Precisión

La precisión podrá establecerse en términos de repetibilidad y reproducibilidad. El grado de

precisión se expresa habitualmente en términos de imprecisión y se calcula como

desviación estándar de los resultados.

A) Repetibilidad: Es la precisión bajo las condiciones de repetibilidad, es decir,

condiciones donde los resultados de análisis independientes se obtienen con el

mismo método en ítems de análisis idénticos en el mismo laboratorio por el mismo

operador utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo.

Se puede determinar registrando a lo menos 6 mediciones bajo las mismas

condiciones (mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en corto

intervalo de tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Calcular la

Desviación Estándar (Sr) y el porcentaje de coeficiente de variación (CVr%).

b) Reproducibilidad: Es la precisión bajo las condiciones de reproducibilidad, es

decir, condiciones donde los resultados de los análisis se obtienen con el mismo

método en ítem idénticos de análisis en condiciones diferentes ya sea de laboratorio,

diferentes operadores, usando distintos equipos, entre otros. Para determinar la

precisión de la reproducibilidad intralaboratorio (Ri) (es decir, la precisión dentro de

un laboratorio), se sugiere realizar 3 mediciones de un Material de Referencia

(MRC o material control) una vez por cada semana o el comportamiento de la curva

de calibración en 3 días distintos. También, se puede determinar registrando a lo

menos 10 mediciones en días distintos, o en un mismo día cambiando a lo menos

una condición analítica (ejemplo: operador, aparato, reactivos y largo intervalo de

tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Calcular la desviación estándar

(SRi) y el porcentaje de coeficiente de variación (CVRi%).

Exactitud

El manual del Codex Alimentarius define la exactitud como el grado de concordancia entre

el resultado de un ensayo y el valor de referencia.

El término “exactitud”, esta aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y supone

una combinación de componentes aleatorios y un componente común de error sistemático o

sesgo.

Cuando se aplica a un método de ensayo, el término “exactitud” se refiere a una

combinación de veracidad y precisión. En el siguiente esquema de “Tiro al Blanco”,

ampliamente utilizado para ejemplificar esto, los punto u orificios equivaldrían a los

resultados analíticos y el círculo rojo al centro el rango en el cual se espera este el valor de

referencia (o verdadero).

Como se puede observar entre más veraz y preciso sea un resultado analítico, es más

exacto.

Linealidad

[1]

La linealidad es la capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado intervalo,

de dar una respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la cantidad del

analito que se habrá de determinar en la muestra de laboratorio. Con el fin de determinar el

rango lineal se puede realizar mediante un gráfico de concentración versus respuesta, que

se conoce como Función Respuesta (normalmente llamada recta de calibrado). Esta se

establece cada día con una cierta cantidad de valores formados por un blanco y los patrones

de trabajos limpios de valor teórico conocido, que cubran el intervalo de trabajo. En este

sentido se recomienda abarcar valores desde cercano al cero y valores superiores al LMP o

al valor de interés. El número de puntos a analizar deberá ser establecido por el analista (en

general, se utiliza un mínimo de 4 valores).

Luego de realizar el gráfico se puede observar el comportamiento de la curva y establecer

cualitativamente el rango lineal (fig.1). Después de establecer el comportamiento lineal del

método se deberá realizar la Curva de trabajo o curva de calibración (fig.2). Graficar los

datos de concentración de los estándares de calibración estimados (X) v/s la lectura

observada (Y).

Figura 1 Figura 2

Evaluar los estimadores de regresión lineal del gráfico: la pendiente (m), el coeficiente de

correlación (r) y el punto de corte (intercepto) con el eje de las Y (L0).

[2]

En general el criterio de aceptación cualitativo que se usa para determinar la linealidad es el

coeficiente de correlación:

El coeficiente de correlación indica el grado de relación entre la variable concentración (X)

y la variable respuesta (Y) de la curva de calibración. Los valores máximos que puede

alcanzar son –1 y 1. El valor máximo de 1 indica una correlación positiva perfecta (entre X

e Y) con una pendiente positiva. Cuando r=0, no existe correlación alguna, independencia

total de los valores X e Y.

En la práctica si r tiene un valor cercano a uno (1), esto significa que existe correlación con

una probabilidad elevada. Para una curva de calibración o trabajo, es recomendable que el

coeficiente de correlación obtenido sea mayor o igual a 0.999, aunque para el caso de trazas

se admite un valor igual o mayor que 0.99.

Límite de Detección (LD).

El límite de detección se define como la mínima cantidad de analito en la muestra que se

puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo las condiciones experimentales

establecidas. El límite de detección es un término solo cualitativo. No debe confundirse este

término con otro al que normalmente se asocia, la sensibilidad, ya que esta es la capacidad

de un método de análisis para discriminar pequeñas diferencias en concentración o masa

del analito. Una alta sensibilidad del método analítico no siempre permite suponer

inferiores límites de detección, ya que lo que definiría este límite es la relación entre el

ruido y la señal debida al analito.

Límite de Cuantificación (LC).

El límite de cuantificación de un método, corresponde a la mínima cantidad de analito

presente en la muestra que se puede cuantificar, bajo las condiciones experimentales

descritas, con una adecuada precisión y exactitud. El límite de cuantificación es un término

cuantitativo, encontrándose entre este y el límite de detección un rango de concentraciones

[3]

en el que si bien no puede cuantificarse el analito en cuestión con razonable certeza, si

puede detectarse su presencia sin incurrir en falsos positivos. Existen diversos métodos de

análisis y equipos instrumentales, dependiendo de cada uno se elige el método para hallar

tanto el límite de detección como el de cuantificación, a continuación se mencionan algunos

métodos para calcularlos.

Método Basado en la Relación Señal/Ruido.

Uno de los empleados, requiere que el procedimiento de análisis sea instrumental y que

proporcione una señal blanco, un ruido de fondo o una línea de base, es decir una señal

residual a concentración de cero analito (espectrofotometría UV-visible). Este

procedimiento presenta la desventaja de que en numerosas ocasiones al llevar a cabo la

comprobación experimental del LC calculado, se observa que es posible obtener resultados

igualmente precisos y exactos aun cuando se desciende más en la concentración límite.

Método Basado en la Desviación Estándar de la Respuesta del Blanco y la Pendiente

de la Recta de Calibrado.

De acuerdo con la IUPAC, puede calcularse el LD y LC de un método analítico a partir del

conocimiento de la desviación estándar atribuible a la respuesta de una muestra y la

pendiente de la recta de calibrado del analito. La expresión a aplicar para este cálculo varía

en función de si el método instrumental empleado corrige la señal frente a un blanco

(métodos espectrofotométricos) o no (métodos cromatográficos).

Método Basado en la Extrapolación de la Recta de Calibrado a concentración Cero.

Se trata de un procedimiento aplicable también a métodos analíticos instrumentales que

proporcionan resultados numéricos y dirigido a evitar el cálculo, en ocasiones costoso en

tiempo, de la señal media del blanco y su desviación estándar. Utilizando como en el

anterior la pendiente de la recta de calibrado, pero en este caso sustituye el valor real de un

blanco, por la extrapolación de dicha recta.

[4]

Sensibilidad.

Es una medida del factor de respuesta del instrumento como una función de la

concentración. En contraste con el límite de detección, la sensibilidad de un método está

definida como la habilidad para distinguir entre diferentes concentraciones. Para métodos

donde la respuesta con respecto a la concentración es una función lineal, la sensibilidad es

constante con respecto a la concentración y es igual a la pendiente de la curva de

calibración. Contrariamente a las funciones lineales, la sensibilidad de métodos cuando su

respuesta es no-lineal cambia con la concentración del analito.

EJEMPLO DE APLICACIÓN

Los autores del artículo se proponen desarrollar y validar un método para la cuantificación

de Moxifloxacin en medicamentos contra la conjuntivitis mediante la espectroscopía UV-

Visible. Se realizó una curva de calibración de MOX utilizando una solución estándar.

Posteriormente se molieron las tabletas médicas, se pesó el equivalente a 25 mg de MOX

teóricos y se disolvieron en 100 mL de agua destilada, se filtraron y se realizó una dilución

de 0.4 mL del filtrado en 10 mL de agua destilada para obtener una concentración

aproximada de 10 µg/mL. Se repitió seis veces este procedimiento y los resultados se

procesaron estadísticamente para determinar la concentración de analito gracias a la curva

de calibración para posteriormente calcular la concentración de MOX por tableta y

compararlo con el valor reportado por el vendedor.

[5]

Los parámetros para validar el método se evaluaron de la siguiente manera:

Linealidad

La linealidad del método fue determinada cualitativamente, graficando la absorbancia de

soluciones estándar y se determinó el rango de linealidad entre 1 y 20 µg/mL de

Moxifloxacin.

Exactitud

Se determinó la exactitud mediante el método de adición estándar, donde se analizaron las

muestras médicas y se fortificaron con la solución estándar por porcentajes de 80, 100 y

120% la concentración teórica de analito, cada una por triplicado. Se evaluó la recuperación

la cual resultó en porcentajes de recuperación de 98 – 100% por lo que se obtiene este

porcentaje de exactitud en el método.

Precisión

Se realizaron 6 veces los análisis y los resultados se evaluaron estadísticamente. Se

encontró un resultado promedio de 397.036 mg/tableta con una desviación estándar de +/-

0.669 mg/tableta. El porcentaje de variación fue entonces de 0.168 %, indicador de una

muy alta precisión en las repeticiones.

Selectividad

La selectividad del método fue evaluada monitoreando una solución estándar de MOX en

presencia de excipientes a la misma concentración que la tableta y se realizó el mismo

procedimiento de obtención de una curva de calibración. Los excipientes no mostraron

ningún efecto en la estimación de la concentración de MOX por lo que se puede afirmar

que el método está libre de interferencias causadas por los excipientes de las tabletas.

Límites de detección y cuantificación

Los límites de detección y cuantificación fueron calculados como 3.3σ/S y 10σ/S

respectivamente, donde σ es la desviación estándar de la respuesta (ABS) y S la pendiente

de la curva de calibración. Los resultados obtenidos fueron de 0.588 µg/mL para el LOD y

[6]

1.764 µg/mL para el LOQ. Como las concentraciones medidas se encontraron bien por

encima de estos valores, los resultados son válidos.

De esta forma se validó este método para la cuantificación de MOX en tabletas para

conjuntivitis, ya que se comprobó que fue preciso, exacto, selectivo, la linealidad fue

adecuada y los valores determinados se encontraron por arriba de los límites de detección y

cuantificación.

[7]

Referencias

Aguirre L, et al. (2001). Validación de métodos analíticos. Ed. Asociación Española de

Farmacéuticos de Industria, Barcelona.

James N. Miller, Jane C. Miller. (2002). Estadística y Quimiometría para Química

Analítica. Ed. Pearson, ed. 4ª.

Aguirre, L., et al., (2001). Validación de métodos analíticos, ed. A.E.F. Industria. España.

Coy, G. (1999). Protocolo. Estandarización de métodos analíticos, ed. I.D.E.A.M.P.F.

Ambiental. Bogotá, Colombia. Pp. 4 - 5.

Rius, F. et al. (2000). La validación de métodos analíticos. Revista Técnicas de laboratorio 252. Pp. 382-385.

Riley, C. & Rosanke, T. (1996). Development and validation of analytical methods. 1 Ed, ed. E. Science. Great Britain.

Tarkase, K. et al. (2012). Development and validation of UV-Spectrophotometric Methods for Determination of Moxifloxacin in Bulk and Pharmaceutical Formulations. Der Pharma Chemica 4, (3). Pp. 1180 – 1185.

[8]