Sveučilište u Zagrebu

Farmaceutsko – biokemijski fakultet

Filip Blažević i Tamara Milekić

Utjecaj lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom

na cijeljenje rane in vitro

Zagreb, 2015.

Ovaj rad izrađen je u Zavodu za farmaceutsku tehnologiju Farmaceutsko – biokemijskog

fakulteta Sveučilišta u Zagrebu pod vodstvom izv. prof. dr. sc. Anite Hafner i predan je na

natječaj za dodjelu Rektorove nagrade u akademskoj godini 2014./2015.

Sadržaj

1. Uvod ................................................................................................................................................ 1

1.1. Građa kože ............................................................................................................................... 1

1.1.1. Epidermis ......................................................................................................................... 1

1.1.2. Epidermokutana veza ...................................................................................................... 3

1.1.3. Dermis ............................................................................................................................. 3

1.2. Cijeljenje rana .......................................................................................................................... 5

1.2.1. Hemostaza ....................................................................................................................... 5

1.2.2. Upala (inflamacija) ........................................................................................................... 6

1.2.3. Proliferacija ...................................................................................................................... 7

1.2.4. Maturacija ....................................................................................................................... 9

1.3. Melatonin .............................................................................................................................. 10

1.3.1. Utjecaj melatonina na cijeljenje rana ............................................................................ 11

1.4. Kitozan ................................................................................................................................... 13

1.4.1. Utjecaj kitozana i njegovih derivata na cijeljenje rana .................................................. 13

1.5. Lecitin .................................................................................................................................... 17

1.6. Nanotehnologija i nanočestice kao terapijski sustavi ........................................................... 18

1.6.1. Nanotehnološki pristup u razvoju funkcionalnih obloga za rane .................................. 18

1.6.2. Kitozanske nanočestice ................................................................................................. 20

1.6.3. Metode priprave nanočestica s kitozanom ................................................................... 21

2. Hipoteza, opći i specifični ciljevi rada ............................................................................................ 24

3. Materijal i metode ......................................................................................................................... 26

3.1. Materijal ................................................................................................................................ 26

3.2. Metode .................................................................................................................................. 27

3.2.1. Priprava nanočestica ..................................................................................................... 27

3.2.2. Određivanje uspješnosti uklapanja lijeka u nanočestice ............................................... 27

3.2.3. Određivanje veličine nanočestica .................................................................................. 28

3.2.4. Određivanje zeta-potencijala nanočestica .................................................................... 28

3.2.5. In vitro oslobađanje melatonina iz nanočestica ............................................................ 29

3.2.6. Stanična linija i uvjeti uzgoja ......................................................................................... 30

3.2.7. Ispitivanje citotoksičnosti in vitro - MTT test ................................................................ 30

3.2.8. Praćenje dinamike prekrivanja praznina nastalih namjernim oštećivanjem

konfluentnog sloja stanica – engl. scratch test ............................................................. 31

3.2.9. Statistička analiza .......................................................................................................... 32

4. Rezultati ......................................................................................................................................... 33

4.1. Priprava lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom................................................. 33

4.2. Karakterizacija nanočestica s melatoninom .......................................................................... 33

4.2.1. Uspješnost uklapanja melatonina u nanočestice .......................................................... 33

4.2.2. Veličina i zeta-potencijal nanočestica ........................................................................... 34

4.3. In vitro oslobađanje melatonina iz nanočestica .................................................................... 35

4.4. Ispitivanje citotoksičnosti in vitro MTT testom ..................................................................... 37

4.5. Utjecaj nanočestica na proliferaciju i migraciju HaCaT stanica ............................................. 40

5. Rasprava ........................................................................................................................................ 45

5.1. Lecitinsko-kitozanske nanočestice sa melatoninom uspješno su pripravljene ..................... 45

5.2. Uklapanje melatonina u nanočestice nije ovisilo o tipu kitozana ......................................... 46

5.3. Veličina i površinski naboj nanočestica ovise o stupnju deacetilacije i molekulskoj masi

kitozana ................................................................................................................................. 47

5.4. Melatonin se produljeno oslobađa iz nanočestica ................................................................ 49

5.5. Lecitinsko-kitozanske nanočestice manje utječu na vijabilnost stanica nego otopine

kitozana ................................................................................................................................. 50

5.6. Lecitinsko-kitozanske nanočestice s melatoninom utječu na epitelizaciju rane in vitro ...... 52

6. Zaključci ......................................................................................................................................... 55

7. Zahvale .......................................................................................................................................... 56

8. Popis literature .............................................................................................................................. 57

9. Sažetak ........................................................................................................................................... 68

10. Summary.................................................................................................................................... 69

1

1. Uvod

1.1. Građa kože

Koža je najveći organ ljudskog tijela, čini čak 16% tjelesne mase, a ukupna površina je oko

1,8 m2. Koža je fizička barijera prema okolini, a to joj je ujedno najvažnija funkcija. Na taj način

sprječava gubitak vode, elektrolita i drugih tvari, a istovremeno štiti od fizičkih, kemijskih i

mikrobioloških utjecaja. Koža također sudjeluje u regulaciji temperature.

Koža je složen organ građen od različitih staničnih tipova i struktura. Građena je od tri sloja:

epidermis, dermis i hipodermis (potkožno masno tkivo) (Slika 1). U kožu se ubrajaju i kožni

adneksi kao što su folikuli dlaka, nokti, žlijezde lojnice i znojnice.

Slika 1: Presjek kože [1]

Na površini kože nalazi se tanki hidrolipidni film (kiseli ili Marchioninijev plašt kože) koji štiti

kožu od gubitka vlage i prodora stranih tvari, posebno mikroorganizama. Masne tvari u

hidrolipidnom filmu odraslih ljudi potječu uglavnom iz žlijezda lojnica (sebacealni lipidi) i manjim

dijelom iz epidermalnih stanica (epidermalni lipidi) [2].

1.1.1. Epidermis

Epidermis je površinski, tanji (debljine oko 100 µm) i avaskularan sloj kože. Keratinizirani

je slojeviti epitel izgrađen od keratinocita koji čine gotovo 95% epidermalnih stanica. Ostale

stanice čine melanociti, Langerhansove stanice i Merkelove stanice. Keratinociti u lamelarnim

2

granulama proizvode keratin i intercelularne lipide, melanociti stvaraju pigment melanin,

Langerhansove stanice su najvažnije stanice imunološkog sustava kože, a Merkelove stanice

imaju ulogu osjetnih mehanoreceptora. Epidermis ne sadrži krvne ni limfne žile, a transport

tvari odvija se difuzijom iz dermisa u epidermis i obratno.

Epidermis je sastavljen od četiri - pet slojeva: stratum corneum, (stratum lucidum), stratum

granulosum, stratum spinosum i stratum basale.

Stratum corneum (rožnati sloj)

Rožnati sloj je krajnji sloj maturacije keratinocita. Sastoji se od 10-30 slojeva spljoštenih,

mrtvih keratinocita (korneocita) koji se kontinuirano ljušte i zamjenjuju novim stanicama iz

dubljih slojeva epidermisa. Najviše slojeva korneocita nalazimo na dlanovima i petama, a

najmanje na usnama. Korneociti su anuklearne stanice bez staničnih organela. Ispunjeni su

keratinom, lipidima, masnim kiselinama i ceramidom, a okruženi su hidrofobnim lipidnim

matriksom. Takva struktura omogućuje zadržavanje vode i prirodnu fizičku barijeru. Rožnati

sloj može apsorbirati tri puta više vode od njegove mase ali ukoliko se razina vode smanji

ispod 10% on prestaje biti savitljiv i dolazi do pucanja. Vrijeme potrebno da epidermalne

stanice stignu od bazalnog do rožnatog sloja je obično 28 dana.

U nižim slojevima rožnatog sloja korneociti su povezani korneodezmosomima.

Približavanjem površini dolazi do dezintegracije korneodezmosoma što rezultira

deskvamacijom, odnosno ljuštenjem korneocita sa površine kože.

Stratum lucidum (svijetli sloj)

Svijetli sloj je sloj u kojem dolazi do potpune razgradnje jezgri i porasta keratinizacije

stanica koji je popraćen daljnjim morfološkim promjenama [3]. Prisutan je samo u debljim

dijelovima kože izloženim trenju.

Stratum granulosum (zrnati sloj)

Zrnati sloj se sastoji od jednog do tri sloja stanica. Keratinociti se i dalje diferenciraju te u

ovom sloju započinje razgradnja stanične jezgre i organela. Keratin se nakuplja u

keratinohijalinskim zrncima, a intercelularni lipidi se sintetiziraju u lamelarnim granulama [3].

3

Stratum spinosum (trnasti ili nazubljeni sloj)

Trnasti sloj je dobio ime po dezmosomima (intercelularnim mostovima) koji spajaju

keratinocite, a pod mikroskopom izgledaju kao trnovi. Sastoji se od dva do šest redova

keratinocita koji se u ovom sloju počinju morfološki mijenjati, diferencirati i sintetizirati keratin

koji se udružuje u tonofilamente. Imunološki aktivne Langerhansove stanice su od svih slojeva

najzastupljenije u u trnastom sloju.

Stratum basale (bazalni sloj)

Bazalni sloj se sastoji od jednog reda zametnih stanica koje se kontinuirano dijele. Stanice

su povezane s bazalnom membranom hemidezmosomima. Nakon diobe keratinocita jedna

stanica ostaje u bazalnom sloju dok druga migrira kroz epidermis do rožnatog sloja. Osim

keratinocita tu su prisutne i Merkelove stanice (posebno u dijelovima kože osjetljivim na dodir

poput jagodica i usna) te melanociti koji stvaraju pigment melanin. Melanin je zadužen za

zaštitu od UV zračenja. Izlaganje sunčevom svijetlu rezultira povećanjem omjera melanocita u

odnosu na keratinocite i zato „tamnimo“.

1.1.2. Epidermokutana veza

Epidermis je povezan s dermisom preko bazalne membrane (epidermokutana veza).

Epidermokutana veza smanjuje mogućnost odvajanja epidermisa od dermisa pri djelovanju

sile naprezanja na kožu te istovremeno sprječava prodor tvari u oba smjera, a štiti kožu i

organizam od mikroogranizama te od gubitka vode i elektrolita. Epidermokutana veza prati

valovitu papilarnu liniju, a građena je od trilamelarnih bazalnih keratinocita i kolagenskih

vlakana koja usidruju epidermis u dermis. U epidermisu su prisutni okrajci živaca dok krvne

žile ne prelaze ovu granicu te hranjive tvari iz cirkulacije difuzijom prelaze u epidermis. Velika

ukupna površina valovite i nabrane papilarne linije pridonosi ovakvom prijenosu tvari [2].

1.1.3. Dermis

Dermis je unutarnji, deblji (1 do 2 mm) sloj vezivnog tkiva. Duž dermisa prolaze folikuli s

dlakama i žlijezde znojnice. Dijeli se na papilarni sloj (lat. stratum papilare) i retikularni sloj

(lat. stratum reticulare), a među njima nema oštre granice. Papilarni sloj je utisnut u epidermis,

a osim vezivnog tkiva sadrži i kapilare, živčane završetke i osjetna tjelešca za dodir

4

(Meissnerova tjelešca). Ispod njega se nalazi retikularni sloj koji sadrži guste snopove

kolagenskih vlakana upletenih u mrežu elastičnih vlakana, krvne i limfne žile, živce, receptore

za hladnoću (Krauseovi klipovi), žlijezde lojnice, kostriješni mišić (lat. m. arrector pilli) [4].

Kolagen čini 70-80% mase dermisa. Kolagenska vlakna prave raznosmjerne tračke

(rombičke strukture) i mogu se dijagonalno razvlačiti, ali se ne mogu vratiti u prvotni položaj

bez elastičnih vlakana. Elastična vlakna čine manje od 1-2% ukupne mase dermisa, ali imaju

nezamjenjivu funkciju pri opiranju silama deformacije i vraćanju kože u prvotni oblik [2].

Dermis sadrži različite vrste stanica: fibroblaste, limfocite i makrofage. Fibroblasti su

zaduženi za biosintezu kolagena, elastina, glikozaminoglikana, proteoglikana, fibronektina,

laminina i drugih proteina izvanstaničnog matriksa koji koži daju potporu i elastičnost.

Strukturni su proteini dermisa kolagen i elastin, a adhezivni laminin i fibronektin. Laminin

povezuje epitelne stanice s bazalnom membranom, a fibronektin pričvršćuje fibroblaste [4].

5

1.2. Cijeljenje rana

Rana se definira kao oštećenje protektivne funkcije kože, gubitak kontinuiteta epitela, sa ili

bez gubitka vezivnog tkiva (mišići, kosti, živci). Cijeljenje rana je biološki odgovor na ozljedu

tkiva. Cijeljenje se sastoji od četiri faze koje se međusobno preklapaju: hemostaze, upale

(inflamacije), proliferacije i maturacije.

1.2.1. Hemostaza

Hemostaza znači zaustavljanje krvarenja. Kada se žila presiječe ili rastrgne, hemostaza se

postiže putem nekoliko mehanizama: 1) grčem žile, 2) stvaranjem trombocitnog čepa,

3) stvaranjem ugruška koji nastaje zgrušavanjem krvi i 4) konačno urastanjem vezivnog tkiva

u ugrušak, što trajno zatvara otvor na žili.

Grč žile

Ozljeda krvne žile, odmah nakon presijecanja ili pucanja, uzrokuje kontrakciju žile čime se

istovremeno smanjuje protjecanje krvi kroz ozljedu žile. Kontrakcija nastane zbog živčanih

refleksa, lokalnog miogenog spazma i lokalnih humoralnih čimbenika iz oštećenog tkiva i

trombocita. Za najveći dio kontrakcije manjih krvnih žila odgovorni su trombociti koji otpuštaju

tromboksan A2, tvar koja djeluje konstrikcijski.

Stvaranje trombocitnog čepa

Stanična membrana trombocita od velike je važnosti za hemostazu. Na njezinoj površini

nalazi se glikoproteinski omotač koji sprječava prianjanje membrane uz normalni endotel, ali

uzrokuje njezino prianjanje uz oštećena područja stijenke krvne žile. Prianja uz oštećene

endotelne stanice i, još više, uz kolagen iz dubljih dijelova žilne stijenke. Također, membrana

trombocita sadrži i velike količine fosfolipida koji mogu djelovati aktivacijski na više mjesta u

procesu zgrušavanja krvi.

Kada trombociti dođu u dodir s oštećenom površinom žile mijenjaju svoja svojstva. Počnu

bubriti te poprimati nepravilne oblike, s brojnim zrakastim izdancima što strše iznad njihove

površine. Postaju ljepljivi te prianjaju za tkivni kolagen i von Willebrandov faktor (protein

plazme). Luče velike količine ADP, a njihovi enzimi stvaraju tromboksan A2. ADP i tromboksan

6

A2 aktiviraju susjedne trombocite i čine ih ljepljivima, te oni prianjaju uz prethodno aktivirane

trombocite što u konačnici vodi do stvaranja trombocitnog čepa. Trombocitni čep može

zaustaviti krvarenje ako je pukotina na žili malena, no, ukoliko je veliki otvor mora se stvoriti i

krvni ugrušak.

Zgrušavanje krvi u ozlijeđenoj žili

Ugrušak se pri velikoj ozljedi počne stvarati za 15 do 20 sekundi, a pri manjoj ozljedi za

jednu do dvije minute. Proces zgrušavanja započinju aktivacijske tvari iz oštećene stijenke žile,

iz trombocita te iz krvnih proteina koje prianjaju uz oštećenu stijenku krvne žile. Ako otvor nije

prevelik, tri do šest minuta poslije ozljede ugrušak ispuni cijeli presječeni ili rastrgani kraj žile.

Nakon 20 minuta do jednog sata ugrušak se počne stezati, zbog čega se žila još više zatvori

[5]. Za stezanje su zaslužni trombociti.

Ugrušak je sastavljen od fibrinskih niti koje se protežu u svim smjerovima i zadržavaju

krvne stanice, trombocite i plazmu. Fibrinske niti prianjaju i za oštećene površine krvnih žila i

sprječavaju krvarenje.

1.2.2. Upala (inflamacija)

U koagulacijskoj kaskadi faktor Xa prevodi inaktivni protrombin u aktivni trombin. Trombin,

povećavajući vaskularnu permeabilnost, potiče migraciju upalnih stanica na mjesto ozljede.

Ovim mehanizmom svi faktori i stanice potrebni za cijeljenje rane prelaze iz intravaskularnog

prostora u ekstravaskularni. Nakon početnog perioda vazokonstrikcije slijedi duži period

vazodilatacije uzrokovane histaminom, prostaglandinima, kininima i leukotrienima.

Vazodilatacija je važna kako bi do rane stigao veći protok krvi, zajedno sa upalnim stanicama

i faktorima potrebnima za sprječavanje infekcije.

U fazi upale uključuju se polimorfonuklearni leukociti (PMN) (neutrofili), makrofagi i limfociti,

a ona traje nekoliko sati nakon ozljede. Neutrofili su dominantne stanice u prvih 48 sati,

međutim nisu esencijalne za proces cijeljenja rane. Oslobađajući medijatore upale i reaktivne

oblike kisika (ROS) koji djeluju antibakterijski, neutrofili uklanjaju bakterije i nekrotizirano tkivo

sa mjesta ozljede [6].

Za razliku od neutrofila, makrofagi su esencijalne i vjerojatno najvažnije stanice u ranoj fazi

procesa cijeljenja rane. Makrofagi fagocitiraju bakterije i ostatke nekrotiziranih stanica, izlučuju

kolagenazu i elastazu koje razgrađuju oštećeno tkivo zbog čega posljedično dolazi do

7

izlučivanja citokina (IL-1, TNF-α) te oslobađanja transformirajućeg čimbenika rasta β (TGF-β,

engl. transforming growth factor-β), transformirajućeg čimbenika rasta α (TGF-α,

engl. transforming growth factor-α) i trombocitnog čimbenika rasta (PDGF, engl. plateled-

derived growth factor) [7]. PDGF je citokin koji stimulira kemotaksiju i proliferaciju fibroblasta i

glatkih mišićnih stanica. Također, makrofagi izlučuju tvari koje privlače endotelne stanice

prema rani i stimuliraju njihovu proliferaciju te promoviraju angiogenezu. T limfociti migriraju

prema ozljedi tijekom faze upale zbog oslobođenog interleukina-1, koji nastaje zahvaljujući

djelovanju kolagenaze. Limfociti izlučuju limfokine poput epitelnog čimbenika rasta koji izlučuje

heparin (HB-EGF, engl. heparin-binding epidermal growth factor) i bazičnog čimbenika rasta

fibroblasta (bFGF, engl. basic fibroblast growth factor) te su odgovorni za stvaranje aktiviranih

limfocita koji omogućuju imunost posredovanu stanicama [6].

1.2.3. Proliferacija

Nakon tri do pet dana od ozljede počinje se stvarati granulacijsko tkivo. To je jedan od

najvažnijih događaja tijekom proliferacijske faze, a preklapa se s fazom upale. Granulacijsko

tkivo se sastoji od inflamatornih stanica, fibroblasta i novih krvnih žila u matriksu sastavljenom

od fibronektina, kolagena, glikozaminoglikana i proteoglikana. Ova faza sastoji se od četiri

podfaze: epitelizacije, fibroplazije, angiogeneze i kontrakcije.

Epitelizacija

Epitelizacija podrazumijeva stvaranje epitela iznad oštećenog tkiva. Ukoliko su rubovi rane

na udaljenosti manjoj od 1 mm, stanice migriraju i stvara se epitelni sloj koji štiti ozljedu od

okoline. Epidermalne stanice se u tom slučaju strukturalno mijenjaju, a zatim odvajaju od

ostalih epidermalnih stanica i bazalne membrane te stvaraju intercelularne aktinske

mikrofilamente koji im omogućuju migraciju. Izlučuju kolagenazu koja razgrađuje kolagen i

aktivator plazminogena čime posljedično dolazi do stvaranja plazmina. Plazmin promovira

otapanje ugrušaka duž puta kojim keratinociti migriraju, a oni ulaze u interakciju sa fibrinom

koji je poprečno vezan na fibronektin i kolagen. Smatra se da fibronektin promovira adheziju

keratinocita i na taj način vodi stanice duž ozljede.

Nakon procesa epitelizacije, epidermalne stanice poprimaju svoj uobičajeni oblik. Stvaraju

nove dezmosome kojima su povezane s ostalim epitelnim stanicama i hemodezmosome

kojima su vezane za bazalnu membranu.

8

Fibroplazija

Fibroblasti su ključne stanice u granulacijskom tkivu. Oni su odgovorni za produkciju

kolagena, elastina, fibronektina, glikozaminoglikana i proteaza. Broj fibroblasta se na mjestu

ozljede povećava kako se broj inflamatornih stanica smanjuje. Fibroplazija započinje tri do pet

dana nakon ozljede i može potrajati do čak 14 dana. Fibroblasti kože i stanice mezenhima

diferenciraju čime stječu sposobnost migracije i kontrakcije. Fibronektin, PDGF, čimbenik rasta

fibroblasta, (FGF, engl. fibroblast growth factor), TGF i C5a potiču fibroblaste na migraciju i

proliferaciju. Fibronektin služi kao sidro za miofibroblaste koji migriraju prema ozljedi [6].

Sinteza kolagena je ključna u ovoj podfazi. Počinje otprilike tri dana nakon ozljede i može

potrajati od dva do četiri tjedna. U početnoj fazi kolagen tipa III je dominantan, no kasnije ga

zamjenjuje kolagen tipa I [7]. Kolagen treba biti bogat hidroksilizinom i hidroksiprolinom kako

bi se stvarale snažne veze, a hidroksilacija prolina i lizina ovisna je o prisutnosti kisika, vitamina

C, željeza i α-ketoglutarata. Kolagen se zatim izlučuje u ekstracelularni prostor egzocitozom u

obliku prokolagena, trostruke α-heliks uzvojnice. Nakon uklanjanja terminalnih dijelova

prokolagen peptidazom nastaje tropokolagen koji onda s drugim molekulama tropokolagena

stvara kolagenske filamente. Stvaranje filamenata, fibrila i tkiva događa se u matriksu koji se

sastoji od glukozaminoglikana, hijaluronske kiseline, hondroitin sulfata, dermatan sulfata i

heparin sulfata za izlučivanje kojih su zaslužni fibroblasti.

Angiogeneza

Kako bi novo formirano tkivo dobivalo dovoljno hranjivih tvari, bogat dotok krvi je od vitalne

funkcije. Makrofagi su esencijalni za stimulaciju angiogeneze i produkciju makrofagnog

čimbenika angiogeneze (MDAF, engl. macrophage-derived angiogenesis factor) kao odgovora

na slabu oksigenaciju tkiva. Epitelne stanice izlučuju bFGF i vaskularni endotelni čimbenik

rasta (VEGF, engl. vascular endothelial growth factor) koji također utječu na angiogenezu [6].

Angiogeneza rezultira boljim protokom krvi prema ozljedi i većom perfuzijom faktora

potrebnih za cijeljenje. Kada novonastale krvne žile prestanu biti potrebne one se uklanjaju

apoptozom.

9

Kontrakcija

Gotovo usporedno za sintezom kolagena započinje i kontrakcija rane. Kontrakcija

podrazumijeva centripetalne pokrete rubova rane koji olakšavaju zatvaranje rane, a

maksimalno je izražena od 5. do 15. dana nakon ozljede. Kontrakcija rane ovisi o obliku rane

i o čvrstoći rubova te o periferno lociranim miofibroblastima, njihovoj vezi sa izvanstaničnim

matriksom i proliferaciji miofibroblasta.

1.2.4. Maturacija

Remodeliranje kolagena tijekom faze maturacije ovisi o kontinuiranoj sintezi novog

kolagena i razgradnji starog kolagena. Započinje oko 21. dana nakon ozljede, a može se

nastaviti godinama. Kolagenaze i metaloproteinaze matriksa pomažu u uklanjaju starog

kolagena na mjestu ozljede. Tkivni inhibitori metaloproteinaza ograničavaju utjecaj

kolagenolitičkih enzima, pa se uspostavlja ravnoteža između sinteze i razgradnje. Tijekom

remodeliranja, kolagen tipa III zamjenjuje kolagen tipa I, fibronektin polako nestaje,

proteoglikani zamjenjuju hijaluronsku kiselinu i glikozaminoglikane, a voda se resorbira iz rane.

Navedeni događaji omogućuju kolagenskim vlaknima da se maksimalno približe i tvore

poprečne veze koje povećavaju mehaničku otpornost rane.

Snaga otpora na istezanje rane podrazumijeva silu koja je potrebna da rana pukne

neovisno o njezinim dimenzijama. Zacjeljena rana može dosegnuti samo oko 80% mehaničke

otpornosti neranjene kože.

10

1.3. Melatonin

Melatonin je neurohormon, strukturno indolni amid, široko je rasprostranjen u prirodi pa ga

možemo pronaći u kralježnjaka, beskralježnjaka, biljaka, algi pa čak i bakterija. U čovjeka se

većinom sintetizira u epifizi (pinealnoj žlijezdi) pod izravnim utjecajem ritma izmjene dana i

noći. Naime, pinealna žlijezda reagira na svjetlo, odnosno tamu i ovisno o tome stvara kemijske

signale. Svjetlo blokira sekreciju melatonina pa se njegova koncentracija tijekom dana

smanjuje ispod 30 pM dok noću dostiže vrijednost od 100-400 pM. Iz aminokiseline triptofan

prvo se sintetizira serotonin, a zatim djelovanjem N-acetiltransferaze i hidroksiindol-O-

metiltransferaze nastaje melatonin. Jednoliko je rasprostranjen u organizmu zbog male

molekulske mase i amfifilnog karaktera molekule koji mu omogućuju pasivnu difuziju kroz

staničnu membranu [8]. Vrijeme poluživota melatonina je 30 minuta. Metabolizira se u jetri

citokrom-P450 monooksigenazama (CYP1A2, CYP1A1, CYP1B1) u 6-hidroksimelatonin te

konjugira sulfotransferazom u 6-sulfatoksimelatonin i izlučuje urinom [9]. Koncentracija tog

metabolita je veća noću nego danju, što reflektira cirkadijani ritam sinteze i sekrecije

melatonina [10].

Melatonin ima pleiotropne bioučinke kao neurotransmitor, hormon, citokin i modulator

biološkog odgovora [11]. U tijelu ima ključnu ulogu u cirkadijanom ritmu fizioloških funkcija

poput spavanja i regulacije krvnog tlaka te kod sezonskih promjena. Opisana su dva

melatoninska receptora preko kojih djeluje, MT1 i MT2. Djelujući preko melatoninskih

receptora lociranih u mozgu i perifernom tkivu ima ulogu u spolnoj maturaciji, potrošnji energije

i regulaciji tjelesne mase. Može imati utjecaja na mozak, imunološku, gastrointestinalnu,

kardiovaskularnu, renalnu, koštanu i endokrinu funkciju te može djelovati onkostatski [12].

Također je poznato da melatonin djeluje imunostimulativno i citoprotektivno [13].

Funkcije melatonina i njegovih metabolita neovisne o vezanju na receptore obuhvaćaju

detoksikaciju i antioksidativno djelovanje, zatim antiapoptotski, antigenotoksični i antimutageni

učinak te mitohondrijsku regulaciju. Melatonin smanjuje oštećenja tkiva uzrokovana reaktivnim

oblicima kisika (ROS) i dušika (RNS) djelujući kao hvatač slobodnih radikala. Povećava

aktivnost antioksidativnih enzima poput superoksid dizmutaze i peroksidaze, a smanjuje

aktivnost prooksidativnih enzima [14]. Potiče sintezu glutationa i obnavljanje njegovog

reduciranog oblika unutar stanica. Zabilježeni su primjeri smanjenja ishemičnog oštećenja

srčanog tkiva in vivo u štakora [15] te oštećenja nastalih ionizirajućim zračenjem [16].

11

Primijenjen topikalno melatonin ima fotoprotektivni učinak te smanjuje eriteme uzrokovane

UV zračenjem. Prevenira fotostarenje, fotokarcinogenezu i druga oštećenja kože izazvana UV

zračenjem [3].

1.3.1. Utjecaj melatonina na cijeljenje rana

Melatonin utječe na brojne procese uključene u cijeljenje rane kao što su oslobađanje

medijatora upale, proliferacija i migracija stanica, angiogeneza i akumulacija kolagena i

glikozaminoglikana u miljeu rane [8]. Učinak melatonina je ovisan o dozi, vremenu primjene i

ciljanom tkivu. Međutim, u literaturi se mogu pronaći oprečna mišljenja o tome ima li melatonin

pozitivan [17, 18] ili negativan [19, 20] učinak na cijeljenje rana, odnosno na proliferaciju

fibroblasta i akumulaciju kolagena. Oprečna mišljenja djelomično mogu biti objašnjena

razlikom između učinka melatonina kada je primjenjen topikalno na milje rane i indirektnog

učinka preko različitih regulatornih mehanizama pri sistemskoj primjeni [21, 22]. Iz navedenog

razloga čini se opravdanim razvijati terapijske sustave s uklopljenim melatoninom za lokalnu

primjenu kojima se zaobilaze sistemski učinci.

Ispitivanja su pokazala da melatonin utječe na stvaranje kolagena ovisno o dobu dana

kada je primijenjen. Primjena ujutro povećava razinu kolagena na mjestu rane, dok ju primjena

navečer smanjuje [23]. Bulbuller i suradnici [19] pokazali su da melatonin primijenjen navečer

ima negativan učinak na sintezu hidroksiprolina u intestinalnim anastomoznim ranama štakora

što rezultira smanjenom mehaničkom otpornošću rana. Odstranjivanje pinealne žlijezde

dovelo je do povećanja razine hidroksiprolina, dok je primjena melatonina kod štakora bez

pinealne žlijezde smanjila razinu hidroksiprolina.

Melatonin regulira inducibilnu sintazu dušikova oskida (iNOS) tijekom procesa cijeljenja.

Za vrijeme faze upale smanjuje njezinu aktivnost, dok ima suprotan učinak tijekom

proliferativne faze. Smatra se da aktivnost iNOS i dušikovog oksida ima utjecaja na

angiogenezu i granulaciju tkiva [8]. Pugazhenthi i suradnici [24] su kao model rane u štakora

napravili inciziju. Primjena melatonina poboljšala je maturaciju i orijentaciju kolagenskih

vlakana, a time i kvalitetu ožiljka. Ubrzala je angiogenezu i stvaranje novih krvnih žila i

povećala razinu VEGF tijekom faze granulacije.

Melatonin ima velikog utjecaja na imunološki sustav, a utjecaj je ovisan o dozi. U

koncentracijama iznad fizioloških inducira proliferaciju T-limfocita i proinflamatornih citokina.

Egzogeno primijenjen melatonin povećava proliferaciju limfocita štakora, povećava broj NK

stanica, stimulira stvaranje proinflamatornih citokina IL-1 i TNF-α i pojačava fagocitozu [25].

12

Gómez-Florit i suradnici [26] su u ispitivanju provedenom na fibroblastima gingive pokazali

da melatonin povećava ekspresiju kolagena, dekorina (proteoglikana prisutnog u humanoj

gingivi koji regulira organizaciju kolagena) i interleukina-10, a smanjuje omjer MMP1/TIMP1

(metaloproteinaza matriksa-1 / tkivni inhibitor metaloproteinaze-1) i promovira zarastanje rane

bez ožiljka. U kombinaciji sa antioksidativnim svojstvima koje posjeduje, smatra se da može

imati protektivni i obnavljajući učinak na integritet tkiva gingive.

Primijenjen topikalno i intraperitonealno melatonin može smanjiti razvoj ulkusa i/ili ubrzati

cijeljenje [27]. Ispitivanja u štakora pokazala su da ima povoljan učinak pri liječenju akutnog

pankreatitisa te da potiče spontanu regeneraciju tkiva gušterače [28].

Za uspješno cijeljenje rane sprječavanje infekcije je od velikog značaja. Infekcija, osim što

može dovesti do sepse, može inhibirati brojne procese uključene u cijeljenje rane. Tekbas i

suradnici [29] pokazali su da melatonin ima antibakterijski učinak na gram-pozitivne i

gram-negativne bakterije in vitro, a djelovanje je potentnije za gram-negativne bakterije.

Učinak se pripisuje njegovom svojstvu vezanja intracelularnih supstrata kao što su slobodno

željezo i masne kiseline.

13

1.4. Kitozan

Kitozan je prirodni polimer koji se priprema alkalnom N-deacetilacijom hitina,

visokomolekularnog polisaharida sastavljenog od β-(1,4)-D-glukozamina i N-acetil-D-

glukozamina (Slika 2) [30]. Hitin je glavni sastojak egzoskeleta člankonožaca (rak, škamp,

jastog) i čini staničnu stijenku nekih gljiva (Aspergillus i Mucor) [31]. N-deacetilacijom hitina

amino skupine glukozamina postaju slobodne. S obzirom da je kitozan slaba baza (pKa=6,5)

u kiselom mediju dolazi do protonacije amino skupina, a kitozan postaje pozitivno nabijena

molekula topljiva u vodenom mediju.

Slika 2: Struktura kitozana

Kitozan je biokompatibilan, biorazgradiv i netoksičan polikationski polimer bez alergenih

svojstava [32]. Različiti tipovi kitozana međusobno se razlikuju u molekulskoj masi i stupnju

deacetilacije, a posljedično i u topljivosti, te viskoznosti i površinskoj napetosti otopina [33].

Komercijalno dostupni kitozani su molekulske mase između 10 i 1000 kDa, a stupnja

deacetilacije između 70% i 95% [34]. Biokompatibilnost kitozana također ovisi o stupnju

deacetilacije i molekulskoj masi. Kod kitozana većeg stupnja deacetilacije toksičnost ovisi o

molekulskoj masi i o koncentraciji, a kod kitozana manjeg stupnja deacetilacije toksičnost je

manje izražena i manje ovisna o molekulskoj masi. Zanimljivo je da su kitozan i njegovi derivati

toksični za neke bakterije (Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus) [35], gljivice

(Candida albicans i Aspergillus niger) [36] i parazite (Leishmania infantum) [37] što bi moglo

poslužiti kao pomoć u kontroli infektivnih bolesti [38].

1.4.1. Utjecaj kitozana i njegovih derivata na cijeljenje rana

Kitozan i derivati kitozana ubrzavaju cijeljenje rana i pridonose smanjenju ožiljaka [39].

Kitozan ima sposobnost vezanja na eritrocite čime ubrzava stvaranje krvnog ugruška. Na

temelju tog djelovanja dobio je odobrenje od FDA za upotrebu u flasterima i drugim

14

hemostatskim sredstvima [40]. Ako se primjenjuje kao semipermeabilni gel, kitozan sprječava

dehidraciju i kontaminaciju rane, osiguravajući optimalne uvjete za cijeljenje rane.

Histološkim ispitivanjima utvrđeno je da hitin i kitozan ubrzavaju reformaciju vezivnog tkiva

i angiogenezu [41]. Induciraju oslobađanje interleukina-8 iz fibroblasta, a on je važan za

migraciju i proliferaciju fibroblasta i vaskularnih endotelnih stanica [42]. Peluso i suradnici [43]

pokazali su da kitozan in vitro ima stimulativni učinak na produkciju dušikovog oksida i

kemotaksiju makrofaga.

U tijelu se hitin i kitozan razgrađuju enzimima poput hitinaze i kitozanaze te posljedično

nastaju oligomeri i monomeri. Minagawa i suradnici [39] su in vivo ispitivanjem u štakora

pokazali da osim hitina i kitozana i oligomeri i monomeri utječu na cijeljenje rana. U

spomenutom ispitivanju kao modelna rana napravljena je linearna incizija, a nakon cijeljenja

je ispitana snaga ožiljaka i aktivnost kolagenaze. Ispitivanjem je utvrđeno ubrzano cijeljenje i

povećanje kolagenazne aktivnosti kod rana tretiranih otopinom kitozana ili hitina u

koncentracijama od 0,1 do 10 mgml-1. Snaga ožiljaka i kolagenazna aktivnost su bili više

povećani kod rana tretiranih kitozanom ili derivatima kitozana (D-glukozamin, kitozan-

oligosaharid, kitozan) nego kod rana tretiranih hitinom ili derivatima hitina (N-acetil-D-

glukozamin, hitin-oligosaharid, hitin), a najveći učinak primijećen je kod rana tretiranih

oligomerima kitozana i hitina. S porastom stupnja deacetilacije (od 14% do 96%) uočena je

povećana snaga ožiljaka i aktivnost fibroblasta.

Howling i suradnici [44] ispitivali su utjecaj hitina i kitozana različitog stupnja deacetilacije,

ali slične molekulske mase, na proliferaciju humanih fibroblasta kože i keratinocita in vitro.

Zapaženo je da kitozani sa relativno visokim stupnjem deacetilacije snažno stimuliraju

proliferaciju fibroblasta, dok kitozani sa nižim stupnjem deacetilacije pokazuju slabiji učinak.

Stimulativni učinak na proliferaciju fibroblasta zahtijevao je prisutnost seruma u mediju.

Moguće objašnjenje je da se kitozan veže za komponente seruma poput heparina i faktora

rasta pa ima indirektan učinak na cijeljenje rana. Kitozan je na humane keratinocite imao

inhibitorni učinak.

Santos i suradnici [45] istraživali su utjecaj kitozana na aktivaciju polimorfonuklearnih

stanica (PMN). Učinak su mjerili kvantifikacijom lizozima i reaktivnih oblika kisika (ROS). PMN

u prisutnosti kitozana izlučuju približno jednaku količinu lizozima i ROS u odnosu na kontrolne

stanice (PMN bez prisutnosti kitozana) što potvrđuje da je kitozan prikladan za cijeljenje rana.

Naime, ROS se izlučuju iz leukocita koji migriraju prema rani, a epitelne stanice na rubovima

rane izlučuju vodikov peroksid koji onda privlači leukocite [46]. ROS su esencijalni za ubijanje

bakterija i oni potiču djelovanje citokina preko aktivacije neuklearnog faktora-κB (NF-κB) [47].

15

Vodikov peroksid inducira reepitelizaciju, stimulira sintezu kolagena i utječe na diferencijaciju

fibroblasta u miofibroblaste. Poznato je da ROS mogu promovirati preživljavanje stanica,

njihovu proliferaciju i diferencijaciju ukoliko su prisutni u fiziološkim koncentracijama, međutim,

pri višim koncentracijama mogu uzrokovati apoptozu i nekrozu stanica [48]. Okidativni stres u

prevelikoj mjeri inducira starenje fibroblasta i oslabljuje njihovu kontrakciju te još više oštećuje

ranu, umjesto da pomaže u cijeljenju [8].

Ueno i suradnici [49] ispitivali su produkciju osteopontina iz humanih PMN tretiranih

kitozanom. Osteopontin je fosfoprotein kojeg sintetiziraju različite stanice i izlučuju u

izvanstanični matriks. Ima sposobnost stimuliranja aktivnosti stanica kroz brojne receptore na

staničnoj površini koji su povezani s nekoliko različitih signalnih puteva. To mu omogućuje

različite funkcije, a jedna od njih je učinak na cijeljenje rana [50]. In vitro ispitivanjem pokazano

je da PMN stimulirani sa čimbenikom stimulacije granulocitnih kolonija (G-CSF,

engl. granulocyte-colony stimulating factor) i kitozanom akumuliraju mRNA osteopontina i

oslobađaju osteopontin u stanični medij. Time je pokazano da migrirajući PMN sintetiziraju

osteopontin, a da kitozan ima ulogu u ranoj fazi cijeljenja rane.

Kitozan je poznat i po svom antimikrobnom učinku [51]. Formuliran u nanočestice može

imati i veću antimikrobnu aktivnost u odnosu na otopinu zahvaljujući velikoj ukupnoj površini i

naboju nanočestica [52, 53]. Nanočestice pripravljene s kitozanom velike molekulske mase

imaju veći učinak na gram-pozitivne bakterije, dok su one s kitozanom manje molekulske mase

učinkovitije kod gram-negativnih bakterija [54].

Točan mehanizam antimikrobnog djelovanja kitozanskih nanočestica nije u potpunosti

jasan. Međutim, smatra se da interakcija između pozitivno nabijenog kitozana i negativno

nabijenog staničnog zida bakterije vodi do promjene permeabilnosti te pucanja staničnog zida

i curenja intracelularnog sadržaja [55]. Bakterije evolucijski imaju negativno nabijenu površinu

pa nije vjerojatno da će razviti rezistenciju na kitozanske nanočestice što im daje veliku

prednost u antimikrobnoj terapiji [56].

Vanjska membrana staničnog zida gram-negativnih bakterija sastoji se isključivo od

lipopolisaharida koji sadrže fosfatne i pirofosfatne skupine. Kako su te skupine negativno

nabijene gram-negativne bakterije imaju veći negativni naboj od gram-pozitivnih bakterija čija

se membrana sastoji od peptidoglikana i vezanih polisaharida i teikoične kiseline. To je

moguće objašnjenje zašto je primjenom kitozana primijećeno veće curenje intracelularnog

sadržaja kod gram-negativnih nego kod gram-pozitivnih bakterija. Povećanjem negativnog

naboja povećava se i interakcija s kitozanom što rezultira većim promjenama u strukturi i

permeabilnosti staničnog zida.

16

Osim vezanja na stanični zid, predložena su su još dva mehanizma. Prvi podrazumijeva

da kitozan može proći kroz stanični zid bakterije i penetrirati u jezgru gdje se veže za

bakterijsku DNA te tako inhibira sintezu mRNA i proteina. Drugi mehanizam bazira se na

keliranju metala koji su esencijalni nutrijenti za rast bakterija [57].

17

1.5. Lecitin

Lecitin je prirodna smjesa fosfolipida netopljivih u acetonu (fosfatidilkolina,

fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina i fosfatidilinozitola) te ostalih komponenti poput

triglicerida, masnih kiselina i ugljikohidrata. Lecitin se nalazi u membranama stanica pa se

svakodnevno unosi prehranom.

Lecitini se najčešće dobivaju iz jajeta i ulja soje te ulja kikirikija, pamuka, suncokreta,

kukuruza i uljane repice. Sastav lecitina značajno varira ovisno o izvoru i stupnju čistoće.

Lecitin iz jajeta sadrži 69% fosfatidilkolina i 24% fosfatidiletanolamina, dok lecitin iz soje sadrži

21% fosfatidilkolina, 22% fosfatidiletanolamina i 19% fosfatidilinozitola, uz ostale komponente.

Boja lecitina varira od smeđe do svijetlo žute ovisno o tome je li bio podvrgnut izbjeljivanju te

o stupnju čistoće. Također, izlaganje zraku vodi do brze oksidacije što rezultira tamnijom bojom

lecitina [58].

Lecitin se široko primjenjuje u farmaceutskim oblicima poput aerosolnih inhalata,

intramuskularnih injekcija i oralnih suspenzija, te u kozmetičkim i prehrambenim proizvodima,

kao emolijens, emulgator i/ili solubilizator. Najčešće se koristi kao surfaktant u pripravcima za

intramuskularnu i intravensku primjenu, pripravcima za parenteralnu prehranu i topikalnim

pripravcima poput masti i krema [58]. Primijenjen topikalno ne uzrokuje iritaciju ni

senzibilizaciju. Sastavnica je pripravaka za enteralnu i parenteralnu prehranu, a fosfatidilkolin

je prepoznat kao važan nutrijent u razvoju fetusa i novorođenčeta te je nužna komponenta

formulacija za novorođenčad odobrenih od strane FDA (Food and Drug Adminitration) [59]. U

vodenim otopinama fosfolipidi lecitina tvore liposome, lipidne dvosloje, micele i lamelarne

strukture, ovisno o hidrataciji i temperaturi. Iz tog razloga lecitin se često koristi za pripravu

istih [60, 61, 62, 63].

Lecitin može djelovati protektivno kod alkoholom izazvane ciroze jetre, smanjiti razinu

kolesterola te imati pozitvni učinak na mentalnu i fizičku sposobnost bolesnika [58]. Vrlo je

dobar izvor kolina koji je prekursor u sintezi acetilkolina. Acetilkolin je važan za mnoge funkcije

mozga uključujući pamćenje pa se smatra da povećana koncentracija ovog neurotransmitora

može rezultirati poboljšanjem pamćenja [64]. Lecitin i njegovi derivati koriste se kao pulmonalni

surfaktanti u liječenju neonatalnog respiratornog distresa [58], a sam lecitin je indiciran u

liječenju tardivne diskineze u dozi do 80 g za oralnu primjenu [65].

18

1.6. Nanotehnologija i nanočestice kao terapijski sustavi

Nanotehnologija se može definirati kao znanost i inženjerstvo koji se bave dizajnom,

sintezom, karakterizacijom i primjenom materijala čija je najmanja funkcionalna jedinica barem

po jednoj dimenziji nanometarske veličine [3]. Danas je nanotehnologija široko rasprostranjena

u svim granama industrije. Njezina primjena u biomedicini je od posebne važnosti, štoviše,

nanotehnologija se smatra početkom novog razdobolja u području primjene lijeka [66].

Nanočestice kao terapijski sustavi su čvrsti koloidni nosači djelatne tvari veličine od

10-1000 nm građeni od prirodnih, polusintetskih ili sintetskih polimera te imaju mogućnost

mijenjati farmakokinetička i farmakodinamička svojstva uklopljene djelatne tvari. Polimerni

nosači bi trebali biti jednostavni za sintezu, jeftini, biokompatibilni i biorazgradivi, netoksični i

topljivi u vodi [66]. Brojna suvremena istraživanja usmjerena su na razvoj nanočestica i

mogućnosti njihove primjene u području dijagnostike, ciljane dostave lijeka i kontroliranog

oslobađanja. Nakupljanjem lijeka u ciljnom tkivu smanjuje se njegova koncentracija u zdravom

tkivu, a time i potencijalni toksični učinci [3]. Primjena nanočestica u dijagnostici može povećati

osjetljivost i granicu detekcije pa se biološke molekule mogu dokazati pri vrlo niskim

koncentracijama [67]. Korištenjem pripravaka kontroliranog oslobađanja smanjuje se

učestalost doziranja lijeka što vodi povećanoj suradljivosti pacijenata te se smanjuje profil

nuspojava, posebno kod lijekova kod kojih dolazi do naglog porasta koncentracije u krvi [68].

1.6.1. Nanotehnološki pristup u razvoju funkcionalnih obloga za rane

Obloge za rane razlikuju se prema kompleksnosti učinka na cijeljenje rane. Gaze i zavoji

predstavljaju pasivne obloge koje apsorbiraju eksudat rane i pružaju fizičku zaštitu, vrlo malo

pridonoseći samom cijeljenju, te se smatraju zasterjelim. Suvremene funkcionalne obloge

osiguravaju uvjete neophodne za optimalno cijeljenje rane kao što su odgovarajuća vlažnost

rane, toplina, pH, mogućnost izmjene plinova (permeabilnost vodene pare i kisika), te

prevencija/suzbijanje infekcije. Suvremene obloge osiguravaju učinkovitije čišćenje rana,

jednostavnije postavljanje obloga, smanjeno sljepljivanje s površinom rane, povećan kapacitet

upijanja eksudata iz rane te ubrzano cijeljenje [69].

Najnovija istraživanja u okviru razvoja funkcionalnih obloga temelje se na primjeni

(bio)polimera s učinkom na cijeljenje rana, primjerice kroz utjecaj na migraciju i proliferaciju

stanica kože, antimikrobni učinak te hemostatsko djelovanje. Razvijaju se polimerni terapijski

nanosustavi koji mogu doprinijeti procesu cijeljenja. Djelatne tvari koje se uklapaju u takve

19

nanosustave s ciljem što bržeg uspostavljanja strukturalnih i fizioloških značajki ozlijeđenog

tkiva obuhvaćaju antibiotike, protuupalne tvari, antioksidanse, antiseptike i antitijela. Uz

mogućnost uklapanja djelatnih tvari, terapijski nanosustavi mogu utjecati na proces cijeljenja

mijenjanjem mikrookolišnih uvjeta rane, a ovisno o polimernom sastavu i specifičnim fizičko-

kemijskim svojstvima kao što su veličina, naboj, reološka svojstva te sposobnost bubrenja. Pri

razvoju takvih sustava prikladniji su biorazgradljivi polimeri poput kolagena, proteoglikana,

hijaluronske kiseline, kitozana i alginata, čijom se uporabom može izbjeći uklanjanje obloge i

mogućnost opetovanog ozljeđivanja površine rane [70].

Nanotehnološke platforme s najvećim potencijalom u razvoju funkcionalnih obloga za rane

su polimerna nanovlakna i nanočestice [70].

Smanjenjem promjera vlakna na nanometarsku skalu značajno se povećava omjer

površine prema volumenu, što čini nanovlakna prikladnim za izradu obloga za rane.

Nanovlakna imaju bolja mehanička svojstva (čvrstoću, tvrdoću i fleksibilnost) u usporedbi s

bilo kojim drugim oblikom istog materijala. Stoga se intenzivno razvijaju funkcionalne obloge i

umjetna tkiva pripravljena iz nanovlakana [71]. Zahvaljujući morfološkoj sličnosti s

izvanstaničnim matriksom, te strukture mogu poticati cijeljenje rana uključujući adheziju,

migraciju i proliferaciju stanica [72].

Nanočestice se odlikuju iznimno velikim omjerom površine prema volumenu, iz čega je

razvidna važnost površinskih svojstava nanočestica za njihovu biofarmaceutsku aktivnost.

Uvođenjem odgovarajućih funkcionalnih skupina na površinu nanočestica mogu se modelirati

interakcije s biološkim sustavima i prilagođavati njihov učinak u biološkom okruženju [70]. S

ciljem ubrzanja procesa cijeljenja rana, nanočestice se uglavnom koriste kao nosači djelatnih

tvari. Terapijski nanosustavi pospješuju topljivost teško topljivih lijekova, produljuju vrijeme

zadržavanja na mjestu djelovanja te omogućuju ciljano i kontrolirano oslobađanje djelatne tvari

[73]. Istovremeno, zbog jedinstvenih fizičko-kemijskih svojstava kao što su mala i kontrolirana

veličina čestica, velika površina u odnosu na volumen, visoka reaktivnost i funkcionalna

struktura mogu prevladati ograničenja klasičnih lijekova, prvenstveno antibiotika [74]. Naime,

za dobro zacjeljivanje rana bez komplikacija i ožiljaka vrlo je važno da ne dođe do infekcije.

Povećano bakterijsko opterećenje unutar rane može dovesti do reduciranog stvaranja

granulacijskog tkiva i reepitelizacije. Postoje različiti pripravci za topikalnu primjenu s

antibakterijskim djelovanjem koji sprječavaju pojavu i širenje infekcije te pospješuju cijeljenje

rane. Međutim, učinkovitost klasičnih antibiotika je smanjena zbog učestale pojave

antibakterijske rezistencije. Jedan od uzroka razvoja rezistencije je nastanak bakterijskog

biofilma. Biofilm je nakupina bakterijskih stanica uklopljenih u izvanstanični matriks - sluzavi

omotač od polisaharida, proteina i nukleinskih kiselina, vezanih na čvrstu površinu. Osim što

20

služi za adheziju bakterijskih populacija za površinu, on je i zaštita od vanjskih nepovoljnih

čimbenika (npr.fagocitoze, utjecaja antiobiotika i drugih signalnih molekula iz okoliša) te ima

važnu ulogu u komunikaciji između bakterija [75]. Kako bakterijski biofilmovi ne odgovaraju na

konvencionalnu antibakterijsku terapiju često uzrokuju ponavljajuće infekcije.

Istraživanja temeljena na nekonvencionalnom pristupu liječenju bakterijskih infekcija vrlo

su aktualna [76]. Nanočestice s antimikrobnim djelovanjem pokazuju različita nespecifična

antibakterijska svojstva i učinak na biofilm, dok istovremeno mogu služiti i kao nosači

konvencionalnih ili nekonvencionalnih lijekova s antimikrobnim djelovanjem [77, 78].

Prednost nanočestica u antimikrobnoj terapiji je da se unutar nanočestice može nalaziti

više lijekova s antimikrobnim djelovanjem. U bakterije bi onda istovremeno trebalo doći do

višestrukih mutacija gena kako bi razvile rezistenciju za svaki lijek što je malo vjerojatno [79].

Tako pripremljene nanočestice smatraju se visoko potentnima i učinkovitima u borbi protiv već

rezistentnih sojeva bakterija kao što su meticilin-rezistentan Staphylococcus aureus (MRSA),

vankomicin-rezistentan Staphylococcus aureus, penicilin-rezistentan Streptococcus

pneumonie, rezistentan soj Mycobacterium tuberculosis i mnogi drugi [56]. Metali i njihovi

oksidi u formi nanomaterijala iskazuju potentnije antimikrobno djelovanje bez razvoja

rezistencije. Nanočestice srebra se već klinički primjenjuju u oblogama za rane, a vrlo su

aktualna istraživanja nanočestica zlata, bizmuta, aluminijevog oksida, cinkovog oksida i

titanijevog dioksida. Terapijski nanosustavi kao što su liposomi, čestice pripravljene od čvrstih

lipida ili polimera te dendrimeri kao nosači klasičnih antibakterijskih lijekovima pokazuju

obećavajuće, sinergijsko ili aditivno antimikrobno djelovanje [8].

1.6.2. Kitozanske nanočestice

Kitozanske nanočestice se često razvijaju kao nosači djelatne tvari zahvaljujući iznimnim

fizičko-kemijskim svojstvima, biorazgradivosti i biokompatibilnosti kitozana [80].

Literaturni pregled ukazuje na kontinuirani porast broja znanstvenih istraživanja u čijem su

fokusu kitozanske nanočestice kao terapijski sustavi namijenjeni različitim putovima primjene

lijeka. Oralno primjenjene nanočestice mogu zaštiti lijek od razgradnje u probavnom sustavu i

poboljšati apsorpciju lijeka [81, 82, 83]. Nazalno primjenjene kitozanske nanočestice,

zahvaljujući pozitivnom naboju, međudjeluju sa negativno nabijenom površinom sluznice. Na

taj način produljuju zadržavanje lijeka na mjestu apsorpcije i poboljšavaju bioraspoloživost

nazalno primjenjenog lijeka [84]. Nova ispitivanja istražuju mogućnosti primjene kitozanskih

nanočestica kao nosača za nazalna cjepiva [85].

21

Kitozanske nanočestice također se koriste za okularnu primjenu lijekova, a njihov učinak

se očituje povećanom bioraspoloživošću lijeka i produljenim zadržavanjem u prekorealnom

području [86, 87]. Topikalno primjenjene nanočestice [88, 89] i nanoobloge [90, 91] kitozana

koriste se za pospješivanje cijeljenja rana, a najnovija ispitivanja pokazuju potencijal

kitozanskih nanočestica za topikalno liječenje alopecije ciljanim oslobađanjem minoksidil

sulfata u folikule dlaka [92].

1.6.3. Metode priprave nanočestica s kitozanom

U literaturi su opisane različite metode priprave kitozanskih nanočestica, a odabir metode

ovisi o svojstvima nanočestica koje želimo dobiti.

Ionotropno geliranje

Kitozanske nanočestice nastaju elektrostatskom interakcijom između amino skupina

kitozana i negativno nabijenih polianiona. Reverzibilno umrežavanje elektrostatskom

interakcijom pokazalo se prihvatljivijim od kemijskog umrežavanja jer se prije svega izbjegava

upotreba toksičnih reagensa [3]. Veliki utjecaj na uspješnost pripravljanja nanočestica tom

metodom i uklapanje djelatne tvari ima stupanj deacetilacije kitozana jer jedino protonirane

amino skupine mogu stupiti u interakciju s polianionima.

Prednosti metode su njezina jednostavnost i mogućnost priprave nanočestica u vodenom

mediju te blagi uvjeti pri kojima nastaju nanočestice [66].

Umrežavanje emulzija

Metoda umrežavanja emulzija podrazumijeva pripravu V/U emulzije s kitozanom otopljenim

u vodenoj fazi, te umrežavanje reaktivnih funkcionalnih amino skupina kitozana s aldehidnim

skupinama umrežavajućeg sredstva (glutaraldehida) [3]. Organsko otapalo se zatim uparuje

pod niskim tlakom, a ostatak surfaktanta se uklanja precipitacijom sa CaCl2, nakon čega slijede

centrifugiranje, dijaliza i liofilizacija [66].

Prednost metode je što se može postići vrlo uska raspodjela veličine čestica srednjeg

promjera manjeg od 100 nm, dok su njezini nedostaci što je vremenski zahtjevna, zahtjeva

korištenje organskih otapala te prilično složene postupke ispiranja nanočestica [66].

22

Metoda desolvatacije/precipitacije

U vodenu otopinu kitozana dodaje se flokulant (najčešće natrijev sulfat) nakon čega se

smanjuje topljivost kitozana povećanjem omjera natrijeva sulfata prema vodi. Rezultat je

precipitacija nanočestica koje nastaju uslijed stvaranja vodikovih veza među molekulama

kitozana [93].

Metoda koacervacije/precipitacije

Metoda se temelji na činjenici da je kitozan netopljiv u alkalnom mediju. Nanočestice nastaju

raspršivanjem otopine kitozana u alkalnoj otopini (NaOH, NaOH-metanol, etandiamin) uslijed

čega nastaju koacervatne kapljice u kojima kitozan precipitira u doticaju s alkalnim medijem.

Nastale čestice se odvajaju filtracijom ili centrifugiranjem, nakon čega se ispiru i suše [94].

Emulzijska metoda koalescencije kapljica

Metoda se temelji na principima umrežavanja emulzija i precipitacije. Pripravi se stabilna

V/U emulzija s kitozanom i djelatnom tvari otopljenima u vodenoj fazi, te druga V/U emulzija s

NaOH u vodenoj fazi. Miješanjem dviju emulazija dolazi do koalescencije kapljica kitozana i

NaOH što rezultira precipitacijom kitozana. Pripavljene čestice se odijele centrifugiranjem ili

filtriranjem, te isperu i osuše [3].

Vezikule i nanočestice nastale samoorganiziranjem kemijski modificiranog kitozana

Kitozan je naprije potrebno kemijski modificirati kako bi se dobio amfifilni polimer. Amfifilni

polimeri dispergirani u vodi mogu samoorganiziranjem tvoriti nanoagregate [93], a u njih je

moguće istovremeno uklopiti i hidrofilne i hidrofobne spojeve.

Nanočestice pripravljene na ovaj način imaju značajan potencijal u specifičnoj dostavi lijeka.

Naime, uz mogućnost uklapanja različitih hidrofobnih lijekova i povećanja njihove

bioraspoloživosti takve nanočestice ostaju neprepoznate tijekom cirkulacije u krvi [3], te imaju

sposobnost nakupljanja u čvrstim tumorskim tkivima [95].

23

Sušenje raspršivanjem

Sušenje raspršivanjem uključuje sljedeće korake: atomizaciju (raspršivanje otopine) kroz

sapnicu, kontakt raspršivač-zrak, sušenje raspršenih čestica i sakupljanje dobivenog produkta.

Nakon raspršivanja uzorka kapljice dolaze u kontakt s vrućim zrakom što rezultira

isparavanjem otapala sa površine kapljica. Zbog velike specifične površine i postojećeg

gradijenta temperature i vlažnosti, dolazi do brzog sušenja. Prednost metode je njezina

prikladnost za termolabilne tvari [3].

Metoda s inverznim micelama

Inverzne micele pripravljaju se otapanjem surfaktanta u organskom otapalu te se uz stalno

miješanje dodaje otopina kitozana i ljekovite tvari. U nastalu mikroemulziju dodaje se sredstvo

za umrežavanje te slijedi otparavanje organskih otapala i izolacija dobivenih nanočestica [94].

Maksimalna količina lijeka koja se može otopiti u inverznim micelama određuje se postupkom

povećavanja sadržaja lijeka sve dok transparentna mikroemulzija ne prijeđe u lagano

opalescirajuću [3].

24

2. Hipoteza, opći i specifični ciljevi rada

Hipoteza

Lecitinsko-kitozanske nanočestice s melatoninom pripravljene metodom ionotropnog

geliranja pozitivno utječu na cijeljenje rane in vitro. Njihov učinak ovisi o sadržaju uklopljenog

melatonina te stupnju deacetilacije i molekulskoj masi korištenog kitozana.

Opći i specifični ciljevi rada

Cijeljenje rane je dinamičan biološki proces koji uključuje interakcije stanica, izvanstaničnog

matriksa i signalnih molekula. Kronične i akutne inficirane rane mogu uslijed komplikacija i

sporog cijeljenja predstavljati veliki klinički problem [69].

Suvremene funkcionalne obloge osiguravaju uvjete neophodne za optimalno cijeljenje rane

kao što su odgovarajuća vlažnost rane, toplina, pH, permeabilnost vodene pare i kisika, te

prevencija/suzbijanje infekcije. Najnovija istraživanja u okviru razvoja funkcionalnih obloga

temelje se na primjeni (bio)polimera s učinkom na cijeljenje rana, primjerice kroz utjecaj na

migraciju i proliferaciju stanica kože, antimikrobni učinak te hemostatsko djelovanje. Razvijaju

se polimerni terapijski nanosustavi koji mogu doprinijeti procesu cijeljenja. Djelatne tvari koje

se uklapaju u takve nanosustave s ciljem što bržeg uspostavljanja strukturnih i fizioloških

značajki ozlijeđenog tkiva obuhvaćaju antibiotike, protuupalne tvari, antioksidanse, antiseptike

i antitijela. Uz mogućnost uklapanja djelatnih tvari, terapijski nanosustavi mogu utjecati na

proces cijeljenja mijenjanjem mikrookolišnih uvjeta rane, a ovisno o polimernom sastavu i

specifičnim fizičko-kemijskim svojstvima kao što su veličina, naboj, reološka svojstva te

sposobnost bubrenja. Pri razvoju takvih sustava prikladniji su biorazgradljivi polimeri čijom se

uporabom može izbjeći uklanjanje obloge i mogućnost opetovanog ozljeđivanja površine rane

[71].

Kitozan je biokompatibilni i biorazgradljivi prirodni poliaminosaharid s utvrđenim

antimikrobnim učinkom koji ovisi o stupnju deacetilacije i molekulskoj masi kitozana kao i građi

staničnog zida ciljane bakterije. Također, dobro je poznat kao promotor cijeljenja rana.

Pretklinička i klinička ispitivanja su pokazala da kitozan pospješuje funkciju granulocita i

ubrzava proliferaciju fibroblasta. Uz antimikrobno djelovanje, promoviranjem granulacije i

stanične organizacije kitozan osigurava i ubrzava uspješno cijeljenje različitih vrsta rana [51].

25

Melatonin je jedan od evolucijski najstarijih, najkonzerviranijih i najsvestranijih hormona

prisutnih u ljudskom tijelu. Izlučuje ga epifiza (pinealna žlijezda), ovisno o prisutnosti svjetla i

tame u okolini. Najpoznatiji je kao regulator cirkadijanog i sezonskog bioritma, no ima ulogu i

u djelovanju imunološkog i reproduktivnog sustava, regulaciji tjelesne mase i inhibiciji rasta

tumora. Direktno djeluje i kao antioksidans, smanjuje utjecaj kemotoksičnog zračenja te

usporava proces starenja. Potencijalni učinak melatonina kao promotora cijeljenja u fokusu je

mnogih istraživanja [96, 8]. Melatonin utječe na brojne procese uključene u cijeljenje rane kao

što su oslobađanje medijatora upale, proliferacija i migracija stanica, angiogeneza i

akumulacija kolagena i glikozaminoglikana u području rane [7]. Učinak melatonina je ovisan o

dozi, vremenu primjene i ciljanom tkivu. Suprotna mišljenja o tome ima li melatonin pozitivan

[16, 17] ili negativan [18, 19] učinak na cijeljenje rana, odnosno na proliferaciju fibroblasta i

akumulaciju kolagena, mogu se dijelom objasniti razlikom između učinka topikalno

primijenjenog melatonina i indirektnog učinka preko različitih regulatornih mehanizama pri

sistemskoj primjeni [20, 21]. Iz navedenog razloga proizlazi potreba za razvojem terapijskih

sustava s uklopljenim melatoninom za lokalnu primjenu kojima se zaobilaze sistemski učinci.

Cilj ovog istraživanja je pripraviti nanočestice kitozana i melatonina za topikalnu primjenu

korištenjem kitozana različitog stupnja deacetilacije i/ili molekulske mase, te evaluirati njihov

učinak na cijeljenje rane in vitro u ovisnosti o sadržaju uklopljenog melatonina i svojstvima

kitozana.

Specifični ciljevi

o Pripraviti lecitinsko-kitozanske nanočestice dostatnog uklapanja melatonina

o Odrediti fizičko-kemijska svojstva pripravljenih čestica

veličinu i raspodjelu veličina čestica

površinski naboj

sadržaj uklopljenog lijeka

o Ispitati utjecaj molekulske mase i stupnja deacetilacije kitozana na

fizičko-kemijska svojstva priređenih terapijskih sustava

profil oslobađanja melatonina in vitro

o Ispitati biokompatibilnost lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom in

vitro praćenjem metaboličke aktivnosti keratinocita nakon izlaganja suspenziji

nanočestica

o Ispitati učinak lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom na proliferaciju

i migraciju keratinocita in vitro

26

3. Materijal i metode

3.1. Materijal

U izradi ovog rada za rektorovu nagradu za pripravu nanočestica korišteni su lecitin S45

(Lipoid GmbH, Njemačka), melatonin (Sigma–Aldrich Chemie GmbH, Njemačka) te četiri tipa

kitozana (ProtosanUP Cl 113,114, 213, 214, NovaMatrix, Norveška). Stupanj deacetilacije i

molekulska masa korištenih kitozana prikazani su u Tablici 1.

Tablica 1: Svojstva pojedinog tipa kitozana

Oznaka Stupanj deacetilacije (%) Molekulska masa (kDa)

Kitozan 113 C113 75-90 50 – 150

Kitozan 114 C114 >90 50 – 150

Kitozan 213 C213 75-90 150 – 400

Kitozan 214 C214 >90 150 – 400

Hranidbeni medij DMEM, PBS (fosfatni pufer bez Ca i Mg), smjesa antibiotika (penicilin,

streptomicin i amfotericin B), tripsin 2,5% i EDTA nabavljeni su od Lonze (Švicarska), a posude

za uzgoj stanica od TPP (Švicarska) i Falcona (SAD). Kalcijev klorid dihidrat nabavljen je od

Sigma-Aldricha, 37% klorovodična kiselina od Carlo Erbe (Italija), HEPES od

AppliChem/Panreac (Njemačka), a kalijev dihidrogenfosfat i natrijev acetat trihidrat od Kemike

(Hrvatska). Dinatrijev hidrogen fosfat je proizveden od Fluke (Švicarska), magnezijev klorid

heksahidrat od Mercka (Njemačka), fetalni teleći serum (FBS) od Biosere (Francuska) dok su

ostale korištene kemikalije od proizvođača Kemig (Hrvatska).

Ispitivanja toksičnosti provedena su korištenjem pufera balansiranog Hankovim solima

(engl. Hank's balanced salt solution) pH 6,0, pripravljenog otapanjem bezvodnog kalcijevog

klorida (CaCl2 bezvodni; 140 mgl-1), magnezijevog klorida (MgCl2 × 6H2O; 100 mgl-1),

magnezijevog sulfata (MgSO4 × 7H2O; 100 mgl-1), kalijevog klorida (KCl; 400 mgl-1), kalijevog

dihidrogenfosfata (KH2PO4; 60 mgl-1), natrijevog bikarbonata (NaHCO3; 350 mgl-1), natrijevog

klorida (NaCl; 8000 mgl-1); dinatrijevog hidrogenfosfata (Na2HPO4 anhydr; 48 mgl-1), D-glukoze

(1000 mgl-1) i 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonske kiseline (HEPES; 30 mM) u

pročišćenoj vodi.

27

3.2. Metode

3.2.1. Priprava nanočestica

Pripravljene su otopine četiri tipa kitozana (C113, C114, C213 i C214; Tablica 1)

koncentracije 10 mgml-1 u pročišćenoj vodi. Otopina lecitina koncentracije 25 mgml-1

pripravljena je u 96% etanolu. Za pripravu lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom,

melatonin je otopljen u etanolnoj otopini lecitina u koncentraciji od 5 mgml-1 odnosno u

masenom omjeru prema lecitinu od 1:5.

Otopine kitozana (0,25 ml) razrijeđene su pročišćenom vodom do volumena od 23 ml.

Suspenzije nanočestica s melatoninom pripravljene su injektiranjem 2 ml etanolne otopine

lecitina i melatonina kroz iglu unutarnjeg promjera 0,75 mm, u 23 ml razrijeđene otopine

kitozana uz miješanje na magnetskoj miješalici (900 okr/min). U pripravljenim suspenzijama

nanočestica koncentracija kitozana iznosi 100 µgml-1, a maseni omjer lecitina i kitozana 20:1.

Usporedbe radi, pripravljene su i lecitinske nanočestice s melatoninom, injektiranjem 2 ml

etanolne otopine lecitina i melatonina u 23 ml pročišćene vode. Lecitinsko-kitozanske i

lecitinske nanočestice bez melatonina (prazne nanočestice) pripravljene su opisanim

postupcima uz izostavljanje melatonina.

3.2.2. Određivanje uspješnosti uklapanja lijeka u nanočestice

Uklopljenost lijeka u nanočestice, odnosno sadržaj lijeka određen je metodom dijalize

kojom je moguće odvojiti neuklopljeni lijek od nanočestica s uklopljenim lijekom. Odgovarajući

volumen (4 ml) suspenzije nanočestica stavljen je u dijalizacijsku vrećicu od celuloza acetata

(Spectra/Por ®, MW cut-off 12 000 – 14 000 Da, Medicell International Ltd, UK). Zatim je

vrećica uronjena u receptorsku fazu (100 ml pročišćene vode). Uz neprekidno miješanje na

magnetskoj miješalici (300 okr/min), iz receptorske faze uzimani su uzorci od 2 ml svakih

10 min kroz određeni vremenski interval, a uzeti volumen nadoknađen je sa 2 ml pročišćene

vode. Uzorci su razrijeđeni s 1 ml pročišćene vode, a onda je određena koncentracija

melatonina UV-Vis spektrofotometrom (λ=278 nm) (Cary 50, Varian Inc., SAD). Ispitivanje je

zaustavljeno kada su u uzastopnim uzorcima receptorske faze izmjerene jednake

koncentracije lijeka (nakon 120 min).

Uspješnost uklapanja lijeka (UU) određena je prema sljedećoj jednadžbi:

UU=([ukupni lijek] – [neuklopljeni lijek]) / [ukupni lijek] x 100

28

Sadržaj melatonina u nanočesticama (engl. drug loading, DL(%)) izračunat je prema

sljedećoj jednadžbi:

DL (%) =([ukupni lijek] – [neuklopljeni lijek]) / [masa nanočestica] x 100.

Sadržaj melatonina (CM) u suspenziji nanočestica izračunat je prema sljedećoj jednadžbi:

CM (µgml-1) =([ukupni lijek] – [neuklopljeni lijek]) / [volumen suspenzije nanočestica]

Dijalizirani uzorci suspenzija nanočestica korišteni su u svim daljnjim ispitivanjima.

3.2.3. Određivanje veličine nanočestica

Veličina nanočestica određena je fotonskom korelacijskom spektroskopijom (engl. photon

correlation spectroscopy; PCS) (Zetasizer 3000HS, Malvern Instruments, UK). PCS metodom

se određuje veličina dispergiranih čestica u području od 2 nm do 3 µm. Mjerenje se provodi

polariziranom laserskom zrakom kojom su obasjane sve čestice nakon čega dolazi do

difrakcije svjetlosti. Bilježi se intenzitet svjetlosti raspršene na česticama pod određenim kutom

pri konstantnoj temperaturi. Promjer čestica dobiven PCS metodom naziva se i

hidrodinamičkim promjerom (Rh).

U mjernim sustavima upotrebljen je monokromatski koherentni 10 mW He-Ne laser

(λ=633 nm), a kut detekcije raspršene svjetlosti je bio 90°. Mjerenja su provedena pri 25°C.

Veličina čestica mjerena je nakon odgovarajućeg razrjeđivanja pročišćenom vodom.

3.2.4. Određivanje zeta-potencijala nanočestica

Zeta-potencijal određen je fotonskom korelacijskom spektroskopijom (PCS) (Zetasizer

3000HS, Malvern Instruments, UK). Zeta-potencijal je elektrokinetički potencijal u koloidnim

disperzijama. Vrijednost zeta-potencijala određuje se indirektno mjerenjem elektroforetske

pokretljivosti čestica. Na površini dispergiranih čestica razlikuju se dva sloja: Sternov sloj i

difuzijski sloj. Sternov sloj je sloj slabo pokretnih iona uz samu površinu čestice, a difuzijski sloj

je sloj pokretnih iona suprotnog naboja iz otapala. Nabijene dispergirane čestice se nalaze u

električnom polju i putuju prema suprotno nabijenoj elektrodi, a zajedno s njima se giba Sternov

sloj i dio vezanih molekula otapala. Vezane molekule su od ostalih molekula otapala odijeljene

29

plohom smicanja, a potencijal na udaljenosti od plohe smicanja je mjereni elektrokinetički zeta-

potencijal (ζ). U sustavu za mjerenje elektroforetske pokretljivosti čestica korišten je 10 mW

He-Ne laser. Elektroforetska pokretljivost izračunava se iz spektra frekvencija koje proizlaze iz

detektiranih fotona svjetlosti. S obzirom da se nabijene čestice nalaze u promjenjivom

električnom polju, one se gibaju i raspršuju svjetlost. Ovisno o brzini gibanja mijenja se i

frekvencija svjetlosti. Mjerenja su provođena pri 25 °C. Zeta-potencijal nanočestica mjeren je

nakon odgovarajućeg razrjeđivanja s 10 mM otopinom NaCl.

3.2.5. In vitro oslobađanje melatonina iz nanočestica

Ispitivanje oslobađanja melatonina iz pripravljenih nanočestica provedeno je metodom

dijalize. Odgovarajući volumen suspenzije nanočestica s uklopljenim melatoninom (250 µg)

stavljen je u vrećicu za dijalizu od celuloza acetata (Spectra/Por ® , MW cut-off

12 000 - 14 000 Da, Medicell International Ltd, UK). Potom je vrećica za dijalizu uronjena u

receptorski medij (30 ml acetatnog pufera, pH 5,8). Eksperiment je vođen uz osigurane uvjete

topljivosti za melatonin. Uz neprekidno miješanje na magnetskoj miješalici (30 okr/min), iz

receptorskog medija uzimani su uzorci (1 ml) u određenim vremenskim intervalima (svakih

15 minuta kroz prva 2 sata i svakih 20 minuta kroz naredna 3 sata). Uzeti volumen

nadoknađivan je svježim acetatnim puferom. Uzorci su zatim razrijeđeni s 2 ml acetatnog

pufera te je koncentracija oslobođenog melatonina mjerena UV-Vis spektrofotometrom

(λ=278 nm) (Cary 50, Varian Inc., SAD).

Profili oslobađanja melatonina iz nanočestica pripravljenih s različitim tipovima kitozana

uspoređeni su upotrebom faktora sličnosti (engl. similarity factor, f2) koji određuje bliskost dvaju

profila:

gdje je n = broj eksperimentalnih točaka, R(t) = srednji postotni udio oslobođenog lijeka iz

referentnog pripravka u vremenu t, T(t) = srednji postotni udio oslobođenog lijeka iz ispitivanog

pripravka u vremenu t.

n

tTtR

fnt

t 1

2

2

)()(

1

100log50

30

3.2.6. Stanična linija i uvjeti uzgoja

U ovom radu korištena je humana stanična linija HaCaT (keratinociti kože; Cell Line

Services, Germany). Stanice su uzgajane u skladu s protokolom kojeg preporučuje

proizvođač. Stanice su nasađene u sterilnim uvjetima u posudama za uzgoj od 25, 75 i

150 cm2, ili na pločama sa 24 jažice, te su uzgajane u inkubatoru pri 37°C, 5% CO2 i 95%

relativne vlažnosti. Konfluentnost je kontrolirana invertnim mikroskopom (Primovert, Carl Zeiss

AG, Njemačka). Za uzgoj HaCaT stanica kao hranidbeni medij korišten je DMEM koji je

sadržavao penicilin, streptomicin i amfotericin uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma.

Nakon postizanja 80-90% konfluentnosti, stanice su presađivane u novu tikvicu. Prilikom

presađivanja medij je odsisan te su stanice isprane sa PBS-om koji je potom uklonjen, zatim

su stanice inkubirane s otopinom EDTA (0,02 % m/V) pri 37°C u periodu od 2,5 minute. Stanice

su tripsinizirane otopinom tripsina (0,125 % m/V), a nakon odvajanja stanica od podloge učinak

tripsina je inhibiran dodatkom medija (DMEM/10% FBS) u volumnom omjeru prema tripsinu

3:2. Stanični medij je mijenjan svaka dva dana.

3.2.7. Ispitivanje citotoksičnosti in vitro - MTT test

U svrhu određivanja potencijalne citotoksičnosti ispitivanih nanočestica HaCaT stanice

nasađene su na ploče s 24 jažice (TPP, Švicarska) pri gustoći od 105 stanica/jažici nakon čega

im je bilo potrebno 2 dana do postizanja odgovarajuće konfluentnosti. Suspenzije nanočestica

razrijeđene su HBSS puferom (pH 6,0) kako bi se dobio raspon (relevantnih) koncentracija

kitozana od 1,25 – 20 µgml-1. Stanice su tretirane pripravljenim suspenzijama nanočestica i

inkubirane u trajanju od 2 sata nakon čega su suspenzije nanočestica odsisane i stanicama je

vraćen svježi medij. Stanice inkubirane u HBSS-u u trajanju od 2 sata korištene su kao

negativna kontrola. Citotoksičnost je određivana nakon 24 sata MTT testom.

MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolijev bromid] (Sigma, Njemačka) test je

kolorimetrijski test za ispitivanje metaboličke aktivnosti stanica. Otopina MTT je žute boje, a

stanice pomoću NAD(P)H – ovisne oksidoreduktaze imaju sposobnost prevoditi MTT u u vodi

netopljivi formazan koji je ljubičaste boje. Nastali ljubičasti kristali formazana topljivi su u

organskim otapalima. Intenzitet boje mjeri se spektrofotometrijski, a izmjerena apsorbancija

izravno je proporcionalna koncentraciji formazana, odnosno metaboličkoj aktivnosti stanica.

Otopina MTT-a (5 mgml-1) priređena u HBSS puferu (pH 6,0) dodana je u medij u omjeru

10 µl prema 100 µl medija. Tako tretirane stanice inkubirane su sat vremena pri 37°C nakon

31

čega im je odsisan medij i dodan kiseli izopropanol koji je pripremljen dodatkom 100 µl

koncentrirane klorovodične kiseline na 30 mL izopropanola. Apsorbancija je mjerena pri valnoj

duljini od 570 nm (Victor3, PerkinElmer, SAD). Metabolička aktivnost izražena je kao relativna

u odnosu na kontrolne, netretirane stanice inkubirane u HBSS puferu. Sva mjerenja rađena su

u triplikatu.

3.2.8. Praćenje dinamike prekrivanja praznina nastalih namjernim

oštećivanjem konfluentnog sloja stanica – engl. scratch test

Utjecaj lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom na cijeljenje rana in vitro određen

je praćenjem dinamike prekrivanja praznina nastalih namjernim oštećivanjem konfluentnog

sloja stanica (engl. scratch test). Metoda se temelji na stvaranju modelne rane (engl. scratch)

na konfluentnom monosloju stanica. Stanice na krajevima modelne rane proliferiraju/migriraju

prema središtu dok ne dođe do zatvaranja modelne rane, odnosno dok ne dođe do

međusobnog kontakta stanica.

HaCaT stanice nasađene su pri gustoći od 105 stanica/jažici na ploče s 24 jažice (TPP,

Švicarska) nakon čega im je bilo potrebno 24 sata za postizanje odgovarajuće konfluentnosti

u mediju s 10% FBS-a.

Nakon postizanja konfluentnosti, stanicama je uklonjen medij i zamijenjen s medijem bez

seruma. Nakon 24 h sloj stanica je po sredini jažice zagreban vrhom pipete od 10 µl kako bi

se stvorila modelna rana. Monosloj je potom ispran HBSS-om (pH 6,0) kako bi se uklonile

odvojene stanice. Modelne rane tretirane su priređenim suspenzijama lecitinsko-kitozanskih

nanočestica s melatoninom te praznim lecitinsko-kitozanskim nanočesticama pri koncentraciji

kitozana od 5 µgml-1. Kao kontrole korištene su otopine melatonina (5 µgml-1) i kitozana

(5 µgml-1), te lecitinske nanočestice (100 µgml-1). Stanice su tretirane 2 sata nakon čega su

suspenzije, odnosno otopine odsisane, a zatim isprane s HBSS-om te im je vraćen svježi medij

bez seruma. Dinamika prekrivanja praznina praćena je invertnim mikroskopom (Primovert,

Carl Zeiss AG, Njemačka) spregnutim s kamerom (Samsung, 5 pixel) tijekom 48 sati nakon

tretiranja. Za obradu slika korišten je program ImageJ (National Institute of Health, SAD).

32

3.2.9. Statistička analiza

Za statističku analizu podataka korišten je 1-way ANOVA test nadopunjen

multiparametarskim Tukey's post-hoc testom (granica značajnosti P < 0,05). Računanje je

provedeno pomoću GraphPad Prism programa (GraphPad Software, Inc., San Diego, USA;

www.graphpad.com).

33

4. Rezultati

4.1. Priprava lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom

Pripravljene su lecitinsko-kitozanske nanočestice s uklopljenim melatoninom. Metoda

priprave uključivala je injektiranje etanolne otopine lecitina i melatonina u vodenu otopinu

kitozana uz miješanje, pri čemu su, uslijed ionske interakcije između negativno nabijenog

lecitina i pozitivno nabijenog kitozana spontano nastale nanočestice (ionotropno geliranje).

U pripravi lecitinsko-kitozanskih nanočestica korištena su četiri tipa kitozana koja se

međusobno razlikuju po molekulskoj masi i stupnju deacetilacije (Tablica 1). Tako su iz

kitozana C113, C114, C213 i C214 pripravljene lecitinsko-kitozanske nanočestice s

melatoninom označene redom kao MLC113, MLC114, MLC213 i MLC214. Maseni omjer

lecitina i kitozana u svim pripravcima iznosio je 20:1, dok je maseni omjer između melatonina

i lecitina iznosio 1:5.

Usporedbe radi, pripravljene su i lecitinske nanočestice s melatoninom (ML).

Nanočestice bez melatonina (prazne nanočestice) pripravljene su opisanim postupkom uz

izostavljanje melatonina. Prazne lecitinsko-kitozanske nanočestice označene su kao LC113,

LC114, LC213, LC214, ovisno o tipu kitozana korištenom u njihovoj pripravi. Prazne lecitinske

nanočestice označene su oznakom L.

U pripravljenim suspenzijama nanočestica vrijednosti pH iznosile su između 4,9 i 5,0.

4.2. Karakterizacija nanočestica s melatoninom

4.2.1. Uspješnost uklapanja melatonina u nanočestice

Uspješnost uklapanja melatonina u nanočestice određena je metodom dijalize koja

omogućava odjeljivanje neuklopljenog lijeka od nanočestica s uklopljenim lijekom.

Postignuta uklapanja melatonina u nanočestice odnosno sadržaj melatonina u

suspenzijama nanočestica prikazani su u Tablici 2. Uspješnost uklapanja melatonina u

lecitinsko-kitozanske nanočestice i sadržaj melatonina u odgovarajućim suspenzijama kretali

su se redom između 23,0 ± 1,7 i 27,0 ± 2,5 %, te 95,7 ± 7,1 i 109,2 ± 9,9 µgml-1. Uspješnost

uklapanja melatonina u lecitinske nanočestice iznosila je 19,4 ± 2,0 %, što odgovara sadržaju

melatonina u suspenziji lecitinskih nanočestica od 79,9 ± 8,3 µgml-1 te upućuje na bolje

34

uklapanje melatonina u lecitinsko-kitozanske nanočestice u odnosu na lecitinske nanočestice,

za sve tipove korištenih kitozana. Najbolje uklapanje melatonina postignuto je kod čestica u

čijoj pripravi je korišten kitozan C213, dok se melatonin najslabije uklopio u nanočestice

pripravljene s kitozanom C214.

4.2.2. Veličina i zeta-potencijal nanočestica

Veličina i površinski naboj lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom određeni su u

dijaliziranim sustavima nakon razrjeđenja s vodom odnosno 10 mM otopinom NaCl. U

pripravljenim sustavima nakon dijalize vrijednosti pH povećale su se na 5,6-5,7, a nakon

razrjeđenja s vodom ili otopinom NaCl na 5,8-6,0. Veličina i polidisperznost te zeta-potencijal

nanočestica određeni pri tim uvjetima prikazani su u Tablici 2.

Tablica 2: Glavna svojstva lecitinskih i lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom

Srednji

promjer (nm) PDI

Zeta-potencijal

(mV) UU (%) DL (%) CM (µgml-1)

ML 96,8±2,1

(78,8±0,4)

0,35±0,01

(0,39±0,01)

-34,3±3,5

(-33,7±2,8) 19,4±2,0 3,8±0,4 79,9±8,3

MLC113 245,2±2,8

(233,4±3,6)

0,35±0,04

(0,16±0,02)

23,4±0,9

(25,7±0,7) 25,8±0,2 4,2±0,02 106,4±0,7

MLC114 255,0±7,7

(242,3±2,8)

0,38±0,07

(0,39±0,12)

24,5±0,6

(26,1±1,1) 26,1±2,5 4,1±0,4 103,3±9,8

MLC213 256,1±1,5

(247,1±5,9)

0,29±0,01

(0,22±0,01)

29,3±1,7

(28,4±0,9) 27,0±2,5 4,3±0,4 109,2±9,9

MLC214 277,1±7,6

(257,5±3,7)

0,45±0,03

(0,38±0,08)

32,5±1,2

(29,0±1,9) 23,0±1,7 3,8±0,3 95,7±7,1

Vrijednosti u zagradama odnose se na prazne nanočestice. Prikazane su srednje vrijednosti ± SD (n = 3). PDI, indeks polidisperznosti UU (%), uspješnost uklapanja: sadržaj lijeka/teorijski sadržaj lijeka × 100 DL (%), sadržaj lijeka/ispitivana količina nanočestica × 100 CM (µgml-1), sadržaj lijeka/volumen suspenzije nanočestica

Veličina i polidisperznost nanočestica određeni su fotonskom korelacijskom

spektroskopijom. Srednji promjeri praznih lecitinsko-kitozanskih nanočestica bili su u rasponu

35

od 233,4 ± 3,6 do 257,5 ± 3,7 nm. Srednji promjeri odgovarajućih lecitinsko-kitozanskih

nanočestica s melatoninom kretali su se između 245,2 ± 2,8 i 277,1 ± 7,6 nm, iz čega se može

zaključiti da je uklapanje melatonina rezultiralo porastom promjera lecitinsko-kitozanskih

nanočestica. Usporedbe radi, lecitinske nanočestice s melatoninom (ML) pripravljene bez

kitozana imale su srednji promjer 96,8 ± 2,1 nm.

Veličina lecitinsko-kitozanskih nanočestica ovisila je o molekulskoj masi (50-150 kDa ili

150-400 kDa) i stupnju deacetilacije (75-90% ili > 90%) kitozana u pripravku. Tako su

nanočestice najvećeg srednjeg promjera pripravljene s kitozanom većeg stupnja deacetilacije

i veće molekulske mase (C214), dok su nanočestice najmanjeg srednjeg promjera pripravljene

s kitozanom manjeg stupnja deacetilacije i manje molekulske mase (C113).

Većina uzoraka karakterizirana je relativno širokom raspodjelom veličina čestica na što

ukazuju vrijednosti indeksa polidisperznosti prikazane u Tablici 2.

Vrijednosti zeta-potencijala promijenile su se od negativne za koloidnu suspenziju lecitina

(-34,3 ± 3,5 i -33,7 ± 2,8 mV redom za ML i L nanočestice) u pozitivne, za sve ispitivane

lecitinsko-kitozanske nanočestice. Zeta-potencijal lecitinsko-kitozanskih nanočestica s

melatoninom nije se značajnije razlikovao od zeta-potencijala odgovarajućih praznih

nanočestica, iz čega se može zaključiti da uklapanje melatonina nije utjecalo na površinski

naboj nanočestica. Jednako kao i veličina lecitinsko-kitozanskih nanočestica, i zeta-potencijal

je ovisilo o molekulskoj masi i stupnju deacetilacije kitozana u pripravku. Tako su nanočestice

najvećeg zeta-potencijala (32,5 ± 1,2 mV) pripravljene s kitozanom većeg stupnja deacetilacije

i veće molekulske mase (C214), dok su nanočestice najmanjeg zeta-potencijala

(23,4 ± 0,9 mV) pripravljene s kitozanom manjeg stupnja deacetilacije i manje molekulske

mase (C113).

4.3. In vitro oslobađanje melatonina iz nanočestica

Ispitivanje oslobađanja melatonina iz pripravljenih nanočestica provedeno je metodom

dijalize uz acetatni pufer (pH 5,8) kao receptorski medij. Profili oslobađanja melatonina iz

lecitinsko-kitozanskih nanočestica prikazani su na Slici 3.

36

0 1 2 3 4 50

20

40

60

80

100

Vrijeme (h)

Q (

%)

0 1 2 3 4 50

20

40

60

80

100

Vrijeme (h)

Q (

%)

A

B

Slika 3: Profil oslobađanja melatonina iz lecitinsko-kitozanskih nanočestica pripravljenih s kitozanom stupnja deacetilacije 75-90% (●) i >90% (●) molekulske mase 50-150 kDa (A) i 150-400 kDa (B). Ispitivanje je provedeno metodom dijalize uz acetatni pufer (pH 5,8) kao receptorski medij. Prikazan je i profil difuzije melatonina iz otopine odgovarajuće koncentracije kroz dijalizacijsku membranu (●) te profil oslobađanja melatonina iz lecitinskih nanočestica (●). Prikazane su srednje vrijednosti kumulativnog udjela oslobođenog melatonina (Q) ± SD (n = 3).

Za sve ispitivane lecitinsko-kitozanske nanočestice dobiveni su slični bifazični profili

produljenog oslobađanja melatonina (t50% 4-5 h) neovisno o tipu korištenog kitozana. Tako je

u prvih sat vremena oslobođeno 30,0 - 34,2 % melatonina iz nanočestica, nakon čega je

uslijedila faza sporijeg oslobađanja te je unutar 5 sati ispitivanja oslobođeno ukupno

48,0 - 50,1 % uklopljenog lijeka. Faktori sličnosti pri usporedbi profila oslobađanja melatonina

iz nanočestica pripravljenih s različitim tipovima kitozana kretali su se između 69,8 i 87,7

potvrđujući sličnosti svih uspoređivanih profila oslobađanja melatonina, neovisno o stupnju

deacetilacije i molekulskoj masi kitozana u pripravku (Tablica 3).

37

Oslobađanje melatonina iz lecitinsko-kitozanskih nanočestica bilo je sporije od

oslobađanja melatonina iz lecitinskih nanočestica (t50% 0,75 h).

Difuzija melatonina kroz dijalizacijsku membranu u slučaju vodene otopine melatonina

značajno je brža (t50% 0,25 h) nego u slučaju ispitivanih nanočestica. Naime, u prvih sat

vremena kroz dijalizacijsku membranu difundiralo je 75,2 % melatonina iz otopine, a u nepuna

tri sata dijaliza otopine melatonina je završena (količina lijeka u receptorskom mediju iznosila

je 94,6 %). Stoga se može zaključiti da je, u slučaju nanočestica, profil oslobađanja melatonina

određen oslobađanjem melatonina iz nanočestica u kontinuiranu fazu, a ne difuzijom kroz

dijalizacijsku membranu.

Tablica 3: Faktori sličnosti (f2) pri usporedbi profila oslobađanja melatonina iz nanočestica pripravljenih s različitim tipovima kitozana

MLC113 MLC114 MLC213

MLC214 69,8 86,6 70,2

MLC213 87,7 71,7

MLC114 70,3

4.4. Ispitivanje citotoksičnosti in vitro MTT testom

Metabolička aktivnost HaCaT stanica nakon dvosatnog izlaganja suspenzijama

lecitinsko-kitozanskih nanočestica i otopinama kitozana razrijeđenim HBSS-om (pH 6,0)

prikazana je na Slici 4. Izlaganje stanica suspenzijama nanočestica s melatoninom pri

koncentraciji kitozana u rasponu od 1,25 do 10 μgml-1 nije značajnije utjecalo na vijabilnost

stanica, neovisno o tipu korištenog kitozana (P ˃ 0,05). Značajno smanjenje vijabilnosti

stanica uočeno je tek pri izlaganju stanica suspenzijama nanočestica pri koncentraciji

kitozana od 20 μgml-1. Suprotno tome, vijabilnost stanica tretiranih otopinama kitozana

smanjivala se je pri manjim koncentracijama, i to ovisno o stupnju deacetilacije kitozana.

Tako je pri tretiranju stanica otopinama kitozana manjeg stupnja deacetilacije

(75-90%; C113 i C213) značajno smanjenje vijabilnosti stanica uočeno pri koncentracijama

kitozana od 10 i 20 μgml-1 (P ˂ 0,05), dok je u slučaju kitozana većeg stupnja deacetilacije

38

(>90%; C114 i C214) vijabilnost stanica značajno smanjena već pri koncentraciji kitozana

od 5 μgml-1 (P ˂ 0,05). Nije uočena ovisnost vijabilnosti stanica o molekulskoj masi kitozana.

Vijabilnost stanica izloženih lecitinsko-kitozanskim nanočesticama s melatoninom, nije

se značajnije razlikovala od vijabilnosti stanica izloženih odgovarajućim praznim

nanočesticama, osim kada je u pripravi nanočestica korišten kitozan C214. U tom su slučaju

lecitinsko-kitozanske nanočestice s melatoninom pri koncentracijama kitozana od 10 i

20 μgml-1 manje utjecale na vijabilnost stanica od odgovarajućih praznih nanočestica

(Slika 4).

Otopina melatonina, lecitinske nanočestice i lecitinske nanočestice s melatoninom

(kontrole) nisu utjecali na vijabilnost HaCaT stanica u ispitivanom rasponu koncentracija

(koncentracije melatonina 1,25 – 20 μgml-1, koncentracije lecitina 25 – 400 μgml-1; Slika 5).

39

1,25 2,5 5,0 10,0 20,00

50

100

150

Koncentracija kitozana (g/ml)

Vij

ab

iln

ost

sta

nic

a (

%)

1,25 2,5 5,0 10,0 20,00

50

100

150

Koncentracija kitozana (g/ml)

Vij

ab

iln

ost

sta

nic

a (

%)

1,25 2,5 5,0 10,0 20,00

50

100

150

Koncentracija kitozana (g/ml)

Vij

ab

iln

ost

sta

nic

a (

%)

1,25 2,5 5,0 10,0 20,00

50

100

150

Koncentracija kitozana (g/ml)

Vij

ab

iln

ost

sta

nic

a (

%)

C113

C114

C213

C214

**

*

*

**

*

*

*

**

*

*

**

*

*

*

**

Slika 4: Utjecaj otopine kitozana (□), lecitinsko-kitozanskih nanočestica (■) i lecitinsko-kitoznskih nanočestica s melatoninom (■) na vijabilnost HaCaT stanica (MTT test). Otopine kitozana i suspenzije nanočestica razrijeđene su HBSS-om (pH 6,0). Koncentracija kitozana u razrijeđenim sustavima bila je u rasponu od 1,25 do 20 µml-1. Stanice su tretirane 2 sata. Vijabilnost stanica izražena je u odnosu na netretirane stanice inkubirane u HBSS-u (pH 6,0). Prikazane su srednje vrijednosti ± SD (n=3).*Razlikuju se od netretiranih stanica inkubiranih u HBSS-u (P˂0,05).

40

Slika 5: Utjecaj otopine melatonina (□), lecitinskih nanočestica (■) i lecitinskih nanočestica s melatoninom (■) na vijabilnost HaCaT stanica (MTT test). Otopina melatonina i suspenzije nanočestica razrijeđene su HBSS-om (pH 6,0). Stanice su tretirane 2 sata. Vijabilnost stanica izražena je u odnosu na netretirane stanice inkubirane u HBSS-u (pH 6,0). Prikazane su srednje vrijednosti ± SD (n=3).

4.5. Utjecaj nanočestica na proliferaciju i migraciju HaCaT stanica

Utjecaj lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom na proliferaciju i migraciju

keratinocita in vitro ispitivan je pri pH 6,0 koji je osiguran razrjeđivanjem suspenzija

nanočestica (pH 5,8-6,0) HBSS puferom navedene pH vrijednosti.

Modelne rane tretirane su pripravljenim suspenzijama lecitinsko-kitozanskih nanočestica s

melatoninom te praznim lecitinsko-kitozanskim nanočesticama pri koncentraciji kitozana od

5 µgml-1. Kao kontrole korištene su otopine melatonina (5 µgml-1) i kitozana (5 µgml-1), te

lecitinske nanočestice (100 µgml-1).

Proliferacija/migracija stanica (cijeljenje rane in vitro) izražena je smanjenjem površine

praznine nastale namjernim oštećivanjem konfluentnog sloja stanica tj. postotkom

prekrivenosti prvotno formirane praznine, 24 i 48 sati nakon dvosatnog tretiranja stanica

(Slike 6 i 7).

Lecitinsko-kitozanske nanočestice s melatoninom pripravljene s kitozanima manje

molekulske mase (MLC113 i MLC114) značajno su ubrzale proces cijeljenja rane in vitro u

odnosu na kontrolu (postotak cijeljenja rane in vitro iznosio je redom 36,9 ± 9,2 i 47,8 ± 8,2 %

za MLC113 i MLC114 nanočestice te 19,0 ± 8,2 % za stanice inkubirane s HBSS-om) već u

24-satnom periodu nakon tretiranja (P ˂ 0,05; Slika 6). Nakon 48 sati od tretiranja stanica

1,25/25 2,5/50 5/100 10/200 20/4000

50

100

150

Koncentracija melatonina/lecitina (g/ml)

Vij

ab

iln

ost

sta

nic

a (

%)

41

nanočesticama MLC113 i MLC114 prekrivenost praznine nastale namjernim oštećivanjem

konfluentnog sloja stanica iznosila je redom 49,16 ± 10,9 i 59,4 ± 12,5 %, a vidljiv je značajan

učinak i MLC213 nanočestica (43,4 ± 6,7 %) u odnosu na kontrolu (stanice inkubirane s

HBSS-om; 27,0 ± 7,2 %). Iz navedenih rezultata razvidan je najveći utjecaj MLC114

nanočestica na cijeljenje rane in vitro (Slika 8). Od praznih lecitinsko-kitozanskih nanočestica,

jedino su LC114 nanočestice značajno ubrzale proces cijeljenja rane in vitro u odnosu na

stanice inkubirane s HBSS-om (postotak cijeljenja rane in vitro 44,7 ± 11,8 %) i to u periodu

od 48 sati nakon tretiranja. Iz tih rezultata je razvidan pozitivan utjecaj melatonina uklopljenog

u nanočestice na proces proliferacije i migracije HaCaT stanica.

HBSS

Mel

atonin L

C11

3

LC11

3

MLC

113

0

20

40

60

80

Cij

elj

en

je r

an

e i

n v

itro

(%

)

HBSS

Mel

atonin L

C11

4

LC11

4

MLC

114

0

20

40

60

80

Cij

elj

en

je r

an

e i

n v

itro

(%

)

HBSS

Mel

atonin L

C21

3

LC21

3

MLC

213

0

20

40

60

80

Cij

elj

en

je r

an

e i

n v

itro

(%

)

HBSS

Mel

atonin L

C21

4

LC21

4

MLC

214

0

20

40

60

80

Cij

elj

en

je r

an

e i

n v

itro

(%

)

A B

C D

*

*

*

*

Slika 6: Utjecaj lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom i praznih lecitinsko-kitozanskih nanočestica pripravljenih s kitozanom C113 (A), C114 (B), C213 (C) i C214 (D) na cijeljenje rane in vitro u 24-satnom periodu. Cijeljenje rane in vitro izraženo je postotkom prekrivenosti površine praznine nastale namjernim oštećivanjem konfluentnog sloja stanica 24 sata nakon dvosatnog tretiranja stanica. Modelne rane tretirane su priređenim suspenzijama lecitinsko- kitozanskih nanočestica pri koncentraciji kitozana od 5 µgml-1. Kao kontrole korištene su otopine melatonina (5 µgml-1) i kitozana (5 µgml-1), te lecitinske nanočestice (100 µgml-1). Otopina melatonina i kitozana te suspenzije nanočestica razrijeđene su HBSS-om (pH 6,0). Prikazane su srednje vrijednosti ± SD (n=6). *Razlikuju se od netretiranih stanica inkubiranih u HBSS-u (P˂0,05).

42

HBSS

Mel

atonin L

C11

3

LC11

3

MLC

113

0

20

40

60

80

Cij

elj

en

je r

an

e i

n v

itro

(%

)

HBSS

Mel

atonin L

C11

4

LC11

4

MLC

114

0

20

40

60

80

Cij

elj

en

je r

an

e i

n v

itro

(%

)

HBSS

Mel

atonin L

C21

3

LC21

3

MLC

213

0

20

40

60

80

Cij

elj

en

je r

an

e i

n v

itro

(%

)

HBSS

Mel

atonin L

C21

4

LC21

4

MLC

214

0

20

40

60

80

Cij

elj

en

je r

an

e i

n v

itro

(%

)

A B

C D

*

*

*

*

*

**

*

Slika 7: Utjecaj lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom i praznih lecitinsko-kitozanskih nanočestica pripravljenih s kitozanom C113 (A), C114 (B), C213 (C) i C214 (D) na cijeljenje rane in vitro u 48-satnom periodu. Cijeljenje rane in vitro izraženo je postotkom prekrivenosti površine praznine nastale namjernim oštećivanjem konfluentnog sloja stanica 48 sata nakon dvosatnog tretiranja stanica. Modelne rane tretirane su priređenim suspenzijama lecitinsko- kitozanskih nanočestica pri koncentraciji kitozana od 5 µgml-1. Kao kontrole korištene su otopine melatonina (5 µgml-1) i kitozana (5 µgml-1), te lecitinske nanočestice (100 µgml-1). Otopina melatonina i kitozana te suspenzije nanočestica razrijeđene su HBSS-om (pH 6,0). Prikazane su srednje vrijednosti ± SD (n=6). *Razlikuju se od netretiranih stanica inkubiranih u HBSS-u (P˂0,05).

43

Slika 8: Brzina cijeljenja modelnih rana nastalih namjernim oštećivanjem konfluentnog sloja HaCaT stanica te izloženih otopini kitozana C114, lecitinsko-kitozanskim nanočesticama pripravljenim s kitozanom C114 (LC114) te lecitinsko-kitozanskim nanočesticama s melatoninom pripravljenim s kitozanom C114 (MLC114) u usporedbi sa stanicama inkubiranim u HBSS-u (pH 6,0). Modelne rane tretirane su otopinom kitozana i suspenzijama lecitinsko-kitozanskih nanočestica pri koncentraciji kitozana od 5 µgml-1. Otopina kitozana te suspenzije nanočestica razrijeđene su HBSS-om (pH 6,0).

44

Utjecaj otopine melatonina na proliferaciju i migraciju HaCaT stanica ispitivan je pri

koncentracijama melatonina od 2,5 do 20 µgml-1. Brže cijeljenje modelne rane u odnosu na

kontrolu zabilježeno je jedino pri koncentraciji melatonina od 2,5 µgml-1 (postotak cijeljenja

rane in vitro nakon 48 h iznosio je 44,2 ± 10,4 %; Slika 9). Sadržaj melatonina u suspenzijama

lecitinsko-kitozanskih nanočestica kojima su stanice tretirane iznosio je približno 5 µgml-1. Pri

toj koncentraciji melatonina u otopini nije uočen utjecaj na cijeljenje rane in vitro u odnosu na

stanice inkubirane s HBSS-om.

HBSS 2,5 5 10 200

20

40

60

80

*

Koncentracija melatonina (mgml-1

)

Cijelje

nje

rane in v

itro

(%

)

Slika 9: Utjecaj otopine melatonina na cijeljenje rane (migraciju i proliferaciju HaCaT stanica) in vitro. Cijeljenje rane in vitro izraženo je postotkom prekrivenosti površine praznine nastale namjernim oštećivanjem konfluentnog sloja stanica 48 sati nakon dvosatnog tretiranja stanica. Otopina melatonina razrijeđena je HBSS-om (pH 6,0). Prikazane su srednje vrijednosti ± SD (n=6). *Razlikuje se od netretiranih stanica inkubiranih u HBSS-u (P˂0,05).

Za razliku od lecitinsko-kitozanskih nanočestica, otopine kitozana odgovarajuće

koncentracije usporile su proces cijeljenja rane in vitro u odnosu na stanice inkubirane s

HBSS-om (Slike 6, 7 i 8). Tako je 24 sata nakon tretiranja stanica otopinama kitozana C114 i

C214 prekrivenost praznine nastale namjernim oštećivanjem konfluentnog sloja stanica

iznosila redom 5,7 ± 2,0 i 4,1 ± 3,7 %, što je značajno manje u odnosu na stanice inkubirane

s HBSS-om (19,0 ± 8,2 %). Nadalje, 48 sati nakon tretiranja stanica otopinama kitozana C114,

C214 i C213 postotak cijeljenja rane in vitro iznosio je redom 9,4 ± 3,0, 10,8 ± 2,1 %, i

13,2 ± 4,8 % što je i dalje značajno manje u odnosu na stanice inkubirane s HBSS-om

(27,0 ± 7,2 %).

45

5. Rasprava

5.1. Lecitinsko-kitozanske nanočestice sa melatoninom uspješno su

pripravljene

Lecitinsko-kitozanske nanočestice s melatoninom uspješno su pripravljene metodom

ionotropnog geliranja kitozana i lecitina. Odabrana metoda priprave nanočestica pokazala se

primjenjivom u izradi nanočestica na bazi kitozana s mogućnošću uklapanja lipofilnih lijekova

poput melatonina [97]. Prednost je i u jednostavnosti i reproducibilnosti metode, a lecitin i

kitozan kao prirodne, biokompatibilne i biorazgradljive tvari, prikladni su za razvijanje

terapijskih sustava za sigurnu i ciljanu primjenu lijekova.

Kitozan je netopljiv u alkalnom i neutralnom mediju ali čini soli s organskim i anorganskim

kiselinama, primjerice s glutaminskom, kloridnom, octenom i mliječnom kiselinom. Soli

kitozana topljive su u vodi a topljivost im ovisi o stupnju deacetilacije (a time i o pKa vrijednosti

kitozana), i pH vrijednosti medija. Kitozani relativno niskog stupnja deacetilacije topljivi su pri

pH vrijednostima do 9, dok su kitozani sa stupnjem deacetilacije oko 85 % topljivi samo do pH

vrijednosti medija od 6,5. Topljivost kitozana također je uvjetovana koncentracijom soli u

otopini. Što je veća ionska jakost otopine to je topljivost kitozana manja [98].

Viskoznost kitozanskih otopina usko je povezana s molekulskom masom kitozana ali i sa

stupnjem deacetilacije. Što je veća molekulska masa kitozana, veća je i viskoznost otopine

kitozana. Usto, što je više slobodnih amino skupina u polimernom lancu kitozana, veća je i

mogućnost nastajanja vodikovih veza, a kao posljedica promjene u konformaciji molekule

povećava se viskoznost kitozanske otopine [98].

U pripravi lecitinsko-kitozanskih nanočestica korištena su četiri tipa kitozana (C113, C114,

C213 i C214) koji se međusobno razlikuju prema stupnju deacetilacije (75-90% ili > 90%; o

kojem, kao i o pH medija, ovisi gustoća naboja na polimernom lancu) i molekulskoj masi

(50 do 150 kDa ili 150 do 400 kDa; Tablica 1), svojstvima koja uvelike određuju njihova

biofarmaceutska svojstva.

Lecitin je smjesa prirodnih fosfolipida koji se često koristi u pripravi različitih terapijskih

nanosustava te se smatra sigurnim i biokompatibilnim ekscipijensom [97]. Kao lipofilni nosač,

omogućuje dobro uklapanje lipofilnih lijekova te njihovo produljeno oslobađanje [99].

Za pripravu lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom odabran je lecitin Lipoid S45

koji sadrži fosfatidilkolin (54,9%), fosfatidiletanolamin (16,9%), lizofosfatidilkolin (1,0%) te

masne kiseline čiji je sadržaj izražen u postotku u odnosu na ukupnu količinu masnih kiselina:

46

palmitinsku (18%), stearinsku (3%), oleinsku (10%), linoleinsku (60%), linolensku (5%); te

manji sadržaj triglicerida i DL-R-tokoferola (0,8%). Injektiranjem etanolne otopine lecitina

Lipoid S45 u vodeni medij nastaju lecitinske nanočestice negativnog površinskog naboja, dok

injektiranjem u vodenu otopinu kitozana nastaju lecitinsko-kitozanske nanočestice zahvaljujući

ionskoj interakciji između pozitivno nabijenih amino skupina kitozana i negativno nabijenih

sastavnica lecitina [97].

5.2. Uklapanje melatonina u nanočestice nije ovisilo o tipu kitozana

Uspješnost uklapanja lijeka odnosi se na sadržaj lijeka uklopljenog u nanočestice, izražen

u postotku prema ukupnoj količini lijeka u pripravku. Uspješnost uklapanja ovisi o fizičko-

kemijskim svojstvima lijeka (topljivost, hidrofilnost i kristaličnost), fizičko-kemijskim svojstvima

polimera (molekulska masa, hidrofobnost, interakcija s lijekom, topljivost), metodi priprave

nanočestica, masenom omjeru polimera i lijeka i korištenom otapalu [100].

Kako bi se odredila uspješnost uklapanja potrebno je odijeliti neuklopljeni lijek od

nanočestica s uklopljenim lijekom što se najčešće provodi ultracentrifugiranjem. Ta metoda

pokazala se neprimjenjivom za odjeljivanje neuklopljenog melatonina od lecitinsko-kitozanskih

nanočestica jer je uslijed djelovanja centrifugalne sile na pripravljene nanočestice došlo do

izraženog istjecanja uklopljenog melatonina [3]. Iz tog razloga u ovom radu odjeljivanje

nanočestica s uklopljenim lijekom provedeno je metodom dijalize.

Sadržaj uklopljenog lijeka može se izraziti kao postotni udio uklopljenog lijeka u odnosu na

ispitivanu količinu nanočestica (DL; Tablica 2), odnosno količinom uklopljenog lijeka

sadržanom u jediničnom volumenu suspenzije nanočestica (koncentracija melatonina u

suspenziji nanočestica, CM; Tablica 2).

S obzirom na tip ispitivanog terapijskog sustava, postignut je relativno velik sadržaj lijeka

u lecitinsko-kitozanskim nanočesticama (3,8 ± 0,3 % do 4,3 ± 0,4 %), koji odgovara

koncentraciji melatonina u suspenziji nanočestica u rasponu od 95,7 ± 7,1 do

109,2 ± 9,9 µgml-1. Usporedbom uspješnosti uklapanja melatonina u lecitinske i lecitinsko-

kitozanske nanočestice (Tablica 2) može se zaključiti da je uvođenje kitozana u sustav

pospiješilo uklapanje melatonina u nanočestice, neovisno o tipu kitozana u sustavu. Takvo

opažanje već je zabilježeno za nanočestice pripravljene s različitim tipovima lecitina i

kitozanom C113 [97].

47

Odjeljivanjem neuklopljenog lijeka od nanočestica s uklopljenim lijekom pripravljeni su

uzorci koji su korišteni u svim drugim ispitivanjima. Prije daljnje karakterizacije nanočestica

(određivanje veličine i površinskog naboja) dijalizirane suspenzije nanočestica su razrijeđene

vodom ili 10 mM otopinom NaCl. Vrijednosti pH u razrijeđenim dijaliziranim sustavima kretale

su se između 5,8-6,0. Poznavanje pH vrijednosti u mjerenim sustavima od velike je važnosti,

s obzirom da naboj i topljivost kitozana, a time i svojstva nanočestica, ovise o pH vrijednosti

medija u kojem su suspendirane [3].

5.3. Veličina i površinski naboj nanočestica ovise o stupnju

deacetilacije i molekulskoj masi kitozana

Veličina i polidisperznost nanočestica

Određivanje veličine čestica neizostavan je vid karakterizacije koloidnih disperzija. Uz

srednji promjer čestica neophodno je poznavati i indeks polidisperznosti koji predstavlja mjeru

širine raspodjele veličina čestica. Vrijednosti indeksa polidisperznosti kreću se od 0 za

monodisperzan sustav do 1 za potpuno heterodisperzan sustav. Koloidni sustavi s indeksom

polidisperznosti iznad 0,7 karakterizirani su vrlo širokom raspodjelom veličina čestica [101].

Veličina nanočestica mjerena je nakon odgovarajućeg razrjeđivanja suspenzija

pročišćenom vodom kako bi se izbjeglo višestruko raspršivanje svjetlosti uzrokovano velikom

koncentracijom nanočestica u uzorku [3]. Srednji promjeri lecitinsko-kitozanskih nanočestica s

melatoninom kretali su se između 245,2 ± 2,8 i 277,1 ± 7,6 nm. Lecitinske nanočestice s

melatoninom bile su srednjeg promjera od 96,8 ± 2,1 nm. Značajno veće vrijednosti srednjih

promjera čestica u sustavima pripravljenim s lecitinom i kitozanom u usporedbi s lecitinskim

nanočesticama upućuju na nastanak lecitinsko-kitozanskih nanočestica u svim miješanim

sustavima [97].

Usporedbom srednjih promjera praznih lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom

i odgovarajućih praznih lecitinsko-kitozanskih nanočestica može se zaključiti da je uklapanje

melatonina rezultiralo porastom promjera lecitinsko-kitozanskih nanočestica. Isto opažanje

objavljeno je već u literaturi za nanočestice s melatoninom pripravljene s lecitinom Lipoid S45

i kitozanom tipa C113 [97].

Veličina lecitinsko-kitozanskih nanočestica ovisila je o molekulskoj masi (50-150 kDa ili

150-400 kDa) i stupnju deacetilacije (75-90% ili > 90%) kitozana u pripravku. Tako su

48

nanočestice najvećeg srednjeg promjera pripravljene s kitozanom većeg stupnja deacetilacije

i veće molekulske mase (C214), dok su nanočestice najmanjeg srednjeg promjera pripravljene

s kitozanom manjeg stupnja deacetilacije i manje molekulske mase (C113). Ovisnost veličine

kitozanskih nanočestica pripravljenih metodom ionotropnog geliranja o molekulskoj masi i

stupnju deacetilacije već je opisana u literaturi [102, 103].

Većina uzoraka karakterizirana je relativno širokom raspodjelom veličina čestica na što

ukazuju vrijednosti indeksa polidisperznosti prikazane u Tablici 2. Slična polidisperznost

nanočestica pripravljenih s kitozanom ili derivatima kitozana česta je u literaturi te vjerojatno

proizlazi iz činjenice da je kitozan, kao prirodni polimer, smjesa lanaca različite molekulske

mase iz kojih nastaju nanočestice šireg raspona veličina [3].

Zeta-potencijal nanočestica

Površinski naboj nanočestica važno je svojstvo o kojem ovisi biokompatibilnost odnosno

biofarmaceutska aktivnost nanočestica u biološkom okruženju.

Slično kao i kod određivanja veličine nanočestica, zeta-potencijal je mjeren nakon

odgovarajućeg razrjeđivanja s 10 mM otopinom NaCl kako bi se izbjeglo višestruko

raspršivanje svjetlosti uzrokovano velikom koncentracijom nanočestica u uzorku [3].

Promjena vrijednosti zeta-potencijala od negativne za koloidnu suspenziju lecitina

(-34,3 ± 3,5 i 33,7 ± 2,8 mV redom za ML i L nanočestice) u pozitivne, za sve ispitivane

lecitinsko-kitozanske nanočestice (Tablica 2), upućuje na prisustvo pozitivno nabijenih amino

skupina kitozana na njihovoj površini. Naime, kitozan je pozitivno nabijen u otopinama pri pH

vrijednostima ispod pKa kitozana (~6,5). Kako se pH sustava približava pKa vrijednosti

kitozana, smanjuje se broj ioniziranih amino skupina kitozana [104].

Razlika u površinskom naboju sustava pripravljenih s različitim tipovima kitozana može se

pripisati različitim stupnjevima deacetilacije. Naime, pri većem stupnju deacetilacije, više je

slobodnih amino skupina koje se protoniraju u kiselim uvjetima [105, 106]. Tako su lecitinsko-

kitozanske nanočestice pripravljene s kitozanima C114 i C214 (stupanj deacetilacije > 90%)

bile pozitivnije nabijene od lecitinsko-kitozanskih nanočestica pripravljenih s kitozanima iste

molekulske mase ali manjeg stupnja deacetilacije (C113 i C213, stupanj deacetilacije 75-90%).

Najveći zeta-potencijal zabilježen je kod nanočestica pripravljenih s kitozanom većeg

stupnja deacetilacije i veće molekulske mase (C214; Tablica 2). Sličan lagani porast

49

zeta-potencijala pri povećanju molekulske mase kitozana zabilježen je u slučaju kitozanskih

nanočestica kao nosača siRNA nastalih ionskom interakcijom između pozitivno nabijenih

amino skupina kitozana i negativno nabijene siRNA [106]. Molekulska masa ne utječe izravno

na površinski naboj nanočestica kao što utječe stupanj deacetilacije kitozana, ali može utjecati

na hidrofilnost/hidrofobnost polimernog lanca, interakciju između lecitina i kitozana,

fleksibilnost i prostornu organizaciju lanaca na površini čestica, a time i na gustoću naboja na

površini čestica [107].

Pripravljene lecitinsko-kitozanske nanočestice karakterizirane su relativno velikim

površinskim nabojem, što je od posebne važnosti za stabilnost pripravljenih suspenzija jer vrlo

nabijene čestice ne podliježu agregaciji zbog izraženog električnog odbijanja [108].

Uklapanje melatonina nije značajnije utjecalo na zeta-potencijal lecitinsko-kitozanskih

nanočestica, iz čega se može zaključiti da je melatonin uklopljen u lecitinsku jezgru

nanočestica.

5.4. Melatonin se produljeno oslobađa iz nanočestica

Određivanje kinetike oslobađanja lijeka in vitro predstavlja važan korak u razvoju i kontroli

kvalitete koloidnih terapijskih sustava. Kinetika oslobađanja lijeka in vitro reflektira fizičko-

kemijska svojstva terapijskog sustava, moguće interakcije molekula lijeka i molekula nosača

te njihov utjecaj na brzinu i mehanizam oslobađanja lijeka [109].

Ispitivanje oslobađanja melatonina iz lecitinsko-kitozanskih nanočestica provedeno je

metodom dijalize uz acetatni pufer (pH 5,8) kao receptorski medij. Odabrana pH vrijednost

medija odgovarajuća je s obzirom na pH vrijednosti (5,8-6,0) pri kojima su određeni veličina i

površinski naboj nanočestica. Metode membranske difuzije smatraju se najprikladnijima za

određivanje kinetike oslobađanja lijeka in vitro iz nosača nanometarskih veličina. Ipak, drugi

uvjeti korištene metode neovisni su o stvarnoj primjeni sustava. Stoga na temelju dobivenih

rezultata nije bilo moguće predvidjeti profil oslobađanja lijeka in vivo. Metoda je prikladna za

provođenje ispitivanja koje ima za cilj usporediti pripravljene lecitinsko-kitozanske nanočestice

i utvrditi postoji li utjecaj tipa kitozana u pripravku na profil oslobađanja melatonina iz

pripravljenih nanočestica [3].

Za sve ispitivane lecitinsko-kitozanske nanočestice dobiven je sličan bifazični profil

produljenog oslobađanja melatonina koji je karakterističan za nosače nanometarskih veličina:

početno naglo oslobađanje (koje je posljedica velikog omjera ukupne površine prema

50

volumenu nanočestica) praćeno je sporijim (kontroliranim) oslobađanjem (Slika 3). Produljeno

oslobađanje lijeka osnovni je preduvjet za postizanje produljenog učinka lijeka. Pripravci s

produljenim oslobađanjem lijeka odlikuju se postizanjem jednoličnije koncentracije lijeka na

mjestu djelovanja, smanjenjem toksičnosti i nuspojava lijeka [109].

Kako je, pri postupku dijalize, pojava lijeka u receptorskom mediju posljedica dvaju

procesa: (a) oslobađanja lijeka iz nosača u kontinuiranu fazu u donorskom odjeljku i (b) difuzije

lijeka kroz dijalizacijsku membranu iz donorskog u receptorski odjeljak, svaki od ta dva procesa

može ograničavati brzinu dijalizacijskog procesa. S obzirom da je difuzija melatonina kroz

dijalizacijsku membranu u slučaju vodene otopine melatonina bila značajno brža nego u

slučaju ispitivanih nanočestica (Slika 3), može se zaključiti da je, u slučaju nanočestica, profil

oslobađanja melatonina određen oslobađanjem melatonina iz nanočestica u kontinuiranu fazu

a ne difuzijom kroz dijalizacijsku membranu.

Profili oslobađanja melatonina iz nanočestica pripravljenih s različitim tipovima kitozana

uspoređeni su upotrebom faktora sličnosti (engl. similarity factor, f2) koji određuje bliskost dvaju

profila. Ako vrijedi da je 50 < f2 < 100, uspoređeni profili smatraju se sličnim. Faktori sličnosti

pri usporedbi profila oslobađanja melatonina iz nanočestica pripravljenih s različitim tipovima

kitozana kretali su se između 69,8 i 87,7 potvrđujući sličnosti svih uspoređivanih profila

oslobađanja melatonina, neovisno o stupnju deacetilacije i molekulskoj masi kitozana u

pripravku (Tablica 3). Ovo zapažanje u skladu je s pretpostavkom da je melatonin uklopljen u

lecitinskoj jezgri nanočestica.

5.5. Lecitinsko-kitozanske nanočestice manje utječu na vijabilnost

stanica nego otopine kitozana

Pri razvoju terapijskog sustava s potencijalnim učinkom na cijeljenje rana neophodno je

procijeniti njegovu biokompatibilnost sa humanim stanicama kože in vitro.

Kitozan prianja na negativno nabijene površine pri pH vrijednostima manjim od 6,5, pri

kojima su amino skupine kitozana protonirane. Interakcije između polikationskog polimera

kitozana i negativno nabijene stanične površine mogu rezultirati promjenama u integritetu

stanične membrane i posljedično u permeabilnosti [79]. Iako se kitozan i njegovi derivati

smatraju manje toksičnim od drugih kationskih polimera kao što je polietilenimin [110], njegov

sigurnosni profil ovisi o tipu stanica korištenih pri ispitivanju biokompatibilnosti, stupnju

deacetilacije, molekulskoj masi, tipu soli i derivata [111, 112, 113, 114, 115].

51

U ovom radu za utvrđivanje potencijalnih negativnih učinaka lecitinsko-kitozanskih

nanočestica na vijabilnost stanica kože in vitro korištena je stanična linija humanih keratinocita

(HaCaT).

In vitro citotoksičnost lecitinsko-kitozanskih nanočestica ispitivana je praćenjem

metaboličke aktivnosti modelnih stanica nakon tretiranja suspenzijom nanočestica.

Metabolička aktivnost stanica mjerena je MTT testom i izražena je kao relativna u odnosu na

netretirane stanice inkubirane u HBSS-u (pH 6,0).

Ispitivanja citotoksičnosti provedena su ne samo zbog procjene biokompatibilnosti

pripravljenih lecitinsko-kitozanskih nanočestica sa stanicama kože nego i s ciljem određivanja

koncentracija nanočestica pri kojima ima smisla ispitivati učinak nanočestica na cijeljenje rane

in vitro.

Pri ispitivanju citotoksičnosti lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom, HaCaT

stanice tretirane su suspenzijama nanočestica razrijeđenim u HBSS-u, pri koncentraciji

kitozana u rasponu od 1,25 do 20 µgml-1, u trajanju od 2 sata. Uzimavši u obzir uspješnost

uklapanja melatonina u nanočestice, isti raspon koncentracija odgovara i koncentracijama

melatonina u razrijeđenim suspenzijama nanočestica. S obzirom na maseni omjer lecitina i

kitozana od 20:1, koncentracija lecitina u pripravljenim sustavima bila je u rasponu od

25 – 400 µgml-1.

Kitozan je istaknut kao ključna sastavnica sustava, s obzirom da o njegovim svojstvima

ovise površinska svojstva nanočestica, a posljedično i interakcija sa površinom stanica. Usto,

uzorci koji su korišteni kao kontrolni (otopina melatonina, lecitinske nanočestice, lecitinske

nanočestice s melatoninom) nisu utjecali na vijabilnost stanica (Slika 5).

Izlaganje stanica suspenzijama lecitinsko-kitozanskih nanočestica pri koncentraciji

kitozana u rasponu od 1,25 do 10 μgml-1 nije značajnije utjecalo na vijabilnost stanica,

neovisno o tipu korištenog kitozana (Slika 4; P ˃ 0,05). Značajno smanjenje vijabilnosti stanica

uočeno je tek pri tretiranju stanica suspenzijama nanočestica pri koncentraciji kitozana od

20 μgml-1. Suprotno tome, značajno smanjenje vijabilnosti stanica tretiranih otopinama

kitozana uočeno je i pri manjim koncentracijama, i to ovisno o stupnju deacetilacije kitozana.

Tako je pri tretiranju stanica otopinama kitozana manjeg stupnja deacetilacije

(75-90%; C113 i C213) značajno smanjenje vijabilnosti stanica uočeno pri koncentracijama

kitozana od 10 i 20 μgml-1 (P ˂ 0,05), dok je u slučaju kitozana većeg stupnja deacetilacije

(> 90%; C114 i C214) vijabilnost stanica značajno smanjena već pri koncentraciji kitozana od

5 μgml-1 (P ˂ 0,05). Veća toksičnost kitozana u otopini u odnosu na onaj inkorporiran u

nanosustav već je uočena na primjeru epitelnih stanica rožnice HCE-T [116]. Smanjenje

52

vijabilnosti stanica kao posljedica povećanja stupnja deacetilacije kitozana može se objasniti

većom gustoćom pozitivno nabijenih amino skupina i naglašenijom interakcijom sa staničnom

membranom [117]. Nije uočena ovisnost vijabilnosti stanica o molekulskoj masi kitozana.

Vijabilnost stanica izloženih lecitinsko-kitozanskim nanočesticama s melatoninom nije se

značajnije razlikovala od vijabilnosti stanica izloženih odgovarajućim praznim nanočesticama,

osim kada je u pripravi nanočestica korišten kitozan C214 (Slika 4). U tom slučaju, lecitinsko-

kitozanske nanočestice s melatoninom pri koncentracijama kitozana od 10 i 20 μgml-1 manje

su utjecale na vijabilnost stanica od odgovarajućih praznih nanočestica (Slika 4). S obzirom

da otopina melatonina u ispitivanom rasponu koncentracija nije utjecala na vijabilnost stanica,

to opažanje se djelomično može objasniti razlikom u veličini odgovarajućih praznih

nanočestica i nanočestica s melatoninom.

5.6. Lecitinsko-kitozanske nanočestice s melatoninom utječu na

epitelizaciju rane in vitro

Cijeljene rane je kompleksan proces koji uključuje interakcije različitih tipova stanica,

izvanstaničnog matriksa i različitih faktora rasta. Tijekom inflamatorne faze fibroblasti

kemotaksijom migriraju u područje rane gdje sintetiziraju i kasnije remodeliraju novi

izvanstanični matriks, u kojem je kolagen glavna sastavnica. Događaji u dermisu predstavljaju

samo jedan vid cijeljenja rane. Također i epidermis, površinski zaštitni sloj kože sastavljen od

nekoliko slojeva keratinocita, mora zacijeliti. Keratinociti iz bazalnog sloja migriraju iz područja

rubova rane i ozlijeđenih epidermalnih adneksa (folikula dlaka i žlijezda znojnica) u područje

rane, preko novonastalog dermalnog tkiva. Keratinociti zatim proliferiraju, raslojavaju se i

diferenciraju stvarajući novi epidermis koji prekriva ranu čime se obnavlja zaštitna funkcija

kože [44].

Stanične kulture fibroblasta i keratinocita koriste se kao in vitro modeli rane u preliminarnim

ispitivanjima biokompatibilnosti i potencijalnog učinka različitih tvari i inovativnih terapijskih

sustava na cijeljenje rane kroz učinak na proliferaciju i migraciju stanica [44, 118].

U ovom radu utjecaj lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom na proliferaciju i

migraciju keratinocita in vitro ispitivan je pri pH 6,0 koji je osiguran razrjeđivanjem suspenzija

nanočestica (pH 5,8-6,0) HBSS puferom navedene pH vrijednosti. Pri tim je uvjetima kitozan

pozitivno nabijen, a lecitinsko-kitozanske nanočestice, nastale uslijed ionske interakcije

kitozana s negativno nabijenim sastavnicama lecitina, stabilne. Istodobno, blago kiseli uvjeti u

području rane pogoduju cijeljenju rane sprječavajući/kontrolirajući infekciju rane, mijenjajući

53

aktivnost proteaza, utječući na oslobađanje kisika, smanjujući toksičnost razgradnih produkata

bakterija te potičući epitelizaciju i angiogenezu [119]. Također je utvrđeno da rane alkalnog pH

sporije cijele od rana čiji je pH bliži neutralnom.

Modelne rane tretirane su priređenim suspenzijama lecitinsko-kitozanskih nanočestica s

melatoninom te praznim lecitinsko-kitozanskim nanočesticama pri koncentraciji kitozana od

5 µgml-1. Kao kontrole korištene su otopine melatonina (5 µgml-1) i kitozana (5 µgml-1), te

lecitinske nanočestice (100 µgml-1).

Proliferacija/migracija stanica (cijeljenje rana) izražena je smanjenjem površine praznine

nastale namjernim oštećivanjem konfluentnog sloja stanica tj. postotkom prekrivenosti prvotno

formirane praznine, 24 i 48 sati nakon dvosatnog tretiranja stanica (Slike 6 i 7).

Utjecaj lecitinsko-kitozanskih nanočestica na cijeljenje rane in vitro ovisio je o molekulskoj

masi i stupnju deacetilacije kitozana u pripravku. Tako su veći učinak na cijeljenje rane in vitro

imale nanočestice pripravljene s kitozanima manje molekulske mase (MLC113 i MLC114).

Najbrže cijeljenje rane zapaženo je kod stanica tretiranih lecitinsko-kitozanskim

nanočesticama pripravljenim s kitozanom C114 koji osim manje molekulske mase, ima i veći

stupanj deacetilacije (Slika 8). Porast aktivnosti kitozana u biološkom okruženju pri većem

stupnju deacetilacije već je opažena [106, 107]. No, prema literaturnim navodima, najveći

učinak kitozana na cijeljenje rana in vivo zabilježen kod kitozana velikog stupnja deacetilacije

i velike molekulske mase [120]. Nedavnim istraživanjem učinka tioliranih kvaternih amonijevih

soli kitozana na cijeljenje rane in vitro također je utvrđen bolji učinak kitozana veće molekulske

mase, no to ispitivanje provedeno je na stanicama dermalnih fibroblasta [121]. Ispitivanja

utjecaja kitozana različite molekulske mase na proliferaciju i migraciju keratinocita nisu

dostupna u literaturi.

Od praznih lecitinsko-kitozanskih nanočestica, jedino su LC114 nanočestice značajno

ubrzale proces cijeljenja rane in vitro u odnosu na stanice inkubirane s HBSS-om i to u periodu

od 48 sati nakon tretiranja (Slike 7 i 8). Iz tih rezultata je razvidan pozitivan utjecaj melatonina

uklopljenog u nanočestice na proces proliferacije i migracije HaCaT stanica. Utjecaj otopine

melatonina na proliferaciju i migraciju HaCaT stanica ispitivan je pri koncentracijama

melatonina od 2,5 do 20 µgml-1 (Slika 9). Brže cijeljenje modelne rane u odnosu na kontrolu

zabilježeno je jedino pri koncentraciji melatonina od 2,5 µgml-1. Sadržaj melatonina u

suspenzijama lecitinsko-kitozanskih nanočestica kojima su stanice tretirane iznosio je približno

5 µgml-1. Bolji učinak lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom u odnosu na

odgovarajuće prazne nanočestice ukazuje na sinergijski učinak kitozana i melatonina. Usto,

produljeno oslobađanje melatonina iz nanočestica rezultiralo je postupnim porastom

54

koncentracije oslobođenog melatonina u mediju. Uzimajući u obzir rezultate ispitivanja in vitro

oslobađanja melatonina (Slika 3), za očekivati je da se tijekom dvosatnog tretiranja modelne

rane melatonin iz lecitinsko-kitozanskih nanočestica nije u potpunosti oslobodio.

Za razliku od lecitinsko-kitozanskih nanočestica, otopine kitozana odgovarajuće

koncentracije usporile su proces cijeljenja rane in vitro u odnosu na kontrolu (stanice

inkubirane s HBSS-om). Razlog tome vjerojatno je veća citotoksičnost kitozana u otopini u

odnosu na onaj inkorporiran u nanosustav [116]. Usto, ispitivanja su provedena pri pH 6,0 koji

odstupa od pH staničnog medija (7,4) što također pridonosi osjetljivosti tretiranih stanica.

Felice i suradnici [121] utvrdili su pozitivan učinak otopina tioliranih kvaternih amonijevih soli

kitozana (pri koncentraciji od 10 µgml-1) na proliferaciju i migraciju fibroblasta tijekom 24 satnog

ispitivanja. Korišteni derivati kitozana topljivi su u vodenom mediju pri većem rasponu pH, tako

da su otopine pripravljene u samom staničnom mediju. Također, pri tim ispitivanjima serum

nije u potpunosti uskraćen stanicama što također može utjecati na dobivene rezultate [44].

Howling i suradnici [42] ispitivali su utjecaj hitina i kitozana različitog stupnja deacetilacije,

ali slične molekulske mase, na proliferaciju humanih fibroblasta kože i keratinocita in vitro.

Zapaženo je da kitozani sa relativno visokim stupnjem deacetilacije snažno stimuliraju

proliferaciju fibroblasta, dok kitozani sa nižim stupnjem deacetilacije pokazuju slabiji učinak.

Stimulativni učinak na proliferaciju fibroblasta zahtijevao je prisutnost seruma u mediju.

Moguće objašnjenje je da se kitozan veže za komponente seruma poput heparina i faktora

rasta pa ima indirektan učinak na cijeljenje rana. Otopina kitozana je na humane keratinocite

imala inhibitorni učinak.

.

55

6. Zaključci

U ovom radu lecitinsko-kitozanske nanočestice s melatoninom uspješno su

pripravljene ionskom interakcijom između lecitina i kitozana. U pripravi nanočestica

korištena su četiri tipa kitozana koja se međusobno razlikuju po molekulskoj masi

(50-150 kDa ili 150-400 kDa) i/ili stupnju deacetilacije (75-90 % ili ˃90 %).

Pripravljene su nanočestice srednjeg promjera od 245,2±2,8 do 277,1±7,6 nm,

pozitivnog zeta-potencijala (23,4±0,9 do 32,5±1,2 mV) te zadovoljavajućeg sadržaja

melatonina (3,8±0,3 do 4,3±0,4 %).

Veličina i površinski naboj nanočestica ovisili su o molekulskoj masi i stupnju

deacetilacije kitozana.

Za sve ispitivane lecitinsko-kitozanske nanočestice dobiveni su slični bifazični profili

produljenog oslobađanja melatonina.

Izlaganje HaCaT stanica suspenzijama nanočestica s melatoninom pri koncentraciji

kitozana manjoj od 20 µgml-1 nije značajnije utjecalo na vijabilnost stanica, neovisno o

tipu korištenog kitozana. Pri tretiranju stanica otopinama kitozana manjeg stupnja

deacetilacije značajno smanjenje vijabilnosti stanica uočeno pri koncentracijama

kitozana od 10 i 20 μgml-1, dok je u slučaju kitozana većeg stupnja deacetilacije

vijabilnost stanica značajno smanjena već pri koncentraciji kitozana od 5 μgml-1.

Za razliku od otopina kitozana koje su usporavale cijeljenje (epitelizaciju) rane in vitro,

suspenzije lecitinsko-kitozanskih nanočestica odgovarajuće koncentracije kitozana

ubrzavale su navedeni proces. Učinak nanočestica na cijeljenje rane in vitro ovisio je o

sadržaju melatonina u nanočesticama i tipu kitozana korištenom u njihovoj pripravi.

Najbrže cijeljenje rane in vitro zabilježeno je kod modelne rane izložene nanočesticama

s melatoninom pripravljenima s kitozanom manje molekulske mase (50-150 kDa) i

većeg stupnja deacetilacije (˃90 %).

Primjenom in vitro modela rane omogućena je procjena i odabir nanočestica s najvećim

potencijalnim učinkom na cijeljenje (epitelizaciju) rane, što predstavlja znanstveno

vrijedan rezultat u području razvoja funkcionalnih obloga za rane. Daljnja procjena

terapijskog potencijala nanosustava uključivat će ispitivanje učinka na migraciju i

proliferaciju fibroblasta te ispitivanje antimikrobnog djelovanja.

56

7. Zahvale

Neizmjerno hvala našoj mentorici izv. prof. dr. sc. Aniti Hafner na pruženoj prilici, znanju i

brojnim savjetima te potpori i strpljenju prilikom izrade i pisanja ovog rada.

Veliko hvala doc. dr. sc. Jasmini Lovrić na strpljenju, savjetima i nesebičnoj pomoći koju nam

je pružila.

Hvala Marini Juretić, mag. pharm. na velikoj podršci, pomoći i savjetima.

Hvala Biseri Jurišić, mag. pharm. i kolegicama Mariji Matičević i Mateji Ljubičić na pruženoj

pomoći oko izrade eksperimentalnog dijela rada.

Hvala svim članovima Zavoda za farmaceutsku tehnologiju.

Hvala našim bližnjima na bezuvjetnoj podršci.

57

8. Popis literature

[1] P. Sánchez i M. J. Segundo, »Omega 7,« Nutrición, svez. 26, br. 7, pp. 58-64, 2007.

[2] I. Pepić, T. Sinovčić i J. Filipović-Grčić, “Hormonsko starenje kože,” Farmaceutski glasnik, br.

67, pp. 11-26, 2011.

[3] A. Hafner, Kitozansko-lecitinske nanočestice za nazalnu i (trans)dermalnu primjenu

melatonina, Doktorski rad, Zagreb, 2008.

[4] M. Čajkovac, Kozmetologija, 2. izdanje, Jastrebarsko: Naklada Slap, 2005.

[5] A. C. Guyton i J. E. Hall, Medicinska fiziologija, 10. izdanje, Zagreb: Medicinska naklada, 2003.

[6] P. E. Simon i A. D. Meyers, »Medscape.com,« 17 4 2014. [Mrežno]. Available:

http://emedicine.medscape.com/article/884594-overview. [Pokušaj pristupa 13 3 2015].

[7] M. Mercandetti i J. A. Molnar, »Medscape.com,« 12 3 2015. [Mrežno]. Available:

http://emedicine.medscape.com/article/1298129-overview#aw2aab6b6. [Pokušaj pristupa 13

3 2015].

[8] J. Drobnik, »Wound healing and the effect of pineal gland and melatonin,« Journal of

Experimental and Integrative Medicine, svez. 2, br. 1, pp. 3-14, 2012.

[9] R. Hardeland, »Melatonin Metabolism in the Central Nervous System,« Curr Neuropharmacol,

svez. 8, br. 3, p. 168–181, 2010.

[10] R. Hardeland, S. R. Pandi-Perumal i D. P. Cardinali, »Melatonin,« The International Journal of

Biochemistry & Cell Biology, svez. 38, pp. 313-316, 2006.

[11] D. X. Tan, L. C. Manchester, M. P. Terron, L. J. Flores i R. J. Reiter, »One molecule, many

derivatives: a never-ending interaction of melatonin with reactive oxygen and nitrogen

species?,« J. Pineal Res., br. 42, pp. 28-42, 2007.

[12] S. R. Pandi-Perumal, V. Srinivasan, G. J. Maestroni, D. P. Cardinali, B. Poeggeler i R. Hardeland,

»Melatonin: Nature's most versatile biological signal?,« FEBS J., br. 273, pp. 2813-2838, 2006.

[13] S. Mao, J. Chen, Z. Wei, H. Liu i D. Bi, »Intranasal administration of melatonin starch

microspheres,« br. 272, pp. 37-43, 2004.

[14] R. Hardeland, »Antioxidative protection by melatonin: multiplicity of mechanisms from radical

detoxification to radical avoidance,« Endocrine, svez. 27, br. 2, pp. 119-130, 2005.

[15] Z. Chen, C. Chau, J. Gao, K. Chua, Y. Ho, R. Hamdy i B. Chua, »Prevention of

ischemia/reperfusion induced cardiac apoptosis and injury by melaton is independent of

glutathione peroxidase 1,« J Pineal Res, br. 46, pp. 235-41, 2009.

[16] M. Karbownik i R. Reiter, »Antioxidative effects of melatonin in protection against cellular

damage caused by ionizing radiation,« Proc Soc Exp Biol Med, br. 225, pp. 9-22, 2005.

58

[17] M. Ozler, K. Simsek, C. Ozkan, E. O. Akgul, T. Topal, S. Oter i A. Korkmaz, »Comparison of the

effect of topical and systemic melatonin administration on delayed wound healing in rats that

underwent pinealectomy.,« Scand J Clin Lab Invest., svez. 70, br. 6, pp. 447-52, 2010.

[18] G. Soybir, C. Topuzlu, O. Odabaş, K. Dolay, A. Bilir i F. Köksoy, »The effect of melatonin on

angiogenesis and wound healing,« Surg. Today, br. 33, pp. 896-901, 2003.

[19] N. Bulbuller, O. Dogru, H. Yekeler, Z. Cetinkaya, N. Ilhan i C. Kirkil, »Effect of melatonin on

wound healing in normal and pinealectomized rats,« Journal of Surgical Research, svez. 123,

br. 1, pp. 3-7, 2005.

[20] J. Drobnik i R. Dabrowski, »Melatonin suppresses the pinealectomy-induced elevation of

collagen content in a wound.,« Cytobios, svez. 85, br. 340, pp. 51-8, 1996.

[21] J. Drobnik, K. Owczarek, L. Piera, D. Tosik, S. Olczak, J. Ciosek i E. Hrabec, »Melatonin-induced

augmentation of collagen deposition in cultures of fibroblasts and myofibroblasts is blocked

by luzindole – a melatonin membrane receptors inhibitor,« Pharmacological Reports, svez. 65,

br. 3, p. 642–649, 2013.

[22] A. Carossino, A. Lombardi, M. Matucci-Cerinic, A. Pignone i M. Cagnoni, »Effect of melatonin

on normal and sclerodermic skin fibroblast proliferation.,« Clin Exp Rheumatol., svez. 14, br. 5,

pp. 493-8, 1996.

[23] J. Drobnik i R. Dabrowski, »The opposite effect of morning or afternoon application of

melatonin on collagen accumulation in the sponge-induced granuloma.,« Neuro Endocrinol

Lett., svez. 21, br. 3, pp. 209-212, 2000.

[24] K. Pugazhenthi i suradnici, »Melatonin accelerates the process of wound repair in full-

thickness incisional wounds,« J Pineal Res., svez. 44, br. 4, pp. 387-396, 2008.

[25] F. Radogna, M. Diederich i L. Ghibelli, »Melatonin: A pleiotropic molecule regulating

inflammation,« Biochemical Pharmacology, svez. 80, br. 12, pp. 1844-1852, 2010.

[26] M. Gómez-Florit, J. M. Ramis i M. Monjo, »Anti-fibrotic and anti-inflammatory properties of

melatonin on human,« Biochemical Pharmacology, svez. 86, br. 12, p. 1784–1790, 2013.

[27] G. Sener, G. Sert, S. A. Ozer, S. Arbak, N. Gedik i G. Ayanoğlu-Dülger, »Melatonin protects

against pressure ulcer-induced oxidative injury of the skin and remote organ in rats,« J. Pineal

Res., br. 40, pp. 280-287, 2006.

[28] S. Sidhu, P. Pandhi, S. Malhotra, K. Vaiphei i K. L. Khanduja, »Melatonin treatment is beneficial

in pancreatic repair process after experimental acute pancreatitis,« European Journal of

Pharmacology, svez. 628, br. 1-3, p. 282–289, 2010.

[29] O. F. Tekbas, R. Ogur, A. Korkmaz, A. Kilic i R. J. Reiter, »Melatonin as an antibiotic: new

insights into the actions of this ubiquitous molecule.,« J Pineal Res, svez. 44, br. 2, pp. 222-6,

2008.

59

[30] M. Rinaudo, »Chitin and chitosan: Properties and applications,« Progress in Polymer Science,

svez. 31, br. 7, p. 603–632, 2006.

[31] M. Saehum, E. A. Decker i J. McClements, »Effect of molecular weight and degree of

deacetylation of chitosan on the formation of oil-in-water emulsions stabilized by surfactant–

chitosan membranes,« Journal of Colloid and Interface Science, br. 296, pp. 581-590, 2006.

[32] P. B. Malafaya, »Natural–origin polymers as carriers and scaffolds for biomolecules and cell

delivery in tissue engineering applications,« Advanced Drug Delivery Reviews, svez. 59, br. 4-5,

pp. 207-233, 2007.

[33] M. Saehum, E. A. Decker i J. McClements, »Effect of molecular weight and degree of

deacetylation of chitosan on the formation of oil-in-water emulsions stabilized by surfactant–

chitosan membranes,« Journal of Colloid and Interface Science, br. 296, pp. 581-590, 2006.

[34] G. Meera i E. Abraham, »Polyionic hydrocolloids for the intestinal delivery of protein drugs:

Alginate and chitosan — a review,« Journal of Controlled Release, svez. 114, br. 1, pp. 1-14,

2006.

[35] M. Juma, F. H. Furkertb i B. W. Müller, »A new lipid emulsion formulation with high

antimicrobial efficacy using chitosan,« European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics, svez. 53, br. 1, pp. 115-123, 2002.

[36] G. Zhanyong i suradnici, »Novel derivatives of chitosan and their antifungal activities in vitro,«

Carbohydrate Research, svez. 341, br. 3, pp. 351-354, 2006.

[37] G. Pujals i suradnici, »In vitro evaluation of the effectiveness and cytotoxicity of meglumine

antimoniate microspheres produced by spray drying against Leishmania infantum,«

Parasitology Research, svez. 102, br. 6, pp. 1243-1247, 2008.

[38] T. Keana i M. Thanou, »Biodegradation, biodistribution and toxicity of chitosan,« Advanced

Drug Delivery Reviews, svez. 62, br. 1, pp. 3-11, 2010.

[39] T. Minagawa, Y. Okamura, Y. Shigemasa, S. Minami i Y. Okamoto, »Effects of molecular weight

and deacetylation degree of chitin/chitosan on wound healing,« Carbohydrate Polymers, svez.

67, br. 4, pp. 640-644, 2007.

[40] R. W. Millner, A. S. Lockhart, H. Bird i A. C, »A new hemostatic agent: initial life-saving

experience with Celox (chitosan) in cardiothoracis surgery,« Ann Thorac Surg, svez. 87, br. 2,

pp. e13-e14, 2009.

[41] S. Minami, Y. Okamoto i S. Tanioka, »Effects of chitosan on wound healing. In Carbohydrates

and Carbohydrate Polymer,,« u ATL Press, Illinois, 1993.

[42] T. Mori, M. Okumura, M. Matsuura, K. Ueno, S. Tokura, Y. Okamoto, S. Minami i T. Fujinaga,

»Effect of chitin and its derivatives on the proliferation and cytokine production of fibroblasts

in vitro,« Biomaterials, svez. 18, br. 13, pp. 947-51, 1997.

60

[43] G. Peluso i suradnici, »Chitosan-mediated stimulation of macrophage function,« Biomaterials,

svez. 15, br. 15, pp. 1215-1220, 1994.

[44] G. I. Howling, P. W. Dettmar, P. A. Goddard, F. C. Hampson, M. Dornish i E. J. Wood, »The

effect of chitin and chitosan on the proliferation of human skin,« Biomaterials, svez. 22, pp.

2959-2966, 2001.

[45] T. C. Santos, A. P. Marques, S. S. Silva, J. M. Oliveira, J. F. Mano, A. G. Castro i R. L. Reis, »In

vitro evaluation of the behaviour of human polymorphonuclear neutrophils in direct contact

with chitosan-based membranes.,« J Biotechnol., svez. 132, br. 2, pp. 218-226, 2007.

[46] P. Niethammer, C. Grabher, T. A. Look i T. J. Mitchison, »A tissue-scale gradient of hydrogen

peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish,« Nature, svez. 459, br. 7249, pp. 996-

999, 2009.

[47] K. Hensley, K. A. Robinson, S. P. Gabbita, S. Salsman i R. A. Floyd, »Reactive oxygen species,

cell signaling, and cell injury,« Free Radical Biology and Medicine, svez. 28, br. 10, p. 1456–

1462, 2000.

[48] H. Yao, L. Guo, B. H. Jiang, J. Luo i X. Shi, »Oxidative stress and chromium(VI) carcinogenesis,« J

Environ Pathol Toxicol Oncol, svez. 27, br. 2, pp. 77-88, 2008.

[49] H. Ueno, M. Murakami, M. Okumura, T. Kadosawa, T. Uede i T. Fujinaga, »Chitosan

accelerates the production of osteopontin from polymorphonuclear leukocytes,«

Biomaterials, svez. 22, br. 12, p. 1667–1673, 2001.

[50] J. Sodek, B. Ganss i M. D. McKee, »Osteopontin.,« Crit Rev Oral Biol Med, svez. 11, br. 3, pp.

279-303, 2000.

[51] T. Dai, M. Tanaka, Y. Y. Huang i M. R. Hamblin, »Chitosan preparations for wounds and burns:

antimicrobial and wound-healing effects.,« Expert Rev Anti Infect Ther., svez. 9, br. 7, pp. 857-

79, 2011.

[52] L. Qi, »Preparation and antibacterial activity of chitosan nanoparticles,« Carbohydrate

Research, svez. 339, br. 16, p. 2693–2700, 2004.

[53] K. Xing, X. G. Chen, C. S. Liu, D. S. Cha i H. J. Park, »Oleoyl-chitosan nanoparticles inhibits

Escherichia coli and Staphylococcus aureus by damaging the cell membrane and putative

binding to extracellular or intracellular targets,« International Journal of Food Microbiology,

svez. 132, br. 2-3, pp. 127-133, 2009.

[54] A. J. Huh i Y. J. Kwon, »“Nanoantibiotics”: A new paradigm for treating infectious diseases

using nanomaterials in the antibiotics resistant era,« Journal of Controlled Release, svez. 156,

br. 2, p. 128–145, 2011.

[55] H. Tang, P. Zhang, T. L. Kieft, S. J. Ryan, S. M. Baker, W. P. Wiesmann i S. Rogelj, »Antibacterial

action of a novel functionalized chitosan-arginine against Gram-negative bacteria,« Acta

Biomaterialia, svez. 6, br. 7, p. 2562–2571, 2010.

61

[56] R. Y. Pelgrift i A. J. Friedman, »Nanotechnology as a therapeutic tool to combat microbial

resistance,« Advanced Drug Delivery Reviews, svez. 65, br. 13-14, p. 1803–1815, 2013.

[57] R. C. Goy, D. de Britto i B. Odilio, »A review of the antimicrobial activity of chitosan,«

Polímeros, svez. 19, br. 3, pp. 241-247, 2009.

[58] R. C. Rowe, P. J. Sheskey i S. C. Owen, »Lecithin,« u Handbook of Pharmaceutical Excipients,

5th edition, London, Chicago, Pharmaceutical Press and American Pharmacists Association,

2006, pp. 409-412.

[59] U. Congress, »Infant formula act of 1980,« Public Law 96-359, 1980.

[60] M. Imran, A.-M. Revol-Junelles, C. Paris, E. Guedon, M. Linder i S. Desobry, »Liposomal

nanodelivery systems using soy and marine lecithin to encapsulate food biopreservative

nisin,« LWT - Food Science and Technology, svez. 62, br. 1, p. 341–349, 2015.

[61] B. Mysliwa-Kurdziel, J. Kruk i K. Strzałka, »Protochlorophyllide and protochlorophyll in model

membranes — An influence of hydrophobic side chain moiety,« Biochimica et Biophysica Acta

(BBA) - Biomembranes, svez. 1828, br. 3, p. 1075–1082, 2013.

[62] A. I. Pérez-Molina i suradnici, »Thermodynamics of laminarinase partitioning in soya lecithin

liposomes and their storage stability,« Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, svez. 72,

br. 1, p. 65–72, 2011.

[63] Y. Tan, J. Qi, Y. Lu, F. Hu, Z. Yin i W. Wu, »Lecithin in mixed micelles attenuates the cytotoxicity

of bile salts in Caco-2 cells,« Toxicology in Vitro, svez. 27, br. 2, p. 714–720, 2013.

[64] »Drugs.com,« [Mrežno]. Available: http://www.drugs.com/npc/lecithin.html. [Pokušaj

pristupa 8 4 2015].

[65] J. H. Growdon, A. J. Gelenberg, J. Doller, M. J. Hirsch i W. R. J, »Lecithin can suppress tardive

dyskinesia.,« N Engl J Med, svez. 298, br. 18, pp. 1029-30, 1978.

[66] K. Nagpal, S. K. Singh i D. N. Mishra, »Chitosan nanoparticles: a promising system in novel drug

delivery.,« Chem Pharm Bull (Tokyo)., svez. 58, br. 11, pp. 1423-30, 2010.

[67] P. V. Baptista, G. Doria, P. Quaresma, M. Cavadas, C. Neves, I. Gomes, P. Eaton, E. Pereira i R.

Franco, »Chapter 11 – Nanoparticles in Molecular Diagnostics,« Progress in Molecular Biology

and Translational Science, svez. 104, p. 427–488, 2011.

[68] P. Talapan-Manikoth, T. E. Tungaraza i R. Jenkins, »The Role of Oral Controlled-Release

Formulations in the Passage of Empty Intact Shells in Faeces,« Ther Adv in Drug Safe, svez. 4,

br. 2, pp. 63-71, 2013.

[69] C. Triller, D. Huljev i D. M. Smrke, »Primjena suvremenih obloga u liječenju kroničnih rana,«

Acta medica Croatica, svez. 66, br. 1, pp. 65-70, 2012.

62

[70] N. Mayet, Y. E. Choonara, P. Kumar, L. K. Tomar, C. Tyagi, L. C. Du Toit i V. Pillay, »A

Comprehensive Review of Advanced Biopolymeric Wound Healing Systems,« Journal of

Pharmaceutical Sciences, svez. 103, br. 8, pp. 2211-2230, 2014.

[71] J. Bertoncelj, J. Pelipenko, J. Kristl, M. Jeras, M. Cukjati i P. Kocbek, »Development and

bioevaluation of nanofibers with blood-derived growth factors for dermal wound healing,«

Eur J Pharm Biopharm, svez. 88, br. 1, pp. 64-74, 2014.

[72] J. Pelipenko, P. Kocbek, B. Govedarica, R. Rošic, S. Baumgartner i J. Kristl, »The topography of

electrospun nanofibers and its impact on the growth and mobility of keratinocytes,« Eur J

Pharm Biopharm, svez. 84, br. 2, pp. 401-11, 2013.

[73] L. Zhang, F. X. Gu, J. M. Chan, A. Z. Wang, R. S. Langer i O. C. Farokhzad, »Nanoparticles in

medicine: therapeutic applications and developments.,« Clin Pharmacol Ther, svez. 83, br. 5,

pp. 761-9, 2008.

[74] L. Zhang, D. Pornpattananangku, C. M. Hu i C. M. Huang, »Development of nanoparticles for

antimicrobial drug delivery.,« Curr Med Chem, svez. 17, br. 6, pp. 585-94, 2010.

[75] J. W. Costerton, P. S. Stewart i E. P. Greenberg, »Bacterial biofilms: a common cause of

persistent infections.,« Science, svez. 284, br. 5418, pp. 1318-22, 1999.

[76] K. Forier, K. Raemdonck, S. C. De Smedt, J. Demeester, T. Coenye i K. Braeckmans, »Lipid and

polymer nanoparticles for drug delivery to bacterial biofilms.,« J Control Release, svez. 190,

pp. 607-23, 2014.

[77] E. Cevher, Z. Orhan, L. Mülazimoğlu, D. Sensoy, M. Alper, A. Yildiz i Y. Ozsoy, »Characterization

of biodegradable chitosan microspheres containing vancomycin and treatment of

experimental osteomyelitis caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus with

prepared microspheres.,« Int J Pharm, svez. 317, br. 2, pp. 127-35, 2006.

[78] R. Y. Pelgrift i A. J. Friedman, »Nanotechnology as a therapeutic tool to combat microbial

resistance,« Advanced Drug Delivery Reviews, svez. 65, br. 13-14, p. 1803–1815, 2013.

[79] A. J. Friedman, J. Phan, D. O. Schairer, J. Champer, M. Qin, A. Pirouz, K. Blecher-Paz, A. Oren, P.

T. Liu, R. L. Modlin i J. Kim, »Antimicrobial and anti-inflammatory activity of chitosan-alginate

nanoparticles: a targeted therapy for cutaneous pathogens,« J Invest Dermatol, svez. 133, br.

5, pp. 1231-9, 2013.

[80] J. Antonioua, F. Liua, H. Majeeda, J. Qia, W. Yokoyamab i F. Zhong, »Physicochemical and

morphological properties of size-controlled chitosan–tripolyphosphate nanoparticles,«

Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, svez. 465, pp. 137-146,

2015.

[81] L. Yin, D. J. C. He, L. Cui, C. Tang i C. Yin, »Drug permeability and mucoadhesion properties of

thiolated trimethyl chitosan nanoparticles in oral insulin delivery,« Biomaterials, svez. 30, br.

29, p. 5691–5700, 2009.

63

[82] A. Dube, J. A. Nicolazzo i I. Larson, »Chitosan nanoparticles enhance the intestinal absorption

of the green tea catechins (+)-catechin and (−)-epigallocatechin gallate,« European Journal of

Pharmaceutical Sciences, svez. 41, br. 2, pp. 219-225, 2010.

[83] Y. Luo, Z. Teng, Y. Lib i Q. Wang, »Solid lipid nanoparticles for oral drug delivery: Chitosan

coating improves stability, controlled delivery, mucoadhesion and cellular uptake,«

Carbohydrate Polymers, svez. 122, pp. 221-229, 2015.

[84] A. K. Singla i M. Chawla, »Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects--an update.,«

J Pharm Pharmacol., svez. 53, br. 8, pp. 1047-67, 2001.

[85] D. Bento, H. F. Staats, T. Gonçalves i O. Borges, »Development of a novel adjuvanted nasal

vaccine: C48/80 associated with chitosan nanoparticles as a path to enhanced mucosal

immunity,« European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2015.

[86] Y. S. Chhonker, Y. D. Prasad, H. Chandasana, A. Vishvkarma, M. K. P. K. Shukla i R. S. Bhatta,

»Amphotericin-B entrapped lecithin/chitosan nanoparticles for prolonged ocular application,«

International Journal of Biological Macromolecules, svez. 72, p. 1451–1458, 2015.

[87] T. Gratieri, G. M. Gelfuso, O. de Freitas, E. M. Rocha i R. F. Lopez, »Enhancing and sustaining

the topical ocular delivery of fluconazole using chitosan solution and poloxamer/chitosan in

situ forming gel,« European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, svez. 79, br. 2, p.

320–327, 2011.

[88] M. C. Bonferoni, G. Sandri, E. Dellera, S. Rossi, F. Ferrari, M. Mori i C. Caramella, »Ionic

polymeric micelles based on chitosan and fatty acids and intended for wound healing.

Comparison of linoleic and oleic acid,« European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics, svez. 87, br. 1, p. 101–106, 2014.

[89] A. Gopal, V. Kant, A. Gopalakrishnan, S. K. Tandan i D. Kumar, »Chitosan-based copper

nanocomposite accelerates healing in excision wound model in rats,« European Journal of

Pharmacology, svez. 731, p. 8–19, 2014.

[90] D. Archanaa, J. Dutta i P. K. Dutta, »Evaluation of chitosan nano dressing for wound healing:

Characterization, in vitro and in vivo studies,« International Journal of Biological

Macromolecules, svez. 57, p. 193–203, 2013.

[91] D. Archana, B. K. Singh, J. Dutta i P. K. Dutta, »Chitosan-PVP-nano silver oxide wound dressing:

In vitro and in vivo evaluation,« International Journal of Biological Macromolecules, svez. 73,

p. 49–57, 2015.

[92] M. B. N, R. T. A, G. T i G. M. Gelfuso, »Chitosan nanoparticles for targeting and sustaining

minoxidil sulphate delivery to hair follicles,« Macromolecules, svez. 75, p. 225–229, 2015.

[93] J. J. Wang, Z. W. Zeng, R. Z. Xiao, T. Xie, G. L. Zhou, X. R. Zhan i S. L. Wang, »Recent advances of

chitosan nanoparticles as drug carriers,« International Journal of Nanomedicine, svez. 6, p.

765–774, 2011.

64

[94] S. A. Agnihotri, N. N. Mallikarjuna i T. M. Aminabhavi, »Recent advances on chitosan-based

micro- and nanoparticles in drug delivery,« Journal of Controlled Release, svez. 100, br. 1, p.

5–28, 2004.

[95] J. H. Park i suradnici, »Self-assembled nanoparticles based on glycol chitosan bearing

hydrophobic moieties as carriers for doxorubicin: In vivo biodistribution and anti-tumor

activity,« Biomaterials, svez. 27, br. 1, p. 119–126, 2006.

[96] R. Hardeland, D. R. Cardinali, V. Srinivasan, D. W. Spence, G. M. Brown i S. R. Pandi-Perumal,

»Melatonin—A pleiotropic, orchestrating regulator molecule,« Progress in Neurobiology, svez.

93, br. 3, p. 350–384, 2011.

[97] A. Hafner, J. Lovrić, D. Voinovich i J. Filipović-Grčić, »Melatonin-loaded lecithin/chitosan

nanoparticles: Physicochemical characterisation and permeability through Caco-2 cell

monolayers,« International Journal of Pharmaceutics, svez. 381, br. 2, p. 205–213, 2009.

[98] L. Illum, »Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient,« Pharm Res., svez. 15, br. 9, pp.

1326-31, 1998.

[99] R. S. Bhatta, H. Chandasana, Y. S. Chhonker, C. Rathi, D. Kumar, K. Mitra i P. K. Shukla,

»Mucoadhesive nanoparticles for prolonged ocular delivery of natamycin: In vitro and

pharmacokinetics studies,« Int J Pharm, svez. 432, br. 1-2, pp. 105-12, 2012.

[100] S. S. Chakravarthi i D. H. Robinson, »Biodegradable Nanoparticles,« Pharmaceutical

Manufacturing: Production and Processes, pp. 535-564, 2008.

[101] P. W. Lee, S. F. Peng, C. J. Su, F. L. Mi, H. L. Chen, M. C. Wei, H. J. Lin i H. W. Sung, »The use of

biodegradable polymeric nanoparticles in combination with a low-pressure gene gun for

transdermal DNA delivery,« Biomaterials, svez. 29, br. 6, pp. 742-751, 2008.

[102] M. Luangtana-anan, P. Opanasopit, T. Ngawhirunpat, J. Nunthanid, P. Sriamornsak, S.

Limmatvapirat i L. Y. Lim, »Effect of chitosan salts and molecular weight on a nanoparticulate

carrier for therapeutic protein,« Pharm Dev Technol, svez. 10, br. 2, pp. 189-96, 2005.

[103] A. Sarwar, H. Katas i N. M. Zin, »Antibacterial effects of chitosan–tripolyphosphate

nanoparticles: impact of particle size molecular weight,« Journal of Nanoparticle Research,

svez. 16, br. 7, p. 2517, 2014.

[104] F. Sonvico, A. Cagnani, A. Rossi, S. Motta, M. T. Di Bari, F. Cavatorta, M. J. Alonso, A. Deriu i P.

Colombo, »Formation of self-organized nanoparticles by lecithin/chitosan ionic interaction,«

International Journal of Pharmaceutics, svez. 324, br. 1, pp. 67-73, 2006.

[105] C. Schatz, C. Pichot, T. Delair, C. Viton i A. Domard, »Static Light Scattering Studies on Chitosan

Solutions:  From Macromolecular Chains to Colloidal Dispersions,« Langmuir, svez. 19, br. 23,

p. 9896–9903, 2003.

[106] X. Liu, K. A. Howard, M. Dong, M. Ø. Andersen, U. L. Rahbek, M. G. Johnsen, O. C. Hansen, F.

Besenbacher i J. Kjems, »The influence of polymeric properties on chitosan/siRNA

nanoparticle formulation and gene silencing,« Biomaterials, svez. 28, br. 6, pp. 1280-8, 2007.

65

[107] R. Novoa-Carballal, R. Riguera i E. Fernandez-Megia, »Chitosan hydrophobic domains are

favoured at low degree of acetylation and molecular weight,« Polymer, svez. 54, br. 8, p.

2081–2087, 2013.

[108] B. Heurtault, P. Saulnier, B. Pech, J. E. Proust i J. P. Benoi, »Physico-chemical stability of

colloidal lipid particles,« Biomaterials, svez. 24, br. 23, pp. 4283-300, 2003.

[109] A. Hafner, A. Karković Marković, N. Ferić i J. Filipović-Grčić, »Oslobađanje lijekova iz koloidnih

terapijskih sustava in vitro,« Farmaceutski glasnik, svez. 69, pp. 603-614, 2013.

[110] M. Amidi, S. G. Romeijn, G. Borchard, H. E. Junginger i W. E. Hennink, »Preparation and

characterization of protein-loaded N-trimethyl chitosan nanoparticles as nasal delivery

system,« J Control Release., svez. 111, br. 1-2, pp. 107-16, 2006.

[111] P. Baldrick, »The safety of chitosan as a pharmaceutical excipient,« Regul Toxicol Pharmacol,

svez. 56, br. 3, pp. 290-9, 2010.

[112] B. Carreño-Gómez i R. Duncan, »Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and

chitosan microspheres,« International Journal of Pharmaceutics, svez. 148, br. 2, pp. 231-240,

1997.

[113] S. Y. Chae, M. K. Jang i J. W. Nah, »Influence of molecular weight on oral absorption of water

soluble chitosans,« J Control Release, svez. 102, br. 2, pp. 283-94, 2005.

[114] P. Opanasopit, P. Aumklad, J. Kowapradit, T. Ngawhiranpat, A. Apirakaramwong, T. Rojanarata

i S. Puttipipatkhachorn, »Effect of salt forms and molecular weight of chitosans on in vitro

permeability enhancement in intestinal epithelial cells (Caco-2),« Pharm Dev Technol, svez. 12,

br. 5, pp. 447-55, 2007.

[115] C. Wiegand, D. Winter i U. C. Hipler, »Molecular-weight-dependent toxic effects of chitosans

on the human keratinocyte cell line HaCaT,« Skin Pharmacol Physiol, svez. 23, br. 3, pp. 164-

70, 2010.

[116] A. Hafner, J. Lovrić, M. Duvnjak Romić, M. Juretić, I. Pepić, B. Cetina-Čižmek i J. Filipović-Grčić,

»Evaluation of cationic nanosystems with melatonin using an eye-related bioavailability

prediction model,« European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2015.

[117] M. Huang, E. Khor i L.-Y. Lim, »Uptake and Cytotoxicity of Chitosan Molecules and

Nanoparticles: Effects of Molecular Weight and Degree of Deacetylation,« Pharmaceutical

Research, svez. 21, br. 2, pp. 344-353, 2004.

[118] M. Shrimanker, Patel, N, H. Modi i R. Dave, »A review: Screening Models for Wound Healing

Activity in Animals,« American Journal od PharmTech Research, svez. 3, br. 3, pp. 237-251,

203.

[119] B. S. Nagoba, N. M. Suryawanshi, B. Wadher i S. Selkar, »Acidic Environment and Wound

Healing: A Review,« WOUNDS, svez. 27, br. 1, pp. 5-11, 2015.

66

[120] I. A. Alsarra, »Chitosan topical gel formulation in the management of burn wounds,« Int J Biol

Macromol, svez. 45, br. 1, pp. 16-21, 2009.

[121] F. Felice, Y. Zambito, E. Belardinelli, A. Fabiano, T. Santoni i R. Di Stefano, »Effect of different

chitosan derivatives on in vitro scratch wound assay: A comparative study,« International

Journal of Biological Macromolecules, svez. 76, pp. 236-241, 2015.

[122] M. H. El-Shabouri, »Positively charged nanoparticles for improving the oral bioavailability of

cyclosporin-A,« Positively charged nanoparticles for improving the oral bioavailability of

cyclosporin-A, svez. 249, br. 1-2, p. 101–108, 2002.

[123] R. Jayaraman, »Antibiotic resistance: An overview of mechanisms and a paradigm shift,« Curr.

Sci., svez. 96, br. 11, pp. 1475-1484, 2009.

[124] K. Blecher, A. Nasir i A. Friedman, »The growing role of nanotechnology in combating

infectious disease,« Virulence, svez. 2, br. 5, pp. 395-401, 2011.

[125] A. J. Friedman, G. Han, M. S. Navati, M. Chacko, L. Gunther, A. Alfieri i J. M. Friedman,

»Sustained release nitric oxide releasing nanoparticles: Characterization of a novel delivery

platform based on nitrite containing hydrogel/glass composites,« Nitric Oxide, svez. 19, br. 1,

pp. 12-20, 2008.

[126] M. Juma, F. H. Furkertb i B. W. Müller, »A new lipid emulsion formulation with high

antimicrobial efficacy using chitosan,« European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics, svez. 53, br. 1, pp. 115-123, 2002.

[127] M. L. W. Knetsch i L. H. Koole, »New Strategies in the Development of Antimicrobial Coatings:

The Example of Increasing Usage of Silver and Silver Nanoparticles,« Polymers, svez. 3, br. 1,

pp. 340-366, 2011.

[128] H. Kobayashi, A. Kromminga, T. W. Dunlop, B. Tychsen, F. Conrad, N. Suzuki, A. Memezawa, A.

Bettermann, S. Aiba, C. Carlberg i R. Paus, »A role of melaronin in neuroectodermal-

mesodermal interactions: the hair follicle synthesizes melatonin and expresses functional

melatonin receptors,« FASEB J., br. 19, pp. 1710-1712, 2005.

[129] C. M. Lotufo, C. E. Yamashita, S. H. Farsky i R. P. Markus, »Melatonin effect on endothelial cells

reduces vascular permeability increase induced by leukotriene B4,« Eur. J. Pharmacol., br. 534,

pp. 258-263, 2006.

[130] P. B. Malafaya, »Natural–origin polymers as carriers and scaffolds for biomolecules and cell

delivery in tissue engineering applications,« Advanced Drug Delivery Reviews, svez. 59, br. 4-5,

pp. 207-233, 2007.

[131] G. Meera i E. Abraham, »Polyionic hydrocolloids for the intestinal delivery of protein drugs:

Alginate and chitosan — a review,« Journal of Controlled Release, svez. 114, br. 1, pp. 1-14,

2006.

[132] D. O. Schairer, J. S. Chouake, J. D. Nosanchuk i A. J. Friedman, »The potential of nitric oxide

releasing therapies as antimicrobial agents,« Virulence, svez. 3, br. 3, p. 271–279, 2012.

67

[133] M. Tetsuo, S. P. Markey i I. J. Kopin, »Measurement of 6-hydroxymelatonin in human urine

and its diurnal variations,« Life Sciences, svez. 27, br. 2, pp. 105-109, 1980.

[134] Z. Guo, R. Chen, R. Xing, S. Liu, H. Yu, P. Wang, C. Li i P. Li, »Novel derivatives of chitosan and

their antifungal activities in vitro,« Carbohydrate Research, svez. 341, br. 3, pp. 351-354, 2006.

68

9. Sažetak

Utjecaj lecitinsko-kitozanskih nanočestica s melatoninom na cijeljenje rane in vitro

Filip Blažević, Tamara Milekić, Sveučilište u Zagrebu, Farmaceutsko-biokemijski fakultet

Ključne riječi: kitozan, melatonin, lecitin, nanočestice, cijeljenje rane in vitro

Cilj ovog istraživanja je priprava nanočestica kitozana i melatonina za topikalnu primjenu te

evaluacija njihovog učinka na cijeljenje (epitelizaciju) rane in vitro u ovisnosti o sadržaju uklopljenog

melatonina i svojstvima kitozana. Najnovija istraživanja u okviru razvoja funkcionalnih obloga temelje se

na primjeni (bio)polimera s učinkom na cijeljenje rana, primjerice kroz utjecaj na migraciju i proliferaciju

stanica kože, antimikrobni učinak te hemostatsko djelovanje. Razvijaju se polimerni terapijski

nanosustavi koji mogu pridonijeti procesu cijeljenja ovisno o sadržaju djelatne tvari, polimernom sastavu

i specifičnim fizičko-kemijskim svojstvima.

U ovom radu lecitinsko-kitozanske nanočestice s melatoninom uspješno su pripravljene ionskom

interakcijom između lecitina i kitozana. U pripravi nanočestica korištena su četiri tipa kitozana koja se

međusobno razlikuju po molekulskoj masi (50-150 kDa ili 150-400 kDa) i/ili stupnju deacetilacije

(75-90 % ili ˃90 %). Pripravljene su nanočestice srednjeg promjera od 245,2±2,8 do 277,1±7,6 nm,

pozitivnog zeta-potencijala (23,4±0,9 do 32,5±1,2 mV) te zadovoljavajućeg sadržaja melatonina

(3,8±0,3 do 4,3±0,4 %). Veličina i površinski naboj nanočestica ovisili su o molekulskoj masi i stupnju

deacetilacije kitozana. Za sve ispitivane lecitinsko-kitozanske nanočestice dobiveni su slični bifazični

profili produljenog oslobađanja melatonina. Izlaganje stanica suspenzijama nanočestica s melatoninom

pri koncentraciji kitozana manjoj od 20 µgml-1 nije značajnije utjecalo na vijabilnost stanica, neovisno o

tipu korištenog kitozana. Pri ispitivanju cijeljenja (epitelizacije) rane in vitro, modelna rana predstavljena

je oštećenjem konfluentnog sloja HaCaT stanica, a cijeljenje rane proliferacijom i migracijom stanica.

Za razliku od otopina kitozana koje su usporavale cijeljenje (epitelizaciju) rane in vitro, suspenzije

lecitinsko-kitozanskih nanočestica odgovarajuće koncentracije kitozana ubrzavale su navedeni proces.

Učinak nanočestica na cijeljenje rane in vitro ovisio je o sadržaju melatonina u nanočesticama i tipu

kitozana korištenom u njihovoj pripravi. Najbrže cijeljenje rane in vitro zabilježeno je kod modelne rane

izložene nanočesticama s melatoninom pripravljenima s kitozanom manje molekulske mase (50-150

kDa) i većeg stupnja deacetilacije (˃90 %). Primjenom in vitro modela rane izvršen je probir sustava s

najvećim potencijalnim učinkom na epitelizaciju rane. Daljnja procjena terapijskog potencijala

nanosustava uključivat će ispitivanje učinka na migraciju i proliferaciju fibroblasta te ispitivanje

antimikrobnog djelovanja.

69

10. Summary

Influence of melatonin-loaded lecithin/chitosan nanoparticles on wound healing in

vitro

Filip Blažević, Tamara Milekić, University of Zagreb, Faculty of Pharmacy and Biochemistry

Key words: chitosan, melatonin, lecithin, nanoparticles, wound healing in vitro

The aim of this study was to prepare chitosan based nanoparticles suitable for topical melatonin

delivery and to evaluate their influence on wound healing (epithelisation) in vitro in relation to melatonin

content and chitosan properties. The latest trends in functional wound dressings development are

focused on (bio)polymers with the potential to improve wound healing, influencing migration and

proliferation of skin cells, having antimicrobial or haemostatic activity. Innovative delivery nanosystems

can improve wound healing process depending on the content of the active compound, polymeric

composition and physico-chemical properties.

Melatonin-loaded lecithin-chitosan nanoparticles were successfully prepared by ionic interaction

between lecithin and chitosan. Four types of chitosan used differed in molecular weight (50-150 kDa or

150-400 kDa) and/or deacetylation degree (75-90 % or ˃90 %). Nanoparticles had mean diameter

ranging between 245,2±2,8 - 277,1±7,6 nm, positive zeta-potential (23,4±0,9 do 32,5±1,2 mV) and

sufficient melatonin entrapment (3,8±0,3 do 4,3±0,4 %). Size and surface charge depended on

molecular weight and deacetylation degree of chitosan. For all lecithin/chitosan nanoparticles prepared

similar biphasic prolonged release profiles were obtained. Cells treatment with melatonin-loaded

nanoparticles at chitosan concentration lower than 20 µgml-1 induced no decrease in cell viability,

regardless of the type of chitosan used. In wound healing (epithelisation) studies, in vitro scratch test

was employed. Wound healing was assayed through cell proliferation and migration. Opposite to

chitosan solutions which impaired wound healing process in vitro, lecithin/chitosan nanoparticles

suspension of corresponding chitosan concentration improved the mentioned process. Influence of

nanoparticles on wound healing in vitro depended on melatonin content and type of chitosan used in

the nanoparticles preparation. The fastest wound healing was observed in case of model wound treated

with melatonin-loaded nanoparticles prepared with chitosan of lower molecular weight (50-150 kDa) and

higher deacetylation degree (˃90 %). In vitro wound model allowed the selection of the nanoparticles

with the highest therapeutic potential in relation with wound epithelisation. Further evaluation of

nanosystems therapeutic potential will include investigation of their effect on fibroblast

migration/proliferation and antimicrobial activity.