INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZONIA

Programa de Pós Graduação em Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva

NATÁLIA DAYANE MOURA CARVALHO

Manaus - AM

2011

Uso de marcadores citogenéticos clássicos e moleculares para a caracterização de Synbranchus spp. (Synbranchiformes) da

Amazônia central

ii

NATÁLIA DAYANE MOURA CARVALHO

Orientadora: Eliana Feldberg, Dra.

Co-orientadora: Maria Claudia Gross, Dra.

Manaus – AM

2011

Uso de marcadores citogenéticos clássicos e moleculares para a caracterização de Synbranchus spp. (Synbranchiformes) da

Amazônia central

Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

Sinopse:

São apresentados dados cromossômicos de quatro espécies de Synbranchus: S. madeirae, S. cf. lampreia, Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp.2, coletadas em simpatria e sintopia na região de confluência dos rios Negro e Solimões. As espécies foram estudadas mediante análise de citogenética clássica (coloração convencional, detecção de heterocromatina e regiões organizadoras de nucléolo) e molecular (hibridização fluorescente in situ com sondas de DNAr 18S, DNAr 5S e sequências teloméricas) e foram comparadas com as espécies descritas na literatura. Foram também discutidas as possíveis tendências evolutivas para este grupo de peixes.

Palavras-chave: Mussum, Variabilidade cromossômica, Heterocromatina constitutiva, Região organizadora de nucléolo, FISH, Amazônia

C331 Carvalho, Natalia Dayane Moura

Uso de marcadores citogenéticos clássicos e moleculares para a caracterização de Synbranchus spp. (Synbranchiformes) da Amazônia Central / Natália Dayane Moura Carvalho. --- Manaus : [s.n.], 2011.

xvi, 57 f. : il. color.

Dissertação (mestrado) -- INPA, Manaus, 2011

Orientador : Eliana Feldberg

Co-orientador : Maria Claudia Gross

Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

1. Mussum (peixe) – Amazônia. 2. Variabilidade cromossômica. 3.Região organizadora de nucléolo. 4. FISH (técnica). I. Título.

CDD 19. ed. 597.10415

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Dedico esta dissertação aos meus pais

Nilce e Maurício, aos meus irmãos

Maurício, Márcio e Júnior, à minha

cunhada Paula, aos meus pequenos

sobrinhos Maurício Vinícius e Paula Sofia

e ao meu noivo Rogério Neves.

v

A realização deste trabalho foi possível devido:

Ao Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva,

do INPA.

Ao laboratório de Genética Animal do INPA, Coordenação de Pesquisas em

Biologia Aquática (CPBA), onde este trabalho foi desenvolvido, com financiamento

proporcionado pelos projetos: “Caracterização genética (cromossomos, proteínas e

DNA) de vertebrados amazônicos” (INPA/MCT) e “Citotaxonomia de Arraias de água

doce da Amazônia central: conhecer para conservar” (PIPT/FAPEAM).

À Fundação de Amparo de Pesquisas do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela

concessão da bolsa de estudo durante a realização deste trabalho.

Agradecimentos

Agradeço a TODOS que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

Em especial:

A Deus, pois, sem sua ajuda, nada teria sido possível.

À Dra. Eliana Feldberg pela excelente orientação, amizade, conselhos, ensinamentos,

confiança e principalmente por ser essa profissional esplêndida e admirável. Obrigada

por ter me acolhido em seu laboratório e por ser tão especial na minha vida,

simplesmente a minha mãe científica.

À Dra. Maria Claudia Gross pela primorosa co-orientação, apoio, incentivo, sugestões e

principalmente pelo auxílio no laboratório. Sem a sua ajuda este trabalho não teria sido

realizado. Obrigada por tudo e principalmente pela confiança depositada em mim.

Ao Dr. Jorge Porto pela amizade e contribuição a este trabalho.

Ao Dr. Jansen Zuanon pela identificação das espécies analisadas.

Aos colegas do laboratório de Genética Animal: Carlos, Leandra, Leila, Heidi,

Thatianna, Brenda, Carlos Valentin, Denise e Érica por todos os momentos que

passamos juntos, pelos debates, sugestões, críticas científicas e às festinhas no

laboratório. Em especial, as minhas amigas Heidi Luz e Thatianna de Lira pela

companhia em nossos passeios (grandes aventuras), conversas, discussões científicas, e

principalmente por ter me aguentado nesse dois anos de mestrado. Obrigada, vocês já

fazem parte da minha vida.

Aos amigos do curso de mestrado – GCBEv/ 2009: Heidi, Alessandro, Carolina,

Luciana, Diana, Ramon, Jaqueliny Zocca, Jaqueline Fortuna, Tatiana e Gilson pelos

bons momentos extra-laboratório.

Aos meus pais Maurício e Nilce que são a razão da minha vida, para mim motivo de

orgulho. Obrigada por tudo e principalmente por acreditarem em mim. Tudo que puder

fazer por vocês farei, por que simplesmente amo vocês.

Aos meus irmãos Maurício, Márcio e Junior e minha cunha Paula pelo apoio

incondicional, amor e amizade.

vii

Ao meu pequeno príncipe Maurício Vinicius e à minha pequena princesa e afilhada

Paula Sofia por iluminar minha vida.

Ao meu noivo Rogério de Oliveira Neves pelo amor, carinho, paciência, atenção e por

mostrar-me o caminho maravilhoso de um amor e amizade, transmitindo sempre de

forma entusiasmada, clara e objetiva.

viii

Resumo

A família Synbranchidae pertence à ordem Synbranchiformes e é composta por quatro gêneros: Macrotrema, Ophisternon, Monopterus e Synbranchus. De acordo com a classificação taxonômica vigente, Synbranchus compreende três espécies válidas: S. marmoratus Bloch, 1795, S. madeirae Rosen & Rumney, 1972 e S. lampreia Favorito, Zanata & Assumpção, 2005. Contudo, estudos citogenéticos têm evidenciado uma variação no número diploide de exemplares identificados como “S. marmoratus”, coletados nas regiões sul, sudeste e centro-oeste do Brasil, os quais apresentam 42, 44 e 46 cromossomos e diversas fórmulas cariotípicas. Para as outras duas espécies válidas nenhuma característica citogenética havia sido publicada até o momento. Diante deste contexto, foram realizadas análises citogenéticas clássicas (coloração convencional, Banda C e RON) e moleculares (FISH com sondas de DNAr 18S, 5S e sequências teloméricas) em 14 indivíduos de S. madeirae, oito de S. cf. lampreia, um indivíduo de Synbranchus sp.1 e um de Synbranchus sp. 2, coletados em simpatria e sintopia no lago Catalão, situado na confluência dos rios Negro e Solimões. Para S. madeirae foi encontrado 2n=46 cromossomos, sendo 6m+2st+38a, NF=54, S. cf. lampreia 2n=44 cromossomos, sendo 6m+2st+36a, NF=52, Synbranchus sp.1 2n=42 cromossomos, sendo 6m+4sm+32a, NF=52 e Synbranchus sp.2 2n=42 cromossomos, sendo 6m+2sm+4st+30a, NF=54. A heterocromatina constitutiva apresentou-se distribuída nas regiões centroméricas, intersticiais, terminais, proximais e distais da maioria dos cromossomos para as quatro espécies de Synbranchus. A região organizadora de nucléolo (RON), apresentou-se como RON simples para S. cf. lampreia e múltipla para S. madeirae, Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp. 2, com variação interespecífica quanto à sua distribuição, evidenciada tanto por impregnação com AgNO3 como pela hibridização de sondas DNAr 18S. A FISH com sonda DNAr 5S evidenciou uma marcação intersticial nos braços longos do par 7 de S. cf. lampreia e S. madeirae e do par 10 em Synbranchus sp.1. A sonda telomérica evidenciou marcações nos telômeros de todos os cromossomos além de marcações em regiões intersticiais em S. madeirae, S. cf. lampreia e Synbranchus sp.1. O somatório destes dados indica a ocorrência de uma variabilidade cariotípica interespecífica no gênero Synbranchus, incluindo heterocromatinização ou adição de heterocromatina, presença de rearranjos robertsonianos e não-robertsonianos na evolução cromossômica do grupo. Assim, acreditamos que a tendência de evolução cromossômica mais provável para este grupo seja a partir de um ancestral com 2n=48 cromossomos com a redução do número diploide.

ix

Abstract

Synbranchidae belongs to the Synbranchiformes order and it is composed by four genus: Macrotema, Ophisternon, Monopterus and Synbranchus. According with the present taxonomic arrangement, Synbranchus comprises three valid species: S. marmoratus Bloch, 1795, S. madeirae Rosen & Rumney, 1972, and S. lampreia Favorito, Zanata & Assumpçao, 2005. However, cytogenetic studies has made evident a variance in the diploid number of specimens of S. marmoratus collected in the south, south-east and center-west of Brasil, presenting 42, 44 and 46 chromosomes and diverse karyotypic formulas. Until nowadays, none cytogenetic characteristics have been registered for the two other valid species. Thereafter this contexture, there have been realized classic cytogenetic analysis (conventional coloration, C Band and NOR) and molecular as well (FISH with rDNA 18S, 5S probers and telomeric sequences) in fourteen individuals of S. madeirae, eight of S. cf. lampreia, one individual of Synbranchus sp.1 and one of Synbranchus sp.2 collected in compatibility at the Catalão lake situated at the confluence of the Negro and Solimões rivers next to Manaus, Amazonas. It was found 2n=46 chromosomes for S. madeirae, being 6m+2st+38a, NF=54, S. cf. lampreia 2n=44 chromosomes, being 6m+2st+36a, NF=52, Synbranchus sp1 2n=42 chromosomes, being 6m+4sm+32a, NF =52 and Synbranchus sp2 2n=42 chromosomes, being 6m+2sm+4st+30a, NF=54. Constitutive heterochromatic presented distributed in the centromeric, interstitial, terminal and proximal and distal of chromosomes majority for the four Synbranchus species. It has been inferred by the nucleolus organizer region (NOR) that simple NOR for S. cf. lampreia and multiple for S. madeirae, Synbranchus sp.1 and Synbranchus sp.2, with interspecific variance as for its distribution, being proved by its impregnation with AgNOR, as much as by r DNA 18S hybridization probe. It has also been proved by FISH with rDNA 5S probe an interstitial marker on pair 7 long arms of S. cf. lampreia and S. madeirae and of pair 10 in Synbranchus sp1. A telomeric probe has evinced marks in all telomeric chromosomes beyond marks in interstitial regions in S. madeirae, S. cf. lampreia and Synbranchus sp.1. It was inferred by the amount of this data that the occurrence of an interspecific karyotypic variability on Synbranchus genus, including heterochromatinization or heterochromatin addition, appearance of Robertsonian and non-Robertsonian rearrangements in chromosomic evolution of this group. Meanwhile, we believe that the evolutive tendency most likely for this group is from an ancestor with 2n = 48 chromosomes with reduction of the diploid number.

x

Sumário

1 Introdução.......................................................................................................................1

1.1 Considerações gerais............................................................................................... 1

1.2 Biologia de Synbranchidae ..................................................................................... 1

1.3 Citogenética de Synbranchiformes ......................................................................... 3

1.5 Objetivos ................................................................................................................. 8

1.5.1 Geral ................................................................................................................ 8

1.5.2 Específicos ........................................................................................................ 8

2 Material e Métodos.........................................................................................................9

2.1 Material ................................................................................................................... 9

2.2 Métodos ................................................................................................................ 12

2.2.1 Indução de mitoses........................................................................................... 12

2.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos ................................................................. 12

2.2.3 Detecção das regiões organizadoras de nucléolo – RONs................................. 13

2.2.4 Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C) ........................................... 13

2.2.5 Extração de DNA total....................................................................................... 14

2.2.6 Isolamento de sequências repetitivas por PCR (Polymerase Chain Reaction) e marcação por nick translation (Bionick labeling system-Invitrogen) ............................. 15

2.2.7 Hibridização in situ por fluorescência - FISH...................................................... 16

2.2.8 Análise cariotípica ............................................................................................. 18

2.2.9 Análise comparativa das medidas cromossômicas entre as espécies de Synbranchus ....................................................................................................................18

3 Resultados.....................................................................................................................20

3.1 Synbranchus madeirae.......................................................................................... 20

3.2 Synbranchus cf. lampreia ..................................................................................... 25

3.3 Synbranchus sp. 1 ................................................................................................. 29

3.4 Synbranchus sp.2 ................................................................................................. 32

3.5 Medidas cromossômicas ....................................................................................... 36

xi

4 Discussão......................................................................................................................37

5 Conclusões....................................................................................................................45

6 Perspectivas ..................................................................................................................46

7 Referências Bibliográficas............................................................................................47

xii

Lista de figuras

Figura 1 Exemplares de Synbranchus madeirae (a, b), S. cf. lampreia (c, d),

Synbranchus sp.1 (e, f) e Synbranchus sp.2 (g, h). Formato da cabeça (a, c, e, g) e o

padrão de manchas ao longo do corpo (b, d, f, h)............................................................11

Figura 2 Cariótipos de Synbranchus madeirae: a) em coloração convencional Giemsa;

b) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de banda C;

c) em destaque os pares nucleolares impregnados por AgNO3. m=Metacêntrico,

st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10µm...............................................22

Figura 3 Cariótipos de Synbranchus madeirae: a-b) localização física cromossômica do

DNAr 18S (amarelo); c) localização física cromossômica do DNAr 5S (amarelo); d)

Localização física cromossômica da sequência telomérica (amarelo). m=Metacêntrico,

st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 20µm...............................................24

Figura 4 Cariótipos de Synbranchus cf. lampreia: a) em coloração convencional

Giemsa; b) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de

banda C; c) em destaque o par nucleolar impregnado por AgNO3. m=Metacêntrico,

st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10 µm..............................................27

Figura 5 Cariótipos de Synbranchus cf. lampreia: a) Localização física cromossômica

do DNAr 18S (amarelo); b) Localização física cromossômica do DNAr 5S (amarelo); c)

Localização física cromossômica da sequência telomérica (amarelo). m=Metacêntrico,

st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barras iguais a 20µm............................................28

Figura 6 Cariótipos de Synbranchus sp. 1: a) em coloração convencional Giemsa; b)

regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de banda C; c)

em destaque os pares nucleolares impregnados por AgNO3. m=Metacêntrico,

sm=Submetacêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10µm...........................................30

Figura 7 Cariótipos de Synbranchus sp.1: a) Localização física cromossômica do DNAr

18S (amarelo); b) em destaque os pares portadores dos sítios de DNAr 18S; c)

Localização física cromossômica do DNAr 5S (amarelo); d) Localização física

cromossômica da sequência telomérica (amarelo). m=Metacêntrico,

sm=Submetacêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 20µm...........................................31

xiii

Figura 8 Cariótipos de Synbranchus sp. 2: a) em coloração convencional Giemsa; b)

regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de banda C; c)

em destaque o par nucleolar impregnado por AgNO3. m=Metacêntrico,

sm=Submetacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10 µm..........33

Figura 9 Cariótipo de Synbranchus sp. 2: a) Localização física cromossômica do DNAr

18S (amarelo). m=Metacêntrico, sm=Submetacêntrico, st=Subtelocêntrico,

a=Acrocêntrico. Barra igual a 20µm...............................................................................34

Figura 10 Idiograma comparativo de (a) Synbranchus madeirae; (b) Synbranchus cf.

lampreia; (c) Synbranchus sp.1; (d) Synbranchus sp.2; em preto, heterocromatina

constitutiva; em amarelo, genes de DNAr 18S; em rosa, genes de DNAr 5S...............35

Figura 11 Análise comparativa das medidas cromossômicas entre as espécies

estudadas. Eixo X: número de classes (classe I: 2,53 a 4,40; classe II: 4,41 a 6,28; classe

III: 6,29 a 8,16; classe IV: 8,17 a 10,04; classe V: 10,05 a 12,87); eixo Y: número de

cromossomos por classe de tamanho...............................................................................36

xiv

Lista de tabelas

Tabela 1 Dados citogenéticos compilados da literatura para a ordem Synbranchiformes.

Local de coleta, número diploide (2n), fórmula cromossômica, número fundamental

(NF) e região organizadora de nucléolos (RONs). O cálculo do número fundamental

considerou como portadores de dois braços os cromossomos metacêntricos (m) e

submetacêntricos (sm) e como portadores de braço único os cromossomos

subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a)..........................................................................06

Tabela 2 Número diploide e frequência relativa (%) para indivíduos de Synbranchus

madeirae coletados no Lago Catalão (Iranduba, AM)..........................................................21

Tabela 3 Número diploide e frequência relativa (%), para indivíduos de Synbranchus cf.

lampreia coletados no Lago Catalão (Iranduba, AM)..........................................................26

Tabela 4 Número diploide e frequência relativa (%), para um indivíduo de Synbranchus

sp.1 coletado no Lago Catalão (Iranduba, AM)...................................................................29

Tabela 5 Número diploide, frequência relativa (%) e local de coleta, para um indivíduo de

Synbranchus sp.2 coletado no Lago Catalão (Iranduba, AM)............................................32

xv

Lista de abreviaturas

Banda C Técnica de detecção da heterocromatina constitutiva

DNAr DNA ribossomal

dNTP Desoxirribonucleotídeo

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

FISH Hibridização in situ fluorescente

FITC Fluoresceina isotiocianato

IGS Espaçador intergênico não transcrito

NTS Espaçador não transcrito

PBD Tampão fosfato dextrano

PCR Reação em cadeia da polimerase

Rex Retroelemento isolado primariamente de Xiphophorus

RNAr RNA ribossomal

RON Região organizadora de nucléolo

SDS Dodecil sulfato de sódio

SSC Solução salina de citrato padrão

Tampão C Tampão de acoplamento

1

1 Introdução

1.1 Considerações gerais A região Neotropical, que compreende a parte sul da América do Norte e as

Américas Central e do Sul, abriga a mais rica e diversa fauna de peixes de água doce do

mundo, sendo estimada a presença de 8.000 espécies, com 4.475 já descritas (Reis et al.

2003). Dentro desta região, a Bacia Amazônica se sobressai por sua diversidade

ictiofaunística, reunindo um grande número de espécies que pode chegar a 5.000, onde

são encontrados representantes das ordens Characiformes, Perciformes, Gymnotiformes,

Siluriformes, Myliobatiformes, Synbranchiformes, entre outras (Santos e Ferreira

1999).

1.2 Biologia de Synbranchidae A ordem Synbranchiformes compreende três famílias de peixes teleósteos:

Chaudhuriidae, Mastacembelidae e Synbranchidae (Nelson 2006). Esta ordem é

composta por 99 espécies válidas, as quais encontram-se amplamente distribuídas nas

regiões tropicais e subtropicais do Novo e Velho Mundo (Rosen e Greenwood 1976;

Schofield e Nico 2009).

As espécies de Synbranchidae apresentam corpo cilíndrico na região anterior e

comprimido na região posterior, são desprovidas de escamas e na idade adulta chegam a

medir cerca de 150 cm de comprimento. As nadadeiras dorsal e anal são rudimentares, a

caudal é curta, rudimentar ou ausente, e não possuem as pélvicas e peitorais.

Apresentam abertura branquial única localizada na região ventral da cabeça, cabeça

proeminente com olhos pequenos, narinas anteriores, boca grande provida de dentes

pequenos e não possuem bexiga natatória. A pele produz um muco que recobre todo o

corpo (Britski et al. 1999; Kullander 2003; Nelson 2006).

Com relação às características reprodutivas dos Synbranchidae, o

hermafroditismo protogínico diândrico é a forma de expressão sexual dominante

(Antoneli 2006). Ou seja, ocorre mudança de sexo nos indivíduos adultos, envolvendo a

degeneração do tecido gonadal feminino e o crescimento e maturação do tecido sexual

masculino, sobretudo apresentando dois tipos diferentes de machos. Os machos do

primeiro tipo são aqueles que se desenvolvem diretamente dos ovos e são denominados

2

machos primários, e os do segundo são machos resultantes da mudança de sexo a partir

de uma fêmea, por reversão do sexo e são chamados machos secundários (Lo Nostro e

Guerrero 1996; Antoneli 2002; Lo Nostro et al. 2003; Ravaglia e Maggese 2003). A

reversão do sexo de indivíduos identificados como S. marmoratus ocorre

predominantemente durante a estação seca e está relacionada à idade e ao comprimento

do indivíduo (Antoneli 2002; 2006). Deste modo, os machos secundários exibem

comprimento entre 25 e 54,9 cm, enquanto os machos primários podem ser encontrados

em qualquer faixa de comprimento (Lo Nostro e Guerrero 1996; Antoneli 2006).

Com relação à distribuição de Synbranchidae, são encontrados na África, Ásia,

Austrália, México e Américas Central e do Sul e compreende quatro gêneros:

Synbranchus, Ophisternon, Monopterus e Macrotrema. Na região Neotropical são

conhecidos apenas dois gêneros, Ophisternon e Synbranchus. Ophisternon é composto

por seis espécies, sendo que nesta região ocorrem duas: O. infernale Hubbs 1938 e O.

aenigmaticum Rosen e Greenwood 1976. Synbranchus compreende três espécies

válidas: S. marmoratus Bloch 1795, S. madeirae Rosen e Rumney 1972 e S. lampreia

Favorito, Zanata e Assumpção 2005 (Nelson 2006). Segundo Favorito-Amorim (1992)

Synbranchus marmoratus, considerada por vários autores como um complexo de

espécies, é representada por, pelo menos, sete táxons distintos, incluídas

provisoriamente dentro de Synbranchus. Deste modo, a autora sugere uma revisão

taxonômica mais ampla das espécies de Synbranchidae, para que a caracterização das

mesmas possa ser resolvida satisfatoriamente.

As espécies de Synbranchus alimentam-se de peixes, moluscos e pequenos

crustáceos e estão presentes em uma variedade de habitats, incluindo estuários,

pântanos, riachos, lagoas, charcos e corredeiras, mas têm preferência por águas com

baixa concentração de oxigênio e durante os períodos de seca sobrevivem enterradas na

lama úmida. Esta adaptabilidade a diferentes ambientes está relacionada aos tipos de

respiração, uma vez que além da típica respiração branquial estas espécies apresentam

respiração bucofaríngea e acessória, na qual as paredes da câmara branquial são

altamente vascularizadas e contribuem para as trocas gasosas, o que possibilita a

permanência fora da água por várias horas e a obtenção de oxigênio atmosférico durante

períodos de seca (Ghaham et al. 1995; Britski et al. 1999; Shibatta 2006). Segundo

3

Shibatta (2006) são peixes não migratórios, de hábitos noturnos, fecundação externa e

apresentam cuidado parental.

De acordo com a literatura, S. marmoratus tem sua distribuição desde o México

até o norte da Argentina; S. madeirae é restrita ao rio Madeira (Rosen e Rumney 1972)

e S. lampreia é endêmica da Ilha de Marajó, no estado do Pará (Favorito et al. 2005).

Entretanto, em levantamentos ictiofaunísticos recentes foi observado que S. marmoratus

parece ocorrer somente no Suriname e as outras duas espécies aparentemente possuem

uma ampla distribuição na Bacia Amazônica (T. Roberts comunicação pessoal), estando

a taxonomia deste grupo ainda não elucidada, o que enfatiza a necessidade de estudos

complementares.

1.3 Citogenética de Synbranchiformes A citotaxonomia pode ser definida como a identificação de táxons, utilizando

técnicas de citogenética, a qual permite individualizar espécies por meio de

características cromossômicas. A citotaxonomia está intimamente ligada à citogenética,

que é a ciência que estuda os cromossomos, seja de forma isolada ou direcionada ao

conjunto cromossômico de uma espécie, abrangendo aspectos morfológicos, funcionais

e evolutivos (Guerra, 1988).

Investigações cromossômicas em espécies de peixes têm contribuído para o

entendimento de sua sistemática, conhecimento da diversidade genética e da evolução,

principalmente quando combinadas com análises morfológicas e moleculares. Este tipo

de análise em peixes amazônicos já possibilitou a identificação de espécies crípticas

(Nakayama et al. 2001; Teixeira et al. 2006; Nakayama et al. 2008), detecção de

polimorfismos intra-específicos (Nakayama et al. 2000; Centofante et al. 2002;

Mesquita et al. 2008), detecção de cromossomos supranumerários (Feldberg et al.

2004), identificação de híbridos (Alves-Brinn et al. 2004), determinação de sistemas de

cromossomos sexuais (de Oliveira et al. 2007; 2008; Terencio et al. 2008) e evolução

cromossômica (Benzaquem et al. 2008).

Os estudos citogenéticos realizados com peixes têm como principais ferramentas

para a compreensão da estrutura organizacional dos cromossomos a determinação do

número diploide e a fórmula cariotípica. Outros marcadores eficazes na caracterização

de espécies são a localização das regiões organizadoras de nucléolo (RONs), as quais

estão envolvidas na transcrição de RNA ribossomal e o padrão de distribuição da

4

heterocromatina constitutiva no cariótipo, que indica como o genoma eucariótico está

organizado (Feldberg et al. 1993; Almeida-Toledo 1998; Margarido e Galetti Jr. 1999).

Ainda, a utilização de técnicas de manipulação do material genético associada à

detecção de sequências específicas de DNA fez surgir o que se conhece hoje por

citogenética molecular, sendo o fator fundamental para a expansão desses estudos a

utilização de marcações não-radioativas do DNA, com o emprego de corantes

fluorescentes. Esta técnica permite a detecção de sequências específicas em

cromossomos metafásicos e núcleos interfásicos através da hibridização de sequências

complementares, sendo utilizadas principalmente sequências repetitivas em tandem, tais

como genes de RNA ribossomais e sequências teloméricas (Artoni et al. 2000).

Citogeneticamente, a família Synbranchidae é a melhor conhecida da ordem

Synbranchiformes, com dados para três espécies dos gêneros Monopterus, Ophisternon

e Synbranchus. Monopterus albus apresenta 2n=24 cromossomos telocêntricos (Yu et

al. 1987) e Ophisternon bengalense 2n=46 cromossomos, sendo 6m+40st (Arkhipchuk

1999). Já os indivíduos identificados como S. marmoratus provenientes das regiões sul,

sudeste e centro-oeste do Brasil e da Argentina apresentam uma grande variabilidade,

com relação ao número diploide, que varia de 42 a 46 cromossomos e diversas fórmulas

cariotípicas (Tabela 1). Para a família Mastacembelidae, também pertencente à ordem

Synbranchiformes, duas espécies têm análises cromossômicas publicadas,

Mastacembelus armatus e M. aculeatus, ambas com 2n=48 cromossomos (Tabela 1).

Quanto ao padrão de distribuição da heterocromatina neste grupo de peixes, em

indivíduos identificados como S. marmoratus foram evidenciados blocos

heterocromáticos na região pericentromérica de quase todos os cromossomos, sendo que

em alguns foram também evidenciados na região intersticial (Foresti et al. 1992). Em

M. armatus foram localizados na região centromérica de quase todos os cromossomos

(Oliveira et al. 1997).

Com relação ao número de regiões organizadoras de nucléolo (RONs), todas as

populações identificadas como S. marmoratus e amostradas no Brasil, apresentaram

RONs simples, enquanto que três populações da Argentina apresentaram RONs

múltiplas (Tabela 1). Mastacembelus armatus também apresentou RON simples, que

5

segundo Oliveira et al. (1997) é uma característica considerada ancestral para a ordem

Synbranchiformes.

Análises citogenéticas moleculares até o momento não foram realizadas em

espécies da família Synbranchidae, bem como as espécies amazônicas ainda não

tiveram a sua composição cariotípica revelada. Deste modo, dada a ampla distribuição

de Synbranchus spp, a taxonomia incerta do grupo e a grande variabilidade cariotípica

já descrita para S. marmoratus de outras regiões brasileiras e argentina, a caracterização

cromossômica das espécies encontradas no lago Catalão, um ecótono de águas mistas,

situado na confluência dos rios Solimões (água branca) com o Negro (água preta), é de

fundamental importância para o conhecimento do grupo. Ainda, a utilização de

elementos repetitivos no mapeamento físico cromossômico em Synbranchus spp.

poderá proporcionar uma melhor visão do genoma das espécies, de como este está

organizado e como ocorreu a sua evolução.

6

Tabela 1 Dados citogenéticos compilados da literatura para a ordem Synbranchiformes. Local de coleta, número diploide (2n), fórmula

cromossômica, número fundamental (NF) e região organizadora de nucléolos (RONs). O cálculo do número fundamental considerou

como portadores de dois braços os cromossomos meta (m) e submetacêntricos (sm) e como portadores de braço único os cromossomos

subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a).

Familia Gênero Espécie Localidade 2n Fórmula cromossômica

NF RON Referências

Synbranchidae Synbranchus S. marmoratus Coxim, MS, BR 42 4m-sm+38st-a 46 Simples Foresti et al. 1992

São Simão, GO, BR 42 4m-sm+38st-a 46 Simples Foresti et al. 1992

Nova Granada, SP, BR 42 4m-sm+38st-a 46 Simples Foresti et al. 1992

Botucatu, SP, BR 42 4m-sm+38st-a 46 Simples Melillo et al. 1996

Birigui, SP, BR 42 4m-sm+38st-a 46 Simples Melillo et al. 1996

Paraguaçu Paulista, SP, BR 42 4m-sm+38st-a 46 Simples Melillo et al. 1996

Pirassununga, SP, BR 42 6m-sm+36st-a 48 Simples Melillo et al. 1996

Ribeirão Preto, SP, BR 42 6m-sm+36st-a 48 Simples Melillo et al. 1996

Bataguaçu, MS, BR 42 6m-sm+36st-a 48 Simples Melillo et al. 1996

Pereiras, SP, BR 42 4m+6sm+8st+24ª 52 - Torres et al. 2005

Presidente Epitácio, SP, BR 42 4m+6sm+8st+24ª 52 - Torres et al. 2005

Londrina, PR, BR 42 4m+2sm+8st+28ª 48 - Torres et al. 2005

Guaíra, PR, BR 42 4m+2sm+8st+28ª 48 - Torres et al. 2005

Miranda, MS, BR 42 4m+2sm+8st+28ª 48 - Torres et al. 2005

Rio Claro, SP, BR 44 4m-sm+40st-a 48 Simples Foresti et al. 1992

7

Pentecostes, CE, BR 44 4m-sm+40st-a 48 Simples Foresti et al. 1992

Botucatu, SP, BR 44 4m-sm+40st-a 48 Simples Melillo et al. 1996

Birigui, SP, BR 44 4m-sm+40st-a 48 Simples Melillo et al. 1996

Bataguaçu, MS, BR 44 4m-sm+40st-a 48 Simples Melillo et al. 1996

Ituzaingo, Corrientes, AR 44 4m-sm+40st-a 48 Múltiplas Sanchez e Fenocchio 1996

Reconquista, Santa Fé, AR 44 4m-sm+40st-a 48 Múltiplas Sanchez e Fenocchio 1996

Garabato, Santa Fé, AR 44 4m-sm+40st-a 48 Múltiplas Sanchez e Fenocchio 1996

Pirassununga, SP, BR 44 4m+2sm+8st+30ª 50 - Torres et al. 2005

Pirassununga, SP, BR 46 4m-sm+42st-a 50 Simples Melillo et al. 1996

Ribeirão Preto, SP, BR 46 4m-sm+42st-a 50 Simples Melillo et al. 1996

Bandeirantes, PR, BR 46 4m+2sm+8st+32ª 52 - Torres et al. 2005

Miranda, MS, BR 46 6m+2sm+6st+32ª 54 - Torres et al. 2005

Ophisternon O. bengalense - 46 6m+40st 52 - Arkhipchuk 1999

Monopterus M. albus Wuhan (China) 24 24t 24 Simples,

múltipla-

Ji et al. 2003

Mastacembelidae Mastacembelus M. armatus - 48 10m+6sm+4st+28a 68 Simples Oliveira et al. 1997

M. aculeatus China 48 - - Liu et al. 2002

Sinobdella S. sinensis - 48 15m+4sm+3st+26a 70 - Yajuan e Qixing 1991

Macrognathus M. aculeatum - 48 8m+2sm+38st,a 58 - Khuda-Bukhsh e Barat 1987

M. pancalus - 48 14m+12sm+14st+8a 88 - Khuda-Bukhsh e Barat 1987

48 16m+6sm+8st+18a 78 - Manna e Prasad 1977

8

1.5 Objetivos

1.5.1 Geral • Analisar as espécies de Synbranchus da região de confluência dos rios Negro e

Solimões, utilizando marcadores citogenéticos clássicos e moleculares.

1.5.2 Específicos • Determinar o cariótipo de indivíduos de Synbranchus spp., coletados na região

de confluência dos rios Negro e Solimões.

• Estabelecer os padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva (Banda

C) e da região organizadora de nucléolo (RONs) em cromossomos mitóticos.

• Localizar as sequências de DNA ribossômico 5S e 18S e sequências teloméricas

em cromossomos mitóticos pela técnica de hibridização in situ fluorescente

(FISH).

• Verificar se os cariótipos observados correspondem às espécies válidas e se

existe variabilidade cromossômica inter e intraespecífica.

• Inferir possíveis tendências evolutivas para o gênero Synbranchus.

9

2 Material e Métodos

2.1 Material Foram efetuadas preparações cromossômicas de 96 indivíduos de Synbranchus,

coletados no lago Catalão (03º10’45” S; 59º54’25.4” W) situado na confluência dos rios

Solimões e Negro, Amazonas, Brasil, porém, apenas 21 apresentaram metáfases em

boas condições de análise. Destes, 14 indivíduos foram classificados como Synbranchus

madeirae, oito como Synbranchus cf. lampreia, um como Synbranchus sp.1 e outro

como Synbranchus sp.2 (Figura 1). Entretanto, somente foi possível identificar o sexo

de três indivíduos de Synbranchus madeirae, sendo 2 machos e uma fêmea. Todos os

exemplares foram identificados pelo pesquisador Dr. Jansen Zuanon (CPBA/INPA).

Para uma melhor caracterização das espécies estudadas foi feita uma breve

descrição morfológica das mesmas com base no formato da cabeça e padrão de

coloração.

Synbranchus madeirae

Esta espécie apresenta a região dorsal do corpo com coloração de fundo escuro

com manchas claras circulares bem definidas; a região ventral com coloração de fundo

marrom claro com manchas escuras. A cabeça bastante afilada, tanto lateralmente

quanto dorsalmente e apresenta uma faixa negra alongada abaixo dos olhos, iniciando-

se na extremidade anterior do focinho e estendendo-se até aproximadamente a

extremidade posterior do osso maxilar.

Synbranchus cf. lampreia

Esta espécie apresenta a região dorsal do corpo com coloração de fundo marrom

com manchas escuras, inclusive na cabeça, onde são menores; a região ventral com

coloração de fundo claro, com manchas escuras. A cabeça com saliência muscular

dorsal.

Synbranchus sp.1

10

Esta espécie apresenta a região dorsal do corpo com coloração de fundo cinza

escuro com ausência de manchas; na região ventral, coloração de fundo cinza claro. A

cabeça bastante afilada, tanto lateralmente quanto dorsalmente.

Synbranchus sp. 2

Esta espécie apresenta a região dorsal do corpo com coloração de fundo escuro

quase preto com ausência de manchas; a região ventral com coloração de fundo claro. A

cabeça com saliência muscular dorsal.

Os peixes foram capturados com o uso de redes e rapichés e transportados vivos

em caixas térmicas tipo isopor, para o Laboratório de Genética Animal do Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA, Coordenação de Pesquisas em Biologia

Aquática ou para o laboratório flutuante do Lago Catalão, onde foram preparadas as

suspensões celulares. Para tanto, os peixes foram submetidos a uma dose letal do

anestésico eugenol (2%) e após terem sido retirados os tecidos de interesse, os mesmos

foram numerados, registrados, fixados em formol 10% por 24h, lavados em água

corrente e acondicionados em recipientes contendo álcool 70%, visando seu depósito na

Coleção de Peixes do INPA (Licença IBAMA: Número 10609-1 de 21/11/2007).

11

Figura 1 Exemplares de Synbranchus madeirae (a, b), S. cf. lampreia (c, d),

Synbranchus sp.1 (e, f) e Synbranchus sp.2 (g, h). Formato da cabeça (a, c, e, g) e o

padrão de manchas ao longo do corpo (b, d, f, h).

12

2.2 Métodos

2.2.1 Indução de mitoses Para se obter um maior número de células em metáfase foi utilizada a técnica de

indução de mitoses descrita por Oliveira et al. (1988), que consiste em preparar uma

solução de fermento biológico na seguinte proporção: 0,5 g de fermento, 0,5 g de açúcar

e 20 mL de água destilada. Em seguida, esta solução foi incubada em banho-maria ou

estufa a 40 °C por cerca de 20 minutos, e posteriormente injetada na região

intraperitoneal do animal, na proporção de 1 mL para cada 100 g de peso vivo. Os

peixes foram mantidos em aquários aerados por um período de 24 horas antes da coleta

das amostras para análise citogenética.

2.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos Após 24 horas da aplicação da solução de fermento, foi injetada,

intraperitonealmente uma solução aquosa de colchicina 0,0125% na proporção de 1 mL

para cada 100 g de peso vivo, por 45 a 60 minutos (Bertollo et al. 1978). Após esse

tempo, os peixes foram submetidos a uma dose letal do anestésico eugenol 2% e

procedeu-se a retirada da porção anterior do rim, que é o órgão hematopoiético. Este

tecido foi lavado em solução hipotônica de KCl a 0,075M e transferido para outro

recipiente de vidro contendo cerca de 10 mL da solução hipotônica de KCl, onde foi

dissociado com pinças de dissecação. A suspensão celular obtida foi colocada em estufa

a 37 °C por 20 minutos. Em seguida o material foi ressuspendido cuidadosamente com

o auxílio de uma seringa desprovida de agulha e transferido para um tubo de centrífuga,

utilizando-se uma pipeta Pasteur. Foram adicionadas 4 gotas de fixador Carnoy 3:1

(metanol: ácido acético), recém preparado e gelado e a amostra foi centrifugada por 10

minutos a 900 rpm, descartando-se o sobrenadante. Adicionou-se com cuidado 8 mL de

fixador Carnoy 3:1, ressuspendeu-se o material cuidadosamente com o auxílio de uma

pipeta Pasteur e esta lavagem foi repetida por mais duas vezes. Após a última

centrifugação e eliminação do sobrenadante foram adicionados 1,5 mL de fixador e o

material foi ressuspendido com cuidado. Esta suspensão celular foi guardada em tubos

eppendorf e mantida em freezer para posterior utilização.

Para a preparação das lâminas, as mesmas foram colocadas em solução

sulfocrômica por 24 horas. Após este período, foram retiradas, lavadas em água corrente

13

e destilada e armazenadas em álcool 100%. As lâminas foram imersas em água destilada

a 45 °C, em banho-maria. Após 5 minutos, foram retiradas da água e a suspensão

celular foi gotejada sobre três pontos diferentes da lâmina, que foi seca diretamente ao

ar. Em seguida, as amostras foram coradas com Giemsa 5% diluído em tampão fosfato

0,06M e pH 6,8, por 15 minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar.

2.2.3 Detecção das regiões organizadoras de nucléolo – RONs Para a detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foi utilizada a

técnica descrita por Howell e Black (1980), com modificações. Sobre as lâminas com a

suspensão foram adicionadas 2 a 3 gotas de uma solução coloidal de gelatina (2 g de

gelatina comercial sem sabor, dissolvida em 100 mL de água destilada, acrescida de

1mL de acido fórmico) e, sobre cada gota de gelatina, duas gotas de solução aquosa de

nitrato de Prata (AgNO3) a 50%, agitando-se levemente a lâmina, que foi coberta com

lamínula. A lâmina foi colocada em câmara úmida, em banho-maria a 60 °C, durante 3

a 8 minutos. Após esse tempo, quando a lâmina adquiriu uma coloração marrom

dourada, a mesma foi lavada em água destilada, permitindo que a lamínula fosse

retirada naturalmente pela própria água e seca ao ar.

2.2.4 Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C) Para a detecção da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica descrita

por Sumner (1972), com algumas modificações. As lâminas com a suspensão celular

foram tratadas com HCl 0,2N a 45 °C, por 2 minutos, lavadas rapidamente em água

destilada à temperatura ambiente e secas ao ar. Após isso as lâminas foram incubadas

por cerca de 40 segundos em solução de hidróxido de bário a 5%, recém preparada e

filtrada a 42 °C. Posteriormente, a ação do hidróxido de bário foi interrompida

imergindo-se rapidamente a lâmina em solução de HCl 0,2N (temperatura ambiente),

lavada em água destilada e deixada secar ao ar. Após secas, as lâminas foram incubadas

em solução 2xSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico 0,03M, pH 6,8) em banho-

maria a 60 °C, por 15 minutos. Em seguida, foram lavadas várias vezes em água

destilada e secas ao ar. As lâminas foram coradas com solução de Giemsa (diluída a 5%

em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8) durante 10 minutos, lavadas em água destilada e

secas ao ar.

14

2.2.5 Extração de DNA total A extração de DNA foi realizada a partir do tecido muscular, utilizando o

protocolo básico de Sambrook e Russel (2001) com algumas modificações. Foram

macerados aproximadamente 20 mg de tecido muscular e transferidos para um tubo de

volume de 1,5 mL. Em seguida foram adicionados 500 µL de tampão de lise (Tris-HCl

10 mM em pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, SDS 1%) conforme Estoup et al.

(1993) e com o acréscimo de Uréia 4 M conforme Asahida et al. (1996). Posteriormente

foram acrescentados: 15 μL de proteinase K (10 mg/mL) e 6 μL de RNAse (10 mg/mL).

As amostras foram incubadas a 60 ºC por aproximadamente 2 horas para que o tecido

fosse totalmente digerido. Foram adicionados 100 µL de acetato de amônio 3M, 1

volume (600 µL) de fenol-clorofórmio (1:1) e agitado por inversão, por alguns minutos.

Após isso as amostras foram centrifugadas por 30 minutos a 14.000 rpm em

temperatura ambiente. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, adicionados

600 µL de clorofórmio e misturado, cuidadosamente, por alguns minutos, por inversão.

Em seguida, a mistura foi centrifugada por 20 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante

foi transferido para um novo tubo e foram acrescentados 100 µL de acetato de amônio

3M, 1 volume (600 µL) de isopropanol gelado e misturado gentilmente por inversão. O

precipitado foi deixado a -20 °C por cerca de 14 horas ou a -80 °C por 1 hora. O

material foi retirado do freezer e centrifugado por 30 minutos a 14.000 rpm,

descartando-se o sobrenadante. O pellet foi lavado com 1 mL de etanol 70% e

centrifugado por 20 minutos a 14.000 rpm. Novamente, o sobrenadante foi descartado,

o pellet foi seco em estufa a 55 °C, ressuspendido em 100 μl de TE 0,2X ou água milli-

Q e deixado eluindo por 14 horas. Para possibilitar a análise da quantidade e integridade

do material, o DNA extraído foi quantificado por comparação com marcador de DNA

bacteriófago Lambda, em eletroforese padrão (com tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X e

corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose 0,8% e corado com GelRed Acid Gel

Stain (Biotium 1:500). A visualização e análise do DNA no gel foram feitas no

fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency), o qual possui acoplado um

transluminador de luz ultravioleta (260 nM).

15

2.2.6 Isolamento de sequências repetitivas por PCR (Polymerase Chain Reaction) e

marcação por nick translation (Bionick labeling system-Invitrogen)

Sequências repetitivas já identificadas e caracterizadas como conservadas em

outras espécies de peixes, tais como 18S, 5S e teloméricas foram estudadas. Para a

obtenção das sondas de DNAr 5S, DNAr 18S e sequências teloméricas foi utilizado o

DNA genômico extraído do músculo de Synbranchus madeirae e Synbranchus cf.

lampreia. As sondas foram obtidas por amplificação por Reação em Cadeia da

Polimerase (PCR), conforme Saiki et al. (1988) utilizando os primers:

-DNAr 5S (A 5’-TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3’ e B 5’-

CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3’) (Komiya e Takemura 1979);

-DNAr 18S (IpF 5’CCGCTTTGGTGACTCTTGAT e IpR

5’CCGAGGACCTCACTAAACCA) (Gross et al. 2010b).

- Sequências teloméricas (TTAGGG)5 e (CCCTAA)5 (Ijdo et al. 1991).

Os ciclos de amplificação seguiram as seguintes etapas:

a) 5S: 5 minutos a 94 ºC (desnaturação); 2 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30 segundos

a 61 ºC e 45 segundos a 72 ºC; 2 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30 segundos a 59 ºC e 45

segundos a 72 ºC; 2 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30 segundos a 57 ºC e 45 segundos a 72

ºC; 25 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30 segundos a 61 ºC e 45 segundos a 72 ºC

(amplificação); 7 minutos a 72 ºC (extensão);

b) 18S: 2 minutos a 94 ºC (desnaturação); 35 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30

segundos a 55 ºC, 1 minuto e 40 segundos a 72 ºC (amplificação); 7 minutos a 72 ºC

(extensão).

c) Telomérica: 10 minutos a 94 ºC (desnaturação); 30 segundos a 55 ºC; 1 minuto

a 72 ºC (amplificação); 30 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC e 1 minuto e

30 segundos a 72 ºC (amplificação); 5 minutos a 72 ºC (extensão).

As reações de PCR foram feitas em um termociclador Eppendorf -

Mastercycler Gradient, para volume final de 15 μL (1 μL de DNA genômico (100 ng);

1,5 μL de Tampão 10X com cloreto de magnésio (1,5 mM); 0,15 μL de Taq DNA

16

polimerase (5U/µl); 3,0 μL de dNTP (1 mM); 0,6 μL de cada primer (5 mM); água

milli-Q para completar o volume).

As sondas foram marcadas por biotina 14-dATP por nick translation, seguindo

protocolo do fabricante (Bionick labeling system-Invitrogen). Para tanto, em um tubo de

eppendorf de 1,5 mL, mantido no gelo, foi preparada uma solução contendo 1 μL de

Mix dNTP 10x; 1 μL de sonda de DNA (200 ng/ μL); 1 μL de Mix de enzima 10x; 6 μL

de água milli-Q, totalizando 9 μL, para cada lâmina que foi hibridizada. Esta solução foi

homogeneizada, centrifugada brevemente e incubada a 16 ºC por 45 minutos no

termociclador. Em seguida, para interromper a reação, foi adicionado 1 μL de stop

buffer contendo 1 μL de acetato de sódio 3M e após isso foi mantida em freezer para

posterior utilização.

2.2.7 Hibridização in situ por fluorescência - FISH

Foi utilizada a técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH) descrita

por Pinkel et al. (1986) com algumas modificações.

Tratamento das lâminas As lâminas foram lavadas em tampão PBS 1x por 5 minutos em temperatura

ambiente. As lâminas foram desidratadas em série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%)

durante 5 minutos cada. Em seguida foram tratadas com 90 µl de RNase 10 µg/mL (5

µL de RNase 10 mg/mL e 975 µL de 2XSSC) por 1 hora em câmara úmida a 37 ºC. As

lâminas foram lavadas três vezes em 2xSSC durante 5 minutos cada. Após isso, as

lâminas foram lavadas em PBS 1x durante 5 minutos.

Fixação

As lâminas foram fixadas em formaldeído 1% em PBS 1X/50mM MgCl2 durante

10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente lavadas em PBS 1x por 5 minutos.

Após, as lâminas foram desidratadas em série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%)

durante 5 minutos cada. Deixou-se secar ao ar. Em seguida foram desnaturadas em

formamida 70% em 2xSSC a 70 ºC por 5 minutos e novamente desidratadas em etanol

gelado 70%, 85% e 100% por 5 minutos cada. Deixou-se secar ao ar.

17

Solução de hibridização

Em um tubo eppendorf, foram adicionados 6 µl de sonda, 15 µl de formamida, 6

µl de sulfato de dextrano 50% e 3 µl de 20xSSC. A sonda foi desnaturada a 99 °C por

10 minutos e passada imediatamente ao gelo.

Hibridização

Foram colocados 30 µl de solução de hibridização sobre uma lamínula e a

lâmina foi invertida sobre a lamínula. As lâminas foram mantidas com o material

voltado para baixo em câmara úmida (H20 destilada) a 37 °C por cerca de 14 horas.

Lavagens

As lamínulas foram removidas das lâminas. Em seguida foram lavadas em

2xSSC a 72 °C por 5 minutos. Após, foram transferidas para solução de PBD 1x (leite

em pó desnatado; Triton X-100; 20xSSC; diluído em água destilada ajustando para pH

7,0) a temperatura ambiente.

Detecção Foram colocadas sobre cada lâmina 30 µL de avidina-FITC 0,07% em tampão C

(0,1 M de bicarbonato de sódio, pH 8,5 e 0,15 M de NaCl). Em seguida foram cobertas

com lamínula e deixadas por 30 minutos em câmara úmida com água destilada.

Posteriormente as lamínulas foram removidas e as lâminas foram lavadas três vezes em

solução de PBD 1x recém preparado a 45 ºC por 2 minutos cada. Após a lavagem, foi

colocada sobre cada lâmina 20 µL de anti-avidina biotina-conjugada 2,5% (1 µL de

anti-avidina estoque em 19 µL de PBD 1x), coberta com lamínula e deixada em câmara

úmida com água destilada a 37 °C por 10 minutos. Após, as lâminas foram lavadas três

vezes em solução de PBD 1x a 45 ºC por 2 minutos cada. Posteriormente, foi colocada

sobre cada lâmina 30 µL de avidina-FITC 0,07% em tampão C, coberta com lamínula e

deixada em câmara úmida com água destilada a 37 °C por 10 minutos.

Montagem das lâminas Adicionou-se a cada lâmina solução de iodeto de propídio diluído em antifade

Vector (20 µL de antifade e 0,4 µL de iodeto de propídio).

18

2.2.8 Análise cariotípica Após a análise e contagem dos cromossomos ao microscópio óptico foi

estabelecido o número diploide modal e suas frequências relativas para cada indivíduo.

As melhores metáfases obtidas com as técnicas clássicas (convencional, RON e banda

C) foram fotografadas, com objetiva de imersão em câmera digital Canon Power shot A

650 IS. As metáfases submetidas a técnicas moleculares (FISH) foram analisadas e

capturadas em um fotomicroscópio de epifluorescência Olympus Bx-51, em objetiva de

imersão.

Para a montagem dos cariótipos foi utilizado o programa Adobe Photoshop 7.0,

versão CS3, a partir de cromossomos metafásicos mitóticos, os quais foram recortados e

tentativamente emparelhados. Os cromossomos foram medidos, utilizando o programa

livre ImageJ, agrupados de acordo com a sua morfologia e colocados em ordem

decrescente de tamanho. A morfologia cromossômica foi determinada de acordo com os

critérios de relação de braços (RB=BM/Bm, onde BM = braço maior e Bm = braço

menor) segundo Levan et al. (1964). Os cromossomos foram separados em

metacêntricos (m), que apresentam RB=1,00 a 1,70, submetacêntricos (sm) RB=1,71 a

3,00, subtelocêntricos (st) RB=3,01 a 7,00 e acrocêntricos (a) RB > 7,00. O número

fundamental (NF) foi determinado de acordo com o número de braços cromossômicos,

considerando-se os metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos como tendo dois

braços e acrocêntricos como tendo apenas um braço.

2.2.9 Análise comparativa das medidas cromossômicas entre as espécies de Synbranchus

A partir dos dados obtidos com as medidas cromossômicas foi feita uma análise

comparativa entre as espécies estudadas. De cada espécie obteve-se a frequência do

comprimento relativo dos pares cromossômicos por classes de tamanho. Para

determinar o número ideal de classes, para a distribuição dos pares por classe de

tamanho relativo, foi utilizada a formula de Sturges (Fonseca e Martins 1982):

n= 1+ 3,32 * LogN, onde n= número de classes e N= lote haplóide (em número).

Depois de determinar o número ideal de classes, foi feita a subtração entre o

maior e o menor valor do comprimento relativo dos cromossomos, em µm, de cada

espécie. O valor encontrado foi dividido pelo número ideal de classes, e o resultado

19

encontrado corresponde ao intervalo de cada classe, onde: classe 1=2,53-4,40; classe

2=4,41-6,28; classe 3=6,29-8,16; classe 4=8,17-10,04; classe 5=10,05-12,87.

20

3 Resultados De um total de 24 indivíduos coletados, 14 foram identificados como

Synbranchus madeirae, oito como Synbranchus cf. lampreia, um foi nomeado de

Synbranchus sp.1 e um de Synbranchus sp. 2.

3.1 Synbranchus madeirae A Tabela 2 mostra o número dos exemplares, número diploide e total de células

analisadas. O número diploide modal determinado para esta espécie foi igual a 46

cromossomos, sendo 6m+2st+38a e o número fundamental (NF) foi igual a 54 (Figura

2a). Nenhum heteromorfismo relacionado à presença de cromossomos sexuais foi

observado.

A heterocromatina constitutiva foi observada nas regiões centromérica e

terminal da maioria dos cromossomos, mas também foram observados blocos

intersticiais e distais em alguns pares cromossômicos (Figura 2b; 4).

A região organizadora de nucléolo (RON), submetida à impregnação com nitrato

de prata, foi evidenciada com até cinco marcações, sendo considerada múltipla,

localizadas nas regiões terminais dos braços longos do par 2, dos braços curtos do par 6

e na região intersticial do braço longo de um dos homólogos do par 7. Porém, nem

sempre todas estiveram ativas (Quadro 1; Figura 2c).

A hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr 18S também

evidenciou até cinco marcações, porém dois padrões de distribuição foram encontrados.

No primeiro padrão (10 indivíduos), um dos homólogos dos pares 1, 2, e 7 apresentou

marcações, assim como ambos os homólogos do par 6 e para um indivíduo foi

observado em ambos os homólogos dos pares 2 e 21 apresentaram sítios ribossomais

18S, bem como um dos homólogos dos pares 6 e 7. Entretanto, para o primeiro padrão e

para um individuo, apenas as marcações dos pares 6 e 7 foram coincidentes com as

marcações com nitrato de Prata. Do par 2 apenas um dos homólogos coincidiu com

AgRON e do par 1, um dos homólogos também apresentou uma marcação na região

terminal dos braços longos (Figura 3 a, b; 4; Quadro 1). A sonda DNAr 5S evidenciou

um sítio localizado na região intersticial dos braços longos do par 7, sendo sintênico e

adjacente a um dos sítios de DNAr 18S (Figura 3c, 4). A sonda telomérica evidenciou

sequências apenas nas regiões teloméricas de todos os cromossomos (Figura 3d).

21

Tabela 2 Número diploide e frequência relativa (%) para indivíduos de Synbranchus

madeirae coletados no Lago Catalão (Iranduba, AM).

Número diplóide Indivíduos

(Nº de registro)

40 41 42 43 44 45 46 47 48 Total de células

10202 0 0 0 0 0 05 26 01 0 32

10212 0 0 0 0 02 04 24 0 0 30

10213 0 0 0 0 02 09 21 0 0 32

10230 0 0 0 0 0 05 25 0 0 30

10247 0 0 0 02 0 09 19 0 0 30

10250 0 0 0 0 01 06 26 0 0 33

10253 0 0 0 06 04 0 21 0 0 31

10254 0 0 0 0 0 03 27 0 0 30

10336 0 0 01 01 0 0 34 0 0 36

10342 0 0 0 02 02 0 27 0 0 31

10346 0 0 0 02 01 0 30 0 0 33

7532 0 0 0 0 0 0 32 0 0 32

7533 0 0 0 0 0 2 28 0 0 30

7446 0 0 0 0 0 0 30 0 0 30

Total 0 0 01 13 12 43 370 01 0 440

% - - 0,23 2,95 2,73 9,77 84,09 0,23 - 100

22

Figura 2 Cariótipos de Synbranchus madeirae: a) em coloração convencional Giemsa;

b) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de

banda C; c) em destaque os pares nucleolares impregnados por AgNO3.

m=Metacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10µm.

23

Quadro 1 Padrões de RONs e DNAr 18S encontrados em indivíduos de S. madeirae,

coletados mo lago Catalão (Iranduba, AM).

24

Figura 3 Cariótipos de Synbranchus madeirae: a-b) localização física cromossômica do

DNAr 18S (amarelo); c) localização física cromossômica do DNAr 5S

(amarelo); d) Localização física cromossômica da sequência telomérica

(amarelo). m=Metacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual

a 20µm.

25

3.2 Synbranchus cf. lampreia A Tabela 3 mostra o número dos exemplares, número diploide e total de células

analisadas. O número diploide modal determinado para esta espécie foi igual a 44

cromossomos, sendo 6m+2st+36a e o número fundamental (NF) foi igual a 52 (Figura

4a).

A heterocromatina constitutiva foi observada nas regiões proximal, terminal,

distal, centromérica e intersticial da maioria dos cromossomos (Figura 4b).

A região organizadora de nucléolo (RON) submetida à impregnação com nitrato

de prata foi evidenciada como RON simples, localizada na região terminal dos braços

longos do par 19, com um bloco de heterocromatina distal, adjacente à RON (Figura

4c).

A hibridização in situ fluorescente (FISH), com sonda de DNAr 18S, evidenciou

um par cromossômico portador deste sítio, coincidente com a marcação por nitrato de

Prata (Figura 5a). A sonda de DNAr 5S evidenciou um sítio localizado na região

intersticial dos braços longos do par 7 (Figura 5b). A sonda telomérica evidenciou

sequências em todas as regiões teloméricas, além de uma marcação centromérica em um

dos homólogos do par 3 (Figura 5c).

26

Tabela 3 Número diploide e frequência relativa (%) para indivíduos de Synbranchus cf.

lampreia coletados no Lago Catalão (Iranduba, AM).

Número diploide Indivíduos

(Nº de registro)

40 41 42 43 44 45 46 47 48 Total de células

9885 0 0 02 04 37 0 0 0 0 43

9911 0 0 0 08 22 0 0 0 0 30

9912 0 0 0 0 31 0 0 0 0 31

10186 01 0 0 07 24 0 0 0 0 32

10210 0 0 02 08 20 0 0 0 0 30

10340 0 0 0 04 27 0 0 0 0 31

10345 0 0 0 08 22 0 0 0 0 30

10349 0 03 0 09 19 0 0 0 0 31

Total 01 03 04 48 202 0 0 0 0 258

% 0,39 1,16 1,55 18,6 78,30 - - - - 100

27

Figura 4 Cariótipos de Synbranchus cf. lampreia: a) em coloração convencional

Giemsa; b) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da

técnica de banda C; c) em destaque o par nucleolar impregnado por AgNO3.

m=Metacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10 µm.

28

Figura 5 Cariótipos de Synbranchus cf. lampreia: a) Localização física cromossômica

do DNAr 18S (amarelo); b) Localização física cromossômica do DNAr 5S

(amarelo); c) Localização física cromossômica da sequência telomérica

(amarelo). m=Metacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barras

iguais a 20µm.

29

3.3 Synbranchus sp. 1 A Tabela 4 mostra o número do exemplar, número diploide e total de células

analisadas do único individuo identificado de Synbranchus sp.1. O número diploide

para este indivíduo foi igual a 42 cromossomos, sendo 6m+4sm+32a e o número

fundamental (NF) foi igual a 52 (Figura 6a).

A heterocromatina constitutiva foi observada nas regiões centromérica e

terminal da maioria dos cromossomos, além de marcações intersticiais nos

cromossomos dos pares 4 e 13 (Figura 6b).

A região organizadora de nucléolo (RON), submetida à impregnação com nitrato

de prata, foi evidenciada como RON múltipla com até cinco marcações, localizadas na

região terminal do braço curto de um dos homólogos do par 4, dos braços longos do par

13 e na região terminal dos braços longos do par 16 (Figura 6c), todas coincidentes com

regiões de heterocromatina constitutiva.

A hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr 18S evidenciou

até cinco marcações, coincidentes com as marcações por nitrato de Prata, além de uma

marcação localizada na região centromérica do braço longo de um dos homólogos do

par 4 (Figura 7a,b). A sonda DNAr 5S evidenciou um sítio localizado na região

intersticial dos braços longos do par 10 (Figura 7c). A sonda telomérica evidenciou

sequências em todas as regiões teloméricas e marcações intersticiais nos cromossomos

dos pares 4, 6, 8, 9, 12, 15, 20 (Figura d).

Tabela 4 Número diploide e frequência relativa (%), para um indivíduo de Synbranchus sp.1 coletado no Lago Catalão (Iranduba, AM).

Número diploide Indivíduo (Nº de

registro) 40 41 42 43 44 45 46 47 48

Total de células

9915 10 0 24 0 0 0 0 0 0 34

Total 10 0 24 0 0 0 0 0 0 34

% 29,4 - 70,6 - - - - - - 100

30

Figura 6 Cariótipos de Synbranchus sp. 1: a) em coloração convencional Giemsa; b)

regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de

banda C; c) em destaque os pares nucleolares impregnados por AgNO3.

m=Metacêntrico, sm=Submetacêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10µm.

31

Figura 7 Cariótipos de Synbranchus sp.1: a) Localização física cromossômica do DNAr

18S (amarelo); b) em destaque os pares portadores dos sítios de DNAr 18S; c)

Localização física cromossômica do DNAr 5S (amarelo); d) Localização

física cromossômica da sequência telomérica (amarelo). m=Metacêntrico,

sm=Submetacêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 20µm.

32

3.4 Synbranchus sp.2 A Tabela 5 mostra o número do exemplar, número diploide e total de células

analisadas do único individuo identificado de Synbranchus sp.2. O número diploide

para este indivíduo foi igual a 42 cromossomos, sendo 6m+2sm+4st+30a e o número

fundamental (NF) foi igual a 54 (Figura 8a).

A heterocromatina constitutiva foi observada nas regiões centromérica e

terminal da maioria dos cromossomos, um dos homólogos do par 1 apresentou dois

blocos intersticiais, sendo um no braço curto e um no longo e alguns cromossomos

apresentaram blocos intersticiais (Figura 8b).

A região organizadora de nucléolo (RON), submetida à impregnação com nitrato

de prata, foi evidenciada como RON simples, localizada na região terminal do braço

curto de um dos homólogos do par 4 (Figura 8c).

A hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr 18S evidenciou

até 14 marcações, sendo oito conspícuas. Estas foram intersticiais no braço longo e

curto de um dos homólogos do par 1, terminal nos braços curtos e intersticial nos braços

longos do par 4, intersticial nos pares 12 e 15, terminal nos braços longos do par 13 e

distal nos braços longos do par 14 (Figura 9a). Porém, somente um dos homólogos do

par 4 foi coincidente com o nitrato de Prata.

Tabela 5 Número diploide e frequência relativa (%), para o indivíduo identificado como Synbranchus sp.2 coletado no Lago Catalão (Iranduba, AM).

Número diploide Indivíduo

(Nº de registro) 40 41 42 43 44 45 46 47 48

Total de células

10209 5 0 15 0 0 0 0 0 0 20

Total 5 0 15 0 0 0 0 0 0 20

% 25 - 75 - - - - - - 100

33

Figura 8 Cariótipos de Synbranchus sp. 2: a) em coloração convencional Giemsa; b)

regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de

banda C; c) em destaque o par nucleolar impregnado por AgNO3.

m=Metacêntrico, sm=Submetacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico.

Barra igual a 10 µm.

34

Figura 9 Cariótipo de Synbranchus sp. 2: a) Localização física cromossômica do DNAr

18S (amarelo). m=Metacêntrico, sm=Submetacêntrico, st=Subtelocêntrico,

a=Acrocêntrico. Barra igual a 20µm.

35

Figura 10 Idiograma comparativo de (a) Synbranchus madeirae;(b) Synbranchus cf. lampreia; (c) Synbranchus sp.1; (d) Synbranchus sp.2; em preto, heterocromatina constitutiva; em amarelo, genes de DNAr 18S; em rosa, genes de DNAr 5S.

36

3.5 Medidas cromossômicas O comprimento total médio dos cromossomos de Synbranchus cf. lampreia

variou entre 19,255 a 44,049 μm, de S.madeirae variou entre 12,364 a 62,936 μm, de

Synbranchus sp1 variou entre 43,281 a 186,274μm e de Synbranchus sp2 variou entre

41,381 a 183,215μm. O agrupamento dos cromossomos em cinco classes de tamanho

também evidencia a distinta composição cromossômica das quatro espécies (Figura 11).

As classes 1 e 2 fornecem resultados mais expressivos na diferenciação das espécies,

uma vez que na classe 3 ocorre sobreposição entre S. cf. lampreia e Synbranchus sp1, e

na classe 5 entre as espécies S. madeirae, Synbranchus sp1 e Synbranchus sp2.

Figura 11 Análise comparativa das medidas cromossômicas entre as espécies

estudadas. Eixo X: número de classes (classe I: 2,53 a 4,40; classe II: 4,41 a 6,28; classe

III: 6,29 a 8,16; classe IV: 8,17 a 10,04; classe V: 10,05 a 12,87); eixo Y: número de

cromossomos por classe de tamanho.

37

4 Discussão Synbranchiformes é uma ordem de peixes com representantes tanto no Velho

como no Novo Mundo e com ampla distribuição (Nelson 2006). Alguns estudos

envolvendo o conteúdo de DNA nuclear já foram efetuados em algumas espécies desta

ordem, sendo possível evidenciar que Mastacembelus armatus apresenta menor

conteúdo de DNA (1.39 ± 0.08 pg) quando comparado a Macrognathus aculeatus (1,61

pg), ambas espécies com o mesmo número diploide (2n= 48). Em Monopterus albus,

que apresenta somente 2n=24 cromossomos, o conteúdo de DNA (1,24 pg) é muito

similar ao observado para outras espécies de Synbranchiformes, o que indica que

ocorreram poucas alterações na quantidade de DNA durante o processo evolutivo deste

grupo (Jianxun et al. 1991; Oliveira et al. 1997). Em contrapartida, apesar dos estudos

cariotípicos ainda serem escassos comparado com outros grupos de peixes, verifica-se

uma grande variabilidade cromossômica entre as espécies (Tabela 1). O número

diploide varia de 42 a 48 e o no número fundamental (NF) de 24 a 88, sendo que as

espécies do Velho Mundo têm 2n=48 cromossomos.

O número diploide igual a 48 cromossomos acrocêntricos foi considerado por

Ohno (1974) como o cariótipo básico dos teleósteos e segundo Foresti et al. (1992), este

número também seria o ancestral para Synbranchiformes. Visto que a família

Synbranchidae apresenta origem Gondwânica (Rosen 1976), e considerando que as

espécies irmãs do Velho Mundo têm 2n=48 cromossomos (Tabela 1), o cariótipo

ancestral desta família também pode ter sido 2n=48. Porém, não existe consenso com

relação ao número diploide considerado basal para o gênero Synbranchus. Melillo et al.

(1996) sugerem que este número seria 2n=42. Em contrapartida, Sanchez e Fenocchio

(1996) propuseram que as populações de Synbranchus marmoratus da Argentina teriam

se originado a partir de um ancestral com 2n=44, o que teria favorecido a alteração da

fórmula cariotípica e a presença de RONs múltiplas. Ainda, os dados citogenéticos

recentes referentes à S. marmoratus evidenciaram a ocorrência de cinco citótipos,

sugerindo que os números diploides 42 e 44 teriam se originado de um ancestral com

2n=46 cromossomos, com a redução do número cromossômico por meio de rearranjos

robertsonianos do tipo fusão (Torres et al. 2005). Parte desta confusão pode estar

relacionada ao fato de que os indivíduos e populações identificados como S.

marmoratus não formam um grupo monofilético, evidenciado por dados morfológicos

38

(Favorito-Amorim 1992) e moleculares (dois genes mitocondriais) (Perdices et al.

2005).

A análise de mais quatro espécies de Synbranchus identificadas como S.

madeirae (2n=46), S. cf. lampreia (2n=44), Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp.2

(2n=42), coletadas em simpatria e sintopia no lago Catalão, Iranduba, no estado do

Amazonas, revelou variabilidade cariotípica interespecífica, sendo verificados três

números diploides e quatro fórmulas cromossômicas. Números diploides semelhantes

aos encontrados no Amazonas foram visualizados em diferentes populações

identificadas de S. marmoratus (Tabela 1). Porém, quando comparamos os dados do

presente trabalho com os disponíveis na literatura, é possível verificar que nenhuma

fórmula cromossômica foi idêntica, ressaltando a presença de rearranjos cromossômicos

não-robertsonianos na evolução cromossômica do grupo. Ainda, apesar de não haver

consenso com relação ao número diploide considerado basal para o gênero

Synbranchus, a evolução cromossômica das espécies deste grupo também englobou

rearranjos robertsonianos que possibilitaram o aparecimento das composições

cariotípicas atuais, os quais favoreceram mudanças no número diploide. Segundo

Sumner (2003), a alteração mais comumente envolvida na evolução cromossômica é o

rearranjo robertsoniano do tipo fusão, mecanismo responsável pela redução do número

diploide e aumento no número de cromossomos com dois braços. No presente trabalho

as duas espécies que apresentaram menor número cromossômico (Synbranchus sp.1 e

Synbranchus sp.2, ambas com 2n=42 cromossomos) também evidenciaram mais

cromossomos do tipo meta-submetacêntricos quando comparado à S. cf. lampreia e S.

madeirae, corroborando a possível ocorrência de fusões cromossômicas.

A presença destes rearranjos cromossômicos também pode ser visualizada pelo

mapeamento físico cromossômico de sequências teloméricas, que consistem de

repetições curtas, ricas em guanina (TTAGGG)n e amplamente conservadas nos

genomas de vertebrados (Guerra 2004), sendo regiões de extrema importância para

manutenção da estabilidade e integridade cromossômica (Nanda et al. 2002; Multani et

al. 2006; Monagham 2010). A hibridização com sonda telomérica evidenciou

marcações nos telômeros de todos os cromossomos das três espécies (S. madeirae, S. cf.

lampreia e Synbranchus sp.1) (não foi obtida para Synbranchus sp. 2), além disso,

foram encontradas marcações intersticiais em duas espécies, o que comprova que na

39

evolução cariotípica do grupo houve a ocorrência de evento de fusão, com a redução do

número diploide. Ainda, essas sequências teloméricas intersticiais podem ser

consideradas resquícios ancestrais de rearranjos cromossômicos, produzidos durante a

evolução cariotípica (Metcalfe et al. 2007). Deste modo, isto é indicativo de um

processo de rearranjo recente ocorrido durante a evolução do grupo (Nanda et al. 2002).

Além disso, rearranjos cromossômicos do tipo inversões e translocações não podem ser

descartados. Estes rearranjos podem contribuir para a reorganização do genoma,

oferecendo novas fórmulas cromossômicas e novos números de braços nos cariótipos.

Assim, os dados do presente trabalho corroboram com a hipótese de Foresti et al.

(1992) e sugerem que o ancestral de Synbranchus possuía 2n=48 cromossomos.

Além da variação interespecífica na fórmula cariotípica e número de

cromossomos, a análise comparativa do tamanho dos cromossomos de S. marmoratus,

S. cf. lampreia, Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp.2 também evidenciou diferenças na

organização do genoma das mesmas. Apesar das quatro espécies apresentarem a maioria

dos cromossomos distribuídos na classe de menor tamanho, a frequência dos

cromossomos que estão agrupados nesta classe variou, sendo que 70% dos

cromossomos de S. madeirae apresentam de 2,53 a 4,4µm, 50% dos de S. cf. lampreia,

42% dos de Synbranchus sp.1 e 52% dos de Synbranchus sp.2. Atualmente é

amplamente aceito que a diversidade de tamanho e de organização dos genomas é

influenciada por regiões de DNA repetitivo não codificante, como pseudogenes,

retrotransposons, transposons, DNA satélite e outros, estando a maioria destes

elementos alocados em regiões heterocromáticas (Leitch 2007).

O padrão de distribuição da heterocromatina de algumas espécies de

Synbranchiformes foi estudado e blocos heterocromáticos foram visualizados nas

regiões centromérica e pericentromérica de quase todos os cromossomos, sendo que em

alguns foram também evidenciados em regiões intersticiais (Foresti et al. 1992; Sanchez

e Fenocchio 1996; Oliveira et al. 1997; Liu et al. 2002). As quatro espécies de

Synbranchus analisadas no presente trabalho apresentaram padrões de heterocromatina

espécie-específicos, sendo possível observar além das marcações já encontradas para as

outras espécies, blocos heterocromáticos nas regiões terminal, proximal e distal da

maioria dos cromossomos, caracterizando um padrão muito diferente daqueles já

descritos. Esse padrão distinto de distribuição de heterocromatina, com um possível

40

aumento da mesma, pode ser devido a um processo de heterocromatinização ou adição

de heterocromatina nos indivíduos de Synbranchus spp. coletados no lago Catalão. Esta

diferenciação pode ter ocorrido por trocas desiguais durante processos de crossing over,

transposições ou duplicações dessas sequências, ou mesmo por mecanismos

epigenéticos, como o remodelamento da cromatina e a metilação do DNA, os quais

auxiliam na compactação e organização do genoma em domínios cromáticos (Grewal e

Jia 2007).

Variação na quantidade e localização da heterocromatina constitutiva tem sido

considerada como importante marcador de alguns gêneros de peixes amazônicos, como

observado em Serrasalmus (Characidae, Serrasalminae), onde sete espécies apresentam

um grande bloco proximal no braço longo de um par de cromossomos, coincidente com

o DNAr 5S (Nakayama et al. 2008; Nakayama et al. no prelo). Ainda, em alguns casos,

este marcador pode ser populacional, como evidenciado em diferentes populações de

Geophagus brasiliensis (Vicari et al. 2006). A heterocromatina é atualmente

reconhecida como uma parte importante do genoma dos eucariotos, cujas funções

incluem segregação cromossômica, organização nuclear e regulação da expressão

gênica, e também pode afetar o processo de recombinação gênica (Grewal e Jia 2007;

Skipper 2007; Bühler 2009).

Ainda, evidências mostram que as regiões heterocromáticas podem ter funções

adicionais, incluindo a regulação da mitose, progressão do ciclo celular e proliferação

das células assim como, podem estar associadas a respostas a mudanças no ambiente

como muitas formas de estresses exógenos, como trocas de temperatura, choques

térmicos e hipóxia (Burt e Trivers 2006; Varriale et al. 2008). Para espécies de peixes

amazônicos já foi evidenciado que o padrão de distribuição da heterocromatina

constitutiva nas três espécies de acarás-disco (Symphysodon spp., Cichlidae) pode estar

relacionado ao ambiente em que vivem, visto que cada espécie ocorre preferencialmente

em águas que apresentam padrões físico-químicos distintos (Gross et al. 2010a).

De maneira geral, em peixes, a heterocromatina é rica em sequências repetitivas

e estas têm merecido atenção especial em estudos relativos à estrutura centromérica e

telomérica (Lanfredi et al. 2001; Vicente et al. 2001), origem e evolução de

cromossomos sexuais (Devlin et al. 1998; Stein et al. 2001; Venere et al. 2004),

41

cromossomos supranumerários (Mestriner et al. 2000; Jesus et al. 2003) e evolução dos

genomas (da Silva et al. 2002). Dentre estas sequências repetitivas destacam-se os genes

ribossomais e sequências teloméricas.

Os DNAs codificadores de RNAs ribossomais podem ser divididos em duas

famílias multigênicas, repetidas em tandem, a primeira classe, representada pelo DNAr

45S, que compreende as regiões que transcrevem os genes RNAs 28S, 18S e 5,8S, além

de espaçadores intergênicos, estando estes genes relacionados com as regiões

organizadoras de nucléolo; e a segunda classe, DNAr 5S, consiste de uma sequência

altamente conservada de 120 pares de bases e espaçadores não transcritos (NTS) de

tamanho variável (Martins 2007).

Segundo revisão de Galetti Jr. e Martins (2004), estudos realizados em peixes

neotropicais, como Astyanax spp, Brycon spp., Hoplias malabaricus, Leporinus spp.,

entre outros, têm utilizado a técnica da hibridização fluorescente in situ (FISH) com

sondas de DNA ribossômico, para compreender a organização das regiões

organizadoras de nucléolo e inferir sobre a evolução cromossômica das espécies. Este

método é considerado mais sensível que a impregnação por nitrato de prata porque

localiza as sequências de DNA ribossômico da família 45S em metáfases mitóticas e

células interfásicas, ao invés de marcar as proteínas nucleolares envolvidas com a

atividade transcricional dos genes ribossomais como ocorre com a prata (Miller et al.

1976; Pendás et al. 1993; Phillips e Reed 1996).

Região organizadora de nucléolo simples pode ser considerada uma

característica plesiomórfica em estudos de evolução cromossômica de qualquer grupo

de organismos, e para a ordem Synbranchiformes, a RON simples é considerada uma

condição ancestral (Oliveira et al. 1997). Dentro desta ordem, foram analisadas espécies

das famílias Mastacembelidae e Synbranchidae. Na espécie Mastacembelus armatus,

pertencente à primeira família, RON simples foi verificada e em Synbranchus

marmoratus foi identificada RON simples em pelo menos 15 populações coletadas no

Sul, Sudeste e Centro-oeste do Brasil, porém em posições distintas, enquanto que três

populações da Argentina apresentaram RON múltipla (Tabela 1). Porém, é necessário

enfatizar que estes resultados para M. armatus e S. marmoratus referem-se apenas à

impregnação com nitrato de prata, que tem afinidade com proteínas nucleolares

envolvidas com a atividade transcricional dos genes ribossomais da família 45S,

42

identificando apenas as RONs que estiveram ativas durante a intérfase precedente

(Miller et al. 1976; Howell e Black 1980; Boisvert et al. 2007). Ou seja, não é possível

determinar com exatidão quantos são os sítios ribossomais encontrados nos indivíduos

das diferentes populações de S. marmoratus já analisadas. Entretanto, em M. albus com

o menor número diploide do grupo (2n=24 telocêntricos), o padrão da RONs

evidenciada tanto pela impregnação com AgNO3 como pela FISH com sonda DNAr

18S foi simples e múltipla (Ji et al. 2003). Esses autores acreditam que essa

variabilidade intraespecífica encontrada em M. albus, pode estar relacionada com a

atividade transcricional dos genes ribossomais. No presente estudo, a localização das

regiões organizadoras de nucléolo (RONs), detectada tanto pela impregnação com

AgNO3 como pela FISH com sonda DNAr 18S constituiu num excelente marcador

espécie-específica para as quatro espécies de Synbranchus, ou seja, S. cf. lampreia

apresentou RON simples, evidenciada tanto pela impregnação com AgNO3 como pela

hibridização da sonda homóloga DNAr 18S; Synbranchus sp.1 apresentou RON

múltipla, em ambas as técnicas e Synbranchus sp.2 mostrou apenas um cromossomo

marcado pelo AgNO3 e até 14 marcações pela FISH com a sonda DNAr 18S. Já, S.

madeirae apresentou RON múltipla e com variação intraespecífica para ambas as

técnicas (Quadro1).

A discordância entre os números de RONs e sítios ribossomais 18S encontrada

em S. madeirae provavelmente está relacionada com a atividade transcricional dos

cístrons ribossomais, porém a detecção de dois padrões de distribuição dos genes RNAr

18S demonstra a presença de rearranjos cromossômicos do tipo não-robertsonianos nos

indivíduos desta espécie, os quais podem ser facilitados pela presença de regiões

heterocromáticas adjacentes ou coincidentes a estes cístrons. Ainda, estas regiões

heterocromáticas podem estar abrigando elementos transponíveis, os quais parecem

afetar a mobilidade dos cístrons ribossomais (Guerra 2004). Este fato corroboraria a

hipótese de Sanchez e Fenocchio (1996), que analisando populações de S. marmoratus

da Argentina, sugeriram que a localização da RON em regiões terminal e intersticial

facilitaria eventos de translocação destes sítios no genoma, o que poderia explicar a

origem de RON múltipla nestas populações.Variabilidade inter e intraespecífica quanto

ao número e tamanho dos sítios ribossomais 18S relacionada à mobilização de

43

elementos transponíveis durante a evolução já foram descritas para outras espécies de

peixes amazônicos, tais como os acarás-disco (Gross et al. 2010a).

Em relação ao gene DNAr 5S, para a maioria dos organismos ele está presente

em apenas um par cromossômico, embora sua localização possa ser em região

intersticial ou terminal, e só podem ser observados com a técnica de hibridização in situ

(Martins e Galetti Jr 1999; Guerra 2004; Martins e Wasko 2004; Galetti Jr e Martins

2004). Entretanto, Martins e Galetti Jr. (1999) consideram que a localização desse sítio

em posição intersticial nos cromossomos estaria mais protegida de eventos de

transposição, os quais poderiam agir na dispersão dessas sequências. Esses autores

hipotetizaram que a localização deste gene em apenas um par cromossômico seja a

condição ancestral entre os organismos (Guerra 2004; Martins e Galetti Jr. 1999). A

FISH com a sonda DNAr 5S, nas espécies de Synbranchus aqui analisadas, evidenciou

uma marcação intersticial nos braços longos de um par cromossômico para três

espécies, sendo que em S. cf. lampreia e em S. madeirae foi o par 7 e em Synbranchus

sp.1 o par 10 (dado não obtido para Synbranchus sp 2). Porém, como as fórmulas

cariotípicas são diferentes, pode-se considerar o sitio de DNAr 5S homeólogo para as

três espécies de Synbranchus, sugerindo uma conservação para este gene, e que os

diversos rearranjos ocorridos na evolução cariotípica deste gênero não afetaram o sítio

DNAr 5S. Ainda, em peixes o DNAr 18S e 5S podem estar localizados em sintenia

(Morán et al. 1996; Almeida-Toledo et al. 2002; Cross et al. 2006) ou localizados em

diferentes pares cromossômicos (Martins e Galleti Jr 2001). Em S. madeirae a marcação

5S foi sintênica com uma das marcações do DNAr 18S.

A variabilidade cariotípica encontrada nas espécies de Synbranchus pode estar

associada às características da biologia, fisiologia e reprodução desses peixes, e tais

características podem ter favorecido o surgimento de mecanismos de isolamento

reprodutivo ou interrupção do fluxo gênico (Futuyma, 2002; Ridley 2006),

possibilitando a fixação de rearranjos cromossômicos. De acordo com Galleti Jr. et al.

(2000), grupos de peixes com variação cariotípica apresentam possibilidade de formar

populações isoladas, o que favorece a especiação e a formação de novos táxons, que

nem sempre são reconhecíveis morfologicamente.

44

Nakamoto et al (1986a, b) analisando populações identificadas como S.

marmoratus coletadas em diferentes regiões de São Paulo, observaram dois padrões de

fenótipos eletroforéticos para a hemoglobina. O primeiro padrão, fenótipo 1, apresentou

três bandas distintas de hemoglobinas: Hb1 (hemoglobina catódica), Hb 2 (hemoglobina

intermediária) e Hb 3 (hemoglobina anódica) nos indivíduos das regiões de Botucatu,

Rio Claro e Ribeirão Preto. O segundo fenótipo também apresentou os três tipos de

hemoglobinas, mas com 12 bandas. Foresti et al (1992), estudando citogeneticamente os

mesmos indivíduos, verificaram uma variação no número diploide (2n=42 a 46). Esses

autores sugerem uma correlação entre o número diploide e o tipo de hemoglobina, ou

seja, os indivíduos identificados pelo fenótipo 1 das hemoglobinas estão associados com

números diploides iguais a 44 e 46 cromossomos, enquanto o fenótipo 2 relaciona-se

apenas com 2n = 42 cromossomos.

Até o momento, apesar da presença de grande variabilidade cariotípica,

cromossomos sexuais diferenciados não foram observados em espécies do gênero

Synbranchus, e esta característica pode facilitar a reversão sexual descrita para essas

espécies. Fato semelhante também ocorre em duas espécies de peixes hermafroditas

sequenciais protogínicos Epinephelus guttatus (Perciformes, Serranidae) e Thalassoma

bifasciatum (Perciformes. Labridae), cujos machos e fêmeas possuem constituição

cromossômica idêntica e a determinação do sexo ocorre por mecanismos gênicos (Ruiz-

Carus 2002).

Diante da variabilidade cromossômica encontrada no presente trabalho e com

base nos dados disponíveis na literatura para o gênero Synbranchus, acreditamos que a

tendência mais provável de evolução cromossômica para este grupo seja a partir de um

ancestral com 2n=48 cromossomos (extinto ou ainda não encontrado) com a redução do

número diploide. Portanto, para que se possa realmente compreender os mecanismos

envolvidos no processo da evolução cariotípica deste grupo de peixes, faz-se necessário

elucidar a sistemática do mesmo, bem como, ampliar os locais de coleta e associar

estudos que envolvam ecologia, biologia e genética de cada táxon.

45

5 Conclusões Através dos estudos citogenéticos realizados no presente trabalho, pode-se

concluir que:

• Foi possível diferenciar quatro espécies de Synbranchus, tanto pela morfologia

como pelos dados cromossômicos, sendo identificadas como: Synbranchus

madeirae, Synbranchus cf. lampreia, Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp.2.

• A variabilidade cariotípica interespecífica do gênero Synbranchus pode ser

atribuída a rearranjos robertsonianos e não-robertsonianos.

• O padrão da heterocromatina constitutiva das quatro espécies de Synbranchus

do lago Catalão caracterizou-se como um padrão muito diferente daqueles já

descritos para Synbranchus marmoratus, sugerindo um processo de

heterocromatinização ou adição de heterocromatina, ou ainda por fatores

epigenéticos.

• A variabilidade da RON, simples para uma espécie (S. cf. lampreia) e múltipla

para as outras três (S. madeirae, Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp.2), tanto

por impregnação com AgNO3 como por FISH com DNAr 18S, pode estar

relacionada com a atividade transcricional dos cístrons ribossomais ou com uma

possível mobilização de elementos transponíveis.

• O sítio de DNAr 5S pode ser considerado homeólogo para S. madeirae, S. cf.

lampreia e Synbranchus sp.1, sugerindo uma conservação para este gene

ribossomal.

• A hibridização com sondas teloméricas evidenciou a presença destas sequências

em posição intersticial, o que pode sugerir que rearranjos cromossômicos do

tipo fusão e/ou inversão ocorreram em S. madeirae, S. cf. lampreia e

Synbranchus sp.1.

46

6 Perspectivas No decorrer deste trabalho surgiram novas perspectivas de pesquisas.

• A ampliação dos locais de coleta, para verificar se a variabilidade cariotípica

encontrada em Synbranchus no lago Catalão é encontrada em outros locais.

• Mapeamento cromossômico de outras sequências repetitivas como histonas,

elementos transponíveis (Rex1, Rex3, Rex6, entre outros), para que seja possível

compreender os mecanismos evolutivos que provocaram a variação do número

de sítios DNAr 18S em S. madeirae.

• Comparação da organização genômica dos diferentes táxons de Synbranchus por

meio da GISH (hibridização genômica in situ).

• Realização de estudos histológicos para que seja possível determinar o sexo dos

indivíduos de Synbranchus.

• Realização de estudos citogenéticos clássicos e moleculares de outras espécies

da ordem Synbranchiformes, pois existem poucos dados citogenéticos para esta

ordem.

47

7 Referências Bibliográficas

Almeida-Toledo, L.F. 1998. Cytogenetic markers in Neotropical freshwater fishes, p.

583-588. In: Malabarba, L.R.; Reis, R.E.; Vari, R.P.; Lucena, R.P.; Lucena,

Z.M.S.; Lucena, C.A.S (Eds). Phylogeny and classification of Neotropical fishes.

Editora da Pontifícia Universidade Católica, Porto Alegre, Brasil.

Almeida-Toledo, L.F.; Ozouf-Costaz, C.; Foresti, F.; Bonillo, C.; Porto-Foresti, F.;

Daniel-Silva, M. 2002. Conservation of the 5S-bearing chromosome pair and co-

localization with major rDNA clusters in five species of Astyanax (Pisces,

Characidae). Cytogenetic Genome Research, 97: 229–233.

Alves-Brinn, M.N.; Porto, J.I.R.; Feldberg, E. 2004. Karyological evidence for

interspecific hybridization between Cichla monoculus and C. temensis

(Perciformes, Cichlidae) in the Amazon. Hereditas, 141: 252-257.

Antoneli, F.N. 2002. Cinética da inversão de sexo em Synbranchus marmoratus

(Teleostei, Synbranchiformes, Synbranchidae). Dissertação de Mestrado.

Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo. 162 pp.

Antoneli, F.N. 2006. Perfil morfo-funcional da inversão do sexo em Synbranchidae

(Teleostei: Synbranchiformes). Tese de doutorado. Universidade Estadual de

Campinas, Campinas, São Paulo. 167 pp.

Arkhipchuk, V.V. 1999. Database of Fish chromosomes. http://www.fishbase.org.

Artoni, R.F.; Vicari, M.R.; Bertollo, L.A.C. 2000. Citogenética de peixes neotropicais:

métodos, resultados e perspectivas. Publication UEPG Biological and Health

Sciences 6(1): 43-60.

Asahida, T.; Kobayashi, T.; Saitoh, K.; Nakayama, I. 1996. Tissue preservation and

total DNA extraction from fish stored at ambient temperature using buffers

containing high concentration of urea. Fisheries Science, 62(5): 727-730.

Benzaquem, D.C.; Feldberg, E.; Porto, J.I.R.; Gross, M.C.; Zuanon, J.A.S. 2008.

Cytotaxonomy and karyoevolution of the genus Crenicichla (Perciformes,

Cichlidae). Genetics and Molecular Biology, 1: 250-255.

48

Bertollo, L.A.C.; Takahashi, C.S.; Moreira-Filho, O. 1978. Cytotaxonomic

considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erytrinidae). Brazilian Journal of

Genetic, 7: 103-120.

Boisvert, F.M.; Koningsbruggen, S.V.; Navascués, J.; Lamond, A.I. 2007. The

multifunctional nucleolus. Molecular Cell Biology, 8: 574-585.

Britski, H.A.; Silimon, K.Z.S.; Lopes, B.S. 1999. Peixes do Pantanal: Manual de

Identificação. EMBRAPA-SPI, Brasília, Brasil. 184 pp.

Burt, A.; Trivers, R. 2006. Genes in conflict: the biology of selfish genetic elements.

Harvard University Press, Cambridge, p. 228-300.

Bühler, M. 2009. RNA turnover and chromatin-dependent gene silencing.

Chromosoma, 118: 141–151.

Centofante, L.; Porto, J.I.R.; Feldberg, E. 2002. Choromosomal polymorphism in

Serrasaln spilopleura Kner, 1858 (Characidae, Serrasalminae) from Central

Amazon Basin. Caryologia, 55: 37-45.

Cross, I.; Merlo, A.; Manchado, M.; Infante, C.; Canavate, J.P.; Rebordinos, L. 2006.

Cytogenetic characterization of the sole Solea senegalensis (Teleostei:

Pleuronectiformes: Soleidae): Ag-NOR, (GATA)n, (TTAGGG)n and ribosomal

genes by one-color and two-color FISH. Genetica, 128: 253–259.

Dasilva, C.; Hadji, H.; Ozouf-Costaz, C.; Nicaud, S.; Jaillon, O.; Weissenbach, J.;

Crollius, H.R. 2002. Remarkable compartmentalization of transposable elements

and pseudogenes in the heterochromatin of the Tetraodon nigroviridis genome.

Proceedings of the National Academy of Science USA, 99(21): 1636-1641.

de Oliveira, R.R.; Feldberg, E.; Anjos, M. B.; Zuanon, J. 2007. Karyotype

characterization and ZZ/ZW sex chromosome heteromorphism in two species of

the catfish genus Ancistrus Kner, 1854 (Siluriformes: Loricariidae) from the

Amazon basin. Neotropical Ichthyology, 5: 301–306.

de Oliveira, R.R.; Feldberg, E.; Anjos, M.B.; Zuanon, J. 2008. Occurrence of multiple

sexual chromosomes (XX/XY1Y2 and Z1Z1Z2Z2/Z1Z2W1W2) in catfishes of the

49

genus Ancistrus (Siluriformes: Loricariidae) from the Amazon basin. Genetica,

134: 243–249.

Devlin, R.H.; Stone, G.W.; Smailus, D.E. 1998. Extensive direct-tandem organization

of a long repeat DNA sequence on the Y chromosome of chinoock salmon

(Oncorhynchus tshawytscha). Journal of Molecular Evolution, 46: 277-287.

Estoup, A.; Presa, P.; Krieg, F.; Vaiman, D.; Guyomard, R. 1993. (CT)n and (GT)n

microsatellites: a new class of genetic markers for Salmo trutta L. (brown trout).

Heredity, 71: 488-496.

Favorito-Amorin, S.E. 1992. Revisão sistemática das espécies brasileiras do gênero

Synbranchus (Teleostei, Acanthopterygii). Dissertação de mestrado. Universidade

de São Paulo. 80pp.

Favorito, S.E.; Zanata, A.M.; Assumpção, M.I. 2005. A new Synbranchus (Teleostei:

Synbranchiformes: Synbranchidae) from ilha Marajó, Pará, Brazil, with notes on

its reproductive biology and larval development. Neotropical Ichthyology, 3: 319-

328.

Feldberg, E.; Porto, J.I.R.; Nakayama, C.M. 1993. Karyotype evolution in Curimatidae

(Teleostei, Characiformes) from the Amazon region II Centric fissions in the

genus Potamorhina. Genome, 36:372-376.

Feldberg, E.; Porto, J.I.R.; Alves-Brinn, M.N.; Mendonça, M.N.C.; Benzaquem, D.C.

2004. B chromosomes in Amazonian cichlid species. Citogenetics and Genome

Research, 106: 195–198.

Fonseca, J.S.; Martins, G.A. 1982. Curso de Estatística. Terceira edição, São Paulo.

Atlas. 286pp.

Foresti, F.; Oliveira, C.; Tien, O.S. 1992. Cytogenetic studies in fishes of the genus

Synbranchus (Pisces, Synbranchiformes, Synbranchidae). Naturalia, 17: 129-138.

Futuyma, D.J. 2002. Biologia evolutiva. Editora Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil.

567pp.

50

Galetti Jr., P.M.; Aguilar, C.T.; Molina, W.F. 2000. An overiew of marine fish

cytogenetics. Hydrobiologia, 420: 55-62

Galetti Jr, P.M.; Martins, C. 2004. Contribuição da hibridização in situ para o

conhecimento dos cromossomos dos peixes. In: Guerra, M. (Ed). FISH: Conceitos

e Aplicações na Citogenética. Editora da Sociedade Brasileira de Genética,

Ribeirão Preto, Brasil. p. 61-88.

Graham, J.B.; Lai, N.C.; Chiller, D.; Roberts, J.L. 1995. The transition to air breathing

in fishes V. Comparative aspects of cardiorespiratory regulation in Synbranchus

marmoratus and Monopterus albus (Synbranchidae). The Journal of Experimental

Biology, 198: 1455-1467.

Grewal, S.I.S.; Jia, S. 2007. Heterochromatin revised. Nature reviews, 8: 35-46.

Gross, M.C.; Schneider, C.H.; Valente, G.T.; Martins, C.; Feldberg, E. 2010a.

Comparative cytogenetic analysis of the genus Symphysodon (Discus fishes,

Cichlidae): chromosomal characteristics of retrotransposons and minor ribosomal

DNA. Cytogenetic and Genome Research, 127: 43-53.

Gross, M.C.; Schneider, C.H.; Valente, G.T.; Martins, C.; Feldberg, E. 2010b.

Variability of 18S rDNA locus among Symphysodon fishes: chromosomal

rearrangements. Journal of Fish Biology, 76: 1117-1127.

Guerra, M. 1988. Introdução à citogenética geral. Editora Guanabara, Rio de Janeiro,

Brasil. 142 pp.

Guerra, M. 2004. Hibridização in situ: Princípios básicos. In: Guerra, M. (Ed). FISH:

Conceitos e Aplicações na Citogenética. Editora da Sociedade Brasileira de

Genética, Ribeirão Preto, Brasil. p. 1-32.

Howell, W.M.; Black, D.A. 1980. Controlled silver staining of nucleolus organizer

regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 3:

1014-1015.

IJdo, J.W.;.Wells, R.A.; Baldini, A.; Reeders, S.T. 1991. Improved telomere detection

using a telomere repeat probe (TTAGGG)n generated by PCR. Nucleic Acids

Research, 19(17): 4780.

Jesus, C.M.; Galetti Jr., P.M.; Valentini, S.R.; Moreira-Filho, O. 2003. Molecular

characterization and chromosomal location of two families of satellite DNA in

51

Prochilodus lineatus (Pisces, Prochilodontidae), a species with B chromosomes.

Genetica, 118: 25-32.

Ji , F.Y.; Yu, Q.X.; Li, K.; Ren, X.H.2003. Ag-staining pattern, FISH and ISH with

rDNA probes in the rice field eel (Monopterus albus Zuiew) chromosomes.

Hereditas, 138: 207-212.

Jianxun, C.; Xiuhai, R.; Qxing, Y. 1991. Nuclear DNA content variation in fishes.

Cytologia, 56: 425-429.

Komiya, H.; Takemura, S. 1979. Nucleotide sequence of 5S ribosomal RNA from

rainbow trout (Salmo gairdnerii) liver. The Journal of Biochemistry, 86: 1067-

1080.

Khuda-Bukhsh, A.R.; Barat, A. 1987. Chromosomes in fifteen species of Indian teleosts

(Pisces). Caryologia, 40: 131-144.

Kullander, S.O. 2003. Family Synbranchidae, p. 594-595. In: Reis, R.R.; Kullander,

S.O.; Ferraris. C.J. (Eds). Check list of the freshwater of South and Central

America. Editora da Universidade Católica, Porto Alegre, Brasil.

Lanfredi, M.; Congiu, L.; Garrido-Ramos, M.A.; Herrán, L.D.; Leis, M.; Chicca, M.;

Rossi, R.; Tagliavini, J.; Rejón, C.R.; Rejón, M.R.; Fontana, F. 2001.

Chromosomal location and evolution of a satellite DNA family in seven sturgeon

species. Chromosome Research, 9: 47-52.

Leitch, I.J. 2007. Genome sizes through the ages. Heredity, 99: 121–122.

Levan, A.; Fredga, K.; Sandberg, A.A. 1964. Nomenclature for centromeric position on

chromosomes. Hereditas, 52: 201-220.

Liu, J.D.; Yi, M.S.; Zhao, G.; Zhou, F.; Wang, D.Q.; Yu, Q.X. 2002. Sex chromosomes

in the spiny eel (Mastacembelus aculeatus) revealed by mitotic and meiotic

analysis. Cytogenetic Genome Research, 98: 291-297.

Lo Nostro, F.; Guerrero, G. 1996. Presence of primary and secondary males in a

population of Synbranchus marmoratus, Bloch 1795, a protogynous fish

(Teleostei, Synbranchiformes). Journal of Fish Biology, 49: 788-800.

Lo Nostro, F.; Grier, H.; Andreone, L.; Guerrero, G.A. 2003. Involvement of the

gonadal germinal epithelium during sex reversal and seasonal testicular cycling in

52

the protogynous swamp eel, Synbranchus marmoratus Bloch 1795 (Teleostei,

Synbranchidae). Journal of Morphology, 257: 107-126.

Manna, G.K.; Prasad, R. 1977. Chromosome analysis of five species of freshwater

fishes. Nucleus, 20: 264-271.

Margarido, V.P.; Galetti Jr, P.M. 1999. Heterochromatin patterns and karyotype

relationships within and between the genera Brycon and Salminus (Pisces,

Characidae). /Genetics and Molecular Biology, 22(3): 357-361.

Martins, C.; Galleti Jr., P.M. 1999. Chromosomal localization of 5S rDNA genes

Schizodon (Pisces, Anostomidae) chromosomes. Chromosome Research, 8(4):

353-355.

Martins, C.; Galleti Jr., P.M. 2001. Two 5S rDNA arrays in Neotropical fish species: is

it a general rule for fishes? Genetica, 111: 439-446.

Martins, C.; Wasko, A.P. 2004. Organization and evolution of 5S ribosomal DNA in the

fish genome. In: Williams, C.R. (ed) Focus on Genome Research. Nova Science

Publishers, Hauppauge, NY, USA. p. 335-363.

Martins, C. 2007. Chromosomes and repetitive DNAs: a contribution to the knowledge

of fish genome. In: Pisano, E.; Ozouf-Costaz, C.; Foresti, F.; Kapoor, B.G. (Eds).

Fish Cytogenetics. Science Publisher, Inc., Enfield, New Hampshire, USA. p.

421-453.

Melillo, M.I.F.M.; Foresti, F.; Oliveira, C. 1996. Additional cytogenetic studies on local

populations of Synbranchus marmoratus (Pisces, Synbranchiformes,

Synbranchidae). Naturalia, 21: 201-208.

Mesquita, D.R.; Porto, J.I.R.; Feldberg, E. 2008. Chromosomal variability in the wild

ornamental species of Symphysodon (Perciformes: Cichlidae) from Amazon.

Neotropical Ichthyology, 6: 181-190.

Mestriner, C.A.; Galetti Jr., P.M.; Valentini, S.R.; Ruiz, I.R.G.; Abel, L.D.S.; Moreira-

Filho, O.; Camacho, J.P.M. 2000. Structural and functional evidence that a B

chromosome in the characid fish Astyanax scabripinnis is an isochromosome.

Heredity, 85: 1-9.

Metcalfe, C.J.; Eldridge, M.D.; Johnston, P.G. 2007. Mapping the distribution of the

telomeric sequence (T2AG3)n in the Macropoidea (Marsupialia) by fluorescence

53

in situ hybridization. II. The ancestral 2n=22 macropodid karyotype. Cytogenetics

Genome Research, 116: 212-217.

Miller, E.A.; Dev, V.G.; Tantravahi, R.; Miller, O.J. 1976. Supression of human

nucleolus organizer activity in mouse human somatic hybrid cells. Experimental

Cell Research, 101: 235-243.

Monagham, P. 2010. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Annals of

the New York Academy of Sciences, 1206: 130-142.

Morán, P.; Martínez, J.L.; Garcia-Vazquez, E.; Pendás, A.M. 1996. Sex chromosome

linkage of 5S rDNA in rainbow trout. Cytogenetics and Cell Genetics, 75: 145-

150.

Multani, A.S.; Ozen, M.; Furlong, C.L.; Zhao, Y.J.; Hsu, T.C.; Pathak, S. 2006.

Heterochromatin and interstitial telomeric DNA homology. Chromosoma, 110:

214–220.

Nakayama, C.M.; Porto, J.I.R.; Feldberg, E. 2000. Ocorrência de dois citótipos em

Serrasalmus spilopleura Kner, 1858 (Characiformes, Serrasalmidae) da região de

confluência dos rios Negro e Solimões Amazonas, Brasil. Acta Amazonica, 1:

149-154.

Nakayama, C.M.; JéGu, M.; Porto, J.I.R.; Feldberg, E. 2001. Karyological evidence for

a cryptic species of piranha within Serrasalmus rhombeus (Characidae,

Serrasalminae) in the Amazon. Copeia, 3: 866–869.

Nakayama, C.M.; Feldberg, E.; Bertollo, L.A.C. 2008. Mapping of ribosomal genes and

chromosomal markers in three piranha species of the genus Serrasalmus

(Characidae, Serrasalminae) from the Amazon basin. Genetics and Molecular

Biology, 31(4): 868-873.

Nakayama, C.M.; Feldberg, E.; Bertollo, L.A.C. In press. Karyotype differentiation and

cytotaxonomic considerations in species of Serrasalminae (Characiformes,

Characidae) from the Amazon basin. Neotropical Ichthyology

54

Nakamoto, W.; Machado, P.E.A.; Foresti, F. 1986a. Hemoglobins patterns in different

populations of Synbranchus marmoratus (Pisces, Synbranchidae). Comparative

Biochemical and Physiology, 84: 377-382.

Nakamoto, W.; Machado, P.E.A.. 1986b. Characterization of the hemoglobins and globins

of Synbranchus marmoratus (Pisces, Synbranchidae). Comparative Biochemical and

Physiology, 84: 383-386.

Nanda, I.; Schrama, D.; Feichtinger, W.; Haaf, T.; Schartl, M.; Schmid, M. 2002.

Distribuition of telomeric (TTAGGG) sequences in avian chromosomes.

Chromosoma, 111: 215-227.

Nelson, J.S. 2006. Fishes of the world. 4 ed. John Wiley and Sons, New York. 600 pp.

Ohno, S. 1974. Protochordata, Cyclostomata and Pisces. Animal Cytogenetics, 4(1): 1-

92.

Oliveira, C.; Almeida-Toledo, L.F.; Foresti, F.; Toledo-Filho, S.A. 1988.

Supernumerary chromosomes, Robertsonian rearrangement and multiple NORs in

Corydoras aeneus (Pisces, Siluriformes, Callichthyidae). Caryologia, 41: 227-

236.

Oliveira, C.; Almeida Toledo, L.F.; Moli, L; Toledo-Filho, S.A. 1992. Extensive

chromosomal rearrangements and nuclear DNA content changes in the evolution

of the armoured catfishes genus Corydoras (Pisces, Siluriformes, Callichthyidae).

Journal Fish Biology, 40: 419-431.

Oliveira, C.; Torres, R.A.; Favorito, S.; Foresti, F. 1997. Cytogenetic studies of

Mastacembelus armatus (Pisces, Mastacembelidae). Cytobios, 92: 83-89.

Pendás, A.M.; Moran, P.; Garcia-Vasquez, E. 1993. Ribosomal RNA genes are

interspersed throughout a heterochromatic chromosome arm in Atlantic salmon.

Cytogenetic and Cell Genetics, 63: 128-130.

Perdices, A.; Doadrio, I.; Bermingham, E. 2005. Evolutionary history of the

synbranchid eels (Teleostei: Synbranchidae) in Central America and the

Caribbean islands inferred from their molecular phylogeny. Molecular

Phylogenetics and Evolution, 37: 460–473.

55

Pinkel, D.; Straume, T.; Gray, J.W. 1986. Cytogenetic analysis using quantitative, high-

sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the Natural Academy of

Science, 83: 2934-2938.

Phillips, R.B.; Reed, K.M. 1996. Application of fluorescence in situ hybridization

(FISH) techniques to fish genetics: a review. Aquaculture, 40: 197-216.

Ravaglia, M.A.; Maggese, M.C. 2003. Ovarian follicle ultrastructure in the teleost

Synbranchus marmoratus Bloch, 1795, with special reference to the vitelline

envelope development. Tissue Cell, 35: 9-17.

Reis, R. E., Kullander S. O., Ferraris, C.J. 2003. Check List of The Freshwater Fishes of

South and Central America. Porto Alegre, EDIPUCRS. 742 pp.

Ridley, M. 2006. Evolução.Editora Artmed, Porto Alegre, Brasil, 752pp.

Rosen, D.E.; Rumney, A. 1972. Evidence of a second species of Synbranchus (Pisces,

Teleostei) in South America. American Museum, 2497: 1-45.

Rosen, D.E.; Greenwood, P.H. 1976. A fourth Neotropical species of synbranchid eel

and the phylogeny and systematics of synbranchiform. Ann Wien von Mus.

Naturg, 157: 1-70.

Rosen, D.E., 1976. A vicariance model of Caribbean biogeography. Systematic Zoology,

2: 431–464.

Ruiz-Carus, R. 2002. Chromosome analysis of the sexual phases of the protogynous

hermaphrodites Epinephelus guttatus and Thalassoma bifasciatum (Serranidae

and Labridae; Teleostei). Caribbean Journal of Science, 38: 44-51.

Saiki, R.K.; Gelfand, D.H.; Stoffel, S.; Scharf, S.J.; Higuchi, R.; Horn, G.T.; Mullis, K.

B.; Erlich, H.A. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a

thermostable DNA polymerase. Science, 239: 487-491.

Sambrook, J.; Russell, D.W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Vol. I.

Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. p. 633–664.

Sanchez, S.; Fenocchio, A.S. 1996. Karyotypic analysis in three populations of the

South-American eel like fish Synbranchus marmoratus. Caryologia, 49: 65-71.

56

Santos, G.M.; Ferreira, E.J.G. 1999. Peixes da Bacia Amazônica. In: Lowe-McConnell,

R.H. (Eds). Estudos ecológicos de comunidades de peixes tropicais. Editora da

Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil. p.345-373.

Schofield, P.; Nico, L.G. 2009. Salinity of non-native Asian swamp eels (Teleostei;

Synbranchidae) in Florida, USA: comparison of three populations and

implications for dispersal. Environmental Biology of Fishes, 85: 51-59.

Scudeler, P.E.S. 2010. Estudo da Estrutura Molecular dos Cromossomos

Supranumerários em Moenkhausia sanctaefilomenae (Teleostei, Characiformes,

Characidae). Tese de doutorado. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita

Filho, Botucatu, São Paulo. 136 pp.

Shibata, O.A. 2006. 40 peixes do Brasil: CESP 40 ANOS. Editora Doiis, Rio de Janeiro,

Brasil, 207pp.

Skipper, M. 2007. Mysteries of heterochromatic sequences unraveled. Nature Reviews,

8: 567.

Stein, J.; Phillips, R.B.; Devlin, R.H. 2001. Identification of the Y chromosome in

chinoock salmon (Oncorhynchus tshawytscha). Cytogenetics and Cell Genetics,

92: 108-110.

Sumner, A.T. 1972. A simple technique for demonstrating centromeric

heterochromatin. Experimental Cell Research, 75: 304-306.

Sumner, A.T. 2003. Chromosomes: organization and function. Blackwell Publishing,

New York, USA. 304 pp.

Teixeira, A.S.; Nakayama, C.M.; Porto, J.I.R.; Feldberg, E. 2006. Esterase-D and

chromosome patterns in Central Amazon piranha (Serrasalmus rhombeus

Linnaeus, 1766) from Lake Catalão. Genetics and Molecular Biology, 3: 498-502.

Terencio, M.L.; Schneider, C.H.; Gross, M.C.; Silva, A.M.; Feldberg, E.; Porto, J.I.R.

2008. Comparative cytogenetics of Carnegiella marthae and Carnegiella strigata

(Characiformes, Gasteropelecidae) and description of a ZZ/ZW sex chromosome

system. Genetics and Molecular Biology, 1: 231-234.

57

Torres, R.A. 2000. O gênero Synbranchus (Pisces, Synbranchinae, Synbranchidae):

interrelações citotaxonômicas, evolutivas e natureza da variabilidade cariotipica

Tese de doutorado. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho,

Botucatu, São Paulo. 141 pp.

Torres, R.A.; Roper, J.J.; Foresti, F.; Oliveira, C. 2005. Surprising genomic diversity in

the Neotropical fish Synbranchus marmoratus (Teleostei, Synbranchidae): how

many species? Neotropical Ichthyology, 3: 277-284.

Vari, R.P; Malabarba, L.R. 1998. Neotropical ichthyology: an overview, p. 1-11. In:

Malabarba, L.R.; Reis, R.E.; Vari, R.P.; Lucena, R.P.; Lucena, Z.M.S.; Lucena,

C.A.S. (Eds). Phylogeny and classification of Neotropical fishes. Editora da

Pontifícia Universidade Católica, Porto Alegre, Brasil.

Varriale, A.; Torelli, G.; Bernardi, G. 2008. Compositional properties and thermal

adaptation of 18S rRNA in vertebrates. RNA, 14: 1492-1500.

Venere, P.C.; Ferreira, I.A.; Martins, C.; Galetti Jr., P.M. 2004. A novel ZZ/ZW sex

chromosome system for the genus Leporinus (Pisces, Anostomidae,

Characiformes). Genetica, 121: 75-80.

Vicente, V.E.; Jesus, C.M.; Moreira-Filho, O. 2001. Chromosomal localization of 5S

and 18S rRNA genes in three Parodon species (Pisces, Parodontidae).

Caryologia, 54: 365-369.

Vicari, M.R.; Moreira-Filho, O.; Artoni, R.F.; Bertollo, L.A.C. 2006. Basic and

molecular cytogenetics in freshwater Cichlidae (Osteichthyes, Perciformes).

Karyotype and conservationism and divergence. Caryologia, 59: 260-266.

Yajuan, L.; Qixing, Y. 1991. Electron microscopic observation of synaptonemal

complexes in spermatocytes of six species of fishes. Chinese Journal Genetic, 18:

273-282.

Yu, X.; Zhou, T.; Li, Y.; Zhou, M. 1987. On the karyosystematics of cyprinid fishes and

a summary of fish chromosome studies in China. Genetica, 72: 225-236.