 36, 47 in 48].

Vrstni red nukleofilnih napadov amino skupin ni povsem razjasnjen, vendar pa produkt

reakcije ostaja enak. Hkrati je možna tudi pretvorba 3-formilkromona v 2-(2-

hidroksibenzoil)malonilaldehid, ki še olajša nukleofilni napad [46, 49].

Med produktoma 11a in 11b ni bilo videti bistvenih razlik v poteku reakcije. Izkoristka

reakcij sta bila visoka (70 in 95 %), razliko lahko pripišemo slabši izolaciji z ekstrakcijo in

kolonsko kromatografijo, reagentom ali pa različnim pogojem v času izvedbe reakcij. Zelo

pomembno je zagotoviti brezvodne pogoje, ki lahko močno vplivajo na potek reakcije.

3. stopnja sinteze je nukleofilna adicija amina na reaktivno ciano skupino produkta 2.

stopnje sinteze. Tukaj smo uporabili dve možni poti: klasičen postopek in postopek v

mikrovalovnem reaktorju. Obe reakciji potekata v brezvodnih pogojih, kar zagotavlja

učinkovitejši potek reakcij.

Pri prvem postopku smo s koncentrirano HCl aktivirali omenjeno ciano skupino, nato

dodali amin (derivati anilina). Za ustavitev reakcije smo uporabili izopropanol.

Pri postopku z mikrovalovnim reaktorjem reakcija poteka v acetonitrilu po nekoliko

drugačnem mehanizmu kot pri klasičnem postopku. Tukaj za aktivacijo ciano skupine

uporabimo TMS-Cl, ki ne le aktivira cianamid, ampak predstavlja tudi vir brezvodnega

HCl (slika 14). Na aktivirano ciano skupino v naslednjem koraku poteče nukleofilna

adicija izbranega amina (v našem primeru derivati anilina) in tako dobimo gvanidinski

derivat oziroma končne spojine tristopenjske sinteze. Na koncu dodamo izopropanol, ki

veže sproščeni Me3SiH [postopek povzet po 44].

Slika 14: Mehanizem delovanja TMS-Cl in nukleofilna adicija v tretji stopnji sinteznega postopka.

[povzeto po 44].


45

Pri načrtovanju sintezne poti smo tako uporabili dva možna postopka za 3. stopnjo.

Odločili smo se, da spojini 12a in 12b sintetiziramo po obeh ter tako primerjamo

enostavnost, čas izvedbe ter izkoristke obeh reakcij. Izkazalo se je, da je klasični postopek

bolj učinkovit, saj so izkoristki reakcij več kot dvakrat višji. 12a smo sintetizirali s 95 %

izkoristkom po klasičnem postopku in 42 % z uporabo mikrovalov, 12b pa s 76 %

izkoristkom po klasičnem postopku in 36 % z uporabo mikrovalov. Čas poteka reakcij gre

sicer v prid postopku z mikrovalovnim reaktorjem, vendar je krajši le za približno pol ure,

prav tako v obeh primerih sledi čiščenje s kolonsko kromatografijo, tako da je nesmiselno

govoriti o prednosti krajšega poteka reakcije. Tudi glede enostavnosti izvedbe sta si oba

postopka približno ekvivalentna, uporaba reagentov pa ni povzročala večjih težav. Za oba

postopka velja, da temeljita na nukleofilnem napadu amino skupine derivata anilina na

ogljikov atom ciano skupine. Razlikujeta se v viru HCl (HCl ali TMS-Cl) in količini

dodanega 2-propanola, ki pri klasičnem postopku hkrati predstavlja medij za potek reakcije

in pa tudi reagent, ki zaključi reakcijo. Kot topilo pri drugem postopku je uporabljen

acetonitril. Temperatura refluksa je približno 90 °C, v mikrovalovnem reaktorju pa je ta

precej višja (160 °C), kar je tudi lahko razlog za nastanek stranskih produktov in slabše

izkoristke. Tukaj je potrebno upoštevati tudi visok tlak, ki nastane v epruveti, ko

segrevamo reakcijsko zmes z mikrovalovi.

Po pregledu rezultatov obeh sintez in primerjavi izkoristkov, smo se odločili, da tudi

spojino 12g sintetiziramo po klasičnem postopku, saj smo izhajali iz relativno male

količine izhodne spojine (spojina 11b). Sinteza se sicer ni izkazala za uspešno, saj nismo

uspeli izolirati produkta. Reakcijsko zmes je namreč sestavljalo ogromno število produktov,

kar smo opazili kot prisotnost številnih lis na TPK kromatogramu. Pri tem pa nismo mogli

zagotovo potrditi, če je nastala želena spojina 12g, ki vsebuje morfolinski obroč. Ravno ta

je lahko razlog, da reakcija ni uspešno potekla, saj gre tokrat za sekundarni in ne aromatski

amin.

Sledile so še sinteze spojin 12c, 12d, 12e in 12f v mikrovalovnem reaktorju, pri čemer sta

uspeli le prvi dve. Pri vseh smo izhajali iz N-(5-(2-hidroksi-5-metoksibenzoil)pirimidin-2-

il)karbamida (spojina 11b), na katerega smo pripenjali različne substituente (4-

metoksianilin pri spojini 12c, anilin pri 12d, triptamin pri 12e in 4-aminobenzensulfonamid

pri 12f). Metoksi skupina 4-metoksianilina zviša nukleofilnost spojine, a je kljub temu

izkoristek reakcije z anilinom precej višji (94 % v primerjavi s 55 % 4-metoksianilina).


46

Triptamin je monoaminski alkaloid, sestavljen iz indolnega obroča s pripeto 1-aminoetilno

skupino na mestu 3. V strukturi je torej primarni amin, za katere je značilna nukleofilna

adicija na ketone in aldehide (pri naših spojinah je prisotna keto skupina). Pri tem nastane

karbinolamin, ki po odcepu vode vodi do nastanka t.i. Schiffovih baz oziroma iminov. To

je lahko eden od razlogov nastanka številnih stranskih produktov in neučinkovitost reakcije.

Podobne težave so se pojavile tudi pri sintezi spojine 12f, kjer je bila prisotna kisla

sulfonamidna skupina, ki je verjetno vplivala na potek sinteze [50].

Oba reakcijska postopka 3. stopnje sinteze bi bilo potrebno optimizirati, da bi bile uspešne

tudi sinteze z alifatskimi amini, saj ti omogočajo večje strukturne spremembe pri končnih

spojinah, kar bi lahko vplivalo tudi na jakost delovanja.

5.2. Rezultati bioloških testiranj

V sodelovanju z Zavodom za transfuzijsko medicino v Ljubljani smo ovrednotili delovanje

sintetiziranih spojin kot potencialnih antagonistov TLR4, za kar smo si prizadevali tekom

našega dela. Spojinam 12a, 12b, 12c ter 12d smo najprej preverili topnost v DMSO in

celičnem mediju. Spojina 12a je bila pri koncentracijah nad 100 μM zelo slabo topna in se

je obarjala v celičnem mediju, medtem ko pri ostalih treh težav s topnostjo ni bilo zaznati.

Problem netopnosti spojin je, da je koncentracija spojin v raztopini vedno nižja od

pričakovane in zato so vsi nadaljnji rezultati zavajajoči. Poleg tega sami kristali spojine

lahko motijo testiranje ali pa mehansko poškodujejo celice, zaradi česar lahko dobimo

lažno pozitivne oziroma lažno negativne rezultate, tako citotoksičnosti kot tudi

antagonistične aktivnosti. Po določanju topnosti smo spojinam z MTS testom preverili

morebitno citotoksičnost na celični liniji HEK 293. Test temelji na določanju živih celic,

saj so le te sposobne substrat pretvarjati v produkt, ki ga spektrofotometrično ovrednotimo.

Ugotovljeno je bilo, da so vse zgoraj naštete končne spojine necitotoksične pri

koncentracijah pod 50 μM. V primerjavi z negativno kontrolo (celice v DMSO) se pri tej

koncentraciji izmerjena absorbanca namreč ni bistveno zmanjšala, kar nam potrjuje

prisotnost številnih živih celic. Na koncu je sledilo še določevanje antagonističnega

delovanja spojin na TLR4, kjer smo uporabili celično linijo HEK-BlueTM-hTLR4, ki

selektivno izraža TLR4. Ob prisotnosti antagonistov teh receptorjev pride do zaviranja

izražanja reporterskega gena in sinteze alkalne fosfataze, kar v mediju zaznamo kot

znižanje absorbance. Analizna poročila za spojini 12a, 12c in 12d so bila dvoumna, saj so


47

se rezultati paralelnih vzorcev preveč razlikovali in je bilo sipanje preveliko, da bi lahko

določili IC50 vrednost. Razlog za tako različne rezultate je verjetno predvsem velika

variabilnost pri gojenju in zrelosti celic. Prav tako ostaja sum, da tudi v uporabljenem

koncentracijskem območju (pod 50 μM), celice niso povsem necitotoksične. Opazili smo

tudi, da je prišlo do nespecifične inhibicije celične rasti (predvsem pri spojini 12d), kar

prav tako vpliva na znižanje absorbance in daje lažno pozitivne rezultate. Spojini 12b smo

določili IC50 vrednost 27 μM, kar je malo višje kot pri spojini A, odkriti z virtualnim

rešetanjem, ki smo jo uporabili za primerjavo.

Če povzamemo rezultate in jih primerjamo s spojino A, lahko rečemo le to, da metoksi

skupina na mestu 5 prvega aromatskega obroča prispeva malo, a ne dosti k boljšem

antagonističnem delovanju (po primerjavi IC50 obeh spojin). V prihodnosti bi bilo potrebno

sintetizirati še nekaj spojin, ki bi dale več uporabnih informacij glede odnosa med strukturo

in antagonističnim delovanjem na TLR4.


48

6. Sklep

V okviru magistrske naloge smo načrtovali sintezno pot, po kateri smo sintetizirali različne

derivate gvanidina (analoge spojine zadetka iz virtualnega rešetanja - spojina A), katerim

smo določili antagonistično delovanje na Toll-u podobnem receptorju 4. Glede na naš

namen dela smo:

a) Uspešno postavili sintezno pot za pripravo derivatov spojine A, ki ima dokazano

antagonistično delovanje na TLR4.

b) Po izbrani trostopenjski sintezni poti smo uspešno sintetizirali 4 končne spojine (12a,

12b, 12c in 12d).

c) Sintetiziranim spojinam smo preverili topnost in citotoksičnost na celični liniji HEK

293 ter določili antagonistično delovanje na TLR4. Spojine 12b, 12c in 12d so bile

topne pri koncentracijah pod 250 μM, spojina 12a pa zgolj pri koncentracijah nižjih od

100 μM. Vse spojine so bile necitotoksične pri koncentracijah nižjih od 50 μM,

Antagonistično delovanje smo dokazali le pri spojini 12b, določili smo ji IC50 vrednost

27 μM. Ostale spojine pa so imele nespecifično delovanje ali pa je bila variabilnost

dobljenih rezultatov prevelika, da bi lahko določili IC50 vrednosti.

d) Na podlagi dobljenih rezultatov lahko zaključimo, da substitucija prvega aromatskega

obroča z metoksi skupino le malo vpliva na izboljšanje antagonističnega delovanja.

Za zaključek lahko povzamemo, da so potrebne nekatere optimizacije sinteznega postopka,

da bi lahko sintetizirali tudi bolj strukturno različne derivate gvanidina, predvsem pa v

sintezo vključili alifatske in ne le aromatske amine. Morali bi uvesti tudi določene

strukturne spremembe na spojinah, pri tem mislimo predvsem na keto in gvanidinsko

skupino, saj bi s tem najbrž znižali toksičnost za človeške celice in prav tako vplivali na

jakost in selektivnost antagonističnega delovanja na TLR4.


49

7. Literatura

1. Berg J.M., Tymoczsko J.L., Stryer L.: Biochemistry, 6.izdaja, W.H. Freeman and

Company, New York, 2007: 945-947.

2. Vozelj M.: Temelji imunologije, 1. izdaja, DZS d.d., Ljubljana, 2000: 2-9, 12-14, 381-

382.

3. Goldman A.S., Prabhakar B.S.: Medical microbiology, 4. izdaja, Galveston (TX):

University of Texas Medical Branch at Galveston, 1996: poglavje 1: Immunology

overview – Evolution of immune system. Na voljo 9.2.2014 ob 16:47 na internetni

strani http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7795/.

4. Leon C.G., Tory R., Jia J., Sivak O., Wasan K.M.: Discovery and Development of Toll-

Like Receptor 4 (TLR4) Antagonists: A New Paradigm for Treating Sepsis and Other

Diseases. Pharmaceutical Research 2008; 25 (8): 1751-1761.

5. Yamamoto M., Takeda K.: Current Views of Toll-Like Receptor Signaling Pathways.

Hindawi Publishing Corporation, Gastroenterology Research and Practice, vol. 2010,

Article ID 240365, 8 strani.

6. Savva A., Roger T.: Targeting Toll-like receptors: promising therapuetic strategies

for the management of sepsis-associated pathology and infectious diseases. Frontiers

in immunology 2013; 4 (387).

7. Lennarz W.J., Lane M.D.: Encyclopedia of Biological Chemistry, 1. izdaja, Elsevier

Inc., Oxford, UK, 2004: 190-194.

8. Pattern Recognition Receptors. R&D Systems, Tools for Cell Biology Research. Na

voljo 5.2. 2014 ob 18:32 na internetni strani

http://www.rndsystems.com/Resources/Images/26231.pdf

9. Kawai T., Akira S.: Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate

Receptors in Infection an Immunity. Immunity 2011; 34 (5): 637-650.

10. Brunette R.L., Young J.M.: Extensive evolutionary and functional diversity among

mammalian AIM2-like receptors. The Journal of Experimental Medicine 2012; 209

(11): 1969-1983.

11. Bone R.C.: Gram-Negative Sepsis: a Dilemma of Modern Medicine. Clinical

Microbiology Reviews 1993; 6 (1): 57-68.


50

12. Agonistic and Antagonistic Effects of LPS on TLR4. InvivoGen Insight, Maj/Junij

2007. Na voljo dne 26.2.2014 ob 19:56 na internetni strani

http://www.invivogen.com/docs/Insight200705.pdf

13. Saitoh S., Akashi S., Yamada T. et al.: Lipid A antagonist, lipid IVa, is distinct from

lipid A in interaction with Toll-like receptor 4 (TLR4)-MD-2 and ligand-induced TLR4

oligomerization. International Immunology 2004; 16 (7), 961-969.

14. Teghanement A., Zhang D., Levis E.N., Weiss J.P.: Molecular Basis of Reduced

Potency of Underacylated Endotoxins. The Journal of Immunology 2005; 175, 4669-

4676.

15. Lever A,, Mackenzie I.: Sepsis: definition, epidemiology, and diagnosis. British

Medical Journal 2007; 335 (7625); 879-883.

16. Hunter P.: Sepsis under siege: A new understanding of sepsis might lead to the

development of therapies to treat septic shock. EMBO reports 2006; 7 (7): 667-669.

17. Claessens Y.E., Dhainaut J.F.: Diagnosis and treatment of severe sepsis. Critical Care

2007, 11 (5): S2.

18. Chou K.-C., Elrod D.W.: Prediction of Membrane Protein Types and Subcellular

Locations. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 1999; 34 (1); 137-153.

19. Lewis S.S., Hutchinson M.R., Zhang Y., Hund D.K.: Glucoronic acid and the ethanol

metabolite ethyl-glucoronide cause toll-like receptor 4 activation and enhanced pain.

Brain, Behavior, and Immunity 2013; 30: 24-32.

20. Švajger U., Brus B.: Novel toll-like receptor 4 (TLR4) antagonists identified by

structure and ligand based virtual screening. European Journal of Medicinal

Chemistry 2013; 70: 393-399.

21. Wittebole X.,Castanares – Zapatero D., Laterre P.F.: Toll-like Receptor 4 Modulation

as a Strategy to Treat Sepsis. Hindawi Publishing Corporation, Mediators of

Inflammation 2010; vol. 2010, Article ID 568396, 9 strani.

22. Visintin A., Halmen K.A., Latz E., Monks B.G.: Pharmacological Inhibition of

Endotoxin Responses Is Achieved by Targeting the TLR4 Coreceptor, MD-2. The

Journal of Immunology 2005; 175: 6465-6472.

23. Kawai T., Akira S.: TLR signaling. Nature Publishing Group 2006; 13: 816-825.

24. Janssens S., Beyaert R.: Role of Toll-like Receptors in Pathogen Recognition. Clinical

Microbiology Reviews 2003; 16 (4): 637-646.


51

25. Bevan D.E., Martinko A.J., Loram L.C., Stahl J.A.: Selection, Preparation, and

Evaluation of Small-Molecule Inhibitors of Toll-Like Receptor 4. ACS Medicinal

Chemistry Letters 2010; 1 (5): 194-198.

26. Peri F., Piazza M., Calabrese V., Damore G.: Exploring the LPS/TLR4 signal pathway

with small molecules. Biochemical Society Transactions 2010; 38(5), 1390-1395.

27. Thompson P.A., Tobias P.S., Viriyakosol S., Kirkland T.N.: Lipopolysaccharide

(LPS)-binding Protein Inhibits Responses to Cell-bound LPS. The Journal of

Biological Chemistry 2003; 278 (31), 28367-28371.

28. http://www.medchemexpress.com/product/TAK-242.html Na voljo na spletu dne

20.2.2014 ob 16:46.

29. Vilbois M.K., De Graaf K.L., Giovannoni L.S., Bosco D.: Anti-TLR4 Antibodies and

Methods of Use Thereof, US Patent Application Publication, US2012/0177648 A1,

12.julij 2012.

30. Artner D., Oblak A.: Conformationally Constrained Lipid A Mimetics for Exploration

of Structural Basis of TLR4/MD-2 Activation by Lipopolysaccharide. ACS Chemical

Biology 2013; 8, 2423-2432.

31. Maeshima N., Fernandez R.C.: Recognition of lipid A variants by the TLR4-MD-2

receptor complex. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 2013; 3 (3): 1-13.

32. Chavez S.A., Martinko A.J.: Development of ß-amino Alcohol Derivates That Inhibit

Toll-like Receptor 4 Mediated Inflammatory Response as Potential Antiseptics.

Journal of Medicinal Chemistry 2011; 54: 4659-4669.

33. http://www.paclitaxel.co.uk/ Na voljo na spletu dne 20.2.2014 ob 16:48.

34. Casar Z., Stavber G., Sova M.: Preparation of sitagliptin intermediates. European

Patent Office, WO/2012/136383, datum objave patenta 11.10.2012.

35. Vercek, B.: Vestnik Slovenskega Kemijskega Drustva 1983; 30 (1): 51-60

36. Su W.K., Li Z.H., Zhao L.Y.: One-pot synthesis of formylchromones from bis-

(trichloromethyl) carbonate/DMF. Organic Preparations and Procedures Inc., 2007; 39

(5): 495-502.

37. Graham Solomons T.W., Fryhle C.B.: Organic chemistry, 9. izdaja, John Wiley &

Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, ZDA, 2008: 527-538.

38. Fox M.A., Whitesell J.K.: Organic Chemistry, 3. izdaja, Jones and Bertlett Publishers,

Sudbury, ZDA, 2004: 400-404, 615-618.


52

39. He F.Q., Liu X.H., Wang B.L., Li Y.H., Li Z.M.: Synthesis, Structure and Biological

Activities of Some Novel N-(4,6-Disubstituted-pyrimidin-2-yl)-N'-

(trifluoromethylphenyl)-guanidine Derivates. Chinese Journal of Chemistry, 2008; 26:

1481-1485.

40. Dovlatyan V.V., Eliazyan K.A., Ghazaryan E.A., Yengoyan A.P.: Synthesis of

azinylthioureas and their heterocyclization using α-chloroacetoacetic ester. Chemistry

of Heterocyclic Compounds, 2006; 42 (3): 389-391.

41. O'Donovan D., Rozas I.: A concise synthesis of asymmetrical N,N'-disubstituted

guanidines. Tetrahedron Letters, 2011; 52: 4117-4119.

42. Katritzky A.R., Rogovoy B.V.: Recent development in guanylating agents. Arkivoc-

Archive for Organic Chemistry, 2005; 4: 49-87.

43. Randhavane P.V., Kale S.B., Jagdhani S.G., Karale B.K.: Conversion of 3-

fomylchromone into biologically important pyrimidines and pyrazoles. Indian Journal

of Heterocyclic Chemistry, 2007; 17: 153-156.

44. Sachdeva N., Dolzhenko A.V., Chui W.K.: Regioselective synthesis of pyrimido[1,2-

a][1,3,5]triazin-6-ones via reaction of 1-(6-oxo-1,6-dihydropyrimidin-2-yl)guanidines

with triethylorthoacetate: observation of an unexpected rearrangement. Organic &

Biomolecular Chemistry, 2012; 10: 4586-4596

45. Abou-Melha K.S.: Octaedral Co(II) and Ni(II) complexes of Schiff bases,

semicarbazone and thiosemicarbazone, synthesis, biological, spectral, and thermal

studies. Journal of Coordination Chemistry 2008; 61 (13): 2053-2067.

46. Shan W.G., Shi X.J., Su W.K.: Vilsmeier-Haack synthesis of aromatic aldehydes using

bis-(trichloromethyl)carbonate and dimethylformamide. Organic Preparation and

Procedures International: The New Journal of Organic Synthesis 2004; 36 (4): 337-340.

47. Plaskon A. S., Grygorenko O. O., Ryabukhin S. V.: Recyclizations of 3-

formylchromones with binucleophiles. Tetrahedron 2012; 68: 2743-2757.

48. Ali T.E., Abdel-Aziz S.A.: Synthesis and biological evaluations of a series of novel

azolyl, azinyl and azepinyl phosphonates. Heterocycles, 2013; 87 (12): 2513-2522.

49. Ibrahim M. A., Abdel-Megid Abdel-Hamed M., El-Gohary N. M.: A new approach

for the synthesis of bioactive heteroaryl thiazolidine-2,4-diones. Journal of the

Brazilian Chemistry Society 2011; 22 (6): 1130-1139.

50. McMurry J.: Organic Chemistry, 8. izdaja, Graphic World Inc., ZDA, 2012: 372-393,

405-412, 714-717.

Documents

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO ZA FARMACIJO KAJA ROŽMAN NAČRTOVANJE, SINTEZA IN VREDNOTENJE DERIVATOV GVANIDINA ... Pharmacy in Ljubljana by virtual screening of the