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Untersuchungen zur direkten und indirekten Genotoxizität von
Natriumselenit und Selenomethionin
vorgelegt von CAROLINE HALL
Staatlich geprüfte Diplom-Lebensmittelchemikerin
aus Bad Hönningen
von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin (TU)
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat.-
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. W. Rotard
Berichter: Prof. Dr. A. Hartwig
Berichter: Prof. Dr. L. W. Kroh
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 03. November 2008
Berlin 2008
D83
Inhaltverzeichnis I
INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................. 1
2 EINLEITUNG.......................................................................................................... 3
2.1 Selen ............................................................................................................ 3
2.1.1 Vorkommen und Exposition .................................................................. 4
2.1.2 Resorption und Metabolismus............................................................... 5
2.1.3 Selenoproteine ...................................................................................... 6
2.1.4 Toxikologie ............................................................................................ 9
2.1.5 Untersuchte Selenverbindungen ......................................................... 10
2.2 DNA-Schäden und ihre Reparatur ............................................................. 11
2.2.1 Oxidative DNA-Schäden und die Basenexzisionsreparatur ................ 11
2.2.2 Helixverzerrende DNA-Schäden und die Nukleotidexzisions-
reparatur ............................................................................................. 13
2.2.2.1 BPDE-induzierte DNA-Schäden................................................... 13
2.2.2.2 UV-induzierte DNA-Schäden ....................................................... 15
2.2.2.3 Nukleotidexzisionsreparatur......................................................... 16
2.2.2.4 Das Xeroderma Pigmentosum Protein A ..................................... 18
2.3 Glutathion................................................................................................... 20
3 FRAGESTELLUNG ................................................................................................ 24
4 MATERIAL UND METHODEN .................................................................................. 25
4.1 Zellkultur und Behandlung der Zellen......................................................... 25
4.1.1 Zelllinien.............................................................................................. 25
4.1.2 Zellkultur ............................................................................................. 25
4.1.3 Inkubationslösungen ........................................................................... 26
4.2 Bestimmung der Aktivität der Glutathion-Peroxidase ................................. 26
4.2.1 Versuchsdurchführung ........................................................................ 27
4.2.2 Proteinbestimmung nach Bradford...................................................... 27
4.3 Bestimmung der Koloniebildungsfähigkeit.................................................. 28
4.4 Nachweis oxidativer DNA-Schäden............................................................ 29
4.4.1 Versuchsansatz................................................................................... 30
4.4.2 Alkalische Entwindung ........................................................................ 30
4.4.3 Chromatographie und fluorimetrische Quantifizierung ........................ 30
4.5 Quantifizierung von Gesamtglutathion und Glutathiondisulfid .................... 31
INHALTSVERZEICHNIS II
4.5.1 Versuchsansatz................................................................................... 32
4.5.2 Probenaufarbeitung............................................................................. 33
4.5.3 Durchführung des Recycling-Assays .................................................. 33
4.5.4 Bestimmung des Proteingehaltes nach der BCA-Methode ................. 34
4.6 Nachweis UVC-induzierter DNA-Schäden ................................................. 34
4.6.1 Versuchsansatz................................................................................... 35
4.6.2 Versuchsdurchführung ........................................................................ 35
4.7 Bestimmung der Glutathion-S-transferase-Aktivität.................................... 36
4.7.1 Versuchsdurchführung ........................................................................ 37
4.8 Nachweis BPDE-induzierter DNA-Addukte ................................................ 37
4.8.1 Versuchsansatz................................................................................... 38
4.8.2 DNA-Isolierung und -Quantifizierung................................................... 39
4.8.3 DNA-Hydrolyse ................................................................................... 39
4.8.4 HPLC-Analyse..................................................................................... 40
4.9 Immunologischer Nachweis des XPA-Proteins .......................................... 40
4.9.1 Zelllyse................................................................................................ 41
4.9.2 Elektrophorese und Westernblot ......................................................... 41
4.9.3 Chemilumineszenz-Detektion.............................................................. 41
4.10 Freisetzung von Zink aus XPAzf ................................................................ 42
4.10.1 Versuchsdurchführung ........................................................................ 43
5 ERGEBNISSE UND DISKUSSION............................................................................. 44
5.1 Bioverfügbarkeit der Selenverbindungen ................................................... 44
5.2 Zytotoxizität der Selenverbindungen .......................................................... 47
5.3 Untersuchungen zur prooxidativen Wirkung der Selenverbindungen......... 49
5.3.1 Induktion von oxidativen DNA-Schäden.............................................. 49
5.3.2 Untersuchung des Glutathionhaushaltes ............................................ 51
5.4 Induktion und Reparatur von UVC-induzierten DNA-Schäden ................... 54
5.4.1 Induktion von UVC-induzierten DNA-Schäden.................................... 54
5.4.2 Reparatur der Photoläsionen .............................................................. 55
5.4.3 Beeinflussung der Reparatur UVC-induzierter DNA-Schäden
durch Selenverbindungen ................................................................... 58
5.5 Modulierung der Toxizität von BPDE durch die Selenverbindungen .......... 62
5.5.1 Untersuchungen zur Detoxifizierung von Benzo[α]pyrendiolepoxid .... 62
5.5.1.1 Beeinflussung des Glutathionhaushaltes ..................................... 62
INHALTSVERZEICHNIS III
5.5.1.2 Untersuchung der Aktivität der Glutathion-S-transferase............. 65
5.5.2 Einfluss auf die Bildung und Reparatur BPDE-induzierter
DNA-Addukte ...................................................................................... 69
5.5.3 Beeinflussung der BPDE-induzierten Zytotoxizität .............................. 74
5.5.4 Untersuchungen in XPA knock-in und XPA-defizienten Zellen ........... 76
5.5.4.1 Charakterisierung der Zellen........................................................ 76
5.5.4.2 Reparatur von BPDE-induzierten DNA-Addukten ........................ 78
5.5.4.3 Beeinflussung der Induktion von BPDE-induzierten
DNA-Addukten durch Selenverbindungen ................................... 81
5.6 Zinkfreisetzung aus XPAzf ......................................................................... 84
6 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION....................................................................... 86
7 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................... 100
8 ANHANG........................................................................................................... 115
8.1 Abkürzungsverzeichnis ............................................................................ 115
8.2 Geräte ...................................................................................................... 117
8.3 Verbrauchsmaterialien ............................................................................. 119
8.4 Zelllinien ................................................................................................... 120
8.5 Chemikalien ............................................................................................. 120
8.6 Lösungen und Puffer ................................................................................ 124
8.7 HPLC-Analyse.......................................................................................... 130
8.8 „Recycling Assay“..................................................................................... 132
PUBLIKATIONSLISTE .................................................................................................. 133
DANKSAGUNG........................................................................................................... 136
ZUSAMMENFASSUNG 1
1 ZUSAMMENFASSUNG Das für den Menschen essentielle Spurenelement Selen ist Bestandteil von
Selenoproteinen, von denen insbesondere die Glutathion-Peroxidasen und die
Thioredoxin-Reduktasen am Abbau von Peroxiden in der Zelle beteiligt sind. Neben
den unumstrittenen antioxidativen Eigenschaften der Selenoproteine werden eine
Stimulierung von DNA-Reparaturprozessen und eine Induktion von Phase II-
Enzymen des Fremdstoffmetabolismus als weitere chemopräventive
Wirkmechanismen von Selen diskutiert. Epidemiologische Studien und
Untersuchungen zur Krebshäufigkeit in Korrelation zur Selenaufnahme sind jedoch
uneinheitlich und deuten auf komplexe biologische Wirkmechanismen der
Selenverbindungen hin, darunter auch prooxidative Eigenschaften. Das Ziel dieser
Arbeit war es, Natriumselenit und Selenomethionin hinsichtlich ihrer direkten und
indirekten genotoxischen Effekte zu vergleichen. Beide Selenverbindungen sind für
die Selenversorgung des Menschen als Bestandteil von Lebensmitteln und
Nahrungsergänzungsmitteln von Bedeutung. Während es sich bei Selenomethionin
um eine organische, vollständig reduzierte Verbindung handelt, gehört Natriumselenit
zu den anorganischen, reduzierbaren Selenverbindungen. Infolge dessen unterliegen
sie einem unterschiedlichen zellulären Metabolismus.
In der vorliegenden Arbeit konnte anhand der Enzymaktivität der Selen-abhängigen
Glutathion-Peroxidase die Aufnahme und Metabolisierung beider Verbindungen in
A549 Zellen nachgewiesen werden. In anschließenden Untersuchungen konnte
gezeigt werden, dass Natriumselenit bereits ab einer Konzentration von 4 µM
zytotoxische Effekte hervorrief und somit ca. 100fach stärker zytotoxisch war als
Selenomethionin. Die Untersuchung der direkten Genotoxizität der
Selenverbindungen erfolgte anhand der Induktion oxidativer DNA-Schäden und des
Einflusses auf den Glutathionhaushalt. Selenomethionin führte weder zu einer
Induktion oxidativer DNA-Schäden, noch zu einer Verschiebung des
Redoxhaushaltes. Hingegen führte Natriumselenit in zytotoxischen Konzentrationen
sowohl zu einer konzentrationsabhängigen und signifikanten Induktion oxidativer
DNA-Basenmodifikationen als auch zu einer signifikanten Bildung von oxidiertem
Glutathiondisulfid.
Die Untersuchungen zur indirekten Genotoxizität der Selenverbindungen erfolgte
anhand der Modulierung der Genotoxizität von UVC-Strahlung und
ZUSAMMENFASSUNG 2
(+)-anti-Benzo[α]pyrendiolepoxid (BPDE), dem ultimalen genotoxischen Metabolit
von Benzo[α]pyren. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Natriumselenit als auch
Selenomethionin in hohen Konzentrationen die Reparatur UVC-induzierter
Photoläsionen hemmen können. Die Untersuchungen zur Beeinflussung der
Genotoxizität von BPDE ergaben keine Anzeichen einer verminderten
Detoxifizierung von BPDE. Der Hauptweg der enzymatischen Detoxifizierung von
BPDE, die Glutathion-S-transferase katalysierte Konjugation an Glutathion, war von
den Selenverbindungen unbeeinflusst. Beide Selenverbindungen führten bereits im
nicht-zytotoxischen Konzentrationsbereich zu einer erhöhten Anzahl BPDE-
induzierter DNA-Addukte und zu einer Hemmung der Nukleotidexzisionsreparatur.
Während die durch Selenomethionin hervorgerufene Reparaturhemmung nach 24-
stündiger Reparaturzeit aufgehoben war, war sie nach Inkubation mit Natriumselenit
sowohl nach acht als auch nach 24 Stunden Reparatur nachweisbar. Zudem konnte
gezeigt werden, dass sich die Reparaturhemmung durch Natriumselenit in einer
Verstärkung der BPDE-induzierten Zytotoxizität auswirkt. Abschließend wurde mit
Hilfe eines subzellulären Testsystems gezeigt, dass Natriumselenit Zink aus der
Zinkfingerdomäne des Xeroderma Pigmentosum Protein A (XPA) herauslösen kann,
während Selenomethionin dazu nicht in der Lage war. Da das XPA-Protein für die
Nukleotidexzisionsreparatur von essentieller Bedeutung ist, kann dies der Grund für
die Reparaturhemmung durch Natriumselenit sein. Demgegenüber sind weitere
Versuche zur Aufklärung der Reparaturhemmung durch Selenomethionin nötig.
Somit konnten im Verlauf dieser Arbeit direkte genotoxische Effekte von
Natriumselenit gezeigt werden, die die genomische Stabilität beeinträchtigen können.
Außerdem wurden erstmals indirekte genotoxische Effekte von Selenverbindungen
nachgewiesen. Die Hemmung der DNA-Reparatur resultierte im Fall von
Natriumselenit wahrscheinlich aus einer Interaktion mit dem DNA-Reparaturprotein
XPA. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die Relevanz der Ergebnisse für
den intakten Organismus abzuklären.
EINLEITUNG 3
2 EINLEITUNG
2.1 Selen
Das Spurenelement Selen wurde 1817 von dem schwedischen Chemiker Jöns Jacob
Berzelius entdeckt und nach der griechischen Mondgöttin Selene benannt. Selen mit
der Ordnungszahl 34 ist ein Halbmetall und gehört in die VI. Hauptgruppe des
Periodensystems der Elemente. Somit hat es ähnliche chemische Eigenschaften wie
Schwefel und Tellur und wird zu den Chalkogenen gezählt. Dennoch unterscheiden
sich seine biochemischen Eigenschaften von denen des Schwefels. Unter
physiologischen Bedingungen ist der Säurecharakter von Selenolen (-SeH) deutlich
stärker ausgebildet als der von Thiolen (-SH), so dass Selenole in biologischen
Systemen fast vollständig dissoziiert vorliegen (Barceloux, 1999).
Nachdem lange Zeit von einer toxischen Wirkung von Selen ausgegangen wurde,
konnten Schwarz und Foltz (1957) die Essentialität für Säugetiere nachweisen. 1973
folgte die Entdeckung von Selen als Komponente der Glutathion-Peroxidase (Flohé
et al., 1973; Rotruck et al., 1973). Als Bestandteil von Glutathion-Peroxidasen ist
Selen für den Abbau von Peroxiden von zentraler Bedeutung und seine antioxidative
Wirkung anerkannt. Als weitere chemopräventive Wirkung werden die Induktion von
Phase II-Enzymen des Fremdstoffmetabolismus und eine Steigerung von DNA-
Reparaturmechanismen diskutiert (Seo et al., 2002; Fischer et al., 2007; Brigelius-
Flohé, 2008). Aufgrund dieser Eigenschaften wurden Selen-Präparate als
Nahrungsergänzungsmittel in den vergangenen Jahren verstärkt angeboten.
Demgegenüber besitzen einige Selenverbindungen ebenso prooxidative
Eigenschaften und die Fähigkeit, mit Thiolgruppen von Proteinen und Peptiden zu
reagieren. Epidemiologischen Studien und Daten zur Krebsinzidenz in Korrelation
der Selenaufnahme sind uneinheitlich, deuteten aber zunächst darauf hin, dass ein
niedriger Selenspiegel im Serum bzw. eine geringe tägliche Aufnahme mit einem
erhöhten Risiko an Leber-, Lungen-, Prostata- und Dickdarmkrebs verbunden ist
(Clark et al., 1996; Yu et al., 1997). In der bislang umfassendsten
placebokontrollierten Interventionsstudie, der Nutritional Prevention of Cancer Studie
(NPC), wurde der Effekt einer täglichen Gabe von 200 µg Selenomethionin in Form
von angereicherter Bäckerhefe auf das Auftreten von Hautkrebsrezidiven in einem
Hautkrebsrisikokollektiv untersucht. Obwohl sich keine Effekte auf das primäre
EINLEITUNG 4
Studienziel ergaben, waren die Prostata-, Lungen- und Dickdarmkrebsraten ebenso
reduziert, wie die krebsbedingte Mortalität. Allerdings zeigten sich in der gleichen
Studie auch gesteigerte Krebshäufigkeiten, von z.B. Brust- und Blasenkrebs. Des
Weiteren wurde die präventive Wirkung nur bei Patienten mit niedrigem initialen
Selenspiegel deutlich (Clark et al., 1996; Duffield-Lillico et al., 2002; Duffield-Lillico et
al., 2003). Dahingegen konnten im finnischen Interventionsprogramm, in welchem
die Selenversorgung der Bevölkerung durch Anreicherung der landwirtschaftlichen
Düngemittel mit Selenat erhöht wurde, keine signifikante Veränderung der
Krebsinzidenz festgestellt werden (Vinceti et al., 2000).
2.1.1 Vorkommen und Exposition
Aufgrund seines Durchschnittsgehaltes in der Erdkruste von 90 µg/kg gehört Selen
zu den seltenen Elementen. Es ist ubiquitär verbreitet. Durch die Verwitterung
sulfidischer Eisenerze wird es in anorganischer Form als Selenit oder Selenat
freigesetzt und von Pflanzen aufgenommen. Nach der Reduktion zu
Hydrogenselenid kann dieses methyliert, zur Biosynthese von Selenoproteinen
genutzt oder zu verschiedenen niedermolekularen Selenverbindungen metabolisiert
werden. Durch Methylierung ist es einigen Pflanzenarten möglich, auf selenreichen
Böden zu wachsen. Diese so genannten „Akkumulatorpflanzen“ speichern Selen
überwiegend in Form methylierter Metabolite wie Methylselenocystein oder
y-Glutamyl-Se-methylselenocystein. Zu ihnen zählen vorwiegend Astralagus-
(Tragant), Brassic-a (Kohl) und Allium- (Zwiebel) Spezies. Demgegenüber speichern
Hefen Selen fast ausschließlich als Selenomethionin (zusammengefasst in
Barceloux, 1999; Birringer et al., 2002; Rayman, 2008).
Mit Ausnahme der beruflich bedingten Exposition, wie z. B. in der Halbleiter- oder
Kupferherstellung und der Keramikindustrie, nimmt der Mensch Selen fast
ausschließlich mit der Nahrung auf. Der Selengehalt in Lebensmitteln ist von der
Selenaufnahme der Pflanzen und Tiere abhängig und kann deshalb je nach
Bodenbeschaffenheit stark variieren. In Lebensmitteln treten überwiegend
Selenomethionin und Selenocystein auf, deren Bioverfügbarkeit aus pflanzlichen
Lebensmitteln besser ist als aus tierischen Lebensmitteln (Navarro-Alarcon und
Lopez-Martinez, 2000). In Deutschland wird die tägliche Selenaufnahme
überwiegend in Form der eiweißreichen Lebensmittel Fleisch, Wurst, Fisch und Eier
gedeckt. Backwaren tragen zu ca. 10 % zur täglichen Selenaufnahme bei (Anke,
EINLEITUNG 5
2002). In Nahrungsergänzungsmitteln werden Selenhefen, welche überwiegend
Selenomethionin enthalten, oder anorganisches Natriumselenit oder -selenat
eingesetzt (Rayman et al., 2008). Der tägliche Bedarf an Selen ist derzeit nicht
ausreichend geklärt, da die zugrunde liegenden Kriterien der Beurteilung unklar sind.
Die Deutsche Gesellschaft für Ernährung empfiehlt eine tägliche Zufuhr von 30 bis
70 µg (DGE/ÖGE/SGE/SVE, 2000) für Erwachsene.
2.1.2 Resorption und Metabolismus
Mit Ausnahme der inhalativen Aufnahme nach Exposition am Arbeitsplatz erfolgt die
Resorption von Selenverbindungen nach oraler Aufnahme im Duodenum des
Gastrointestinaltraktes ohne homöostatische Kontrolle (zusammengefasst in
Barceloux, 1999). Selenomethionin wird über den gleichen Na+ Ionen-abhänhigen
Aminosäurecarrier wie Methionin absorbiert. Selenocystein wird wie Cystein über
den Carrier für basische Aminosäuren transportiert (Wolffram et al., 1989). Während
Selenat mittels eines aktiven Natrium-Cotransportes transportiert wird, konnten für
die Absorption von Selenit keine aktiven Transportmechanismen identifiziert werden.
Daher wird im Fall von Selenit von eine passiven Diffusion ausgegangen. Dies wird
als Grund dafür angesehen, dass Selenit langsamer absorbiert wird als Selenat
(Wolffram et al., 1986; Mykkanen und Wasserman, 1989). Nach der Resorption
können organische sowie anorganische Selenverbindungen zu Hydrogenselenid
(H2Se) umgesetzt werden, welches nach ATP-abhängiger Phosphorylierung dem
Aufbau von Selenoproteinen dienen kann. Selenit unterliegt dem reduktiven
Metabolismus und wird zunächst durch Glutathion reduziert. Das dabei entstehende
gemischte Disulfid wird nachfolgend durch die Glutathion-Reduktase oder
Thioredoxin-Reduktase unter NADPH-Verbrauch zu Hydrogenselenid, dem zentralen
Metabolit, reduziert. Im Gegensatz dazu kann Selenomethionin entweder ohne
vorherige Metabolisierung unspezifisch anstelle von Methionin in Proteine eingebaut
werden oder durch enzymatische Reaktion dem zellulären Selenpool zugeführt
werden. Nach der Transselenierung von Selenomethionin katalysiert die ß-Lyase die
Freisetzung von Hydrogenselenid aus Selenocystein. Dieses kann in
Folgereaktionen entweder zur Biosynthese von Selenoproteinen eingesetzt werden
oder in Form methylierter Produkte oder als Selenozucker ausgeschieden werden.
Des Weiteren wird eine Oxidation von Hydrogenselenid mit gleichzeitiger Bildung von
EINLEITUNG 6
Superoxidradikalen diskutiert (Whanger, 2004; Rayman et al., 2008; Brigelius-Flohé,
2008). Abbildung 1 zeigt den Metabolismus von Selenomethionin und Selenit.
Se0 + 2 O2• -
Selenomethionin
Körperproteine
CH3SeH(CH3)3Se+
Urin
(CH3)2SeH
Selenit
GS-Se-SG
H3SePO3
H2Se
Selenoproteine
2 O2 + 2 OH-
4 GSHGSSG
ATPADP+Pi
Selenocystein
12 3
AusscheidungSelenozucker
Urin
Selenoproteinbiosynthese
Unspezifischer Einbau in Proteine
Toxizität
partielle Abatmung
2 H2O
Se0 + 2 O2• -
Selenomethionin
Körperproteine
CH3SeH(CH3)3Se+
Urin
(CH3)2SeH
Selenit
GS-Se-SG
H3SePO3
H2Se
Selenoproteine
2 O2 + 2 OH-
4 GSHGSSG
ATPADP+Pi
Selenocystein
12 3
AusscheidungSelenozucker
Urin
Selenoproteinbiosynthese
Unspezifischer Einbau in Proteine
Toxizität
partielle Abatmung
2 H2O
Abbildung 1: Metabolismus von Selenomethionin und Selenit. 1: Glutathion-Reduktase und Thioredoxin-Reduktase, 2: γ-Lyase, 3: ß-Lyase; GSH: Glutathion, GSSG:
Glutathiondisulfid (zusammengefasst aus Yan und Spallholz, 1993; Rayman et al., 2008;
Brigelius-Flohé, 2008).
2.1.3 Selenoproteine
Im Gegensatz zu anderen essentiellen Metallionen, die als Cofaktoren mit Proteinen
in Wechselwirkung treten, wird Selen in Form der 21sten genetisch codierten
Aminosäure Selenocystein cotranslational in so genannte Selenoproteine eingebaut.
Bekannt sind außerdem Selen-bindende Proteine, deren Funktion weitgehend
ungeklärt ist, und selenomethioninhaltige Proteine, die keine besondere biologische
Bedeutung ausüben (Behne und Kyriakopoulos, 2001). Proteomanalysen ergaben
eine Anzahl von 25 humanen Selenoproteinen, die mindestens ein Selenocystein im
aktiven Zentrum enthalten, welches für die Enzymaktivität von essentieller
Bedeutung ist (Kryukov et al., 2003). Die Synthese von Selenoproteinen bedarf zum
einen spezieller Enzyme zur Ausbildung der Selenocysteinyl-tRNA, dem
Grundbaustein für Selenoproteine. Des Weiteren wird eine von der gewöhnlichen
Transkription abweichende Proteinsynthesemaschinerie benötigt, die das UGA-
EINLEITUNG 7
Codon nicht wie üblich als Stoppcodon, sondern als Selenocystein-Insertionssignal
decodiert. Zentrales Element für die korrekte Decodierung ist die Selenocystein-
Insertions-Sequenz (SECIS), eine Haarnadelstruktur im 3’-untranslatierten Bereich
der mRNA. Dieses Strukturelement wird durch SECIS-bindende Proteine erkannt, die
infolgedessen spezifische Elongationsfaktoren rekrutieren. Als weiteres an der
Synthese einiger Selenoproteinen beteiligtes Element wurde das selenocystein
redefinition element entdeckt, welches sich in 5’-Richtung in unmittelbarer Nähe des
UGA-Codons befindet. Dessen Funktion bedarf jedoch noch der Aufklärung (Behne
und Kyriakopoulos, 2001; Schomburg et al., 2004; Papp et al., 2007).
Die Biosynthese der Selenoproteine und die Selenversorgung der Organe
unterliegen einer Hierarchie mit bislang teilweise unklaren molekularbiologischen
Grundlagen. Dies bedeutet, dass einzelne Gewebe bevorzugt versorgt werden und
Selenoproteine mit besonderer Bedeutung für den Organismus auch unter
Mangelzuständen präferentiell synthetisiert werden (Allan et al., 1999).
Zu den Selenoproteinen mit bekannter biologischer Funktion gehören die
Enzymfamilien der Glutathion-Peroxidasen (GPx), Thioredoxin-Reduktasen und
Thyroxin-Deiodinasen sowie das Selenoprotein P. Es sind vier Enzyme aus der
Familie der Glutathion-Peroxidasen bekannt. Diese sind die zytosolische (GPx-1), die gastrointestinale (GPx-2) Glutathion-Peroxidase, die Plasma-GPx (GPx-3, pGPx)
und die Phospholipidhydroperoxid-GPx (GPx-4, PHGPx). Sie katalysieren die
Reduktion von Wasserstoffperoxid und organischen Hydroperoxiden, einschließlich
Lipidhydroperoxiden, zu den entsprechenden Alkoholen (Abbildung 2). Auf diese
Weise schützen sie die Zelle vor oxidativen Schäden durch reaktive
Sauerstoffverbindungen. Sie weisen ein breites Substratspektrum bezüglich der
Peroxide auf. Alle GPx haben Selenocystein in ihrem aktiven Zentrum, welches aus
einer katalytischen Triade aus Selenocystein, Glutamin und Tryptophan besteht
(Arthur, 2000; Brigelius-Flohé et al., 2002).
EINLEITUNG 8
E-Se- E-SeOH
E-Se-SGH2O
GSH
GSH
GSSG + H+
ROHROOH
E-Se- E-SeOH
E-Se-SGH2O
GSH
GSH
GSSG + H+
ROHROOH
Abbildung 2: Allgemeiner Reaktionsmechanismus von Glutathion-Peroxiden. GSH: reduziertes Glutathion, GSSG: oxidiertes Glutathion (modifiziert nach Birringer et al., 2002)
Thioredoxin-Reduktasen katalysieren die NADPH-abhängige Reduktion von Thioredoxin, welches an zahlreichen Redoxreaktionen der Zelle beteiligt ist.
Thioredoxine enthalten in ihrem aktiven Zentrum zwei Cystein-Gruppen, die in der
Disulfid- oder Thiolform vorliegen können. Außerdem können sie weitere Stoffe, wie
z.B. Wasserstoffperoxid, Selenit und Hydroperoxide reduzieren. Durch ihre
reduzierenden Eigenschaften haben sie Auswirkungen auf die Faltung von
Proteinen, die Redoxregulation von Transkriptionsfaktoren und die Steuerung der
Proliferation (Behne und Kyriakopoulos, 2001). Die Familie der Thyroxin-Deiodinasen enthält drei verschiedene Deiodinasen (Typ 1-3) und ist für die Aktivierung und den Abbau von Schilddrüsenhormonen von zentraler Bedeutung. Sie
katalysieren die Deiodierung von Thyroxin und Iodothyroninen, wobei der molekulare
Mechanismus nicht vollständig aufgeklärt ist (Köhrle, 2000). Das menschliche
Selenoprotein P enthält 10 Selenocysteine und es wird geschätzt, dass es ca. 50 % des im Plasma enthaltenen Selens enthält. Es wird vermutet, dass Selenoprotein P
für die Verteilung von Selen aus der Leber in Zielorgane und als extrazelluläres
Antioxidans von Bedeutung ist. Des Weiteren wird seine Beteiligung an der
Komplexierung von Schwermetallionen diskutiert (Burk et al., 2003; Papp et al.,
2007).
EINLEITUNG 9
2.1.4 Toxikologie
Die Toxizität von Selen hängt von der entsprechenden Selenverbindung ab und ist
im Allgemeinen eher gering. Anorganische Selenverbindungen gelten als toxischer
als organische Verbindungen (Barceloux, 1999). Die auftretenden toxischen Effekte
werden auf die Reaktivität des Selens gegenüber SH-Gruppen und die Induktion von
reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zurückgeführt (Yan und Spallholz, 1993; Stewart
et al., 1999; Vinceti et al., 2001). Obwohl die molekularen Mechanismen der
Selentoxizität noch unklar sind, scheint die Reaktion einiger Selenverbindungen mit
Glutathion, die zur Bildung von Selenotrisulfiden führt, eine wesentliche Rolle zu
spielen. Dies kann eine Depletion von Glutathion und somit eine Störung des
Redoxhaushaltes zur Folge haben (Vernie et al., 1979; Caffrey und Frenkel, 1991;
Yan und Spallholz, 1993; Shen et al., 2000). Des Weiteren wird die Bildung reaktiver
Sauerstoffspezies und damit verbunden oxidativer Stress als Ursache für die durch
Selen hervorgerufene Apoptose diskutiert (Kim et al., 2004; Drake, 2006). In-vitro
Untersuchungen zeigten eine Bildung von Superoxidradikal-Anionen durch
Selenverbindungen, die reduktiv unter Beteiligung von Glutathion zu
Hydrogenselenid umgesetzt werden (Spallholz et al., 2004). Durch die Reaktivität
anorganischer Selenverbindungen gegenüber Thiolen, wie z. B. Glutathion, werden
die Selenverbindungen in Hydrogenselenid überführt, welches mit Sauerstoff
reagieren und zur ROS-Produktion beitragen kann (Abbildung 3) (Seko et al., 1989;
Spallholz, 1997). Während die Reduktion von Selenit zu Selenodiglutathion ohne
enzymatische Katalyse stattfindet, werden die weiteren Reaktionen zur Bildung von
Selenid durch Glutathion-Reduktasen oder Thioredoxin-Reduktasen katalysiert
(Birringer et al., 2002).
SeO32- GSSeSG GSSeH H2Se Se0
2 O2•- + 2 H2O2 O2 + 2 OH-GSSGGSHGSSGGSHGSSG4 GSH
SeO32- GSSeSG GSSeH H2Se Se0
2 O2•- + 2 H2O2 O2 + 2 OH-GSSGGSHGSSGGSHGSSG4 GSH
Abbildung 3: Mögliche Bildung von Superoxidradikal-Anionen aus Selenit. (modifiziert nach Seko et al., 1989; Spallholz, 1997). SeO32-: Selenit, GSH: reduziertes Glutathion, GSSG: oxidiertes Glutathiondisulfid, H2Se: Hydrogenselenid, O2-•: Superoxidradikal-Anion,
Se0: elementares Selen.
EINLEITUNG 10
Außerdem können einige Selenverbindungen Thiole in Proteinen oxidieren und auf
diese Weise zu einer Inaktivierung von Enzymen führen (Kim et al., 2003). Neben
den beschriebenen Mechanismen werden zusätzlich toxische Wirkungen
beispielsweise auf das Immun- und Nervensystem, das endokrine System, die Haut
und die Leber beschrieben (zusammengefasst in Vinceti et al., 2001).
2.1.5 Untersuchte Selenverbindungen
Mit dem Ziel der Untersuchung direkter und indirekter genotoxischer Effekte wurden
in dieser Arbeit reduzierbares, anorganisches Natriumselenit und vollständig
reduziertes, organisches Selenomethionin eingesetzt (Abbildung 4). Wie in Kapitel
2.1.1 beschrieben, sind beide Selenverbindungen als Bestandteil von Lebensmitteln
oder Nahrungsergänzungsmitteln für die Ernährung des Menschen von Bedeutung.
Aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften wird Natriumselenit unter Beteiligung von
Glutathion zu Hydrogenselenid reduziert, während Selenomethionin enzymatisch,
ohne Beteiligung von Redoxreaktionen in den Zentralmetabolit überführt wird. Die
unterschiedlichen Redoxeigenschaften von Selenverbindungen spiegeln sich ebenso
in ihrer Interaktion mit Thiolen wider. Reduzierbare Selenverbindungen können Zink
aus Zinkfingerstrukturen freisetzen, während vollständig reduzierte
Selenverbindungen dazu nicht in der Lage sind (Blessing et al., 2004). Sowohl eine
Interaktion mit Zinkfingerstrukturen, eine Störung des vorwiegend durch Glutathion
bedingten Redoxstatus als auch eine verstärkte Bildung von reaktiven
Sauerstoffspezies können wesentliche zelluläre Mechanismen beeinflussen. Dazu
zählen die genomische Stabilität, die Zellzykluskontrolle, die Genexpression und die
Apoptose.
Natriumselenit Selenomethionin
-II+IVNa
NaSe
O
OO-
-
+
+
H3N
COO
Se
-
+
Natriumselenit Selenomethionin
-II+IVNa
NaSe
O
OO-
-
+
+
H3N
COO
Se
-
+
Abbildung 4: Strukturformeln von Natriumselenit und Selenomethionin.
EINLEITUNG 11
2.2 DNA-Schäden und ihre Reparatur
Nach Schätzungen finden pro Tag in einer menschlichen Zelle ca. 104 - 106 DNA-
Schadensereignisse statt. Ihre Ursachen können endogenen Ursprungs, wie z.B.
Replikationsfehler oder reaktive Sauerstoffspezies, sein. Oder sie können exogen
durch DNA-schädigende Agenzien aus der Umwelt verursacht werden. Das
Netzwerk der zellulären Antwort besteht im Wesentlichen aus der Schadenstoleranz,
dem Einleiten von Zellzyklusarresten und Apoptose sowie in Abhängigkeit des
Schadenstyps der Aktivierung verschiedener DNA-Reparaturwege. Somit stellen
DNA-Reparaturprozesse einen wichtigen Mechanismus der Aufrechterhaltung der
genomischen Stabilität dar und wirken der Entstehung von Mutationen entgegen. Die
Mechanismen der Doppelstrangbruchreparatur, das nichthomologe End-Joining und
die homologe Rekombination beseitigen DNA-Doppelstrangbrüche, die unter
anderem durch ionisierende Strahlung entstehen. Die Basenexzisionsreparatur
(BER) dient der Reparatur von Schäden an DNA-Basen als Folge von Alkylierung,
Desaminierung oder Oxidation. Durch Umweltmutagene, wie z.B. Benzo[α]pyren,
verursachte großräumige DNA-Addukte und UV-induzierte Photoläsionen werden
über den Weg der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) beseitigt. Zur Reparatur von
Basenfehlpaarungen sowie von Polymerasen eingefügte Nukleotid-Insertionen und
-Deletionen, wie sie bei der Replikation entstehen können, dient die Fehlpaarungs-
oder Mismatchreparatur (zusammengefasst in Friedberg, 2001, 2003). Dem Fokus
dieser Arbeit entsprechend werden im Folgenden einzelne Aspekte der DNA-
Schadensinduktion und der DNA-Reparatur eingehender erläutert.
2.2.1 Oxidative DNA-Schäden und die Basenexzisionsreparatur
Oxidative Schäden an zellulären Makromolekülen, wie Lipiden, Proteinen und der
DNA, werden in der Zelle durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) verursacht. Sie
können durch entzündliche Prozesse in der Zelle, ionisierende Strahlung,
langwelliges UV-Licht oder kontinuierlich als Nebenprodukte der aeroben Zellatmung
entstehen und werden über ein fein reguliertes Abwehrsystem abgebaut.
Enzymatische Abwehrmechanismen, wie Superoxiddismutasen, Peroxidasen und
Reduktasen sowie nicht-enzymatische Antioxidantien, wie Glutathion, Ascorbinsäure
und Carotinoide stellen die wesentlichen Bestandteile der zellulären Abwehr gegen
ROS dar, welche jedoch unvollständig ist. Durch das Gleichgewicht zwischen der
EINLEITUNG 12
chronischen ROS-vermittelten Induktion und Reparatur oxidativer DNA-Schäden
existiert in Zellen ein Grundschaden der zellulären DNA (Epe, 2002). Die Exposition
gegenüber exogenen Noxen, wie UVA-Strahlung oder redoxaktiven Chemikalien,
kann zu einer erhöhten Bildung von ROS oder zu einer Deaktivierung zellulärer
Detoxifizierungsmechanismen führen und in Folge dessen oxidativen Stress und
vermehrt auftretende oxidative Schäden von Makromolekülen hervorrufen. Durch
Interaktion von reaktiven Sauerstoffspezies mit der DNA entsteht ein vielfältiges
Spektrum an DNA-Schäden. Dabei stellt das prämutagene 8-Oxoguanin einen der
schwerwiegendsten oxidativen DNA-Basenschäden dar, da es sich bei der
Replikation mit Adenin paaren und somit Mutationen hervorrufen kann
(zusammengefasst in Friedberg, 2006).
Die Basenexzisionsreparatur dient der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität
und repariert oxidative DNA-Schäden, alkylierte DNA-Basen, Uracil und abasische
Stellen. Die BER besteht im Wesentlichen aus drei Schritten und wird durch Enzyme
der Familie der DNA-Glykosylasen eingeleitet. Substratspezifische Glykosylasen
erkennen die geschädigte Base und entfernen diese durch Hydrolyse der
N-glycosidischen Bindung zwischen Base und Zucker-Posphat-Rückgrat.
Anschließend hydrolysiert eine AP-Endonuklease die Phosphodiesterbrücke an der
5’-Position zur abasischen Stelle und das Desoxyribosephosphat wird an der 3’-
Position zur AP-Stelle durch eine Desoxyribosephosphatdiesterase abgespalten.
Dadurch entsteht eine Lücke von einem Nukleotid in 5’-Position zur abasischen
Stelle. Alternativ existieren Glykosylasen, welche die Glykosylaseaktivität mit einer
Endonuklease- oder 3’-Lyase-Aktivität vereinen. In der short-patch BER wird ein
Nukleotid durch die Polymerase ß eingefügt und ein Enzymkomplex aus DNA-Ligase
III, Pol ß und XRCC1 katalysiert die Ligation. Bei der long-patch BER werden durch
die Polymerase δ und ε bis zu 10 Nukleotide synthetisiert. Nachfolgend werden die
überschüssigen Desoxyriboseeinheiten durch das Zusammenspiel der Flap-
Endonuklease-1 und PCNA entfernt und die Reparatur durch die Ligase I vollendet
(zusammengefasst in Friedberg, 2006; Wilson und Bohr, 2007).
EINLEITUNG 13
2.2.2 Helixverzerrende DNA-Schäden und die Nukleotidexzisions-reparatur
Durch Umweltmutagene oder deren Metabolite verursachte großräumige bzw.
helixverzerrende DNA-Schäden werden durch die Nukleotidexzisionsreparatur aus
der DNA entfernt. In dieser Arbeit wurden zur Schädigung der DNA
(+)-anti-Benzo[α]pyrendiolepoxid, der reaktive Metabolit von Benzo[a]pyren, und
UVC-Strahlung eingesetzt. Aus diesem Grund werden im Folgenden zunächst
Benzo[α]pyrendiolepoxid (BPDE)- und UVC-induzierte DNA-Schäden beschrieben,
um anschließend auf den Mechanismus der Nukleotidexzisionsreparatur einzugehen.
2.2.2.1 BPDE-induzierte DNA-Schäden
Wegen ihrer Persistenz, Toxizität und ihrer ubiquitären Verbreitung zählen
Polyaromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) zu den bedeutendsten
Umweltschadstoffen. Sie entstehen durch unvollständige Verbrennungsprozesse
organischer Materialien und umfassen Verbindungen mit maximal sechs
kondensierten, meist aromatischen Ringen. Im Körper werden sie zu aromatischen
Elektrophilen metabolisiert, welche mit Purinbasen der DNA stabile Addukte bilden
können. Die Kanzerogenität vieler PAK ist bekannt, wobei Benzo[α]pyren (B[α]P) zu
den stärksten Kanzerogenen aus dieser Gruppe gehört und von der International
Agency for Research on Cancer als krebserregend für den Menschen eingestuft
wurde (IARC, 2008). Mit Ausnahme der beruflichen Expositionen stellen Tabakrauch
und Lebensmittel die Hauptexpositionsquellen für den Menschen dar. Dabei
stammen ca. 70 % der täglichen B[α]P-Aufnahme aus Lebensmitteln, wie Gemüse,
Fisch und Fleisch (Phillips, 1999). Die berufliche Exposition ist insbesondere bei
Schornsteinfegern und Arbeitern in Kokereien und Gasfabriken, bei der
Aluminiumherstellung, der Eisen- und Stahlerzeugung und in Gießereien besonders
hoch (Praml und Nowak, 1998).
B[α]P ist gut über den Magen-Darmtrakt, die Haut und die Lunge resorbierbar und
wird im Verlauf des menschlichen Fremdstoffmetabolismus zu einer Vielzahl
Metabolite umgesetzt (Abbildung 5). Der wahrscheinlich relevanteste Reaktionsweg
für die kanzerogene Wirkung von B[α]P ist die Bildung des ultimalen Kanzerogens
(+)-anti-BPDE ((+)-r-7,t-8-dihydroxy-t-9,10-epoxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyren)
und dessen Interaktion mit der DNA. BPDE bildet vor allem stabile DNA-Addukte an
EINLEITUNG 14
der N2-Position von Guanin. Infolge der damit verbundenen Helixverzerrung der DNA
werden die Replikation und Transkription inhibiert und Mutationen hervorgerufen
(Conney et al., 1994; Melendez-Colon et al., 1999). Als weitere Ursache für die
zytotoxische und potentiell mutagene Wirkung des B[α]P gilt weiterhin die Induktion
reaktiver Sauerstoffspezies über die Bildung von Chinonen. Aus B[α]P gebildete
Dihydrodiole werden durch eine Dehydrogenase in Katechole umgewandelt, die zu
Semichinonradikalen und o-Chinon autoxidieren und dabei ROS freisetzen.
o-Chinone können instabile DNA-Addukte bilden oder werden durch nicht-
enzymatische Reduktion in Katechole überführt, welche durch Oxidation erneut zur
Produktion von ROS beitragen können (zusammengefasst in Bolton et al., 2000).
Des Weiteren wird angenommen, dass an der C6-Position des B[α]P Radikal-
Kationen gebildet werden, die instabile DNA-Addukte und infolgedessen potentiell
mutagene AP-Stellen hervorrufen (zusammengefasst in Cavalieri und Rogan, 1995).
Über die Bildung von Semichinonen können diese Radikal-Kationen außerdem zur
ROS-Produktion beitragen (Joseph und Jaiswal, 1994).
instabile DNA-Addukte
ROS
instabile DNA-Addukte
ROS
Cytochrom P450
Benzo[a]pyren
erweiterteChinone
Semichinone
Autoxidation
Reduktion
HydrolyseAutoxidation
Cytochrom P450(Ein-Elektronen-Oxidation)
•+
8
10
12 1
3
7 6
9 Cytochrom P450Epoxidhydrolasen
Benzo[a]pyren
erweiterteChinone
Semichinone
Autoxidation
Reduktion
HydrolyseAutoxidation
Cytochrom P450(Ein-Elektronen-Oxidation)
•+ ••+
8
10
12 1
3
7 6
9
8
10
12 1
3
7 6
910
12 1
3
7 6
9
12 1
3
7 6
9
ROS
2
45
11
SemichinonradikalanionSemichinonradikalanion
HO
OH
OO
Cytochrom P450
(+)-anti-BPDE
O2
Katechol
o-Chinon
HOHO
O
HOHO
HO
NHN
NHN
N
O
DNA
HO
HO
O2-•
O2-•
H2O2
O
O
-
HO
OH
HO
OH
OO
Cytochrom P450
(+)-anti-BPDE
O2
Dihydrodiol-Dehydrogenase
Katechol
o-Chinon
HOHO
HOHOHO
O
HOHO
HO
NHN
NHN
N
O
DNA
HO
HO
O2-•O2-•
O2-•O2-•
H2O2
O
O
- O
O
- O
O
O
O
-
N2-Guaninaddukt
NADPH
NADP+
OH
HO
OH
GS
GSH-Konjugat
GSTGSH
instabile DNA-Addukte
ROS
instabile DNA-Addukte
ROS
Cytochrom P450
Benzo[a]pyren
erweiterteChinone
Semichinone
Autoxidation
Reduktion
HydrolyseAutoxidation
Cytochrom P450(Ein-Elektronen-Oxidation)
•+ ••+
8
10
12 1
3
7 6
9
8
10
12 1
3
7 6
9 Cytochrom P450Epoxidhydrolasen
Benzo[a]pyren
erweiterteChinone
Semichinone
Autoxidation
Reduktion
HydrolyseAutoxidation
Cytochrom P450(Ein-Elektronen-Oxidation)
••+ ••+
8
10
12 1
3
7 6
910
12 1
3
7 6
9
8
10
12 1
3
7 6
9
12 1
3
7 6
910
12 1
3
7 6
9
12 1
3
7 6
9
ROS
2
45
11
SemichinonradikalanionSemichinonradikalanion
HO
OH
HO
OH
OO
Cytochrom P450
(+)-anti-BPDE
O2
Katechol
o-Chinon
HOHO
HOHOHO
O
HOHO
HO
NHN
NHN
N
O
DNA
HO
HO
O2-•O2-•
O2-•O2-•
H2O2
O
O
- O
O
- O
O
O
O
-
HO
OH
HO
OH
OO
Cytochrom P450
(+)-anti-BPDE
O2
Dihydrodiol-Dehydrogenase
Katechol
o-Chinon
HOHOHO
HOHOHO
O
HOHO
HO
NHN
NHN
N
O
DNA
HO
HO
O2-•O2-•
O2-•O2-•
H2O2
O
O
- O
O
O
O
- O
O
O
O
- O
O
O
O
-
N2-Guaninaddukt
NADPH
NADP+
OH
HO
OH
GS
OH
HO
OH
GS
GSH-Konjugat
GSTGSH
Abbildung 5: Metabolismus von Benzo[α]pyren (modifiziert nach Conney et al., 1994; Joseph und Jaiswal, 1994; Cavalieri und Rogan, 1995; Bolton et al., 2000).
EINLEITUNG 15
An der Detoxifizierung von (+)-anti-BPDE und seinen Metaboliten sind vor allem
Glutathion-S-transferasen (GST), UDP-Glucuronosyltransferasen und
Sulfotransferasen beteiligt. Die GST-katalysierte Konjugation an Glutathion als
Hauptweg der metabolischen Inaktivierung von (+)-anti-BPDE wird in Kapitel 2.3
beschrieben.
2.2.2.2 UV-induzierte DNA-Schäden
UV-Strahlung, deren Hauptquelle für die menschliche Exposition die Sonne ist, wird
in die drei Wellenlängenbereiche UVA (315 bis 400 nm), UVB (280 bis 315 nm) und
UVC (100 bis 280 nm) unterteilt. Für die Exposition des Menschen sind
ausschließlich UVA- und UVB-Strahlung relevant, die mit einem Anteil von 95 bzw.
5 % die Erde erreichen. UVC-Strahlung wird dagegen von der Ozonschicht
vollständig resorbiert. Das verursachte Schadensspektrum variiert mit der
Wellenlänge. UVA-Strahlung führt hauptsächlich zu oxidativen Basenschäden,
während UVB überwiegend und UVC-Strahlung fast ausschließlich DNA-
Photoprodukte induziert. UVC-Strahlung führt hauptsächlich durch [2+2]-Zyklo-
addition zur Bildung von DNA-helixverzerrenden Cyclobutanpyrimidindimeren (CPD)
und 6-4-Photoprodukten (6-4-PP). Dabei werden durchschnittlich dreimal mehr CPD
als 6-4-PP induziert (Ravanat et al., 2001). Beide Verbindungen sind zytotoxisch und
können zu Mutationen führen. Obwohl 6-4-PP in geringerem Maße auftreten, sind sie
aufgrund ihres höheren mutagenen Potentials von großer biologischer Bedeutung.
Die eingesetzte Wellenlänge von 254 nm stimmt nahezu mit dem
Absorptionsmaximum der DNA überein, wird nur ineffizient von Proteinen absorbiert
und führt infolgedessen zu einer relativ spezifischen Photoreaktion mit der DNA
(IARC, 1992; Brendler-Schwaab et al., 2004; Friedberg, 2006).
N
NH
O
O
N
NH
O
O
DNA DNA
N
NH
O
O
N
NH
O
O
DNA DNA
N
NH
O
O
OH
N
NH
O
DNADNA
UVC UVC
CPD 6-4-PP
N
NH
O
O
N
NH
O
O
DNA DNA
N
NH
O
O
N
NH
O
O
DNA DNA
N
NH
O
O
OH
N
NH
O
DNADNA
UVC UVC
CPD 6-4-PP
Abbildung 6: Bildung von Cyclobutanpyrimidindimeren (CPD) und 6-4-Photoprodukten (6-4-PP) am Beispiel zweier benachbarter Thyminbasen (Ravanat et al., 2001).
EINLEITUNG 16
2.2.2.3 Nukleotidexzisionsreparatur
Die Nukleotidexzisionsreparatur ist ein komplexer Reparaturmechanismus mit einer
breiten Substratspezifität, die sowohl UV-induzierte DNA-Läsionen als auch durch
andere Umweltmutagene induzierte Schäden einschließt. Die biologische Bedeutung
der NER wird anhand der autosomal rezessiven Krankheiten Xeroderma
Pigmentosum (XP), Cockayne-Syndrom (CS) und der Trichothiodystrophie deutlich.
Die NER wird in zwei Reparaturpfade unterteilt, die sich vor allem in der
Schadenserkennung unterscheiden. Die globale genomische Reparatur (GGR)
bezieht sich auf die Reparatur von nichttranskribierter DNA und umfasst somit den
Großteil der genomischen DNA. Bei aktiv transkribierten Genen werden Schäden
durch die transkriptionsgekoppelte Reparatur (TCR) aus der DNA entfernt. Im Ablauf
der NER folgen auf die Schadenserkennung die Schritte der DNA-Entwindung, der
Inzision und Schadensentfernung sowie der Reparatursynthese. Vollendet wird die
Reparatur durch die Ligation. Der in die GGR und TCR unterteilte Ablauf der
Nukleotidexzisionsreparatur ist in Abbildung 7 dargestellt.
EINLEITUNG 17
Globale genomische Reparatur Transkriptionsgekoppelte Reparatur
DNA-Ligase I
Schadenserkennung
Reparatursynthese
Schadensentfernung
DNA-Entwindung
XPC-hHR23B
RNA-Polyerase II
PCNA, RFC DNA-Polymerase ε/δ
ERCC1-XPF XPG
TFIIH (XPB, XPD)
XPG
RPA
XPA
CSB
CSA, DDB1
DDB2 (XPE)
DDB1
Globale genomische Reparatur Transkriptionsgekoppelte Reparatur
DNA-Ligase I
Schadenserkennung
Reparatursynthese
Schadensentfernung
DNA-Entwindung
XPC-hHR23B
RNA-Polyerase II
PCNA, RFC DNA-Polymerase ε/δ
ERCC1-XPF XPG
TFIIH (XPB, XPD)
XPG
RPA
XPA
CSB
CSA, DDB1
DDB2 (XPE)
DDB1
Abbildung 7: Mechanismus der humanen Nukleotidexzisionsreparatur (modifiziert nach Volker et al., 2001; Sugasawa, 2008). Dargestellt sind die Proteine mit bekannter Funktion für die NER.
In-vitro Versuche zeigten eine Beteiligung von mindestens 30 Proteinen, wobei der
Mechanismus der NER in Säugerzellen weitere Faktoren benötigt und noch nicht
vollständig aufgeklärt ist (Friedberg, 2006; Thoms et al., 2007). Zur
Schadenserkennung während der GGR bildet XPC einen heterotrimeren Komplex
mit dem humanen Homolog von RAD23B (hHR23B) und Centrin 2. Dies stabilisiert
die Bindung an partiell verzerrte, teilweise einzelsträngige DNA. Es wird
angenommen, dass aufgrund der schwächeren Helixverzerrung durch CPD diese
weniger gut von XPC erkannt werden und ihre Reparatur langsamer ist, als die von
EINLEITUNG 18
6-4-PP. Zur Erkennung von CPD dient zusätzlich das UV-damaged DNA-binding
protein (UV-DDB) mit seinen Untereinheiten DDB1 und DDB2. Dabei ersetzt
UV-DDB nicht die Schadenserkennung durch XPC, sondern begünstigt diese
(zusammengefasst in Sugasawa, 2008). UV-DDB ist nicht nur an der Erkennung von
CPD, sondern auch 6-4-PP, AP-Stellen und fehlgepaarter DNA beteiligt (Moser et al.,
2005; Wittschieben et al., 2005). Die Schadenserkennung während der TCR verläuft
unabhängig von XPC und UV-DDB. Stattdessen erfolgt die Erkennung des Schadens
durch eine Transkriptionshemmung der RNA-Polymerase II aufgrund der Verzerrung
der DNA-Helix. Infolge dessen kommt es zur Assoziation weiterer Reparaturproteine,
wie CSA, CSB und DDB1.
Nach der Schadenserkennung erfolgt um den Schaden eine initiale, lokale
Entwindung der DNA durch den basalen Transkriptionsfaktors IIH (TFIIH), der aus
zehn Untereinheiten, darunter die Helikasen XPB und XPD, besteht. An der
Rekrutierung des TFIIH sind einerseits XPC und andererseits die RNA-Polymerase
II, CSA und CSB beteiligt. Zur Bildung des Präinzisionskomplexes, der partiell
entwundene DNA enthält, lagern sich weitere Proteine an. Darunter befinden sich die
3’-Endonuklease XPG, der XPA-RPA Proteinkomplex und die 5’-Endonuklease XPF-
ERCC1. Das Zinkfingerprotein XPA bindet an DNA, ist an der Protein-Protein-
Interaktion zu TFIIH und RPA beteiligt und ist für die Endonukleaseaktivität von
ERCC1 unerlässlich. Anschließend erfolgt die Exzision eines Oligonukleotids mit der
Länge von 24 bis 32 Nukleotiden durch XPG und XPF-ERCC1. Die DNA-
Neusynthese in der entstandenen Lücke wird durch die Polymerasen δ und ε in
Gegenwart von PCNA und RPA katalysiert, bevor die DNA-Ligase I den
Reparaturprozess beendet (zusammengefasst in Sugasawa, 2008). Obwohl Details
des molekularen Mechanismus der TCR noch unklar sind, gilt die TCR als der
schnellere und effizientere Reparaturpfad der NER, welcher zu einer schnellen
Wiedererlangung der transkriptionellen Aktivität führt (zusammengefasst in Mellon,
2005).
2.2.2.4 Das Xeroderma Pigmentosum Protein A
Xeroderma Pigmentosum-Patienten zeigen eine gesteigerte Sensitivität gegenüber
UV-Licht sowie eine um mehr als 1000fach gesteigerte Prädisposition gegenüber
Hautkrebs. Ursache dafür ist ein Defekt in einem Gen der XP-Komplementations-
gruppen A bis G oder V (Thoms et al., 2007). Bei dem 273 Aminosäuren langen
EINLEITUNG 19
XPA-Protein handelt es sich um ein Zinkfingerprotein, in dessen Zinkfingerdomäne
Zink durch vier Cysteine (Cys105, Cys108, Cys126 und Cys129) komplexiert wird
(Buchko et al., 1998). Die Substitution eines der vier an der Zinkbindung beteiligten
Cysteine führt zu einem Funktionsverlust von XPA und einem fast vollständigem
Erliegen der NER (Miyamoto et al., 1992).
Abbildung 8: Minimale Bindungsdomäne (98-210) und Zinkfingerdomäne (XPAzf, AS 101-137) von XPA (Ikegami et al., 1998; Bal et al., 2003).
XPA-defiziente Zellen zeigen im Gegensatz zu XPA-profizienten Zellen keine NER
Kapazität und infolge dessen eine hohe Sensitivität gegenüber UV-induzierten DNA-
Schäden (siehe Abbildung 9) (Tanaka et al., 1990; Satokata et al., 1993). In der
Vergangenheit wurden XPA-defizienten Zelllinien aus verschiedenen Spendern
isoliert, von denen vor allem die drei Zelllinien XP12RO, XP2OS und XP12BE in
Studien eingesetzt werden. XPA-/- Mausmodelle bestätigen die hohe Sensitivität
gegenüber UV-Strahlung und chemischen Mutagenen (de Vries et al., 1997a; de
Vries et al., 1997b; Bol et al., 1998; Ide et al., 2000; Tanaka et al., 2001). Dies
verdeutlicht die für die Nukleotidexzisionsreparatur essentielle Bedeutung des XPA-
Proteins. Wie bereits beschrieben ist XPA im Verlauf der NER an der Bildung des
Präinzisionskomplexes beteiligt (Volker et al., 2001; Sugasawa, 2008).
EINLEITUNG 20
XPA knock-in Zellen (XPA+):
• Überexpression von XPA
• NER profizient: Reparatur UV-induzierter DNA-Schäden
• normale Sensitivität gegenüber UV-Strahlung
XPA-defiziente Zellen (XPA-):
• G-zu-C-Transversion im XPA-Gen führt zum vorzeitigen Transkriptionsstopp
• NER-defizient: keine Reparatur UV-induzierter DNA-Schäden
• hohe Sensitivität gegenüber UV-Strahlung
SV40-
Knock-in von XPAC
Transformation
XPA knock-in Zellen (XPA+):
• Überexpression von XPA
• NER profizient: Reparatur UV-induzierter DNA-Schäden
• normale Sensitivität gegenüber UV-Strahlung
XPA-defiziente Zellen (XPA-):
• G-zu-C-Transversion im XPA-Gen führt zum vorzeitigen Transkriptionsstopp
• NER-defizient: keine Reparatur UV-induzierter DNA-Schäden
• hohe Sensitivität gegenüber UV-Strahlung
SV40-
Knock-in von XPAC
Transformation
Abbildung 9: Ursprung und Eigenschaften XPA-defizienter und XPA knock-in Zellen (modifiziert nach Tanaka et al., 1990; Satokata et al., 1993; Camenisch et al., 2006). XPAC:
Xeroderma pigmentosum complementation group A correcting gene.
2.3 Glutathion
Glutathion (GSH) ist ein in allen Organismen ubiquitär vorkommendes Tripeptid,
γ-L-Glutamyl-L-Cysteinyl-L-Glycin, welches an einer Vielzahl zellulärer Funktionen
beteiligt ist (Abbildung 10). Die Synthese erfolgt intrazellulär aus den entsprechenden
Aminosäuren in zwei aufeinander folgenden ATP-abhängigen Reaktionen. Zunächst
erfolgt die Peptidbindung zwischen Glutamat und Cystein, welche durch die
γ-Glutamylcystein-Synthetase katalysiert wird. Anschließend katalysiert die
Glutathionsynthetase die Kondensation der Carboxylgruppe des Cysteins mit der
Aminogruppe des Glycins. Die erste Reaktion stellt den limitierenden Syntheseschritt
dar, der durch GSH rückkoppelnd gehemmt und durch die Verfügbarkeit der
Aminosäuren limitiert wird (zusammengefasst in Sies, 1999; Lu, 2000).
EINLEITUNG 21
γ-Glu Cys Gly
NO
O
HH
O
NH
OH
OSH
NH2
O
NO
O
HH
O
NH
OH
OS
NH2
O
S
O
NH
HO
O
NH
O O
OH
NH2
GlutathiondisulfidGlutathion
γ-Glu Cys Gly
NO
O
HH
O
NH
OH
OSH
NH2
O
NO
O
HH
O
NH
OH
OS
NH2
O
S
O
NH
HO
O
NH
O O
OH
NH2
GlutathiondisulfidGlutathion Abbildung 10: Struktur von Glutathion und Glutathiondisulfid. γ-Glu: Glutaminsäure; Cyc: Cystein, Gly: Glycin.
Das niedermolekulare Tripeptid ist das vorherrschende zelluläre Thiol und kommt in
millimolaren Konzentrationen vor. Gemeinsam mit dem oxidierten Glutathiondisulfid
(GSSG), welches durch Oxidation und Ausbildung einer Disulfidbrückenbindung
gebildet wird, stellt es das wichtigste Redox-Puffersystem der Zelle dar. Die
intrazelluläre Konzentration an oxidiertem Glutathiondisulfid beträgt in der Regel
maximal 1 % des reduzierten Glutathions (Meister und Anderson, 1983; Deneke und
Fanburg, 1989). Glutathion ist an der Metabolisierung von Fremdstoffen beteiligt und
beeinflusst den Redoxstatus der Zelle. Somit beeinflusst es weitere wichtige
Prozesse, wie die Signaltransduktion, die Genexpression, die Zellproliferation und
die Apoptose (zusammengefasst in Sies, 1999). Im Folgenden wird die Bedeutung
von Glutathion im Fremdstoffmetabolismus und als Elektronendonator bei der
enzymatischen Reduktion von Peroxiden näher beschrieben (Abbildung 11).
Glutathion ist für den Abbau von reaktiven Sauerstoffspezies endogenen oder
exogenen Ursprungs von großer Bedeutung. Es fungiert als Elektronendonator bei
der enzymatischen Reduktion von Peroxiden, welche durch die Glutathion-
Peroxidase (GPx) katalysiert wird. Dabei kommt es als Folge der Oxidation von GSH
zur Bildung von GSSG. Unter physiologischen Bedingungen ist das Verhältnis von
GSH zu GSSG fein reguliert. Glutathiondisulfid wird in einer durch
Glutathionreduktasen katalysierten Reaktion unter Verbrauch von NADPH zu
reduziertem Glutathion regeneriert. Die Aufrechterhaltung eines optimalen
Verhältnisses von GSH zu GSSG ist für die Zelle von essentieller Bedeutung, da
eine Verschiebung des Gleichgewichtes zu Gunsten von GSSG die Gefahr der
oxidativen Schädigung von Proteinen, Lipiden und der DNA erhöht (Townsend et al.,
2003).
EINLEITUNG 22
Xenobiotika (X)
GSH-X-Konjugat
2 GSH
H2O + ROH
ROOH
GSSG NADPH/H+
NADP+
GSTGSH GRGPx
Abbau von Peroxiden:Fremdstoffmetabolismus:
Xenobiotika (X)
GSH-X-Konjugat
2 GSH
H2O + ROH
ROOH
GSSG NADPH/H+
NADP+
GSTGSH GRGPx
Abbau von Peroxiden:Fremdstoffmetabolismus:
Abbildung 11: Rolle von Glutathion im Fremdstoffmetabolismus und als Antioxidans (Sies, 1999). GSH: reduziertes Glutathion, GSSG: Glutathiondisulfid, GST: Glutathion-S-transferase, GPx: Glutathion-Peroxidase, GR: Glutathionreduktase, NADPH/H+:
Nicotinamidadenin-dinucleotidphosphat (reduzierte Form); NADP+: Nicotinamidadenin-
dinucleotidphosphat (oxidierte Form).
Im Zuge der Metabolisierung von Fremdstoffen erfolgt unter anderem in der Phase II
Reaktion eine Konjugation von unpolaren und elektrophilen Xenobiotika an
Glutathion. Diese Reaktion wird durch Enzyme der Glutathion-S-Transferase (GST)
Familie katalysiert und entspricht in der überwiegenden Anzahl der Fälle einer
Detoxifizierung der Fremdstoffe. Für die Inaktivierung von
(+)-anti-Benzo[α]pyrendiolepoxid gilt die GST-katalysierte Konjugation an reduziertes
Glutathion als wichtigster enzymatischer Mechanismus. Sie wirkt der toxischen
Wirkung von BPDE entgegen (Abbildung 12) (Robertson et al., 1986; Hu et al.,
1996).
EINLEITUNG 23
OH
HO
HO
N N
N N
O
NH
DNA
OH
O
OH
OH
GS
OH
OH
GSH, GST
Bildung eines N2-Guanin-Adduktes Konjugation an Glutathion
BPDE-DNA-Addukt BPDE-GSH-Konjugat
(+)-anti-BPDE
DNA
weitere Reaktionswege
OH
HO
HO
N N
N N
O
NH
DNA
OH
O
OH
OH
GS
OH
OH
OH
HO
HO
N N
N N
O
NH
DNA
OH
O
OH
OH
GS
OH
OH
GSH, GST
Bildung eines N2-Guanin-Adduktes Konjugation an Glutathion
BPDE-DNA-Addukt BPDE-GSH-Konjugat
(+)-anti-BPDE
DNA
weitere Reaktionswege
Abbildung 12: (+)-anti-Benzo[α]pyrendiolepoxid - Bildung von BPDE-DNA-Addukten und enzymatische Detoxifizierung. GSH: reduziertes Glutathion, GST: Glutathion-S-transferase.
Glutathion-S-transferasen katalysieren die Konjugation von reduziertem Glutathion
an eine Vielzahl von Elektrophilen endogenen oder exogenen Ursprungs. Die Familie
der GST wird in sieben Klassen unterteilt, von denen in Säugerzellen die Alpha
(GSTA), Mu (GSTM) und Pi (GSTP) Klassen am häufigsten exprimiert werden
(Sheehan et al., 2001). Die humanen Isoenzyme GSTM-1, GSTP1 und GSTA1
besitzen die höchste katalytische Aktivität zur Konjugation von (+)-anti-BPDE
(Sundberg et al., 2002). Ein wichtiger Transkriptionsfaktor für die basale und
induzierbare Genexpression der Glutathion-S-transferasen ist Nrf2 (nuclear factor
E2-related factor) (Hayes et al., 2000; Ramos-Gomez et al., 2001). Nrf2 wird von
keap1 (kelch-like ECH-associated protein 1) im Cytosol verankert und translokalisiert
nach Einwirkung elektrophiler oder oxidativer Stimuli in den Kern. Dort bindet Nrf2 an
antioxidativ-responsive Elemente (ARE), welche sich in der regulatorischen Region
der Zielgene befinden. Daneben wurden weitere Bindungsstellen für
Transkriptionsfaktoren, wie z.B. C/EBPß, NF-κB und AP-1, identifiziert. Deren
Funktionen sowie die transkriptionelle Regulation der einzelnen Klassen der
Glutathion-S-transferasen sind noch nicht vollständig aufgeklärt (zusammengefasst
in Coles und Ketterer, 1990; Hayes et al., 2005; Pool-Zobel et al., 2005).
FRAGESTELLUNG 24
3 FRAGESTELLUNG Selen ist für den Menschen ein essentielles Spurenelement, welches mit der
Nahrung und in Form von Nahrungsergänzungsmitteln aufgenommen wird. Aufgrund
der antioxidativen Eigenschaften der Selenoproteine, insbesondere der Glutathion-
Peroxidasen und der Thioredoxin-Reduktasen, wird Selen eine antikanzerogene
Wirkung zugesprochen (Whanger, 2004; Letavayova et al., 2006). Außerdem wurde
als Mechanismus der Steigerung der genomischen Stabilität eine Stimulation von
DNA-Reparaturprozessen postuliert (Seo et al., 2002; Fischer et al., 2007).
Epidemiologische Studien zur Auswirkung einer erhöhten Selenversorgung auf die
Tumorinzidenz zeigen bisweilen ein uneinheitliches Bild. Insbesondere die
umfangreichste Nutritional Prevention of Cancer Studie zeigte sowohl inverse als
auch direkte Korrelationen einiger Tumorarten (Clark et al., 1996; Duffield-Lillico et
al., 2002). Neben den antioxidativen Eigenschaften sind prooxidative Effekte einiger
Selenverbindungen bekannt. Diese scheinen von der chemischen Struktur und dem
daraus resultierenden zellulären Metabolismus der Verbindungen abhängig zu sein.
Anhand von reduzierbarem Natriumselenit und vollständig reduziertem
Selenomethionin, die einem unterschiedlichen zellulären Metabolismus unterliegen,
soll zum einen deren direkte Genotoxizität anhand der Induktion oxidativer DNA-
Schäden und der Beeinflussung des Redoxhaushaltes in A549 Zellen untersucht
werden. Außerdem sollen die indirekten genotoxischen Wirkungen der beiden
Selenverbindungen anhand der Interaktion mit Umweltmutagenen in intakten Zellen
aufgeklärt werden. Dabei soll einerseits die Reparatur UVC-induzierter DNA-
Photoläsionen untersucht werden. Andererseits steht die Induktion und Reparatur
von (+)anti-Benzo[α]pyrendiolepoxid (BPDE), dem ultimalen Kanzerogen von
Benzo[α]pyren, sowie die Beeinflussung der Detoxifizierung von BPDE im
Vordergrund. Als mögliche Ursache der indirekten Genotoxizität soll die Interaktion
von Natriumselenit und Selenomethionin mit der Zinkfingerdomäne des DNA-
Reparaturproteins Xeroderma Pigmentosum Proteins A (XPA) untersucht werden.
Die Ausbildung des Zinkfingers und demzufolge die Aktivität des XPA- Proteins ist für
die Nukleotidexzisionsreparatur von essentieller Bedeutung. Sowohl die
Zinkfreisetzung als auch die Verminderung der DNA-Bindungsfähigkeit von XPA wird
durch die Redoxeigenschaften einiger Selenverbindungen hervorgerufen (Blessing et
al., 2004).
MATERIAL UND METHODEN 25
4 MATERIAL UND METHODEN Eine Zusammenstellung aller verwendeten Chemikalien, Lösungen und Puffer sowie
der benutzten Geräte und Verbrauchsmaterialien befindet sich im Anhang.
4.1 Zellkultur und Behandlung der Zellen
4.1.1 Zelllinien
Bei den in dieser Arbeit eingesetzten adhärent wachsenden Zelllinien handelte es
sich um die humane Lungenadenokarzinomzellen der Linie A549, humane XPA-
defiziente SV40-transformierte Fibroblasten (XPA-) und daraus entstandene XPA
knock-in Fibroblasten (XPA+). Die XPA- Zellen, genauer XP2OS, entstammen einem
weiblichen asiatischen Spender mit einem Gendefekt im XPA-Gen und daraus
resultierender schwerwiegender Xeroderma Pigmentosum Erkrankung. Es liegt eine
G zu C Transformation vor, die zur frühzeitigen Beendigung der Translation führt
(Satokata et al., 1990; Tanaka et al., 1990). Die XPA+ Zellen, genauer XP2OS-
pCAH19WS, sind durch Transfektion der cDNA des XPAC Gens (Xeroderma
Pigmentosum complementation group A Correcting gene) aus XPA- Zellen
entstanden und zeigen dadurch im Gegensatz zu den XPA- Zellen eine normale
Sensitivität gegenüber UV-Licht (Levy et al., 1995) (siehe Abbildung 9).
Die Zellen wachsen als Monolayer in Zellkulturschalen bei 37 °C, 5 % CO2 und 100
% Luftfeuchtigkeit. Als Kulturmedium für die A549 Zellen wurde DMEM (1000 mg/l)
mit einem Zusatz von 10 % FKS, Penizillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 µg/ml)
verwendet. XPA- und XPA+ Zellen wurden in DMEM mit 4500 mg/l Glukose mit
einem Zusatz von 15 % FKS, 100 µM nicht-essentielle Aminosäuren, Penizillin
(100 U/ml) und Streptomycin (100 µg/ml) kultiviert. Die Zellen wurden regelmäßig
mittels PCR auf Mykoplasmenkontamination untersucht. Die Lagerung der Zellen
erfolgte in flüssigem Stickstoff bei –196 °C in einem Einfriermedium aus 90 % FKS
und 10 % DMSO.
4.1.2 Zellkultur
Sämtliche Zellkulturarbeiten wurden unter einer Sicherheitswerkbank durchgeführt.
Mediumflaschen wurden nach dem Erwärmen im Wasserbad auf 37 °C mit 70%igem
MATERIAL UND METHODEN 26
Ethanol abgewischt und nach dem Öffnen unter der Sterilbank abgeflammt. Die
verwendeten Glaspipetten wurden bei 180 °C für 4 Stunden heißsterilisiert.
Kunststoffpipettenspitzen und Flaschen wurden bei 120 °C für 20 Minuten bei 3 atm
autoklaviert.
Alle 3 bis 4 Tage wurden die Zellen in eine neue Zellkulturschale oder -flasche mit
frischem Medium überführt (Passagieren). Dazu wurde das Kulturmedium abgesaugt
und die Schale zunächst mit Trypsin gewaschen. Nach dem Absaugen wurde erneut
Trypsin hinzu pipettiert, 30 Sekunden geschwenkt, das Trypsin abgesaugt und die
Schale für 2-3 Minuten in den Brutschrank gestellt. Nach Zugabe von frischem
Medium wurden die Zellen mit einer Pipette vereinzelt. Die Bestimmung der Zellzahl
erfolgte mit dem automatischen Zellzählgerät (Casy). Eine entsprechende Menge der
Zellsuspension wurde in eine neue Zellkulturschale mit frischem Medium gegeben,
die Schale zur Verteilung der Zellen hin und her bewegt und im Brutschrank
aufbewahrt.
4.1.3 Inkubationslösungen
Zur Inkubation der Zellen mit Natriumselenit, Selenomethionin oder
Buthioninsulfoximin (BSO) wurden aus sterilfiltrierten Stammlösungen (10 bzw. 100
mM) durch Verdünnen geeignete Arbeitslösungen hergestellt und diese in
entsprechender Menge in das Kulturmedium pipettiert. Zur Behandlung mit Menadion
wurde eine 10 mM Stammlösung in DMSO hergestellt und diese in entsprechender
Menge ins Medium pipettiert. Als Kontrolle diente in diesem Fall Dimethylsulfoxid.
Zur Inkubation der Zellen mit dem reaktiven Metaboliten (+)-anti-BPDE
((+)-anti-Benzo[α]pyren-7,8-diol-9,10-epoxid) wurde die bei -80 °C gelagerte
Stammlösung (1 mg/ml in THF/5 % Triethylamin) unmittelbar vor der Verwendung in
THF/0,5 % Triethylamin verdünnt und im Verhältnis 1:1000 in das Medium pipettiert,
so dass die Lösungsmittelkonzentration immer 0,1 % beträgt. Nach 1 h wurde die
Inkubation durch Waschen mit FKS-freiem Medium beendet.
4.2 Bestimmung der Aktivität der Glutathion-Peroxidase
Die Aktivität der Glutathion-Peroxidase (GPx) wurde nach einer von Paglia et al.
(1967) entwickelten Methode bestimmt. Die Glutathion-Peroxidase katalysiert die
MATERIAL UND METHODEN 27
Reaktion zwischen Kumolhydroperoxid und GSH. Das dabei freigesetzte GSSG wird
durch im Reaktionsansatz enthaltene Glutathion-Reduktase zu GSH reduziert.
Gleichzeitig wird NADPH zu NADP+ oxidiert, was mit einer Verminderung der
Absorption bei 412 nm verbunden ist (Abbildung 13). Der Abfall der Absorption ist
dabei proportional zur GPx-Aktivität.
GSHOH2
CH3OOH
CH3
CH3
CH3
OH GSSG
GSSG NADPH H+ GR
GSH NADP
GPx2+
-+
+ ++ + Abbildung 13: Bestimmung der GPx-Aktivität anhand der Reduktion von Kumolhydroperoxid (Paglia und Valentine, 1967). GSH: Glutathion; GSSG: Glutathiondisulfid; GPx: Glutathion-Peroxidase; NADPH/H+: Nicotinamidadenin-
dinucleotidphosphat (reduzierte Form); NADP+: Nicotinamidadenindinucleotidphosphat
(oxidierte Form); GR: Glutathionreduktase.
4.2.1 Versuchsdurchführung
In 100 mm Zellkulturschalen wurden 2x106 A549 Zellen ausgesät und nach 24 h mit
Natriumselenit oder Selenomethionin inkubiert. Nach weiteren 24 h wurden die
Zellen zur Entfernung von Mediumresten mit Lysepuffer gespült und durch
Abschaben in 100 µl Lysepuffer geerntet. Nach 20minütiger Inkubation auf Eis
wurden die Lysate 15 min bei 10000 g (4 ºC) zentrifugiert und die Überstände zur
Enzymaktivitätsbestimmung eingesetzt. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte nach den
Herstellerangaben des Glutathion-Peroxidase Test Kits (Cayman Chemical) als
Doppelbestimmung in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte. Die Angabe der mit Hilfe des
molaren Extinktionskoeffizienten von NADPH (6,22 nM-1•cm-1) errechneten GPx-
Aktivität erfolgt in Bezug zur Proteinmenge. Diese wurde nach Bradford (1976)
quantifiziert.
4.2.2 Proteinbestimmung nach Bradford
Die Proteinbestimmung nach Bradford (1976) beruht auf der Verschiebung des
Absorptionsmaximas des im Bradfordreagenz enthaltenen Farbstoffes Coomasie
Brilliant Blau G 250 durch Bindung an Proteine bei saurem pH von 465 auf 595 nm.
MATERIAL UND METHODEN 28
20 µl einer geeigneten Probenverdünnung wurden als Doppelbestimmung in eine
96-Loch-Mikrotiterplatte pipettiert. Nach Zugabe von 180 µl Bradfordfärbelösung
(BioRad-Reagenz) wurde die Absorption bei 595 nm nach genau fünf Minuten in
einem Mikrotiterplattenlesegerät (TECAN SpectraFluor) bestimmt. Die Berechnung
der Proteinkonzentration erfolgte anhand einer externen Kalibriergerade mit
Rinderserumalbumin (BSA) im Bereich von 0-150 µg/ml, welche auf jeder Lochplatte
mitgeführt wurde.
4.3 Bestimmung der Koloniebildungsfähigkeit
Zur Untersuchung der Koloniebildungsfähigkeit wurden jeweils 1x106 Zellen in eine
100 mm Zellkulturschale ausgesät. Nach einer Adhäsionsszeit von 24 h folgte die
Inkubation mit den jeweiligen Selenverbindungen. Nach weiteren 24 h wurden die
Zellen abtrypsiniert. Gegebenenfalls wurde nach 23-stündiger Inkubation der
jeweiligen Selenverbindung mit 50 nM BPDE für eine Stunde koinkubiert und
abtrypsiniert. Nach dem Vereinzeln wurden die Zellen entsprechend einer 1:20
Verdünnung in ein Eppendorfgefäß mit Medium pipettiert und die Zellzahl am
automatischen Zellzählgerät (CASY) ermittelt. Aus der 1:20 Verdünnung wurden
anschließend jeweils 300 Zellen in 60 mm Zellkulturschalen mit 5 ml Medium
ausgesät und die Schalen für weitere 9 Tage im Brutschrank aufbewahrt. In dieser
Zeit wuchsen aus den einzelnen Zellen deutlich sichtbare Kolonien heran, die im
Anschluss gefärbt werden. Dazu wurde das Medium abgesaugt und die Schalen
wurden mit kaltem PBS einmal gewaschen, bevor die Kolonien 5 Minuten mit
eiskaltem Ethanol (96 %) fixiert und 30 Minuten mit Giemsalösung (5 % in Wasser)
gefärbt wurden. Schließlich wurden die Zellkulturschalen mit Wasser gewaschen.
Nach dem Trocknen wurden die Kolonien pro Zellkulturschale ausgezählt. Durch
Vergleich der Anzahl der Kolonien der verschiedenen Konzentrationsstufen mit der
Anzahl der unbehandelten Kontrolle wurden die längerfristigen zytotoxischen Effekte
der jeweiligen Verbindungen sichtbar.
MATERIAL UND METHODEN 29
4.4 Nachweis oxidativer DNA-Schäden
Die Induktion von oxidativen DNA Schäden durch Selenverbindungen wurde mit Hilfe
der Methode der Alkalischen Entwindung zum Nachweis von DNA-Strangbrüchen
untersucht. Diese wurde mit dem Einsatz der bakteriellen Formamidopyrimidin-DNA-
Glykosylase (Fpg) kombiniert, wodurch zusätzlich der Nachweis oxidativer DNA-
Basenmodifikationen, die durch Fpg erkannt werden, möglich war. Dabei stellen
8-Oxoguanin, imidazolringoffene Purine und AP-Stellen Substrate für Fpg dar (Tchou
et al., 1991; Boiteux et al., 1992; Haring et al., 1994). Der DNA-Entwindung im
alkalischen Milieu folgte die chromatographische Trennung von einzel- und
doppelsträngiger DNA an Hydroxylapatit und die fluorimetrische Quantifizierung
(Abbildung 14). Aus dem Verhältnis von einzel- und doppelsträngiger DNA erfolgte
im Anschluss die Berechnung der Anzahl von DNA-Strangbrüchen und oxidativer
DNA-Basenmodifikationen. Hierbei ist die Entwindung der DNA umso stärker
ausgeprägt, je größer die Anzahl an oxidativen DNA-Schäden ist.
Fluoreszenzdetektion von einzel- und doppelsträngiger DNA(Kalibrierung mit Röntgenstrahlung)
Behandlung mit Fpg
Entfernung der Histone (2 M NaCl)
Lyse
oxidative DNA-Basenmodifikation, AP-Stelle
Alkalische Entwindung (pH 12,3)
Neutralisation (pH 6,8), Ultraschallbehandlung
Trennung von einzel- und doppelsträngiger DNA(Hydroxylapatit-Chromatographie)
Inkubation mit Natriumselenit oder
Selenomethionin
DNA-Strangbruch
A549 Zellen Chromatin
Fluoreszenzdetektion von einzel- und doppelsträngiger DNA(Kalibrierung mit Röntgenstrahlung)
Behandlung mit Fpg
Entfernung der Histone (2 M NaCl)
Lyse
oxidative DNA-Basenmodifikation, AP-Stelle
Alkalische Entwindung (pH 12,3)
Neutralisation (pH 6,8), Ultraschallbehandlung
Trennung von einzel- und doppelsträngiger DNA(Hydroxylapatit-Chromatographie)
Inkubation mit Natriumselenit oder
Selenomethionin
DNA-Strangbruch
A549 Zellen Chromatin
Abbildung 14: Prinzip der Alkalischen Entwindung.
MATERIAL UND METHODEN 30
4.4.1 Versuchsansatz
In 40 mm Zellkulturschalen wurden 1x105 A549 Zellen ausgesät und nach 24 h mit
Natriumselenit oder Selenomethionin inkubiert. Nach Beendigung der Adhäsions-
bzw. Inkubationszeit wurden das Kulturmedium nach weiteren 24 h entfernt, 2 ml
eiskaltes PBS zugegeben und die Zellkulturschalen bis zur Lyse auf Eis gelagert.
Dabei wurden pro Inkubationskonzentration jeweils drei Schalen für die Bestimmung
von DNA-Strangbrüchen und die Quantifizierung Fpg-sensitiver Stellen angesetzt.
Alle folgenden Arbeiten wurden zur Vermeidung von durch Licht induzierten DNA-
Schäden in einem abgedunkelten Raum durchgeführt.
4.4.2 Alkalische Entwindung
Zunächst wurde das PBS durch je 500 µl Lysepuffer ersetzt. Nach 5 min wurde
dieser entfernt und es folgten eine 2minütige Inkubation mit je 500 µl Salzlösung und
nach dem Absaugen eine 8minütige Nachinkubation auf Eis. Dies gewährleistet die
Zugänglichkeit der Fpg zum DNA-Schaden. Innerhalb der folgenden 30minütigen
Inkubation mit 760 µl Fpg-Puffer mit Fpg (1 µg/ml) bzw. ohne Fpg bei 37 ºC wurden
oxidative DNA-Basenmodifikation durch Fpg in DNA-Strangbrüche umgewandelt.
Anschließend erfolgte die Entwindung der DNA im alkalischen Milieu bei pH 12,3
durch Zugabe von 775 µl alkalischer Lösung. Nach exakt 30 min wurde die
Entwindung durch Rückneutralisation auf pH 6,8 abgebrochen. Das dafür
notwendige Volumen 0,1 M HCl wurde vorher ermittelt. Nach dem Durchmischen der
Probe wurde diese auf Eis mit einer Ultraschallspitze für 15 s bei 30 Watt sonifiziert.
Um einer Renaturierung der DNA-Fragmente vorzubeugen wurden anschließend
15 µl SDS-Lösung (10%ig) zugegeben. Die Proben wurden bis zur Chromatographie
bei -18 ºC gelagert.
4.4.3 Chromatographie und fluorimetrische Quantifizierung
Zunächst wurden alle benötigten Puffer und die Proben auf 60 ºC temperiert. Zur
Präparation der Chromatographiesäulen wurden je 1 ml Hydroxylapatit-Suspension
(0,1 g/ml in 0,01 M Natriumphosphatpuffer, 30 min bei 60 ºC gequollen) in eine 2 ml
Einwegspritze gefüllt. Dabei stellen Glasfilterfritten ober- und unterhalb des
Säulenmaterials deren Abschluss dar. Die vorbereiteten Säulen wurden mit 1,5 ml
MATERIAL UND METHODEN 31
0,5 M Kaliumphosphatpuffer gewaschen und mit 1,5 ml 0,01 M
Natriumphosphatpuffer konditioniert, bevor die Proben aufgegeben wurden und mit
2,5 ml 0,01 M Natriumphosphatpuffer gespült wurden. Danach wurden zunächst die
einzelsträngige DNA mit 1,5 ml Kaliumphosphatpuffer (0,15 M) und anschließend die
doppelsträngige DNA mit 1,5 ml Kaliumphosphatpuffer (0,35 M) getrennt
voneinander in 24-Lochplatten eluiert. Abschließend erfolgt die fluorimetrische
Quantifizierung am Mikrotiterplattenlesegerät (Tecan, Emission 360 nm, Extinktion
455 nm) durch Zugabe von 3,75 µl Höchst-Farbstoff 33258 (0,3 mM). Abbildung 15
zeigt die Berechnung der Anzahl der induzierten DNA-Schäden anhand der
Fluoreszenzwerte.
relative Fluoreszenz (Doppelstrang)
relative Fluoreszenz (Doppelstrang) + 2,1 x relative Fluoreszenz (Einzelstrang) ds DNA =
Anzahl der DNA-Strangbrüche = -lnds DNA (Probe ohne Fpg)
ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666
Anzahl der Fpg-sensitiven Stellen = -lnds DNA (Probe ohne Fpg)
ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666
relative Fluoreszenz (Doppelstrang)
relative Fluoreszenz (Doppelstrang) + 2,1 x relative Fluoreszenz (Einzelstrang) ds DNA =
Anzahl der DNA-Strangbrüche = -lnds DNA (Probe ohne Fpg)
ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666
Anzahl der Fpg-sensitiven Stellen = -lnds DNA (Probe ohne Fpg)
ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666
relative Fluoreszenz (Doppelstrang)
relative Fluoreszenz (Doppelstrang) + 2,1 x relative Fluoreszenz (Einzelstrang) ds DNA =
relative Fluoreszenz (Doppelstrang)
relative Fluoreszenz (Doppelstrang) + 2,1 x relative Fluoreszenz (Einzelstrang) ds DNA =
Anzahl der DNA-Strangbrüche = -lnds DNA (Probe ohne Fpg)
ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666Anzahl der DNA-Strangbrüche = -ln
ds DNA (Probe ohne Fpg)
ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666
ds DNA (Probe ohne Fpg)
ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666
Anzahl der Fpg-sensitiven Stellen = -lnds DNA (Probe ohne Fpg)
ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666Anzahl der Fpg-sensitiven Stellen = -ln
ds DNA (Probe ohne Fpg)
ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666
ds DNA (Probe ohne Fpg)
ds DNA (Mittelwert der Kontrollen ohne Fpg)x 16666
Abbildung 15: Berechnung der induzierten DNA-Schäden pro Zelle. ds DNA: Anteil der doppelsträngigen DNA, relative Fluoreszenz: Fluoreszenz der Probe abzüglich der
Fluoreszenz des Pufferblindwertes.
Der Korrekturfaktor von 2,1 zur Berechnung des Anteils an doppelsträngiger DNA
berücksichtigt die stärkere Bindung des Höchstfarbstoffes an doppelsträngige DNA
(Hartwig et al., 1993). Der Korrekturfaktor 16666 ergibt sich aus der Kalibrierung mit
Röntgenstrahlung und errechnet sich aus dem Quotienten D/c. D steht dabei für die
Dosis in Gray und c für die Steigung der Kalibriergeraden (Hartwig et al., 1996).
Durch Division durch 6000 werden die errechneten DNA-Schäden pro Zelle auf 106
Basenpaare bezogen angegeben.
4.5 Quantifizierung von Gesamtglutathion und Glutathiondisulfid
Nach Anderson (1985) erfolgt die Quantifizierung von Gesamtglutathion (Summe von
GSH und GSSG) und Glutathiondisulfid (GSSG) mit Hilfe von
MATERIAL UND METHODEN 32
5,5’-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) und des durch die Glutathionreduktase
getriebenen GSSG-Recyclings (Abbildung 16). Die Kombination der Quantifizierung
des Thiolgehaltes durch DTNB mit der Verwendung der Glutathionreduktase
ermöglicht die selektive Bestimmung von Glutathion; das am häufigsten in der Zelle
vorkommende Thiol. Zur Bestimmung der GSSG-Konzentration wurde GSH selektiv
durch Zugabe von 2-Vinylpyridin derivatisiert. Die so ermittelten GSSG-Gehalte
wurden zur Berechnung des GSH-Gehaltes von der Gesamtglutathionkonzentration
subtrahiert (Anderson, 1985; Abdelmohsen et al., 2003; Rahman et al., 2006).
O2N
HOOC SS
NO2
COOH
SH
O2N
HOOC
NADPH H+
2
TNBDTNB
NADP+
GR
2 GSH GSSG
+ Abbildung 16: DTNB-Methode zur Bestimmung von Glutathion (Anderson, 1985; Rahman et al., 2006); DTNB: 5,5’-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure), TNB: 5-Thio-2-nitrobenzoesäure, GSH: Glutathion, GSSG: Glutathiondisulfid, NADP+:
Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (oxidierte Form), NADPH/H+: Nicotinamidadenin-
dinucleotidphosphat (reduzierte Form)
4.5.1 Versuchsansatz
In 100 mm Zellkulturschalen wurden 2x106 A549 Zellen ausgesät und nach 24 h mit
Natriumselenit, Selenomethionin, Menadion oder BSO inkubiert. Nach Beendigung
der Adhäsions- bzw. Inkubationszeit wurde das Kulturmedium entfernt. Nach
einmaligem Spülen mit eiskalter HCl (0,01 N) wurden die Zellen durch Abschaben in
250 µl HCl (0,01 N) geerntet und bis zur Quantifizierung bei -80 ºC gelagert.
MATERIAL UND METHODEN 33
4.5.2 Probenaufarbeitung
Die Proben wurden aufgetaut und nach zweimaligem freeze-thaw-Zyklus für 2 min
bei 14000 g und 4 ºC zentrifugiert, um Zelltrümmer aus dem Extrakt zu entfernen.
Der pH-Wert der Extrakte sollte ≤ 6 sein. Zur Proteinfällung wurden 200 µl des
Extraktes mit 68 µl Sulfosalicylsäure (20 %) versetzt, 5 min auf Eis inkubiert und
anschließend 5 min bei 14000 g und 4 ºC zentrifugiert. Die restliche Extraktmenge
wurde zur Proteinbestimmung verwendet. Aus dem nach der Proteinfällung im
Überstand befindlichen Zellextrakt wurden 40 µl direkt zur enzymatischen
Gesamtglutathionbestimmung eingesetzt und 200 µl zur Derivatisierung des GSH
verwendet. Hierzu wurden 200 µl des proteinfreien Extraktes mit 12 µl Triethanolamin
und 4 µl 2-Vinylpyridin versetzt und 60 min bei RT inkubiert. 200 µl dieser
Reaktionslösungen, deren pH-Wert nicht über 7-8 liegen sollte, wurden zur
enzymatischen GSSG-Bestimmung eingesetzt. Kalibrierlösungen für GSH (1000,
500, 100, 50, 10, 5 und 0 µM GSH in 0,01 N HCl) und GSSG (500, 100, 50, 10, 5, 1,
0,5, 0,2 und 0 µM GSSG in 0,01 N HCl) wurden auf die gleiche Weise behandelt.
4.5.3 Durchführung des Recycling-Assays
Zur enzymatischen Bestimmung von Gesamtglutathion wurden 40 µl des
proteinfreien Zellextraktes bzw. der GSH-Kalibrierlösungen mit 360 µl GSH-
Reaktionspuffer versetzt. Aus diesen Reaktionsansätzen wurden jeweils drei
Kavitäten einer 96-Lochplatte mit 100 µl beladen. Anschließend erfolgte der Start der
Enzymreaktion durch Zugabe von 10 µl Glutathionreduktaselösung (aus Bäckerhefe,
10 - 20 U/ml). Nach dem Durchmischen wurde die zeitabhängige Veränderung der
Extinktion bei 412 nm mit Hilfe eines Mikrotiterplattenlesegeräts (Labsystems) in