“Validación de métodos cualitativos para la detección …bvs.panalimentos.org/local/File/INCLUSIONES2008/5GSS_AVANZADO... · La mayoría de los parámetros cualitativos se expresan

Servicio Fisiopatogenia, Departamento BacteriologíaINEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

Gerardo Leotta

IV CURSO AVANZADO WHO GSS 2006

Buenos Aires, 15 - 24 de Mayo

““ValidaciValidacióón de mn de méétodos cualitativos para todos cualitativos para la deteccila deteccióón de STEC en alimentosn de STEC en alimentos””

Martes 16 de mayo

El 11 de mayo de 2004, se incluyó en el Código Alimentario Argentino el artículo 156tris y se modificaron los artículos 255 y 302.

Especificaciones microbiológicas

Productos preparados a base de carne picada una vez cocidos:ausencia de E. coli/g y ausencia de E. coli O157:H7/NM en 5 muestras de 65 g cada una

Carne picada fresca y chacinados frescos: E. coli máximo 5 x 102 UFC/g, y ausencia de E. coli O157:H7/NM en 5 muestras de 65g cada una.

Para la detección de E. coli O157:H7 y O157:NM en productos cárnicos se recomienda la metodología validada por USDA/FSIS.

CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO

Separacióninmunomagnética

Medios selectivos y diferenciales

37 ºC 20 h

PCR múltiple

Muestra65 g

Detección de E. coli O157:H7/NM según USDA/FSIS

Caldo de enriquecimiento

ECm + novobiocina585 ml, 37ºC, 18 h

(Figura 1)

Inmunocromatografía

ELISA

PCR MK

Resultado negativo

Identificación ycaracterización de una colonia aislada

AISLAMIENTO TAMIZAJE

Resultado positivo

Tipos de pruebas diagnTipos de pruebas diagnóósticas para la deteccisticas para la deteccióón n de STEC O157:H7/NMde STEC O157:H7/NM

TamizajeTamizaje inmunocromatografinmunocromatografííaaELISAELISAaglutinaciaglutinacióón reversa pasiva (RPLA)n reversa pasiva (RPLA)PCRPCR

AislamientoAislamiento separaciseparacióón n inmunomagninmunomagnééticaticainmunocapturainmunocapturainmunoconcentraciinmunoconcentracióónnmedios medios cromogcromogéénicosnicos, , fluorogfluorogéénicosnicos, selectivos , selectivos

ConfirmatorioConfirmatorio PCRPCRidentificaciidentificacióón bioqun bioquíímicamicaserotipificaciserotipificacióónncitotoxicidadcitotoxicidad en cen céélulas Verolulas Veroaglutinaciaglutinacióón reversa pasiva (RPLA)n reversa pasiva (RPLA)

ValidaciValidacióónn

Capacidad de medir aquello que se pretende Capacidad de medir aquello que se pretende

medir respecto a un patrmedir respecto a un patróón oro externon oro externo

Métodos del propio laboratorio (In house) para su uso adecuado deben estar perfectamente documentados y validados.

Métodos de revistas científicas (Literature methods) deben usarse con suma precaución y con previa validación.

Métodos oficiales son de uso exigido por organismos gubernamentales y satisfacen regulaciones estatales. Los mismos fueron previamentevalidados.

Métodos estándar son los de mayor calidad analítica. Son desarrollados por organizaciones de prestigio y están rigurosamente validados.

Validación de métodos analíticos

Método cualitativo

Método de análisis cuya respuesta está basada en la presencia o ausencia del analito, detectado directa o indirectamente

(AOAC 2002)

La mayoría de los parámetros cualitativos se expresan en términos probabilísticos (Trullols 2004)



Método cualitativo

Rango de trabajoLímite de detecciónLímite de corte

SelectividadInclusividadExclusividad

Robustez



37 ºC 20 h

PCR múltiple

Muestra65 g




(Figura 1)


ELISA

PCR MK

Resultado negativo



Resultado positivo


TAMIZAJETAMIZAJE

Inclusividad: 98%

Exclusividad: 90%

Detección de falsos negativos: 2%

Detección de falsos positivos: 10%

PCR MK para la detecciPCR MK para la deteccióón de los genes n de los genes stxstx1 y 1 y stxstx22

Servicio Fisiopatogenia, Departamento de BacteriologíaINEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

Laboratorio de Microbiología de Alimentos D.L.I.M. - D.G.H.y S.A., G.C.B.A.

TAMIZAJETAMIZAJE

PCR MK para la detecciMK para la deteccióón de los genes n de los genes stxstx1 y 1 y stxstx22

Secuencia nucleotídica de los primers utilizados

Karch y Meyer, 1989.

CACATATAAATTATTTCGCTCMK 2224 - 227TTTACGATAGACTTCTCGACMK 1

Tamaño del fragmento amplificado (pb)

Secuencia del primer (5’-3’)Primer


104 103 102 101 100 104 103 102 101 100

Cepa E. coli EDL 933 O157:H7 stx1/stx2

+ - s/t

Tº annealing: 48ºC Tº annealing: 53ºC


1 10 102 103 1 10 102 103 1 10 102 103 1 10 102 103 C/S

Carne sin aditivo Carne sin aditivoCarne con aditivo Carne con aditivo

+ - s/t

ECm 8 h de incubación ECm 18 h de incubación

Cepa E. coli EDL 933 O157:H7 stx1/stx2

¿Cómo nos aseguramos que la muestra es realmente negativa?

El Comité de Estandarización Europeo (CEN) y la Organización Internacional de Estandarización (ISO)

propusieron la utilización de un control interno de amplificación en cada mezcla de reacción de PCR

Muestra negativa: mal funcionamiento del termocicladorerrores en la mezcla de reacciónbaja actividad de la polimerasainhibidores en la matriz del alimento

Control Interno de Amplificación (IAC)

Secuencia de ADN presente en el mismo tubo de reacción, que es coamplificada simultáneamente con el extracto de ADN

obtenido de la muestra problema

IAC no competitivo

IAC competitivo

IAC NO COMPETITIVOOrigen del IAC: genoma del organismo blanco (16S o 23S)

ADN de otro microorganismo

Muestra +, IAC - : problemas en la reacción IACMuestra -, IAC - : problemas en la reacción IAC, muestra ??Muestra -, IAC +: muestra ??

No hay competencia por los primers

Diferente set de primers (dos reacciones diferentes simultáneamente)Mismas condiciones de PCR

Inseguridad en la amplificación de la secuencia blancoLa reacción de PCR subeficiente para ambas reaccionesPuede utilizarse en diferentes PCR

IAC COMPETITIVO

Origen del IAC: microorganismos recombinantes amplicones

Siempre hay competencia por los primers

Mismo set de primers

Mismas condiciones de PCR

Muestra +, IAC - : OKMuestra -, IAC - : problemasMuestra -, IAC +: la muestra es negativa

Baja el límite de detección de la PCR, falsos negativos si hay exceso de IAC

Tamaño, debe ser inferior a la secuencia blanco e inferior a 500 pb

btención de la secuencia blanco por deleción

Desarrollo del IACCR MK para la detecciCR MK para la deteccióón de los genes n de los genes stxstx1 y 1 y stxstx22

Conservación de las células transformadas

Clonado del fragmento IAC obtenido por PCR

Transformación de células competentes

CR MK para la detecciCR MK para la deteccióón de los genes n de los genes stxstx1 y 1 y stxstx22

AC competitivo

170 pb224-227 pb


106 105 104 103 102 106 105 104 103 102

106 105 104 103 102 106 105 104 103 102

106 105 104 103 102

+ - s/t

+ - s/t

ATCC 25922 E. coli ONT stx1 E. coli O26 stx1

E. coli O157 stx1/stx2 E. coli O145 stx2


xclusividad (n:30)

nclusividad (n:50)


ROBUSTEZ

Operador I, Termociclador I

Operador II, Termociclador II

4 5 6 7 8 9 10 + - M

Día 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + - M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + - M

4 5 6 7 8 9 10 + - M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + - M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + - M

Día 2 Día 3

B + DA + C∑

C + DD

Verdadero negativo

CFalso positivonegativo

A + BB

Falso negativoA

Verdaderopositivo

positivo

negativopositivoCitotoxicidad específica en

células Vero

∑PCR MK + IAC

PCR MK + IAC. Análisis de los resultados

Inclusividad (%) = A : (A+B) x 100

Exclusividad (%) = D : (C+D) x 100

Valor predictivo positivo (%) = A : (A+C) x 100

Valor predictivo negativo (%) = D : (B+D) x 100

Precisión analítica (%) = (A+D) : (A+B+C+D) x 100


Comparación de los resultados obtenidos con el ADN correspondiente a 105 UFC/50 µl de mezcla de reacción

100%100%100%100%100%1 x 105

Precisión analítica

Valor predictivonegativo

Valor predictivopositivo

ExclusividadInclusividadUFC/50 µl



Carne con aditivo Carne con aditivoCarne sin aditivo Carne sin aditivo

Carne con aditivo Carne con aditivoCarne sin aditivo Carne sin aditivo

E. coli O157:NM stx1/stx2 E. coli O145:NM stx2

E. coli ONT:H19 stx1 E. coli O26:H11 stx1

1 10 102 103

0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10 0,1 1 10 102

+ - s/t M

+ - s/t M

1 10 102 103 1 10 102 103 1 10 102 103

0,1 1 10 102



37 ºC 20 h

PCR múltiple

Muestra65 g




(Figura 1)


ELISA

PCR MK

Resultado negativo



Resultado positivo

Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga

CONFIRMACIONCONFIRMACION

G.A. LEOTTA, I. CHINEN, S. EPSZTEYN, E. MILIWEBSKY, I.C. MELAMED, M. MOTTER, M. FERRER, E. MAREY, M. RIVAS

Servicio Fisiopatogenia, INEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”Laboratorio de Microbiología de Alimentos DLIM-DGHySA, G.C.B.A.

Revista Argentina de Microbiología 37 (1): 1-10

Productos de amplificación por PCR para la detección de los genes stx1, stx2 y rfbO157

Comparación de dos técnicas de extracción de ADN utilizando la cepa E. coli EDL 933 O157:H7 stx1/stx2.

------2 x 102

---+D+D+D2 x 103

---+++2 x 104

+D+D+D+++2 x 105

++++++2 x 106

stx1rfbO157stx2stx1rfbO157stx2

Kit Wizard™ (Promega)Tritón X-100 al 1% en buffer TE 1X

UFC/50 µl de mezclade reacción de PCR

Con buffer Tritón X-100 al 1% en buffer TE 1Xse obtuvieron buenos resultados.

No hubo interferencias, es menos laboriosa, más rápida y económica

Comparación de dos técnicas de extracción de ADN utilizando la cepa E. coli EDL 933 O157:H7 stx1/stx2.

Comparación de los resultados obtenidos con el ADN correspondiente a 105 UFC/50 µl de mezcla de reacción

100%100%100%100%100%1 x 105

Precisión analítica

Valor predictivonegativo

Valor predictivopositivo

ExclusividadInclusividadUFC/50 µl

PCR múltiple - Análisis de los resultados

Servicio Fisiopatogenia, Departamento de BacteriologíaINEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

GRACIAS POR SU ATENCIÓN

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“Validación de métodos cualitativos para la detección …bvs.panalimentos.org/local/File/INCLUSIONES2008/5GSS_AVANZADO... · La mayoría de los parámetros cualitativos se expresan