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Uso del microscopio ottico. Preparazione di un vetrino a fresco. Osservazioni al microscopio ottico degli organelli della cellula vegetale
Laboratorio didattico n.1
•IL MICROSCOPIO OTTICO DA BIOLOGIA
•LA CELLULA VEGETALE:
Parete cellulare:
•lamella mediana
•parete primaria
•parete secondaria
Nucleo
Vacuolo
Plastidi:
• cloroplasti
• amiloplasti
• cromoplasti
MICROSCOPIA
Il microscopio (dal greco: μικρόν (micron) piccolo e σκοπεῖν
(skopein) guardare) è uno strumento che consente di risolvere
e ingrandire oggetti di piccole dimensioni per permetterne
l'osservazione diretta o indiretta tramite fotografia e sistemi
elettronici.
Può essere ottico, e quindi basato sull'osservazione nell'ambito
dello spettro elettromagnetico della luce in senso lato,
elettronico basato sull'osservazione tramite fasci di elettroni, o
di altro tipo.
I primi strumenti efficaci vennero prodotti in Olanda alla fine del
XVI secolo, ma l'invenzione vera e propria è tuttora
controversa.
Il Microscopio Ottico
Costituenti: Parte meccanica
08/05/2020Titolo Presentazione Pagina 5
Costituenti: Parte meccanica
La parte meccanica deve essere robusta e relativamente pesante per
consentire la necessaria stabilità al sistema. Lo stativo rappresenta il corpo
principale del microscopio ed ha la funzione di fare da supporto ai
meccanismi di movimento e di messa a fuoco ed alla parte ottica. La parte
meccanica del microscopio alloggia anche il sistema di illuminazione, in
caso di sistemi con illuminazione incorporata.
Il preparato da osservare si pone sul tavolino portaoggetti, dotato di un
carrello traslatore per mezzo del quale il preparato può essere spostato
agevolmente eventualmente con movimenti meccanici micrometrici nelle
direzioni destra-sinistra e avanti-indietro. Al di là del tavolino portaoggetti,
verso l'illuminazione si trova un supporto meccanico che ospita il
condensatore ed il diaframma di apertura. Ancora oltre, prima
dell'illuminatore, si trova il diaframma di campo. Il microscopio deve
essere dotato di un sistema molto accurato di messa a fuoco sia del
preparato che del sistema di illuminazione. Il tavolino portaoggetti viene
spostato verticalmente rispetto all'obiettivo tramite i comandi di messa a
fuoco macrometrici e micrometrici (o alternativamente si può spostare
l'ottica rispetto al tavolino). Il condensatore focalizza correttamente
l'illuminazione sul preparato, il collettore focalizza la sorgente luminosa in
un particolare piano ottico del condensatore.
Costituenti: Parte funzionale
La parte funzionale, in genere chiamata ottica per gli strumenti basati sull'utilizzo della luce, è
formata da tre o quattro sistemi di lenti e dalla sorgente, che, nei sistemi composti a
radiazione trasmessa, partendo dalla base del microscopio, sono:
la sorgente
il collettore della sorgente o condensatore di campo, col diaframma di campo
il condensatore con il diaframma di apertura
l'obiettivo l'oculare.
La porzione di microscopio nella quale vanno
posizionati gli obiettivi multipli, se presente,
che possono essere scelti in base all'ingrandimento
si chiama revolver.
Il microscopio ottico utilizza come sorgente
la luce, intesa in senso generale come
radiazione elettromagnetica dal vicino
infrarosso all'ultravioletto, anche se i
microscopi più diffusi utilizzano proprio la
radiazione visibile, ha risoluzione
tipicamente minore rispetto al microscopio
elettronico, ma è generalmente economico e
fornisce immagini a colori anche di organismi
viventi. Con il microscopio ottico si possono
ad esempio distinguere i batteri.
Braccio
dello
stativo
Basamento
dello stativo
Vite
micrometrica
Vite
macrometrica
Tubo
oculare
Oculari
Obiettivi
Tavolino
portaoggetti
Condensatore
Fonte
luminosa
Viti per la
traslazione
orizzontale
del tavolino
Revolver
portaobiettivi
IL MICROSCOPIO OTTICO DA BIOLOGIA
1. Accendere il microscopio
2. Ruotare il revolver portaobiettivi
mettendo in posizione l’obiettivo a
minore ingrandimento (il più corto)
3. Montare il vetrino sul tavolino
portaoggetti
4. Traslare il vetrino con le viti per la
traslazione orizzontale, fino a portare il
preparato nel campo visuale
5. Mettere a fuoco il preparato con la vite
macrometrica
6. Aggiustare il fuoco con la vite micrometrica
7. Mettere in posizione l’obiettivo a maggiore ingrandimento
8. Aggiustare il fuoco con la vite micrometrica
9. Prima di rimuovere il vetrino dal tavolino portaoggetti, ruotare il revolver portaobiettivi
mettendo in posizione l’obiettivo a minore ingrandimento
08/05/2020Titolo Presentazione Pagina 9
COME SI PREPARA UN VETRINO A FRESCO
LA CELLULA VEGETALE
Parete cellulare
Lamella
mediana
Parete
secondaria
Parete
primaria Cellula 1
Cellula 2
LAMELLA MEDIANA (in comune
tra cellule contigue):
Sostanze pectiche
No cellulosa
STRATI DELLA PARETE CELLULARE
Questa immagine della parete cellulare di 2 cellule contigue è stata effettuata al
microscopio elettronico a trasmissione. Osserviamo la lamella mediana a contatto
tra le 2 cellule ed all’interno di ogni cellula la parete primaria e secondaria
PARETE PRIMARIA (si forma
all’interno della lamella mediana):
- FASE FIBRILLARE: cellulosa
- FASE MATRICIALE:
• H2O (70% del peso fresco)
• emicellulose
• sostanze pectiche
• proteine
Lamella
mediana
Parete
secondaria
Parete
primaria Cellula 1
Cellula 2
STRATI DELLA
PARETE CELLULARE
FASE DI MATRICE
(amorfa)
• Emicellulose
• Pectine
• H2O
• Proteine
• Composti fenolici
ARCHITETTURA DELLA
PARETE PRIMARIA
FASE MICROFIBRILLARE
• cellulosa
PARETE SECONDARIA (si forma
all’interno della parete primaria):
• Percentuale di fibrille di cellulosa
assai maggiore rispetto alla matrice
• Può essere formata da più strati
(generalmente 3)
•Spesso impregnata di sostanze
idrofobiche (lignina, suberina)
Lamella
mediana
Parete
secondaria
Parete
primaria Cellula 1
Cellula 2
STRATI DELLA
PARETE CELLULARE
E’ possibile osservare la parete
secondaria lignificata nei tessuti
meccanici e nei vasi xilematici
Ispessimenti lignificati
nella parete secondaria
di vasi legnosi
PER OSSERVARE
LE
CARATTERISTICHE
DI UN TESSUTO
EPIDERMICO AL
MICROCSOPIO
OTTICO
UTILIZZIAMO UNA
SPELLATURA DI
CIPOLLA
1. Prelevare un catafillo (foglia carnosa con funzione di riserva) di cipolla
2. Ottenere una spellatura della parte convessa del catafillo
3. Con l’ausilio della lametta tagliare un frammento della spellatura
4. Porre il frammento in una navicella contenente il Rosso Rutenio
5. Attendere 1 minuto circa e trasferire il frammento un un’altra navicella
contenente acqua
6. Dopo circa 30 secondi montare su vetrino il frammento su una goccia di
acqua, chiudere il preparato con un vetrino coprioggetto, montare il
vetrino sul microscopio
SPELLATURA DI CIPOLLA TRATTATA CON
ROSSO RUTENIO
SPELLATURA DI CIPOLLA TRATTATA CON
ROSSO RUTENIO
Il Rosso Rutenio colora in fucsia le pectine e le
emicellulose
PER OSSERVARE LE SCLEREIDI (CELLULECON PARETE
CELLULARE LIGNIFICATA): UTILIZZAIMO LA POLPA DI PERA
COLORATE CON BLU DI TOLUIDINA
Il Blu di Toluidina colora in azzurro la lignina
LA CELLULA VEGETALE
Vacuolo
VACUOLO IN CELLULE EPIDERMICHE DI CIPOLLA
ROSSA
Ottenere una spellatura di catafillo, come precedentemente descritto per la cipolla bianca
ed osservare direttamente. La maggior parte delle cellule risultano rosso-viola per la
presenza di antociani nel grande vacuolo centrale. Le cellule chiare si sono rotte nella
preparazione ed hanno perso gli antociani. Si può osservare il citoplasma ridotto in un
sottile strato a ridosso della membrana plasmatica
OSSERVIAMO COSA ACCADE NELLE
CELLULE VEGETALI IN RISPOSTA ALLE
VARIAZIONI DI CONCENTRAZIONE DELLE
SOLUZIONI CON CUI POSSONO VENIRE
IN CONTATTO: FENOMENO CHIAMATO
PLASMOLISI
LA RISPOSTA DELLA CELLULA VEGETALE ALLE
VARIAZIONI DI CONCENTRAZIONE DELLE SOLUZIONI
DELL’AMBIENTE ESTERNO. PER FARE L’ESPERIMENTO
METTIAMO UNA SPELLATURA DI CIPOLLA A CONTATTO
CON UNA SOLUZIONE CONCENTRATA DI ACQUA E
ZUCCHERO O SALE
Concentrazione interna di soluti
LA CELLULA VEGETALE
I PlastidiPER OSSERVARE I PLASTIDI AL
MICROSCOPIO OTTICO POSSIAMO
UTILIZZARE LE ALGHE CHE HANNO I
CLOROPLASTI MOLTO GRANDI
CLOROPLASTO NASTRIFORME DI Spirogyra
(ALGA VERDE: CHLOROPHYTA)
Mettiamo un filamento di alga su un vetrino portaoggetti con una goccia di
acqua. Copriamo con il vetrino copri-oggetti ed osserviamo
Possiamo osservare i cloroplasti al microscopio ottico anche
prendendo una fogliolina (filloide) di muschio
Mettiamo la fogliolina sul vetrino con una goccia di acqua ed osserviamo
immediatamente
AMILOPLASTI DI PATATA COLORATI CON IODO-IODURO
•Porre su vetrino una goccia di Reattivo di Lugol (che colora l’amido in viola scuro)
•Raschiare con lametta una piccola quantità di parenchima amilifero
•Montare sulla goccia la raschiatura
•Chiudere il preparato con vetrino coprioggetto ed osservare
Dopo la colorazione
Prima della colorazione
POSSIAMO OSSERVARE LA CONVERSIONE DEI
CLOROPLASTI IN CROMOPLASTI FACENDO SEZIONI DI
POLPA DI PEPERONI VERDI E ROSSI
Materiale vegetale incluso in gel e tagliato con
microtomo a vibrazione
La DisidratazioneE’ il passaggio che permette la sostituzione dell’acqua contenuta nel tessuto con unsolvente dei mezzi di inclusione (Paraffina o resine)
La disidratazione si effettua mediane passaggi del campione in soluzioni di alcool in una scala crescente di concentrazioni
Alcool 70%
Alcool 90%Alcool 100%
Fissazione 3° con Acetato di Uranile in alcool 70%(T.E.M.)
ChiarificazioneL’ultimo agente deve essere miscibile con i mezzi di inclusione
Xilolo
Acetone assoluto
Ossido di propilene
Paraffina
Resine idrofobiche per T.E.M.
InfiltrazioneDopo aver concluso la disidratazione del campione bisogna sostituire gradualmente lo xilolo o l’acetone con il mezzo di inclusione in forma liquida (Xilolo/acetone:mezzo di inclusione)
3:1 2:1 1.1 1:2 1:3
InclusioneE’ il passaggio che permette di impregnare il campione in un materiale abbastanzaduro ed omogeneo tale da poter essere tagliato in fette molto sottili
PARAFFINA (M.O.)
RESINE(T.E.M.)
• Miscela di idrocarburi saturi
• solida a T ambiente
• punto di fusione a 54-60°
• insolubile in H2O, solubile in xilolo
• Epon, Araldite
• liquida a T ambiente
• polimerizza a 60-70°C
• insolubile in H2O, solubile in acetone
• si preparano a partire da soluzioni dimonomeri, da sostanze plasticizzanti chemigliorano la consistenza finale del polimero e da un acceleratore chimicoper la reazione di polimerizzazione
Il campione viene immerso in paraffinao resina pura per completarne l’infiltrazione
T ambiente4°C
Polimerizzazione
Paraffina (m.o.) Resina (T.E.M)
60-70°C
Blocchetti prontiper esseretagliati insezioni
Il taglio delle sezioni
MICROTOMO
Strumento che permette di sezionarei blocchetti di paraffina contenenti il campione in fette spesse 3-10 uM
La raccolta delle sezioni
La colorazione
I coloranti sono di solito in soluzione acquosa Le sezioni devono essere
sparaffinate in xilolo e reidratate con scala decrescente di alcool (100, 90, 80, 70, 50,H2O)
Metodica ematossilina eosina
Ematossilina 10 min
Lavaggio con H2O corrente
Eosina 1 min
Disidratazione
Montaggio
VetriniXilanizzati