KinetikaKinetika

Mihaelis-Menten-ova jednačina

Mihaelis-Menten-ov mehanizam

Enzim-supstrat kompleks je u ravnoteži sa slobodnim enzimom i supstratomES kompleks – Mihaelisov kompleksKs – konstanta disocijacije ES kompleksaKorak koji odredjuje brzinu reakcije je raspad kompleksa ES na E i P

Brigs-Haldan-ov mehanizamUvode pojam ravnotežnog stanja: ukoliko je brzina reakcije konstantna u odredjenom vremenskom intervalu, i koncentracija ES je takodje konstantna

Km = (k2 + k-1)k1

Ks = k-1/k1

Km = Ks + k2/k1

Lineweaver-Burk Hanes Eadie-Hofstee

Distribucija greške za različite metode linearizacije

Linearni oblici Mihaelis-Menten-ove jednačine

Km: 10Km: 10-1-1 – 10 – 10-7-7 M M

Konstanta specifičnostiKonstanta specifičnosti

Mehanizam sa intermedijerima

-kcat je konstanta prvog reda koja se odnosti na osobine i reakcije ES, E-intermedijer i EP

-Km: prividna konstanta disocijacije koja se moze smatrati opštom konstantom disocijacije za sve komplekse koje gradi E-Značenje kcat/Km: konstanta specifičnosti; odnosi se na svojstva i reakcije slobodnog enzima i slobodnog supstrata

Prolazna vremena vs. konstante brzineProlazna vremena vs. konstante brzine

Enzimske reakcije koje uključuju više intermedijera! (Himotripsin)

Prolazna vremena su aditivna.Briggs-Haldan-ov mehanizam

Integralni oblik MM jednačineIntegralni oblik MM jednačineKrive progresa reakcije (jedna konc. S više merenja)

1. Enzim mora da bude stabilan tokom čitavog merenja

2. Povratna reakcija mora da bude zanimarljiva

3. Proizvod ne sme da inhibira enzim

KompetujuKompetujući supstratići supstrati

Specifičnost prema kompetujućim supstratimaSpecifičnost prema kompetujućim supstratima

Haldanova jednačinaHaldanova jednačina

Da li ravnoteža u reverzibilnim enzimima katalizovanim reakcijama zavisi od prisustva enzima?

Ravnoteža na površini enzimaRavnoteža na površini enzima

Ravnotežne konstante na površini enzima su drugačije od konstanti u rastvoru.

Razlozi: 1. napon; 2. neproduktivno vezivanje; 3. entropijski faktor

IzuIzučavanje složenih metaboličkih putevačavanje složenih metaboličkih puteva Izučavanje složenih multisupstratnih Izučavanje složenih multisupstratnih

reakcijareakcija Enzimske inaktivacije i zdravlje (trovanje i Enzimske inaktivacije i zdravlje (trovanje i

lekovi)lekovi)

- Tipovi inhibicije: Tipovi inhibicije:

- reverzibilna reverzibilna (kompletna i parcijalna) (kompletna i parcijalna) i i - ireverzibilna (inaktivaireverzibilna (inaktivacijacija))

- Tipovi reverzibilne inhibicije:Tipovi reverzibilne inhibicije:- KompetitivnaKompetitivna- AntikompetitivnaAntikompetitivna- MešovitaMešovita- NekompetativnaNekompetativna

Inhibicije

Kompetitivna inhibicija

Inhibitor (I) i supstrat se vezuju za isto mesto na enzimu

Jednostavni MM mehanizam

Km se menja, ali ne i Vmax

Linearizovani oblici MM jednačine za Linearizovani oblici MM jednačine za kompetitivnu inhibicijukompetitivnu inhibiciju

Sekundarni grafik za Sekundarni grafik za odredjivanje Ki u slučaju odredjivanje Ki u slučaju

kompetitivne inhibicije LB kompetitivne inhibicije LB metodommetodom

Akompetitivni tip inhibicijeAkompetitivni tip inhibicije Inhibitor se vezuje za kompleks ES, ali ne i za slobodan Inhibitor se vezuje za kompleks ES, ali ne i za slobodan

enzimenzim Uspostavlja se ravnoteUspostavlja se ravnotežno stanje, pri čemu je kompleks žno stanje, pri čemu je kompleks

ESI u ravnoteži sa ESESI u ravnoteži sa ES

Linearizovani oblici MM jednačine za Linearizovani oblici MM jednačine za ampetitivnu inhibicijuampetitivnu inhibiciju

Sekundarni grafik za Sekundarni grafik za odredjivanje Ki u slučaju odredjivanje Ki u slučaju

akompetitivne inhibicije LB akompetitivne inhibicije LB metodommetodom

Mešovita inhibicija (specijalni slučaj – Mešovita inhibicija (specijalni slučaj – nekompetitivna inhibicija)nekompetitivna inhibicija)

Linearizovani oblici MM jednačine za mešovitu Linearizovani oblici MM jednačine za mešovitu inhibicijuinhibiciju

Sekundarni grafici za Sekundarni grafici za određivanje Ki i Ki’ u određivanje Ki i Ki’ u

slučaju mešovite inhibicije slučaju mešovite inhibicije LB metodomLB metodom

Nekompetitivna inhibicija

*Inhibitor utiče samo na katalitičku funkciju enzima, ali ne i na vezivanje supstrata

*Važan tip inhibicije za multisupstratne enzime

*Pri niskim koncentracijama S, efekat inhibitora se može zanemariti

Linearizovani oblici MM jednačine za Linearizovani oblici MM jednačine za nekompetitivnu inhibicijunekompetitivnu inhibiciju

Sekundarni grafici za Sekundarni grafici za određivanje Ki i u slučaju određivanje Ki i u slučaju nekompetitivne inhibicije nekompetitivne inhibicije

LB metodomLB metodom

Efekti različitih inhibitora na Efekti različitih inhibitora na parametre u MM jednačiniparametre u MM jednačini

Km

Km

Km app.

Km/’

Km/’

*Specijalan slučaj: =’, nekompetitivna inhibicija, Km se ne menja, Vmax se smanjuje za faktor ’

*

Odstupanje od MM jednačineOdstupanje od MM jednačine

Inhibicija (aktivacija) supstratom

Neproduktivno vezivanjeNeproduktivno vezivanje

Km i kcat se smanjuju

Km je manje od Ks Važi i za reakcione mehanizme u kojima nastaju intermedijeri!

`=

Odredjivanja enzimskih aktivnostiOdredjivanja enzimskih aktivnosti Optimalni usloviOptimalni uslovi Prisustvo supstrataPrisustvo supstrata Prisustvo kofaktoraPrisustvo kofaktora

Kinetička odredjivanjaKinetička odredjivanja Kinetički parametriKinetički parametri

Praktični aspekti određivanja u enzimologiji

Enzimska aktivnost (IU ili U, Katal) Enzimska aktivnost (IU ili U, Katal) Specifična aktivnost (U/mg)Specifična aktivnost (U/mg) Koncentracija enzimske aktivnosti Koncentracija enzimske aktivnosti

U/mLU/mL

Turnover number, molekulska Turnover number, molekulska aktivnost (1/min, 1/s)aktivnost (1/min, 1/s)

Aktivnost katalitičkog centra (kcat) Aktivnost katalitičkog centra (kcat)

Prečišćavanje enzimaPrečišćavanje enzima  -         Neophodan je odgovarajući test enzimske aktivnosti-         Neophodan je odgovarajući test enzimske aktivnosti-         Odgovarajući test za odredjivanje koncentracije proteina-         Odgovarajući test za odredjivanje koncentracije proteina-         Definicije: specifična aktivnost, prinos, stepen prečišćenja-         Definicije: specifična aktivnost, prinos, stepen prečišćenja, broj izmena, broj izmena-         Dnevnik postupka izolovanja i prečišćavanja (-         Dnevnik postupka izolovanja i prečišćavanja (zapreminazapremina, conc., akt.), conc., akt.)-         Izbegavati one korake koji daju slab prinos i mali porast u čistoći-         Izbegavati one korake koji daju slab prinos i mali porast u čistoćiNeke osnovne definicije:Neke osnovne definicije:- Jedinica aktivnostiJedinica aktivnosti (1 U): Ona količina enzima neophodna za katalizu reakcije transformacije 1 mikromola (1 U): Ona količina enzima neophodna za katalizu reakcije transformacije 1 mikromola

susuppstrata po minuti pri standardnim uslovima*.strata po minuti pri standardnim uslovima*.- 1 Katal – 1 mol supstrata u 1 s1 Katal – 1 mol supstrata u 1 sPrimer: Ako 0,1 mg/mL enzima katalizuje konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada u 1 mL ima 10 jedinica aktivnosti.Primer: Ako 0,1 mg/mL enzima katalizuje konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada u 1 mL ima 10 jedinica aktivnosti. Specifična aktivnost ovog Specifična aktivnost ovog

rastvora će biti 100 Urastvora će biti 100 U/mg proteina./mg proteina.**Standardni usloviStandardni uslovi: oni koji odgovaraju datom enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc). Odnosno, kad god je moguće:: oni koji odgovaraju datom enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc). Odnosno, kad god je moguće:-         Temperatura 30 -         Temperatura 30 ooC C -         pH optimum za dati sistem Enz-Sub-         pH optimum za dati sistem Enz-Sub

Koncentracija substrata na 10x poluzasićenja substratom (10 Km)Koncentracija substrata na 10x poluzasićenja substratom (10 Km)

Vrste merenjaVrste merenja

KontinualneKontinualne DiskontinualneDiskontinualne DirektneDirektne IndiriktneIndiriktne

Kuplovani testoviKuplovani testovi

4. Kuplovani testovi4. Kuplovani testovi

Praktične metode za odredjivanje kinetike i Praktične metode za odredjivanje kinetike i ravnotežeravnoteže

1. Spektrofotometrija (prirodne hromofore, NADH 340 nm; veštačke hromofore na bazi pNP estara) – radni opseg instrumenta, Lambert-Ber-ov zakon

2. Spektrofluorimetrija (prirodne fluorofore, NADH 340 nm – 460 nm, Trp 280 nm – 335 nm; 4-metillumbeliferon)

3. Cirkularni dihroizam

5. 5. Automatska titracija kiseline i bazeAutomatska titracija kiseline i baze

6. E6. Elektrohemijskelektrohemijske metode metode

7. 7. Radioaktivne procedureRadioaktivne procedure

8. M8. Manometrijske metode anometrijske metode - - prati prati se se promena parcijalnog pritiska gasa promena parcijalnog pritiska gasa iznad rastvoraiznad rastvora

9. Hromatografske metode9. Hromatografske metode