Dra. Alejandra Aquino Andrade

Febrero 2015

Vectores de clonación

Clon: es una colección de organismos idénticos que se derivan de un único ancestro.

Clon

La clonación molecular involucra dos estados generales: El DNA de alguna fuente en particular es cortado y

liberado, puede ser un gen o un fragmento de interés. Este fragmento es entonces clonado por su inserción

en otro DNA, conocido como vector.

Clonación molecular

Insertar un segmento de DNA de interés en una molécula de DNA que se replica autónomamente, llamada vector de clonación o vehículo de forma que el segmento de DNA es replicado con el vector.

Chimera monstruo de la mitología griega que tiene cabeza de león, cuerpo de cabra y cola de serpiente

Vectores de clonación

Una quimera es entonces una molécula de DNA híbrida, como un vector más un gen clonado, el cual ha sido construido de dos diferentes fuentes de DNA.

1. Seleccionar una molécula pequeña de DNA capaz de replicarse (Vectores de clonación o vehículo).

2. Cortar el DNA en una localización precisa

3. Unir estos dos fragmentos de forma covalente (DNA recombinante).

4. Introducir el DNA recombinante a una célula huésped

5. Seleccionar o identificar las células huésped que contienen el DNA recombinante.

Clonación de DNA

Los métodos involucrados en llevar a cabo estos procesos son referidos como tecnología del DNA recombinante o más informalmente ingeniería genética.

Características generales de los vectores

El vector debe ser una molécula de DNA razonablemente pequeño y manejable

El movimiento del vector de célula a célula.

Generar y purificar grandes cantidades del DNA del vector

Detectar la presencia del vector

Seleccionar directamente las células que contienen al vector

Insertar genes en el vector

Detectar la presencia de un gen insertado en el vector

Tipos de vectores

Plásmidos Virus Cromosomas artificiales

Vectores plasmídicos

Características de vectores plasmídicos 1

10kb

Replicación (sitio ori)

Varias copias por célula

Contener al menos un sitio de clonación

Enzimas de restricción

Son endonucleasas que cortan DNA de doble cadena Se unen a DNA en una región específica (sitio de

reconocimiento) Los sitios de reconocimiento son regiones invertidas

de 4,6 y 8 bases

Tipos de enzimas de restricción

Tipo I Cortan el DNA lejos del sitio de reconocimiento Tipo II Cortan el DNA en el sitio de reconocimiento -Generan extremos romos o cohesivos

Sitios de clonación

Fragmento de DNA sintetizado artificialmente 50pb Se mantiene la estructura del plásmido Dirección

Características de vectores plasmídicos 1

10kb

Replicación (sitio ori)

Varias copias por célula

Contener al menos un sitio de clonación

Características de vectores plasmídicos 2

Marcadores de selección

Detección de resistencia 1 b-lactamasas: Enzimas que catalizan la ruptura del enlace amida del anillo b-lactámico Codificadas por genes bla

Detección de resistencia 2

Medio de cultivo suplementado con

ampicilina

Medio de cultivo suplementado con

ampicilina

Medio de cultivo suplementado con

ampicilina

Plásmidos de la serie pBR

10-20 copias por célula Inactivación por inserción

Serie pBR

pBR: Inactivación por inserción Las células que reciben el plásmido sin el inserto deberán resistir a ambos antibióticos, y aquellas que reciben el plásmido con el inserto resistirán solo al primer antibiótico.

Plásmidos de la serie pUC 200-1000 copias/ células pUC18 Los plásmidos de la serie pUC están basados es pBR322 del cual

poseen el 40% del DNA Los vectores pUC tienen MCS. ampr permite seleccionar a las bacterias que reciben una copia

del vector. Tienen elementos genéticos que proveen una manera

conveniente para escanear los clones con el DNA recombinante.

Los sitios múltiples de clonación están dentro de la secuencia que codifica la porción N-terminal (a- péptido 146 aa) de la enzima b-galactosidasa (lacZ´). pUC19

La bacteria huésped usada para los vectores pUC lleva el fragmento que codifica para la porción C-terminal de b-galactosidasa. Pueden complementarse in vivo, en un proceso llamado a-complementación

a-complementación

Los MCS han sido cuidadosamente construidos para preservar el marco de lectura de b-galactosidasa

Insertos más largos

destruyen la función del gen

Sitio múltiple de clonación

Sustrato cromogénico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactopiranósido)

5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole

galactosa

5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo

http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector_pages/plasmid_pages/all_plasmid.html

VECTORES VIRALES

FAGOS COMO VECTORES DE CLONACIÓN

Dr. Fred Blattner

Fagos Charon

Los fagos tienen una ventaja natural sobre los plásmidos: infectan células de manera más eficiente

Charon & Río Styx

Vectores basados en el fago l

Aproximadamente un tercio de su genoma no es esencial y puede ser remplazado.

Las partículas fágicas solo se forman si el DNA es de 40,000 a 53,000 bp

23 Kb

Fago-DNA recombinante se empaqueta dentro de una partícula al añadir el extracto crudo de células bacterianas que contienen todas las proteínas necesarias para ensamblar un fago completo

Empaquetamiento in vitro

Cósmidos

Es un plásmido que contiene un sitio cos y como todos los vectores plasmídicos tienen: • un origen de replicación • un marcador de selección • un sitio de clonación. Puede utilizarse para clonar fragmentos de hasta 45 kb

Empaquetamiento de DNA en la cabeza del fago requiere una secuencia de 14 bp específica conocida como sitios cos • Situados en ambos extremos • Estén separado por 36-51 kb.

5. Esta construcción puede ser empaquetada en partículas l in vitro y ser usada para infectar a E. coli. Se replica como plásmido

1. El cósmido en forma lineal

2. El fragmento de interés y el cósmido deben ser cortados con la misma enzima de restricción .

3. La ligación de las dos piezas del cósmido permite obtener un DNA con sitos cos en cada uno de sus extremos.

4. Empaquetar in vitro.

1

2

3

4

5

Vectores provenientes de M13

Fago de cadena sencilla Introdujeron en el fago M13 el fragmento del gen de la b-galactosidasa. No pueden mantener > 1kb Puede ser utilizado para ensayos de mutagénesis dirigida, secuenciación

1. Un fragmento de DNA y el fago es cortado con la misma enzima de restricción

2. Ligación

3. Célula huésped

4. Forma replicativa

1

2

3

4

4

Fagémidos

Producen DNA de cadena sencilla Poseen características de plásmidos y fagos La variedad más utilizada pBS (Bluescript) Poseen un sitio múltiple de clonación (lacZ) Tiene un origen de replicación del fago F1,

el cual esta relacionado con M13 (DNA una cadena).

Esta clase de vectores tienen MCS que esta flanqueado por dos diferentes promotores de RNApol.

pBS tiene el promotor T3 de un lado y del otro T7, esto permite aislar el DNA fágico de doble cadena y transcribirlo in vitro con alguna de las dos polimerasas para producir transcritos de RNA correspondientes a cada hebra.

Una vez que un gen ha sido clonado en un vector, este puede ser o no

expresado

Si el gen estructural y el promotor son clonados en el mismo segmento de DNA el gen podría ser expresado. Por otro lado, si solo el gen fue clonado entonces la expresión dependerá de que el promotor se encuentra dentro del plásmido.

VECTORES DE EXPRESIÓN

Vectores de expresión

Vectores de clonación con señales necesarias para regular la expresión de un gen clonado

Elementos de un vector de expresión

Secuencias promotor y operador Sitio de unión a ribosomas Sitio múltiple de clonación Secuencia terminación de

transcripción Marcador de selección Sitio ori Gen codificante para represor

(unión a operador o promotor)

Tipos de promotores

Promotores fuertes: Altos niveles del producto son requeridos

Promotores de regulación estricta:

Utilizados en experimentos fisiológicos donde el efecto de la expresión genética son evaluados bajos varias condiciones.

Promotor trp (del operón del triptofano)

Tiene la región promotora/operadora seguida por un sitio de unión a ribosoma

Puede ser usado como un vector de expresión directamente insertando el gen de interés en el sitio ClaI

La región control trp puede ser eliminada por el corte con ClaI y HindIII e insertarlo en otro vector

Vectores de expresión con promotores fuertes

Mantienen al gen clonado apagado mediante la represión. En algunos casos los genes clonados son eficientemente expresados, el producto de interés constituye el 10% de las proteínas. A estas concentraciones pueden matar o intervenir con el crecimiento de la bacteria huésped .

Promotores inducibles

Operón lac Un promotor (p), un operador (o), un lugar de unión de la proteína activadora de catabolito CAP (c), Tres genes estructurales en un mRNA policistronico (lacZ, lac Y, lac A) y un gen estructural que produce la proteína represora Lac (lacI)

El promotor lac de E. coli es inducible Es estimulado por el inductor isopropiltiogalactosidasa (IPTG)

Promotor lac

La represión causada por el represor lac es débil, la expresión de los genes clonados puede observarse, incluso en ausencia del inductor.

Construcción de plásmido o fagémido que lleve su propio gen represor lacI como el pBS. El exceso del represor produce que el mantenga al gen clonado apagado hasta el momento en que el inductor (IPTG) se adicione.

Promotor controlado PL del fago l

Las células huésped (cl857) poseen un gen represor l que codifica para la proteína cl

La proteína cl represora es sensible a la temperatura

32°C- reprime 42°C - EXPRESA

Promotor PL del fago l

Promotor fuerte

La transcripción solo ocurrirá si la bacteria huésped contiene el gen de la RNA polimerasa T7

El gen de la RNA polimerasaT7 puede estar bajo el control de un promotor lac modificado en una célula que también pueda llevar el represor lac

Promotor del fago T7

El gen de la polimerasa T7 es fuertemente reprimido hasta que el inductor esté presente

La transcripción del gen de interés no puede llevarse a cabo porque el promotor T7 requiere de propia polimerasa

Controla alternadamente la expresión de la RNA polimerasa T7.

La inducción del promotor lac induce la síntesis de la RNA polimerasa T7, la cual alternadamente transcribe el gen clonado.

Esto provee una regulación estricta y un alto nivel de expresión

Proteínas de fusión

La mayoría de los vectores de expresión producen proteínas de fusión, esto puede a primera vista ser una desventaja porque el producto natural del gen insertado no lo hace. Sin embargo aminoácidos extras en la proteína de fusión puede ser de gran ayuda para purificar el producto

Vectores que insertan DNA bajo el control del promotor lac Si un DNA es insertado en el mismo marco de lectura que el gen lacZ se producirá una proteína de fusión. Esta tendrá una secuencia parcial de la proteína b-galactosidasa en su extremo N-terminal y la secuencia de la otra proteína del gen insertado en el otro extremo.

pUC y pBS

VENTAJAS: 1. El sitio de inserción EcoRI inactiva el gen de la b-galactosidasa. Pueden seleccionarse

con medio con X-gal. 2. Se obtendrá una proteína fusionada con el producto y b-galactosidasa. Detección

Secuencia corta rio arriba del sitio de clonación múltiple que codifica para seis histidinas. Se obtiene una proteína de fusión con 6 histidinas en el extremo amino terminal.

Vectores (His)6

Tienen alta afinidad por metales como el níquel, por lo que estas proteínas podrían purificarse utilizando cromatografía por afinidad al níquel

¿Qué ocurre si las 6 histidinas interfieren en con la actividad de la proteína?

Justo antes del sitio de clonación esta una región que codifica para una región de aminoácidos que reconoce la enzima enterocinasa.

La enterocinasa puede ser usada para romper la proteína de fusión en dos partes: la cola de poli-histidinas y la proteína de interés

La proteína de interés puede ser removida con una columna de níquel una vez más para separar los fragmentos de poli-histidina.

Cromosomas bacterianos artificiales (BACs)

Plásmidos

100-300 kb.

Marcadores de selección como resistencia .

Sitio ori que mantiene al plásmido en 1-2 copias /célula.

Son introducidos por electroporación.

Usan células huésped con cambios en la pared celular que permiten la captura de grandes moléculas de DNA

Vectores de expresión eucarióticos

Vectores lanzadera (shuttle vectors)

Replicarse en más de un tipo de célula huésped.

25-100 copias

Orígenes de replicación (bacterias y levaduras)

Secuencia centrómero

Sitio de clonación múltiple

Marcadores de detección Complementación de mutaciones auxotróficas (trpI, leu2, his3)

E. coli→levaduras

c

c

c

c c

c

Complementación de mutaciones auxotróficas

Cromosomas artificiales de levaduras (YACs)

Contienen todos los elementos necesarios para mantener un cromosoma eucariótico en el núcleo (tel)

Se pueden insertar hasta 100 Kb

Dos marcadores de selección

Sitios de restricción

Vectores para vegetales

Plásmido Ti de Agrobacterium Puede mediar la transferencia de DNA de bacterias a células vegetales Género Agrobacterium A. tumefaciens produce tumores (Ti –tumor-inducing) en los que puede desarrollarse

Plásmido Ti El plásmido Ti confiere la capacidad a ciertas bacterias de introducir el DNA dentro de las células vegetales.

• Dos secuencias repetidas 25 bp

• Genes para hormonas que promueven el crecimiento y división células de la vegetales.

• Genes para la síntesis de opina (fuente de carbono).

• Tiene un origen de replicación

Solo el fragmento T-DNA es transferido a la planta. Cualquier fragmento introducido en el sitio T-DNA será transferido a la célula vegetal

Vectores para mamíferos

Vectores vaccinia

• Las proteínas son procesadas y modificadas correctamente.

• Las proteínas son transportadas apropiadamente y localizadas en la célula huésped.

• La producción uniforme de proteína es alcanzada dentro de una población de células blanco.

• Poseen un amplio rango de células huésped lo que permite transformar un gran número de líneas celulares.

Promotor del virus vaccinia

Sitios de restricción

DNA no esencial

Un origen para replicación en bacterias

Un marcador de resistencia

gen reportero

Líneas de trabajo

Detección de beta-lactamasas en enterobacterias de interés clínico

Tipificación por PFGE de enterobacterias Análisis de variables en proteínas vacunales de

Bordetella pertussis Detección de resistencia y tipificación de

Staphylococcus aureus Detección oportuna de patógenos relacionados a

sepsis y bacteriemia a través de EM-MALDITOF Diagnóstico de neumonías atípicas causadas por M.

pneumoniae y C. pneumoniae

Dra. Alejandra Aquino Andrade Instituto Nacional de Pediatría aquinoa26@hotmail.com