v. Graefes Archiv fiir Ophthalmologie 164, 289--297 (1962)

Aus dem Augenklinischen Institut der Universit/it Neapel (Direktor: Prof. A. SA~qTO~Z)

Untersuchungen iiber das Verhalten der Natriumverteilung und des Gesamtwasserinhalts bei experimentellen

Hornhautverpflanzungen Von

A. DELOGU und L. VECCHIONE* Nit 5 Textabbildungen

Zufolge der Verbesserungen der chirurgischen Technik und vor allem auf Grund der bemerkenswerten therapentisehen M6glichkeiten, fiber die wit heute verffigen, k6nnen wit in der Entwicklung des Problems der IIornhautplast ik einen bemerkenswerten neuen Impuls in der klinisehen wie aueh in der experimentellcn Forsehung beobaehten. Hierbei ist das vielleieht bedeutsamste Problem, das in bezug auf verschiedene Aspekte noeh weiterer Studien und Aufkl/~rungen bedarf, dasjenige der Faktoren, welehe die Vitalit/~t und die Durehsichtigkeit des I-Iornhautrands regeln.

Bekanntlich liefert die t Iornhaut vielleicht das einzige Beispiel in der gesamten Biologie ffir ein Gewebe, das bei Verpflanzung im Wirtsorganis- mus ohne Verlust der Transparenz und ohne Erseheinung yon Immuni- t~tserscheinungen anw/iehst, welch letztere zu einer AusstoBung des Gewebes ffihren wiirden. Unter den allergisch-immunbiologischen Er- seheinungen, die naeh einigen Autoren ziemlieh frtihzeitig - - zwisehen der ersten und dritten nachoperativen D e k a d e - - auftreten k6nnen, m/igtc man die Hauptursachen f/Jr die Beeintr/iehtigung im I-Iornhautrand und ffir dessen fortsehreitende Eintrfibung suchen. An anderer Stelle wurden bereits die Grfinde angeftihrt, auf Grund welcher wit es ffir wenig wahrscheinlieh halten, dab bier eine rein anaphylaktisehe Erkl/~rung dieser Erseheinungen maBgebend sei (SANTO?r et al. 1959); nach unserer Meinung kommt den Ern/~hrungsverh/fltnissen und der Reaktionsf/ihig- keit des Wirtsgewebes eine gr6Bere Bedeutung ffir das weitere Schicksal des verpflanzten Hornhautrandes zu. Es ist somit die Untersuchung des Zellenlebens sowohl in der /iberpflanzten t tornhaut als aueh in dem Hornhautring des Wirtes yore Standpunkt der Bioehemie gesehen, yon hervorragendstem Interesse. Besonders fiber den Stoffwechsel der fiber- pflanzten Hornhaut war his vor wenigen Jahren kaum etwas bekannt.

Erst in allerjfingster Zeit wurden - - insbesondere durch die Anwen- dung yon Methoden auf Grund der Verwendung radioaktivcr Isotopen - -

* Die Ergebnisse dieser Versuehe sind auf dem XIV. KongreB der Soeiets Toseo-Umbro-Emiliana di Oftalmologia (Gesellsehaft fiir Ophthalmologie) in Bologna am 28. Mai 1961 verOffentlicht worden.

Albrecht v. Graefes Arch. Ophthal. Bd. 164 19b

290 A. I)ELOGU und L.VEccttIONE:

mehr systematisehe Untersuehungen angestellt, die vor allem dureh die Forschungen yon DOItLMAN~ DUNNINGTON nnd SMELSEI~, NATttANIEL und LEVENE, LA TESSA u. a. angeregt worden sind.

DO~LMA~ (1957) hat die Aufnahme yon S s5 im t Iornhautrand und im t tornhautr ing des Wirtes, sowie dieAusseheidung dieses Elements aus den markierten und anschlieBend fiberpflanzten Hornhautr/~ndern stu- diert. Die yon ihm erzielten Ergebnisse haben zu der sieheren Fest- stellung gefiihrt, dab nieht nur der tIornhautr~nd, sondern aueh der I-Iornhautring des Wirtes w/~hrend der ersten naehoperativen Tagen eine starke t Ierabminderung der Aufnahme yon S a5 als Natr iumsulfat zeigen, w/~hrend sieh in den folgenden Tagen bei diesen Gewebeteilen eine Wiederzunahme der F/~higkeit bemerkbar maehte, in den Mueo- polysaeehariden das Sulfat zu synthetisieren. Augerdem haben diese Versuehe als sieher erwiesen, dab in den folgenden Tagen in dem Trans- plantar eine sehnellere Katabolisierung der Wirkstoffe stattf indet : inner- halb der ersten beiden Woehen verlieren ns die iiberpflanzten tIorn- hautr/~nder etwa 1/3 des vorhandenen Sehwefels, wghrend die normale t Io rnhaut verhs163 weniger ausseheidet und naeh der 2. Woehe bereits den normalen Ausseheidungsgrad fiir Sehwefel wiedererlangt hat. Diese Ergebnisse lassen sieh z. T. unter Bezugnahme auf die Arbeiten yon SMELSER, I-IE~aM~t~N und Love erklgren, welehe die Bedeutung des t tornhautepithels ffir den Stromastoffweehsel untersueht haben. SMEL- SER stellte lest, dag bei I~atten, denen S a5 subeutan injiziert worden war, and bei denen das t tornhautepithel an einer Stelle entfernt, an anderen Stellen belassen worden war, die Aufnahme yon Sehwefel nut in dem unterhalb der intakten Epithelsehieht, nieht aber in dem yon Epithel entbl6gten Stroma stattfand. SCHMELSER stellte lest, dab dies aueh dort zutraI, wo das Endothel der riiekw~rtigen Oberil/~ehe entfernt worden war.

Die Bedeutung des Epithels im Stoffweehsel des Stromas wird dutch die Arbeiten yon HEaaMa~N und LOVE best/~tigt. Sie haben bei Experi- menten in vitro beobaehtet, dab bei einer Bebriitung yon tIfihnerhorn- haut bei 37~ w/~hrend 1 Std auf Kulturb6den mit versehiedenen Meta- boliten - - unter anderem Glyein mit markier tem erstem C-Atom - - die Aufnahme dieser Aminos~uren nur in demjenigen Teilstroma start- finder, fiber welehem die Epithelsehieht intakt belassen wurde, w/~hrend in derjenigen Zone, welehe dem Bereieh entspraeh, in dem vor der Uberpflanzung das Epithel entfernt worden war, keine Aufnahme iest- gestellt wurde.

Diese Arbeiten bestgtigen deutlieh die Bedeutung des Epithels fiir den Stoffweehsel der Wirkstoffe und der Stromaproteine. 1-Iistologisehe Untersuehnngen fiber Hornhaut t ransplanta te seitens versehiedener Autoren, n . a . BaBeL (1945), MAUMENEE und KO~BLUETI~ (1948),

Na~riumverteilung bei experimentellen Hornhautverpflanzungen 291

KATZIN (1950) und DOI-1LMAN (1957) konnten den Beweis dafiir liefern, dai~ das Epithel des t tornhautrandes verschwindet und w~hrend der ersten nachoperativen Woche durch Zellen aus der empfangenden t torn- haut ersetzt wird; auch die Endothelzellen, die durch wahrscheinliche Sch~digungen geschwollen nEd wasserstichtig aussehen, werden ersetzt. W~hrend der ersten Woche erscheinen viele der Stromazellen angesehwol- lee und pyknotiseh.

Das Verschwinden yon Epithel ned Endothel des t tornhautrandes kann ira Lichte der obengenannten Arbeiten yon SMELSEn, ttSaRMAN und LOVE mit der Vergnderung mindestens des Anabolismus der Wirkstoffe erkl~rt werden, und zwar mit der fehlenden Aufnahme des Schwefels im Stroma des Jdornhautrandes w~hrend der ersten beiden postopera- tiven Wochen. Jedoch ]~Bt sich die gleiche Ver~nderung des Anabolis- mus in dem J_~ornhantring des Wirtes nicht auf diese Weise erkl~ren. Verschiedene Autoren, welche Gelegenheit hatten, transparente mensch- liehe Transplantate zu beobachten, haben die Meinung ge~uBert, dab bei einer erfolgreichen Operation in dem verpflanzten Hornhautrand - - mit Ausnahme der Nervenfasern - - die Kollagenfasern, die Bow- mansche Membran, Descemetsche Membran, sowie der gr56ere Tell der Zellmasse erhalten bleiben. Wenn daher das Epithel und das Endothel nicht wegfallen, und wenn der SMP-Stoffwechsel im Stroma yon den Epithel- und Endothelzellen abh~ngt, dann sind die Ver/~nderungen des Anabolismus und des SMP-Katabolismus wahr- seheinlich auf Ver~nderungen der Wirkung yon Enzymen zurfickzu- ffihren, welche dieselben synthetisieren und hydrolysieren: ATP-Sul- furilase, APS-Phosphochinase, Sulfochinase, Sulfatase und andere En- zyme; dies wiederum geschieht infolge yon Sehwankungen der Elektro- lytenkonzentration oder anderer, die genannten Enzyme aktivierender Stoffe, oder yon Schwankungen der pH-Zahl bzw. der Konzentration der erforderlichen Substrate.

Unsere derzeitigen Untersuchungen wurden zu dem Zweck durch- gefiihrt, entweder in der transplantierten Randhornhant oder in der Wirtshornhaut irgendwelehe Ver~nderungen der Natriumverteilung in bezug auf das Plasma, ned zwar 1/2 Std Each Injektion yon Isotopen aufzufinden, wobei mit verschiedenen Zeitabstiinden Each dem Zeitpunkt der Operation gearbeitet wurde und zum Vergleich die normale Horn- haul herangezogen war; gleichzeitig sollte auch der Wassergehalt der untersuchten Gewebe geprfift werden.

Hierzu wurden Kaninchen yon einem mittleren Gewicht yon etwa 2,5 kg ver- weeder. Unter Pupillenerweiterung durch Atropin nEd Each Lokalanaesthesie durch Eintr5pfehl yon 2 % iger CocainlSsung sowie retrobulb~rer Injektion yon 1 cm s ~ovocain-Adrenalin wurde eine perforierende, gekreuzte Itornhautfiberpflanzung zwischen den rechtsseitigen Augen zweier Kaninchen vorgenommen. W~hrend des Eingriffs wurde die Iris in Mydriase gehal~en, und zwar durch Adrenalininjektion

292 A. DELOGIJ und L.VEccHm~E:

Abb. 1. Reehtes Auge eines I~a.ninehen 8 Tage naeh der HornhautverPflanzung

~kbb. 2. lleehtes Auge eines Ig:aninehen 30 Tage naeh der IIornhautverpflanzung

Abb. 3. Rechtcs Auge eines Kaninehen 60 Tage naeh der ttornhautverpflanztmg

unter die Conjunetiva; augerdem wurde wiihrend der Operation eine Eintrop- lung yon Heparin-Augen- wasser gemaeht. Bei den ersten Kaninehen, die yon uns dieser Operation unter- zogen wurden, ha t te der fiberpflanzte Hornhau t rand einen Durehmesser von 9 ram. Nachfolgend haben wir eine ~berpf lanzung von 6 mm Durehmesser vorge- zogen; es wurde I-Iornhaut. rand auf I-[ornhautrand mit 6- -7 Seidenf~den vernaht . Naeh der Operation wurde eine kleine Luftmenge in die AugenhShle injiziert. Die Medikation wahrend der folgenden Tage bes tand aus Atropin, Antibiotica und Cortisonderivaten. Der post- operative Verlauf war regel- m/~Big: wahrend der ersten Tage nach dem Eingriff konnte man eine merkbare konjunkt ivale und auch tiefgehende Reakt ion be- obaehten, bei der in dem operierten Auge eine wEg- rige Entzi indung sowie ein Auftreten yon Fibr in in der Augenh6hle sowie 1Engs des Narbenbereiehes auftraten. Die Wir thornhau t und der iiberpflanzte Kornhau t r and ersehienen wi~hrend der er- sten Woehe teilweise nur durehseheinend, wegen der erhShten Wasserhalt igkeit (Abb. 1). Diese Entziin- dungserscheinungen began- nen zwisehen dem 10. und dem 20. naehoperat iven Tag abzuklingen; am 30. Tag naeh der Operation (Abb. 2) waren die Augen, an denen operiert worden war, wie- der normal, wobei die Horn- haut, und zwar die fiber-

pilanzte wie aueh die des Wirtes, ihre normale Transparenz wiedererl~ngt hatte. In Abb. 3 wird ein Transp]antat naeh dem 60. Tag seit der Operation gezeigt.

Natriumverteflung bei experimentellen Hornhautverpfianzungen 293

Die Ablation der N~hte, soweit diese noch vorhanden waren, wurde zwischen dem 10. und 15. Tag durchgefiihrt.

Die Proben mit Na z~ wurden naeh 3, 5, 8, 30 und 60 Tagen seit dem Eingriff ausgefiihrt.

Es wurden etwa 50 1Vfikroeurie Na 22 eingeimpft, und zwar in Form yon NaC1 in 2 em a physiologiseher LOsung; die Einffihrung erfolgte in die Randvene des 0hres bei jedem der behandelten Kaninchen. ]Es wurden hierzu nur solehe Kaninehen heran- gezogen, bei denen der post- operative Verlauf jederzeit normal geblieben war und bei denen der iiberpfianzte ~ornhautrand naohgewiese- nermaBen - - jedenfaUs in klinischer Betrachtung - - eine gute Vitalit/it zeigte.

li2 Std nach der Eirrfiih- rung der Isotope wurden durch Herzpunktion 10 cm a Blur in einem heparinisielten Prober6hrehen entnommen; anschliegend wurde das Vet- 0 suehstier mittels Gasembolie get6tet. Sodann wurde zur /g0 Entfernung des fiberpflanz- ten Hornhautrandes geschrit- ten, einschlieglich des Horn- 20 hautrings des Wirtstieres und der ttornJaaut des anderen Auges. Naeh genauer W/i- ~"~g0 gung der Proben auf der c~ Mikroanalysenwaage wurde ~: die Messung der in den Pro- 70 ben vorhandenen Radioakti- vit/~t durehgefiihrt, wozu ein Funkenzghler mit angesehlos- senem Einkanal-Analysator gOz benutzt win'de. Die in Ent- ladungen jeMinute gemessene

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Abb. 5 Tage ~o

Radioaktivit~t je Gramm Frisehgewebe wurde in Prozentzahlen der Flasmaradioakti- vitgt ausgedrfickt; auf diese Weise wurde die Natriumverteilung in den untersuehten Proben berechnet. AnsohlieBend win'de das Trockengewioht der Froben sowie der Gesamtprozentsatz an Wasser in den genannten Geweben festgesteilt.

Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 1 u n d 2 dargestell t und in Schemadiagrammen gezeigt (Abb. 4 und 5). Aus der Un te r suchung der- selben k6nnen wit en tnehmen, dab sieh w/ihrend der naehopera t iven Tage in dem Transp lan t a t eine verst/irkte Na t r iumver te i lung anbahn t , und zwar sowohl im t I o r n h a u t r a n d wie auch im t Io rnhau t r i ng des Wir~es, verglichen mib den Verh/iltnissen in der Kont ro l lhornhaut .

294 A. DELOGU und L.VECC~tlO~E :

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Die Verstgrkung der Na- triumverteilung ist - - wie zu erwarten w a r - yon einer merkbaren Erh6hung des Wassergehalts sowohl im /iberpflanzten Gewebe wie in dem des Wirtes begleitet. Besonders bemerkenswert ist hierbei, dab am 30. Tag nach dem Eingriff, w~hrend der Gesamtwasserinhalt sich be- reits zu normalisieren be- ginnt, die Natriumwerte naeh wie vor erh6ht bleiben. Am 60. Tag sind aueh diese Werte wieder in die nor- mMen Grenzen zurfiekge- kehrt. Wit k6nnen daraus sehliegen, dab naeh 2 Mona- ten seit der Operation das normMe Gleiehgewieht im Wasseraustauseh der I-Iorn- haut wieder hergestellt ist. Bekunntlieh ist die Natrium- verteilung ein NaBstab der extraeellul~ren Phase oder der extraeellulgren Flfissig- keit, da das N a t r i u m i o n - im Gegensatz zum KMium- ion - - eine ausschlieglich extraeellul~re Verteilung auf- weist. Der extrueellul/ire l~aum umfagt in der Praxis den gesamten Vaseulgrraum einsehlieBlieh der eigentli- ehen Interstitialr/~ume; da abet die tIornhaut keine Gefgge aufweist, ist hier die Lage einfaeher, und das AusmaB der Sodiumvertei- lung ist gleiehzusetzen mit dem Ausmag der vorhan- denen Inter stitialfiiissigkeit.

Natriumverteilung bei experimentellen Hornhautverpflanzungen 295

Tabelle 2

I 3 Wage 5 Wage I 8 Wage 30 Wage 60 Wage

'Trocke-~-] H O T roc ken- !Troc ken- T roc ken- I r I gewicht ~ H O t I O H O H O

rocken- gewicht 2 I gewieht 2 gewicht [ ~ gewieht 2

I

Hornhaut- 9,6 84,3 I 7,8 81,9 ~ o ~1 1 rand 3,8 80,5 3,3 83,3 4,5 I 86,7 4,5 1 76,8 I ~': '-:'~

3,3 81,0 1,5 71,61 ~,u ~;,~ 19,6 186, 13,1 185, 1 . . . . . .

11,7 86 ,7 24 ,4 86 ,0 14,2 76 ,9 . . . . . . Wirt 23,6 84,3 ! 8,5 74 ,9 lb,~ '~t~,l

Kontroll- 26,7 t 77,3 18,4:177,7 ~ 22 5 7~t 9 hornhaut 25 ,6 74 ,1 12 ,2 75 ,0 20,4 77,3 I 16,9 173,7 [ ~.'~ _,'^~

19,7 76 ,6 12,1 68,1 I z~,z '~,uz

Unter Berficksiehtigung der bemerkenswerten hydrophilen Eigenschaf- ten der in der Hornhaut vorh~ndenen Mucopolysaeeharide, denen die Kontrolle der extraee]lul/~ren Wasser- und Elektrolytkonzentrat ion obliegt, ist die erheb]iche Zunahme der yon uns beobaehteten Natr ium- verteilung, besonders in den ersten Tagen nach der Operation, ein genauer MaBstab f fir die Hydrophilie der eigentliehen Hornhautsubstanz.

Bei der weiteren Deutung jener Ergebnisse mfissen wir uns wenig- stens flfichtig mit dem Problem der Vorg~Lnge befussen, welche die Wasserffihrung des Hornhautgewebes regeln. Es ist fibrigens noch durch- aus nicht v511ig gekl~rt, durch welchen Meehanismus in einem hydro- philen Gewebe, wie es die t tornhaut ist, der Wassergehalt konstant erhalten wird: etwa dureh ein einfaches wechselseitiges Einwirken der verschiedenen osmotischen Drficke, wodureh eine Wasserbewegung yore Hornhautgewebe weg zur Augen~lfiss~gkeit und zur Tr/~nenflfissigkeit hin hervorgerufen wird, oder vielleieht dureh eine aktive WasserfSrde- rung fiber die Stoffweehselvorg~nge, die in bezug auf das Epithel und das Endothel eintreten - - eine Meinung, die z. Z. yon einem GroBteil der Autoren vertreten wird. Uber die aktive Teilnahme und fiber den Einflul] der genannten beiden Membranen kSnnen wir aus zahlreiehen Unter- suchungen diejenigen yon DAVSON, LAI~GHAI~I, P H I L P O T , MAUI~ICE. und GIARDI~I, SCKWARZ et al. nennen (eine vollst~ndige bibliographisehe Zusammenstellung fiber diese Frage finder sich in den Monographien von SCUDE~I und in dem kfirzlich verSffentlichten Symposium fiber die Transparenz der Hornhaut). Diese Untersuehungen haben den Beweis daffir geliefert, dab der Wasser-Salzstoffweehsel in der Hornhaut - - allerdings in weehselndem Ausma$ - - durch die Stoffweehselt~tigkeit des Epithels uud des Endothels gesteuert wird. Die genannten Autoren haben experimentell fiber den Einflu$ der Anwesenheit yon Epithel und Endothel auf die Wasserffihrung der Hornhaut gearbeitet, ebenso fiber

296 A. DELOGU und L.VEcc~Io>r~:

den EinfluB verschiedener anderer Faktoren wie Temperatur, Sauerstoff- und Stickstoffdruck, Glucosekonzentration, sowie verschiedene inhibitori- sehe Einfl/isse auf die Glykolyse oder die Atmung.

I m Lichte der derzeitigen Erkenntnisse fiber das Verhalten der Wasser- nnd Elektrolytenffihrung in der Hornhaut - - sowohl im Trans- plantar als auch beim Wirt - - gelangen wir zu der Ansicht, dab die erhebliche Wasseraufnahme sowie die Zunahme der Natriumverteilung, welche in den ersten nachoperativen Tagen in den Geweben festgestellt wurden, auf einen ungesteuerten Durchlauf yon Wasser durch s~mtliehe Gewebestarken der L/~sion zurfickzuffihren ist, wobei wit jedoch nicht die M6glichkeit ausschlieSen k6nnen, dab such in diesem Zeitraum Ver- gnderungen durch Aktivit/itsschwankungen im Epithel- und Endothel- stoffweehsel auftreten m6gen. Mit dem ansehlieBenden Fortsehreiten der normalen Vernarbungsvorggnge, und vor allem mi t der Wieder- herstellung der Epithel- und Endothelmembran, werden die hydro- salinen Austauschvorg/~nge zwischen Hornhaut und umgebendem Ge- webe - - vor allem die for~schreitende Entw~sserung derselben his zur Wiederherstellung des normalen Gleichgewichts - - mi~ der Stoffwechsel- akt ivi tgt des Epithels und des Endothels Hand in Hand gehen. Die Untersuchung letzterer Vorg/~nge wird Gegenstand unserer weiteren Forschungen sein.

Zusammenfassung Naeh einer kurzen Besprechung der derzeitigen Erkenntnisse fiber

den Stoffwechsel des fiberpflanzten I-Iornhautrandes mad einer m6glichen Deutung der yon frfiheren Autoren erzielten Ergebnisse vom Gesichts- punkt neuerer Untersuchungen fiber den tIornhautstofLvechsel, bespre- chen die Autoren die Ver&nderungen der Natriumverteilungsr/~ume und des Gesamtwasserhaushalts im cornealen Transplantat zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem operativen Eingriff.

Nach einer Beschreibung der verwendeten Technik werden die erziel- ten Ergebnisse beschrieben (merkbare Erh6hung der Natriumvertei lung und des Gesam~wasserinhalts, besonders in den ersten nachoperativen Tagen, sowie eine Rfickkehr dieser Werte znr Norm nach dem sechzig- sten nachoperativen Tag). Es werden schlieBlich die Arbeiten frfiherer Autoren fiber die Steuerung der t Iornhautbe- und -entw~sserung unter physiologischen Verh/iltnissen besprochen; die Autoren geben zum Ab- schluB eine m6gliche Deutung der erzielten Ergebnisse.

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Natrinmverteilung bei experimentellen Hornhautverpflanzungen 297

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Dr. A. DELOGU, Univ.-Augenklinik Neapel, Sant Andrea delle Dame 8