PROTEINI

Proteini su makromolekulska jedinjenja izgrađena od polipeptidnih lanaca koji se

sastoje iz α-L-aminokiselina povezanih peptidnim vezama. Uloga proteina u organizmu je

višestruka. Omogućavaju rast i regeneraciju organizma, kao i pravilan tok metaboličkih

procesa. Izvori su energije (1g proteina = 4 kcal). Prema prvom principu racionalne ishrane

unosom proteina treba da se zadovolji 12-15% ukupnih dnevnih energetskih potreba

organizma.

Proteini su izgrađeni od aminokiselina, koje se na osnovu mogućnosti sinteze u

organizmu dele na esencijalne i neesencijalne aminokiseline. Esencijalne aminokiseline

organizam ne može da sintetiše pa se moraju unositi hranom. Prema sadržaju esencijalnih

aminokiselina proteini se dele na: potpune (sadrže sve esencijalne aminokiseline) - to su

proteini životinjskog porekla (meso, mleko, jaja), i nepotpune (nedostaje jedna ili više

esencijalnih aminokiselina) - to su proteini biljnog porekla (leguminoze, žitarice).

Najčešće korišćena metoda za određivanje sadržaja proteina u hrani je metoda po

Kjeldahl-u. Ova metoda podrazumeva indirektno određivanje sadržaja proteina preko sadržaja

organskog azota. Sadržaj azota u proteinima iznosi u proseku 16%. Izračunavanje proteina

preko organskog azota dovodi do manje ili veće greške u zavisnosti od sadržaja drugih

organskih jedinjenja koja sadrže azot kao što su slobodne aminokiseline, njihovi amidi

(glutamin i asparagin), alkaloidi, itd.

Osim standardnom metodom po Kjeldahl-u, sadržaj proteina u pojedinim uzorcima

može se odrediti i specifičnim metodama koje su karakteristične za pojedine vrste namirnica.

Tako se za određivanje sadržaja proteina u mleku, pored metode po Kjeldahl-u, može

primeniti i metoda po Pyne-u (formol titracija).

Određivanje sadržaja proteina primenom kolorimetrijskih metoda zasniva se na

reakciji proteina sa odgovarajućim reagensom, pri čemu nastaje obojeni proizvod. Intenzitet

boje je proporcionalan sadržaju proteina. Određivanje se vrši na osnovu standardne krive koja

se priprema sa proteinom poznate koncentracije (goveđi serum albumin, kazein). Najviše

primenjivane kolorimetrijske metode za određivanje proteina su : biuretska , Lowry-jeva,

Bradford-ova metoda.

ODREĐIVANJE SADRŽAJA UKUPNIH PROTEINA METODOM PO KJELDAH L-u Princip

Zagrevanjem uzorka sa sumpornom kiselinom dolazi do njegove dehidratacije i

oksidacije, pri čemu se ugljenik postepeno oksiduje do ugljen-dioksida, vodonik do vode a

sumporna kiselina se redukuje do sumpor-dioksida. Nastali sumpor-dioksid redukuje azot do

amonijaka, koji sa sumpornom kiselinom gradi amonijum-sulfat.

C → CO2 oks.

H → H2O oks.

H2SO4 → SO2 red.

N2 + 3SO2 + 6H2O → 2NH3 + 3H2SO4

2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

Postupak razaranja uzorka ubrzava se dodatkom katalizatora (CuSO4, Se, Hg) i

supstanci koje povećavaju tačku ključanja sumporne kiseline (K2SO4). Nakon razaranja

uzorka sadržaj u balonu je bistar bez tragova ugljenika, a azot iz proteina i eventualno

prisutnih neproteinskih materija, nalazi se u obliku amonijum-sulfata ili dolazi do formiranja

kompleksa [Cu(NH3)4]SO4, ukoliko se kao katalizator koristi bakar -sulfat:

4NH3+ CuSO4 → [Cu(NH3)4]SO4

Destilacija amonijaka se izvodi pomoću vodene pare u aparatu po Parnas-Wagneru

(slika 1). Dodavanjem NaOH oslobađa se amonijak koji se hvata u poznatu zapreminu

kiseline određenog titra. Višak kiseline se retitrira pomoću NaOH poznatog titra. Istovremeno

se radi i slepa proba. Iz razlike utroška NaOH za titraciju slepe probe i analize, dobija se

količina NaOH koja je ekvivalentna količini NH3 u uzorku koji je destilisan. Iz te količine se

izračunava procenat azota i dalje, množenjem odgovarajućim faktorom, procenat proteina u

ispitivanom uzorku. Faktor za preračunavanje iznosi 6,25, jer prosečni sadržaj azota u

proteinima iznosi 16% (100/16).

Slika 1. Aparatura po Parnas-Wagneru-u

Ovom metodom ne određuje se azot iz nitrita i nitrata jer se delovanjem sumporne

kiseline iz njih izdvajaju pare azotnih gasova koje izlaze iz sistema.

Reagensi

• Sumporna kiselina, konc.

• CuSO4, 1%-tni rastvor

• K2SO4, p.a.

• Natrijum-hidroksid , 30%-tni rastvor

• Sumporna kiselina, 0,01M

• Natrijum hidroksid, 0,01M

• Kiselo-bazni indikator

Postupak

Odmeri se 0,1g uzorka (± 0,001g) i prenese u suv balon po Kjeldahlu. Zatim se doda

1ml 1% rastvora CuSO4, 1g K2SO4 i 1ml koncentrovane sumporne kiseline. Balon se u

digestoru pričvrsti za stalak pod uglom od 45°, a na otvor balona se stavi stakleni levak da bi

se sprečilo isparavanje sumpor-dioksida. Zagrevanje se u početku vrši na slabom plamenu da

ispari sva voda (do pojave belih para), a zatim se zagrevanje pojačava. Razaranje uzorka je

završeno kada nema ugljenisanih delova uzorka na zidovima balona, a sadržaj u balonu

postane bistar i plavo-zelene boje.

Posle razaranja, sadržaj u balonu se ohladi, razblaži sa malo destilovane vode (20 ml) i

kvantitativno prenese preko levka u balon destilacione aparature po Parnas-Wagneru,

ispirajući balon destilovanom vodom. Zatim se u balon sipa 30%-tni natrijum-hidroksid (na 1

ml koncentrovane sumporne kiseline dodate za sagorevanje, dodaje se 4 – 5 ml 30% rastvora

NaOH ) sve dok reakcija ne postane alkalna, pri čemu se sadržaj u balonu oboji tamnoplavo

(od tetraminskog kompleksa sa bakrom [Cu(NH3)4]2+). Omogući se prolaz vodenoj pari. Za

vreme destilacije plavo obojenje se menja u svetlosmeđe (jer se kompleks razlaže, oslobađa se

kupri-hidroksid, koji zagrevanjem prelazi u kuprioksid što daje rastvoru smeđu boju). Destilat

se hvata u prijemni sud (erlenmajer od 100ml), sa 25ml 0,01M HCl i 2 kapi indikatora. Nakon

15 min proverava se da li je predestilisao sav amonijak iz uzorka, crvenim lakmusom na koji

se hvata kap destilata. Ukoliko ne dođe do promene boje indikatorske hartije destilacija je

završena i višak kiseline u prijemnom sudu retitrira se 0,01M NaOH. Prethodno se izvrši

titracija 25ml 0,01M HCl (slepa proba) pomoću 0,01M NaOH u prisustvu 1-2 kapi indikatora

Izračunavanje

A = ________ ml NaOH 0,01M utrošenih za titraciju slepe probe

B = ________ ml NaOH 0,01M utrošenih za titraciju analize

m(N) = ______ g

m (proteina) = ________ g

Sadržaj proteina = ___________ %

Datum: __________________

Overa vežbe _________________

ODREĐIVANJE PROTEINA U MLEKU METODOM PO PYNE-u (FORMOL TITRACIJA)

Princip

Dodatkom neutralnog rastvora formaldehida blokiraju se amino grupe proteina, pri

čemu dolazi do "oslobađanja" karboksilnih grupa, koje se zatim titriraju bazom.

Ukoliko se na ovaj način određuju proteini mleka, neophodno je na početku

određivanja dodati kalijum-oksalat koji oslobađa kazein iz kompleksa sa kalcijumom, i

uzorak pre dodavanja formaldehida titrirati bazom, kako bi se prethodno neutralisale sve

prisutne kisele supstance u uzorku. Na taj način će kiselost uzorka, nakon dodavanja

formaldehida poticati isključivo od proteina tj. "oslobođenih " karboksilnih grupa.

Reagensi

• Fuksin, 0,0025%-tni rastvor

• Fenolftalein, 1%-tni rastvor u etanolu

• Kalijum-oksalat, zasićen rastvor

• Formaldehid, 40%-tni rastvor

• Natrijum-hidroksid, 0,1 mol/l rastvor

Postupak

U dva erlenmajera trbušastom pipetom prenese se po 50 ml mleka. U prvi erlenmajer

se doda 2 ml rastvora fuksina a u drugi 0,5 ml rastvora fenolftaleina, i zatim u oba erlenmajera

po 2 ml zasićenog rastvora kalijum-oksalata i promeša. Posle 2 minuta rastvor u drugom

erlenmajeru se titrira 0,1 mol/l rastvorom NaOH do boje rastvora u prvom erlenmajeru.

Zatim se u isti erlenmajer doda 10 ml 40% rastvora formaldehida, sačeka 1 minut i ponovo

titrira 0,1 mol/l rastvorom NaOH do boje rastvora u prvom erlenmajeru. Broj mililitara

0,1mol/l rastvora NaOH utrošenih u drugoj titraciji predstavlja tzv. formolni broj (po Pyne-u).

Sadržaj proteina = V x 0.338%

V - broj ml 0,1 mol/l rastvora NaOH utrošenih u drugoj titraciji

0.338 – empirijski faktor koji važi za opisani postupak

Rezultat

V = _______ ml 0,1 mol/l rastvora NaOH utrošenih u drugoj titraciji Sadržaj proteina = ________ %

Datum: __________________ Overa vežbe _________________

ODREĐIVANJE PROTEINA LOWRY-evom METODOM Princip Postupak se zasniva na biuretskoj reakciji, tokom koje se Cu2+ koordinativno vezuju za amino

azot iz peptidne veze (-CO-NH-) proteina, pri čemu se stvara kompleks Cu2+-protein. Nakon

dodatka Folin-Ciocalteau-ovog reagensa, koji sadrži fosfomolibdensku i fosfovolframovu

kiselinu, dolazi do njegove redukcije pomoću bočnih ostataka tirozina i triptofana, pri čemu se

razvija plavo obojenje. Intenzitet boje proporcionalan je sadržaju proteina u uzorku i meri se

spektrofotometrijski na 750 nm.

Reagensi

• Natrijum-karbonat

• Natrijum-hidroksid , 0,1 mol/l

• Bakar-sulfat , CuSO4 · 5 H20

• Natrijum-kalijum tartarat

• Folin-Ciocalteu reagens

• Standard proteina (1 mg /ml)

Postupak

Rastvor A (2% natrijum-karbonat u 0,1 mol/ l NaOH)

• Rastvoriti 2 g natrijum-karbonata u 100 ml 0,1 mol/ l NaOH

Rastvor B (0,5 % bakar-sulfat u 1% natrijum-kalijum tartaratu):

• Rastvoriti 0,5 g bakar-sulfata i 1,0 g natrijum-kalijum tartarata u 100 ml destilovane

vode

Rastvor C

• Pomešati A i B u odnosu 50:1

Folin-Ciocalteu reagens

• Komercijalni reagens razblažiti 1:1 sa destilovanom vodom

1. Pripremiti seriju razblaženja standarda proteina (0,1-1 mg/ml).

2. Pomešati 0,2 ml uzorka ili standarda sa 1,0 ml rastvora C i inkubirati na sobnoj

temperaturi 10 min.

3. Pomešati 0,2 ml destilovane vode sa 1,0 ml rastvora C i inkubirati na sobnoj

temperaturi 10 min ( slepa proba).

4. Dodati 0,1 ml razblaženog Folin-Ciocalteu-ovog reagensa, izmešati i inkubirati na

sobnoj temperaturi 30 minuta.

5. Izmeriti apsorbanciju na 750 nm, konstruisati grafik i preračunati koncentracije.

Izračunavanje Koncentracija radnih rastvora ( mg/ ml)

Standard proteina ( ml)

Destilovana voda ( ml)

Apsorbancija ( 750 nm)

0,1 0,5 4,5 0,2 1,0 4,0 0,4 2,0 3,0 0,6 3,0 2,0 0,8 4,0 1,0 1,0 5,0 0,0

Jednačina kalibracione krive : __________________ Apsorbancija uzorka : _______ Sadržaj proteina : _______ Datum: __________________ Overa vežbe _________________

BIURETSKA METODA ZA ODRE ĐIVANJE RASTVORLJIVIH PROTEINA Princip Biuretska metoda se zasniva na osobini peptidne veze da u jako alkalnoj sredini gradi

ljubičasti kompleks sa jonima bakra (Cu2+). Intenzitet boje je proporcionalan broju peptidnih

veza, tj. sadržaju proteina i meri se spektrofotometrijski na 550 nm.

Reagensi

• Biuretski reagens: rastvoriti 1,50 g kupri-sulfata (CuSO4 · 5 H20), 6,0 g natrijum-

kalijum tartarata (NaKC4H4O6 · 4H20) u 500 ml destilovane vode. Postepeno uz

mešanje dodati 300 ml 10% NaOH. Dopuniti do 1000 ml destilovanom vodom i čuvati

u plastičnoj boci.

• Standardni rastvor proteina (10 mg/ ml): rastvoriti 100 mg standarda proteina u 10 ml

destilovane vode.

Postupak

1. Pripremiti seriju razblaženja standardnog rastvora proteina (1,0-10 mg/ml).

2. Pomešati 1 ml uzorka, odnosno radnih standardnih rastvora sa 4,0 ml biuretskog

reagensa, izmešati i sačekati 30 min.

3. Pomešati 1 ml destilovane vode sa 4,0 ml biuretskog reagensa, izmešati i sačekati 30

min (slepa proba).

4. Izmeriti apsorbancije analize i radnih standardnih rastvora na 550 nm u odnosu na

slepu probu i konstruisati standardnu krivu.

5. Na osnovu jednačine standardne krive i očitane apsorbancije uzorka, izračunati

sadržaj proteina u analiziranom rastvoru.

6. Izračunati % rastvorljivih proteina u analiziranom uzorku.

Koncentracija radnih rastvora

(mg/ ml)

Standardni rastvor proteina

(ml)

Destilovana voda (ml)

Apsorbancija (550 nm)

0,0 0,00 1,00 slepa proba 1,0 0,10 0,90 2,5 0,25 0,75 5,0 0,50 0,50 7,5 0,75 0,25 10,0 1,00 0,0

Jednačina standardne krive: __________________ Apsorbancija uzorka: _____________ Sadržaj proteina u analiziranom rastvoru: _______________ Sadržaj proteina u uzorku (%): ____________ Datum: __________________ Overa vežbe: _________________