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UOC Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera - Università degli Studi di Padova
Dipartimento di Scienze Statistiche - Università degli Studi di Padova
L’attività proliferativa nel carcinoma della mammella: come valutarla?
Dott. Enrico Orvieto
4° CONFRONTO INTERISTITUZIONALE IN PATOLOGIA MAMMARIA DA SCREENING
Padova 23-24 novembre 2011
Ki-67: Figlio di un Dio minore
www.google.com
Viale: SIAPEC Palermo 2011
Ki67 immunohistochemistry: a valuable marker inprognostication but with a risk of misclassification:proliferation subgroups formed based on Ki67immunoreactivity and standardized mitotic index Jalava et al 2006
• Valori ≤15; >16 e ≤30; >30 discriminavano nelle pazienti endocrino responsive diverse categorie di rischio.
• Valutazione effettuata su area periferica della neoplasia, con maggior proliferazione, contando 200 cellule
St. Gallen 2009
Ki67 Index, HER2 Status, and Prognosis of Patients With Luminal B Breast Cancer
Maggie C. U. Cheang et al. J Natl Cancer Inst. 2009
Nei 144 casi identificati come luminal (dalla metodica molecolare) si è individuato il cut-off del Ki67 (14%) in grado di separare i casi luminal A dai luminal B
357 tumori della mammella studiati con gene expression profiles (50-gene PAM50)
La distinzione tra Luminal A e B avviene prevalentemente sulla base dell’espressione di geni coinvolti nella proliferazione
L’espressione IHC di ER, PgR, HER2 e di Ki67 (cut-off 14%), è stata utilizzata come surrogato alla classificazione molecolare dei Luminal in una casistica di oltre 4000 casi
St. Gallen 2011
Ki67 Index, HER2 Status, and Prognosis of Patients With Luminal B Breast CancerCheang et al 2009
•Un core di 0,6 mm selezionato casualmente nel tessuto neoplastico•Percentuale di cellule positive sul totale delle cellule neoplastiche
“This study has several limitations. The main weaknesses ofimmunohistochemical approaches are limited technical reproducibility,subjective interpretation, and qualitative readouts .To facilitate analysis of suffi ciently large cohorts of samples, theimmunostaining panel was trained and validated on tissue microarrays,whereas clinical implementation would likely occur on wholesections.” Cheang et al 2009
Eppure…
• Quantità di dati sul valore prognostico e predittivo di KI-67
• A dispetto di:– Uso di diversi materiali (TMA vs core
biopsies vs intere sezioni)– Differenti protocolli di colorazione– Differente valutazione dei risultati
• Possiamo migliorare standardizzazione e riproducibilità?
Viale: SIAPEC Palermo 2011
Le raccomandazioni internazionali
J Natl Cancer Inst 2011; 103:1656-1664Viale: SIAPEC Palermo 2011
Gradiente di Ki-67
Viale: SIAPEC Palermo 2011
Gradiente & hot spots
Viale: SIAPEC Palermo 2011
Gradiente & hot spots
?
Viale: SIAPEC Palermo 2011
The approach to scoring hot spots varies across studies; some investigators have focused in particular on the analysis of hot spots, others have included hot spots in a general assessment of Ki67 across the section, and yet others have recommended avoiding them altogether.
This issue needs clarification, and a working party of the International Ki67 in Breast Cancer Working Group has been established to assess which method is more robust.
In the meantime, for the purposes of consistency, when hot spots are present, an approach that assesses the whole section and records the overall average score is recommended.
J Natl Cancer Inst 2011; 103:1656-1664
J Natl Cancer Inst 2011; 103:1656-1664
Spot 1: 90% Ki67
Spot 2: 30% Ki67
Valore medio tra spot 1 e 2 = 60% ki67
Spot 1: 180 cell Ki67 +/200 cell tumorali = 90% Ki67Spot 2: 45 cell Ki67 +/150 cell tumorali = 30% Ki67
Somme delle cell positive per ki67 tra i due spot: 225/350 = 64% ki67
Cut points for prognosis, prediction, and monitoring should only be applied if the results from local practice have been validated against those in studies that have defined the cutoff for the intended use of the Ki67 result.
Data handling
A threshold that is appropriate for determination of prognosis may not pertain to one that is used for eligibility for a neoadjuvant trial or for use of Ki67 as a pharmacodynamic marker.
Currently, in the absence of harmonized methodology, the International Ki67 in Breast Cancer Working Group was unable, therefore, to come to consensus regarding the ideal cut point(s) that might be used in clinical practice.
Recommendations
Ki67 Ki67 Ki67 Ki67
TV MIB1 DAKO
2020 GSP6
VENTANA
15(20)
PMIB1 DAKOBONDMAX
9(20)
Z30-9 VENTANA
40
ASP6 NEOMARKER
LEICABOND
15(20)
H30-9 VENTANA
30(20)
Q NP
BMIB1 DAKOBONDMAX
20 IMIB1 DAKO
10(20)
RSP6
5(20)
CMIB1 DAKO
25 LMIB1 DAKOBONDMAX
20 SMIB1 DAKOBONDMAX
10(15)
DSP6 NEOMARKER
LEICABOND
10(20)
M30-9 VENTANA
10(35)
TMIB1 DAKOBONDMAX
10
EMIB1 DAKOBONDMAX
8(20)
N30-9 VENTANA
24 UMIB1 DAKO
10(20)
F30-9 VENTANA
25 O 30-9 VENTANA
30 V 25
Ventana + 30-9 = alto LI; score superiore: pregio o difetto? Necessaria correlazione clinicaMIB1 e SP6 sovrapponibili
Valutazione: 10 casi basso LI (rosa)
• Il nostro studio prevedeva di valutare l’attività proliferativa con metodica immunoistochimica in 50 casi di carcinoma della mammella
• Cercando di evidenziare il metodo più corretto ed efficace per valutare l’attività proliferativa mediante l’espressione di ki67
Confronto tra metodiche di valutazione dell’attività proliferativa nel carcinoma
della mammella
Ki67 colorazioni nella linea cellulare MCF-7 . A mitosi; dalla B alla F la fase precoce (G1); Nella G assente; da H a L confinate nei nucleoli. Dalla M alla Q con presenza congiunta nel nucleo e nella matrice nucleare ; R una cellula in profase caratterizzata da condensazione cromosomica
•Tre regioni del diametro di 3mm ciascuna che sono state evidenziate con inchiostro permanente•Queste aree erano selezionate cercando di rappresentare l’eterogenea espressione dell’attività proliferativa della neoplasia.
Valutazione con reticolo
Reticolo di 10 mm di lato diviso in 100 celle inserito nell’oculare del microscopio
Per ogni regione vengono contati 3 reticoli
Analizzatore digitaleValutazione effettuata su ogni regione
L’analizzatore è tarato per valutare un massimo di 350 cellule per area
Valutazione routinaria
Valutazione in percentuale di cellule proliferanti sul totale delle cellule
Vengono valutate approssimativamente 500 cellule per area
Significatività differenze (p)
Differenza complessiva
Valutazione clinica routinaria
Vsvalutazione routinaria
Valutazione clinica routinaria
vs Valut
Analizzatore digitale
Valutazione clinica routinaria
Vs Valut con griglia
Valutazione clinica routinaria 0,0137 0,0026 0,4273 0,0402
Confronto con dato clinico dell’attività proliferativa
Percentuali medieSignificatività differenze
(p)
ValutAnalizzatore digitale
Valut. routinari
a
Valut con
griglia
Differenza complessi
va
Digitale vs
routine
Digitale vs
griglia
Griglia vs
routine
Percentuale totale 23,0 23,2 25,0 0,024 0,739 0,012 0,029
Media percentuali 3 aree 23,9 25,7 24,9 0,082
0,026
0,206 0,325
Percentuali medieSignificatività differenze
(p)
ValutAnalizzatore digitale
Valut. routinar
ia
Valut con
griglia
Differenza
complessiva
Digitale vs
routine
Digitale vs
griglia
Griglia vs
routine
Grading 1 (% totale) 12,7 10,4 10,8 0,281 0,146 0,220 0,802
Grading 2 (% totale) 15,6 17,8 17,6 0,274 0,904 0,187 0,151
Grading 3 (% totale) 41,9 43,2 47,1 0,017 0,219 0,005 0,091
Grading 1 (media medie) 13,0 11,4 10,8 0,347 0,321 0,166 0,672
Grading 2 (media medie) 16,6 17,9 18,2 0,351 0,278 0,170 0,768
Grading 3 (media medie) 35,4 39,2 37,2 0,037 0,011 0,206 0,172
Il confronto tra la valutazione con analizzatore di immagini e la
valutazione “manuale” effettuata con il metodo descritto si è
dimostrata significativamente correlata
La valutazione di una singola griglia era sufficiente per valutare correttamente
l’espressione dell’attività proliferativa dell’intero campo identificato sul vetrino
Era necessario esaminare l’area con 3 reticoli o si poteva diminuire il numero di
reticoli contati?
stabilito un livello di precisione si è calcolato quante griglie servono per arrivare alla stima della percentuale
giusta col margine d'errore prefissato.
L’unità “griglia” (100 celle contate) era il minimo da contare
Il numero medio di cellule contate nelle griglie del nostro studio
variava da 180 a 570
Per conoscere l’attività proliferativa dell’intera neoplasia sarebbe necessario suddividere la porzione infiltrante periferica della neoplasia in campi da 3mm di diametro e valutare una singola “griglia” per campo
Valutazione estremamente onerosa in termini di tempo-lettura
Selezionato 20 dei 50 casi
Selezione è avvenuta in maniera casuale bilanciando i diversi casi in funzione del grading
Abbiamo valutato interamente la periferia della neoplasia
costruito un algoritmo che individua, facendo tutte le possibili combinazioni casuali di aree, quante aree si
devono contare per avere un margine d'errore accettabile.
1 area 2 aree 3 aree 4 aree 5 aree
Errore medio 0.30 0.37 0.29 0.18 0.12
Obbiettivo è quello di individuare il numero minore di aree, selezionate, in maniera casuale, che consentano di raggiungere il valore della conta di tutta l’area di
proliferazione
Quanti campi, selezionati casualmente, sono necessari per ottenere il valore corretto dell’attività
proliferativa dell’intera sezione neoplastica?
Considerando una popolazione con differente attività proliferativa, per ottenere il valore dell’attività
proliferativa più “corretto” è necessario valutare con il metodo descritto almeno 5 aree.
Un “errore” di valutazione del 10% dell’attività proliferativa può avere differente impatto clinico alla luce
dei cut off che stanno emergendo dalla letteratura
una variazione dal 40% al 44% del valore dell’attività proliferativa è dal punto di vista clinico ininfluente
una variazione dal 13% al 14,3% del valore dell’attività proliferativa può essere discriminante
La valutazione dell’attività proliferativa con metodica immunoistochimica sembra
assumere un significato clinico rilevante
Cosa valutare?La massima attività proliferativa della neoplasia?
L’attività proliferativa dell’intera neoplasia?Quali anticorpi anti ki-67 usare?
Metodi automatici o valutazione “manuale?
Necessaria la standardizzazione della valutazione
•La valutazione “manuale” se basata su concetti condivisi e con parametri certi è efficace quanto la valutazione con analizzatori di immagini computerizzati
•Dal nostro studio emerge che per ottenere una valutazione più corretta dell’attività proliferativa è necessario valutare almento 5 regioni selezionate casualmente alla periferia della neoplasia
•Che per ogni regione è sufficiente contare le cellule incluse nell’area di un reticolo, o in alternativa in un’area equivalente (0.0625 mm2 a 400x)
•Che il numero di cellule contate è un parametro meno significativo rispetto ad un campionamento appropriato della regione proliferante della neoplasia
Conclusioni
Conclusioni
Le considerazioni espresse vanno comunque validate anche con una riproducibilità
interlaboratorio
In attesa di ulteriori “decisioni” delle linee guida
In attesa della definizione di cut-off correlati a metodiche standard
Dott.ssa Giovanna BoccuzzoDipartimento di Scienze Statistiche dell’Università di Padova
Prof. Massimo RuggeDott Marcello Lo Mele
Dott.ssa Rajshree SangapurDott. Luciano GiacomelliUOC Anatomia PatologicaUOC Anatomia Patologica
Azienda Ospedaliera – Università di PadovaAzienda Ospedaliera – Università di Padova