İÇİNDEKİLER: PCR’ ın tarihçesi

PCR ve kısıtlamaları

Real-time PCR

Genel özellikler

Kullanım alanları

Avantaj ve dezavantajları

Prob sistemleri

Ct ve Tm değerleri

Negatif kontrol

Pozitif kontrol

Light Cycler Carousel Based Sistem Protokolü

Master Mix hazırlanması

PCR Mix hazırlanması

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

PCR’ IN TARİHÇESİ

PCR ilk kez 1985’ te kullanılmaya başlanmıştır.

Hem araştırmada hem de klinik laboratuarlarda

tanıda yeni bir çığır açmıstır.

ABD'de Cetus şirketin'de çalisan Henry A.

Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki

tarafindan gelistirilmistir.

1 1

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

2

• Metod basitçe tüpte nükleik asitlerin uygun

kosullarda çogaltilmasidir.

(Science,1985:230,135).

• Bu buluşundan dolayi K.Mullis, 1993 yılı Nobel

Kimya Ödülüne hak kazanmıştır.

2 http://www.google.com.tr/imgres?q=rt+pcr&start=224&num=10&hl=tr&gbv=2&biw=102

4&bih=499&tbm=isch&tbnid=niUsV0PD_QMNsM:&imgrefurl=http://my.opera.com/than

hvu123/&docid=fy7bz3Lm4cY2wM&imgurl=http://files.myopera.com/thanhvu123/blog/R

T-PCR.png&w=640&h=494&ei=kLBwT_62PIjOsga7ray8Ag&zoom=1&iact=hc

PCR’ IN TARİHÇESİ m

ole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

3 3

• PCR ;laboratuvar ortamında spesifik DNA

dizilerinin, primer denilen sentetik oligonükleotid

diziler yardımıyla çoğaltılması işlemidir.

• PCR yönteminin bulunması DNA ve RNA ‘nın

incelenebilmesinin yolunu açmıştır

• Standart bir PCR Protokolü yoktur. Bileşenler

çoğaltılacak DNA bölgesinin özelliklerine göre

değişir.

PCR’ IN TARİHÇESİ m

ole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

PCR AŞAMALARI

PCR reaksiyonunda üç temel basamak vardır

ve çoğaltılmış ürün miktarı, bu üç adımın

tekrarına bağlıdır.

1. Denatürasyon (90-95 °C)

2. Primer bağlanması (50-70 °C)

3. DNA sentezi (70-75 °C)

Bu üç adım bir PCR siklusunu oluşturur .

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

http://lisagervassi.blogspot.com

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

KLASIK PCR’DAKI PROBLEMLER

Primer seçimi ve dizaynı

Reaksiyon şartları

Zaman alan analiz işlemleri

Bir testin optimizasyonu

Agaroz jel elektroforezi, Blotlama

Kontaminasyon riski

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

7 7

PCR ÇEŞİTLERİ:

• KLASİK PCR

• MULTİPLEX PCR

• NESTED PCR

• REVERS TRANSKRİPSİYON PCR

• REAL TİME PCR

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

8 8

PCR TİPİ HEDEF UYGULAMA

KLASİK DNA DNA dizisinin

amplifikasyonu ve

araştırılması

REAL TİME DNA Hedef nükleik asit dizisinin

kopya sayısının tespiti ile

quantifikasyon

MULTİPLEX DNA İki veya daha fazla sayıdaki

farklı DNA dizisinin aynı

anda amplifikasyonu (Klasik

ve Real time ‘de uygulanır)

NESTED DNA External ve internal primer

takımları kullanılarak

REVERSE

TRANKRİPTAZ rRNA

mRNA

Viral RNA

RNA ‘nın amplifikasyonu ve

araştırılması

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

9

REAL TİME PCR Gerçek zamanlı polimeraz zincir

reaksiyonu, DNA amplifikasyonu ile eş zamanlı

olarak artış gösteren floresans sinyalin ölçülmesi

ile kantitatif sonuç verebilen bir PCR yöntemidir.

dsDNA’ya bağlandıkları zaman floresans

veren boyalar (örneğin, SYBR green-I)

kullanılarak amplifikasyona bağlı DNA artışı

floresans miktarı ile ölçülmektedir.

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Real-time PCR’da ürünlerin analizi reaksiyon

sırasında yapılmaktadır.

Bu nedenle, agaroz jel elektroforezi, DNA

bantlarının mor ötesi ışık altında görüntülenmesi

gibi işlemlerin uygulanmasına gerek

kalmamaktadır.

10

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

11 http://www.uoguelph.ca/crifs/node/16

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

REAL-TIME PCR KULLANIM

ALANLARI mRNA’nın düzeyini

sayısal olarak belirleyebilme

DNA’nın kopya sayısını sayısal

değerlere dönüştürme

Tek nokta mutasyonlarını

belirleme

Patojen belirleme

Metilasyon tespiti

Kromozom bozukluklarının

tespiti

SNP analizi

DNA hasarı belirleme

12

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

REAL-TIME PCR AVANTAJLARI VE

DEZAVANTAJLARI

Avantajları

Eşzamanlı amplifikasyon

Analize özgü reaktifler (ASR’ler)

Kitlerin bulunabilirliği

Geliştirilmiş standardizasyon

Esnek

PCR sonrası elektroforez

gerektirmez.

Floresan tespiti (jel temelli değil)

Hızlı (30-40 dakika)

Nicel

Dezavantajları

Yüksek ekipman ihtiyacı

Beceri ve tecrübe

Teknik donanım

13

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

FLORESAN PROB SİSTEMLERİ:

a) Özgül Floresan İşaretli Problar:

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Taqman

Molecular Beacons

Scorpion Primerleri

Hibridizasyon Probları

Kullanılan boyalar:

SYBR Green I

Etidyum Bromid

14 14

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

LİGHT CYCLER:

Sıcak hava akımıyla ısınan bir kapalı sistemdir.

Performans olarak hem duyarlılığı hem

özgüllüğü ABI 7700 sistemine eşit olarak

bildirilmiştir.

Yirmi dakikaya kadar inebilen RT-PCR

olanağına karşın yalnızca 32 reaksiyon

gerçekleştirebilen bir sistemdir.

15 15

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Üç foto saptama ucuyla farklı dalga boylarına

yayılabilen bir görsellik avantajı vardır.

PCR döngülerinin her biri sonunda ekrana bilgi

yansımasıyla gerçek bir “eş-zamanlı”

yöntemidir.

16 16 http://www.google.com.tr/imgres?q=sybr+green+pcr+amplifikasyon&start=98&um=1&hl=tr

&biw=1024&bih=421&tbm=isch&tbnid=p1o-48bwFeZLrM:&imgrefurl=http://www.bio-

rad.com/evportal/en/US/LSR/Solutions/LUSOJW3Q3/PCR_Primer_and_Probe_Chemistries&

docid=c8BqhmxzTkA6dM&imgurl=http://www.bio-

rad.com/webroot/web/images/lsr/solutions/technologies/gene_expression/pcr/technology_detail

/gxt28_img1.gif&w=506&h=366&ei=k8d0T-b-

Oon74QS2s5WnDg&zoom=1&iact=rc&dur=272&sig=109219116955681988051&page=7&tbn

h=108&tbnw=149&ndsp=18&ved=1t:429,r:0,s:98&tx=60&ty=80

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

SYBR GREEN I: Yalnızca çift zincirli DNA’ya bağlandıklarında floresans

veren boyalar (SYBR Green I) kullanılarak, amplifikasyona

bağlı DNA artışı, ortaya çıkan floresansın miktarı ile

ölçülmektedir.

17 17

http://www.google.com.tr/imgres?q=sybr+green+pcr+amplifikasyon&um=1&hl=tr&biw=1024

&bih=421&tbm=isch&tbnid=tKIy3zrU7bZQHM:&imgrefurl=http://dyes.gene-

quantification.info/&docid=IpPo7camtDa57M&imgurl=http://www.gene-

quantification.de/sybr1.gif&w=310&h=151&ei=McJ0T9_MLYfP4QShv7mTDg&zoom=1&iact

=rc&dur=43&sig=109219116955681988051&page=1&tbnh=72&tbnw=148&start=0&ndsp=1

2&ved=1t:429,r:10,s:0&tx=66&ty=61

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Primerin bağlanmasını takiben uzama

aşamasında;

Hedef DNA’nın çift sarmal hale gelmesiyle

DNA’ya bağlanan “SYBR green” miktarı

artmakta, buna bağlı olarak yayılan floresans

miktarında artış gözlenmektedir.

18 18 http://www.google.com.tr/imgres?q=sybr+green+pcr+amplifikasyon&um=1&hl=tr&biw=1024&bih=421&tbm=isch&tbnid=LmhQlEhJ2e_uWM:&imgrefurl=http://w

ww.genome-diagnostics.com/real-time-pcr.htm&docid=UXRSUmfMHbd4XM&imgurl=http://www.genome-diagnostics.com/images/real-time-

pcr_clip_image002_0003.gif&w=469&h=347&ei=McJ0T9_MLYfP4QShv7mTDg&zoom=1&iact=rc&dur=221&sig=109219116955681988051&page=4&tbnh=108&t

bnw=146&start=45&ndsp=17&ved=1t:429,r:9,s:45&tx=67&ty=90

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Çift zincirli DNA ya bağlanmaktadır,

Çift zincirli DNA ya bağlandıkları sürece floresan emisyonu olmaktadır,

Spesifik olmayan bağlanmalar gerçekleşmektedir,

Yoğun optimizasyona ihtiyacı yoktur.

19 19

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

20 20

TAQMAN:

Taq DNA Polimeraz:

Thermus aquaticus YT–1(1)’den izole edilmiş ısıya

dayanıklı bir enzimdir.

5u/µl konsantrasyona sahiptir, DNA’yı 72°C’de

çoğaltma özelliğindedir.

Enzim ortamda magnezyum iyonlarının varlığında

5’-3’ yönünde aktivite göstermektedir, ayrıca 5’-3’

ekzonukleaz aktivitesine de sahiptir.

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

21 21

http://www.google.com.tr/imgres?q=taq+polymerase&num=10&um=1&hl=tr&biw=1024&bih

=421&tbm=isch&tbnid=MjhQ8olfoBFKhM:&imgrefurl=http://www.bio.davidson.edu/Courses

/Molbio/MolStudents/spring2003/Pierce/realtimep

RTA Real-Time PCR Kitlerinde bulunan;

Reaktifler,

Enzimler,

Nükleik asitlerin spesifik amplifikasyonu ve

tespitine yönelik tasarlanmış problar ile güvenilir

patojenlerle ilgili kalitatif ve/veya kantitatif data

sağlanır.

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

22 22

Kit ile birlikte gelen kantifikasyon standartları ve

spesifik IC Real-Time PCR sisteminde etkin

kantifikasyonu ve normalize amplifikasyonu mümkün

kılar.

htt

p:/

/ww

w.g

oogle

.com

.tr/

imgre

s?q=

IC+

Real-

Tim

e+

PC

R+

sist

em

ind

e+

etk

in+

kan

tifi

kasy

on

u+

ve+

norm

ali

ze+

am

pli

fik

asy

on

u+

m%

C3%

BC

m

k%

C3%

BC

n+

k%

C4%

B1la

r&n

um

=10&

um

=1&

hl=

tr&

biw

=1024&

bih

=421&

tbm

=is

ch&

tbn

id=

h

keO

fDY

Nm

vO

lxM

:&im

gre

furl

=h

ttp

://w

ww

.rta

labs.

com

.tr/

uru

n.p

hp

%3

Fu

run

%3

D78%

26la

ng

%3

Dtr

&d

oci

d=

Qp

xw

nA

tkR

hN

-

dM

&im

gu

rl=

htt

p:/

/ww

w.r

tala

bs.

com

.tr/

ass

ets

/uru

nle

r/R

ealT

imeP

CR

meth

od

_alt

_E

n.j

pg&

w=

650&

h=

848&

ei=

qst

0T

4S

pD

c_D

swap

6u

nID

Q&

zoom

=1&

iact

=h

c&vp

x=

82&

vp

y=

54&

du

r=550&

hovh

=256&

hovw

=196&

tx=

93&

ty=

214&

sig=

1092191169556819

88

05

1&

sqi=

2&

page=

1&

tbn

h

=104&

tbn

w=

80&

start

=0&

nd

sp=

3&

ved

=1t:

429,r

:0,s

:0

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

23 23

Burada problarla testin

özgüllüğü artırılmıştır.

Problardan biri 3’ ucundan

floresans boya ile işaretli

(donör boya), diğeri 5’

ucundan alıcı boya (acceptor

dye) ile işaretlenmiştir.

Problar hedef amplikonlar

üzerinde birbirine yakın (1-5

nükleotit uzaklıkta) yere

bağlanmakta ve işaretli uçlar

yan yana http://www.google.com.tr/imgres?q=Problar+hedef+amplikonlar+taqman&um=1&hl=tr&biw=1024&bih=4

21&tbm=isch&tbnid=8XLg1xd6ULdXaM:&imgrefurl=http://www.genetiklab.com/altsayfa.php%3Fgiris_I

D%3D2%26tablo%3Dtbl_yontemler&docid=HKakeO3RCEtcRM&imgurl=http://www.genetiklab.com/yont

emler/realtimepcr2.jpg&w=209&h=511&ei=vc50T8KDJMGKswbQldy7DQ&zoom=1&iact=hc&vpx=81&vp

y=-

41&dur=361&hovh=351&hovw=143&tx=78&ty=299&sig=109219116955681988051&page=1&tbnh=103&

tbnw=42&start=0&ndsp=14&ved=1t:429,r:0,s:0

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

24 24

İki boyanın yan yana gelmesiyle açığa çıkan enerji

ikinci prob üzerindeki alıcı boyayı etkileyerek

floresans oluşumuna yol açmaktadır.

“Fluoresance resonance energy transfer, (FRET)”

olarak adlandırılan bu enerji transferi sonucunda

oluşan floresans miktarı;

Ortamdaki hibridizasyonun derecesine diğer bir ifade

ile PCR siklusu süresince oluşan amplikonların

miktarına bağlı olarak artmaktadır.

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

25 25

TaqMan sisteminde 5’ ve 3’ uçlarından florokrom

maddelerle işaretli prob kullanılmaktadır.

Prob’un 5’ ucunda raportör florokrom (6-

carboxyfluorescein =6-FAM),

3’ ucunda ise baskılayıcı florokrom (6-carboxy-

tetramethyl-rhodamine =TAMRA) bulunur.

Prob, tek sarmal hale getirilen hedef molekül

üzerinde, primerlerin bağlanma bölgesinin arasında

kalan yere bağlanır.

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

26 26

Prob-hedef molekül arasındaki hibridizasyon

devam ettiği sürece raportör florokrom maddenin

sinyal oluşturması,

3’ uçtaki baskılayıcı florokrom tarafından

engellenmektedir.

http://www.google.com.tr/imgres?q=TaqMan+sisteminde+5%E2%80%99+ve+3%E2%80%99+u%C3%A7lar%C4%B1ndan&u

m=1&hl=tr&biw=1024&bih=421&tbm=isch&tbnid=ANLyh-

IPKNw5hM:&imgrefurl=http://www.drzeydanli.com.tr/index.php%3Fpage%3Dicerikgoster%26menuID%3D30&docid=VVOz

P0J7rPsJ7M&imgurl=http://www.drzeydanli.com.tr/images/image/TAqMan-

Alternatif.JPG&w=943&h=1261&ei=4NB0T9y9N4_otQawi_nYDQ&zoom=1&iact=hc&vpx=341&vpy=50&dur=15554&hovh

=260&hovw=194&tx=73&ty=157&sig=109219116955681988051&page=1&tbnh=106&tbnw=67&start=0&ndsp=15&ved=1t:

429,r:3,s:0

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

27 27

Primerlerin hedef nükleik asite bağlanmasını

takiben başlatılan primer uzaması prob’un

bağlandığı noktaya kadar geldiğinde,

Sentezin devam edebilmesi için Taq DNA

polimeraz enzimi 5’→3’ nükleaz aktivitesini

kullanarak probu 5’ uçtan yıkmaya başlar.

Böylece raportör florokrom serbest hale geçer ve

sinyal oluşturur.

Her siklusta üretilen amplikon miktarına paralel

olarak sinyal şiddeti de artmaktadır

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

CT nedir?

CT (cycle threshold),gerçek zamanlı PCR

deneylerinde floresan sinyal miktarının,

gözlemlenebilmesi için gereken minimum değeri

(eşik değerini) geçtiği döngü sayısına (eşik

döngüsü) verilen addır.

28

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

MELT CURVE ANALYSIS/ERIME

EĞRISI ANALIZI NEDIR?

Erime eğrisi analizi, SYBR-Green vb. floresan

boyaların kullanıldığı analizlerde, çoğalan DNA’nın

hedef bölge olduğunu kesinleştirmek amacıyla

kullanılır.

29

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Kendi aralarında sekonder yapılar oluşturmayan

primerler seçilmesi, ya da primer sekonder

yapıların (dimer) Tm’inin üzerinde bir sıcaklıkta

ölçüm alınması yoluyla yalnızca PCR ürününe

bağlı artışın gözlemlenmesi mümkündür.

30

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Erime eğrisi analizinde, ikili sarmal DNA

örneğinin sıcaklığı yavaş yavaş artırılarak

floresan sinyalin sıcaklığa bağlı değişimini

gösteren bir grafik oluşturulur.

Floresan sinyalin ani düşüşünden kaynaklanan

tepecikler aracılığıyla, DNA iplikçiklerinin

birbirlerinden ayrılmaları gözlemlenir.

31

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

NEGATIF KONTROL NEDIR?

Negatif kontrol, içinde test edilen madde hariç bütün

reaksiyon içeriğini barındıran kontrole verilen addır.

Her Real-Time PCR çalışmasına bir adet negatif kontrol;

yani içinde her malzemeyi barındırıp sadece test edilen

genetik materyal bulunmayan bir reaksiyon tüpü, dahil

edilmelidir.

Bu, olası bir kontaminasyonun varlığının kontrol

edilmesini sağlar, pozitif hasta sonuçlarının anlamlı

olduğunu kanıtlar.

32

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

POZITIF KONTROL NEDIR?

Pozitif test sonucu vereceği bilinen ve pozitif sonuç vermesi beklenen reaksiyon kontrolüdür.

Pozitif kontrol, uygulamadaki veya kullanılan malzemelerdeki olası aksaklıkların ortaya çıkarılmasını sağlar.

Pozitif kontrol pozitif sonuç vermezse, o deneyin sağlıklı olmadığı anlaşılır.

Doğru sonuçların verildiğinden emin olmak için deney tekrarlanır.

33

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

ÇIFTE IŞARETLI PROB VE SYBR-GREEN TABANLı

KITLERDE, FLORESAN ÖLÇÜMÜ VE ÜRÜNÜN

SAPTANMASıYLA ILGILI FARKLıLıKLAR VAR MıDıR?

Evet. Çifte işaretli hidroliz probları kullanan

(TaqMan temelli) kitlerde floresans ölçümü,

PCR’ın Taq Polimerazın probu kestiği

“annealing+elongation” evresinde, (genellikle

50-60°) alınır.

SYBR-Green diziye özgü olmadığı için primer

dimerleri vb. gibi hedef ürünün dışındaki çift

zincirli DNA yapılarını da görüntüler. 34

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Bu nedenle SYBR-Green bazlı kitlerde, primer dimerlerinin tek zincirli olduğu, hedef PCR ürününün ise çift zincirli olduğu bir sıcaklıkta ölçüm yapılmalıdır.

Bu sıcaklık da yaklaşık olarak ürünün Tm’ine, ya da bir-iki derece altına denk gelir.

Böylece, mümkün olduğunca, primer dimerlerden kaynaklanan floresans artışlarından kurtulmuş olunur ve spesifik olarak ürünün artışı izlenir.

35

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Çifte İşaretli Prob temelli kitlerde PCR ürünü

baz dizisi o ürüne özgü floresan işaretli problarla

görüntülenir, bu yüzden çoğalan ürün spesifik

biçimde saptanmış olur.

SYBR-green kullanılan kitlerde ise, SYBR-

green dizi ayrımı yapmaksızın tüm çift zincirli

DNAlara bağlandığı için PCR ürünü spesifik

olarak görüntülenemez.

36

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Tm (Erime sıcaklığı) nedir?

Erime sıcaklığı (Tm), DNA molekülünün

yarısının tek sarmal haline geldiği belirli sıcaklığa verilen addır.

Erime sıcaklığını büyük ölçüde baz dizisi belirler ve farklı dizilere sahip DNA moleküllerinin Tm değerleri birbirinden farklı olur.

37

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

38

Gerçek DNA amplifikasyonunu ölçmek için amplifikasyon

ürünlerinin “melting curve”(erime eğrisi) analizi yapılmalıdır.

Her dsDNA kendine özgül Tm değerine sahiptir.

Amplifikasyondan sonra sıcaklık yavaş yavaş yükseltilerek belirli

aralıklar ile tüpteki floresans miktarı kayıt edilir.

dsDNA denatüre olmaya başlayınca boya serbest kaldığı için

ölçülen floresans miktarı düşmeye başlar.

Böylece elde edilen erime eğrisinden yararlanılarak

amplifikasyonun Tm derecesi saptanabilir.

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

PCR VERIMI NASıL

HESAPLANıR?

PCR verimi standart eğrinin eğimi ile doğru

orantılıdır (Verim = [10(-1/eğim)] – 1). Buna

göre -3.332’lik bir eğim %100’lük bir verime

karşılık gelir.

39

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Ancak PCR ürününün spesifik olarak

saptanması erime eğrisi analizi (melt curve

analysis) yoluyla kesinlikle sağlanabilir.

40

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Verimin mutlak değerinin 3.332’den

büyük olması verimin %100’den düşük

olduğunun, küçük olması ise %100’den

büyük olduğunun göstergesidir ki, her iki

durumda da reaksiyonun optimize

edilmesi gerekir.

41

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

%100’lük verimde template her döngüde 2’ye

katlanır. Gerçekte hiçbir PCR reaksiyonunun bu

değere erişmediği bilinmektedir.

Çoğaltılan bölgenin (amplicon) uzunluğu,

sekonder yapılar ve primer kalitesi gibi faktörler

PCR verimini etkileyebilir.

42

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

REAL-TİME PCR İLE

Candida albicans ANALİZİ

2 aşamadan oluşmaktadır:

1-DNA izolasyonu

2-Real-time PCR uygulaması

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Candida albicans

Eşeyli çoğalan, diploit mayadır.

Fırsatçı patojen bir mayadır.

İnsanlarda oral ve vajinal enfeksiyonların etmenidir.

Bu enfeksiyon candidiasis ile sonuçlanır.

Dimorfiktir. 44

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Light Cycler Carousel Based Sistem

Protokolü

Aşağıdaki adımlar takip edilir;

Pre-İnkübasyon: FastStart DNA polimerazın aktivasyonu ve DNA denatürasyonu içindir.

Amplifikasyon: Hedef DNA içindir.

Erime eğrisi: PCR ürünü identifikasyonu/amplifikasyon analizi içindir.

Soğutma: Rotor ve Terminal bölme 45

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

46

www.roche-applied-science

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Master Mix Hazırlanması:

Reaksiyon mix şişesinin(1b-yeşil kapaklı) eritilir ve ışıktan uzak tutulmalıdır.

Enzimin bir şişesi(1b-beyaz kapaklı) ve eritilmiş reaksiyon mix şişesi hafifçe santrifüj edilir. Buza yerleştirilir.

10’ ar mikro litre 1a ve 1b şişesinden alınır.

saklanır.(ışıktan uzak tutulur) 47

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

Pipetasyon yapılır(vortexlenmez).

Etiketlenir ve pre-cooled light cycler santrifüj

adaptör cooling blocklarında kullanıma kadar

48

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

PCR Mix Hazırlanması:

Reaksiyonun total miktarına göre buzda saklanan

Light Cycler kapillerinin gerekli miktarı koyulur.

PCR primerinin 10 katı konsantrasyon solüsyonu

hazırlanır.

Buzda 1,5 ml reaksiyon tübünde, aşağıda belirtilen

içerikler eklenerek 20 mikrolitre PCR Mix

hazırlanır.

49

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

50 www.roche-applied-science

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

-Pipetasyon yapılır. Vortexlenmez.

-Her bir Pre-cooled Light Cycler kapiler içine 18

μl PCR Mix pipetlenir.

- 2 μl DNA eklenir. Kapiler kapağı kapatılır.

Standart Benchtop Mikrosantrifüj içine kapilerleri

içeren Santrifüj adaptörleri yerleştirilir.

51

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

-3,000 rpm’de santrifüj edilir.

Kapilerler Light Cycler Sample Carousel’ a

transfer edilir ve daha sonra Light Cycler aletine

aktarılır.

Sonra grafik okunur

52

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK

53

mole

ku

lce.co

m/T

uba

ER

TÜ

RK