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Verificación de métodos microbiológicos 3M™Petrifilm™frente a
métodos de referencia, para matrices específicas
Rocío Sanabria Aguirre y Olga Velázquez Madrazo
UNAM, Facultad de Química. 2018
Trabajo colaborativo2010 a 2017
Métodos de referencia
Métodos tradicionales, basados en cultivo
• Microbiológicos en México: • NOM-210-SSA1-2014. Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos.
Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.
• NOM 092-SSA1-1994, CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA.
• NOM-110-SSA1-1994. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS
• NOM-111-SSA1-1994, CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS
• NOM-113-SSA1-1994, MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES EN PLACA.
NOM-210-SSA1-2014.
• 3.15 Métodos alternativos aprobados: a aquéllos que se encuentran referidos en las referencias internacionales como AOAC . . . y que cuentan con validación internacional y verificación en el laboratorio de prueba, sólo pueden ser usados en el análisis del producto para el cual fue validado.
• Complejidad de las matrices.
• Requiere verificación, del laboratorio interesado, en la matriz específica.
Single laboratory validation ó In-house validation(Nordval, 2009).
NordVal, NMKL. Protocol for the validation of alternative microbiological methods. 2009. National VeterinaryInstitute. Norway. Disponible en: http://www.nmkl.org/NordVal/NordValprotocolmarch2009.pdf
Métodos Alternativos
• 3M Petrifilm
• Indudablemente más cómodos, confiables, económicos.
• ¿Aceptados por la autoridad? • NOM-210-SSA1
3M Petrifilm
• Tiempo de preparación
• Volumen en incubadora
•Estandarización
•Costo
3M Petrifilm
• Menor consumo de energía
• Menor gasto de agua
• Menos emisiones
• Menos residuos
Objetivo • Presentar resultados de verificaciones Petrifilm en matrices alimentarias mexicanas en 8 años.
• Resaltar la importancia de la adecuada verificación en matriz específica, para aprovechar las ventajas que tienen los métodos rápidos.
METODOLOGÍA
Metodología: MATRICES mexicanas
Miel de abeja
Lácteos:
Queso panela
Queso Oaxaca
Crema ácida
Arroz con leche
Yogures,
petitsuis
Alimentos de
bajo pH
Cárnicos:
Jamón de pavo,
de pavo y cerdo
Salchichas de pavo
Tortillas
Fécula de maíz
Humus, mayonesa
Y otros aderezos
Diluyentes
Metodología
• > 30 réplicas
• Muestras pareadas para MT y 3M Pf
• Blanco y
• 3 niveles de inóculo
• Estandarización de inóculos con Densimatde Biomerieux y cuenta en placa
Análisis Estadístico:
• t-student
• Diagrama cajas y bigotes
Metodología. Cepas utilizadas Matriz Determinaciones Microorganismos
Miel de abeja AC CCEsporulados en AC
S. aureus ATCC-6538 + E. coli ATCC-1122E. coli ATCC-1122B. cereus CFQ + Clostridium sp. CFQ
Alimentos de bajo pH:Jugo naranja y Aquafrut, yogures y PetiZoo
AC CCYM
S. aureus ATCC-6538 + E. coli ATCC-1122E. coli ATCC-1122Sacch. cerevisiae CFQ-L-25 + Penicillium sp. CFQ-H-75
Efecto de Diluyentes AC CC
S. aureus ATCC-6538 + E. coli ATCC-1122E. coli ATCC-1122
Lácteos: Q. Panela, Q. Oaxaca, crema, arroz con leche, yogures, PetiZoo
AC CCYM
S. aureus ATCC-6538 + E. coli ATCC-1122E. coli ATCC-1122Sacch. cerevisiae CFQ-L-25 + Penicillium sp. CFQ-H-75
Derivados cereales:Tortillas y Fécula de maíz
RYM
Pbas de no-interferencia :
Aspergillus niger CFQ-H-18-3 + P. chrysogenum CFQ-H-63-1Sacch. cerevisiae CFQ-L-26-3S. aureus ATCC-6538 + E. coli ATCC-1122
BAL en Cárnicos: Jamón: pavo,
pavo y cerdo, salchicha de pavo
LAB Leuconostoc mesenteroides NRRL 512FLactococcus lactis ssp lactis + Lactobacillus brevis
BAL en hummus y mayonesa LAB Leuconostoc mesenteroides NRRL 512FLactococcus lactis ssp lactis + Lactobacillus brevis
RESULTADOS
Resultados. Miel de Abeja
Xolalpa, A. 2012. Evaluación de características de inocuidad y calidad en mieles mexicanas. Tesis maestría, FMVZ, UNAM (Asesor: S. Rubio L.)
Mesófilos aerobios (Petrifilm AC): No hay diferencia significativa entre métodos (p > 0.05), a partir de dilución 10-2 o 2500UFC/gEn diluciones < 10-2 hay inhibición.
Coliformes totales (Petrifilm CC): No hay diferencia significativa entre métodos (p > 0.05), a partir de dilución 10-2 o 1500UFC/gEn diluciones < 10-2 hay inhibición.
Specs:Higiene, AC: 1000 UFC/g; Y: 100 UFC/g
Resultados. Miel de Abeja
Xolalpa, A. 2012. Evaluación de características de inocuidad y calidad en mieles mexicanas. Tesis maestría, FMVZ, UNAM (Asesor: S. Rubio L.)
Bacterias esporuladas aerobias y anaerobias (Petrifilm AC): No hay diferencia significativa entre métodos (p > 0.05), a partir de dilución 10-2 o 2500UFC/gEn diluciones < 10-2 hay inhibición.
Mohos y Levaduras (Petrifilm YM):No hay diferencia significativa entre métodos (p > 0.05)
Límite Levaduras 100 UFC/g
Resultados. Alimentos de bajo pH
Muestras semisólidas:
• Yogur de fresa
• Yogur bebible de fresa
• Petit suiss sabor mora
Se analizaron con y sin dilución.
Huerta Márquez, L. 2011. Comparación de método 3M Petrifilm™ con método tradicional para determinación de indicadores microbiológicos en alimentos de bajo pH. Tesis Licenciatura. UNAM, FQ. (Asesor: OVM).
Muestras líquidas:
• Aquafrut sabor uva
• Jugo de naranja Natural’es
Resultados. Alimentos de bajo pH
Aquafrut sabor uva:
• Si hay diferencia estadísticamente significativa, p<0,05 para los 3 indicadores
• Mejor desempeño de Petrifilm en los 3 indicadores
Aquafrut
Requiere BUFFER
DE FOSFATOS
PARA AC Y CC,
pH es inestable en
otros diluyentes.
Importancia de estandarización
Resultados. Alimentos de bajo pH
MT Petrifilm
Log
UFC
/g
MT Petrifilm
Resultados. Alimentos de bajo pH
Jugo Natural’es:
No hay diferencia significativa para AC
Si hay diferencia significativa para CC (MT mejor desempeño)
Si hay diferencia significativa para YM (Pf mejor desempeño)
MT PF
MT PF
MT PF
YM
CC
AC
Resultados. Alimentos de bajo pH
Muestras semi-sólidas:
• DEBEN DILUIRSE 1:10
• Falsos negativos sin dilución
• Fermentación, bacteriocinas, inhibición en ambos métodos,
• Petrifilm más afectado
Petrifilm no es útil para AC en las matrices lácteas con fermentación por BAL, por presencia de inhibidores.
NOM-110-SSA1-1994:• Solución reguladora de fosfatos• Agua peptonada
Guía Petrifilm:
• Solución reguladora de fosfatos
• Agua peptonada
• Buffer de sal peptona (ISO 6887);
• Solución salina isotónica estéril
Resultados. Diluyentes
Olvera Barrón, G. 2016. Evaluación del efecto de diferentes diluyentes para la recuperación de microorganismos indicadores en alimentos, empleando placas 3M Petrifilm. Tesis licenciatrua, FQ, UNAM. (Asesor: OVM)
NOM-210-SSA1-2014:• Agua peptonada• Buffer agua peptonada• Diluyentes + indicadores• Diluyente con tween 80
Resultados. Diluyentes
Matrices lácteas: queso, crema, yogur, arroz con leche
Jugo de naranja
Petrifilm AC y Petrifilm CC Métodos de Referencia
• Solución reguladora de fosfatos• Agua peptonada• Buffer de sal peptona (ISO 6887); • Solución salina isotónica estéril
Resultados. Diluyentes
Arroz con leche
Resultados. Diluyentes
Arroz con leche
Resultados. Diluyentes
CONCLUSIONES • Buffer de fosfatos da las mejores
recuperaciones• Petrifilm es menos afectado por el
diluyente• Agua peptonada tamponada genera
mayores diferencias entre métodos • Jugo de naranja por Petrifilm,
únicamente con buffer de fosfatos, pH inestable
Resultados. Productos Lácteos
Validaciones:
• “NMX -F-717-COFOCALEC-2006. Sistema Producto Leche-Alimentos-Lácteos-Análisis Microbiológicos de Leche y Derivados-Métodos de Prueba Rápidos”.
• AOAC
• AFNOR
MUESTRAS: crema ácida, queso panela, queso Oaxaca y el arroz con leche.
Ramírez Lima I.X. 2012. Validación de Petrifilm™ en matrices lácteas producidas en México. Tesis Licenciatura, FQ, UNAM. (Asesor: O.V.M.)
Resultados. Productos Lácteos
Diferencia significativa entre MT y MPf
Placa / Matriz Queso panela
Queso Oaxaca
3M™ Petrifilm™ AC
SI SI
3M™ Petrifilm™ CC
SI SI
3M™ Petrifilm™ YM
SI PF mayor
recuperación
SI PF mayor
recuperación
Resultados. Productos Lácteos
Diferencia significativa entre MT y MPf
Placa / Matriz Crema ácida
Arroz con leche
3M™ Petrifilm™ AC No SI
3M™ Petrifilm™ CC No SI
3M™ Petrifilm™ YMLevadurasHongos
NoSI PF mayor
recuperación
SI PF mayor
recuperación
Resultados. Productos Lácteos
Resultados de AC en arroz con leche
Resultados. Productos Lácteos
Matriz INDICADOR t-tablas
t-experimental
Mejor Desempeño
Resultados. Tortilla y fécula de maíz
Sanabria Aguirre, R.A. 2016. Validación de la placa 3M Petrifilm RYM para la determinación rápida de mohos y levaduras en matrices mexicanas. UNAM, FQ, Tesis de licenciatura. (Asesor: OVM)
Fotos: Sanabria, 2015
PETRIFILM RYM en cereales y derivados:Gran facilidad de interpretación
Resultados. Tortilla y fécula de maíz
Resultados. Tortilla y fécula de maíz
Resultados. Tortilla y fécula de maíz
Levaduras: No hay diferencia significativa, no hay interferencia con bacterias.
Mohos: Diferencia significativa, Mejor desempeño de Petrifilm RYM
FACILIDAD DE INTERPRETACIÓN
Resultados. Cárnicos
BAL relacionadas con deterioro de cárnicos al vacío:
Limo, olor, sabor, abombamiento de empaque, coloración o decoloración (Kempton & Bovier, 1970).
• Lactobacillus homofermentativos
• Lb. viridiscens heterofermentativo
• Carnobacterium psicrótrofos
• Leuconostoc spp (Forsythe, 2002)
Durán de León, P. 2013. Evaluación de placas 3M Petrifilm para el recuento de bacterias lácticas en productos cárnicos procesados y para estimación de vida de anaquel. Tesis de Licenciatura, UNAM, FQ. (Asesor: OVM)
Resultados. Cárnicos
Jamón de pavo
Jamón de pavo y cerdo
Salchicha de pavo
Vida de anaquel 40 días
Refrigeración durante 44 días,
9 muestreos 105 UFC/g
Resultados. Cárnicos
72 a 96+2 h
Jarra+GaspackJarra+Gaspack
Resultados. CárnicosDiagramas de cajas y bigotes para jamón de cerdo y pavo, inoculado
con Leuconostoc mesenteorides con Lactococcus lactis spp lactis y Lactobacillus brevis
Resultados. Cárnicos
Resultados. Cárnicos
Detección oportuna de BAL:
PFANA
PFAE
MT
cuantificar bacterias ácido-lácticas en productos cárnicos procesados y para estimación de vida de anaquel
Resultados. Hummus y mayonesa
Lozano R.P. 2018. Comparación de Métodos tradicional y 3M Petrifilm-LAB para la recuperación de bacterias ácido lácticas en matrices alimentarias elaboradas en México. Tesis licenciatura en revisión final (Asesor: OVM)
Resultados. Hummus y mayonesa
Hummus (2 marcas):
• Si hay diferencia significativa
• facilita diferenciación UFC (violeta) y alimento (azul)
• MT sobreestima UFC por confusión con partículas
• Diferencia homo y heterofer-mentativas
Resultados. Hummus y mayonesa
Mayonesa (3 marcas):
• homogenización
• Temperatura de incubación inadecuada, aún con cepas de referencia
• Óptima: 30 oC
• Inhibición en dilución 10-1, por conservadores (benzoatos o sorbatos, 3 a 6mg/g)
• No hay diferencia significativa entre métodos
Conclusiones
• La verificación para CADA MATRIZ ESPECÍFICA, es INDISPENSABLE.
• El proceso de verificación genera aprendizaje en el analista.
•Petrifilm es excelente opción
• La estandarización de la técnica es muy importante.
GRACIAS!!
Protocolos de validación de métodos
• ISO 16140 Protocol for validationof alternative methods y EU Directive 2073/2005: Microbiological criteria for foodstuffs
• AOAC International Rapid Methods Validation Process
• AOAC Guidelines For Validation Of Qualitative And Quantitative Food Microbiological Official Methods Of Analysis published J. Assoc. Off. Anal. Chem. 85, 1187-1203 (2002)
Protocolos de validación de métodos
• ISO 16140 Protocol for validation of alternative methods y EU Directive2073/2005: Microbiological criteria for food stuffs
Requiere:• Métodos ISO O CEN (Comité Europeo de Normalización o European
Committee for Standardization y• Certificación por terceros
• AFNOR: French National Organization for Standardization• MicroVal: European certification body for microbiology methods• NordVal: Nordic certification body: Denmark, Finland, Iceland,
Norway, Sweden
AOAC
Protocolos de validación de métodos
• AOAC
Requiere:
Precolaborativo y colaborativo
Resultados de “First action” y
“Final action”