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U.O. ANATOMIA PATOLOGICA Il percorso del campione dal prelievo al referto Diagnosi cito-istologica e Marcatori biomolecolari Rossana Culli 08/06/2013. Il percorso del campione dal prelievo al referto FASE PRE-ANALITICA FASE ANALITICA - PowerPoint PPT Presentation
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U.O. ANATOMIA PATOLOGICA
Il percorso del campione dal prelievo al refertoDiagnosi cito-istologica
eMarcatori biomolecolari
Rossana CulliRossana Culli08/06/201308/06/2013
Il percorso del campione dal prelievo al referto
FASE PRE-ANALITICA
FASE ANALITICA
FASE POST-ANALITICA
FASE PRE-ANALITICA
PRELIEVO DEL MATERIALE DA ESAMINAREPRELIEVO DEL MATERIALE DA ESAMINARE
ALLESTIMENTO ALLESTIMENTO
inizia al momento del prelievo e si completa in laboratorio a opera del personale tecnico di Anatomia Patologica
TRASPORTO TRASPORTO
dal punto di prelievo al laboratorio
In questa fase si annidano numerosi punti critici :* insufficienza del materiale prelevato* presenza di una quantità eccessiva di sangue o di flogosi,che offuscano il preparato* contaminazione con talco che può mimare la presenza di
cellule neoplastiche* scorretto allestimento dei preparati(vetrini mal strisciati
mal fissati in cui le cellule si presentano danneggiate e non valutabili)
* trasporto ritardato del materiale fresco.
Molte di queste criticità sono superabili usando procedure e metodiche corrette.
flogosi-necrosi
Brushing bronchiale:Inquinamento da cristalli di talco
TECNICA CORRETTA ALLESTIMENTO AGOASPIRATI
TECNICHE DI FISSAZONE CON CITOSPRAY
Agoaspirato polmonare:Artefatti di allestimento
Caso precedente Strato sottile su lavaggio dell’ago
ESAMI ISTOLOGICI
• BIOPSIE DA SEDI DIVERSE IN CORSO DI FIBROBRONCOSCOPIA
• AGOBIOPSIE POLMONARI TC GUIDATE
BIOPSIA:fissazione in formalina
inclusione in paraffina allestimento di sezioni microscopiche colorazione con ematossilina-eosina
ESAMI CITOLOGICI In corso di broncoscopia
Broncoaspirato-lavaggio-espettorato
Metodica “ CITOINCLUSO” Fissazione in alcool 95° Inclusione in paraffina Allestimento sezioni microscopiche Colorazione con ematossilina –eosina
Vantaggi: conservazione di tutto il materiale possibilità di allestire preparati per immunocitochimica e di eseguire metodiche di biologia molecolare
Brushing il materiale prelevato viene strisciato sul vetrino, fissato con citospray e colorato con Papanicolaou
Agoaspirato transcarenale/intralesionale
striscio convenzionale strato sottile
lo strato sottile offre un fondo pulito, permette di conservare il materiale per 30 giorni, di allestire preparati per immunocitochimica e di eseguire metodiche di biologia molecolare.
ESAMI CITOLOGICI
in corso di agobiopsia percutanea TC guidata
Agoaspirato (FNA)
Striscio convenzionale Strato sottile
Valutazione estemporanea adeguatezza del materialesi esegue su uno o due vetrini convenzionali inviati immediatamente dopo il prelievo e colorati con una metodica rapida.
ESAMI CITOLOGICI in corso di toracentesi
Liquido pleuricoDal materiale inviato “a fresco”
* si allestiscono 6 vetrini con citocentrifuga si colorano con Papanicoleau, MGG, PAS
(colorazioni diverse permettono di valutare diverse caratteristiche cellulari)*se si forma o è presente un coagulo si allestisce un citoincluso* il materiale rimanente viene lasciato
nel fissativo liquido per strato sottileper eventuali ulteriori indagini (immunocitochimica –biologia molecolare)
FASE ANALITICA
OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO OTTICO OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO OTTICO DEL MATERIALE OPPORTUNAMENTE DEL MATERIALE OPPORTUNAMENTE
PROCESSATOPROCESSATO
DIAGNOSTICA IMMUNOISTOCHIMICADIAGNOSTICA IMMUNOISTOCHIMICA
ESAMI DI BIOLOGIA MOLECOLAREESAMI DI BIOLOGIA MOLECOLARE
FASE POST-ANALITICA
Referto istologico / citologico
descrizione e conclusione diagnostica
FASE POST-ANALITICA Referto citologico
1. INADEGUATO (vedi fase pre-analitica)
2. NEGATIVO PER CELLULE MALIGNE
3. DUBBIO4. SOSPETTO
5. POSITIVO PER CELLULE MALIGNE
In ogni tipo di patologia oncologica ,ma in modo particolare nella diagnostica delle neoplasie toraciche,due sono le questioni fondamentali da affrontare
• LA NEOPLASIA IN ESAME E ‘ PRIMITIVA ?
SE METASTATICA DA DOVE VIENE ?
• QUAL E’ L’ISTOTIPO DELLA NEOPLASIA ?
In entrambi i casi, oltre all’osservazione delle caratteristiche citoarchitetturali della neoplasia ,che rimane il punto fondamentale della diagnostica ,sono di aiuto le metodiche immumocitochimiche .
IMMUNOCITOCHIMICA
Si ricercano antigeni presenti nelle cellule tumorali, diversi da neoplasia a neoplasia, tramite anticorpi specifici ai quali è legato un segnale colorato.
Se la reazione antigene-anticorpo avviene,cioè se nelle cellule è presente l’antigene cercato, il segnale colorato è visibile al microscopio ottico.
CASI ESEMPLIFICATIVI
1) liquido pleurico con cellule chiaramente maligne le cui caratteristiche pongono il problema della diagnosi differenziale fra adenocarcinoma metastatico e mesotelioma
Si eseguono indagini mmunocitochimiche usando il pannello costituito dagli anticorpi CEA e Calretinina
Risultati possibili:
CEA+ Calretinina – …….. Adenocarcinoma
CEA- calretinina + ………. Mesotelioma
Nel caso adenocarcinoma si pone il quesito dell’origine della neoplasia che può derivare dal polmone, dal colon,dall’ovaio……..
Può essere di aiuto un pannello costituito da citocheratina 20 ,citocheratina 7,ttf1
Risultati possibili
ttf1+ citocheratina 7+citotocheratina 20 – Depone per carcinoma del polmonettf1 –citocheratina 7-citocheratina 20+Depone per carcinoma del colonretto
2) Carcinoma primitivo del polmone con alterazioni cellulari poco differenziate,del quale si vuole determinare con la maggiore accuratezza possibile l’istotipo.
Cd56 + neoplasie neuroendocrineCitocheratina 7+ adenocarcinoma
P63+ carcinoma squamoso
3) Cellule da microcitoma versus linfociti
Lca - CD56 + microcitomaLca+ CD56- linfociti
Liquido pleurico mesotelioma MGG citocentrifuga
Mesotelioma Liquido pleurico Citocentrifuga Calretinina
Mesotelioma liquido pleurico citoincluso calretinina
Adenocarcinoma del polmone espettorato citocheratina 7
Stesso caso P63
LIMITI DELLA METODICA 1)Tumori diversi hanno antigeni in comune(Ck 7+ /20- caratterizza carcinoma del polmone ,ma anche di mammella,endometrio e pancreas)2) Non sempre i tumori esprimono gli antigeni che dovrebbero caratterizzarli ( il ttf1 caratteristico degli adenocarcinomi del polmone è espresso nel 70% circa dei casi)3) La presenza di necrosi altera l’antigenicità dei tessuti.4) Lo stesso effetto è prodotto da non corretta fissazione e conservazione del materiale .5) Cellule della stessa origine maligne o benigne esprimono gli stessi antigeni (la calretinina non è di aiuto nel distinguere fra mesoteli attivati e mesoteli maligni ,il cui aspetto citologico è in parte sovrapponibile)
L’accuratezza diagnostica nella determinazione dell’istotipo neoplastico si riflette su terapia e prognosi,poiché i percorsi terapeutici sono diversi per neoplasie diverse.E’ quindi doverosa la distinzione fra fra neoplasie neuroendocrine(microcitoma),adenocarcinoma e carcinoma squamoso.Anche all’interno dello stesso istotipo neoplastico si sono individuati trattamenti farmacologici differenziati,in base a alterazioni genetiche e mutazioni presenti o meno nella neoplasia.L’evidenziazione di queste alterazioni richiede l’uso di tecniche di biologia molecolare.
Indagini di biologia molecolare
Analisi molecolare mediante PCR e sequenziamento diretto per ricerca mutazioni esoni 19 e 21 del gene EGFR
AdenocarcinomaAnalisi mediante metodica di ibridazione in situ
flourescente (FISH) per riarrangiamento gene ALK
Carcinoma non piccole cellule pre-trattatoKRAS BRAF ROS1 quando non sono presenti altre alterazioni geniche
Exon 19DeletionsN= 192(56%)
Exon 21(L858R/Q)N= 143(41%)
Exon 18N= 9 (3%)
30%
Mutated Wild type N= 335
Frequency of EGFR mutationsand its subtypes.Tanaka et al. Int J Cancer. 126:651-5, 2010.
Cases examined N= 1117
1416
19
264
348
384
394
Cases examined N= 1390
Frequency of EGFR mutationsIn Italy.
Exon 21(L858R/Q)N= 82(47%)
Exon 19DeletionsN= 86(49%)
Exon 18N= 6 (3%)
13%
Mutated Wild typeN= 174
ESONE 19 MUTATO
Dott.ssa Francesca Castiglione
ESONE 19 WT
Dott.ssa Francesca Castiglione
Dott.ssa Francesca Castiglione
DIPARTIMENTO DAI BIOMEDICINASOD ISTOLOGIA PATOLOGICA E DIAGNOSTICA
MOLECOLAREDIRETTORE GL.TADDEI
Dott.ssa Francesca CastiglioneDott.ssa Milena Paglierani
Centro di riferimento
UN FATTORE LIMITANTE NELLA DIAGNOSTICA DELLE NEOPLASIE TORACICHE E’ RAPPRESENTATO DALLA QUANTITA’ DI MATERIALE A DISPOSIZIONE.
Si deve infatti ricordare che in questo tipo di diagnosticai campioni prelevati consistono o di piccole biopsie o, molto più spesso ,di materiale citologico costituito talvolta da un numero scarso di elementi cellulari. Ne conseguono sia difficoltà nella diagnostica classica sia nella applicazione di pannelli immunocitochimici ottimali, sia nel reperire materiale per biologia molecolare.
LA FASE POST-ANALITICA ALTRI REPERTI
•QUADRI CITOLOGICI RICONDUCIBILI A TBC
•ALTERAZIONI CITOLOGICHE DA VIRUS
•PRESENZA DI PARASSITI
•PRESENZA DI FUNGHI
•PRESENZA DI BATTERI
Agoaspirato polmonare: tubercolosi
BAL Pneumocystis carinii
Stesso caso immunocitochimica
Aspergillo . agoaspirato polmonare .strato sottile
Mucor . Lavaggio bronchiale
Mucor .lavaggio bronchiale
espettorato alterazioni cellulari da Herpes virus
Brushing tracheale alterazioni citologiche da HPVBiologia molecolare HPV 16
Lavaggio bronchiale actinomiceti
Lavaggio bronchiale actinomiceti
Un sincero grazie allo staff tecnico della U.O.di Anatomia Patologica