Vezba2-2015

7/26/2019 Vezba2-2015

1/29

Veba 2

2. Tehnologija rekombinovane DNK

2.1 Restrikcioni enzimi Makaze za DNK.......................................................................................3

2.1.1 Uvod......................................................................................................................................... 3

2.1.2 Aktivnost................................................................................................................................... 6

2.1.3 Cilj vebe.................................................................................................................................. 6

2.1.4 Materijal.................................................................................................................................... 6

2.1.5 Procedura 1.............................................................................................................................. 7

2.1.6 Procedura 2.............................................................................................................................. 7

2.1.7 adna sveska........................................................................................................................... !

2.1.7.1 Odgovori na pitanja iz procedure 1....................................................................................8

2.1.7.2 Odgovori na pitanja iz procedure 2....................................................................................8

2.2 lektro!oreza " gel" Trka !ragmenata DNK............................................................................#

2.2.1 Uvod......................................................................................................................................... "

2.2.2 Aktivnost.................................................................................................................................. 11

2.2.3 Cilj vebe................................................................................................................................. 11

2.2.4 Materijal.................................................................................................................................. 12

2.2.5 Procedura...............................................................................................................................12

2.3 Rekombinovana DNK................................................................................................................... 1$

2.3.1 Uvod....................................................................................................................................... 14

2.3.2 Aktivnost................................................................................................................................. 14

2.3.3 Cilj vebe................................................................................................................................14

2.3.4 Materijal.................................................................................................................................. 15

2.3.5 Procedura...............................................................................................................................15

2.3.5.1 Konstruisanje plazmida pAMP i pKA.............................................................................15

2.3.5.2 Konstruisanje re!om"inovanog plazmida pAMP#KA......................................................15

2.3.5.3 $rans%ormacija..................................................................................................................1&

2.3.6. adna sveska........................................................................................................................17

2.3.&.1 Pitanja.............................................................................................................................. 17

2.$ Detekcija s%eci!i&nih sekvenci DNK 'ecanje DNK..............................................................1#

2.4.1 Uvod....................................................................................................................................... 1"

2.4.2 Aktivnost................................................................................................................................. 21

2.4.3 Cilj vebe................................................................................................................................21

2.4.4 Materijal.................................................................................................................................. 21

2.4.5 Procedura...............................................................................................................................21

2.4.6 adna sveska.........................................................................................................................21

2.'.&.1 Pitanja.............................................................................................................................. 21

1

7/26/2019 Vezba2-2015

2/29

#snovi $olekularne biolo%ije

2.( Detekcija s%eci!i&nih sekvenci DNK Kombinovanje restrikcije i hibri)izacije.....................23

2.5.1 Uvod....................................................................................................................................... 23

2.5.2 Aktivnost................................................................................................................................. 23

2.5.3 Cilj vebe................................................................................................................................24

2.5.4 Materijal.................................................................................................................................. 24

2.5.5 Procedura...............................................................................................................................24

2.5.6 adna sveska.........................................................................................................................25

2.5.&.1 Pitanja.............................................................................................................................. 25

2

7/26/2019 Vezba2-2015

3/29

Veba 2

2.1 Restrikcioni enzimi Makaze za DNK

2.1.1 Uvod

Restrikcioni enzimi ili restrikcione en)on"kleaze su proteini !oji prepoznajuspeci%i(ne se!vence )K* vezuju se za te se!vence i +idrolizuju %os%odiestars!e veze uo!viru nji+ ili u nji+ovoj "lizini. u!leaze su enzimi !oji +idrolizuju %os%odiestars!e veze izo!osnice polinu!leotidnog lanca )K ili ,K. )o! egzonu!leaze +idrolizuju samo%os%odiestars!e veze na !rajevima lanaca* endonu!leaze to (ine sa vezama unutarpolinu!leotidni+ lanaca.

,estri!cione enzime proizvode "a!terije* a ot!riveni su za+valjuju-i svojojsposo"nosti da degraduju stranu )K. Oni mogu da razli!uju )K !oja je normalno prisutnau "a!terijs!oj -eliji od strane )K* !ao to je )K "a!terio%aga !oji in%icira "a!teriju. ji+ova

uloga je da "rane -eliju od invazije strani+ )K* ta!o to %ragmentiu stranu )K* odnosnose!u je na delove* ta!o da su popularno nazvani &'( $aka)e. ,estri!cione endonu!leazese nalaze is!lju(ivo !od pro!ariota.

/va!i restri!cioni enzim* a do sada je poznato nji+ ne!oli!o stotina* speci%i(noprepoznaje odre0enu se!vencu )K. /e!vence !oje restri!cioni enzimi prepoznajuozna(ene su !ao restrikciona mesta. ,estri!cioni enzimi !oji se naj(e-e !oriste ula"oratoriji speci%i(no prepoznaju se!vence duine '& "p !oje se odli!uju palindroms!omstru!turom. e-ina restri!cioni+ enzima +idrolizuje %os%odiestars!e veze unutar ovi+se!venci* dovode-i do dvolan(anog pre!ida )K. ,estri!ciona mesta ne!i+ (esto !ori-eni+restri!cioni+ endonu!leaza* sa ozna(enim mestima na !ojima se lanac pre!ida* pri!azana suna slici 2.1.

4 4EcoR*+ 5 6AA$$ 3 Hind***+ 5 AA6$$ 3

3 $$AA6 5 3 $$6AA 5

4 4

Bam,* 5 66A$ 3 Alu*+ 5 A6$ 393 $A66 5 3 $6A 5

4 4Sma*+ 5 666 3 Hha*+ 5 66 3

3 666 5 3 66 5

Slika 2.1.Restrikciona mesta nekih restrikcionih enzima

3

7/26/2019 Vezba2-2015

4/29


$re"a da zapazite da je se!venca u o"a lanca )K u o!viru jednog restri!cionogmesta ista !ada se (ita u istom smeru :na primer u smeru 53;* to je !ara!teristi!a sva!epalindroms!e se!vence )K. $a!o0e* uo(ite da ne!i restri!cioni enzimi +idrolizujunaspramne %os%odiestars!e veze* odnosno se!u dva lanca )K na istom mestu* %ormiraju-i%ragmente )K sa ravnim krajevima. )rugi enzimi* me0utim* +idrolizuju %os%odiestars!e

veze iz dva polinu!leotidna lanca na razma!u od ne!oli!o nu!leotida* %ormiraju-i %ragmentesaje)nolan&anim krajevima.

EcoR* + 5 6 AA$$ 3

3 $$AA 6 5

Slika 2.2.Krajevi restrikcionih !ragmenata enzima EcoR*

Pod odre0enim uslovima :!oncentracija soli* p

7/26/2019 Vezba2-2015

5/29

7/26/2019 Vezba2-2015

6/29

PvuII 3247

PvuI 4916


lika 2.3. Restrikciona ma%a %lazmi)a /*'(. =roj posle imena enzima po!azuje "roj nu!leotida (iju%os%odiestars!u vezu enzim +idrolizuje.

2.1.2 Aktivnost

ovoj ve"i studenti do"ijaju osnovne in%ormacije o restri!cionim enzimima i !oristema!aze !a!o "i simulirali nji+ovo delovanje. $a!o0e* studenti u(e ta su restri!cione mape i

!a!o se !oriste za predvi0anje "roja %ragmenata !oje moe da proizvede odre0enirestri!cioni enzim od datog mole!ula )K.

&

7/26/2019 Vezba2-2015

7/29

Veba 2

2.1.3 Cilj vebe

ilj ove ve"e je da studenti upoznaju na(in delovanja i zna(aj restri!cioni+endonu!leaza za istraivanja u mole!ularnoj "iologiji.

Kada zavre ovu ve"u studenti "i tre"alo da znajuG

ta su restri!ciona mesta i da opiu nji+ovu stru!turuH

!a!o restri!cioni enzimi delujuH

da !oriste restri!cionu mapu ne!og mole!ula )K za predvi0anje "roja%ragmenata !oje odre0ena restri!ciona endonu!leaza moe da proizvede.

2.1. !ate"ijal

PonetiG

Ma!aze

astavni! -e o"ez"editiG

Kopije se!venci )K

2.1.# $"ocedu"a 1

1. ?secite ma!azama !artone sa se!vencama !oje -ete do"iti od nastavni!a. /va!i niz

slova predstavlja nu!leotidnu se!vencu du %os%odiestars!e o!osnice* a verti!alnelinije izme0u slova predstavljaju

7/26/2019 Vezba2-2015

8/29


7. zmite prvi %ragment sa nalepnice ' :*co,?; i drugi sa nelpnice 3 :0ind???;. O"a%ragmenta imaju ElepljiveF !rajeve duine po ' nu!leotida. apiite se!vencu dvajednolan(ana !raja i o"eleite i+ sa E*co,?F i E0ind???F. O"eleite 5 i 3 !rajeve. )a lisu se!vence !rajeva *co,? i 0ind??? %ragmenata !omplementarneD +#d%ovor u,i-ite uadnu svesku.

8. Ostavite 0ind??? %ragment i uzmite drugi %ragment sa nalepnice 1 :*co,?;. poreditejednolan(ane !rajeve i za"eleite svoje zapaanje u ,adnu sves!u.

2.1.% $"ocedu"a 2

1. Posmatrajte restri!cionu mapu plazmida I?P5 :sli!a 2.3;. )uina ovog plazmida je 5 5'1"p i on sadri jedno restri!ciono mesto za *co,? !oje po(inje na nu!leotidu 1. Koli!a je

duina linearne plazmidne )K do"ijene +idrolizom plazmida sa *co,?D

2. Koli!a je duina %ragmenata !oji "i se do"ili digestijom sa dva enzima* *co,? i *a%?D

3. Koli!a je duina %ragmenata !oji "i se do"ili digestijom sa dva enzima* 0ind??? iA,a?D

'. Koli!a je duina %ragmenata !oji "i se do"ili digestijom sa tri enzima*0ind???*A,a? Pvu?D

5. Koli!i %ragmenti "i se do"ili a!o "iste proizvode do"ijene digestijom sa *co,? i *a%?tretirali sa Pvu??D

Odgovore upiite u ,adnu sves!u

2.1.& 'adna sveska

8

7/26/2019 Vezba2-2015

9/29

Veba 2

2.1.7.1 O)6OO,?AP?$ACA?BP,OJ),J1

Odgovorite na pitanja postavljena pod ta(!ama '* 5* &* 8 i .

'.

5.

&.

8.

.

7/26/2019 Vezba2-2015

10/29


2.1.7.2 O)6OO,?AP?$ACA?BP,OJ),J2

1.

2.

3.

'.

5.

1>

7/26/2019 Vezba2-2015

11/29

Veba 2

2.2 lektro!oreza " gel" Trka !ragmenata DNK

2.2.1 Uvod

e- ste nau(ili o restri!cionim enzimima i !a!o oni se!u )K na %ragmente.Posmatrali ste i restri!cionu mapu i razumeli !a!o se ona !oristi za predvi0anje "roja%ragmenata !oji mogu nastati !ao proizvodi delovanja odre0enog enzima. Kada u la"oratorijiradite restri!cionu digestiju* vi stavite enzim i )K u epruvetu i pustite da enzim uradi svojposao. Pre nego to rea!cija po(ne* rea!ciona smea u epruveti izgleda !ao "istra i"ez"ojna te(nost. Kada se rea!cija zavri* ona i dalje izgleda isto. /amim posmatranjem nemoete za!lju(iti da se neto dogodilo.

)a "i restri!ciona digestija imala svr+u* vi morate videti razli(ite restri!cione%ragmente !oji su nastali. Postoje +emijs!e "oje !oje mogu da o"oje )K* ali o(igledno je da

se ne moe nita posti-i nji+ovom upotre"om L svi %ragmenti )K o"oji-e se na isti na(in. la"oratoriji* nau(nici razdvajaju %ragmente )K te+ni!om !oja je ozna(ena !ao elektroore)au %elu!a!o "i mogli da razli!uju i analiziraju proizvode restri!cione digestije.

lektro!oreza " gel" je metoda za razdvajanje ma!romole!ula u ele!tri(nom poljuprema nji+ovoj veli(ini. neutralnoj sredini %os%atne grupe u o!osnici mole!ula )K i ,Ksu negativno naele!trisane. Mole!uli )K i ,K su* da!le* polianjoni* ta!o da se uele!tri(nom polju !re-u prema pozitivnoj ele!trodi* anodi. egativna naele!trisanja suravnomerno raspore0ena du polinu!leotidnog lanca* ta!o da je u!upna !oli(inanaele!trisanja* !oju jedan mole!ul nu!leins!e !iseline nosi* proporcionalna njegovoj veli(ini. ele!tri(nom polju* !re-u-i se !roz inertan i porozan matri!s* !ao to je agarozni ilipolia!rilamidni gel* nu!leins!e !iseline se razdvajaju prema veli(ini mole!ula. 6el slui !aosito !roz (ije pore ve-i mole!uli nu!leins!i+ !iselina prolaze tee i zato se !re-u sporije* amanji prolaze la!e i !re-u se "re. Kao rezultat* mole!uli nu!leins!i+ !iselina za isto vremeprolaze razli(it put u zavisnosti od veli(ine.

Agarozni gel za razdvajanje %ragmenata )K pravi se ta!o to se agaroza rastvori uzzagrevanje u pu%eru !oji ima ulogu ele!trolita. ru- rastvor se sipa u plit!u posudu !oja jedeo aparature za ele!tro%orezu. jedan !raj posude postavi se pose"an e-alj ta!o danjegovi zupci "udu uronjeni u agarozu. Potom se ostavi da se rastvor agaroze o+ladi* !a!o "ise %ormirao gel. Ovaj postupa! se u la"oratoriji naziva razlivanje gela. Kada se iz %ormiranog

gela izvadi e-alj* du jednog !raja gela do"ija se niz mali+ udu"ljenja na mestima gde su uagarozu "ili uronjeni zupci e-lja :sli!a 2.';. udu"ljenja se pre ele!tro%oreze sipaju uzorci:na primer* restri!cione smee;.

6el* u (ija su udu"ljenja uneti uzorci* smeta se u aparaturu za ele!tro%orezu : sli!a2.5; i potapa u pu%er. Kada se aparatura pri!lju(i na izvor struje* struja proti(e !roz pu%er i gel.@ragmenti )K po(inju da se !re-u !roz gel prema pozitivnom polu. Bamislite da jeele!tro%oreza tr!a u !ojoj su tr!a(i %ragmenti )K. Oni se razdvajaju* "a !ao tr!a(i u pravojtrci L manji se !re-u "re* a ve-i sporije :sli!a 2.&;. A!o su iste veli(ine* %ragmenti tr(eFzajedno i istovremeno stiu na cilj.

11

7/26/2019 Vezba2-2015

12/29

ealj

posuda u koju se sipa vru rastvor agaroze

udubljeja za uzorke

gel

! "


lika 2.$. Razlivanje agaroznog gela.A. )a "i se %ormirao agarozni gel* vru- rastvor agaroze sipa seu plit!u posudu i u jedan njegov !raj uroni se e-alj. =. Poto se agaroza o+ladi i o(vrsne* (ealj se

izvadi* ostavljaju-i u gelu udu"ljenja za nanoenje uzora!a.

lika 2.(. 0%arat"ra za elektro!orez" " agaroznom gel".J!sperimentator !oristi mi!ropipetu !a!o"i uneo uzor!e u udu"ljenja na agaroznom gelu. 6el se nalazi u !omori napunjenoj pu%erom. ?zvor

struje se vidi iza !omore.

12

7/26/2019 Vezba2-2015

13/29

Veba 2

13

7/26/2019 Vezba2-2015

14/29


lika 2.. ragmenti DNK se trkaj".ajmanji %ragmenti uve! po"e0uju.

Kada se ele!tro%oreza zavri* mole!uli razli(iti+ veli(ina %ormiraju razdvojene tra!e narazli(itom rastojanju od po(et!a gela* a u o!viru sva!e tra!e nalaze se mole!uli iste ili sli(neveli(ine. Ka!o "i tra!e u gelu postale vidljive gel se in!u"ira u rastvoru %luorescentne "oje*

etidijum "romida. Jtidijum "romid je planaran mole!ul !oji se inter!alira izme0u parova "azau dvolan(anoj zavojnici )K i na taj na(in se na!uplja u mole!ulima )K pove-avaju-inji+ovu %luorescenciju. Kao rezultat inter!alacije etidijum "romida* !ada se gel ozra(iultravioletnom svetlo-u* tra!e u gelu u !ojima se nalaze %ragmenti )K intenzivno%luoresciraju i opaaju se !ao svetle pruge na tamnoj pozadini :sli!a 2.7;.

lika 2.. ragmenti DNK " agaroznom gel" obojeni eti)ij"m bromi)om. udu"ljenja ozna(enasa M uneti su mar!eri %ragmenti )K poznati+ duina. a levoj strani su ozna(ene duine

%ragmenata !oji su !ori-eni !ao mar!eri.

2.2.2 Aktivnost

Ova ve"a predstavlja simulaciju gel ele!tro%oreze pomo-u papirni+ modela gela irestri!cioni+ %ragmenata )K.

2.2.3 Cilj vebe

ilj ve"e je da studenti nau(e principe na !ojima se zasniva ele!tro%orets!orazdvajanje restri!cioni+ %ragmenata )K i da sagledaju mnogostru!e mogu-nosti primeneove metode u mole!ularnoj "iologiji i "iote+nologiji.

Kada zavre ovu ve"u studenti -e mo-i daG

predvide !oli!o restri!cioni+ %ragmenata -e se do"iti digestijom ne!og mole!ula)K sa odre0enim restri!cionim enzimom* u!oli!o im je poznata restri!cionamapa te )KH

odrede raspored do"ijeni+ restri!cioni+ %ragmenata u gelu posle ele!tro%orets!eseparacijeH

o"jasne !a!o je to!om ele!tro%oreze dolo do razdvajanja %ragmenata )K !ojise razli!uju po veli(ini.

2.2. !ate"ijal

1'

7/26/2019 Vezba2-2015

15/29

Veba 2

PonetiG

Ma!aze


Papirne modele mole!ula )K duine 15 !" sa ozna(enim restri!cionim mestimaza tri restri!ciona enzima

Papirni model agaroznog gela

2.2.# $"ocedu"a

1. ?secite tri modela mole!ula )K

2. /imulirajte a!tivnost restri!cionog enzima *co,? na mole!ulu na !ome su ozna(enarestri!ciona mesta za ovaj enzim ta!o to -ete ma!azama prese-i model du verti!alni+linija. radili ste digestiju )K sa *co,?. /a!upite restri!cione %ragmente na jednomesto.

3. /imulirajte digestiju drugog mole!ula )K sa a$

7/26/2019 Vezba2-2015

16/29


2.3 Rekombinovana DNK

2.3.1 Uvod

e!e od najvaniji+ te+ni!a !oje se danas !oriste u "iote+nologiji u!lju(uju!onstruisanje re!om"inovani+ mole!ula )K. Rekombinovani molek"l DNK nastaje!om"inovanjem ne!oli!o delova !oji imaju razli(ito pore!lo. ,e!om"inovani "ici!l napravili"iste ta!o to "iste rastavili na delove dva "ici!la* a onda napravili EnoviF !om"inuju-i delovedva staraG na primer* to(!ove jednog i osnovnu !onstru!ciju drugog. ? a genom jere!om"inovan* "udu-i da jedan njegov deo poti(e od oca* a drugi od maj!e. ,e!om"inovanimole!uli )K* da!le* nastaju spajanjem delova mole!ula )K !oji su do"ijeni iz razli(iti+izvora. Cedan od ti+ izvora (esto je plazmid.

'lazmi)i su mali* !runi mole!uli )K !oji se mogu na-i u ne!im -elijama. Oni

sadre speci%i(ne se!vence nu!leotida* ozna(ene !ao mesta %o&etka re%likacije i*za+valjuju-i tome* repli!uju i+ -elijs!i enzimi za repli!aciju )K. a tim se!vencama enzimirepli!acije )K grade !omple!se i zapo(inju repli!aciju* odnosno sintezu novog mole!ula)K. Kao to se moe i o(e!ivati* "a!terijs!i +romozomi* !ao i +romozomi svi+ drugi+ vrsta*ta!o0e* sadre mesta po(et!a repli!acije. $e se!vence imaju sutins!i zna(aj zanasle0ivanjeH !ada mole!ul )K ne "i sadrao mesta po(et!a repli!acije* on ne "i mogao "itirepli!ovan i ne "i "io prenet u nove generacije.

Plazmidi (esto sadre gene !oji im o"ez"e0uju rezistencij" na antibiotike.Anti"iotici su prirodne supstance !oje naj(e-e proizvode zemljini mi!roorganizmi.Proizvodnja anti"ioti!a omogu-uje ovim mi!roorganizmima da se "ore protiv

mi!roorganizama sa !ojima su u !ompeticiji. ,ezistencija na anti"ioti!e je* ta!o0e* prirodnapojava* a!o ni z"og (ega drugog* onda z"og toga to sami proizvo0a(i anti"ioti!a moraju "itiotporni na one anti"ioti!e !oje sami sintetiu. ovoj ve"i radi-emo sa genima !ojio"ez"e0uju rezistenciju na anti"ioti!e !ao to su ampicilin i !anamicin.

2.3.2 Aktivnost

ovoj ve"i* sastavi-ete plazmide !oji nose gene za rezistenciju na ampicilin i!anamicin* a zatim -ete i+ re!om"inovati. Plazmid !oji nosi gen za rezistenciju na ampicilinozna(avamo sa pAMP* onaj !oji nosi gen za rezistenciju na !anamicin sa pKA* a

re!om"inovani plazmid sa pAMP#KA. Koristi-ete papirne modele plazmida i pro-i -ete !rozproceduru !oju nau(nici !oriste !ada !onstruiu re!om"inovane mole!ule )K. Koristi-etema!aze umesto restri!cioni+ endonu!leaza* a lepljivu tra!u :selotejp; umesto ligaze. ,ezultataeg rada "i-e papirni model re!om"inovanog mole!ula )K. au(nici unose pravere!om"inovane plazmide u "a!terijs!e -elije u !ojima se plazmidi repli!uju. =a!terije se "rzorazmnoavaju i* poto sadre re!om"inovane plazmide* one stvaraju milione !opija ti+plazmida* !ao i proteina !oje plazmidi !odiraju.

2.3.3 Cilj vebe

ilj ve"e je da studenti upoznaju postupa! !onstruisanja re!om"inovanog mole!ula)K* !ao po(etni !ora! prili!om !loniranja )K i !ao jedan od naj(e-i+ postupa!a umole!ularnoj "iote+nologiji uopte.

1&

7/26/2019 Vezba2-2015

17/29

Veba 2

Kada zavre ovu ve"u studenti "i tre"alo da znaju daG

opiu delovanje )K ligazeH

de%iniu pojam Ere!om"inovani mole!ul )KFH

opiu postupa! !onstruisanja re!om"inovanog plazmida od dva po(etnaplazmida.

2.3. !ate"ijal

PonetiG

Ma!aze

epa! ili selotejp


Papirne modele plazmida2.3.# $"ocedu"a

17

7/26/2019 Vezba2-2015

18/29


2.3.5.1 KO/$,?/ACJPABM?)APAMP ?PKA

1. zmite tri tra!e !oje (ine papirni model plazmida pAMP. a sva!oj traci dva niza slova

predstavljaju "aze* a pune +orizontalne linije predstavljaju o!osnice )K lanaca.odoni(ne veze izme0u "aza nalaze se u "elom prostoru izme0u dva reda slova.

2. Ma!azama paljivo isecite tra!e du puni+ +orizontalni+ linija* ostavljaju-i linije da sevide. Presecite tra!e verti!alno du otvoreni+ "o(ni+ ivica tra!a. $im rezom -ete u!lonitiona!e 5 i 3.

3. Poto ste ise!li sve tri tra!e* poveite ozna!u E1F sa povrinom Epaste 1F !oriste-i lepa! iliselotejp. Pri tome* pre!rijte verti!alne linije. Poveite E2F sa Epaste 2F i E3F sa Epaste 3F naisti na(in. apravili ste !runi papirni model plazmida pAMP* !oji sadri gen zarezistenciju na ampicilin.

'. a isti na(in napravite i model plazmida pKA* !oji sadri gen za rezistenciju na!anamicin.

18

7/26/2019 Vezba2-2015

19/29

Veba 2

2.3.5.2 KO/$,?/ACJ,JKOM=?OAO6PABM?)APAMP#KA

Poto ste napravili modele plazmida pAMP i pKA* u ovom delu ve"e is!oristi-ete i+

da napravite re!om"inovani plazmid. Prese-i -ete pAMP i pKA sa dva speci%i(na enzimaGa$

7/26/2019 Vezba2-2015

20/29

7/26/2019 Vezba2-2015

21/29

Veba 2

2.3.&.1 P?$ACA

1. Cednolan(ani !raj restri!cionog %ragmenta do"ijenog uz pomo- enzima a$

7/26/2019 Vezba2-2015

22/29


'. au(nici (esto !om"inuju gen za rezistenciju na anti"ioti! sa ne!im drugim genom !ojegele da !loniraju. ?spitivani gen je u ta!vim slu(ajevima povezuje sa genom zarezistenciju na anti"ioti!* ta!o da je sva!a "a!terija !oja sadri ispitivani gen rezistentna

na dati anti"ioti!. ve-ini slu(ajeva nau(nicima nije potre"an protein !oji degradujeanti"ioti!. Bato oni* onda* !om"inuju gene na ta!av na(inD

22

7/26/2019 Vezba2-2015

23/29

Veba 2

2.$ Detekcija s%eci!i&nih sekvenci DNK 'ecanje DNK

2..1 Uvod

Bamislite da ste nau(ni! !oji posmatra epruvetu u !ojoj je upravo izolovana )K.eoma vas interesuje da li ta )K sadri gen za cisti(nu %i"rozu. Poto o tom genu znateveoma malo* postavlja se pitanje !a!o moete znati da li se on nalazi u vaem uzor!u )KD

au(nici (esto imaju potre"u da EupecajuF odre0eni deo mole!ula )K* !ao to je naprimer gen za cisti(nu %i"rozu. Ka!o oni to radeD A!o znaju "ar neto o )K !oju trae* ondato ne mora "iti tea! posao.

Kada ne!i nau(ni! EpecaF odre0eni deo mole!ula )K* on !oristi pose"nu EudicuF!oja se naziva %roba. Pro"a je naj(e-e jednolan(ana )K. Bamislite sli!u mole!ula )K ilimodel !oji ste pravili. =azni parovi su u unutranjosti* a o!osnice dva lanca spolja.

Cednolan(ana )K je samo polovina te stru!tureG jedna o!osnica sa "azama !oje su vezaneza nju :neto sli(no mole!ulu ,KH vidite sli!u 2.8;. A!o jedna jednolan(ana )K Eprona0eFdrugu i a!o su nji+ove se!vence !omplementarne* one -e se spariti i nagraditi standardnudvolan(anu zavojnicu. au(nici taj proces sparivanja !omplementarni+ jednolan(ani+polinu!leotida nazivaju hibri)izacija.

lika 2.4. ,ibri)izacija %robe sa je)nolan&anom DNK.

)a "i ispitao da li se ne!i gen nalazi u uzor!u )K* na nau(ni! !oristi pro"u !ojaima nu!leotidnu se!vencu istu !ao deo ispitivanog gena. $a!o0e* !oristi i radioa!tivnio"eleiva( uz pomo- !oga -e pro"a "iti dete!tovana. On dodaje pro"u u uzora! )K da "i

video da li -e pro"a +i"ridizovati sa uzor!om )K. Ka!o -e znati da li je dolo do+i"ridizacijeD A!o je pro"a +i"ridizovala sa )K* ona -e ostati vezana za )K. A!o nije*onda -e se la!o u!loniti ispiranjem.

Poto se uzora! )K ispere* izloi se rendgen %ilmu. A!o je radioa!tivna pro"a+i"ridizovala sa ispitivanom )K* na tom mestu %ilm -e "iti e!sponiran. Kada razvije ipregleda %ilm* nau(ni! -e znati da pro"a ima se!vencu !oja je !omplementarna se!vencidela ispitivane )K. Poto se!venca pro"e odgovara se!venci dela gena za cisti(nu %i"rozu*jasno je da se taj gen nalazi u uzor!u )K.

)rugi na(in da se pro"e o"elee i dete!tuju jeste da se za nji+ veu %luorescentne

"oje. Poto se pro"a in!u"ira sa uzor!om )K i nevezana pro"a u!loni ispiranjem* nau(ni!

23

7/26/2019 Vezba2-2015

24/29


moe da dete!tuje prisustvo pro"e merenjem %luorescencije. =oje mogu da %luorescirajurazli(itim "ojama* to omogu-ava da se istovremeno moe !oristiti ne!oli!o pro"a.

Cedan tip analize !oja se radi sa %luorescentnim pro"ama je !l"orescentna in situhibri)izacija :*,;. ovoj metodi %luorescentno o"eleene pro"e se nanose na inta!tni

+romozom* -eliju ili prese! t!iva* umesto na izolovanu )K. Pro"e se vezuju za svoje ciljnese!vence* i !ada se %luorescencija dete!tuje* ona po!azuje lo!alizaciju odre0ene se!vence uoriginalnom uzor!u.

/li!a 2.pri!azuje primere @?/

7/26/2019 Vezba2-2015

25/29

Veba 2

lika 2.17. 'rimena *,8a " )etekciji translokacije hromozoma %9eni&ne trave " genom%9enice.

2..2 Aktivnost

a papiru imate se!vencu duine 37 nu!leotida !oja predstavlja va uzora! )K.

/va!a deseta "aza je o"eleena masnim slovom* a "aze na po(et!u sva!og reda sunumerisane. ?mate i jednu !rat!u se!vencu !oja predstavlja pro"u za gen za cisti(nu %i"rozu.Koristi-ete pro"u da ispitate da li se gen za cisti(nu %i"rozu nalazi u vaem uzor!u )K.

)a li prime-ujete neto neo"i(no u vezi sa duga(!om se!vencom )KD Ona jejednolan(ana. )a "iste testirali da li pro"a moe da +i"ridizuje sa ispitivanom )K*neop+odno je da se prvo razdvoje dva lanca )K* !a!o "i pro"a mogla da Eprona0eF!omplementarne "aze. a uzora! )K je ve- pripremljen za +i"ridizaciju.

2..3 Cilj vebe

ilj ve"e je da studenti razumeju !oncept +i"ridizacije i primenu +i"ridizacije zaispitivanje prisustva ne!og gena u uzor!u )K.


da o"jasne princip +i"ridizacijeH

da razumeju primenu o"eleeni+ pro"a u ispitivanju prisustva odre0ene se!venceu ne!om mole!ulu )KH

da opiu +i"ridizaciju o"eleene pro"e sa uzor!om )K u rastvoru i in situ.

2.. !ate"ijal

PonetiG

Ma!aze


Papirne modele uzor!a )K i o"eleene pro"e

2..# $"ocedu"a

1. ?secite pro"u.

2. Pretraite se!vencu ispitivane )K da "iste videli da li -e pro"a +i"ridizovati sa njom.

3. )a li je gen za cisti(nu %i"rozu prisutan u vaem uzor!u )K. A!o na0ete se!vencu sa!ojom pro"a moe da +i"ridizuje* ozna(ite je.

2..% 'adna sveska

25

7/26/2019 Vezba2-2015

26/29


2.'.&.1 P?$ACA

1. ta je +i"ridizacijaD

2. Ka!o se +i"ridizacija primenjuje za dete!tovanje odre0ene se!vence u uzor!u )KD

3. )ata je se!venca ispitivane )K. apiite se!vencu pro"e od 1> "p !oja "i mogla da+i"ridizuje sa ovom )K.

5AA$6A66$A$A$6$$AA66A$A$6AA$6$AAA$6AA6$AA663

2&

7/26/2019 Vezba2-2015

27/29

obojei gel rezultat #ibridiza$ioe aalize

Veba 2

2.( Detekcija s%eci!i&nih sekvenci DNK Kombinovanje restrikcije i

hibri)izacije

2.#.1 Uvod

7/26/2019 Vezba2-2015

28/29


:odnosno /outern+i"ridizacionu analizu; !a!o "i do!azali prisustvo i lo!alizaciju ispitivanese!vence )K u ispitivanom uzor!u )K.

2.#.3 Cilj vebe

ilj ve"e je da studenti razumeju !a!o se !om"inovanjem +i"ridizacije*ele!tro%orets!og razdvajanja %ragmenata* /out+ern "lota i +i"ridizacije moe do"itiin%ormacija o prisustvu i lo!alizaciji ispitivane se!vence )K u ne!om mole!ulu )K.


da o"jasne primenu metode /out+ern "lotaH

da o"jasne !a!o se +i"ridizacijom o"eleene pro"e sa restri!cionim %ragmentimaispitivane )K moe locirati ispitivana se!venca.

2.#. !ate"ijal

PonetiG

Ma!aze

epa! ili selotejp


Papirne modele uzor!a )K* o"eleene pro"e i gela

2.#.# $"ocedu"a

1. zmite papirni model se!vence iz pret+odne ve"e i isecite tra!e oivi(ene ispre!idanimlinijama. Balepite tra!u 1 za tra!u 2* tra!u 2 za tra!u 3 i ta!o redom* ta!o da do"ijeteduga(a! linearni mole!ul jednolan(ane )K. Bamislite da je to +romozom.

2. /imulirajte a!tivnost restri!cionog enzima /$a?. Ovaj enzim preseca se!vencu56663 ta(no po sredini* izme0u i 6. @ragmentiite +romozom ta!o to -ete gaprese-i na sva!om restri!cionom mestu za /$a? :vai %ragmenti -e "iti jednolan(ani*zato to je predvi0eno da sa njima uradite +i"ridizacijuH u realnosti restri!ciona analiza seradi sa dvolan(anim %ragmentima* a dva lanca se razdvajaju te! posle ele!tro%oreze;.

3. /imulirajte ele!tro%orezu vai+ %ragmenata. /ortirajte i+ po duini i postavite i+ na sto !aoda se nalaze u gelu.

'. acrtajte poloaje vai+ %ragmenata u gelu posle ele!tro%oreze na papirnom modelugela.

5. Ozna(ite zvezdicom one %ragmente !oji mogu da +i"ridizuju sa pro"om.

&. ?majte na umu da -e raspored %ragmenata u gelu "iti potpuno o(uvan posle trans%era namem"ranu. a mem"rani oni -e "iti testirani na +i"ridizaciju sa pro"om. Posle toga*samo %ragmenti !oji su +i"ridizovali sa pro"om mo-i -e da "udu dete!tovani :!ao na slici2.11;. acrtajte ono to -e se videti posle +i"ridizacione analize u "o!su ozna(enom saErezultati +i"ridizacione analizeF.

2.#.% 'adna sveska

28

7/26/2019 Vezba2-2015

29/29

Veba 2

2.5.&.1 P?$ACA

1. Mogu-e je napraviti ise(a! agaroznog gela* pre(istiti )K iz njega i !lonirati ga.

Pretpostavite da imate pro"u za virusni gen !oji "iste eleli da !lonirate* ali ne znate gdese taj gen nalazi u virusnom genomu !oji sadri '> >>> "p. O"jasnite !a!o "i vam/outern+i"ridizaciona analiza mogla pomo-i da !lonirate gen od interesa.

Documents

Vezba2-2015